Биохимические и физиологические аспекты деградации полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) лигнинолитическими грибами

Позднякова, Наталия Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биохимические и физиологические аспекты деградации полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) лигнинолитическими грибами
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические и физиологические аспекты деградации полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) лигнинолитическими грибами"

На правах рукописи

ПОЗДНЯКОВА НАТАЛИЯ НИКОЛАЕВНА

БИОХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ДЕГРАДАЦИИ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ (ПАУ) ЛИГНИНОЛИТИЧЕСКИМИ ГРИБАМИ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Саратов-2014

005547910

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Инстит; биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФР РАН)

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Турковская Ольга Викторовна

доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганиз

мов Российской академии наук,

лаборатория экологической биотехнологии,

заведующая лабораторией

Королева Ольга Владимировна

доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук,

лаборатория молекулярных основ биотрансформаций,

заведующая лабораторией

Терехова Вера Александровна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской академии наук,

лаборатория изучения экологических функций почв, заведующая лабораторией Ильина Галина Викторовна доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пензенская государственная сельскохозяйственная академия», кафедра «Биология животных и ветеринария», профессор кафедры

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, г. Пермь

Защита диссертации состоится «25»июня 2014 г. в J_L00 часов на заседании диссертационно го совета Д 002.146.01 при ИБФРМ РАН по адресу: 410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13. Тел. / факс: (8452) 97-03-83

Автореферат диссертации и диссертация размещены на сайте ИБФРМ РА fhttn://ww\v.ibppm. Saratov, ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат разослан « »CL/bjlC+Li 2014 г.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета Д 002.146.01

доктор биологических наук

Л.П. Антонюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований и состояние проблемы. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) - огромный класс органических соединений, химическая структура которых включает два и более конденсированных бензольных кольца. Интерес к механизмам биодеградации и «судьбе» ПАУ в окружающей среде связан с их широким распространением, устойчивостью к деградации, аккумуляцией почвой и осадками, токсическими, мутагенными и канцерогенными свойствами (Juhasz and Naidu, 2000; Kanaly and Harayama, 2000; Mrozik et al., 2003; Peng et al., 2008; Haritash and Kaushik, 2009). Некоторые ПАУ отнесены национальными агентствами по защите окружающей среды к приоритетным поллютантам (http://vvww.defra.gov.uk/Environment /consult/airqualOl/11 .htm). ПАУ являются гидрофобными соединениями, сброс и случайное попадание которых в природную среду создает серьезную проблему, особенно в случае, когда биодеградативной активности природной микрофлоры не достаточно для их удаления или нейтрализации (Reddy, 1995; Juhasz and Naidu, 2000; Peng et al., 2008). Использование различных живых организмов лежит в основе высокоэффективных и относительно недорогих технологий детоксикации этих опасных поллютантов - биоремедиации (Mrozik et al., 2003). Для разработки и эффективного использования этих технологий необходимо всестороннее исследование организмов-деструкторов, метаболических путей деградации ПАУ, катализирующих их ферментных систем и условий окружающей среды, необходимых для оптимизации разрушения этих соединений.

Одними из наиболее активных деструкторов ПАУ являются грибы, разрушающие в природе лигниновый компонент древесины (лигнинолитические). К ним относятся деревообита-ющие (грибы белой гнили; в англ. white rot fungi) и почвообитающие (подстилочные сапро-трофы; в англ. litter-decomposing fungí) базидиомицеты и некоторые виды аскомицетов (Buswell and Odier, 1987; Hatakka, 2001; Pointing, 2001; Wong, 2009). Ферментативная система этих грибов, катализирующая деградацию лигнина, является внеклеточной неспецифической и окислительной, что позволяет им, кроме природного субстрата, метаболизировать широкий спектр поллютантов и их смесей, давая значительное преимущество перед бактериями и нелиг-нинолитическими грибами (Cerniglia, 1992; 1997).

Основными лигнинолитическими ферментами являются лигнин пероксидаза, Мп-пероксидаза, гибридная пероксидаза (в англ. versatile peroxidase) и лакказа (Wong, 2009). До настоящего времени обсуждаются следующие ферментативные механизмы деградации ПАУ лигнинолитическими грибами: (а) лигнин пероксидазы и Mn-пероксидазы катализируют одно-электронное окисление ПАУ с потенциалами ионизации не более 7,55 eV с образованием соответствующих хинонов (Hammel et al., 1986; Vazquez-Duhalt et al., 1994; Field et al., 1996), которые далее могут быть метаболизированы через расщепление ароматического кольца (Hammel et al., 1991); (б) лакказы катализируют одно-электронное окисление ПАУ также с образованием

хинонов, и каталитические возможности этих ферментов могут быть расширены в присутствии ряда легко окисляемых веществ, так называемых медиаторов (Johannes et al., 1996; Collins et al., 1996); (в) ПАУ, содержащие до шести ароматических колец, могут быть окислены в процессе перокисления липидов, катализируемого Mn-пероксидазами (Moen and Hammel, 1994; Bogan and Lamar, 1995).

Репрессии синтеза лигнинолитических ферментов не происходит, когда концентрации веществ снижаются до уровня, который неэффективен для их индукции, и, следовательно, они могут деградировать даже низкие концентрации поллютантов. В результате каталитического действия этих ферментов образуются полярные водорастворимые продукты, которые более доступны как для грибного метаболизма, так и для дальнейшей деградации природной почвенной микрофлорой. Лигнинолитические грибы обладают значительным потенциалом для использования в биоремедиационных технологиях (микоремедиации), особенно для соединений, которые трудно разлагаются бактериями.

Несмотря на то, что изучение деградации ПАУ лигнинолитическими грибами проводится довольно давно, до настоящего времени существует целый ряд пробелов в исследованиях, в основном касающихся регуляции метаболизма, доступности этих веществ для грибной клетки, участия и роли разных форм лигнинолитических ферментов. Без восполнения подобных пробелов невозможно глубокое понимание деградативных механизмов и практическое использование этих грибов.

Цель настоящего исследования - выявление основных закономерностей и механизмов регуляции метаболизма ПАУ лигнинолитическими грибами, характеристика и функции ферментов, катализирующих разные этапы деградации.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследование влияния условий культивирования на деградацию трех- (фенантрен, антрацен, флуорен) и четырехкольцевых (пирен, хризен, флуорантен) ПАУ и продукцию лигнинолитических ферментов грибами Pleurotus ostreatus Dl и Agaricus sp. F-8. Идентификация основных метаболитов.

2. Выявление продукции эмульгирующего вещества в процессе деградации ПАУ Р. ostreatus Dl.

3. Очистка и определение молекулярных (молекулярная масса, субъединичный состав, спектры поглощения) и каталитических (рН-оптимумы, Км, Vmax, kcat Для моноароматических субстратов, активность по отношению к ПАУ) свойств внеклеточных лакказ из погруженных и твердофазных культур грибов Р. ostreatus Dl и Agaricus sp. F-8.

4. Сравнительное исследование основных молекулярных (молекулярная масса, субъединичный состав) и каталитических (рН-оптимумы, Км, Vmax, kcat для моноароматических суб-

стратов, активность по отношению к ПАУ) свойств пероксидаз Р. ostreatus DI и Bjerkandera fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst.

5. Выявление активностей основных лигнинолитических ферментов Р. ostreatus DI на поверхности и внутри грибной клетки.

6. Выделение и определение основных молекулярных (молекулярная масса, субъединичный состав) и каталитических (рН-оптимумы, Км, Vmax, kcal для моноароматических субстратов, активность по отношению к ПАУ) свойств «поверхностных» и внутриклеточных форм лакказ и пероксидазы Р. ostreatus DI.

7. Изучение деструктивного потенциала лигнинолитических грибов в процессе микоре-медиации нефтезагрязненной почвы.

Научная новизна. На примере Р. ostreatus DI получены приоритетные данные об основных закономерностях и механизмах регуляции метаболизма ПАУ лигнинолитическими грибами. Установлена комбинированная роль лакказы и пероксидазы гриба в процессе деградации этих ксенобиотиков. Оба фермента могут катализировать окисление ПАУ, что предполагает их взаимозаменяемость в начальной атаке молекул этих веществ. Показано, что пероксидаза участвует в утилизации образовавшихся метаболитов. Впервые обнаружено образование эмульгирующего вещества в процессе деградации ПАУ Р. ostreatus DI, коррелирующее с продукцией пероксидазы и обеспечивающее доступность гидрофобного субстрата для гриба.

Получены новые данные о каталитических свойствах внеклеточных форм лакказ гриба белой гнили Р. ostreatus D1 и подстилочного сапротрофа Agaricus sp. F-8, показана их ключевая роль в деградации ПАУ этими грибами. Получены новые данные об ингибиторной и субстратной специфичности гибридной пероксидазы В. fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst. Впервые из гриба белой гнили Р. ostreatus DI выделена пероксидаза, обладающая необычными каталитическими свойствами, отличающими ее от типичной гибридной пероксидазы В. fumosa и других известных лигнинолитических пероксидаз. Обнаружена способность исследованных пероксидаз окислять широкий ряд синтетических красителей антрахинонового ряда, что значительно расширяет каталитические возможности этих ферментов.

Впервые выделены и частично охарактеризованы «поверхностные» и внутриклеточные формы лакказ и пероксидазы Р. ostreatus DI. Показана возможность участия «поверхностных» форм этих ферментов в начальной атаке молекулы ПАУ. Обнаружено, что каталитически активные внутриклеточные формы лакказ и пероксидазы не только могут быть предшественниками внеклеточных и «поверхностных» форм, но и участвовать в утилизации метаболитов ПАУ, проникающих в клетку.

Установлена способность лигнинолитических грибов метаболизировать широкий спектр углеводородов нефти, как в экспериментальных условиях, так и в условиях реального загрязнения.

На основании анализа данных литературы и сопоставления их с результатами собственных исследований впервые, на примере Р. ostreatus DI, сделаны выводы об основных физиологических и энзимологических особенностях деградации ПАУ лигнинолитическими грибами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Деградация трех- и четырехкольцевых ПАУ грибом белой гнили Р. ostreatus DI и почвенным сапротрофом Agaricus sp. F-8. происходит по одной схеме с образованием хинонов на первом этапе. Образование и последующая утилизация фталевой кислоты на последних этапах метаболизма ПАУ грибом Р. ostreatus DI предполагает ее включение в основной обмен.

2. Лакказа продуцируется на первых этапах деградации ПАУ Р. ostreatus DI, приводящих к образованию хинонов, тогда как пероксидаза — на более поздних, приводящих к утилизации образовавшихся метаболитов. Существует зависимость «глубины» деградации ПАУ от набора лигнинолитических ферментов, продуцируемых грибом: накопление хинонов в условиях продукции лакказы и образование и последующая утилизация хинонов в условиях продукции лакказы и пероксидазы.

3. Продукция эмульгирующего вещества Р. ostreatus DI зависит от растворимости исследованных ПАУ и коррелирует с продукцией пероксидазы этим грибом.

4. Внеклеточные формы лакказ и пероксидазы, выделенные из погруженной культуры Р. ostreatus DI, могут окислять ПАУ, что предполагает их взаимозаменяемость в начальной атаке молекулы. Пероксидаза окисляет метаболиты деградации ПАУ, тогда как для лакказы эти соединения не доступны.

5. «Желтые» формы внеклеточных лакказ, выделенные из твердофазных культур грибов Р. ostreatus DI и Agaricus sp. F-8, способны окислять ПАУ без медиатора в реакционной смеси.

6. Пероксидаза Р. ostreatus DI, обладает уникальными каталитическими свойствами, отличающими ее от гибридной пероксидазы В. fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst, и других известных грибных лигнинолитических ферментов.

7. Молекулярные и каталитические свойства внеклеточных и «поверхностных» форм лакказ совпадают и отличаются от таковых внутриклеточных форм. Предположительно внутриклеточные формы являются каталитически активными предшественниками «поверхностных» и внеклеточных. «Поверхностные» формы лакказы могут катализировать начальную атаку молекулы ПАУ, когда активности внеклеточных форм еще недостаточно.

8. Твердофазные культуры лигнинолитических грибов, относящиеся к видам Pleurotus ostreatus, Lentinus edodes, Coriolus sp. и Agaricus sp., способны колонизировать почву с нефтяным загрязнением, продуцировать лигнинолитические ферменты и активно деградировать нефтяное загрязнение. На основании проведенных исследований грибы Р. ostreatus DI и Agaricus sp. F-8 могут быть предложены для разработки на их основе технологии микоремедиа-ции.

Научно-практическая значимость. Результаты работы вносят вклад в понимание основных механизмов деградации ПАУ лигнинолитическими грибами. Полученные данные о метаболических путях, катализирующих их ферментах, и продуктах деградации ПАУ представляют значительный интерес для специалистов в области микробиологии, биохимии и биотехнологии.

Сведения, касающиеся выделения, очистки и каталитических свойств основных лигни-нолитических ферментов важны для объяснения механизмов функционирования этих ферментов, а также для создания на их основе биокатализаторов.

Создана научная основа для разработки эффективной технологии микоремедиации с использованием деревообитающих и почвообитающих лигнинолитических грибов. На основании исследований способности метаболизировать нефть в условиях реального загрязнения, образовывать устойчивый и доминирующий мицелий и продуцировать лигнинолитические ферменты были отобраны гриб белой гнили Р. ostreatus Dl и подстилочный сапротроф Agaricus sp. F-8. Комплексы этих грибов с почвенной микрофлорой являются перспективными для дальнейшего создания на их основе технологии микоремедиации нефтезагрязненных почв.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе могут быть использованы в организациях биологического и биотехнологического профилей, занимающихся исследованием деградации ксенобиотиков и разработкой технологий биоремедиации, а также при чтении курсов лекций по биохимии и микробиологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 1999 по 2013 гг. в лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой тематикой. Часть исследований выполнена в рамках договоров о сотрудничестве между Российской и Польской академиями наук в 2002-2013 гг. в Институте катализа и химии поверхности Польской академии наук (г. Краков) и на кафедре биохимии Университета им. Марии Кюри-Склодовской (г. Люблин). Изучение «поверхностных» и внутриклеточных форм лигнинолитических ферментов проводили в Центре исследований окружающей среды (Helmholtz Zentrum für Umweltforschung - UFZ; Лейпциг, Германия). Исследования поддержаны грантами фонда И. Миановского (Польша, 2004 г.), Немецкой службы академических обменов (DAAD, №А0903583 по программе "Forschungsaufenthalte für Hochschullehrer und Wissenschaftler" 2009-2010 гг.), Международного научно-технического центра (ISTC №3419.2, 2008 г.), государственным контрактом № 02.512.11.2210 с Роснаукой в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (2008-2009 гг.). Научные положения диссертации и выводы базируются на собственных исследованиях автора.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждены на 6российских: Межрегиональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микро-

организмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 26-27 марта 2002 г., 10-12 октября 2006 г., 14-16 октября 2008 г.), «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, 15-17 июня 2005 г.), Всероссийская конференция «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 23-27 сентября 2007 г.), Третий съезд микологов России (Москва, 10-12 октября 2012 г.) и 12 международных конференциях: Международная конференция «Биохимия и физиология культивируемых грибов» (Саратов, 6-8 июня 2002 г.), «12th International biodégradation and biodeterioration symposium (Prague, Czech Republic, 14-18 July 2002), «International symposium biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants» (Saratov, Russia, 28-30 July 2003), «International conference on protein stabilization» (Bratislava, Slovakia, 26-29 September 2004), «Грибы в природных и антропогенных системах» (Санкт-Петербург, 25-29 апреля 2005 г.), Международная конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 14-16 сентября 2005 г.), «International symposium on environmental biotechnology» (Leipzig, Germany, 9-13 July 2006), IV Международная научная конференция «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 21 -23 ноября 2006 г.), «Oxizymes and 9th International symposium on peroxidases (Leipzig, Germany, 14-16 June 2010), «Enzymes in the environment: Activity, ecology and applications» (Prague, Czech Republic, 14-17 July 2003; Viterbo, Italy, 15-19 July 2007; Bad Nauheim, Germany, 17-21 July 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 62 работы, в том числе 18 статей в российских и международных журналах из списка ВАК, 2 главы в книгах, 7 статей в сборниках, 35 тезисов конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 397 страницах, содержит 28 таблиц и 130 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Список литературы включает 22 российских и 564 зарубежных источников.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы по теме диссертации представлен 4 главами, включающими описание физиологических особенностей и деструктивного потенциала лигнинолитических грибов, краткую характеристику ПАУ как опасных загрязнителей окружающей среды, описание известных метаболических путей деградации ПАУ этими грибами, современные представления о каталитических механизмах и функциях основных лигнинолитических ферментов, а также анализ биотехнологического потенциала лигнинолитических грибов в процессах микоремедиации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследований и методы культивирования. В работе использованы грибы белой гнили Pleurotus ostreatus Dl, D2, 336, D/L и, Lentinus edodes 0779, F-249, 2T и NY, из кол-

лекции лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН1; гриб белой гнили Coriolus sp. F-l и подстилочные сапротрофы Agaricus sp. F-8 и F-l, выделенные из объектов окружающей среды.

Для погруженного культивирования грибов использовали богатую среду для базидио-мицетов (Bezalel et al., 1997) и среду Кирка (Kirk et al., 1986) в нашей модификации. Твердофазное культивирование грибов проводили в колбах на лузге подсолнечника.

Исследование деградативной активности грибов по отношению к ПАУ (фенантрен, антрацен, флуорен, пирен, хризен или флуорантен) и их метаболитам (9,10-антрахинон, 9-флуоренол, 9-флуоренхинон, 9,10-фенантрол, 9,10-фенантренхинон, 2,2'-дифеновая и фталевая кислоты) проводили в условиях погруженного культивирования при стартовой концентрации 50 мг/л. Образование мицелия в процессе деградации определяли весовым методом. Экстракцию остаточных ПАУ и их метаболитов проводили хлороформом и этилацетатом, экстракты упаривали досуха и анализировали хроматографическими методами.

Обесцвечивание красителей исследовали на среде Кирка, убыль тестировали спектрофо-тометрически по снижению поглощения при следующих длинах волн (нм): ализариновый красный - 505, акридиновый оранжевый — 470, нейтральный красный - 525, бутилродамин С — 560, родамин 6G- 500, сафранин Т-515, эозин - 520.

Для изучения деградации нефти в процессе микоремедиации использовали южный чернозем, искусственно загрязненный нефтью (30 г/кг), и промышленный грунт со старым нефтяным загрязнением (36,2 г/кг). Общее содержание нефти и ее фракционный состав в образцах почвы анализировали хроматографическими методами. Количество углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) подсчитывали методом мембранных фильтров, общее количество ге-теротрофов - методом прямого высева кратных разведений на МПА. Количество микроорганизмов подсчитывали с учетом влажности почвы.

Хроматографические методы. Газожидкостную хроматографию (ГЖХ) проводили на хромотографе Shimadzu 2010 с пламенно-фотометрическим детектором, на колонке НР5 (Agilent), газ-носитель - гелий. Продукты деградации ПАУ перед проведением ГЖХ метилировали CH3COCI (Горяев и Евдакова, 1977). ГЖХ с масс-спектрометрическим детектированием осуществлялась с использованием Termo Finifan "Trace DSQ" (ThermoElectron Corp., Austin, USA) с турбомолекулярным насосом, ионизацией электронным ударом и библиотеками масс-спектров (NIST-02 и Wiley), на капиллярной колонке RT-FAME (30 м х 0,25 мм ID), газ-носитель - гелий.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили с использованием системы HPLC (GPC, Laboratorni Pristroje Praha, Czechia) на колонке Supelcosil™ LC-PAH (5 см x 4,6 мм, 3 мкм) с UV-детектором при Х=254 нм, в режиме изократического элюирования смесью ацетонитркшНгО (70:30 % об/об).

1 Автор благодарит д.б.н., профессора Никитину В.Е. за любезно предоставленные штаммы грибов

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили в системе: бензол 9:этанол 1 (Song, 1999) на пластинах Silufol UV-254 ("Kavalier", Чехия).

Адсорбционная хроматография на колонке А1203 с гравиметрическим окончанием была использована для определения общего содержания нефти и ее фракционного состава. Фракции последовательно элюировали гексаном (парафины, нафтены), смесью 15% бензола в гексане (моно- и бициклическая ароматика), бензолом (ПАУ), смесью (1:1) спирт-бензол (смолы) и идентифицировали по показателям преломления (Полунина и Кушик, 1977).

Определение эмульгирующей активности. Для выявления способности грибов к продукции биоПАВ в процессе деградации ПАУ и их производных тестировали эмульгирующую активность (Е48) культурапьной жидкости методом Купера (Cooper, 1996), вычисляли как соотношение объема эмульсии к общему объему жидкости и выражали в процентах.

Получение грубых препаратов внеклеточных ферментов. Для получения грубого ферментного препарата из твердофазных культур, грибы Р. ostreatus Dl и Agarícus sp. F-8 выращивали на лузге подсолнечника 9-14 суток. Ферментированную лузгу (5 г) промывали трижды, по 20 мл дистиллированной воды, водные экстракты объединяли и фильтровали.

Для получения грубого ферментного препарата из погруженной культуры, Р. ostreatus Dl выращивали на богатой среде для базидиомицетов в течение 7-10 сут. для получения лакказ и 14-21 сут. для получения пероксидазы. Мицелий отделяли фильтрованием и далее использовали для выделения «поверхностных» и внутриклеточных форм ферментов, среда культивирования служила источником внеклеточных ферментов.

«Поверхностные» формы ферментов смывали с мицелия 0,1 М фосфат-цитратным буфером pH 7,0 в соотношении 10 мл буфера на 1 г сырой биомассы, на шейкере (Shaker 3015, GFL, Burgwedel), процедуру повторяли 4-5 раз до полного исчезновения активности ферментов в су-пернатанте. Фракции, содержащие «поверхностные» ферменты, собирали и использовали в качестве грубого ферментного препарата.

Оставшийся мицелий гомогенизировали в фарфоровой ступке с кварцевым песком, ферменты экстрагировали 0,1 М фосфат-цитратным буфером pH 7,0 (15 мл на 3 г биомассы) в течение 2 ч, дважды. Полученный экстракт центрифугировали, супернатант использовали в качестве источника внутриклеточных ферментов.

Схема очистки лигнинолитических ферментов была аналогичной и включала фракционирование сульфатом аммония, ионообменную хроматографию на колонках DEAE-Sepharose (Sigma-Aldrich, США) или TEAE-Servacel 23 (Chemapol, Чехия) и гель-фильтрацию на колонке Sephacryl S-200 HR (Pharmacia, Швеция). Для более тонкой очистки ферментные препараты подвергали ионообменной хроматографии на колонке Mono Q HR 5/5 с использованием системы FPLC (Pharmacia, Швеция).

В процессе очистки чистоту ферментных препаратов контролировали методом электрофореза в денатурирующих условиях. В случае необходимости, последний этап очистки повторяли. Концентрацию белка определяли по методу Bradford (1976).

Электрофоретически гомогенный препарат гибридной пероксидазы В. fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst, был предоставлен профессором кафедры биохимии Университета им. Марии Кюри-Склодовской (Люблин, Польша) А. Ярош-Виколаска.

Для концентрирования ферментных препаратов использовали ультрафильтрацию на ячейке Amicon РМ-10 (Millipore, США).

Определение активности ферментов проводили с п е кто ф ото м етр и ч ее к и на спектрофотометре Evolution 60 (Thermo Scientific, США). В ходе очистки активность лакказ тестировали по скорости образования продукта окисления 2,2-азино-ди-3-этилбензотиазолин-6-сульфата (АБТС) (Niku-Paavola et al., 1988), пероксидазы по образованию продукта окисления 2,6-диметоксифенола в присутствии 0,2 мМ Н202 и 0,5 мМ МпСЬ, согласно Martinez с соавторами (1996). Активность пероксидазы рассчитывали по разнице между активностью в присутствии и в отсутствии Н2О2. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль продукта окисления в минуту. Удельную активность определяли как мкмоль/мин/мг белка и выражали в Ед./мг белка. В случае невозможности определения концентрации белка активность фермента выражали в условных единицах — мкмоль/мин/мл препарата (Ед./мл).

Для определения субстратной специфичности ферментов использовали: 4-гидрокси-3,5-диметоксибензальдегид - сирингальдазин (Leonowicz and Crzywnowicz, 1981), АБТС (Niku-Paavola et al., 1988), пирокатехин (Королева и др., 2001), 2,6-диметоксифенол (Martinez et al., 1996), 2,7-диаминофлуорен (Criquet et al., 2000), о-дианизидин (Bartha and Bordeleau, 1969), 1-гидроксибензотриазол (Ander and Messner, 1998), вератриловый спирт (Tien and Kirk, 1984). Окисление MnCl2 тестировали по образованию комплексов Мп3+-малонат (Wariishi et al., 1992) и Мп3+-пирофосфат (Schlosser and Höfer, 2002). Окисление и-фенилендиамина и ТУ-ацетил-п-фенилендиамина изучали спектрофотометрически по образованию продуктов реакции при 530 нм и 355 нм, соответственно. Окисление замещенных нафталинов исследовали при 530 нм для а-нафтола, 360 нм для /?-нафтола (Kulys et al., 2003), 480 нм для а-нафтиламина и 405 нм для а-нитрозо-/?-нафтола. Субстратная специфичность пероксидаз исследовалась в реакционных смесях, содержащих кроме буфера и субстрата 0,2 мМ Н2О2 и 0,5 мМ МпСЬ-

Ферментативное обесцвечивание антрахиноновых красителей тестировали по снижению поглощения при 505 нм для ализаринового красного (AR), при 590 нм для Acid Blue 62 (АВ62), Basic Blue 22 (BB22) и Reactive Blue 4 (F2R), в реакционной смеси содержащей 50 мМ цитрат-фосфатный буфер pH 2,0-8,0 для лакказы, и 50 мМ Na-малонатный буфер pH 2,0-7,5, 0,2 мМ Н202 и 0,5 мМ МпСЬ Для пероксидаз. Обесцвечивание красителей, содержащих конденсиро-

ванные ароматические кольца (не антрахинонового типа), изучали в этих же условиях, но время инкубации было увеличено до 2-7 сут. Исследуемые красители добавляли до конечной концентрации 50 мкМ. Убыль субстратов отслеживали спектрофотометрически по снижению поглощения, как это было описано в экспериментах с культурами грибов.

Определение каталитических характеристик ферментов. Влияние рН на скорость ферментативных реакций изучали, определяя активность лакказ в 50 мМ цитрат-фосфатном буфере рН 2,0-8,0 и гибридных пероксидаз в 50 мМ Ыа-малонатном буфере в этом же диапазоне рН (Досон и др., 1991). Влияние эффекторов на активность лакказы тестировали в смеси, содержащей 50 мМ NaK-фосфэтный буфер рН 6,0 и 0,05 мМ сирингальдазин или 50 мМ Na-тартратный буфер рН 4,5 и 0,5 мМ АБТС, на активность пероксидаз - в смеси, содержащей 50 мМ Na-малонатный буфер рН 4,0, 0,5 мМ 2,6-диметоксифенол, 0,5 мМ МпСЬ и 0,2 мМ Н202. В качестве эффекторов использовали 1-100 мкМ и 1-10 мМ n-аминобензойную кислоту, 1-10 мМ твин-80, 5-40 мкМ NaN3, 1-80 мкМ флуорен и антрацен. Металлы (Си, Mn, Ni, Со, Zn, Fe, Mg, Са) вносили в виде солей хлоридов или сульфатов до концентрации 1-10 мМ.

Ферментативное окисление ПАУ и их производных исследовали в реакционных смесях следующего состава: в реакциях с лакказами - 1 мл буфера, 1% ацетонитрила (по объему), 0,5 мМ АБТС (или без АБТС); в реакциях с пероксидазами - вместо АБТС вносили 0,5 мМ МпСЬ (или без МпСЬ) и 0,2 мМ Н202. Ферменты добавляли до конечной концентрации 1 или 10 Ед./мл. ПАУ и их производные растворяли в ацетонитриле и добавляли до конечной концентрации 20 мкМ. Через 2-7 сут. реакционные смеси подкисляли до рН 2,0, продукты реакций экстрагировали и анализировали хроматографическими методами. В контрольных вариантах использовали ферментные препараты, инактивированные кипячением в течение 10 минут.

Электрофорез. Вертикальный диск-электрофорез в денатурирующих условиях с доде-цилсульфатом натрия и /?-меркаптоэтанолом проводили в 12% полиакриламидном геле, в системе Laemmly (1970), с последующим окрашиванием Coomassie R-250 (Досон и др., 1991). Неденатурирующий вертикальный диск-электрофорез проводили в этих же условиях, но исключали додецилсульфат натрия и /?-меркаптоэтанол. Для выявления активности лакказ гель окрашивали о-дианизидином, для обнаружения пероксидаз в реакционную смесь дополнительно вносили 0,5 мМ МпС12 и 200 мкМ Н202.

Определение молекулярных масс ферментов. Молекулярную массу ферментов методом электрофореза в денатурирующих условиях определяли по калибровочной кривой (Гааль и др., 1992), используя набор стандартных белков (кДа): ¿-лактальбумин - 14,2, ингибитор трипсина - 20,1, трипсиноген - 24, карбоангидраза - 29, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа -36, овальбумин - 45, бычий сывороточный альбумин - 66. Молекулярную массу ферментов методом гель-фильтрации определяли на колонке Sephacryl S-200 HR (Pharmacia, Швеция), для

калибровки которой были использованы (кДа): Dextran blue (2000), бычий сывороточный альбумин (66), пероксидаза хрена (44,2), миоглобин (17,8).

Все варианты описанных экспериментов и анализов имели не менее чем трехкратную повторность. Каждый эксперимент повторяли не менее трех раз. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью Microsoft Excel 2003 и Origin 7. Для подсчета Vmax и Км дополнительно использовали программу ENZFITER (Biosoft, Cambridge).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности метаболизма ПАУ лигиинолитическими грибами

На основании предварительного скрининга для исследования особенностей метаболизма ПАУ были отобраны гриб белой гнили Р. оя^еаШ 01 и подстилочный сапротроф Agaricus эр. Р-8, обладающие деструктивной активностью по отношению к фенантрену и продуцирующие высокий титр лигнинолитических ферментов.

Деградация ПАУ с тремя конденсированными кольцами Р. оьКеШт £>/

Изучение деградативной активности лигнинолитических грибов чаще всего проводят в условиях погруженного культивирования. Мы исследовали деградацию трехкольцевого ПАУ — фенантрена Р. о$ггеа1и$ при культивировании на среде Кирка. Исходное вещество для гриба было нетоксичным, однако в процессе деградации накапливались метаболиты, ингибирующие его рост, о чем свидетельствовало снижение количества биомассы по отношению к контролю, не содержащему фенантрен. Затем эти токсичные метаболиты разрушались, и в конце эксперимента количество биомассы в экспериментальном и контрольном вариантах было почти одинаковым. Через 3 недели убыль фенантрена в этих условиях составляла 95,1% (Рисунок 1). Методами ГЖХ и ТСХ на 7-21 сутки культивирования идентифицирован метаболит со временем удерживания, соответствующим стандарту - фенантрен-9,10-хинону, а начиная с 14 сут. появлялся еще один пик продукта соответствующий 2'2-дифеновой кислоте.

=.! 100

график - убыль фенантрена, %; гистограмма - прирост биомассы (% по отношению к контролю без фенантрена)

Рисунок 1 - Деградация фенантрена и продукция лакказы грибом Р. оэ^еаШв О! на среде Кирка

5 6 7 8 9 10 U 1Ï 13 14 15 16 17 1 Время, сут.

В данных условиях из всего комплекса лигнинолитических ферментов обнаружена продукция только лакказы, при этом в присутствии фенантрена выявлено образование двух допол-

нительных форм этого фермента (Рисунок 2). Активности лигнинолитических пероксидаз на протяжении всего времени культивирования обнаружено не было.

80 Б Лакказа-4

70 60 Лакказа-3

Лч I Лакказа-2

40 / У^ \ \ Лакказа-1 sip Лакказа-1

30 J / V,1

20 1

10 ¿Г

.Л* 1 - контроль (без ПАУ), 2 -

О 1 : 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Время, сут.

присутствии фенантрена

• - контроль (без ПАУ), ■ - в присутствии фенантрена Рисунок 2 - Продукция (А) и электрофореграмма в неденатурирующих условиях (Б) лакказ при культивировании P. ostreatus D1 на среде Кирка

Известно, что грибы рода Pleurotus продуцируют лигнинолитические пероксидазы на среде с пептоном (Martinez et al., 1996; Rodriquez et al., 2004). На следующем этапе мы исследовали деградацию фенантрена на богатой среде для базидиомицетов (рН 6,0), которая, как было предварительно показано, поддерживает продукцию пероксидазы у P. ostreatus. В этих условиях гриб метаболизировал около 60% фенантрена уже через 3 сут. инкубации, а к 10 сут. деградация фенантрена достигала более 98% (Рисунок 3). Так же как и при культивировании на среде Кирка, в данных условиях в процессе деградации фенантрена накапливались метаболиты, инги-бирующие рост гриба, которые затем разрушались. Так же как и при культивировании на среде Кирка нами были выявлены фенантрен-9,10-хинон и 2,2'-дифеновая кислота. Однако в отличие от культивирования на среде Кирка эти метаболиты не накапливались и полностью разрушались к 20 суткам. Их структуры были подтверждены при сравнении Rf (ТСХ), времени удерживания (ВЭЖХ) и спектров поглощения метаболитов, выделенных препаративной ТСХ, с соответствующими характеристиками коммерческих соединений. В отличие от среды Кирка, начиная с 14 сут., в среде культивирования выявлено образование еще одного метаболита, Rf которого на ТСХ равный 0,29 соответствовал стандарту - фталевой кислоте. Это вещество также было выделено препаративной ТСХ, его спектр поглощения с максимумом при 280 нм соответствовал спектру фталевой кислоты. Использование ГЖХ показало, что его время удерживания (8,5 мин) совпадало с таковым фталевой кислоты. Остальные метаболиты присутствовали в количествах, недостаточных для их выделения и идентификации.

На богатой среде для базидиомицетов деградация фенантрена сопровождалась продукцией и лакказы, и пероксидазы. Лакказа продуцировалась с начала культивирования в виде двух пиков активности. Активность пероксидазы выявлялась только через 8-9 дней, достигая

максимума на 19 сутки. Установлено, что в присутствии фенантрена и/или продуктов его деградации наблюдалось образование дополнительных форм лакказы и пероксидазы (Рисунок 4).

график - деградация, %; гистограмма — прирост биомассы (% по отношению к контролю без фенантрена)

Рисунок 3 - Деградация фенантрена Р. ояКеатя 01 на богатой среде для базидиомицетов

7 8 9 10 11 12 13 14 15

.520

01234567

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Время, суг.

1 2 3 4 к

1 -лакказа в присутствии фенантрена, 2 - лакказа (контроль), 3 — пероксидаза в присутствии фенантрена, 4 - пероксидаза (контроль)

(А) ■ — лакказа (контроль), □ — лакказа в присутствии фенантрена, • — пероксидаза (контроль), о — пероксидаза в присутствии фенантрена; (Б) стрелками отмечены дополнительные формы лакказы (1) и пероксидазы (3) Рисунок 4 - Динамика активности (А) и электрофореграмма в неденатурирующих условиях (Б) лигнинолитических ферментов Р. ostreatusD\ на богатой среде для базидиомицетов

В отличие от фенантрена сведений о метаболических путях деградации антрацена немного. Большинство исследователей идентифицируют 9,10-антрахинон как доминирующий продукт его грибной деградации. Нами также была исследована деструктивная активность гриба Р. оэКеМт по отношению к антрацену. В отличие от фенантрена, антрацен почти не ин-гибировал прирост мицелия при культивировании гриба, как на богатой среде, так и на среде Кирка. Обнаружено, что при культивировании на богатой среде для базидиомицетов через 7 сут. инкубации гриб метаболизировал 50,1, а через 21 сут. - 85,3% антрацена. При культивировании на среде Кирка деградация антрацена проходила более активно и уже через 7 сут. достигала 100%.

Так же как и в случае фенантрена, деградация антрацена на среде Кирка сопровождалась продукцией только лакказы, а на богатой среде для базидиомицетов - продукцией и лакказы, и

пероксидазы. Однако в отличие от фенантрена антрацен оказался активным индуктором перок-сидазы продукция, которой начиналась почти одновременно с продукцией лакказы.

Накопление ключевого метаболита деградации антрацена — 9,10-антрахинона было нами обнаружено методами ГЖХ и ВЭЖХ только при культивировании на среде Кирка. На богатой среде для базидиомицетов он не накапливался и метаболизировался дальше, с образованием фталевой кислоты, которая, как известно, включается у грибов в основной обмен (Hammel et al., 1991). Идентификация фталевой кислоты была подтверждена совпадением ГЖХ времени удерживания с таковым стандарта.

Известно, что 9,10-антрахинон занимает центральное положение в структурах красителей, так называемого, антрахинонового типа. Нами была исследована деградация ряда красителей, содержащих конденсированные ароматические кольца и заместители ароматической и неароматической природы, Р. ostreatus Dl при культивировании на среде Кирка. Обнаружено, что в этих условиях было обесцвечено 78% ализаринового красного, 71,2% нейтрального красного, 71,4% бутилродамина, 43,8% родамина, 21,9% сафранина и 89,3% эозина через 3 недели культивирования при стартовой концентрации 50 мкМ. Данных об обесцвечивании этих красителей грибами белой гнили в доступной нам литературе не обнаружено. Полученные данные показывают, что Р. ostreatus Dl обладает способностью деградировать не только ПАУ, но и другие соединения, содержащие конденсированные кольца.

Также активно Р. ostreatus Dl метаболизировал флуорен. При культивировании на среде Кирка его деградация достигала 94% через 14 сут., при этом среда окрашивалась в желтый цвет из-за образования соответствующих хинонов. Окрашивание не исчезало при увеличении времени инкубации гриба. Хроматографическое исследование экстрактов культурапьной жидкости показало наличие двух метаболитов. Сравнение ГЖХ и ВЭЖХ времен удерживания этих веществ с таковыми стандартных соединений позволило нам идентифицировать их как 9-флуоренол и 9-флуоренхинон. Процесс деградации флуорена в данных условиях сопровождался продукцией единственного лигнинолитического фермента - лакказы. Электрофорез в неденату-рирующих условиях выявил наличие двух дополнительных полос с лакказной активностью, отсутствующих в контрольном варианте, как это было обнаружено в присутствии двух других исследованных ПАУ.

Исследование деградации флуорена на богатой среде для базидиомицетов показало, что исходное вещество и/или продукты его деградации не были токсичными для гриба и не инги-бировали прирост мицелия. Деградация флуорена в этих условиях проходила более активно и достигала почти 100% уже через 7 сут. культивирования. Так же как и при культивировании на среде Кирка деградация этого ПАУ происходила с образованием 9-флуоренола и 9-флуоренхинона. Однако в данных условиях эти вещества не накапливались и метаболизирова-лись дальше и, также как и в случае антрацена, было выявлено присутствие фталевой кислоты.

Процесс деградации флуорена в данных условиях сопровождался продукцией обоих лигнино-литических ферментов, как это было показано для фенантрена и антрацена.

Деградация ПАУс четырьмя конденсированными кольцами P. ostreatus D1

На среде Кирка деградация пирена P. ostreatus D1 составляла 46,0% за 14 сут. Первые этапы сопровождались образованием токсичных метаболитов, ингибирующих рост гриба. Эти метаболиты затем деградировались и вес мицелия в контрольном и экспериментальном вариантах выравнивались к концу эксперимента. Около 65,6% пирена было метаболизировано за 3 недели, и сопровождалось накоплением пирен-4,5-дигидродиола (по данным ГЖХ и ВЭЖХ). В этих условиях на протяжении всего времени культивирования продуцировалась только лакказа.

В то же время на богатой среде для базидиомицетов около 89,8% исходного пирена было метаболизировано за 3 недели культивирования без накопления пирен-4,5-дигидродиола. ТСХ позволила выявить пять метаболитов. Хромато-масс-спектрометрия продукта с Rf=0,86 и ГЖХ временем удерживания 11,23 мин показала наличие молекулярного иона с m/z 177(М+) и фрагментов ионов с m/z 175 (М+-2Н), 151 (М+-С2Н2), 75 (М^т) и 88 (М++). Эти данные позволили предположить наличие трехкольцевой структуры «фенантрена», предположительно соответствующей фенантровой кислоте (Hadibarata et al., 2013). Максимальное количество этого вещества обнаружено на 7 сут. культивирования. Затем оно полностью разрушалось с образованием нового метаболита (ГЖХ время удерживания 11,98 мин), масс-спектр которого включал молекулярный ион с m/z 254(М+) и фрагменты ионов с m/z 253 (М+>-Н), 235 (М+»-Н20), 222 (М+>-СН20Н), 204 (М+--С4Н803), 169, 153 (М+--СН30-С4Н50), 148(М+»-С4Н803), 69 и 55. Третий метаболит был также выделен препаративной ТСХ (Rf=0,29). Сравнение величины Rf на ТСХ, времени удерживания на ГЖХ и спектра поглощения этого вещества с аналогичными характеристиками стандарта позволили нам идентифицировать его как фталевую кислоту. На рисунке 5 представлена гипотетическая схема метаболизма пирена грибом P. ostreatus D1, предложенная нами на основании идентификации метаболитов. Следует отметить, что образование продукта, имеющего трехкольцевую структуру фенантрена (предположительно фенантровая кислота) обнаружено нами впервые и позднее подтверждено Hadibarata с соавторами (2013).

Исследования продукции внеклеточных ферментов на богатой среде для базидиомицетов показали, что в отличие от минеральной среды, в этих условиях пирен и/или продукты его деградации индуцировали и лакказу, и пероксидазу, включая образование новых форм, аналогичных обнаруженным нами ранее.

До настоящего времени деградация флуорантена лигнинолитическими грибами остается малоизученной и обнаружена у трех видов грибов: /. lacteus, P. ostreatus и Т. versicolor. Исследование деградации этого ПАУ P. ostreatus D1 показало, что при культивировании на среде Кирка флуорантен ингибировал рост мицелия гриба. Вместе с тем деградация флуорантена была высокой и через три недели достигала 96,6%. ТСХ позволила выявить метаболит с Rf=0,90.

В этих условиях в присутствии флуорантена, так же как и в присутствии других ПАУ, культу-ральная жидкость приобретала желтый цвет, который сохранялся на протяжении всего времени эксперимента. По-видимому, одним из наиболее вероятных продуктов деградации флуорантена может быть соответствующий хинон. Также как и в случае других исследованных нами ПАУ, деградация флуорантена на среде Кирка сопровождалась продукцией только лакказы.

фтапевая кислота

Рисунок 5 - Гипотетическая схема метаболизма пирена Р. ойгеашз 01

На богатой среде для базидиомицетов флуорантен и/или продукты его деградации оказались не токсичными для Р. оьКеаЫз Было обнаружено, что уже к концу первой недели инкубации гриб метаболизировал 89,2% исходного вещества. Обнаружено, что в этих условиях деградация флуорантена сопровождалась продукцией лакказы и пероксидазы.

По данным литературы менее всего изучена деградация высокотоксичного четырехколь-цевого ПАУ хризена, растворимость которого не превышает 0,002 мг/л. До настоящего времени основные исследования проводятся при культивировании грибов белой гнили в почве. К началу наших экспериментов не было обнаружено сведений ни о минерализации этого субстрата, ни об идентификации продуктов его деградации. Практически ничего не было известно о продукции лигнинолитических ферментов в присутствии хризена.

Нами обнаружено, что независимо от условий культивирования Р. озКеаЫх 01 активно метаболизировал хризен, уже к 7 сут. в среде определялось не более 5% исходного вещества. На среде Кирка убыль хризена сопровождалась желтым окрашиванием среды, которое сохранялось на протяжении всего времени эксперимента, и исчезало при добавлении восстановителя

(дитионита), что говорит о возможном присутствии хиноновых интермедиатов. ТСХ позволила нам выявить наличие единственного метаболита, который присутствовал до конца эксперимента. ВЭЖХ показала исчезновение пика хризена и появление пика продукта. В данных условиях нами была обнаружена продукция одного лигнинолитического фермента - лакказы на протяжении всего времени эксперимента.

При культивировании Р. ostreatus Dl на богатой среде для базидиомицетов были выявлены три метаболита. Метаболит I по Rf на ТСХ, ВЭЖХ времени удерживания и спектру поглощения соответствовал таковому, выявленному при культивировании гриба на среде Кирка. Однако в этих условиях он присутствовал только до 14 сут., когда в среде культивирования выявлялись еще два метаболита. Один из них по Rf на ТСХ, времени удерживания и спектру поглощения был идентифицирован как фталевая кислота. На богатой среде для базидиомицетов убыль хризена сопровождалась продукцией двух лигнинолитических ферментов: лакказы - в первые сутки и пероксидазы - на более поздних этапах, когда исходное вещество в среде культивирования практически не определялось.

Деградация основных метаболитов ПАУ Р. ostreatus Dl

Исследование деградативной активности Р. ostreatus по отношению к основным, выявленным нами метаболитам ПАУ: фенантрен-9,10-хинону, 9,10-антрахинону, 9-гидроксифлуорену и 9-флуоренхинону, показало, что эти вещества являются токсичными для гриба и в значительной степени ингибируют как образование мицелия, так и продукцию лигнинолитических ферментов. Метаболиты утилизировались грибом только при культивировании на богатой среде (в условиях продукции лакказы и пероксидазы). Фенатрен-9,10-хинон и 9,10-антрахинон деградировались грибом на 52,6 и 68,3% соответственно. Убыль 9-гидроксифлуорена составляла 45,3, а 9-флуоренхинона - 48,0% за 14 сут. культивирования.

Еще два метаболита более «глубокой» деградации ПАУ - 2,2'-дифеновая и фталевая кислоты также метаболизировались грибом. 2,2'-дифеновая кислота использовалась Р. ostreatus Dl независимо от условий культивирования: убыль составляла 40,2 и 63,0% за 14 сут. на среде Кирка и богатой среде для базидиомицетов соответственно. Фталевая кислота также ме-таболизировалась Р. ostreatus Dl независимо от условий культивирования: убыль составляла 65,6 % и 92,4% за 14 сут. на среде Кирка и богатой среде для базидиомицетов соответственно. Анализ данных литературы (Hammel et а!., 1991) и сопоставление с собственными результатами позволили нам предположить, что фталевая кислота, образующаяся в результате деградации ПАУ, может включаться в основной обмен.

Деградация фенантрена и антрацена подстилочным сапротрофом Agaricus sp. F-8

Проанализировав полученные данные, мы предположили, что «глубина» деградации ПАУ может определяться составом лигнинолитического ферментного комплекса продуцируемого грибом: накопление хиноновых метаболитов в условиях продукции лакказы, образование

и последующая утилизация хинонов в условиях продукции лакказы и пероксидазы. Для проверки этого предположения нами был использован подстилочный сапротроф Аёапсиз ер. Р-8, продуцирующий в условиях погруженного культивирования единственный лигнинолитический фермент — лакказу.

Деструктивную активность гриба по отношению к трехкольцевому ПАУ - фенантрену определяли на богатой среде для базидиомицетов. Было обнаружено, что гриб метаболизировал до 78% фенантрена за 7 сут. инкубации без значительной сорбции на мицелии. Хроматографи-ческие методы позволили выявить и идентифицировать метаболит, соответствующий стандарту - фенантрен-9,10-хинону.

В этих же условиях Л^апсиз ер. Р-8 метаболизировал до 80% антрацена за 7 сут. инкубации. Хроматографические методы позволили идентифицировать основной продукт деградации антрацена - 9,10-антрахинон, который накапливался в процессе культивирования. В течение всего времени эксперимента также была выявлена продукция единственного лигнинолити-ческого фермента - лакказы независимо от присутствия ПАУ в среде культивирования.

Продукция эмульгирующего вещества в процессе деградации ПАУ Р. ои1геа1и$ 01

Растворимость ПАУ в водных растворах очень низкая (0,003-1,3 мг/л), и биодоступность этих соединений может быть лимитирующим фактором для микробной атаки. Несмотря на то, что деградация ПАУ лигнинолитическими грибами широко изучается, только незначительная часть исследований посвящена проблеме биодоступности этих субстратов для грибных клеток.

На богатой среде для базидиомицетов деградация всех исследованных нами ПАУ и ряда грибных и бактериальных метаболитов, включая а-гидрокси-/?-нафтоевую, 2,2'-дифеновую и фталевую кислоты, грибом Р. а$1геаШ.ч Б1 сопровождалась образованием пены. Мы предположили, что ее образование может быть следствием продукции биосурфактанта. По-видимому, это вещество небелковой природы, так как концентрация белка в среде культивирования без ПАУ и среде с ПАУ была одинаковой и составляла около 80 мг/л.

Эмульгирующую активность среды исследовали через 20 сут. культивирования гриба. В контрольном варианте было отмечено только следовое образование пены, при этом эмульгирующая активность через 24 ч (Е24) не превышала 1%. Присутствие ПАУ увеличивало эмульгирующую активность (Е48) среды культивирования от 2 до 48 раз. Наименее растворимый ПАУ -хризен увеличивал ее до 48,4%, тогда как наиболее растворимый - фенантрен - только в 2 раза (Рисунок 6). Кроме того, некоторые метаболиты ПАУ (а-гидрокси-/?-нафтоевая, 2,2'-дифеновая и фталевая кислоты) увеличивали эмульгирующую активность среды до 52,2% (а-гидрокси-/?-нафтоевая кислота). Была обнаружена обратная зависимость эмульгирующей активности от растворимости этих веществ.

0,|£ i

А - трехкольцевые ПАУ (ANT - антрацен, FLU - флуо-рен, РНЕ - фенантрен), Б - четырехкольцевые (CRY — хризен, PYR - пирен, FLA - флуорантен). В — продукты деградации ПАУ (HYDNAPH - а-гидрокси^-нафтоевая кислота. DIPH —2,2'-дифеновая кислота. РНТН — фталевая кислота).

Рисунок 6 — Зависимость эмульгирующей активности среды от растворимости веществ: гистограмма - эмульгирующая активность, график - растворимость

Полученные данные показывают, что Р. ostreatus DI продуцирует биосурфактант в ответ на присутствие в среде культивирования ПАУ и/или продуктов их деградации. На основании собственных данных и сравнения их с литературными, можно предположить три функции био-сурфактанта: (а) увеличение растворимости этих соединений; (б) стимулирование продукции внеклеточных лигнинолитических ферментов при культивировании гриба в условиях перемешивания; (в) участие в реакциях, катализируемых лигнинолитическими ферментами.

2. Внеклеточные формы лигнинолитических ферментов

Для определения роли в метаболизме ПАУ лакказы и пероксидазы Р. ostreatus DI необходимы были их очистка и характеристика. Выявленное нами временное разделение продукции ферментов (на 5-6 сут. - в основном лакказа, через 4 недели культивирования - в основном пе-роксидаза) значительно упростило процедуру их очистки. Для получения элекгрофоретически гомогенных препаратов нами была разработана схема очистки, включающая фракционирование сульфатом аммония, анионообменную хроматографию и гель-фильтрацию. Электрофоретически гомогенная гибридная пероксидаза В. fumosa предоставлена польскими коллегами.

Синие лакказы Р. ostreatus DI

Лакказы (ЕС 1.10.3.2, п-дифенол: кислород оксидоредуктаза) принадлежат к группе синих медьсодержащих оксидаз и катализируют окисление орто- и пара-дифенолов, аминофено-лов, полифенолов, ароматических аминов, восстанавливая при этом кислород воздуха до воды.

Обнаружено, что P. ostreatus D1 в зависимости от условий культивирования продуцирует от 3 до 5 форм лакказы. Для их полного разделения была использована ионообменная хроматография на колонке Mono Q в системе FPLC (Рисунок 7). Лакказа-1 доминировала по активности, ее выход составлял 41,4%.

Электрофоретически гомогенная лакказа-1 представляла собой мономер с молекулярной массой, по данным электрофореза в денатурирующих условиях, 64 кДа, по данным гель-фильтрации на колонке Sephacryl S-200 - 65,4 кДа. Концентрированный препарат фермента был синего цвета, спектр его поглощения содержал характерные для грибных лакказ максимумы при 330 и 610 нм. Соотношение поглощения при 280 и 610 нм (Агво/Абш) составляло 18,5, что говорит о высокой степени его очистки.

2 3 4 5

На графике: 1 — лакказа-1; 2 - лакказа-2; 3 — лакказа-3: на элекгрофореграмме Б (неденату-рирующие условия): 1 — лакказа-1; 2 и 3 - лак-каза-2; 4 - лакказа-3; 5 — грубый препарат лак-фракции каз; на электрофореграмме В (денатурирующие

условия): 1 — белки-маркеры молекулярной массы, 2 — лакказа-1

Рисунок 7 - Ионообменная хроматография (А) и электрофореграммы (Б,В) лакказ Р. ОБи-еаЫэ

Лакказа-1 проявляла активность в ряду рН 3,0-8,5 с максимумами при 4,5 для реакции окисления АБТС, 7,0 - сирингальдазина, 5,5 - 2,6-диметоксифенола, 6,5 - пирокатехина и 6,0 -2,7-диаминофлуорена. Для этих субстратов были определены Км и \^т1ах и показано, что наибольшим сродством фермент обладает по отношению к сирингальдазину - тестовому субстрату лакказ (Таблица 1).

Таблица 1 - Кинетические константы лакказы-1 Р. оэГгеа^я

Субстрат рН Км, мМ Vmax, Ед./мг kcat? С

АБТС 4,5 0,159±0,003 55,72±0,003 59,5

Сирингапьдазин 7,0 0.0075±0,0004 15,63±0,023 16,7

2,6-Диметоксифенол 5,5 0,14±0,004 61,3±0,33 65,5

Пирокатехин 6,5 2,81±0,12 28±0,12 29,9

2,7-Диаминофлуорен 6,0 0,025±0,001 25±0,14 26,7

Лакказа-1 окисляла 1-гидроксибензотриазол, но скорость реакции была невысокой. Рядом авторов показана способность лакказ из разных источников окислять Мп2+ в Мп3+ в присутствии некоторых хелаторов марганца, таких как оксалат, малонат и пирофосфат (НбГег ег а1.,

1999; Schlosser et al., 2002). Нами была обнаружена подобная способность у лакказы-1. Скорость окисления Мп2+ в присутствии малоната превышала таковую в присутствии пирофосфата почти в 2 раза.

Обнаружено, что лакказа-1 окисляла ПАУ только в присутствии медиатора, в роли которого в наших исследованиях выступал АБТС - один из наиболее доступных субстратов этого фермента. 1 Ед./мл лакказы-1 окисляла только антрацен 91% за 2 сут. инкубации. Увеличение времени инкубации до 10 сут. приводило к окислению и других исследованных субстратов (%): фенантрена - на 72,0, флуорена - на 53,5, пирена - на 65,5 и перилена - на 73,8. Флуорантен оставался интактным. Одновременное увеличение концентрации фермента и времени реакции приводило также к окислению и этого вещества (Рисунок 8). В качестве основных продуктов реакции методами ГЖХ и ВЭЖХ идентифицированы соответствующие хиноны.

6,97 ev 7,43 eV 7,43 eV 7,89 eV 7,95 eV 8,03 eV

ANT - антрацен, РНЕ - фенантрен, FLU — флуо-рен, FLA — флуорантен, PYR - пирен, PER - перилен

Рисунок 8 - Окисление ПАУ лакказой-1 (10 Ед./мл)

РЕЯ ANT PYR FLU FLA РНЕ

Долгое время считали, что каталитическая активность системы лакказа-медиатор ограничена потенциалом ионизации (1Р) субстрата, который не может превышать 8,0 eV. Однако Böhmer с соавторами (1998) показали, что окисление фенантрена системой лакказа/1-гидроксибензотриазол возможно в присутствии ненасыщенных липидов как результат сопряжения двух реакций: перокисления липидов и окисления фенантрена. Нами было обнаружено лишь следовое (10,6%) окисление фенантрена парой лакказа-1/АБТС без детергента в реакционной смеси. Внесение детергентов приводило к значительной убыли этого ПАУ: в присутствии твин-80 - 49,2 и в присутствии АОТ - 72,2% в течение 10 сут. Наибольшее окисление в присутствии АОТ явилось неожиданностью, поскольку это не может объясняться сопряжением с реакцией перокисления липидов, так как АОТ не содержит в своей структуре ненасыщенных углеводородных цепей.

При сравнении активности лакказы по отношению к трехкольцевым ПАУ (антрацену и флуорену) в присутствии разных медиаторов (АБТС и 1-гидроксибензотриазол) было обнаружено, что АБТС является лучшим медиатором окисления антрацена. Процент окисления антрацена в присутствии АБТС превышал таковой в присутствии 1 -гидроксибензотриазола почти в

1,5 раза. С другой стороны, обнаружено, что деградация флуорена лакказой-1 была выше в присутствии 1-гидроксибензотриазола, чем с АБТС.

Известно, что некоторые природные ароматические соединения могут играть роль синтетических медиаторов в реакциях окисления ПАУ (Johannes and Majcherczyk, 2000). Мы предположили, что некоторые интермедиа™ окисления ПАУ также могут служить природными медиаторами. В таком случае, смесь ПАУ, один из которых легко окисляется лакказой, другой -трудно, будет окисляться быстрее, чем ее отдельные компоненты. Нами было установлено, что смесь антрацена и пирена окислялась лакказой-1 быстрее, чем отдельные ее компоненты. Вероятно, в данном случае в реакционной смеси в качестве медиатора присутствовали два соединения: АБТС - синтетический и продукт окисления антрацена (9,10-антрахинон) - природный. В результате этого реакция окисления проходила быстрее, чем в присутствии только АБТС.

Изучение активности фермента по отношению к выявленным метаболитам деградации ПАУ показало, что ни дифеновая, ни фталевая кислоты не окислялись лакказой-1.

Две другие выявленные нами лакказы Р. ostreatus Dl (лакказы-2 и -3) присутствовали в минорных количествах, что затрудняло их очистку и характеристику. По данным электрофореза в денатурирующих условиях оба фермента были гомогенными белками с молекулярными массами 60,5 кДа.

Лакказы-2 и -3 проявляли сходные каталитические свойства и значительно отличались от лакказы-1. рН-оптимумы для обоих ферментов совпадали и составляли 3,5 для АБТС и 5,5 для о-дианизидина. Кинетические константы для реакции окисления АБТС составляли: для лакказы-2 Км=0,8 мМ и Vmax=100 Ед./мг, для лакказы-3 Км=0,32 мМ и Vmax=221,9 Ед./мг; для окисления о-дианизидина лакказой-3: Км=1,1 мМ и Vmax=4,7 Ед./мг. Обнаружено, что оба фермента не окисляли сирингальдазин - тестовый субстрат грибных лакказ, кроме того, не обнаружено активности по отношению к пирокатехину, л-фенилендиамину и 2,6-диметоксифенолу во всем исследованном диапазоне pH.

Лакказа-3 окисляла ПАУ, содержащие 3 и 4 ароматических кольца как в присутствии медиатора (АБТС), так и напрямую. При этом наличие АБТС в реакционной смеси незначительно увеличивало скорость реакции (Таблица 2).

Таблица 2 - Окисление ПАУ лакказой-3

Лакказа-3 Окисление, %

-АБТС + АБТС

ANT РНЕ FLU PYR FLA CHR ANT РНЕ FLU PYR FLA CHR

53,6 52,1 95,4 55,7 68,6 58,3 66,9 51,5 93,6 67,3 74,1 54,7

Примечание-. ANT - антрацен, РНЕ - фенантрен, FLU - флуорен, PYR - пирен, FLA - флуорантен, CHR — хризен

Таким образом, лакказа-1, выделенная из погруженной культуры Р. Э1, пред-

ставляет собой типичную синюю лакказу, что было подтверждено ее основными молекулярными и каталитическими свойствами. По каталитическим свойствам лакказы-2 и -3 значительно

отличаются от свойств типичных грибных лакказ, что позволяет нам отнести эти ферменты к нетипичным лакказам, описанным ранее у грибов белой гнили (Vares et al., 1992; Palmieri et al., 1997; Позднякова и др., 1999).

«Желтые» лакказы Р. ostreatus DI и Agaricus sp. F-8

Известно, что при культивировании на природных лигнин содержащих субстратах лиг-нинолитические грибы могут продуцировать так называемую «желтую» форму лакказы, активный центр которой предположительно модифицирован продуктами деградации лигнина. Основным результатом подобной модификации является приобретение этими ферментами способности окислять нефенольные субстраты без медиатора в реакционной смеси (Леонтьевский и др., 1999).

Из твердофазной культуры Р. ostreatus DI нами была выделена «желтая» форма лакказы (Рисунок 9). Это медьсодержащий фермент с молекулярной массой 64 кДа, его концентрированный препарат (0,5-0,8 мг/мл) был желто-коричнево го цвета. Спектр поглощения не содержал максимума в области 610 нм, характерного для типичных синих лакказ.

64 кДа

24 кДа

20.1 кДа

14.2 кДа

Рисунок 9 - Ионообменная хроматография (А) и электрофореграмма в денатурирующих условиях (Б) «желтой» лакказы Р. оз1геаШз 01

Определены рН-оптимумы и каталитические константы (Ута* и Км) для сирингальдази-на, пирокатехина, АБТС, 2,6-диметоксифенола, и-фенилендиамина, УУ-ацетил-и-фенилендиамина. Обнаружено, что фермент без медиатора окислял нефенольное ароматическое вещество - вератриловый спирт (Таблица 3). Как уже упоминалось выше, грибные лакказы могут катализировать окисление Мп2+ в Мп3+ в присутствии некоторых хелаторов. Нами была обнаружена подобная способность у «желтой» лакказы, при этом скорость окисления Мп2+ в присутствии малоната превышала таковую в присутствии пирофосфата почти в 2 раза. Было обнаружено, что «желтая» лакказа Р. 051геа1ш 01 окисляет 1-гидроксибензотриазол, субстрат, который наряду с АБТС наиболее часто используют в качестве медиатора в реакциях окисления не-фенольных ароматических структур грибными лакказами.

Таблица 3 - Основные кинетические константы желтой лакказы Р. овКесЛю

Субстрат Км, мМ \'\,|:„, Ед./мг ксаь с

Сирингальдазин 0,0087±0,00088 5,71±0,17 365,4

АБТС 0,11±0,0075 11,0±0,29 704

Пирокатехин 3,65±0,53 20,61±1,17 1319

Вератриловый спирт 0,29±0,0064 0,46±0,002 29,4

2.6-Диметоксифенол 0,43±0,02 - -

и-Фенилендиамин 0,66±0,008 - -

ТУ-Ацетил-я-фенилендиамин 6,70±0,085 - -

Гидрохинон н.о. - -

Тирозин н.о. - -

Примечание: н.о. - не окислялось

Была изучена каталитическая активность «желтой» лакказы РЫигоЫэ о.ч(геа1и.ч 01 по отношению к простейшему представителю ПАУ - нафталину и ряду субстратов нафталинового ряда. Фермент не окислял нафталин, однако наличие гидроксильной группы в ароматическом кольце делает его структуру более доступной для окисления. Показано, что положение гидроксильной группы в молекуле также имеет важное значение для каталитической активности, а ее замена на амино-группу (1-нафтиламин) делает субстрат менее доступным для фермента. При окислении а-нафтола образуется окрашенный продукт с максимумом поглощения при 530 нм. Продуктом окисления /?-нафтола был белый нерастворимый преципитат, поэтому окисление этого субстрата фиксировали по снижению поглощения исходного вещества. Положение гид-рокси-группы в ароматическом кольце также оказалось важным для доступности субстрата для фермента. Например нафтол, содержащий гидрокси-группу в а-положении, окислялся в 4 раза быстрее, чем его /?-замещенный аналог (Рисунок 10).

А -а-нафтол (■),/?-нафтол (•), а-нафтиламин (Ж), а-нитрозо-/?-нафтол (▼); Б -а-нафтол (■) Рисунок 10 - Окисление лакказой замещенных нафталинов

Кроме того, было обнаружено, что замена гидрокси-группы (а-нафтол) на аминогруппу (а-нафтиламин) снижает активность лакказы почти в 6 раз. а-Нитрозо-/?-нафтол был наименее доступным субстратом для лакказы среди исследованных нафтолов.

Исследование активности по отношению к субстрату, содержащему гидроксигруппу в а-положении и карбоксигруппу в /^-положении (а-гидрокси-Д-нафтоевая кислота) показало, что лакказа окисляла только 25,9% от исходно добавленных 10 мкМ этого субстрата в течение 10 сут. По-видимому, он является наиболее «жестким» среди всех исследованных субстратов нафталинового ряда.

Мы исследовали каталитическую активность «желтой» лакказы по отношению к некоторым красителям, содержащим в структуре конденсированные ароматические кольца. Было обнаружено, что антрон, содержащий одну хиноновую группу, не окислялся лакказой даже при десятикратном увеличении концентрации фермента. Ализариновый красный, который содержит две хиноновые и две гидроксильные группы, был лучшим субстратом для лакказы (91,2% за 3 ч). Обесцвечивание субстратов, не содержащих хиноновые группы, было очень медленным. В течение 10 сут. оно достигало только 8,5 и 14,7% для акридинового оранжевого и нейтрального красного соответственно. Красители, содержащие ароматические кольца в качестве заместителей, оказались хорошими субстратами для лакказы. Обесцвечивание бутилродамина С, родамина 60, сафранина Т и эозина достигало 70,8, 47,8, 43,2 и 64,8 соответственно.

Обнаружено, что в отличие от синей, «желтая» лакказа окисляла все исследованные ПАУ без синтетического медиатора (%): перилен - 100, антрацен - 95,1, флуорен - 95,9, пирен - 38,9. Для окисления фенантрена (87,4%) и флуорантена (49,0%) потребовалось увеличить время инкубации до 10 сут (Рисунок 11).

,6,97 eV 7,43 eV 7,43 eV 7,89 eV 7.95 eV 8,03 eV

I I

ANT - антрацен, РНЕ - фенантрен, FLU - флуорен FLA - флуорантен, PYR - пирен, PER - перилен

Рисунок 11 - Окисление ПАУ «желтой» лакказой Р. ояггеаЫз 01

РГЯ Р1У НА РНЕ РЕВ

Использование ВЭЖХ показало наличие дополнительных пиков, соответствующих продуктам реакции. Так же как и в случае синей лакказы, сравнение ВЭЖХ времен удерживания выявленных продуктов реакции с таковыми стандартных соединений позволило нам идентифицировать 9,10-антрахинон как продукт окисления антрацена, фенантрен-9,10-хинон - фенантрена и 9-флуоренхинон - флуорена.

Мы исследовали влияние различных детергентов на активность «желтой» лакказы по отношению к фенантрену. В отличие от данных Böhmer с соавторами (1998) и наших экспериментов с синей лакказой, было обнаружено, что «желтая» лакказа не требует наличия детергента в реакционной смеси. Убыль фенантрена составляла: в контрольном варианте (без детергента) 73,6, в присутствии твин-80 - 68,8% и в присутствии АОТ - 87,4%. Наибольшее окисление в присутствии АОТ может быть следствием того, что этот детергент лучше сохраняет фермент, что подтверждается нашими предварительными исследованиями. По-видимому, механизмы окисления фенантрена синей и «желтой» формами лакказы различаются.

Мы сравнили активность лакказы по отношению к трехкольцевому ПАУ - антрацену и четырехкольцевым — пирену и флуорантену в присутствии разных медиаторов: АБТС и 1-гидроксибензотриазола. АБТС практически не влиял на окисление антрацена и пирена, но снижал окисление флуорантена почти в два раза. При добавлении к реакционной смеси 1 мМ 1-гидроксибензотриазола, вместо АБТС, было обнаружено снижение окисления антрацена и флуорантена почти в 4 раза. При этом активность по отношению к пирену незначительно увеличивалась. Возможно, полученное снижение активности может быть следствием конкуренции за активный центр фермента фенольного (медиатора) и нефенольного (ПАУ) субстратов. Это предположение требует дополнительной проверки. Таким образом, желтая форма лакказы является более активным окислителем ПАУ, чем ее синий аналог.

Было изучено влияние различных эффекторов на активность лакказы. Ингибирование активности 140 мМ SDS является еще одним тестом на лакказную природу фермента. Известно, что SDS активирует тирозиназу, а на активность лакказы не влияет или незначительно снижает ее (Pomerantz and Murthy, 1974). Обнаружено, что выделенный нами фермент на 100% ингиби-ровался 140 мМ SDS, что также подтверждает его лакказную природу. Лакказу также на 100% ингибировал у?-меркаптоэтанол в концентрации 0,1 мМ. Слабый ингибитор грибных лакказ -ЭДТА (Bollag and Leonowicz, 1984) снижал активность фермента на 60% в концентрации 100 мМ. При сходном в целом характере ингибирования - «сильный» ингибитор полностью подавлял активность фермента, «слабый» - только на 60%, лакказа Р. ostreatus Dl, так же как и «желтая» лакказа гриба белой гнили Partus tigrinus (Позднякова, 1997) была более чувствительна к действию ингибиторов. /?-Меркаптоэтанол полностью подавлял активность «желтой» лаказы Р. ostreaus в концентрации на порядок ниже, чем известных синих лакказ.

Желтая форма лакказы была выделена нами также и из второго исследуемого гриба Agaricus sp. F-8. По результатам электрофореза в денатурирующих условиях молекулярная масса этого фермента составляла около 58,5 кДа (Рисунок 12), а по результатам гель-фильтрации на колонке Sephacryl S-200 - 80,9 кДа. Полученные данные позволяют предположить димерную структуру фермента, аналогичную структурам лакказ, описанных у других представителей рода Agaricus (Wood, 1980). Концентрированный препарат лакказы Agaricus sp.

Б-8 был палево-желтого цвета, в его спектре поглощения отсутствовал характерный для лакказ максимум при 610 нм. Соотношение величин поглощения А28о/А6ю составляло около 96, тогда как для типичных синих лакказ этот параметр не превышает 20.

1 2

1 - маркерные белки, 2 — лакказа

12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 Фракции

Рисунок 12 - Элюция лакказы А^апсия эр. Б-8 с колонки 8ерЬасгу1 8-200 (А) и электрофорез в

денатурирующих условиях (Б)

Были исследованы некоторые каталитические свойства лакказы А§аг1сиз эр. Б-8. рН-оптимум для АБТС составлял 3,5, для 2,6-диметоксифенола - 5,5, для сирингальдазина - 6,0, для пирокатехина - 6,2, для л-фенилендиамина - 5,7 и для а-нафтола - 5,5. Наименьшая величина Км была получена для реакции окисления тестового лакказного субстрата - сирингальдазина (Таблица 4).

Таблица 4 - Каталитические свойства лакказы Agaricus эр. И-8

Субстрат Км, мМ Ушах, ЕД./МГ ксаЬ С

АБТС 0,234±0,014 17,0±0,12 22,9

Сирингальдазин 0,002±0,00018 1,7±0,07 2,3

2,6-Диметоксифенол 0,012±0,0001 2,5±0,14 3,4

Пирокатехин 3,21±0,46 5,8±0,29 7,8

и-Фенилендиамин 0,154±0,013 - -

а-Нафтол 0,854±0,038 - -

Мы исследовали каталитическую активность лакказы Agaricus эр. Б-8 по отношению к ПАУ, содержащим 3 и 4 ароматических кольца. Обнаружено, что, так же как и «желтая» лакказа Р. о81геаШя 01, лакказа Agancus эр. Р-8 окисляла все исследованные ПАУ без медиатора в реакционной смеси (%): фенантрен - 36,6, антрацен - 98,2, флуорен - 68,0, пирен - 91,9, хризен - 83,0, флуорантен - 78,2 за 5 сут. инкубации. ВЭЖХ выявила наличие дополнительных пиков продуктов окисления антрацена, фенантрена и флуорена, со временами удерживания 4,51, 5,04 и 4,33 мин соответственно. Сопоставление времен удерживания этих веществ с таковыми стандартов позволило идентифицировать 9,10-антрахинон как продукт окисления антрацена, 9,10-

фенантренхинон - фенантрена и 9-флуоренон - флуорена.

Таким образом, обнаружено, что в отличие от синих, «желтые» лакказы окисляли все исследованные ПАУ без синтетического медиатора. Окисление фенантрена этими ферментами не требовало ни присутствия медиатора, ни присутствия детергента в реакционной смеси. Впервые для лакказы из грибов рода Agaricus показано окисление ПАУ без медиатора в реакционной смеси с образованием соответствующих хинонов. Таким образом, желтые формы лакказ является более активным окислителем ПАУ, чем их синий аналог.

Пероксидазы Р. ostreatus DI и Bjerkandera fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst.

Вторым внеклеточным ферментом, выявленным в процессе деградации ПАУ Р. ostreatus DI, была пероксидаза. Известно, что грибы рода Pleurotus продуцируют два типа пероксидаз: Mn-зависимые и гибридные (Mester et al., 1998; Ruiz-Duenas et al., 2001). На основании предварительных данных мы предположили, что пероксидаза, продуцируемая Р. ostreatus DI, относится к гибридным пероксидазам. Однако было обнаружено, что пероксидаза обладала не совсем обычными для подобных ферментов свойствами. Так как в доступной нам литературе почти не было сведений об изучении каталитической активности гибридных пероксидаз по отношению к ПАУ, то на первом этапе исследований мы охарактеризовали типичную гибридную пероксидазу из гриба В. fumosa 137 и получили тест-объект для сравнения с пероксидазой Р. ostreatus D1.

Исследованы ингибиторная и субстратная специфичность гибридной пероксидазы В. fumosa. 2,7-Диаминофлуорен, АБТС, вератриловый спирт и сирингальдазин окислялись ферме-том как напрямую, так и хелатированным Мп3+ (Таблица 5).

Таблица 5 - Кинетические константы гибридной пероксидазы В. fumosa

Субстраты рН + Mn¿+ -Mil"

К-м kcat кса/Км К-м к», кса/Км

мМ с'1 MMV мМ с"1 MMV

Сирингальдазин 7,0 0,035 6,1 174,3 0,066 0,22 3,3

2,6-Диметоксифенол* 4,5 0,063 30,0 476,2 0,345 10,6 30,7

2,7-Диаминофлуорен 4,5 0,038 0,83 21,8 0,009 0,19 21,1

7,0 0,27 1,28 4,7 2,3 0,45 0,2

**МгГ* 4,0 0,68 3,9 5,7 - - -

АБТС 3,0 0,86 6,2 7,2 0,48 2,77 5,8

Вератриловый спирт 6,5 0,53 26,8 50,6 3,04 7,08 2,3

Примечание: "(Jarosz-Wilkolazka et al., 2008); **в реакции окисления 2,6-диметоксифенола

«Лучшими» субстратами были сирингальдазин, 2,7-диаминофлуорен и 2,6-диметоксифенол. Величины Км для АБТС, 2,7-диаминофлуорена и сирингальдазина находились в ряду средних величин Км, полученных для окисления различных ароматических субстратов гибридными пероксидазами различных грибов (Яшг-Оиепаз о? а/., 2001). В процессе окисления ферментом 2,7-диаминофлуорена, независимо от наличия Мп2+, выявлена двухфаз-

ная кинетика с кажущимся разделением на микромолярный и миллимолярный ряды (Рисунок 13).

Рисунок 13 - Кривые Михаэлиса-Ментен окисления 2,7-диаминофлуорена гибридной пероксидазой В. fumosa для микромолярных (А) и миллимолярных (Б) концентраций субстрата

Впервые показано ингибирование активности пероксидазы избытком субстрата (АБТС) и обнаружено, что и-аминобензойная кислота - известный ингибитор пероксидаз (http://\v ww.sigmaaldrich.com/life-science/biochemicals/biochemical-products.html) является субстратом гибридной пероксидазы (Рисунок 14).

А Б

Активность, Ед./мг /\ ! \ \ t. 0,5 г И 0.4-S ^ 03 я / /

1 W g 02 О Í

12 3 1 < 10 20 30 40 50

АБТС, мМ и-Аминобензойная кислота, мМ

Рисунок 14 - Зависимость скорости окисления АБТС (А) и и-аминобензойной кислоты (Б) от концентрации субстрата в присутствии Мп2+ (■) и без (•) Мп~+

Гибридная пероксидаза окисляла антрацен, фенантрен, флуорен, пирен, хризен и флуо-рантен (Рисунок 15), методами ГЖХ и ВЭЖХ идентифицированы продукты реакций, включая 9,10-антрахинон, 9,10-фенантренхинон и 9-флуоренон. Охарактеризовав некоторые каталитические свойства гибридной пероксидазы В. fumosa, мы получили тест-объект для сравнения с пероксидазой из Р. ostreatus DI.

ANT - антрацен, РНЕ - фенантрен, FLU - флуорен, PYR - пирен, CUR - хризен, FLA - флуорантен Рисунок 15 - Окисление ПАУ гибридной пероксидазой в присутствии твин-80 (А) и без твин-80 (Б); без Мп2+ (□) и в присутствии Мп2+(и)

Пероксидаза Р. ostreatus Dl проявляла каталитическую активность по отношению к ряду субстратов как в присутствии Мп2+, так и без него (Рисунок 16). Динамика продукции этого фермента, тестированная по окислению целого ряда субстратов в присутствии Мп2+, совпадала с таковой без Мп2+ в реакционной смеси. Электрофоретический анализ показал наличие только одной полосы при окрашивании геля о-дианизидином как в присутствии Мп2+, так и без него.

^—^

■ - МпС12; • - MnS04

Рисунок 16 - Влияние Мп2+ на окисление 2,6-диметоксифенола пероксидазой Р. ostreatus D1

мМ

Молекулярная масса электрофоретически гомогенного фермента по данным электрофореза в денатурирующих условиях составляла 44,5 кДа, масса, определенная методом гель-фильтрации на колонке 5ерЬасгу1 Б-200 - 42 кДа. Таким образом, выделенный нами фермент является мономером с молекулярной массой 42-44 кДа, что соответствует данным, полученным большинством авторов для гибридных и Мп-зависимых пероксидаз из различных источников. Величины Км и Утах для ряда субстратов, определенные с Мп2+ и без Мп2+, были одного порядка (Таблица 6). Фермент одинаково активно окислял ПАУ, содержащие 3 и 4 ароматических кольца, как в присутствии Мп2+, так и без него.

Таблица 6 - Каталитические свойства пероксидазы Р. ostreatus DI

Субстрат Ку, мМ Vnlax, Ед./мг к»„ с"

-Мп" + Мп" -Mn¿+ + Мп" - Мп + Мп

АБТС 0,066±0,002 0,157±0,02 6,9±0,34 8,0±0,03 4,98 5,77

Сирингальдазин 0,068±0,004 0,053±0,003 4,82±0,28 7,3±0,26 3,48 5,27

2,6-Диметоксифенол 0,31±0,04 0,34±0,021 3,24±0,17 9,01±0,03 2,34 6,50

2,7-Диаминофлуорен 0,026±0,003 0,032±0,003 3,27±0,55 6,52±0,51 2,36 4,70

Н,СЬ* 0,057±0,002 0,058±0,002 - - - -

MnCl, - 0.183±0,016 - 5,92±0,25 - 4,27

MnS04 - 0,052±0,008 - 2,61±0,23 - 1,88

Вератриловый спирт 2,08±0,12 2,36±0,15 0,85±0,073 0,98±0,069 0,61 0,71

ВЭЖХ показала наличие дополнительного пика продукта окисления антрацена со временем удерживания 4,65 мин. По времени удерживания и спектру поглощения этот продукт соответствовал 9,10-антрахинону. При этом внесение Мп2+ в реакционную смесь увеличивало выход реакции от 36,6 до 51,2%. Продукт окисления антрацена по времени удерживания на НРЬС и ГЖХ был идентифицирован как 9,10-антрахинон. Нами впервые была обнаружена активность пероксидазы по отношению к 9,10-антрахинону (Рисунок 17). Эта реакция также была возможна без Мп2+, но ее выход увеличивался почти в 2 раза в присутствии Мп~+. Все тестированные антрахиноновые красители были обесцвечены пероксидазой как в присутствие Мп2+, так и без него.

■ - в присутствии Мп2+; я - без Мп2т

Рисунок 17 — Окисление антрацена (ANT) и 9,10-антрахинона (ANTQ) пероксидазой Р. ostreatus DI

Обесцвечивание красителей пероксидазами Р. ostreatus DI и В. fumosa

Исследование каталитической активности пероксидаз по отношению к красителям, содержащим трехкольцевую структуру антрацена, показало, что оба фермента наиболее активно окисляли красители с хиноновыми группами (ализариновый красный, Acid Blue 62, Basic Blue 22, Reactive Blue 4), тогда как обесцвечивание красителей, не содержащих хиноновые группы (акридиновый оранжевый, нейтральный красный, бутилродамин С, родамин 6G, сафранин Т, эозин), происходило медленно.

Известно, что грибные гибридные пероксидазы способны окислять ароматические соединения двумя способами: напрямую или хелатированным Мп3+ как окисляющим агентом (Ruiz-Duenas et al., 2001, Martinez, 2002, Pogni et al., 2005), поэтому все исследования каталити-

ческой активности гибридных пероксидаз В. fumosa и P. ostreatus были проведены в присутствии МпСЬ и без МпСЬ. Определены рН-оптимумы реакций обесцвечивания ализаринового красного (AR), Acid Blue 62 (АВ62), Basic Blue 22 (BB22), Reactive Blue 4 (F2R) обеим перок-сидазами как в присутствии МпС12, так и напрямую. Они составляли для гибридной пероксида-зы В. fumosa-, рН 3,5 и 3,5 для АВ62, рН 4,5 и 3,5 для ВВ 22, 4,0 и 3,5 для F2R, 4, 5,0 и 6,0 для AR соответственно; для пероксидазы Р. ostreatus DI: рН 3,5 и 3,5 для АВ62, рН 3,0 и 6,0 для ВВ22, 3,5 и 3,5 для F2R, 4,5 и 5,0 для AR соответственно.

Получены кинетические константы (Км и Vmax) реакций обесцвечивания АВ62, ВВ22, F2R и AR для этих ферментов. Показано, что величины Км обесцвечивания АВ62, F2R и AR гибридной пероксидазой В. fumosa подобны, независимо от наличия МпСЬ в реакционной смеси. Вместе с тем, величина Км обесцвечивания ВВ22 этим ферментов напрямую превышала таковую в присутствии МпСЬ почти в 4 раза (Таблица 7). Интересные кинетические данные были получены для пероксидазы Р. ostreatus DI. Величины Км прямого обесцвечивания АВ62, ВВ22 и AR были в 2-6 раз ниже, чем в присутствии МпСЬ, что может свидетельствовать о большем сродстве этого фермента к исследованным красителям по сравнению с гибридной пероксидазой из В. fumosa. Для ализаринового красного выявлен эффект ингибирования активности пероксидазы Р. ostreatus DI избытком субстрата (Рисунок 18).

Таблица 7 - Величины Vmax и Км обесцвечивания красителей пероксидазами В. fumosa и Р. ostreatus DI

Красители В. fumosa Р. ostreatus

+ Mn¿T + Mn¿+

Км, мМ Км, мМ Ут„,Ед./мг Км, мМ Ут1„Ед./мг Км, мМ Утах,Ед./мг

АВ62 0,14±0,026 25,5±1,4 0,17±0,084 32,3±4,9 0,14±0,015 25,5±1,4 0,066±0,0083 16,8±0,8

ВВ22 0,06±0,007 2,0±0,3 0,22±0,025 2,б±0,25 0,39±0,09 24,8±0,4 0,06±0.008 9,3±0,9

F2R 0,05±0,006 13,5±1,3 0,06±0,002 8,1±2,7 0,07±0,008 56,0±7,8 0,16±0,004 82,9±2,0

AR 0,02±0,002 1,7±0,2 0,04±0,007 0,4±0,0б 0,04*±0,003 6,3*±0,03 0,013±0,0004 5,3±0,05

Примечание: *Обнаружено ингибирование избытком субстрата

0,05-

0.04-

Я 0.03-

0.02-

0,01 -

0.00-

Рисунок 18 - Ингибирование обесцвечивания ализаринового красного пероксидазой Р. ostreatus D1 избытком субстрата

Акридиновый оранжевый, нейтральный красный, бутилродамин С, родамин 6в, сафранин Т и эозин были менее доступны для обоих ферментов, реакции их обесцвечивания требовали большего, по сравнению с антрахиноновыми красителями, времени. Показано, что обесцве-

чивание этих красителей гибридной пероксидазой В. flemosa в значительной степени стимулируется МпСЬ. Тогда как подобные реакции пероксидазы из Р. ostreatus DI не зависели от наличия ионов Мп2+, а в ряде случаев (родамин 6G, сафранин Т) МпС12 ингибировал реакцию почти полностью (Рисунок 19).

гибридная пероксидаза В. fumosa т пероксидаза Р. ostreatus DI

Время, сут.

Ал

Время, сут.

□ - без Мп" ; ■ - с Мп Рисунок 19 - Обесцвечивание красителей пероксидазами

Таким образом, сопоставляя данные, полученные для гибридных пероксидаз из разных источников, и сравнивая их с результатами, полученными нами ранее, можно утверждать, что по каталитическим свойствам пероксидаза из В. fumosa представляет собой «типичную» гибридную пероксидазу, тогда как пероксидаза из Р. ostreatus DI обладает необычными для подобных ферментов свойствами.

3. Внутриклеточные и «поверхностные» формы лигнинолитических ферментов Р. ostreatus DI

Многие авторы подтверждают участие внеклеточных лакказ и пероксидаз в деградации ПАУ. На наш взгляд, в этих исследованиях не учитывается еще два важных пула лигнинолитических ферментов. Это ферменты, выявляемые на поверхности грибной клетки («поверхностные») и внутриклеточные. Хотя некоторыми авторами было показано, что лакказы, определяемые на поверхности мицелия и внутри клеток, могут представлять собой внеклеточные формы

перед или в процессе секреции, их некоторые генетические и биохимические характеристики значительно отличаются от свойств внеклеточных ферментов (Schlosser et al., 1997; Nagai et al., 2003; Tetsch et al., 2006). Мы предположили, что лигнинолитические ферменты, по крайней мере, лакказы, определяемые на поверхности мицелия, могут играть важную роль в начальной атаке молекулы ПАУ, прежде всего потому, что для экскреции ферментов во внеклеточную среду необходимо время.

На данном этапе исследований мы не можем однозначно утверждать, что лигнинолитические ферменты, выявляемые на поверхности клетки, связаны с клеточной стенкой или же они включены в полисахаридную капсулу, окружающую поверхность грибных гиф. Для обозначения этого пула ферментов мы приняли условный термин «поверхностные», которым наши немецкие коллеги обозначают аналогичный пул лакказ у водного аскомицета Phoma sp. (Schlosser et al., неопубликованные данные).

На первом этапе был изучен баланс внеклеточных, смываемых с поверхности клеток («поверхностных») и внутриклеточных форм лигнинолитических ферментов в зависимости от условий культивирования и присутствия ПАУ.

Показано, что при культивировании гриба на среде, не содержащей ПАУ, активность внеклеточной лакказы, в зависимости от использованной среды, составляла 66-83, «поверхностной» - 5-20 и внутриклеточной - 9-39%.

Р. ostreatus Dl продуцировал пероксидазу только на среде с пептоном, поэтому баланс форм этого фермента был исследован только на богатой среде для базидиомицетов. Обнаружено, что на 3-5 сут. основная часть пероксидазы (около 83%) выявлялась внутри грибной клетки, тогда как внеклеточная активность составляла не более 13%. В конце эксперимента (4 недели культивирования) около 90% пероксидазы было вне клетки, тогда как внутриклеточная перок-сидаза составляла около 6%. В отличие от лакказы, на поверхности грибной клетки выявлялась только следовая активность пероксидазы.

При культивировании в присутствии ПАУ (антрацен, фенантрен, флуорен и флуорантен) распределение активности этого фермента было аналогичным контрольному варианту. При культивировании гриба в присутствии метаболитов ПАУ (9,10-антрахинон, 9,10-гидроксифенантрен, 9,10-фенантренхинон, 9-гидроксифлуорен и 9-флуоренхинон) не только снижалась общая активность исследованных ферментов, но и менялось соотношение их форм. Так, например, в присутствии хинонов активность внеклеточной лакказы составляла 67-83%, ее поверхностной формы 3-13%, а внутриклеточной 14-20. Эти данные могут косвенно свидетельствовать о проникновении гидроксилированных метаболитов ПАУ в грибную клетку.

Для получения «поверхностной» формы лакказы, мицелий, после удаления активности внеклеточных ферментов, инкубировали в цитрат-фосфатном буфере до полного исчезновения активности ферментов. За 100% принимали активность лакказы, обнаруживаемую в буфере по-

еле первой процедуры отмывки (Рисунок 20). Грубые препараты «поверхностной» лакказы объединяли и использовали для получения этого фермента.

Рисунок 20 - Получение «поверхностной» формы лакказы Р. ostreatusT>\

Электрофорез в неденатурирующих условиях выявил наличие как минимум трех лакказ, соответствующих обнаруженным нами ранее внеклеточным ферментам (Рисунок 21).

А _____ , ~~

Рисунок 21 - Электрофорез в неденатурирующих условиях внеклеточных (А) и «поверхностных» лакказа-1 т ... лакказа-1 (Б) лакказ Р. оз^еаШ О]

лакказа-3 лакказа-2

лакказа-2 лакказа-2а

Общая невысокая активность в значительной степени затрудняла работу с «поверхностными» формами. На данном этапе исследований нам не удалось разделить лакказу-2 и близкую ей форму -2а. При использовании ионообменной хроматографии на колонке MonoQ 1/1 была выделена только «поверхностная» форма лакказы-1. Молекулярная масса фермента, определенная методом гель-фильтрации, составляла около 65 кДа, что соответствует величине, полученной для внеклеточной формы лакказы-1.

Были определены оптимумы pH окисления основных субстратов, они соответствовали величинам, полученным нами ранее для внеклеточной формы лакказы-1. Величины Км для реакций окисления основных субстратов были близки таковым, полученным для внеклеточной лакказы-1. Величины Км для реакций окисления основных субстратов были близки таковым, полученным для внеклеточной лакказы-1 и составляли: 0,148 мМ для АБТС, 0,008 мМ для си-рингальдазина и 0,131 мМ для 2,6-диметоксифенола. Полученные данные показывают, что «поверхностная» форма лакказы-1, так же как и ее внеклеточный аналог, обладает наибольшим сродством к сирингальдазину - тестовому субстрату грибных лакказ. Была исследована каталитическая активность «поверхностной» лакказы-1 по отношению к трехкольцевому ПАУ - антрацену. Обнаружено, что за 7 сут. инкубации фермент окислял около 83% исходного вещества

Циклы

при стартовой концентрации 20 мкМ. ВЭЖХ позволила нам выявить 9,10-антрахинон как основной продукт реакции.

Для получения внутриклеточных лакказ мицелий отмывали буфером, гомогенизировали с кварцевым песком и анализировали на активность этого фермента. Электрофоретический анализ показал наличие пяти форм внутриклеточной лакказы, которые по подвижности соответствовали формам внеклеточной лакказы (Рисунок 22). Использование анионообменной хроматографии позволило получить две формы внутриклеточной лакказы, соответствующие внеклеточным.

Фракции

внеклеточные лакказа-1 (1), -2 (2,3), -3 (4), внутриклеточные лакказа-1 (6), -2 (7), грубые ферментные препараты (5,8)

Рисунок 22 - Наложение профилей элюции вне- (■) и внутриклеточных лакказ (•) с колонки DEAE-Sepharose (А). Электрофорез в неденатурирующих условиях (Б)

Использование гель-фильтрации показало, что в отличие от внеклеточной и «поверхностной» форм внутриклеточные лакказы элюировались с колонки Sephacryl S-200 как два пика активности, молекулярная масса соответствующих белков составляла 80 и 64 кДа. Последующее использование ионообменной хроматографии на Mono Q показало наличие одной формы внутриклеточной лакказы (лакказа-1) в пике с молекулярной массой 80 кДа и двух форм внутриклеточной лакказы в пике с молекулярной массой 64 кДа (лакказы-1 и -2).

рН-Оптимумы внутриклеточных лакказ были определены для различных субстратов. Обнаружено, что во всем исследованном диапазоне рН лакказа-2 не окисляла сирингальдазин и 2,7-диаминофлуорен (Таблица 8). Сравнение полученных ферментов с аналогичными формами внеклеточных лакказ, показало, что в целом рН-оптимумы окисления различных субстратов внутриклеточными лакказами являются более щелочными.

Величины Км, полученные для окисления АБТС лакказой-1 (0,134 мМ) и лакказой-2 (1,28 мМ), различались почти в 10 раз. Обе внутриклеточных лакказы окисляли антрацен только в присутствии АБТС (34,4 и 18,5% соответственно). В обоих случаях ВЭЖХ позволила идентифицировать 9,10-антрахинон как продукт реакции.

Таблица 8 - рН-оптимумы внутриклеточных лакказ

Субстраты pH

Лакказа-1 Лакказа-2

АБТС 5,5 3,5

2,7-Диаминофлуорен 3,6 -

2,6-Диметоксифенол 6,5 6,0

Гваякол 6,5 6,5

Сирингальдазин 6,5 -

Отдельный этап работы был посвящен получению внутриклеточной формы второго лиг-нинолитического фермента — пероксидазы. По данным гель-фильтрации молекулярная масса этого фермента составляла 50 кДа, в отличие от 42 кДа внеклеточной пероксидазы. Активность внутриклеточной пероксидазы без Мп2+ составляла до 94% от активности в присутствии Мп~', что соответствует данным, полученным для ее внеклеточного аналога.

Исследование окисления ПАУ внутриклеточной пероксидазой показало, что без Мп2+ фермент окислял лишь следовые количества всех тестированных субстратов, тогда как внесение Мп2+ в реакционную смесь приводило к значительному окислению всех тестированных ПАУ от 25 (для хризена) до 94% (для антрацена) (Таблица 9). Было показано, что внутриклеточная пероксидаза может окислять антрацен (с образованием 9,10-антрахинона) и 9,10-антрахинон. Убыль этих субстратов составляла 10-12%, добавление Мп2+ в реакционную смесь приводило к увеличению окисления до 20-25%.

Таблица 9 - Окисление ПАУ внутриклеточной пероксидазой

Окисление ПАУ, %

ANT РНЕ FLU PYR CHR FLA

- Мп2+ 68,6±5,2 0 100±2,6 14,6±3,1 12,6±0,8 15,2±2,2

+ Мп2+ 94±2,8 20,5±1,6 !00±2,3 35,4±2,8 24,2±1,9 45,4±2,7

Примечание: ANT - антрацен, РНЕ - фенантрен, FLU — флуорен, PYR - пирен, FLA — флуорантен, CHR - хризен

4. Биотехнологический потенциал лигнинолитических грибов Р. ostreatus DI и Agaricus sp. F-8 для микоремедиации иефтезагрязненной почвы

Реальные природные объекты, как правило, загрязнены не только ПАУ, но и другими углеводородами. В результате скрининга ряда грибов белой гнили и подстилочных сапротро-фов, включая Pleurotus ostreatus, Lentinus edades, Coriolus sp. и Agaricus sp., обнаружено, что скорость роста, плотность мицелия, продукция ферментов и деградация старого нефтяного загрязнения снижалась в ряду Agaricus sp. > Р. ostreatus > L. edodes > Coriolus sp., наиболее активными продуцентами лакказы и пероксидазы были штаммы видов Р. ostreatus и Agaricus sp. Показано, что грибы, активно колонизирующие загрязненную почву и продуцирующие лигни-нолитические ферменты, также являются активными деструкторами нефтяного загрязнения.

Штаммы Р. оя^еаШ были схожи по способности колонизировать почву со старым нефтяным загрязнением и деградировать этот поллютант. Снижение общего содержания углеводородов варьировало от 18 до 28% в стерильной почве и достигало 64% в нестерильной. Оба исследованных штамма Agaricus ер. также активно колонизировали почву и снижали общее содержание углеводородов. Они оказались очень близкими в этих свойствах. Снижение общего содержания углеводородов достигало 32 в стерильной и 75% в нестерильной почве. Присутствие этих грибов в почве ускоряло деградацию старого нефтяного загрязнения почти в два раза по сравнению с почвенной микрофлорой. В то же время грибы ЬепИпив и Соп'о/из эр. Р-1 росли очень медленно, и полная колонизация почвенного образца не была достигнута. Как результат было показано незначительное снижение общего содержания углеводородов в стерильной почве, а в нестерильной эта величина не превышала контрольной (Рисунок 23).

Варианты Варианты

1 - контроль (без гриба), 2 -Р. ostreatus 336, 3 - Р. ostreatus D1, 4 ~ Р. ostreatus D2, 5 -Р. ostreatus D/л, 6 — Р. os-treatus D/o, 7-1. edodes F-249, 8 - i. edades 0779, 9 - L. edades 2T, 10 - L. edodes NY, 11 - Coriolus sp. F-1, 12 -Agaricus sp. F-8, 13 - Agaricus sp. F-17 Рисунок 23 - Снижение общего содержания углеводородов в процессе микоремедиации стерильной (А) и нестерильной (В) почвы со старым нефтяным загрязнением

Активности лигнинолитических ферментов в стерильной и нестерильной почве были подобными. Активность лакказы была несколько выше в стерильных условиях и достигала максимума в течение первых двух недель эксперимента, затем снижалась до минимального уровня, сохраняющегося до конца эксперимента. Тенденция, обнаруженная нами в элиминировании нефтяных углеводородов, сохранялась и в этом исследовании. Грибы, активно колонизирующие загрязненную почву, были активными продуцентами лакказы. Наиболее активными продуцентами лакказы в этих условиях были штаммы Agaricus sp. Поскольку лигнинолитиче-ские грибы являются деструкторами ароматических и полициклических ароматических соединений в различных средах, включая почву, было проведено исследование изменения фракционного состава старого нефтяного загрязнения в процессе микоремедиации. Убыль низко- и высокомолекулярных ароматических соединений в стерильной и нестерильной почве представлена на рисунке 24. Все штаммы Р. ostreatus и Agaricus sp. активно деградировали как низко-, так и высокомолекулярные ароматические соединения. Снижение содержания низкомолекулярных

ароматических соединений варьировало от 42 до 53% для различных штаммов Р. а^геаШ.ч и достигало 60% для штаммов Agaricus эр. в стерильной почве (Рисунок 24). В нестерильных условиях важный вклад в этот процесс вносила почвенная микрофлора.

1-контроль без гриба, 2-Р. ostreatus 336,3-Р. ostreatus DI, 4 - Р. ostreatus D2, 5 — Р. ostreatus D/л, 6 - Р. os-treatus D/o, 1-L. edodes F-249, 8-1. edodes 0779, 9-1. edodes 2T, 10 - L. edodes NY, 11 - Coriolus sp. F-1.

12 -Agaricus sp. F-8, 13 - Agarícus sp. F-17 Рисунок 24 - Убыль низко- (I) и высокомолекулярных (II) ароматических углеводородов в процессе микоремедиации стерильной (А) и нестерильной (Б) почвы со старым нефтяным загрязнением

Подобные данные были получены для высокомолекулярных ароматических соединений. Эта фракция была плохо доступна для почвенной микрофлоры, но все исследованные грибы белой гнили снижали ее содержание как в стерильной, так и в нестерильной почве. Отмечено, что наиболее активные продуценты лигнинолитических ферментов (Р. ostreatus и Agaricus sp.) наиболее активно снижали содержание этой фракции в почве. Полученные данные свидетельствуют о том, что лигнинолитические грибы могут вносить заметный вклад в снижение этих соединений в нестерильной почве (Рисунок 24).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить ряд особенностей и механизмов регуляции деградации ПАУ лигнинолитическими грибами. Начальными продуктами

деградации всех исследованных ПАУ являются соответствующие хиноны. Обнаружено, что «глубина» деградации ПАУ и состав внеклеточного ферментного комплекса, продуцируемого в их присутствии, зависят от условий культивирования. При этом на среде Кирка деградация ПАУ происходит с накоплением соответствующих хинонов и сопровождается продукцией только лакказы на протяжении всего эксперимента. На богатой среды для базидиомицетов, в условиях продукции лакказы и пероксидазы деградация идет дальше с образованием 2,2-дифеновой и фталевой кислот, последняя может включаться в основной обмен. Обнаруженное нами эмульгирующее вещество, по-видимому, может выполнять три функции в процессе деградации ПАУ грибом Р. шгеашз Э1: (а) увеличивать растворимость гидрофобных соединений, (б) стимулировать продукцию внеклеточных ферментов при культивировании гриба в условиях перемешивания, (в) участвовать в окислении гидрофобных соединений, катализируемом лигнинолитическими ферментами. Полученные результаты позволили предположить, что метаболические пути деградации ПАУ могут определяться не только видом гриба-деструктора, но и условиями его культивирования.

Значительный размер молекул ПАУ и их плохая растворимость определяют природу ферментативной системы, катализирующей начальную атаку на эти субстраты. Эта система должна быть внеклеточной и неспецифической. Лигнинолитическая ферментная система грибов белой гнили и подстилочных сапротрофов отвечает таким требованиям. Нами были выделены и охарактеризованы основные лигнинолитические ферменты гриба белой гнили Р. 05-Ъесйш 01 и подстилочного сапротрофа Лgaricus эр. Р-8.

Внеклеточная лакказа-1 Р. оз1геаШ 01, представляет собой типичную синюю лакказу, что было подтверждено ее основными молекулярными и каталитическими свойствами. Показано, что фермент окислял ПАУ только в присутствие синтетических медиаторов. Изучение деградации смеси ПАУ, позволило сделать предположение о том, что продукт окисления более доступного ПАУ может служить медиатором окисления более "жесткого". Обнаружено, что для эффективной деградации фенантрена необходимо наличие детергента в реакционной смеси.

Минорные формы лакказы Р. о.ч1геа1их 01 (лакказы-2 и -3), проявляющие сходные молекулярные и каталитические свойства, являются, по-видимому, изоформами одного фермента. По каталитическим свойствам лакказы-2 и -3 значительно отличаются от свойств типичных грибных лакказ, что позволяет нам отнести эти ферменты к нетипичным лакказам, описанным у грибов белой гнили.

«Желтые» формы внеклеточных лакказ выделены из твердофазных культур Р. ояггеаШ 131 и А^апсш эр. Р-8, охарактеризованы их основные молекулярные и каталитические свойства. Показано, что оба фермента отличаются по молекулярным и каталитическим свойствам от типичных синих лакказ. Так «желтая» лакказа Р. озй-еаШ Р1 без медиатора окисляла нефеноль-ное соединение - вератриловый спирт. Исследование каталитической активности этого фермен-

та по отношению к нафталину и ряду субстратов нафталинового ряда показано, что положение гидроксильной группы в молекуле также имеет важное значение для каталитической активности, а ее замена на аминогруппу (1-нафтиламин) делает субстрат менее доступным для фермента. Обнаружено, что в отличие от синей, «желтая» лакказа Р. ostreatus DI окисляла все исследованные ПАУ без синтетического медиатора. Окисление фенантрена этим ферментом не требовало ни присутствия медиатора, ни присутствия детергента в реакционной смеси. «Желтая» форма лакказы Agaricus sp. F-8, предположительно, имеет двумерную структуру и также катализирует окисление моноароматических и полиароматических соединений, включая ПАУ. Впервые для лакказы из грибов рода Agaricus показано окисление ПАУ без медиатора в реакционной смеси с образованием соответствующих хинонов. Таким образом, «желтые» формы лакказ являются более активными окислителями ПАУ, чем синий аналог.

В ходе исследования ингибиторной и субстратной специфичности гибридной пероксида-зы В. fumosa выявлен целый ряд свойств, ранее неизвестных у подобных ферментов: (а) двухфазная кинетика окисления 2,7-диаминофлуорена с кажущимся разделением на микромолярный и миллимолярный ряды; (б) ингибирование активности пероксидазы избытком субстрата (АБТС); л-аминобензойная кислота является субстратом гибридной пероксидазы. Гибридная пероксидаза окисляла антрацен, фенантрен, флуорен, пирен, хризен и флуорантен, идентифицированы некоторые продукты реакций, включая 9,10-антрахинон, 9,10-фенантренхинон и 9-флуоренон. Охарактеризовав некоторые каталитические свойства гибридной пероксидазы В. fumosa, мы получили тест-объект для сравнения с пероксидазой Р. ostreatus DI.

Выделена и охарактеризована пероксидаза Р. ostreatus DI, по некоторым молекулярным и каталитическим свойствам фермент был подобен Mn-зависимым и гибридным пероксидазам других грибов. Однако активность пероксидазы Р. ostreatus DI по отношению к разным субстратам тестированная без Мп2+ составляла до 80% от активности, тестированной в присутствии Мп2+. Величины Км и Vmax для ряда субстратов, определенные с Мп2+ и без Мп2+, были одного порядка. Фермент одинаково активно окислял ПАУ содержащие 3 и 4 ароматических кольца как в присутствии Мп2+, так и без него. Тестированные антрахиноновые красители были обесцвечены пероксидазой как в присутствие Мп2+, так и без него. Все выше изложенные данные позволяют нам утверждать, что пероксидаза Р. ostreatus DI обладает необычными свойствами, отличающими ее от известных лигнинолитических пероксидаз.

На основании результатов собственных исследований и анализа данных литературы можно предположить, что лигнинолитическая ферментная система играет ключевую роль в начальной атаке молекулы ПАУ в процессе деградации этих соединений грибами белой гнили и подстилочными сапротрофами. Образующиеся метаболиты более растворимы и могут проникать внутрь грибной клетки, где подвергаются действию внутриклеточных ферментов (например, лакказы и пероксидазы). По-видимому, внутриклеточный пул лигнинолитических фермен-

тов может участвовать в их утилизации. Проведенные исследования позволили выявить различия между внеклеточной, «поверхностной» и внутриклеточной формами лигнинолитических ферментов Р. омгемия Ш в каталитических и структурных свойствах. Полученные данные позволяют предположить, что внутриклеточные формы обоих ферментов могут быть каталитически активными предшественниками внеклеточных. По-видимому, малоизученные до настоящего времени формы (поверхностная и внутриклеточная) могут также вносить заметный вклад в деградацию и детоксикацию поллютантов.

В последнее время широко обсуждается способность лигнинолитических грибов метабо-лизировать ПАУ как в стерильной почве, так и в комплексе с природной почвенной микрофлорой. Нами выявлена способность грибов белой гнили и подстилочных сапротрофов метаболи-зировать нефть при интродукции в почву искусственно загрязненную нефтью и почву со старым нефтяным загрязнением. Наиболее активно деградация "жестких" фракций углеводородов нефти происходила при наличии в почве природного ростового субстрата гриба, который необходим для активной продукции им окислительных ферментов, участвующих в процессе деградации этих соединений. Показано, что грибы, активно колонизирующие почву и продуцирующие лигнинолитические ферменты, являются самыми активными деструкторами нефтяного загрязнения в почве. Полученные результаты позволяют считать, что комплекс лигнинолитиче-ский гриб — почвенная микрофлора является перспективным для дальнейших исследований по созданию технологии биоремедиации загрязненных почв, для практического использования могут быть рекомендованы грибы Р. оз&еаШ и Agaricus ер. Р-8.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что деградация трех- и четырехкольцевых ПАУ грибом белой гнили Р. оЯгеаш 01 происходит по одной схеме с образованием хинонов на первом этапе и фталевой кислоты - на последнем. Утилизация фталевой кислоты исследованными грибами предполагает ее включение в основной обмен. Деградация трех-кольцевых ПАУ почвенным сапротрофом Agaricus йр. Б-8 приводит к накоплению соответствующих хинонов.

2. Показано, что деградация ПАУ Р. о.ч1геа1ш- 01 сопровождается продукцией лакказы на первых этапах, приводящих к образованию хинонов, и пероксидазы - на более поздних, приводящих к утилизации образовавшихся метаболитов. Впервые выявлена зависимость «глубины» деградации ПАУ от состава комплекса лигнинолитических ферментов, продуцируемых грибом в процессе деградации: накопление хинонов в условиях продукции лакказы и образование и последующая утилизация хинонов в условиях продукции лакказы и пероксидазы.

3. Впервые обнаружена продукция эмульгирующего вещества в процессе деградации ПАУ Р. озй-есйиз 01, коррелирующая с растворимостью исследованных соединений и продукцией внеклеточной пероксидазы этим грибом.

4. Выделены и охарактеризованы внеклеточные формы лакказы и пероксидазы P. os-treatus Dl. Обнаружено, что оба фермента могут окислять ПАУ, что предполагает их взаимозаменяемость в начальной атаке молекулы. Пероксидаза окисляет метаболиты деградации ПАУ, тогда как для лакказы эти соединения не доступны.

5. Впервые из твердофазных культур Р. ostreatus Dl и Agaricus sp. F-8 выделены и охарактеризованы внеклеточные «желтые» формы лакказ, выявлена их способность окислять ПАУ без медиатора в реакционной смеси.

6. Обнаружено, что по каталитическим свойствам (субстратная специфичность, зависимость от ионов Мп2+) пероксидаза Р. ostreatus Dl отличается от типичной гибридной пероксидазы В. fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst, и других известных лигнинолитических пероксидаз.

7. Впервые выделены и частично охарактеризованы «поверхностные» и внутриклеточные формы лигнинолитических ферментов Р. ostreatus Dl. Обнаружено, что молекулярные и каталитические свойства внеклеточных и «поверхностных» форм лакказ совпадают и отличаются от таковых внутриклеточных форм лакказ. Показано, что внутриклеточные формы лигнинолитических ферментов являются каталитически активными предшественниками «поверхностных» и внеклеточных. «Поверхностные» формы лакказы могут катализировать начальную атаку молекулы ПАУ, когда активности внеклеточных форм еще недостаточно.

8. Изучена способность 12 штаммов грибов белой гнили и подстилочных сапротрофов, относящихся к видам Pleurotus ostreatus, Lentinus edades, Coriolus sp. и Agaricus sp., колонизировать почву с нефтяным загрязнением, продуцировать лигнинолитические ферменты и также активно деградировать нефтепродукты. На основании проведенных исследований как перспективные для разработки технологии микоремедиации предложены штаммы Р. ostreatus Dl и Agaricus sp. F-8.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Главы в монографиях:

1. Pozdnyakova, N.N. Chapter 20: Production of ligninolytic enzymes by white-rot fungi during bioremediation of oil-contaminated soil / N.N. Pozdnyakova, E.V. Dubrovskaya, O.E. Makarov, V.E. Nikitina, O.V. Turkovskaya // Soil Enzymology, Soil Biology 22 / Ed. G. Shukla and A. Varma- Berlin Heidelberg: Springer-Verlag. - 2011.-DOI 10.1007/978-3-642-14225-3_20. - P. 363-377.

2. Pozdnyakova, N.N. Chapter 1: Ligninolytic peroxidases: Unique properties and biotechnological potential / N. Pozdnyakova, K. Wlizlo, K. Szalapata, A. Jarosz-Wilkolazka, O. Turkovskaya // Peroxidases: biochemical characteristics, functions and potential applications / Ed. L. Bogaert and N. Coppens - Nova Science Publishers. - 2013. - ISBN: 978-1-62808-261-6. - P. 1-54.

Экспериментальные статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

3. Pozdnyakova, N.N. Catalytic properties of yellow laccase from Pleurotus ostreatus D1 / N.N. Pozdnyakova, J. Rodakiewicz-Nowak, O.V. Turkovskaya // Molecular Catalysis B: Enzymatic. -2004.-Vol. 30.-P. 19-24.

4. Rodakiewicz-Nowak, J. Water-in-oil microemulsions as the reaction medium for the solventsensitive yellow laccases / J. Rodakiewicz-Nowak, N.N. Pozdnyakova, O.V. Turkovskaya // Biocatalysis and Biotransformation. - 2005. - Vol. 23, N 3/4. - P. 271-279.

5. Плешакова, E.B. Получение нефтеокисляющего биопрепарата путем стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры / Е.В. Плешакова, Н.Н. Позднякова, О.В. Турковская // Прикл. биохим. микробиол. - 2005. - Т. 41, № 6. - Р. 634-639.

6. Позднякова, Н.Н. Желтая лакказа гриба Pleurotus ostreatus D1: очистка и характеристика / Н.Н. Позднякова, О.В. Турковская, Е.Н. Юдина, Я. Родакевич-Новак // Прикл. биохим. и микробиол. - 2006. - Т. 42, № 1. - Р. 63-69.

7. Pozdnyakova, N.N. Oxidative degradation of polyaromatic hydrocarbons catalysed by blue laccase from Pleurotus ostreatus D1 in the presence of synthetic mediators / N.N. Pozdnyakova, J. Rodakiewicz-Nowak, O.V. Turkovskaya, J. Haber // Enzyme and Microbial Technol. - 2006. -Vol. 39, N6.-P. 1242-1249.

8. Pozdnyakova, N.N. Oxidative degradation of polyaromatic hydrocarbons and their derivatives catalyzed directly by the yellow laccase from Pleurotus ostreatus D1 / N.N. Pozdnyakova, J. Rodakiewicz-Nowak, O.V. Turkovskaya, J. Haber // J. Molecular Catalysis B: Enzymatic. - 2006. -Vol.41,N 1.-P. 8-15.

9. Позднякова, Н.Н. Биоремедиация нефтезагрязненной почвы комплексом гриб Pleurotus ostreatus - почвенная микрофлора / Н.Н. Позднякова, В.Е. Никитина, О.В. Турковская // Прикл. биохим. и микробиол. - 2008. - Т. 44, № 1. - Р. 69-75.

10. Ветчинкина, Е.П. Ферменты ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes F-249 в процессе морфогенетического развития / Е.П. Ветчинкина, Н.Н. Позднякова, В.Е. Никитина // Микробиология. - 2008. - Т. 77, № 2. - Р. 171-177.

11. Vetchinkina, Е.Р. Laccase and lectin activities of intracellular proteins produced in a submerged culture of the xylotrophic basidiomycete Lentinus edodes / E.P. Vetchinkina, N.N. Pozdnyakova, V.E. Nikitina // Curr. Microbiol. - 2008. - Vol. 57, N 4. - P. 381-385.

12. Muratova, A. Oxidoreductase activity of sorghum root exudates in a phenanthrene-contaminated environment / A. Muratova, N. Pozdnyakova, S. Golubev, L. Wittenmayer, O. Makarov, W. Merbach, O. Turkovskaya // Chemosphere. - 2009. - Vol. 74. - P. 1031 -1036.

13. Nikiforova, S.V. Emulsifying agent production during PAH degradation by white rot fungus Pleurotus ostreatus D1 / S.V. Nikiforova, N.N. Pozdnyakova, O.V. Turkovskaya // Curr. Microbiol. - 2009. - Vol. 58, N 6. - P. 554-558.

14. Pozdnyakova, N.N. Influence of PAHs on ligninolytic enzymes of the fungus Pleurotus ostreatus D1 / N.N. Pozdnyakova, S.V. Nikiforova, O.V. Turkovskaya // Cent. Eur. J. Biol. - 2010. - Vol. 5, N 1. - P. 83-94.

15. Pozdnyakova, N.N. Influence of cultivation conditions on pyrene degradation by the fungus Pleurotus ostreatus D1 / N.N. Pozdnyakova, S.V. Nikiforova, O.E. Makarov, M.P. Chemyshova, K.E. Pankin, O.V. Turkovskaya // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - Vol. 26. - P. 205-211.

16. Никифорова, C.B. Биоконверсия хризена грибом белой гнили Pleurotus ostreatus D1 / C.B. Никифорова, Н.Н. Позднякова, O.E. Макаров, М.П. Чернышева, О.В. Турковская // Микробиология. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 481-485.

17. Позднякова, Н.Н. Влияние полициклических ароматических углеводородов на продукцию лакказы грибом белой гнили Pleurotus ostreatus D1 / Н.Н. Позднякова, C.B. Никифорова, O.E. Макаров, О.В. Турковская // Прикл. биохим. и микробиол. - 2011. - Т. 47, № 5. - С. 595601.

18. Pozdnyakova, N.N. Involvement of the ligninolytic system of white-rot and litter-decomposing ftmgi in the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Review Article / Pozdnyakova N.N. // Biotechnol. Research Intern. - 2012. - Article ID 243217,20 pages.

19. Muratova, A.Yu. Remediating abilities of different plant species grown in diesel-fuel-contaminated leached chernozem / A.Yu. Muratova, S.N. Golubev, E.V. Dubrovskaya, N.N. Pozdnyakova, L.V. Panchenko, E.V. Pleshakova, M.P. Chemyshova, O.V. Turkovskaya // Appl. Soil Ecol. - 2012. - Vol. 56. - P. 51-57.

20. Pozdnyakova, N. Versatile peroxidase of Bjerkandera fumosa: substrate and inhibitor specificity / N. Pozdnyakova, O. Makarov, M. Chemyshova, O. Turkovskaya, A. Jarosz-Wilkolazka // Enzyme Microbial Techno!. -2013. - Vol. 52. - P. 44-53.

Статьи в сборниках:

21. Panchenko, L.V. Large scale in situ bioremediation of oil-slime / L.V. Panchenko, O.V. Turkovskaya, M.A. Volkov, A.Yu. Muratova, Y.V. Dubrovskaya, Y.V. Pleshakova, N.N. Pozdnyakova // Proceedings of the 3rd International conference "Oil pollution: Prevention, characterization, clean technology", Gdansk, Poland, 8-11 September, 2002. - P. 9-17.

22. Pleshakova, E.V. Stimulation of the indigenous hydrocarbon-oxidizing microflora in the oil-contaminated soil / E.V. Pleshakova, N.N. Pozdnyakova, O.V. Turkovskaya // Proceedings of the 3rd International conference "Oil pollution: Prevention, characterization, clean technology" Gdansk, Poland, 8-11 September, 2002. - P. 46-55.

23. Turkovskaya, O.V. Potential of modem methods of environment bioremediation / O.V. Turkovskaya, E.V. Dubrovskaya, A.Yu. Muratova, L.V. Panchenko, E.V. Pleshakova, N.N. Pozdnyakova // Proceedings of the 1st International congress "Biotechnology: status and future trends", Moscow, Russia, 14-18 October, 2002.-P. 290.

24. Turkovskaya, O.V. Biotechnology for environment decontamination / O.V. Turkovskaya, L.V. Panchenko, E.V. Dubrovskaya, E.V. Pleshakova, A.Yu. Muratova, N.N. Pozdnyakova, V.V. Ignatov // High technology as a way to progress: Articles. «Scientific book», Saratov, Russia, 2003. -P. 76-81.

25. Pozdnyakova, N.N. Catalytic properties of yellow laccase from Pleurotus ostreatus D1 / N.N. Pozdnyakova, J. Rodakiewicz-Nowak, O.V. Turkovskaya // Proceedings of the XXXVI "Ogolnopolskie kolokwium katalityczne", Krakow, Poland, 17-19 March, 2004. - P. 188-189.

26. Rodakiewicz-Nowak, J. Water-in-oil microemulsions as the reaction medium for the solventsensitive yellow laccases / J. Rodakiewicz-Nowak, N. Pozdnyakova, O. Turkovskaya // Proceedings of the 6,h International conference on protein stabilization. Bratislava, Slovakia, 26-29 September, 2004.-P. 47.

27. Pozdnyakova, N.N. Phenanthrene degradation by fungus Pleurotus ostreatus D1 / N.N. Pozdnyakova, O.V. Turkovskaya, O.E. Makarov, V.E. Nikitina // Proceedings of the International conference "Fungi in natural and anthropogenic ecosystems", St. Petersburg, Russia, 25-29 April, 2005.-Vol. 2.-P. 87-92.

Тезисы докладов на конференциях — 35.

Выражаю глубокую признательность моему научному консультанту д.б.н. профессору О.В. Турковской за постоянное внимание и ценные советы, без которых данная работа не могла бы состояться.

Выражаю мою искреннюю благодарность российским и зарубежным коллегам, оказавшим неоценимую помощь при выполнении данной работы: д.б.н. профессору В.Е. Никитиной (НБФРМ РАН), всем сотрудникам лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН и особенно к.б.н. Е.В. Дубровской, к.х.н. О.Е. Макарову, к.б.н. М.П. Чернышовой, к.х.н. B.C. Гриневу, нашим зарубежным партнерам: профессору Ежи Хаберу (Институт катализа и химии поверхности ПАН, Краков, Польша), доктору Янине Родакевич-Новак (Институт катализа и химии поверхности ПАН, Краков, Польша), профессору Анне Ярош-Виколаска (Университет Марии Склодовской-Юори, Люблин, Польша), профессору Ежи Рогальскому (Университет Марии Склодовской-Юори, Люблин, Польша), доктору Иоланте Полак (Университет Марии Склодовской-Кюри, Люблин, Польша), доктору Мартину Гронцу (Университет Марии Скло-довской-Кюри, Люблин, Польша), доктору Дитмару Шлоссеру (Центр исследований окружающей среды - UFZ-Центр, Лейпциг, Германия).

Выражаю глубокую благодарность моим первым учителям: заслуженному деятелю науки РФ, доктору биологических наук, профессору Л.А. Головлевой (ИБФМ РАН) и д.б.н. А.А. Леонтьевскому (ИБФМ РАН).

Типография «Новый Проект», Саратов, Московская, 160, тел.: 26-38-48, sar-print.ru Тираж 110 шт.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Позднякова, Наталия Николаевна, Саратов

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ и

МИКРООРГАНИЗМОВ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Позднякова Наталия Николаевна

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

О сч

Научный консультант:

ч- доктор биологических наук,

-профессор.

Турковская О.В.

Саратов - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 9

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 18

1 Лигнинолитические грибы: деструктивный потенциал и физио- 18 логические особенности

1.1 Структура лигнинолитической ферментной системы и деграда- 19 тивные свойства грибов

1.2 Основные условия проявления грибами деструктивной активно- 24 сти и продукции лигнинолитических ферментов

1.3 Индукция продукции внеклеточных ферментов 27

1.3.1 Индукция ионами металлов 27

1.3.2 Органические вещества как индукторы 29

2 Метаболические пути деградации ПАУ лигнинолитическими 32 грибами

2.1 Свойства ПАУ и проблема биодоступности 32

2.2 Ключевые метаболиты деградации ПАУ и продукция лигнино- 35 литических ферментов

2.2.1 Деградация низкомолекулярных ПАУ 37

2.2.1.1 Деградация нафталина 37

2.2.1.2 Деградация фенантрена 39

2.2.1.3 Деградация и трансформация антрацена и антрахиноновых кра- 46 сителей

2.2.1.4 Деградация флуорена 51

2.2.2 Деградация и трансформация высокомолекулярных ПАУ 52 2.2.2.1 Деградация пирена 52

.2.2.2.2-Деградация-бенз[а]ант-рацена-56

2.2.2.3 Деградация и трансформация ПАУ с 5 и более конденсирован- 57

ными кольцами

2.2.3 Продукция лигнинолитических ферментов в процессе деграда- 60 ции ПАУ

3 Биотехнологический потенциал лигнинолитических грибов в 64

процессах микоремедиации

3.1 Микоремедиация как форма биоремедиации 64

3.2 Технологии и подходы микоремедиации 67

3.3 Примеры микоремедиации устойчивых поллютантов 70

3.4 Условия и факторы эффективной микоремедиации 75

3.4.1 Доза внесенного инокулята 76

3.4.2 Концентрация загрязнителя 76

3.4.3 Сопутствующее загрязнение 76

3.4.4 Оптимальные условия колонизации почвы лигнинолитическими 11 грибами

3.4.5 Влияние поверхностно-активных веществ 79

3.4.6 Индукция лигнинолитических ферментов 80

3.5 Продукция лигнинолитических ферментов в процессе микоре- 81 медиации

3.6 Взаимодействие интродуцированных лигнинолитических гри- 84 бов с почвенной микробиотой

3.7 Снижение токсичности и мутагенности почвы в процессе мико- 86 ремедиации

3.8 Возможности и ограничения микоремедиации 88 4 Ключевые ферменты деградации ПАУ лигнинолитическими 91

грибами

4.1 Внеклеточные формы лигнинолитических ферментов 91

4.1.1 Лигнин пероксидазы 92

4.1.1.1 Молекулярные свойства и каталитический цикл 92

4.1.1.2 Основные каталитические свойства 94

4.1. 2_Мп-зависимые пероксидазы 100

4.1.2.1 Молекулярные свойства и каталитический цикл 100

4.1.2.2 Основные каталитические свойства 102

4.1.3 Гибридные пероксидазы 110

4.1.3.1 Молекулярные свойства и каталитический цикл 110

4.1.3.2 Основные каталитические свойства 111

4.1.4 Лакказы 116

4.1.4.1 Молекулярные свойства и каталитический цикл 117

4.1.4.2 Основные каталитические свойства 120 4.2 Внутриклеточные и «поверхностные» формы лигнинолитиче- 138

ских ферментов

4.2.1 Пероксидазы 138

4.2.2 Лакказы 138 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 143

5 Материалы и методы 144

5.1 Объекты исследований и методы культивирования 144

5.1.1 Хранение лигнинолитических грибов и получение инокулята 144

5.1.2 Погруженное культивирование грибов 144

5.1.3 Твердофазное культивирование грибов 145

5.2 Исследование деградативной активности грибов 145

5.2.1 Деградация ПАУ 145

5.2.2 Синтетические красители, содержащие конденсированные аро- 145 матические кольца

5.2.3 Изучение деградации нефти в процессе микоремедиации почвы 146

5.3 Определение прироста мицелия 148

5.4 Методы экстракции 148

5.5 Хроматографические методы 149

5.5.1 Газожидкостная хроматография 149

5.5.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография 149

5.5.3 Тонкослойная хроматография 150

5.5.4 Адсорбционная хроматография 150

5.6 Спектральные методы 151

5-7_Определение эмульгирующей активности_Г5-1—

5.8 Очистка и характеристика лигнинолитических ферментов 152

5.8.1 Получение грубых препаратов внеклеточных ферментов 152

5.8.2 Получение грубых препаратов «поверхностных» и внутрикле- 152 точных форм ферментов

5.8.3 Схема очистки лакказ и пероксидазы из погруженной культуры 153

Р. ОБ^еШиБ

5.8.4 Очистка лакказ из твердофазных культур Р. ostreatus DI и Aga- 154 ricus sp. F-8

5.8.5 Гибридная пероксидаза Bjerkander a fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst. 155

5.8.6 Определение активности ферментов 155

5.8.7 Определение каталитических характеристик ферментов 159

5.8.8 Ферментативное окисление ПАУ 159

5.8.9 Электрофорез 160

5.8.10 Определение молекулярных масс ферментов 160 5.9 Реактивы и материалы 161

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 163

6 Особенности метаболизма ПАУ лигнинолитическими грибами 163

6.1 Деградация ПАУ с тремя конденсированными кольцами 163

6.1.1 Фенантрен 163

6.1.1.1 Скрининг грибов на способность деградировать фенантрен и 163 продуцировать лигнинолитические ферменты

6.1.1.2 Деградация фенантрена при культивировании Р. оь^геаШя на 164 среде Кирка

6.1.1.3 Деградация фенантрена при культивировании Р. ОБггеаШз 01 на 172 богатой среде для базидиомицетов

6.1.1.4 Деградация фенантрена подстилочным сапротрофом Agaricus 175 Бр. Б-8

6.1.2 Антрацен и синтетические красители 177

6.1.2.1 Деградация антрацена грибом белой гнили Р. оБ^еаШз 177

6.1.2.2 Деградация антрацена подстилочным сапротрофом Agaricus Бр. 182 Б-8

6.1.2.3 Обесцвечивание синтетических красителей Р. оБ^еМт Р1_183

6.1.3 Деградация флуорена Р. оз^еМт 184

6.2 Деградация ПАУ с четырьмя конденсированными кольцами 189

6.2.1 Деградация пирена Р. оБКеШт Б1 189

6.2.2 Деградация хризена Р. ОБКеМт 01 196

6.2.3 Деградация флуорантена Р. оБКеМт Б1 199

6.3 Деградация основных метаболитов ПАУ Р. оБКеШт Б1 202

6.4 Продукция эмульгирующего вещества в процессе деградации 204 ПАУ Р. ОБКеаШ Б1

7 Внеклеточные формы лигнинолитических ферментов 208

7.1 Лакказы гриба белой гнили Р. оз^еаШ Б1 и подстилочного са- 208 протрофа Agaricus Бр. Б-8

7.1.1 Очистка и характеристика лакказ из погруженной культуры Р. 208 ОБЬгеаШБ

7.1.1.1 Продукция и очистка лакказ 208

7.1.1.2 Молекулярные свойства лакказы-1 210

7.1.1.3 Каталитические свойства лакказы-1 211

7.1.1.4 Очистка и характеристика минорных лакказ 222

7.1.2 Очистка и характеристика лакказы из твердофазной культуры Р. 224 ОБ^еМш 01

7.1.2.1 Подбор условий твердофазного культивирования гриба для по- 224

лучения лакказы

7.1.2.2 Очистка «желтой» лакказы 224

7.1.2.3 Молекулярные свойства «желтой» лакказы 226

7.1.2.4 Каталитические свойства «желтой» лакказы 227 7.1.3 Очистка и характеристика лакказы из твердофазной культуры 240

Agaricus яр. Б-8

7.1.3.1 Продукция лакказы и ее очистка 241

7.1.3.2 Молекулярные свойства 244

7.1.3.3 Каталитические свойства 245

7.2 Пероксидазы грибов белой гнили Pleurotus ostreatus DI и Bjer- 248

kandera fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst. 7.2.1_Характеристика гибридной пероксидазы В. fumosa 137 (Pers.iFr.) 248

Karst.

7.2.2 Очистка и характеристика пероксидазы Р. ostreatus DI 264

7.2.2.1 Молекулярные свойства 265

7.2.2.2 Каталитические свойства 266

7.2.3 Обесцвечивание антрахиноновых красителей пероксидазами Р. 272 ostreatus DI и В. fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst.

8 Внутриклеточные и «поверхностные» формы лигнинолитиче- 279 ских ферментов гриба P. ostreatus D1

8.1 Влияние ПАУ на баланс внеклеточных, «поверхностных» и 279 внутриклеточных форм ферментов

8.2 Лакказы 283

8.2.1 «Поверхностные» формы лакказ: очистка и характеристика 283

8.2.2 Внутриклеточные лакказы: очистка и характеристика 287

8.2 Внутриклеточная пероксидаза: очистка и характеристика 292

9 Биотехнологический потенциал лигнинолитических грибов Р. 295 ostreatus D1 и Agaricus sp. F-8 для микоремедиации нефтезаг-рязненной почвы

9.1 Скрининг лигнинолитических грибов по способности к деграда- 295 ции нефти

9.2 Исследование деградации нефти в условиях погруженного куль- 296 тивирования грибов

9.2.1 Деградация нефти при росте грибов на разных средах 296

9.2.2 Влияние рН на деградацию нефти P. ostreatus D1 298

9.2.3 Влияние поверхностно-активных веществ на деградацию нефти 299 P. ostreatus D1

9.2.4 Продукция лигнинолитических ферментов P. ostreatus D1 в при- 301 сутствии нефти

9.3 Деградация ПАУ и других углеводородов нефти при культиви- 302 ровании лигнинолитических грибов в почве

9.3.1 Деградативная активность грибов белой гнили в почве 302

9.3.2 Деградация нефти в почве грибом P. ostreatus D1 303

9.3.2.1 Влияние интродуцированного мицелия P. ostreatus D1 на поч- 304 венную микрофлору

9.3.2.2 Изменение фракционного состава нефти в процессе микореме- 308 диации почвы P. ostreatus D1

9.4 Микоремедиация почвы со старым нефтяным загрязнением под- 310 стилочным сапротрофом Agaricus sp. F-8

9.4.1 Рост гриба Agaricus sp. F-8 в загрязненной почве 311

9.4.2 Изменение фракционного состава нефти в процессе микореме- 312 диации почвы Agaricus Бр. Р-8

9.5 Продукция внеклеточных лигнинолитических ферментов в про- 314 цессе микоремедиации нефтезагрязненной почвы

9.5.1 Деградативная активность лигнинолитических грибов в почве 314 со старым нефтяным загрязнением

9.5.2 Продукция лакказ в процессе микоремедиации 317

9.5.3 Продукция пероксидаз в процессе микоремедиации 319

9.5.4 Модификация состава ароматических фракций в процессе мико- 320 ремедиации

9.6 Грибы Р. оБ1геШш 01 и Agaricus Бр. Р-8 как перспективные кан- 322 дидаты для создания эффективной технологии микоремедиации

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 324

ВЫВОДЫ 334

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 336

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 337

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований и состояние проблемы. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) - огромный класс органических соединений состоящих из двух и более конденсированных бензольных колец. Интерес к механизмам биодеградации и «судьбе» ПАУ в окружающей среде связан с их повсеместным распространением, устойчивостью к деградации, аккумуляцией почвой и осадками, токсическими, мутагенными и канцерогенными свойствами (Juhasz and Naidu, 2000; Kanaly and Harayama, 2000; Mrozik et al, 2003; Peng et al., 2008; Hari-tash and Kaushik, 2009). Некоторые ПАУ отнесены к приоритетным поллютантам американским и рядом других национальных агентств по защите окружающей среды (http://www.defra.gov.uk/Environment /consult/airqual01/l 1 .htm).

ПАУ являются гидрофобными соединениями, их устойчивость внутри экосистем является следствием низкой растворимости в воде (Juhasz and Naidu, 2000; Peng et al., 2008). Сброс и случайное попадание ПАУ в природную среду создает серьезную проблему, особенно в случае, когда биодеградативной активности природной микрофлоры не достаточно для удаления или нейтрализации загрязнителей (Reddy, 1995).

В настоящее время ведется активный поиск и совершенствование технологий биоремедиации почв и воды, загрязненных ПАУ. Использование микроорганизмов представляет собой высокоэффективную и относительно недорогую технологию детоксификации этих опасных поллютантов, которая может заменить традиционные методы (Mrozik et al., 2003). Для разработки и эффективного использования биоремедиации необходимо всестороннее исследование организмов-деструкторов, метаболических путей деградации ПАУ, катализирующих их ферментных систем и условий окружающей среды, необходимых для оптимизации разрушения этих соединений.

В настоящее время способность метаболизировать ПАУ выявлена у целого ряда бактерий, водорослей, цианобактерий и грибов (Haritash and Kaushik, 2009). Грибы-деструкторы ПАУ могут быть разделены на две группы: нелигнинолити-

ческие и лигнинолитические (Cerniglia, 1997). Наиболее активными являются грибы, разрушающие в природе лигниновый компонент древесины (лигнинолитические). К ним относятся в основном деревообитающие (грибы белой гнили) и почвообитающие (подстилочные сапротрофы; в англ. litter-decomposing fungi) базидиомицеты и некоторые виды аскомицетов (Buswell and Odier, 1987; Hatakka, 2001; Pointing, 2001, Wong, 2009). Ферментативная система этих грибов, катализирующая деградацию лигнина, является внеклеточной, неспецифической и окислительной, что позволяет им, кроме природного субстрата, метаболизировать широкий спектр поллютантов и их смесей, давая значительное преимущество перед бактериями и нелигнинолитическими грибами (Cerniglia, 1992; 1997). Основными лигнинолитическими ферментами являются лигнин пероксидаза, Мп-пероксидаза, гибридная пероксидаза (в англ. варианте versatile peroxidase) и лакказа (Wong, 2009). Репрессии синтеза ферментов не происходит, когда концентрации веществ снижаются до уровня, который неэффективен для их индукции, и, следовательно, они могут деградировать даже низкие концентрации поллютантов. Поэтому считают, что лигнинолитические грибы обладают значительным потенциалом для использования в биоремедиационных технологиях, особенно для соединений, которые трудно разлагаются бактериями (Aust and Benson, 1993; Reddy, 1995).

В результате каталитического действия лигнинолитических ферментов образуются полярные и водорастворимые продукты, которые более доступны как для грибного метаболизма, так и для дальнейшей деградации природной почвенной микрофлорой. До настоящего времени обсуждаются следующие ферментативные механизмы деградации ПАУ лигнинолитическими грибами: (а) лигнин пероксидазы и Mn-пероксидазы катализируют одно-электронное окисление ПАУ с потенциалами ионизации не более 7,55 eV с образованием соответствующих хи-нонов (Hammel et al., 1986; Vazquez-Duhalt et al., 1994; Field et al., 1996), которые далее могут быть метаболизированы через расщепление ароматического кольца (Hammel et al., 1991); (б) лакказы катализируют одно-электронное окисление ПАУ также с образованием хинонов, и каталитические возможности этих ферментов могут быть расширены в присутствии ряда легко окисляемых веществ, так

называемых медиаторов (Johannes et al., 1996; Collins et al., 1996); (в) некоторые ПАУ, содержащие до шести ароматических колец, могут быть окислены в процессе перокисления липидов, катализируемого Mn-пероксидазами (Moen and Hammel, 1994; Bogan and Lamar, 1995).

Рядом авторов показано, что кроме лигнинолитической системы, в грибной деградации ПАУ могут участвовать внутриклеточные цитохром Р-450 и эпоксид гидролаза (Sutherland et al., 1991; Bezalel et al., 1996a,б,в; 1997; Masaphy et al., 1996).

Кроме всестороннего изучения метаболических путей деградации ПАУ и катализирующих их ферментных систем, широко исследуется способность лиг-нинолитических грибов разрушать полиароматическую фракцию нефти в комплексе с природной микрофлорой в процессе ремедиации почвы. Предполагают, что грибы могут начинать атаку на жесткий ароматический субстрат, а почвенные микроорганизмы минерализуют окисленные метаболиты. Процесс деструкции ПАУ в этом случае происходит более полно, начальная атака грибов делает доступными для природной почвенной микрофлоры углеводороды с большим количеством ароматических колец (Brodkorb and Legge, 1992; Davis et al., 1993; Andersson and Henrysson, 1996). Вместе с тем реальные природные объекты чаще загрязнены комплексом углеводородов. Хорошо известно, что в процессе бактериальной деградации разрушается в основном парафино-нафтеновая фракция нефти, тогда как значительная часть тяжелых фракций, особенно ПАУ, остаются интактными и накапливаются в окружающей среде. Сведений об использовании лигнинолитических грибов для восстановления (микоремедиации) нефтезагряз-ненных почв все еще мало (Yateem et al., 1998; Ishikhuemhen et al., 2003).

Несмотря на то, что исследования деградации ПАУ лигнинолитическими грибами проводятся довольно давно, до настоящего времени существует целый ряд пробелов в исследованиях, в основном касающихся регуляции метаболизма, доступности этих веществ для грибной клетки, участия и роли разных форм лигнинолитических ферментов. Без восполнения подобных пробелов невозможно

глубокое понимание деградативных механизмов и практическое использование этих грибов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследование влияния условий культивирования на деградацию трех-(фенантрен, антрацен, флуорен) и четырехкольцевых (пирен, хризен, флуорантен) ПАУ и продукцию лигнинолитических ферментов грибами Pleurotus ostreatus DI и Agaricus sp. F-8. Идентификация основных метаболитов.

2. Выявление продукции эмульгирующего вещества в процессе деградации ПАУ Р. ostreatus DI.

3. Очистка и определение молекулярных (молекулярная масса, субъединичный состав, спектры поглощения) и каталитических (рН-оптимумы, Км, Vmax, kcat для моноароматических субстратов, активность по отношению к ПАУ) свойств внеклеточных лакказ из погруженных и твердофазных культур грибов Р. ostreatus DI и Agaricus sp. F-8.

4. Сравнительное исследование основных молекулярных (молекулярная масса, субъединичный состав) и каталитических (рН-оптимумы, Км, Vmax, kcat для моноароматических субстратов, активность по отношению к ПАУ) свойств пе-роксидаз Р. ostreatus Din Bjerkandera fumosa 137 (Pers.:Fr.) Karst.

6. Выделение и определение основных молекулярных (молекулярная масса, субъединичный состав) и �

Информация о работе

Позднякова, Наталия Николаевна
доктора биологических наук
Саратов, 2014
ВАК 03.01.04

Диссертация

Биохимические и физиологические аспекты деградации полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) лигнинолитическими грибами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Биохимические и физиологические аспекты деградации полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) лигнинолитическими грибами - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы