Изучение микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов и их использование в технологии биоремедиации загрязненных почв

Анкудинова, Анастасия Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов и их использование в технологии биоремедиации загрязненных почв
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Изучение микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов и их использование в технологии биоремедиации загрязненных почв"

На правах росписи

004800111

Анкудинова Анастасия Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ТЕХНОЛОГИИ БИОРЕМЕДИАЦИИ ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ

03.01.06 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 АПР 2010

Саратов-2010

004600111

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)» на кафедре технологии микробиологического синтеза.

Научный руководитель доктор химических наук, профессор

Гарабаджиу Александр Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Антонюк Людмила Петровна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Мурыгина Валентина Павловна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Санкт-Петербургский научно-исследовательский центр экологической безопасности РАН (НИЦЭБ РАН)

Защита диссертации состоится «28» апреля 2010 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат диссертации размещен на сайте http://www.ibppm.saratov.ru/obvav dis.html

Автореферат разослан « марта 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор -М/^"- В.Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одной из острых экологических проблем современности является загрязнение экосистем полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ). Антропогенное воздействие на окружающую среду становится все более необратимым. Среди множества соединений, образующихся в результате сжигания ископаемых топлив, в производствах химической, нефтехимической, целлюлозно-бумажной, металлургической промышленности, наибольшую опасность представляют вещества группы ПАУ. Особо загрязненными являются территории скопления крупных промышленных предприятий, а также городские земли (Лазарев, 1976; Пурмаль, 1998; Капелькина, 2008).

ПАУ отвечают основным признакам, характерным для стойких органических загрязнителей (СОЗ): стойкость в окружающей среде, устойчивость к деградации, острая и хроническая токсичность, биоаккумуляция, трансграничный перенос на большие расстояния в окружающей среде. ПАУ включены в биосферный круговорот, переходят из одной среды в другую, при этом происходит непрерывный перенос этих веществ по пищевым цепям и их аккумуляция в конечных звеньях, к которым относится и человек. ПАУ токсичны, обладают потенциальным мутагенным, канцерогенным и тератогенным действием, представляют собой опасность для живых организмов (Fernandez et al., 1992; Sutherland etal., 1995).

Адсорбируясь на твердых частицах пыли, ПАУ оседают в почву, которая является депонирующей средой для этих соединений. Нередко масштабы загрязнений превышают природную способность почвы к самоочищению, поэтому существует необходимость в разработке и применении эффективных методов очистки загрязненных территорий.

Для интенсификации процесса деструкции используют методы биореме-диации загрязненных экосистем. Эти методы основаны, в том числе, на применении микроорганизмов, обладающих огромным разнообразием ферментных систем и большой лабильностью метаболизма, осуществляющих процесс биодеструкции. Микроорганизмы-деструкторы способны использовать большой круг органических экотоксикантов в качестве единственного источника углерода и энергии (Eriksson et al., 2000).

В этой связи актуален поиск новых штаммов бактерий для рекультивации почв, которые были бы устойчивы к условиям восстанавливаемых территорий и могли бы обеспечивать деструкцию ПАУ в значительных количествах..

Все выше изложенное явилось предпосылкой для проведения исследований, результаты которых представлены в данной работе.

Целью данной работы являлось выделение природных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ из техногенно загрязненных источников и изучение возможности использования этих ассоциаций для биоремедиации почв, относящихся к категории опасных и чрезвычайно опасных.

В соответствии с целью работы решались следующие задачи:

1. Выделить устойчивые природные сообщества микроорганизмов-деструкторов ПАУ из загрязненных источников.

2. Выделить и идентифицировать чистые культуры микроорганизмов-деструкторов из природных ассоциаций.

3. Изучить способность выделенных бактериальных культур к деградации ПАУ в условиях пониженных температур, экстремальных значений pH, высокой засоленности почв и в присутствии тяжелых металлов.

4. Произвести подбор носителя для иммобилизации клеток ассоциаций микроорганизмов.

5. Изучить эффективность применения биопрепаратов на основе природных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов для очистки почв, загрязненных ПАУ, в лабораторных экспериментах.

6. Оценить токсичность продуктов деструкции ПАУ полученными биопрепаратами с помощью биологических тест-объектов.

Научная новизна. Селекционированы и охарактеризованы 5 новых природных сообществ микроорганизмов-деструкторов ПАУ, состоящих из представителей следующих родов бактерий: Arthrobacter, Curtobacterium, Cellulomonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Azotobacter, Beijerinckia, Flavobacterium, Vibrio и Aeromonas.

Выделены новые штаммы бактерий, способные к деградации ПАУ в условиях пониженных температур (+4°С; представители видов Alcaligenes paradoxus, Pseudomonas delafieldii, Vibrio mediterranei, Pseudomonas facillis, Alcaligenes xylosoxidans, Aeromonas sp., Beijerinckia indica, Vibrio sp.), экстремальных значений pH (4,5 и 8,5); представители видов Pseudomonas sp., Flavobacterium odoratum, Alcaligenes paradoxus, Pseudomonas delafieldii, Pseudomonas mendocina, Aeromonas sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas facillis, Alcaligenes xylosoxidans, Vibrio sp.), высокой засоленности почв и в присутствии тяжелых металлов.

Среди исследованных микроорганизмов-деструкторов ПАУ обнаружены штаммы, проявляющие гиперустойчивость к тяжелым металлам (Aeromonas sp., Alcaligenes xylosoxidans — к 25 ЦДК кадмия; Vibrio sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas pickettii - к 9 ПДК меди) и при этом сохраняющие способность к утилизации ПАУ.

Впервые продемонстрировано, что бактерия рода Curtobacterium, входящая в состав микробной ассоциации II, способна утилизировать трехкольцевой ПАУ фенантрен, присутствующий в среде в качестве единственного источника углерода и энергии.

Методами хромато-масс-спектрометрии показано, что исследованные микробные ассоциации подвергают бактериальной деградации такие многоядерные ПАУ, как индено[1, 2, 3-сс1]пирен и бенз[к]флуорантен, которые, по литературным данным, окисляются только грибами.

Научно-практическая значимость работы. Коллекция природных ассоциаций и микроорганизмов-деструкторов ПАУ представляет интерес как для

разработки новых эффективных биопрепаратов-деструкторов ПАУ и других СОЗ, так и для изучения различных аспектов их деградации в лабораторных, пилотных и полевых условиях. В работе продемонстрирована возможность совместного использования коммерческого препарата - нефтедеструктора и выделенных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ для более полной очистки почвы от углеводородных загрязнений. Результаты биотестирования почв после биоремедиации с применением биопрепаратов на основе ассоциаций-деструкторов ПАУ, свидетельствуют о возможности их использования для очистки и детоксикации загрязненных почв.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделенные из загрязненных образцов почвы и воды сообщества бактерий-деструкторов ПАУ таксономически гетерогенны, включают в свой состав микроорганизмы, способные использовать в качестве ростового субстрата фе-нантрен в широком диапазоне температуры окружающей среды (4-37 °С), рН (4,5-8,5), концентраций хлорида натрия (до 2 %) и тяжелых металлов (12 ПДК Pb, 18 ПДК Cd, 5 ПДК Си).

2. Иммобилизация ПАУ-деградирующих бактерий на торфе способствует сохранению их жизнеспособности и катаболической активности в течение года в отсутствии загрязнения и увеличению численности деструкторов при поллю-тантном давлении.

3. В процессе биоремедиации почвы, загрязненной ПАУ, иммобилизованными на торфе сообществами бактерий-деструкторов деградации подвергаются все 16 ПАУ, определяемых хромато-масс-спектрометрическим методом, и суммарная деградация этих поллютантов составляет не менее 50 % за 30 суток.

4. Продукты деградации ПАУ, образующиеся при биоремедиации загрязненных почв, сообществами бактерий-деструкторов, иммобилизованных на торфе, не оказывают острого токсического действия на биологические тест-объекты.

5. Эффективность очистки почв коммерческим биопрепаратом БАК возрастает в отношении утилизации персистентных ПАУ при дополнительной интродукции выделенных в этом исследовании и иммобилизованных на торфе сообществ бактерий-деструкторов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на всероссийской конференции аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование» (Ярославль, 2006), на международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва - Пущино, 2006), на четвертом и пятом международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2009), на научно-практической конференции «Исследования и разработки по предупреждению аварийных разливов нефти и ликвидации их последствий» (Москва 2007), на международном биотехнологическом симпозиуме «Биотехнология для устойчивого развития человеческого общества» (Китай, Далянь, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, 1 из которых в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, включает 11 рисунков и 34 таблицы. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, экспериментальной части с описанием объектов и методов исследования, 4 глав с изложением полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, и библиографического списка, включающего 172 источника литературы, в том числе зарубежных - 82.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность работы, сформулирована основная цель и задачи исследования.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В этой главе приводится описание антропогенных и природных источников поступления ПАУ в окружающую среду, влияние ПАУ на почву, растительность, живые организмы. Рассматриваются основные направления рекультивации почв, загрязненных ПАУ. Подробно рассмотрен наиболее эффективный метод биоремедиации с применением бактерий-деструкторов ПАУ. Оценены факторы, влияющие на микробную биодеградацию ПАУ. В обзоре указано многообразие микроорганизмов-деструкторов ПАУ, упоминающихся в различных источниках литературы.

ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследования. В работе исследовали природные ассоциации микроорганизмов-деструкторов ПАУ, выделенные из образцов почвы и воды, которые были отобраны на территории Санкт-Петербургского полигона захоронения токсичных отходов города СПб ГУПП «Полигон «Красный бор».

Остаточную токсичность продуктов окисления фенантрена и острую токсичность образцов почв в лабораторных экспериментах изучали с применением биологических тест-объектов: дафний (Daphnia magna Straus), ряски (Wolffia arrhiza), кресс-салата (Lepidium sativum). Для сравнения углеводородокисляю-щей и ПАУ-деградирующей активности в работе были использованы штаммы коллекции нефтеокисляющих бактерий ВНИИСХМ (г. Пушкин, Ленинградская обл.). Для постановки экспериментов по очистке нефтезагрязненной почвы использовали коммерческий биопрепарат-нефтедеструктор БАК (пат. 2270808 РФ).

Почву, загрязненную ПАУ, отбирали на территории промышленной площадки района Красное село (Ленинградская обл.), почву, загрязненную нефтепродуктами - на территории Тихорецкого локомотивного депо СевероКавказской железной дороги.

Питательные среды и субстраты, условия выращивания бактериальных культур. В качестве полноценной среды использовали пептон-дрожжевую среду с глюкозой (Нетрусов и др., 2005), в качестве минимальной -среду Раймонда (состав, г/л: NH4NO3 - 2, КН2Р04- 2, Na2HP04 - 3, NaCl - 1-5, MgS04 - 0,2; Na2C03 - 0,1; СаС12 - 0,01; MnS04 - 0,02; FeS04 - 0,01; вода до 1 л. pH 6,8-7,2 (Raymond, 1961). Для получения плотной среды дополнительно вносили агар в количестве 1,7-2 масс. %. Ассоциации микроорганизмов-деструкторов ПАУ получали методом накопительных культур. Микроорганизмы культивировали в жидкой среде Раймонда с добавлением фенантрена в качестве единственного источника углерода и энергии в количестве 0,1 % (масс). Культивирование проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл в течение 7 суток в условиях аэрации на роторной качалке с частотой вращения 220 об/мин, при температуре 25°С. Доля посевного материала составляла 10 % (об). Чистые культуры выделяли на агаризованной пептон-дрожжевой среде с глюкозой методом Коха. В качестве гидрофобного источника углерода помимо фенантрена также использовали сырую нефть, которую добавляли на поверхность агаризованной среды Раймонда.

Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств микроорганизмов и дальнейшую идентификацию культур проводили общепринятыми методами (Лисицкая, 2002; Берджи, 1997).

Определение влияния абиогенных факторов на рост микроорганизмов-деструкторов ПАУ. Температурный диапазон, оптимальный для роста микроорганизмов-деструкторов ПАУ, определяли по интенсивности роста при инкубации культур на агаризованной среде Раймонда с фенантреном при разных температурных режимах: +4, +18, +28, +37°С. Оптимальный диапазон значений рН выявляли, создавая в среде для культивирования разную кислотность: 4,5; 7,1; 8,5. Влияние ионов тяжелых металлов на рост культур определяли при культивировании в присутствии соли тяжелых металлов (РЬ(СНзСОО)2, CdCl2x2H20, CuS04*5H20) в разной концентрации. Устойчивость микроорганизмов к засоленности среды устанавливали на средах с повышенным содержанием хлорида натрия.

Степень деструкции фенантрена в жидкой среде определяли флуо-рометрическим методом на анализаторе «Флюорат-02». Измерения осуществляли по стандартной методике (ПНД Ф 16.1.21-98).

Остаточную токсичность продуктов окисления фенантрена в жидкой среде ассоциациями микроорганизмов-деструкторов ПАУ оценивали по всхожести семян и длине побегов и корней кресс-салата (в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной культуральной жидкостью ассоциации), по смертности дафний, по состоянию листецов ряски (выцветание, замедленные темпы развития), помещенных в анализируемую жидкость.

В качестве носителей для иммобилизации микроорганизмов-деструкторов ПАУ использовали сорбенты органической (торф, ГС, БАУ, СК'Г-4, древесный уголь-сырец) и неорганической природы (бентонит, цеолит, силикагель).

Оценка эффективности очистки почвы с помощью биопрепаратов на основе иммобилизованных природных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ. Определяли динамику изменения количества микроорганизмов-деструкторов ПАУ в ходе эксперимента. Учет микроорганизмов вели по методу Коха.

Концентрацию ПАУ и продуктов деструкции определяли методом хрома-то-масс-спектрометрии на приборе QP-2010 Shimadzu в соответствии с методикой (МУК 4.1.1062 - 01 Хромато-масс-спектрометрическое определение труднолетучих органических веществ в почве и отходах производства и потребления).

Для выявления остаточной токсичности после проведенного процесса биоремедиации проводили биотестирование водных вытяжек из почв опытных и контрольных образцов, не обработанных биопрепаратом, В качестве тест-объектов использовали дафнии {Daphnia magna Straus) и ряску ( Wolffla arrhiza).

Сравнение эффективности коммерческого биопрепарата и иммобилизованной ассоциации микроорганизмов-деструкторов ПАУ. Определение ПАУ и нефтяных углеводородов также проводили хромато-масс-спектрометрическим методом.

Статистическая обработка результатов. Все эксперименты проводились в 3-10 параллельных определениях. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием программ Microsoft Office Excel 2003 и STATISTICA 7.0. Рассчитывали средние значения и стандартные отклонения, для сравнения групп использовали параметрические критерии достоверности (критерий Стьюдента), (Лакин, 1990).

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ ПАУ

С 1979 года в Ленинградской области действует полигон по захоронению токсичных отходов ГУПП «Полигон «Красный бор».

Для поиска высокоактивных диких штаммов из хронически загрязненных почв полигона, карт захоронения жидких отходов были отобраны образцы.

Количество гетеротрофов и ПАУ-деструкторов в почвенных и водных образцах представлено в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, в образце 1 все микроорганизмы являлись ПАУ-деструкторами, их численность составляла 107 КОЕ/г. В других образцах количество гетеротрофных микроорганизмов отличалось от ПАУ-деструкторов на порядок (за исключением 4 образца, отобранного с прибрежной зоны, в котором численность гетеротрофных микроорганизмов отличалась от ПАУ-деструкторов на 4 порядка).

Методом накопительных культур получены 5 ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ. 4 сообщества микроорганизмов выделили из почвы, одно - из воды. После 4 последовательных пересевов в жидкую минеральную среду с фенантреном в качестве единственного источника углерода и энергии

получили стабильные природные сообщества микроорганизмов-деструкторов фенантрена.

Таблица 1 - Титр гетеротрофов и микроорганизмов-деструкторов ПАУ в почвенных и водных образцах

№ п.п. Образец Ассоциация Титр гетеротрофных микроорганизмов, КОЕ/г (КОЕ/мл) Титр микроорганизмов-деструкторов ПАУ, КОЕ/г (КОЕ/мл)

1 Почва Г (1,6±0,2)х107 (1,0±0,1)х107

2 Почва И (1,0±0,1)хЮ8 (1,3±0,1)хЮ7

3 Почва III (1,0±0,1)х107 (1,0±0,1)х106

4 Почва IV (1,2±ОД)хЮ10 (1,6±0,2)х106

5 Вода V (2,б±0,3)х101 (1,3±0,1)х106

Биодеструкцию фенантрена ассоциациями микроорганизмов оценивали по изменению его концентрации за 7 суток культивирования в минеральной среде. Начальная концентрация фенантрена в среде составляла 0,1 % (масс). Как видно из гистограммы на рисунке 1, исследованные ассоциации отличаются по эффективности потребления фенантрена.

Рис. 1 - Степень деструкции фенантрена ассоциациями микроорганизмов-деструкторов ПАУ после 7 суток культивирования в жидкой минеральной среде

Деструкция фенантрена ассоциацией V составила 47 %. Также наблюдалась высокая степень деградации фенантрена ассоциациями микроорганизмов И, III. За 100 % принимали количество фенантрена в аналогичном опыте без внесения биомассы исследуемых микроорганизмов.

Любая экобиотехнология призвана уменьшить действие загрязняющих веществ и продуктов их деградации на природные объекты. Поэтому было изучено влияние продуктов деструкции выделенных ассоциаций микроорганизмов на различные биологические тест-объекты. Для оценки остаточной токсичности культуральных жидкостей, полученных при ферментации ассоциаций микроор-

ганизмов на минер&тьной среде с фенантреном за 7 суток культивирования, провели биотестирование с использованием тест-объектов.

При анализе данных, полученных в эксперименте с кресс-салатом в качестве тест-объекта, можно сказать, что ассоциации (за исключением ассоциации V) без разведения не оказывали выраженного ингибирующего действия на всхожесть семян (рис. 2). Однако наблюдалось ингибирование длины побегов кресс-салата, обработанного культуральными жидкостями ассоциаций без разведения (рис. 3). Длина стебля в вариантах, обработанных культуральными жидкостями в разведении в 2,4, 8 раз, была близка к контрольному значению, а 1 в некоторых случаях даже превосходила длину побегов растений контроля (при -обработке семян культуральными жидкостями ассоциаций I, II, III, исключение составляет вариант с культуральной жидкостью ассоциации II, разбавленной в 4 раза, параметр не отличался от контрольного).

О Контроль (вода)

ЁЭ Минеральная

среда Ю Ассоциация I

□ Ассоциация II

О Ассоциация III

■ Ассоциация IV

0 Ассоциация V

без разведения

Рис. 2 - Всхожесть семян кресс-салата, обработанных культуральными жидкостями ассоциаций, культивированных на среде с фенантреном Примечание - * - достоверные различия параметров по сравнению с параметрами контроля (р = 95 %)

40 35 30 25

5 20 15 10 5 0

без разведения 8

2 раза в 4 раза в 8 раз

Контроль (вода) □ Минеральная среда 23 (Ассоциации I [Г] Ассоциация II П Ассоциация III | Ассоциация IV Ассоциация V

Рис. 3

- Влияние культуральных жидкостей ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ на длину побега кресс-салата

В ходе эксперимента было отмечено заметное ингибирование длины корневой системы в опытных образцах, а также в вариантах, в которых для обработки семян использовали минеральную среду (рис. 4).

60 50

§ 40

I 30

4 20 10 0

6ез разведения в 2 раза в 4 раза в £ раз

Рис. 4 - Влияние культуральных жидкостей ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ на длину корня кресс-салата

В чашках с самым большим разведением длина корня приближалась к длине корня растений контроля (вода). Таким образом, можно предположить, что на развитие корней кресс-салата оказал влияние минеральный фон, а не продукты деструкции.

Таким образом, в результате культивирования микроорганизмов на минеральной среде с фенантреном, образуются продукты метаболизма, которые в ряде случаев оказывают ингибирующее действие на развитие тест-растения. Поскольку состав ассоциаций отличается входящими в них микроорганизмами, то при создании биопрепарата для очистки и восстановления загрязненных экосистем, необходимо выбрать микроорганизмы и ассоциации, при деградации ПАУ которыми не образуются токсические вещества. При деструкции фенан-трена реализуются различные механизмы метаболизма субстрата, образующиеся окисленные формы, обладая большей растворимостью в воде, могут оказывать сильное биологически активное действие на тест-объект. Культуральная жидкость самой активной в отношении деструкции фенантрена ассоциации V оказала самый значительный токсический эффект на кресс-салат.

Тестирование на ракообразных показало, что культуральные жидкости всех ассоциаций оказывали острое токсическое действие на дафний уже за 24 часа экспозиции (смертность дафний больше 50 %). Однако была замечена гибель дафний и в пробе с минеральной средой. При разбавлении пробы в 4 раза токсического эффекта не наблюдалось (табл. 2).

Такой эффект можно объяснить высокой чувствительностью дафний к колебаниям осмотического давления, высокий минеральный фон среды для них токсичен. Таким образом, этот метод оценки остаточной токсичности культуральных жидкостей микроорганизмов, выращенных на минеральной среде, не применим в нашем случае.

УЛ Контроль (вода)

ГЛ №нерапьмая среда

П Ассоциация 1

|Ш Ассоциация 11

I I Ассоциация III

В Ассоциация IV

П Ассоциация V

Таблица 2 - Оценка токсического действия культуральных жидкостей ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ на дафний (Daphnia magna Straus)

Проба Смертность дафний по отношению к контролю (%) при разведении культуральных жидкостей ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ

без разведения в 2 раза в 4 раза в 8 раз в 16 раз

I 100 50±3 0 0 0

II 100 80±4 0 0 0

III 100 60±3 0 0 0

IV 100 50±3 0 0 0

V 100 100 0 0 0

Контроль (минеральная среда) 100 50±3 0 0 0

В опытах с ряской уже через двое суток началось почкование во всех ячейках планшета, кроме тех, которые содержали культуральные жидкости ассоциаций И, III, IV, V без разведения, причем наблюдалось выцветание листе-цов ряски в культуральных жидкостях ассоциаций III, V (табл. 3). В пробе с ассоциацией V даже при разведении культуральной жидкости в 2 раза не происходило размножения растения. Итак, наиболее токсичными для Woljfia arrhiza оказались продукты метаболизма ассоциации V, нетоксичными - ассоциации I.

Таблица 3 - Оценка токсического действия культуральных жидкостей ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ на ряску (\Volffia аггЫга)

Разведение культуральных жидкостей ассоциаций

Проба микроорганизмов-деструкторов ПАУ

без разведения в 2 раза в 4 раза в 8 раз в 16 раз

I 3 3 3 3 3

+ + + + +

II 3 3 3 3 3

- + + + +

Ш 1 2 3 3 3

- + + + +

IV 3 3 + 3 + 3 + 3 +

у 1 2 3 3 3

- - + + +

Контроль (минеральная среда) 3 + 3 + 3 + 3 + 3 +

Контроль (культивационная вода) 3 +

Примечание - учет проводили по бальной системе, где: «1» - обесцвеченные листецы, «2» -ослабленная окраска, «3» - ярко-зеленые; «+» - наличие почкования, «-» - отсутствие почкования.

Оценивая результаты проведенных биотестов, следует отметить, что для кресс-салата наиболее токсичны метаболиты культуральных жидкостей V и IV, для ряски - V и III, для дафний - V и II.

Для изучения состава микробных сообществ из 5 ассоциаций микроорганизмов-деструкторов (накопительных культур) методом Коха была выделена 21 чистая культура. На основании морфологических и физиолого-биохнмических свойств определили их видовую принадлежность. Из 21 культуры до вида удалось идентифицировать 13. Из выделенных культур 3 грамположительныс и 18 грамотрицателыше. Все грамположительные бактерии отнесли к группе кори-неформных: аэробные бактерии родов Artlirobacler, Curtobacterium, и факультативно анаэробные Cellitlomonas. Грамотрицателыше микроорганизмы: обли-гатпые аэробы - представители родов Pseudomonas, Alcaligenes, азотфикси-рующие Azotobacter и Beijerinckia, Flavobacterium, факультативные анаэробы рода Vibrio и Aeromonas (табл. 4).

Таблица 4 - Видовая принадлежность выделенных культур

Шифр культуры Микроорганизм % в ассоциации

Ассоциация I

1-1 Pseudomonas sp. 70

1-2 Azotobacter beijerinckii 20

[-3 Flavobacterium odoratum 5

1-4 Beijerinckia fluminensis 2

1-5 Alcaligenes paradoxus 2

1-6 Pseudomonas deiafleldii 1

Ассоциация II

II-1 Pseudomonas mendocina 75

II-2 Curtobacterium albidum 15

11-3 Pseudomonas sp. 5

II -4 Vibrio mediterranei 5

Ассоциация III

III-1 Pseudomonas sp. 60

III-2 Pseudomonas facillis 20

III-3 Alcaligenes xylosoxidans 10

III-4 Aeromonas sp. 5

III-5 Cellitlomonas cellulans 5

Ассоциация IV

IV-1 Beijerinckia indica 60

IV-2 Aeromonas sp. 40

Ассоциация V

V-1 Pseudomonas pickettii 60

V-2 Arthrobacter sp. 30

V-3 Aeromonas sp. 5

V-4 Vibrio sp. 5

Особый интерес представляют собой выделенные бактерии рода Curtobacterium. По имеющимся сведениям данный род микроорганизмов не был описан как деструктор ПАУ. Его окислительная активность в отношении ПАУ была доказана с помощью методов культивирования на жидкой и плотной минеральных средах с фенантреном в качестве единственного источника углерода и энергии.

Соотношение микроорганизмов в ассоциациях было неодинаковым. В ассоциации I преобладали бактерии 1-1 (Pseudomonas sp.) и I—II (Azotobacter beijerinckii), в ассоциации II - II-1 (Pseudomonas mendocina) и 11-2 (Curtobacterium albidum), в ассоциации III - III-l (Pseudomonas sp.) и III-2 (Pseudomonas facillis), в ассоциации IV - IV-1 (.Beijerinckia indicd), в ассоциации V больше всего было бактерий V-1 (Pseudomonas pickettii) и V-2 {Arthrobacter sp.). Качественный и количественный состав ассоциаций не изменялся в течение года.

ДЕСТРУКЦИЯ ФЕНАНТРЕНА ЧИСТЫМИ КУЛЬТУРАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ И ВЛИЯНИЕ НА НЕЕ АБИОГЕННЫХ ФАКТОРОВ

На плотной минеральной среде с фенантреном в качестве единственного источника углерода развивались все культуры, наиболее активно росли 6 видов микроорганизмов (Pseudomonas delafieldii, Pseudomonas sp., Cellulomonas cellu-lans, Beijerinckia indica Pseudomonas pickettii, Arthrobacter sp.), причем некоторые из них выделяли диффундирующий в среду пигмент (этого не было замечено при росте тех же культур на «богатой» среде).

Загрязнения почв полициклическими ароматическими соединениями часто сопровождаются загрязнением нефтью, нефтепродуктами. Все выделенные микроорганизмы проявили способность к активному росту на плотной минеральной среде с сырой нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии (табл. 5).

Известно, что на процесс деградации ПАУ большое влияние оказывает температура и значение pH среды, присутствие в среде соли (хлорида натрия) и ионов тяжелых металлов.

Выделенные нами микроорганизмы-деструкторы ПАУ способны развиваться в широком диапазоне температуры. Для большинства культур оптимальной температурой для роста и развития является диапазон 18-28°С. В литературе есть сведения о деградации различных углеводородов в условиях экстремальных температур (ZoBell, 1973), однако мало известно о деструкции именно полициклических ароматических углеводородов при пониженных температурах. Следует отметить, что многие выделенные нами микроорганизмы способны активно развиваться на среде с фенантреном при 4°С, это бактерии вида Alcaligenes paradoxus, Pseudomonas delafieldii, Vibrio mediterranei, Pseudomonas facillis, Alcaligenes xylosoxidans, Aeromonas sp., Beijerinckia indica, Vibrio sp. Этот факт является важным для выбора перспективных штаммов-деструкторов для биоремедиации, так как рабочий сезон препарата из таких микроорганизмов может быть более продолжительным.

Таблица 5 - Способность микроорганизмов к росту на углеводородных

субстратах

Шифр культуры Микроорганизм Рост на минеральной среде с фенантреном Рост на среде с нефтью

1-1 Pseudomonas sp. 1 +

1-2 Azotobacter beijerinckii 1 +

1-3 Flavobacterium odoratwn 2 +

1-4 Beijerinckia jluminensis 1 +

1-5 Alcaligenes paradoxus 2, окрашивание среды, коричневый цвет +

1-6 Pseudomonas delafieldii 3 +

11-1 Pseudomonas mendocina 1 +

II-2 Curtobacterium albidum 1 +

Н-3 Pseudomonas sp. 3 окрашивание среды, коричневый цвет +

II-4 Vibrio mediterranei 1 +

им Pseudomonas sp. 1 +

111-2 Pseudomonas facillis 2 +

III-3 Alcaligenes xylosoxidans 2 +

Ш-4 Aeromonas sp. 2 +

III-5 Cellulomonas celhdans 3 окрашивание среды, коричневый цвет +

IV-1 Beijerinckia indica 3 окрашивание среды, коричневый цвет +

IV-2 Aeromonas sp. 2 +

V-1 Pseudomonas pickettii 3 +

V-2 Arthrobacter sp. 3 +

V-3 Aeromonas sp. 2 +

V-4 Vibrio sp. 1 +

Примечания: 1) «+» - наличие роста, «-» - отсутствие роста, 2) интенсивность роста культур на срсдс с фенантреном оценивали по бальной шкале, где «О» - отсутствие роста, «1» -слабый рост по штриху отдельными мелкими колониями, «2» - рост по штриху сливающимися колониями, «3» - сплошной рост по штриху.

Анализ экспериментальных данных показал, что большинство выделенных микроорганизмов-деструкторов ПАУ (16 культур из 21) способно развиваться в широком диапазоне рН. Для многих микроорганизмов оптимальным является значение рН=8,5. Следует отметить бактерии Pseudomonas sp., Flavobacterium odoratwn, Alcaligenes paradoxus, Pseudomonas delafieldii, Pseudomonas mendocina, Aeromonas sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas facillis, Alcaligenes xylosoxidans, Vibrio sp., которые одинаково хорошо растут во всем исследованном диапазоне значений рН.

К торможению процесса биоремедиации может привести засоленность городских территорий (концентрация хлорида натрия 1-2 %), которая обуслов-

лена использованием реагента в зимний период (Дронин, 1997). В связи с этим мы исследовали способность микроорганизмов к росту на среде с фенантреном при повышенной концентрации хлорида натрия. Все микроорганизмы-деструкторы продемонстрировали интенсивный рост в присутствии в среде соли (хлорида натрия) в концентрации 1 и 2 %. Таким образом, можно предположить, что они будут адаптированы к условиям засоленности городских почв, однако они не являются галотолерантными.

Наряду с ПАУ, в почвах мегаполисов присутствуют высокие концентрации тяжелых металлов, которые могут препятствовать процессу биодеградации ПАУ (Козлова, 1999). Устойчивость микроорганизмов к присутствию свинца, кадмия, меди оценивали по способности их к росту при разных концентрациях этих металлов в среде. Таким образом, все выделенные культуры микроорганизмов стабильны в присутствии тяжелых металлов в среде, количество которых превышает уровень ПДК: 12 ПДК РЬ, 18 ПДК Cd, 5 ПДК Си (кроме Cellu-lomonas cellulans). При этом деструкция фенантрена не ингибируется. Гиперу-стойчивы к кадмию культуры Aeromonas sp., Alcaligenes xylosoxidans, к меди -Vibrio sp., Arthrobacter sp., Pseudomonaspickettii.

Известно, что при использовании консорциумов микроорганизмов достигаемая степень деструкции субстратов выше, чем при использовании монокультур (Бойкова, Конев, 1994). В этой связи далее в лабораторных экспериментах изучалась возможность применения природных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов для очистки почв, загрязненных ПАУ.

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ПРИРОДНЫХ АССОЦИАЦИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ ПАУ

При осуществлении технологии биоремедиации территорий, загрязненных ПАУ, наиболее эффективно использовать микроорганизмы в иммобилизованной форме. Известно, что иммобилизованные микроорганизмы более устойчивы к неблагоприятным факторам природной среды (Могилевич, 1995). Носитель для микроорганизмов подбирали эмпирически, так как до настоящего времени не разработаны научно-обоснованные подходы к решению, данного вопроса (Самоиин, 2004). Нами был проведен скрининг различных сорбентов-носителей для закрепления клеток микроорганизмов. Исследованные характеристики носителей приведены в таблице 6.

Важным параметром при выборе носителя для иммобилизации клеток микроорганизмов-деструкторов ПАУ является время жизни микроорганизмов на нем. На хранение были заложены образцы ассоциации III микроорганизмов-деструкторов ПАУ, иммобилизованной на различных носителях. Через интервалы 1, 3, 12 месяцев в образцах определяли титр жизнеспособных клеток и ПАУ - окисляющую активность бактерий в биопрепарате, путем высева на плотную минеральную среду с фенантреном.

Таблица 6 - Характеристика носителей для микроорганизмов-деструкторов

ПАУ

Сорбент-носитель Характеристика Наличие эндогенной микробиоты РН носителя

ГС Сорбент модификации ГС/РС. Термообработанная шелуха гречихи. ТУ 216491.001-2005 + 3,70

БАУ Активный уголь марки А. ГОСТ 6217-74 - 7,68

СКТ-4 Активный уголь на торфяной основе ТУ 6-16-2352-79 + 3,41

Силикагель Силикагель технический ГОСТ 3956-76 + 8,16

Цеолит Цеолит гранулированный - 7,13

Бентонит Природная глина, мелкодисперсная + 8,29

Торф Верховой сфагновый, низкой степени разложения, нейтрализованный известняковой мукой. ГОСТ 51661.4-2000 + 4,89

Древесный уголь-сырец ГОСТ 7657-84 - 7,62

Примечание - «+» - наличие роста при высеве с носителя, «-» - отсутствие роста.

Жизнеспособность клеток, адсорбированных на торфе и древесном угле, после года хранения препарата сохранилась на 90 и 76 %, соответственно, причем культура не потеряла ПАУ - окисляющую активность, о чем свидетельствует наличие роста микроорганизма на плотной минеральной среде с фенантреном в качестве единственного источника углерода и энергии. Однако другие носители не показали удовлетворительных результатов: количество клеток на носителе при хранении биопрепарата постепенно уменьшалось (рис. 5).

—•—торф

—»—древесный

уголь сырец —А—БАУ

-ж-СКТ-4

—•— бентонит

-+-ГС

О 1 3 12

Врет хранения биопрепарата, мое.

Рис. 5 - Динамика изменения количества жизнеспособных клеток, иммобилизованных на различных носителях

Таким образом, в качестве носителя для иммобилизации микроорганизмов-деструкторов ПАУ рекомендовано использовать торф. Наблюдается высокая жизнеспособность клеток на этом носителе во времени без потери активности в отношении фенантрена. Следует отметить, что как сырье торф доступен и дешев, биоразлагаем. Конкурирующим носителем по тем же показателям является древесный уголь-сырец, однако его использование экономически менее выгодно.

ЭКСПЕРИМЕНТЫ ПО ОЧИСТКЕ ПОЧВЫ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ ПАУ

Эксперимент по очистке почвы с применением биопрепаратов иа основе природных ассоциаций микроорганизмов-деструкггоров ПАУ. На исследование была предоставлена почва, загрязненная ПАУ, отобранная в районе промышленных площадок Красного Села Ленинградской области. Категория почвы по степени загрязненности ПАУ - чрезвычайно опасная (концентрация бензо[а]пирена 0,3 мкг/г, превышение ПДКбснзоМпнрена в 15 раз). Образец представлял собой песчаную почву с кусками строительного мусора и неприятным запахом. В грунте определили количество микроорганизмов, способных утилизировать фенантрен в качестве единственного источника углерода и энергии. Количество ПАУ-деструкторов в 1 г почвенного образца составляло 7,5x105 КОЕ/г, рН водной вытяжки - 5.

Для эксперимента по восстановлению грунта, загрязненного ПАУ, использовали наиболее активные ассоциации микроорганизмов-деструкторов ПАУ: ассоциации И, III и V.

В 100 г воздушно-сухой загрязненной почвы, просеянной через сито с диаметром ячеек 2 мм, помещенной в емкость, внесли ассоциации микроорганизмов-деструкторов ПАУ в жидком виде и закрепленные на носителе-торфе в количестве 1 г. Во все образцы почвы добавляли 1 г минеральных удобрений (доломитовая мука и «Кемира» в соотношении 2:1). Комплексное удобрение «Ксмнра цветочное» вносили для оптимизации уровня азотно-фосфорно-калиевого питания, а доломит использовали в качестве стабилизатора величины рН. Контролем служил грунт, не обработанный биопрепаратом. Емкости инкубировали при температуре 18-22°С, поддерживая постоянную влажность (60 % от полной влагоемкости) и аэрацию.

Через месяц инкубации титр микроорганизмов, способных утилизировать фенантрен, в опытных образцах возрос на порядок (рис. 6). В контрольном варианте количество клеток существенно не изменилось. Вероятно, при внесении в почву минеральных удобрений и препарата, содержащего микроорганизмы-деструкторы ПАУ, происходит активация аборигенной микробиоты, содержащейся в исходной загрязненной почве, а также расширяется круг деструкторов за счет включения бактерий, способных к соокислению. Наибольшее увеличение клеточного титра наблюдалось в вариантах, в которых препарат вносили в виде микроорганизмов, адсорбированных на торфе (за исключением ассоциации II).

процессе биоремедиации

Таким образом, торф благоприятно влияет на бактериальную микрофлору, содержащуюся в почве, что также подтверждается литературными данными (Сваровская и др., 2007). Спустя 2 месяца после начала эксперимента количество микроорганизмов-деструкторов начало снижаться, через 4 - упало на порядок, что может говорить об исчерпании доступного углеводородного субстрата.

Через месяц биоремедиации пробы почвы исследовали на содержание ПАУ методом хромато-масс-спектрометрии. Были проанализированы образцы, в которых наблюдалось наибольшее увеличение клеточного титра: почва, обработанная ассоциацией II, иммобилизованной ассоциацией III, иммобилизованной ассоциацией V. В таблице 7 приведена степень деструкции ПАУ по отношению к контрольному образцу.

Таблица 7 - Деструкция ПАУ в загрязненной почве

Наименование соединения Деструкция, % от контроля

И Iii ИМ v„„

Нафталин 14,0±1,7 7,а±0,8 64,0±5,2

Аценафтилен 90,0±4,5 93,0±8,7 95,0±4,8

Аценафтен 29,0±1,4 45,0±3,3 73,0±4,8

Флуорен 36,0±2,8 45,0±3,3 72,0±4,6

Фенантрен 27,0±2,4 45,0±2,8 67,0±5,4

Антрацен - 32,0±2,6 94,0±5,7

Флуорантен 4,0±0,2 39,0±2,0 60,0±3,2

Пирен 7,0±0,4 46,0±4,3 63,0±5,2

Бенз[а]антрацен 29,(Ш,7 70,0±3,5 77,0±4,8

Хризен 35,0±2,8 73,0±4,7 80,0±3,0

Бенз[Ь]флуорантен 58,0±4,9 82,0±5,1 88,0±5,4

Бенз[к]флуорантен 40,0±3,0 74,0±3,7 80,0±4,2

Бензо[а]пирен 25,0±1,3 75,0±3,7 87,0±6,3

Дибенз[а, Цантрацек 55,0±4,8 80,0±4,5 80,ОНО

BeH3[g, h, г]перилен 36,0±3,0 92,0±4,6 88,0±4,4

Индено[1, 2, 3-сс1]пирен 80,0±5,0 92,0±6,8 93,0±4,7

Сумма ПАУ 25,0±1,3 56,0±3,8 73, 0±3,7

В загрязненном грунте идентифицировали 16 ПАУ. Наблюдалась деградация как простых, так и сложных полиядерных ПАУ. Из таблицы 7 видно, что деструкции подвергались такие многоядерные ПАУ, как индено[1, 2, 3-ссЦпирен и бенз[к]флуорантен, которые по литературным данным окисляются только грибами. При развитии ассоциации V произошло более полное расщепление ароматических углеводородов по сравнению с пробами, обработанными ассоциациями II и III, степень деструкции бензо[а]пирена ассоциацией V достигала 87 %, а ассоциациями II и III - 25 и 75 %, соответственно. Максимальный эффект снижения суммы ПАУ также отмечается для варианта с внесением ассоциации V (73 %). Особый интерес представляет собой тот факт, что в процессе биоремедиации образовалось большое количество различных окисленных форм и промежуточных продуктов (метилбифенил, гидроксиметил нафталин, октагидро нафталин, алкилгексагидро нафталин, гидроксифлуорен, алкилфенил нафталин, метил флуорантен, диметил флуорантен), которых не обнаружили в контрольной почве. Это говорит о том, что в окислении ПАУ принимают участие именно интродуцированные микроорганизмы.

Хромато-масс-спектрометрический метод анализа свидетельствует о качественном и количественном изменении, произошедшем в составе ПАУ в ходе биоремедиации. Биотестирование же дает токсикологическую оценку эффективности процесса. Поэтому для выявления остаточной токсичности после проведенного процесса биоремедиации тестировали водные вытяжки из почв контрольных и опытных образцов. В качестве тест-объектов использовали дафнии и ряску.

Вытяжка из почв, обработанных иммобилизованными ассоциациями микроорганизмов-деструкторов, не оказала острого токсического действия на дафний (гибель дафний < 50 %), в отличие от контрольного образца, в который микроорганизмы не вносили, гибель дафний за 96 часов экспозиции составила 100 % (рис. 7).

I Контроль(почва без обработки)

Контроль

Рис. 7 -

Оценка токсического действия водных вытяжек из почв на дафний (Daphnia magna Straus)

Данные, полученные при тестировании почвенных вытяжек на ряске, иллюстрируют ту же закономерность (табл. 8).

Таблица 8 - Оценка токсического действия водных вытяжек из почв на ряску

(\Voljfia аггк'иа)

Наименование тестируемого образца «Поведение» ряски

Проба «II» 3 +

Проба «III им» 3 +

Проба «V„M» 3 +

Проба «Контроль почва» 1

Проба «Контроль культивационная вода» 3 +

Примечания: 1) «1» - обесцвеченные лисгецы, «2» - ослабленная окраска, «3» - ярко-зеленые, 2) «+» - наличие почкования, «-»- отсутствие почкования.

Таким образом, при обработке почвы ассоциацией V, иммобилизованной на торфе, наблюдается высокая степень деструкции поллютантов и образование окисленных форм ПАУ, водные вытяжки из почв не обладают острой токсичностью. Предлагаемый способ биоремедиации загрязненных почв с помощью ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ, позволяет снизить количество ПАУ, а также токсичность почвы.

Использование ассоциации III для очистки почвы от ПАУ. Для оценки эффективности использования выделенной нами активной и наиболее безопасной ассоциации III, иммобилизованной на торфе, для очистки почв с высоким содержанием углеводородного загрязнения был проведен эксперимент, результаты которого приведены в таблице 9. Из представленных в таблице данных видно, что ассоциация III незначительно деструктировала углеводороды нефти, однако эффективно подвергала деструкции ПАУ.

Таблица 9 - Эффективность использования ассоциации III для очистки загрязненной почвы

Показатель Контроль, мкг/г Опыт, мкг/г ш„м Деструкция, %

Суммарное содержание углеводородов 329±16 322±16 2,0±0,1

Суммарное содержание ПАУ 65,8±3,3 17,7±0,8 73,0±3,6

Бензо[а]пирен 1,6±0,1 0,2±0,1 87,0±4,3

Известной проблемой при биоремедиации почв является низкое содержание ПАУ в почве по сравнению с содержанием нефтяных углеводородов, и, вследствие этого, недоступность ПАУ микроорганизмам-нефтедеструкторам,

применяемым при очистке почв. Созданные специальные биопрепараты-деструкторы ПАУ могут помочь решить задачу минимизации концентраций ПАУ в почве до приемлемого уровня (ГЩК БП в почве составляет 0,02 мг/кг, принятый норматив содержания нефтяных углеводородов в почве - 1000 мг/кг почвы).

Для проверки этого предположения проведены эксперименты по очистке почвы при использовании коммерческого препарата-нефтедеструктора БАК, как самостоятельно, так и в сочетании с ассоциацией III, иммобилизованной на торфе. В предварительных исследованиях было установлено, что бактерии, входящие в состав биопрепарата БАК не проявляют антагонистических свойств по отношению к микроорганизмам в составе ассоциации III.

Загрязненную почву обработали биопрепаратами в равных соотношениях (титр клеток 108 КОЕ/г), внесли минеральные удобрения. В ходе эксперимента поддерживали постоянную влажность (60 % от полной влагоемкости) и аэрацию. Для оценки процесса биодеградации образцы проанализировали через 2 месяца методом хромато-масс-спектрометрии. Оказалось, что внесение биопрепарата БАК в почву привело к значительному снижению концентраций нефтепродуктов и ПАУ (табл. 10).

Таблица 10 - Сравнение эффективности биоремедиации почвы, загрязненной нефтепродуктами и ПАУ, биопрепаратом БАК и ассоциацией III

Показатель Контроль, мкг/г Опыт 1, мкг/г Опыт 2, мкг/г

«БАК» «БАК+Шям»

Суммарное содержание углеводородов 4000±150 460±20 430±20

Суммарное содержание ПАУ 83,4±4,1 4,7±0,2 1,3±0,1

Бензо[а]пирен 2,4±0,1 0,2±0,1 0,05±0,01

Количество бензо[а]пирена уменьшилось в 12 раз. Однако совместное применение ассоциации III и БАК было более эффективно, при этом концентрация бензо[а]пирена снизилась в 48 раз. Следует отметить, что применение препарата на основе ассоциации III позволяет снизить концентрацию ПАУ до безопасных величин, чего не достигается при использовании препаратов-нефтедеструкторов.

Таким образом, в ходе работы мы выделили и охарактеризовали устойчивые природные сообщества микроорганизмов-деструкторов ПАУ. Проведенные исследования подтверждают возможность дальнейшего использования препаратов на основе выделенных ассоциаций для очистки и детоксикации почв территорий, загрязненных персистентными ПАУ. Созданная коллекция микроорганизмов-деструкторов ПАУ представляет собой большой научный интерес в области изучения различных аспектов деградации поллютантов.

ВЫВОДЫ

1. Выделено 5 сообществ микроорганизмов-деструкторов ПАУ, в состав которых входят представители следующих родов бактерий: Arthrobacter, Curtobacíerium, Cellulomonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Azotobacter, Beijerinckia, Flavobacterium, Vibrio и Aeromonas.

2. На основе выделенных микроорганизмов создана коллекция штаммов-деструкторов, способных использовать в качестве ростового субстрата фенан-трен в широком диапазоне температур (от 4 до 37°С) и величины pH (от 4,5 до 8,5), устойчивых к высоким концентрациям хлорида натрия (2%) и тяжелых металлов (12 ПДК РЬ, 18 ПДК Cd, 5 ПДК Си).

3. Найден носитель для иммобилизации микроорганизмов-деструкторов ПАУ. Иммобилизованные на торфе клетки могут храниться в течение года без потери жизнеспособности и активности.

4. Показано, что иммобилизованные на торфе сообщества бактерий-деструкторов подвергают деградации широкий круг ПАУ, суммарная деградация этих поллютантов составляет не менее 50 % за 30 суток.

5. Совместное использование коммерческого биопрепарата БАК и иммобилизованных на торфе сообществ бактерий-деструкторов позволяет существенно снизить уровень остаточных концентраций наиболее персистентных ПАУ.

6. Применение иммобилизованных на торфе сообществ бактерий-деструкторов ПАУ при биоремедиации загрязненных почв, способствует устранению или значительному снижению токсичности очищаемых почв.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Анкудииова A.B., Малахова Д.В., Гарабаджиу A.B., Янкевич М.И. Очистка почв, загрязненных полициклическими ароматическими углеводородами, микробиологическим методом // Материалы всероссийской конференции аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование». - Ярославль. - 2006. - С. 310-312.

2. Анкудииова A.B., Малахова Д.В., Гарабаджиу A.B., Янкевич М.И. Разработка метода очистки почв, загрязненных полиароматическими циклическими углеводородами, с помощью микроорганизмов-деструкторов (на примере фенантрена) // Сборник тезисов международной школы конференции, посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна. «Генетика микроорганизмов и биотехнология». - Москва. - Пущино. - 2006. - С. 30.

3. Малахова Д.В., Анкудииова A.B., Гарабаджиу A.B., Янкевич М.И. Восстановление городских почв, загрязненных полициклическими ароматическими углеводородами, микробиологическим способом // Материалы четвертого московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 2. - Москва. -2007. - С. 135.

4. Анкудииова A.B., Орина A.C., Малахова Д.В., Гарабаджиу A.B. Выделение микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических угле-

водородов из загрязненных экосистем // Материалы четвертого московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 2. - Москва. - 2007. - С. 136.

5. Анкудинова А.В., Малахова Д.В., Янкевич М.И., Гарабаджиу А.В. Технология восстановления почвенных и водных экосистем, загрязненных нефтью и полициклическими ароматическими углеводородами // Научно-практическая конференция «Исследования и разработки по предупреждению аварийных разливов нефти и ликвидации их последствий». Тезисы докладов. -Москва. - 2007. - С. 38-39.

6. Анкудинова А.В., Малахова Д.В., Гарабаджиу А.В., Орина А.С., Ян-кевич М.И. Исследование микроорганизмов-ПАУ-деструкторов, выделенных из техногенно-нарушенных почв // Естественные и технические науки. - 2008. -№3. - С. 114-119.

7. Malakhova D.V., Ankoodinova A.V., Garabadjiu A.V., Yankevitch M.I. Reducing of city soils polluted with polycyclic aromatic hydrocarbons by microbiological method // Abstr. of the 13th International Biotechnology Symposium and Exhibition «Biotechnology for the sustainability of human society». - Dalian. - 2008. -P. 71.

8. Янкевич М.И., Анкудинова A.B., Гарабаджиу А.В. Практика применения биоремедиационных технологий // Материалы международной научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем». Тезисы докладов. - Астрахань. - 2008. — G. 302-306.

9. Анкудинова А.В., Янкевич М.И., Козлов Г.В., Гарабаджиу А.В. Комплексная биоремедиация техногенно загрязненных территорий // Материалы пятого московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 2. - Москва. - 2009. - С. 196-197.

Подписано в печать « 20 » марта 2010 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсепная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 25

Типография «Восстания-1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Анкудинова, Анастасия Владимировна

Введение.

Глава 1 Обзор литературы.

1.1 Общая характеристика полициклических ароматических углеводородов.

1.1.1 Природные и антропогенные источники поступления полициклических ароматических углеводородов в окружающую среду

1.1.2 Влияние ПАУ на почву и ее компоненты.

1.1.3 Воздействие ПАУ на живые организмы.

1.2 Основные направления рекультивации почв, загрязненных ПАУ.

1.2.1 Рекультивация с использованием растений.

1.2.2 Микробиологическая рекультивация.

1.2.2.1 Биоремедиация с использованием грибов.

1.2.2.2 Биоремедиация с использованием бактерий.

1.3 Многообразие микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

1.4 Факторы, влияющие на микробную деградацию ПАУ.

Глава 2 Объекты, материалы и методы исследований.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Среды и субстраты.

2.2.1 Жидкие и агаризованные среды.

2.2.2 Субстраты и носители.

2.3 Тест-объекты.

2.4 Музейные культуры микроорганизмов.

2.5 Методы исследования.

2.5.1 Метод получения накопительных культур. Жидкофазный метод культивирования.

2.5.2 Определение количества гетеротрофных и ПАУ-деградирующих микроорганизмов в почвенных и водных образцах по методу Коха.

2.5.3 Выделение чистых культур микроорганизмов-деструкторов фенантрена.

2.5.4 Подбор способа внесения фенантрена в среду.

2.5.5 Подбор концентрации фенантрена.

2.5.6 Построение кривых роста ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

2.5.7 Изучение морфологических и физиолого-биохимических признаков выделенных культур.

2.5.8 Определение влияния абиогенных факторов на рост микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

2.5.9 Выявление способности микроорганизмов к росту на плотной минеральной среде с фенантреном в качестве единственного источника углерода и энергии (твердофазное культивирование).

2.5.10 Выявление способности микроорганизмов к росту на плотной минеральной среде с сырой нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии.

2.5.11 Культивирование выделенных микроорганизмов в жидкой минеральной среде.

2.5.12 Определение степени деструкции фенантрена в жидкой среде.

2.5.13 Определение наличия остаточной токсичности с помощью тест-объектов.

2.5.14 Изучение характеристик носителей для иммобилизации микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

2.5.15 Получение иммобилизованных микроорганизмов-деструкторов.

2.5.16 Определение выживаемости клеток микроорганизмов на носителе

2.5.17 Постановка почвенного эксперимента.

2.5.18. Определение эффективности использования ассоциации III для очистки почвы от ПАУ.

2.5.19 Статистическая обработка результатов.

Глава 3 Выделение и характеристика микроорганизмов-деструкторов ПАУ

3.1 Выделение и изучение природных сообществ микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

3.1.1 Титр гетеротрофных и ПАУ-деградирующих микроорганизмов в почвенных и водных образцах.

3.1.2 Кривые роста ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

3.1.3 Деструкция фенантрена в жидкой среде ассоциациями микроорганизмов.

3.2 Токсичность продуктов окисления полициклического ароматического субстрата.

3.2.1 Результаты биотестирования на семенах кресс-салата (Lepidium sativum).

3.2.2 Результаты биотестирования на дафниях {Daphnia magna Straus).

3.2.3 Результаты биотестирования на ряске (Wolffia arrhiza).

3.3 Состав природных сообществ микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

3.3.1 Чистые культуры микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

3.3.2 Морфологические признаки выделенных культур.

3.3.3 Дифференциация грамотрицательных факультативно анаэробных палочек.

3.3.4 Дифференциация грамотрицательных аэробных палочек.

3.3.5 Идентификация грамотрицательных бактерий, фиксирующих азот в аэробных условиях.

3.3.6 Дифференциация грамположительных аэробных неспорообразующих палочек неправильной формы.

3.3.7 Идентификация грамположительных факультативно анаэробных неспорообразующих палочек неправильной формы.

3.3.8 Видовой состав ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ

Глава 4 Деструкция фенантрена чистыми культурами микроорганизмов и влияние на нее абиогенных факторов.

4.1 Выбор методики использования фенантрена в качестве ростового субстрата при культивировании микроорганизмов.

4.2 Рост культур на углеводородных субстратах.

4.3 Рост культур в жидкой минеральной среде с фенантреном.

4.4 Влияние абиогенных факторов на рост культур микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

4.4.1 Рост микроорганизмов на среде с фенантреном при разных значениях температуры.

4.4.2 Рост микроорганизмов на среде с фенантреном при разных значениях кислотности среды.

4.4.3 Способность микроорганизмов к росту на среде с повышенным содержанием хлорида натрия.

4.4.4 Способность микроорганизмов к росту в присутствии тяжелых металлов (свинца, кадмия, меди).

Глава 5 Получение и исследование иммобилизованных природных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

5.1 Наличие эндогенной микробиоты носителей.

5.2 Значение pH водной вытяжки носителей.

5.3 Выживаемость клеток микроорганизмов-деструкторов, иммобилизованных на носителе.

5.4 Выбор оптимального носителя для микроорганизмов.

Глава 6 Эксперименты по очистке почвы, загрязненной ПАУ.

6.1 Эксперимент по очистке почвы с применением биопрепаратов на основе природных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

6.1.1 Изменение клеточного титра в ходе эксперимента.

6.1.2 Деструкция ПАУ.

6.1.3 Остаточная токсичность почвенных образцов.

6.2 Использование ассоциации III для очистки почвы от ПАУ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов и их использование в технологии биоремедиации загрязненных почв"

Одной из острых экологических проблем современности является загрязнение экосистем полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ). Антропогенное воздействие на окружающую среду становится все более необратимым. Среди множества соединений, образующихся в результате сжигания ископаемых топлив, в производствах химической, нефтехимической, целлюлозно-бумажной, металлургической промышленности, наиболее опасными являются вещества группы ПАУ. ПАУ попадают в окружающую среду в результате неполного сгорания топлива и некоторых органических веществ, аварийных разливов нефти и нефтепродуктов, накапливаются в выхлопных газах автомобилей. Особо загрязненными являются области скопления крупных промышленных предприятий, а также городские территории [1-3].

ПАУ отвечают основным признакам, характерным для стойких органических загрязнителей (СОЗ): стойкость в окружающей среде, устойчивость к деградации, острая и хроническая токсичность, биоаккумуляция, трансграничный перенос на большие расстояния в окружающей среде. ПАУ включены в биосферный круговорот, переходя из одной среды в другую, при этом происходит непрерывный перенос этих веществ по пищевым цепям и их аккумуляция в конечных звеньях, к которым относится и человек. ПАУ токсичны, обладают потенциальным мутагенным, канцерогенным и тератогенным действием, представляют собой опасность для живых организмов [4-6].

Человечество не может избежать влияния таких веществ, так как они образуются практически во всех областях его хозяйственной деятельности. Нередко масштабы загрязнений превышают природную способность почвы к самоочищению. ПАУ стабильны в окружающей среде и для их полного разложения в естественных условиях требуются столетия. Поэтому существует необходимость в разработке эффективных методов очистки территорий, загрязненных ПАУ.

Для интенсификации процесса деструкции используют методы биологической рекультивации загрязненных экосистем. Эти методы основаны на применении микроорганизмов, обладающих огромным разнообразием ферментных систем и большой лабильностью метаболизма, осуществляющих процесс биодеструкции. Микроорганизмы-деструкторы способны использовать этот экотоксикант в качестве единственного источника углерода и энергии [7].

ПАУ не являются единственными загрязнителями окружающей среды антропогенного происхождения, хотя и считаются наиболее опасными, в техногенно нарушенных почвах также присутствуют в повышенных количествах и другие поллютанты. Поэтому актуален поиск новых штаммов бактерий для рекультивации почв, которые были бы устойчивы к условиям восстанавливаемых территорий и могли бы обеспечивать значительную степень утилизации ПАУ [8].

Целью настоящей работы являлось выделение природных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ из техногенно загрязненных источников и изучение возможности использования этих ассоциаций для биореме-диации почв, относящихся к категории опасных и чрезвычайно опасных.

В соответствии с целью работы решались следующие задачи:

1. Выделить устойчивые природные сообщества микроорганизмов-деструкторов ПАУ из загрязненных источников.

2. Выделить и идентифицировать чистые культуры микроорганизмов-деструкторов из природных ассоциаций.

3. Изучить способность выделенных бактериальных культур к деградации ПАУ в условиях пониженных температур, экстремальных значений рН, высокой засоленности почв и в присутствии тяжелых металлов.

4. Произвести подбор носителя для иммобилизации клеток ассоциаций микроорганизмов.

Научная новизна

Селекционированы и охарактеризованы 5 новых природных сообществ микроорганизмов-деструкторов ПАУ, состоящих из представителей следующих родов бактерий: Arthrobacter, Curtobacterium, Cellulomonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Azotobacter, Beijerinckia, Flavobacterium, Vibrio и Aeromonas.

Среди исследованных микроорганизмов-деструкторов ПАУ обнаружены штаммы, проявляющие гиперустойчивость к тяжелым металлам {Aeromonas sp., Alcaligenes xylosoxidans — к 25 ПДК кадмия; Vibrio sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas pickettii — к 9 ПДК меди) и при этом сохраняющие способность к утилизации ПАУ.

Впервые продемонстрировано, что бактерия рода Curtobacterium, входящая в состав микробной ассоциации II, способна утилизировать трехколь-цевой ПАУ фенантрен, присутствующий в среде в качестве единственного источиика углерода и энергии.

Научно-практическая значимость работы

Коллекция природных ассоциаций и микроорганизмов-деструкторов ПАУ представляет интерес как для разработки новых эффективных биопрепаратов-деструкторов ПАУ и других СОЗ, так и для изучения различных аспектов их деградации в лабораторных, пилотных и полевых условиях.

Результаты биотестирования почв после биоремедиации с применением биопрепаратов на основе ассоциаций-деструкторов ПАУ, свидетельствуют о возможности их использования для очистки и детоксикации загрязненных почв.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделенные из загрязненных образцов почвы и воды сообщества бактерий-деструкторов ПАУ таксономически гетерогенны, включают в свой состав микроорганизмы, способные использовать в качестве ростового субстрата фенантрен в широком диапазоне температуры окружающей среды (4— 37 °С), рН (4,5-8,5), концентраций хлорида натрия (до 2 %) и тяжелых металлов (12 ПДК РЬ, 18 ПДК Сс1, 5 ПДК Си).

5. Эффективность очистки почв коммерческим биопрепаратом БАК возрастает в отношении утилизации персистентных ПАУ, при дополнительной интродукции выделенных в этом исследовании и иммобилизованных на торфе сообществ бактерий-деструкторов.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на всероссийской конференции аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование» (Ярославль, 2006), на международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва - Пущино, 2006), на четвертом и пятом международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2009), на научно-практической конференции «Исследования и разработки по предупреждению аварийных разливов нефти и ликвидации их последствий» (Москва 2007), на международном биотехнологическом симпозиуме «Биотехнология для устойчивого развития человеческого общества» (Китай, Далянь, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, 1 из которых в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, включает 11 рисунков и 34 таблицы. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, экспериментальной части с описанием объектов и методов исследования, 4 глав с изложением полученных результатов и их обсуждения, выводов, и библиографического списка, включающего 172 источника литературы, в том числе зарубежных - 82.

Личный вклад соискателя

Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором и в совместной работе с сотрудниками кафедры технологии микробиологического синтеза СПбГТИ (ТУ).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Анкудинова, Анастасия Владимировна

Выводы

1. Выделено 5 сообществ микроорганизмов-деструкторов ПАУ, в состав которых входят представители следующих родов бактерий: Arthrobacter, Curtobacterium, Cellulomonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Azotobacter, Beijerinckia, Flavobacterium, Vibrio и Aeromonas.

2. На основе выделенных микроорганизмов создана коллекция штаммов-деструкторов, способных использовать в качестве ростового субстрата фенантрен в широком диапазоне температур (от 4 до 37°С) и величины pH (от 4,5 до 8,5), устойчивых к высоким концентрациям хлорида натрия (2%) и тяжелых металлов (12 ПДК РЬ, 18 ПДК Cd, 5 ПДК Си).

6. Применение иммобилизованных на торфе бактерий-деструкторов ПАУ при биоремедиации загрязненных почв, способствует устранению или значительному снижению токсичности очищаемых почв.

Заключение

Проблема чрезвычайной загрязненности окружающей среды опасными и устойчивыми поллютантами, в том числе ПАУ, обусловила выбор направления исследований, результаты которых представлены в данной диссертационной работе. Наиболее эффективным и перспективным методом очистки загрязненных экосистем является микробиологический способ. Этот метод основан на применении микроорганизмов, осуществляющих процесс биодеструкции.

Мы изучали природные ассоциации и входящие в них микроорганизмы - активные деструкторы ПАУ, разработали на их основе биопрепараты для очистки почв от ПАУ.

Микроорганизмы, способные утилизировать сложные органические загрязнители, как правило, присутствуют в местах высокого загрязнения такими соединениями.

Из образцов почвы и воды, отобранных на полигоне захоронения токсичных органических отходов, было выделено и охарактеризовано 5 новых устойчивых природных сообществ микроорганизмов-деструкторов ПАУ, в состав которых входят представители следующих родов бактерий: Arthrobacter, Curtobacterium, Cellulomonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Azotobacter, Beijerinckia, Flavobacterium, Vibrio и Aeromonas.

Выделенные штаммы микроорганизмов способны использовать в качестве ростового субстрата фенантрен при следующих условиях: о пониженная температура (+4°С), это представители видов Alcaligenes paradoxus, Pseudomonas delafieldii, Vibrio mediterranei, Pseudomonas facillis, Alcaligenes xylosoxidans, Aeromonas sp., Beijerinckia indica, Vibrio sp.; о экстремальные значения pH среды (4,5 и 8,5) - представители видов Pseudomonas sp., Flavobacterium odoratum, Alcaligenes paradoxus, Pseudomonas delafieldii, Pseudomonas mendocina, Aeromonas sp.,

Arthrobacter sp., Pseudomonas facillis, Alcaligenes xylosoxidans, Vibrio sp.; о высокая концентрация хлорида натрия (2 %); о присутствие тяжелых металлов (кадмия, меди свинца).

Отмечена гиперустойчивость ряда культур к тяжелым металлам (Aeromonas sp., Alcaligenes xylosoxidans — к 25 ПДК кадмия; Vibrio sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas pickettii — к 9 ПДК меди), при этом сохраняется способность к утилизации ПАУ.

Впервые показано, что бактерия рода Curtobacterium, входящая в состав микробной ассоциации II, способна утилизировать фенантрен, присутствующий в среде в качестве единственного источника углерода и энергии.

Известно, что иммобилизация микроорганизмов на подходящих носителях позволяет получать стабильные биопрепараты, сохраняющие деструктивную активность по отношению к различным субстратам.

Опытным путем был выбран носитель и предложена методика иммобилизации ассоциаций. Определено, что иммобилизованные на торфе бактерии сохраняют жизнеспособность в течение года без потери активности в отношении потребления фенантрена. Результаты экспериментов по биореме-диации загрязненной ПАУ почвы, относящейся к категории чрезвычайно опасной по содержанию БП (15 ПДК), свидетельствуют, что наиболее эффективно использование ассоциаций в иммобилизованном виде. Суммарная деградация поллютантов составила не менее 50 % за 30 суток инкубации. Показано, что исследованные микробные ассоциации подвергают бактериальной деградации такие многоядерные ПАУ, как индено[1, 2, 3-сс1]пирен и бенз[к]флуорантен, которые, по литературным данным, окисляются только грибами. Следует отметить, что ассоциации III и V обладают высокой эффективностью при биоремедиации загрязненных почв, причем токсичность почв значительно снижается, что и делает возможным их использование в городском благоустройстве.

В работе продемонстрирована возможность совместного использования коммерческого препарата-нефтедеструктора и выделенных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов ПАУ для более полной очистки почвы от углеводородных загрязнений. Установлено, что эффективность деструкции ПАУ созданными нами биопрепаратами значительно выше, чем препаратом БАК. Сочетание БАК и иммобилизованной на торфе ассоциации III позволило существенно снизить содержание наиболее персистентных ПАУ в почве.

Определяя в большой степени качество жизни в мегаполисах, почвы нуждаются в очистке и обезвреживании. Созданные биопрепараты-деструкторы специфических, именно городских поллютантов, являются составной частью новой комплексной технологии биоремедиации, в которой должен быть использован как потенциал микроорганизмов-деструкторов токсикантов, так и потенциал высших растений, способных к гипераккумуляции тяжелых металлов.

Созданная нами коллекция природных ассоциаций и микроорганизмов-деструкторов ПАУ представляет интерес как для разработки новых эффективных биопрепаратов-деструкторов ПАУ и изучения различных аспектов их деградации, так и для применения в технологии биоремедиации городских почв с органическим и неорганическим загрязнением.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анкудинова, Анастасия Владимировна, Санкт-Петербург

1. Лазарева Н.В. Вредные вещества в промышленности. Т. 1, 2, 3 / Под ред. -М.: Химия, 1976, 1977.

2. Пурмаль А.П. Антропогенная токсикация планеты, часть 2 // Соросовский образовательный журнал. 1998. - № 9. - С.46-51.

3. Fernandez P., Grifoll М., Solanas A.M., Bayona J.M., Albaiges J. Bioassay-directed chemical analysis of genotoxic components in coastal sediments // Environ. Sci. Technol. 1992. - Vol. 26. - P. 817-829.

4. Shuttleworth K.L., Cerniglia C.E. Environmental aspects of PAH degradation // Appl. Biochem. Biotechnol. 1995. - Vol. 54. - P. 291-302.

5. Eriksson M., Dalhammar G., Borg-Karlson A.K. Biological degradation of selected hydrocarbons in an old РАН/creosote contaminated soil from a gas work site // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - Vol. 53. - P. 619626.

6. Киреева H.A. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. Уфа: БашГУ, 1994. - 172 с.

7. Hiroshi Н, Toshio О. Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria. Review // Biosci. Biotecnol. Biochem. 2003. - Vol. 67, № 2. - P. 225-243.

8. Габов Д.Н., Безносиков В.А., Кондратенок Б.М., Яковлева Е.В. Критерии оценки загрязнения почв полициклическими ароматическими углеводородами // Экология и промышленность России. 2008. - № 11.-С. 42-45.

9. Lim L.H., Harrison R.M., Harrad S. The contribution of traffic to atmospheric concentrations of polycyclic aromatic hydrocarbons // Environ. Sci. Technol. 1999. -Vol. 33. - P. 3538-3542.

10. Marr L.C., Kirhstetter T.W., Harley R.A., Miguel A.H., Hering S., Hammond S.K. Characterization of polycyclic aromatic hydrocarbons in motor vehicle fuels and exhaust emissions // Environ. Sci. Technol. 1999. -Vol. 33.-P. 3091-3099.

11. Gundel J., Mannschreck C., Buttner K., Ewers U., Angerer J. Urinary levels of 1-hydroxypyrene, 1-, 2-, 3-, and 4-hydroxyphenantrene in females living in an industrial area of Germany // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1996.-Vol. 31.-P. 585-590.

12. Охрана окружающей среды, природопользование и обеспечение экологической безопасности в Санкт-Петербурге в 2007 году / под редакцией Д.А. Голубева, Н.Д. Сорокина. СПб, 2008. - 472 с.

13. Новый справочник химика и технолога. Радиоактивные вещества. Вредные вещества. Гигиенические нормативы. СПб.: АНО НПО «Профессионал», 2004. 1142 с.

14. Геннадиев А.Н. Миграция и аккумуляция полициклических ароматических углеводородов при техногенном загрязнении почв: Сб. тез. междунар. науч. конф. «Современные проблемы загрязнения почв». М.: Изд-во Моск. ун-та, 2004. С. 13-15.

15. Молотков И.В., Касьяненко В.А. Фиторемедиация // НефтьГазПро-мышленность. 2005. - № 1. - С. 18-24.

16. Clements W.H., Oris J.T., Wissing Т.Е. Accumulation and food chain transfer of fluoranthene and benzoa.pyrene in Chironomus riparius and Lepomis macrochirus II Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1994. - Vol. 26. -P. 261-266.

17. Holman H.-Y. N., Tsang Y.W., Holman W.R. Mineralization of sparsely water-soluble polycyclic aromatic hydrocarbons in a water table fluctuation zone//Environ. Sci. Technol. 1999. - Vol. 33. - P. 1819-1824.

18. Harvey R.G. Polycyclic aromatic hydrocarbons. New York: Wiley-VCH, 1997.-682 p.

19. Boopathy R. Factors limiting bioremediation technologies // Biores. Technol. 2000. - Vol. 74. - P. 63-67.

20. Margesin R., Zimmerbauer A., Schinner F. Monitoring of bioremediation by soil biological activities // Chemosphere. 2000. - Vol. 40.-P. 339-346.

21. Логинов O.H., Бойко Т.Ф. О биологической очистке технологических отвалов от нефтепродуктов // Почвоведение. 2002. -Т. 35, №4.-С. 481-486.

22. Киреева Н.А. Биодеструкция нефти в почве культурами углеводо-родоокисляющих микроорганизмов // Биотехнология. 1996. - № 1. -С. 51-54.

23. Киреева Н.А., Водопьянов В.В., Мифтахова A.M. Биологическая активность нефтезагрязненных почв. Уфа: Гилем, 2001. - 376 с.

24. Тонкопий Н.И. // Экспериментальная онкология. 1987. - № 5. - С. 24-27.

25. Monographs on the evaluations of carcinogenic risks to humans / International Agency for Research on Cancer 1972-1990. - Vol. 1-49. International Agency for Research in Cancer, Lyons, France.

26. Philips D.H. Fifty years of benzoa.pyrene // Nature. 1983. - Vol. 303. -P. 468-472.

27. Леденцова E.E., Зайцева H.B., Землянова М.А. Оценка воздействия выбросов нефтеперерабатывающих производств на здоровье населения // Гигиена и санитария. 2004. - № 1. - С. 10-12.

28. Ким И.Н., Ким Г.Н., Кривошеева JI.B. Исследование канцерогенной опасности дымовых выбросов коптильных камер // Гигиена и санитария. 2001. - № 2. - С. 20-26.I

29. Куркатов С.В., Андреева С.Г. Токсико-гигиеническая оценка производственных отходов ведущих отраслей промышленности Красноярского края // Гигиена и санитария. 2004. - № 4. - С. 22-24.

30. Bartsch Н. DNA adducts in human carcinogenesis: etiological relevance and structure-activity relationship // Mutat. Res. 1996. - Vol. 340. - P. 67-79.

31. Phillips D.H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues // Carcinogenesis. 2002. - Vol. 23. - P. 1979-2004.

32. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Молекулярная генетика рака яичников // Практическая онкология. 2000. - № 4. - С. 3-6.

33. Куценко В.А. Основы токсикологии. СПб: Фолиант, 2004. - 720 с.

34. Arif J.M., Dresler С, Clapper M.L., Gairola C.G., Srinivasan С., Lubet R.A., Gupta R.C. Lung DNA adducts detected in human smokers are unrelated to typical polyaromatic carcinogens // Res. Toxicol. 2006. - Vol. 19.-P. 295-299.

35. Manual of environmental microbiology / Eds. Hurst C.J. et al. 2nd ed. Washington: ASM Press, 2002. P. 1138.

36. Манеев В.Г., Ваметова A.P., Болышева Т.Н. Фиторемедиирующий эффект различных культур // Плодородие. 2006. - № 1. - С. 34-36.

37. Киреева Н.А., Тарасенко Е.М., Онегова Т.С., Бакаева М.Д. Комплексная биоремедиация нефтезагрязненных почв для снижения токсичности // Биотехнология. 2004. - № 6. - С. 63-71.

38. Молекулярные основы взаимоотношения ассоциативных микроорганизмов с растениями / под ред. Игнатова В.В. М.: Наука, 2005.-262 с.I

39. Соломатин А.В. Результаты испытаний технологии рекультивации нефтезагрязненных территорий // Экология и промышленность России. -2006. -№ 6. -С. 28-32.

40. Ларионова Н.Л. Устойчивость растений к загрязнению почвы углеводородами и эффект фиторемедиации: Дис. . канд. биол. наук. К., 2005.- 153 с.

41. Alexander M. Biodégradation and bioremediation. 2nd ed. CA, USA: Academic Press, New York, 1999. 453 p.

42. Johnsen A.R., Wick L.Y., Harms H. Principles of microbial PAH-degradation in soil //Environ. Pollut. -2005. Vol. 133, № 1. - P. 71-84.

43. Рабинович M.JI., Болобова A.B., Васильченко JI.Г. Разложение природных ароматических структур и ксенобиотиков грибами (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. - Т. 40, № 1. - С. 5-23.

44. Steffen K.T., Hatakka A., Hafricher M. Degradation of benzoa.pyrene by the litter-decomposing basidiomycete Stropharia coronilla: role of manganese peroxidase // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - Vol. 69, № 7. -P. 3957-3964.

45. Велысов B.B. Стандартизация формата описаний промышленных технологий биоремедиации. // Биотехнология. 2001. - № 2. - С. 70-76.

46. Градова Н.Б., Горнова И.Б., Эддауди Р., Салина Р.Н. Использование бактерий рода Azotobacter при биоремедиации нефтезагрязненных // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39, № 3. - С. 318321.

47. Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Кошелева И.А. Выделение и характеристика микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов // Микробиология. 1997. - Т. 66, № 2. — С. 269-272.

48. Плешакова Е.В., Позднякова Н.Н., Турковская О.В. Получение нефтеокисляющего биопрепарата путем стимуляции аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - Т. 41, № 6. - С. 634-639.

49. Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Приемы стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры // Биотехнология. 2005. - № 1. - С. 42-50.

50. Салеем Каид М., Перминова И.В., Гречищева IT.IO., Мурыгина В.П., Мещеряков С.В. Биорекультивация нефтезагрязненных почв гуминовыми препаратами // Экология и промышленность. 2003, № 4. -С. 54-60.

51. Бакулин М.К., Захаров В.Ю., Чеботарев Е.В. Интенсификация биодеградации микроорганизмами нефти и нефтепродуктов под влиянием перфтордекалина // Прикладная биохимия и микробиология. -2004.-Т. 40, №3.-С. 317-322.

52. Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Интродукция нефтеокисляющих микроорганизмов в почву: проблемы и перспективы: Тез. докл. междунар. науч. конф. «Микроорганизмы и биосфера». Москва, 2007. С. 97-98.

53. Измалкова Т.Ю., Сазонова О.И., Соколов С.JI., Кошелева И.А., Боронин A.M. Разнообразие генетических систем биодеградации нафталина у штаммов Pseudomonas fluorescens II Микробиология. — 2005.-Т. 74, № 1.-С. 70-78.

54. Bateman J.N., Speer В., Feduik L., Hartline R.A. Naphthalene association and uptake in Pseudomonas putida II J. Bacteriol. — 1986. Vol. 166, № l.-P. 155-161.

55. Zhuang W.Q., Tay J.H., Maszenan A.M., Tay S.T.L. Bacillus naphtho-vorans sp. no Vol from oil-contaminated tropical marine sediments and itsrole in naphthalene biodégradation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. -Vol. 58,№4.-P. 547-553.

56. Кошелева И.А., Балашова И.В., Измалкова Т.Ю. Деградация фенантрена мутантными штаммами-деструкторами нафталина // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 6. - С. 783-789.

57. Головлев E.JL, Баскунов Б.П., Финкелылтейн З.И., Головлева JI.A., Бабошин М.А. Микробная трансформация фенантрена и антрацена // Микробиология. 2005. - Т. 74, № 6. - С. 357-364.

58. West Р.А., Okpokwasili G.C., Brayton P.R., Grimes D.J, Colwell R.R. Numerical taxonomy of phenanthrene-degrading bacteria isolated from the Chesapeake Bay // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - Vol. 48, № 5. -P. 988-993.

59. Iwabuchi T., Inomata-Yamauchi Y., Katsuta A., Harayama S. Isolation and characterization of marine Nocardioides capable of growing and degrading phenanthrene at 42 degrees С // J. Mar. Biotechnol. 1998. - Vol. 6, №2.-P. 86-90.

60. Финкелылтейн З.И., Баскунов Б.П., Головлев E.JI. Превращение флуорена бактериями рода Rodococcus И Микробиология. 2003. - Т. 72, №6. -С. 746-751.

61. Grifoll M., Casellas M., Bayona J.M. Isolation and characterization of a fluorene degrading bacterium: Identification of ring oxidation and ring fission products // Appl. Environ. Microbiol. - 1992. - Vol. 58, № 9. - P. 2910-2917.

62. Селифонов C.A., Слепенькин A.B., Аданин B.M. Катаболизм аценафтена штаммами Alcaligenes eutrophus и Alcaligenes paradoxus // Микробиология. 1993.-T. 62, № l.-C. 120-128.

63. Kanaly R., Bartha R., Fogel S., Findlay M. Biodégradation of C-14. benzo [a] pyrene added in crude oil to uncontaminated soil // Appl. Environ. Microbiol. 1997.-Vol. 63, № 11.-P. 4511-4515.

64. Rehmann K., Noll H.P., Steinberg E.W., Kettrup A.A. Pyrene degradation by Mycobacterium sp. strain KR2 // Chemosphere. 1998. -Vol. 36, № 14. - P. 2977-2992.

65. Juhasz A.L., Britz M.L., Stanley G.A. Degradation off fluoranthene, pyrene, benz«.anthracene and dibenz[a,h\anthracene by Burkholderia cepacia II J. Appl. Microbiol. 1997. - Vol. 83, № 2. - P. 189-198.

66. Caldini G., Cenci G., Manenti R., Morozzi G. The ability of an environmental isolate of Pseudomonas fluorescens to utilize chrysene and four-ring polynuclear aromatic hydrocarbons // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - Vol. 44. - P. 225-229.

67. Габассова И.М., Сулейманов P.P., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф. Использование биогенных добавок совместно с биопрепаратом «Деворойл» для рекультивации нефтезагрязненных почв // Биотехнология. 2002. - № 2. - С. 57-66.

68. Логинов О.Н., Нуртдинова А.А., Бойко Т.Ф., Четвериков С.П., Силищев Н.Н. Оценка эффективности нового препарата «Ленойл» для биоремедиации загрязненных почв // Биотехнология. — 2004. № 1. - С. 77-82.

69. Киреева Н.А., Онегова Т.С., Жданова Н.В. Изучение возможности применения биопрепарата белвитамил для ускорения деструкции нефти в почве и водоеме // Биотехнология . 2003. - № 5. - С. 77-81.

70. Консорциум штаммов микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов: пат. 223280 РФ. Заявка 2002121985/13; заявл. 12. 08. 2002; опубл. 10. 03. 2004.

71. Штамм бактерий Azotobacter vinelandii для получения биопрепарата для борьбы с болезнями пшеницы, вызываемыми грибными фитопатогенами, и повышения урожая: пат. 2232806 РФ. Заявка 2002116983/13; заявл. 25. 06. 2002; опубл. 27. 02. 2004.

72. Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами: пат. 2077397 РФ. Заявка 93029534/13; заявл. 15. 06. 1993; опубл. 20. 04. 1997.

73. Биологически активная композиция для очистки поверхностных вод, почв и грунтов от нефтяных загрязнений: пат. 2270808 РФ. Заявка 2003116075/13; заявл. 30. 05. 2003; опубл. 27. 02. 2006.

74. Могилевич Н.Ф. Иммобилизованные микроорганизмы и очистка воды // Микробиол. Журнал. 1995. - Т. 57, № 5. - С. 90-105.

75. Самонин В.В., Еликова Е.Е. Изучение закономерностей адсорбции бактериальных клеток на пористых носителях // Микробиология. -2004.-Т. 73, №6.-С. 1-7.

76. Воронин A.M. Природные и генетически модифицированные микроорганизмы для биоремедиации: Тез. докл. Российской школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». 28 ноября 2 декабря, Москва - Пущино, 2006. - С. 217.

77. Cerniglia С.Е. Microbial metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons //Adv. Appl. Microbiol. 1984. - Vol. 30. - P. 31-71.

78. Narro M.L., Cemiglia C.E., Van Baalen C, Gibson D.T. Metabolism of phenanthrene by the marine cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum PR-6 // Appl. Environ. Microbiol. 1992.-Vol. 58, №4.-P. 1351-1359.

79. Safonova E., Kvitlco К.1., Kuschk P., Moder M., Reisser W. Biodegradation of phenanthrene by the green aiga Scenedesmus obliquus ES-55 // Engineering in Life Sciences. 2005. - Vol. 5, № 3. - P. 234-239.

80. Romero M.C., Cazau M.C., Giorgieri S., Arambarri A.M. Phenanthrene degradation by microorganisms isolated from a contaminated stream // Environ. Pollut. 1998. - Vol. 101, № 3. - P. 355-359.

81. Квасников Е.И., Щелокова И.Ф., Масумян В.Я. Дрожжевая микрофлора почв, содержащих нефть западноукраинских месторождений // Микробиология. 1967. - Т. 36, № 6. - С. 1077-1081.

82. Majcherczyk A., Johannes С., Huttermann A. Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) by laccase of Trametes versicolor // Enzyme Microbiol. Technol. 1998. - Vol. 22, № 5. - P. 335-341.

83. Квасников Е.И., Клюшникова T.M. Микроорганизмы-деструкторы нефти в водных бассейнах. К: Наукова думка, 1981. 117 с.

84. Zhang H., Kallimanis A., Koukkou A.I., Drainas С. Isolation and characterization of novel bacteria degrading polycyclic aromatic hydrocarbons from polluted Greek soils // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2004.-Vol. 65, № l.-P. 124-131.

85. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes E7, используемый для очистки воды и почвы от нефти нефтепродуктов: пат. 2134723 РФ. Заявка 98105707/13; заявл. 25. 03. 98; опубл. 20. 08. 99.

86. Trzesiclcamlynarz D., Ward O.P. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by a mixed culture and its component pure cultures, obtained from PAH contaminated soil // Can. J. Microbiol. - 1995. -Vol. 41, № 6. — P. 470-476.

87. Juhasz A.L., Britz M.L., Stanley G.A. Degradation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons by Pseudomonas cepacia II Biotechnology Letters. 1996. - Vol. 18, № 5. - P. 577-582.

88. Cenci G., Caldini G. Catechol dioxygenase expression in a Pseudomonas fluorescens strain exposed to different aromatic compounds // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - Vol. 47, № 3. - P. 306-308.

89. Ахметов JI.И. Роль горизонтального переноса плазмид биодеградации и микробной деструкции полициклических ароматических углеводородов: Автореф. дис. . канд. биол. наук, Пущино, 2006. — 25 с.

90. Grimberg S.J., Stringfellow W.T., Aitken H.D. Quantifying the biodégradation of phenanthrene by Pseudomonas stützen PI6 in the presence of a nonionic surfactant // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - Vol. 62, № 7. - P. 2387-2392.

91. Samanta S.K., Jain R.K. Degradation of phenanthrene by different bacteria // IX Int. Congress of Bacteriol. and Applied Microbiol, and IX Int. Congress Mycology, 16-20 Aug. — Sydney, 1999. — P. 45.

92. Dean-ross D., Cerniglia C.E. Degradation of pyrene by Mycobacterium flavescens // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - Vol. 46, № 3. - P. 307312.

93. Daugulis A.J., McCracken С. M. Microbial degradation of high and low molecular weight polyaromatic hydrocarbons in a two-phase partitioning bioreactor by two strains of Sphingomonas sp. // Biotechnol. Lett. 2003. -Vol. 25, № 17. - P. 1441-1444.

94. Ye D.Y., Siddiqi M.A., Maccubbin A.E., Kumar S., Sikka H.C. Degradation of polynuclear aromatic hydrocarbons by Sphingomonas paucimobilis II Environ. Sci. Technol. 1996. - Vol. 30, № 1. - P. 136-142.

95. Суровцева Э.Г., Ивойлов B.C., Беляев С.С. Разрушение ароматической фракции нефти ассоциацией грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов // Микробиология. 1997. - Т. 66, № 1.-С. 78-83.

96. Бабошин М.А., Финкелыптейн З.И., Головлева JT.A. Кометаболизм флуорена культурами Rhodococcus rhodochrous и Pseudomonas fluorescens. // Микробиология. 2003. - T. 72, № 2. - С. 194-195.

97. Guo C.L., Zhou H.W., Wong Y.S., Tam N.F. Isolation of PAH-degrading bacteria from mangrove sediments and their biodégradation potential // Mar. Pollut. Bull. 2005. - Vol. 51, № 8-12. - P. 1054-1061

98. Liu Zhi-Pei, Wang Bao-Jun, Liu Ying-Hao, Liu Shuang-Jiang. Novosphingobium taihuense sp. novol, a novel aromatic-compound-degrading bacterium isolated from Taihu Lake, China // Int. J. Syst. and Evol. Microbiol. 2005. - Vol. 55, № 3. - P. 1229-1232.

99. Leahy J.G., Colwell R.R. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment // Microbiol. Revol 1990. - Vol. 54. - P. 305-315.

100. Spain J.C., Pritchard P.H., Bourquin A.W. Effect of adaptation on biodégradation rates in sediment/water cores from estuarine and fresh water environment // Appl. Environ. Microbiol. 1980. - Vol. 40. - P. 726-730.

101. Bauer J.E., Capone D.G. Effects of co-occurring aromatic hydrocarbons on degradation of individual polycyclic aromatic hydrocarbons in marine sediments slurries // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - Vol. 54. - P. 16491653.

102. Cerniglia С. E. Biodégradation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Biodégradation. 1992. - Vol. 3. - P. 351-368.

103. Суровцева Э.Г., Ивойлов B.C., Беляев C.C. Физиолого-биохимические свойства штамма Beijerinckia mobilis 1ф Phn+- деструктора полициклических ароматических углеводородов // Микробиология. -.1999. Т. 68. - С. 845-850.

104. Volkering F., Breure A.M., Rullkens W.H. Microbiological aspects of surfactant use for biological soil remediation // Biodégradation. 1998. -Vol. 8.-P. 401-417.

105. Tiehm A., Stieber M., Werner P., Frimmel F.H. Surfactantenhanced mobilization and biodégradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in manufactured gas // Plant Soil Environ. Sci. Technol. 1997. - Vol. 31. - P. 2570-2576.

106. Jonathan W.C. Wong, Min Fang, Zhenyong Zhao, Baoshan Xing. Effect of surfactants on solubilization and degradation of phenanthrene under ter-mophilic conditions // J. Environ. Qual. 2004. - Vol. 33. - P. 2015-2025.

107. Ершов Ю.А., Плетнева Т.В. Механизм токсического действия неорганических соединений. М.: Медицина, 1998. - 272 с.

108. Atlas R.M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective // Mirobiol. Reviews. 1981. - Vol. 45, № 2. - P. 180-209.

109. Klug M.J., Markovetz A J. Termophilic bacteria isolated on n-tetradecane // Nature. 1967. - Vol. 215. - P. 1082-1083.

110. Margesin R., Schinner F. Biodégradation and bioremediation of hydrocarbons in extreme environments // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - Vol. 56.-P. 650-663.

111. Whyte L. G., Greer C. W., Inniss W. E. Assessment of the biodégradation potential of psychrotrophic microorganisms // Can. J. Microbiol. 1996. -Vol. 42.-P. 99-106

112. Casellas M., Grifoll M., Bayona J. M., Solanas A. M. New metabolites in the degradation of fluorene by Arthrobacter sp. strain F101 // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - Vol. 63. - P. 819-826.

113. Aislabie J., Foght J., Saul D. Aromatic hydrocarbon degrading bacteria from soil near Scott base, Antarctica // Polar Biol. 2000. - Vol. 23. -P. 183-188.

114. Galushko A., Minz D., Schink В., Widdel F. Anaerobic degradation of naphthalene by a pure culture of a novel type of marine sulphate-reducing bacterium // Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 1. - P. 415-420.

115. Rockne K.J., Chee-Sanford J.C., Sanford R.A., Hedlund B.P., Staley J.T., Strand S.E. Anaerobic naphthalene degradation by microbial pure cultures under nitrate-reducing conditions // Appl. Environ. Microbiol. 2000. -Vol. 66.-P. 1595-1601.

116. Bamblov N., Sokolov G. New soil improving agents for accelerated cultivations of soils with low fertility or damaged // Int. Agrophysics. 1998. -Vol. 12.-P. 357-360.

117. Дронин H. M., Седова H. Б. Современное техногенное засоление почв Москвы в результате применения противогололедных смесей: Тез. докл. в сб.: "Экологические проблемы крупных административных единиц мегаполисов". М., 1997. 351 с.

118. Rhykerd R.L., Weaver R.W., Mclnnes KJ. Influence of salinity on bio-remediation of oil in soil // Environ. Pollut. 1995. - Vol. 90. - P. 127-130.

119. Ashok B.T., Saxena S., Musarrat J. Isolation and characterization of four polycyclic aromatic degrading bacteria from soil near of oil refinery // Lett. Appl. Microbiol. 1995. - Vol. 21. - P. 246-248.

120. Hinchee R.T., Arthur M. Bench scale studies of the soil aeration process for bioremediation of petroleum hydrocarbons // Appl. Biochem. Biotech-nol. 1991. - Vol. 28-29. - P. 901-906.

121. Пунтус И.Ф. Микробная деградация нафталина и фенантрена в модельных почвенных системах: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Пу-щино, 2000.- 17 с.

122. Киреева H.A. Использование биогумуса для ускорения деструкции нефти в почве // Биотехнология. 1995. - № 5-6. - С. 32-35.

123. Сидоров Д.Г., Борзенков И.А., Милехина Е.И., Беляев С.С., Иванов М.В. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании биопрепарата «Деворойл» // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т. 34, № 3. - С. 281-286.

124. Kroll R.G. Alkalophiles // Microbiology of extreme environments / Eds Edwards C. (ed). Milton Keynes: Open University Press, 1990. P. 55-92.

125. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук JIM. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений ; Под ред. Нетрусова А.И. -М.: Академия, 2005. 608 с.

126. Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffmic hydrocarbons // Develop. Indust. Microbiol. 1961. - Vol. 2, № 1. - P. 23-32.

127. Лисицкая Т.Б. Методы изучения физиолого-биохимических свойств микроорганизмов: Метод, указания. СПб, СПБГТИ (ТУ), 2002. 30 с.

128. Культивирование коллекционных штаммов водорослей. Межвуз. сб. / Под ред. Громова Б.В.-Л., 1983.- 152 с.

129. ГОСТ 17. 4. 3. 01-83. Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб.

130. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под ред. Егорова Н.С. М.: МГУ, 1995. - 222 с.

131. ПНД Ф 16. 1. 21-98. Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в пробах флюориметрическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат-02». Госкомитет РФ по охране окружающей среды. М. 1998.

132. Петухов В.Н., Фомченков В.М., Чугунов В.А., Холоденко В.П. Биотестирование почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с помощью растений // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т. 36, № 6. - С. 652-655.

133. Жмур Н.С. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и измерению плодовитости дафний. M.: АКВАРОС, 2001. - 48 с.

134. Цаценко Л.В., Филипчук О.Д. Биологическая индикация и генетический скрининг загрязнения компонентов агроценоза // С.-х. Биология. 1997. - № 5. - С. 33-37.

135. Суржко Л.Ф., Финкелынтейн З.И., Баскунов Б.П., Янкевич М.И., Яковлев В.И., Головлева Л.А. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками // Микробиология. 1995. - Т. 64, № 3. - С. 393-398.

136. МУК 4. 1. 1062-01 Хромато-масс-спектрометрическое определение труднолетучих органических веществ в почве и отходах производства и потребления.

137. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

138. Фомин Г.С. Вода. Контроль химической, бактериальной и радиационной безопасности по международным стандартам: Энциклопедический справочник. 2-е изд., перераб. и доп. М.: «Протектор», 1995. 624 с.

139. Соколов В.Е. Международная программа биоиндикации антропогенного загрязнения природной среды // Экология. 1990. - № 2 - С. 9094.

140. Определитель бактерий Берджи. Т. 1, 2 / Под ред. Д. Хоулта и др. Пер. с англ. М.: Мир, 1997.

141. ГН 6229-91. Перечень предельно допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно допустимых концентраций (ОДК) химических веществ в почве.

142. Экология крупного города (на примере Москвы): учеб. пособие / С.Н. Голубчиков, В. А. Гутников, И. Н. Ильина и др.; Под ред А.А. Минина. -М.: НПО "Пасьва", 2001.- 192 с.

143. Бойкова И.А., Конев Ю.Е. Микробиологическая очистка воды и почвы от нефти и нефтепродуктов: Тез. докл. Конференции "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду". Москва, 17-19 мая. М., 1994.-С. 145.

144. Суржко Л.Ф. Очистка природных и сточных вод от нёфтезагрязнений иммобилизованными углеводородокисляющими микроорганизмами: Дис. . канд. техн. наук. СПб, 1999. 117 с.

145. Лизунов А.Б. Деструкция тяжелых нефтепродуктов в почве иммобилизованными углеводородокисляющими микроорганизмами: Дис. . канд. техн. наук. СПб, 2002. 106 с.

146. Сваровская Л.И., Иванов А.А., Юдина Н.В., Филатов Д.А. Стимулирующее влияние гуминовых кислот на оксигеназную активность микроорганизмов нефтезагрязненных почв // Биотехнология. 2007. - № 6 - С. 60-64.

147. Holman H.Y.N., Nieman К., Sorensen D.L., Miller C.D., Martin M.C., Borch T., McKinney W.R., Sims. R.C. Catalysis of РАН biodégradation by humic acid shown in synchrotron infrared studies // Environ. Sci. Technol. -2002. Vol. 36, № 6 - P. 1276-1280.

148. Ortega-Calvo J J., Saiz-Jimenez C. Effect of humic fractions and clay on biodégradations of phenanthrene by a Pseudomonas fluorescense strain isolated from soil // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64. - P. 31233126.

Информация о работе

Анкудинова, Анастасия Владимировна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Изучение микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов и их использование в технологии биоремедиации загрязненных почв - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы