Растительно-микробные ассоциации в условиях углеводородного загрязнения

Муратова, Анна Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Растительно-микробные ассоциации в условиях углеводородного загрязнения
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Растительно-микробные ассоциации в условиях углеводородного загрязнения"

На правах рукописи

МУРАТОВА Анна Юрьевна

РАСТИТЕЛЬНО-МИКРОБНЫЕ АССОЦИАЦИИ В УСЛОВИЯХ УГЛЕВОДОРОДНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

16 МАЙ Ш

Саратов-2013

005059099

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Инстшуте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научный консультант . доктор биологических наук, профессор

зав. лабораторией экологической биотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН Ольга Викторовна Турковская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

начальник отдела экологической биотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Научно-исследовательского центра токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов ФМБА России Геннадии Алексеевич Жариков

доктор биологических наук профессор кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (Технического университета) Марина Ивановна Янкевич

доктор биологических наук, профессор зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова Лидия Владимировна Карпунина

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования Кубанский государственный университет

Защита диссертации состоится « 5 » июня 2013 г. в 1000 ч на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13). Тел. / факс (8452) 97 03 83.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат диссертации размещен на сайте ВАК.

Автореферат разослан «Т.-?» апреля 20131'.

Ученый секрегарь диссертационного еовега доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Широкомасштабные добыча и использование нефти и нефтепродуктов в России сделали их приоритетными загрязнителями окружающей среды не только в нашей стране, но и за рубежом (Государственный доклад..., 2011). Попадая в окружающую среду, нефтяные углеводороды оказывают выраженное воздействие на все компоненты экосистемы (Иваненко, 2006). Среди них растения и микроорганизмы - продуценты и редуценты - заслуживают особое внимание, т.к. представляют собой базовые природные системы синтеза и разложения органических соединений. Процессы аккумуляции, трансформации и деградации нефтяных углеводородов растениями и микроорганизмами активно изучаются в последнее время как для оценки риска и предотвращения попадания токсикантов в пищевые цепи, так и с целью поиска природных механизмов детоксикации и деградации антропогенных загрязнителей. Результатами этих исследований стали, с одной стороны, выделение штаммов микроорганизмов-деструкторов, описание путей микробного катаболизма углеводородов (Van Hamme, 2003; Head et al., 2006), а с другой - характеристика метаболизма некоторых углеводородов в растениях (Kvesitadze et al., 2009).

Микробная деградация углеводородов составляет основу современной технологии биоремедиации (биоаугментации) нефтезагрязненных объектов окружающей среды (Sarkar 2005; Trindade 2005). Однако за годы практического использования этой биотехнологии выявился ряд ее недостатков, связанных с вытеснением аборигенной микрофлорой интродуцированных микроорганизмов-деструкторов, опасностью интродукции как таковой (т.е. введением в природные экосистемы селекционированных микроорганизмов, включая генетически модифицированных), а также высокой стоимостью процесса обработки загрязненных объектов, особенно на значительных площадях.

Выявление эффекта повьппенной биодеградации поллютантов в корневой зоне послужило поводом объединения усилий физиологов растений и микробиологов в разработке биотехнологии фиторемедиации - использования растений и ассоциированных с ними микроорганизмов для очистки окружающей среды (Gunther et al., 1996; Reynolds, Wolf, 1999; Hutchinson et al., 2001; Merkl et al„ 2005; Kechavarzi et al„ 2007; Wang et al., 2012; Karthikeyan et al„ 2012). Растительно-микробные ассоциации и симбиозы, обладающие гибким метаболизмом и уникальными ферментными системами, имеют большие преимущества при выживании в неблагоприятных условиях окружающей среды, обусловленные не только повышенной толерантностью к ксенобиотикам, но и способностью к активному удалению токсикантов из сферы обитания.

изучены недостаточно. В частности, не понятно, почему одни виды растений стимулируют элиминацию углеводородов из почвы, а другие - нет; как растения в своей корневой зоне формируют микробное сообщество, активно разрушающее загрязнитель; какова роль в деградации поллютанта микроорганизмов, тесно ассоциированных с корневой зоной растений; как инокуляция растений стимулирующими их рост микроорганизмами-деструкторами способствует очистке почвы; участвуют ли непосредственно растения в ризосферной деградации углеводородов. Кроме того, особенностью фиторемедиации является ее сайт-специфичность, т.е. использование растений в одних почвенно-климатических условиях не гарантирует их успешного применения в других. Поэтому расширение спектра растительных видов-фиторемедиантов и выяснение закономерностей самого процесса являются основой успешного распространения и применения этой экологической биотехнологии. Предпринятые нами научные исследования растительно-микробных ассоциаций в условиях углеводородного загрязнения основаны на убежденности в перспективности фиторемедиации, направлены на выяснение ее механизмов и могут послужить фундаментом для решения новых задач в биотехнологии.

Цель работы: охарактеризовать адаптационный и деструктивный потенциал партнеров растительно-микробных ассоциаций в отношении нефтяных углеводородов и разработать способ фиторемедиации загрязненных почв.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Исследовать эколого-функциональные реакции ассоциированных с растениями ризосферных микробных сообществ на загрязнение окружающей среды нефтяными углеводородами.

2. Провести скрининг микроорганизмов, выделенных из корневой зоны растений, по проявлению способности к деградации нефтяных углеводородов, в том числе полицикличсских ароматических углеводородов (ПАУ). Охарактеризовать деструктивную активность отобранных штаммов.

3. Изучить пути микробной деградации фенантрена у штамма ризосферной бактерии ЕпхЦег теШой Р221

4. Изучить физиологические и биохимические реакции растений на стресс, связанный с присутствием в среде углеводородов, оценивая воздействие загрязнителя на рост, развитие и фотосинтетический аппарат растений, изменение корневой экссудации, эндогенной и экзогенной ферментативной активности.

5. Определить возможность участия растения в ризосферной деградации углеводородов посредством изучения ферментативной активности корней и корневых экссудатов по отношению к ПАУ и их производным.

6. Исследовать выделенные штаммы микроорганизмов на наличие признаков, характерных для стимулирующих рост растений ризобактерий (РСгРК): азотфиксацию, синтез фитогормона индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), продукцию фермента 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат-деаминазы (АЦК-деаминазы) и колонизацию корней. Оценить влияние углеводородов на проявление этих свойств.

7. В вегетационных опытах охарактеризовать влияние бактеризации отобранными штаммами на рост, развитие и корневую экссудацию растения, оценить приживаемость инокулянта в его корневой зоне.

8. На основе созданных растительно-микробных ассоциаций разработать и апробировать способ фиторемедиации загрязненного углеводородами грунта.

Научная новизна

Впервые выявлена и охарактеризована деструктивная активность в отношении углеводородов у типичных представителей ассоциативной микрофлоры корневой зоны растений - азоспирилл. На примере штамма Azospirillum brasileme SR80 показано разрушение сырой нефти.

Впервые для представителей рода Ensifer на примере штамма Е. meliloti Р221 показана биодеградация фенантрена по пути окисления центрального ароматического кольца с образованием 9,10-дигидро-9,10-дигидроксифенантрена и 9,10-фенантренхинона.

Впервые на примере трехкольцевого ПАУ фенантрена и сорго веничного (Sorghum bicolor) проведено исследование влияния углеводородов на корневую экссудацию растения. Показано, что присутствие в грунте фенантрена в концентрации 0,01 г/кг стимулировало экссудацию корнями свободных Сахаров (мальтозы), не оказывая существенного влияния на количество выделяемых карбоновых кислот, аминокислот и снижая выделение белковых соединений. В концентрации 0,1 г/кг фенантрен значительно ингибировал развитие корневой системы растения, что приводило к отчетливому сокращению количества выделяемых карбоновых кислот, свободных Сахаров и аминокислот, а также белков. В исследованных концентрациях фенантрен не оказывал влияния на качественный состав корневых экссудатов и на интенсивность их выделения.

Впервые показано окисление ПАУ и их микробных метаболитов корневыми экссудатами и экстрактами корней растений, что доказывает участие растительных оксидоредуктаз в ризосферной деградации углеводородов ароматического ряда и указывает на возможность сопряженного растительно-микробного метаболизма загрязнителей в ризосфере.

Получены оригинальные данные о влиянии углеводородных поллютантов (сырой нефти и ПАУ) на проявление ассоциативных свойств ризобактерий (хемотаксис, колонизацию корней) и стимулирующую рост растений активность, связанную с синтезом фитогормона ИУК.

Получены приоритетные данные о влиянии PGPR-деструктора углеводородов на корневую экссудацию растения, его рост и развитие в зависимости от присутствия в среде углеводородного загрязнителя.

Установлено, что сорго веничное селективно поддерживает популяцию штамма-интродуцента Е. meliloti Р221 как в стерилизованном, так и в открытом грунте, загрязненном углеводородами.

Практическая значимость

Создана коллекция ризосферных ыггаммов-деструкторов углеводородов, включая ГТАУ, которые служат объектами для изучения микробного метаболизма этих соединений, а также используются для отработки приемов биорекультивации и фиторемедиации загрязненного грунта.

Охарактеризован штамм бактерий Е. meliloti Р221, обладающий способностью к деградации ПАУ и проявляющий стимулирующую рост растений активность; разработан способ его использования для улучшения роста растений, применяемых в фиторемедиации загрязненного углеводородами грунта, и интенсификации очистки (Патент РФ № 2406758).

Охарактеризован штамм бактерий Mycobacterium sp. N7, обладающий способностью подвергать деградации углеводороды и проявляющий устойчивость к тяжелым металлам, который представляется перспективным для использования в биоремедиации комплексного загрязнения грунта углеводородами и тяжелыми металлами.

Обосновано использование растительно-микробных ассоциаций на основе следующих растений для очистки почвы: от нефтешлама - рожь озимая (Seeale cereale), райграс пастбищный (Lolium регеппе) и люцерна посевная {Medicago saliva) и дизельного топлива - рожь озимая (Seeale cereale), кукуруза обыкновенная (Zea mays) и сорго веничное (Sorghum bicolor). Указанные растительные виды обладают устойчивостью к углеводородному загрязнению среды, способностью формировать и поддерживать в своей ризосфере эффективные микробные популяции и снижать концентрацию поллютанта в почве.

Отработаны приемы фиторемедации, обеспечивающие максимальную эффективность очистки почвы от углеводородов. Разработан и апробирован способ фиторемедиации грунта, загрязненного углеводородами (Патент РФ № 2403102).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Эколого-функциональные реакции ассоциированных с растениями ризосферных микробных сообществ на загрязнение окружающей среды нефтяными углеводородами проявляются в увеличении общей численности почвенных микроорганизмов, в том числе деструкторов, и поддержании большей устойчивости физиологической структуры микробоценоза ризосферы растений по сравнению с почвой без растительности.

2. Создана коллекция ризосферных микроорганизмов-деструкторов углеводородов, среди которых перспективными для использования в технологиях био- и фиторемедиации являются: штамм Mycobacterium sp. N7, способный подвергать деградации углеводороды и проявляющий устойчивость к тяжелым металлам, штаммы A. brasilense SR80 и Е. meliloti Р221, наряду со способностью к деградации углеводородов проявляющие стимулирующую рост растений активность.

3. Деградация фенантрена ризосферным штаммом Е. meliloti Р221 происходит по двум параллельным путям: (а) через расщепление терминального арома-

тического кольца (предположительно по связи СЗ-С4) с образованием бензокума-рина и 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты; (б) через окисление центрального ароматического кольца по связи С9-С10 с образованием 9,10-дигидро-9,10-дигидроксифенантрена и 9,10-фенантренхинона.

4. Углеводородное загрязнение грунта как легкими нефтепродуктами (дизельное топливо), так и тяжелыми нефтяными фракциями (нефтешлам) или ПАУ (на примере фенантрена) оказывает выраженный токсический эффект на физиологические и биохимические параметры растения. Чувствительность растений к токсичности загрязненного углеводородами грунта носит видоспецифич-ный характер и зависит от типа загрязнителя.

5. Пероксидазы, являющиеся доминирующими окислительными системами, как в тканях, так и в корневых выделениях растений, способны принимать участие в ризосферной деградации ПАУ и их микробных метаболитов.

6. Выявлены растительные виды, селективно поддерживающие популяцию микроорганизмов-деструкторов в своей ризосфере. Основные компоненты корневых экссудатов растений, карбоновые кислоты и углеводы, в зависимости от их вида и концентрации оказывают как стимулирующее, так и ингибирующее воздействие на интенсивность микробной деградации углеводородов.

7. Влияние микроорганизмов на рост и развитие растений видоспеци-фично, в значительной степени определяется способностью бактерий синтезировать фитогормон ИУК и зависит от присутствия углеводородного поллютанта, которое не препятствует формированию растительно-микробных ассоциаций.

8. Использование растений целесообразно для очистки почвы от тяжелых нефтяных углеводородов и таких персистентных загрязнителей, как ПАУ. Инокуляция растений PGPR-десгрукторами углеводородов улучшает рост растительности и ремедиацию загрязненного грунта.

9. В основе разработанного и апробированного способа фиторемедиации лежит использование растительно-микробных ассоциаций, созданных на основе люцерны посевной, сорго веничного или райграса пастбищного и исследованных штаммов PGPR-деструкторов углеводородов.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были представлены в виде устных и стендовых сообщений на научных мероприятиях различного уровня: 7th International Conference on Contaminated soil (Leipzig, Germany, 2000); ISEB 2001 Meeting "Phytoremediation" (Leipzig, Germany, 2001); Конференция «Экобиотех-нология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды» (Пущино, 2001); 12th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium (Prague, Czech Republic, 2002); 3rd International Conference "Oil Pollution: Prevention, Characterization, Clean Technology" (Gdansk, Poland, 2002); International Symposium "Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants" (Saratov, Russia, 2003); Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 117-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова (Саратов, 2004); 1st Baltic Sea Region Symposium and Postgraduate Course "Agro-Biotechnology Focused on Root-Microbe Systems" (Kaunas, Lithuania, 2005); 13th

International Biodeterioration and Biodegradation Symposium (Madrid, Spain, 2005); IX международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 2005); II международная конференция «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь-Казань-Пермь, 2005); Всероссийская конференция «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, 2005); Международная конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005); International Symposium on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB 2006 (Leipzig, Germany, 2006); Me-ждународная научная конференция «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2006); I-III региональные конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2002, 2004, 2006); International Conference on Sustainable Agriculture for Food, Bio-energy and Livelihood Security (Jabalpur (M.P.), India, 2007); 3r International Conference "Enzymes in the Environment: Ecology, Activity, Applications" (Viterbo, Italy, 2007); 4th Symposium on Biosorption and Bioremediation (Prague, Czech Rebublic, 2007); International Conference "Rhizosphere 2" (Montpelier, France, 2007); Всероссийская конференция с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007); 14th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium (Messina, Italy, 2008); Meeting of the Specialist Groups "Desert Ecology" and "Experimental Ecology" of the Society of Ecology (GfD) in Cooperation with German Society of Limnology (DGL) "Plant Life in an Extreme and Changing Environment" (Tharandt, Germany, 2008); I, II, IV и V Московские Международные Конгрессы «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2007, 2009); П и IV Саратовские салоны изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2006, 2009); 15-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011); IV Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); Всероссийский симпозиум «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии» (Москва, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 65 работ: 27 статей, в том числе 16 -в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК, 36 тезисов сообщений, получено 2 патента РФ.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 382 страницах машинописного текста, содержит 65 рисунков, 56 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав результатов собственных исследований, заключения, основных выводов, списка литературы, который включает 526 источников, в том числе 438 зарубежных, и 7 страниц приложений.

Работа выполнена в лаборатории экологической биотехнологии (ЛЭБ) ИБФРМ РАН в соответствии с плановой тематикой при непосредственном участии или под руководством автора. Часть исследований, связанная с получением

корневых экссудатов, проводилась в сотрудничестве с д-ром Л. Виттенмайером в Институте почвоведения и питания растений при сельскохозяйственном факультете университета Мартина-Лютера Галле-Виттенберг (Institut fur Bodenkunde und Pflanzenernährung Professur Physiologie und Ernährung der Pflanzen Martin-LutherUniversität Halle-Wittenberg) г. Галле, Германия. Отдельные эксперименты по фи-торемедиации были проведены в сотрудничестве с д-ром Е. Хюбнером и д-ром П. Кушком в Центре исследования окружающей среды (UFZ Centre for Environmental Research Leipzig-Halle) г. Лейпциг, Германия. Исследования метаболизма фенантрена штаммом Е. meliloti Р221 проводились совместно с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина, г. Пущино-на-Оке. Исследования были частично поддержаны грантами Немецкой службы академических обменов (DAAD А/00/06/80, 2000 г.; DAAD Leonhard-Euler-Stipendienprogramm 2003/2004 гг.), Президента РФ № НШ-1529.2003.4, Международного научно-технического центра (ISTC #3419.2, 2008 г.), государственным контрактом № 02.512.11.2210 с Роснаукой в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (2008-2009 гг.), грантом Мин. обр. и науки РФ соглашение № 8852 (номер заявки 2012-1.5-14000-2021-004 (2012-2013 гг.)).

Автор выражает глубокую признательность своему научному консультанту - заведующей ЛЭБ ИБФРМ РАН д.б.н., профессору О.В. Турковской за многолетнюю помощь и всестороннюю поддержку работы, большую благодарность с.н.с. ЛЭБ к.б.н. Л.В. Панченко за понимание, помощь и поддержку в работе. Искренняя благодарность также сотрудникам ЛЭБ: к.б.н. Е.В. Дубровской, К.6.Н. С.Н. Голубеву, к.б.н. А.Д. Бондаренковой за участие в проведении вегетационных опытов, К.Х.Н. O.E. Макарову, к.б.н. М.П. Чернышовой и к.б.н. Е.В. Лю-бунь за содействие в проведении химико-аналитических исследований, к.б.н. H.H. Поздняковой за помощь при изучении ферментативной активности; сотрудникам лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН д.б.н., профессору Л.Ю. Матора и к.б.н. Г.Л. Бурыгину за помощь в иммунохимической идентификации ре-изолятов, вед. научн. сотруднику лаборатории биохимии д.б.н. Л.П. Антонюк за консультативную поддержку исследований, а также другим сотрудникам ИБФРМ РАН, способствовавшим успешному выполнению работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

Обзор литературы по теме диссертации представлен 5 разделами, содержащими краткую характеристику углеводородов как загрязнителей окружающей среды, современные представления о реакциях растений и микроорганизмов на углеводородные поллютанты, описание известных механизмов биодеградации углеводородов, растительно-микробных взаимодействий в ризосфере и роль корневых экссудатов как связующего звена в системе растение-микроорганизм-

загрязнитель, анализ достижений технологий био- и фиторемедиации, созданных на основе адаптационного и деструктивного потенциала растений и микроорганизмов по отношению углеводородам.

Глава 2. Материалы и методы

Микроорганизмы, использованные в работе, включали в себя 33 штамма азоспирилл из коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН, а также оригинальные штаммы бактерий, выделенные из образцов ризосферы в ходе выполнения представленных исследований. Штамм Ensifer meliloti Р221 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (г. Москва) как Sinorhizobmm meliloti Р221 под номером В-9442 (в соответствии с современной номенклатурой вид Sinorhizobium meliloti переименован в Ensifer meliloti).

Растения, использованные в экспериментах: пшеница мягкая (Triticum aestivum L.), рожь посевная (Secale cereale L.), овес посевной (Avena sativa L.), ячмень обыкновенный {Hordeum vulgare L.), сорго веничное (Sorghum bicolor L. Moench), просо посевное (Panicum miliaceum L.), тростник южный (Phragmites australis L.), райграс пастбищный {Lolium perenne L.), кострец безостый (Bromop-sis inermis), житняк гребенчатый (Agropyron cristatum L.), пырей бескорневшцный {Agropyrum tenerum L.), овсяница луговая {Festuca pratensis Huds.), кукуруза обыкновенная {Zea mays L.), люцерна посевная {Medicago sativa L.), клевер луговой {Trifolium pratensis L.), эспарцет песчаный {Onobrychis arenaria (Kit.) DC), щирица запрокинутая {Amaranthus retroßexsus L.), циклахена дурнишниколистная {Cyclachaena xanthiifolia (Nutt.) Fresen). Семена щирицы и циклахены получали самостоятельно, семена тростника южного - от компании Jelitto (Германия), остальные семена - из НИИ сельского хозяйства Юго-Востока Россельхозакадемии (г. Саратов).

Углеводородные загрязнители, использованные в работе, были представлены сырой нефтью, нефтешламом, дизельным топливом, парафинистым битумом и индивидуальными углеводородам алканового и полиароматического рядов.

Для поддержания микроорганизмов в работе использовали полноценные питательные среды: мясо-пегггонный бульон или агар, среда LB, картофельный агар (Методы общей бактериологии, 1983). Для культивирования и выявления азоспирилл использовались среды Nfb и с конго красным (Enrique and Caceres, 1974; Döbereiner and Baldani, 1979); для выделения микроорганизмов-деструкторов ПАУ - среда MSM (Foght and Westlake, 1988); для углеводородо-кисляющих микроорганизмов - среда Бушнелла-Хааса (Bushnell, Haas, 1941); для выделения бактерий, устойчивых к тяжелым металлам - трис-минимальная среда (Mergeay et al.,1985); для учета микроорганизмов различных физиологических групп - селективные среды (Методы почвенной микробиологии..., 1991). Для культивирования растений использовали среду MCP (Муратова с соавт., 2005) и среду Ruakara (Smith et al., 1983).

Выделение и учет микроорганизмов из почвы, ризосферы и ризопланы растений, а также исследование микроорганизмов различных физиологических

групп проводили традиционными методами (Методы почвенной микробиологии..., 1991); учет численности углеводородокисляющих микроорганизмов - методом мембранных фильтров (А.с. СССР №1629318, 1991); выделение деструкторов ПАУ - методом КтуоЬага (КлуоЬага с1 а1., 1982). Таксономическую принадлежность выделенных микроорганизмов определяли на основании изучения их культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков, идентификацию проводили по Определителю бактерий Берджи (1997).

Изучение деструктивной активности штаммов по отношению к углеводородам проводили, культивируя микроорганизмы в жидких средах, содержащих углеводородный субстрат (сырую нефть, дизельное топливо, индивидуальные углеводороды) в качестве единственного источника углерода и энергии или с ко-субстратом - карбоновой кислотой или углеводом. Концентрации нефтепродуктов в среде в зависимости от задач эксперимента варьировали от 1 до 20 г/л, углеводородов алканового ряда - 1-10 г/л, ПАУ - 0,01-0,4 г/л; косубстратов - 0,1-1 г/л. Как правило, культивирование проводили в условиях аэрации на круговой качалке при 130 об/мин и 28-30°С. Деструктивную активность выражали в процентах убыли субстрата из среды.

Для изучения метаболизма трехкольцевого ПАУ фенантрена у штамма Е. теШой Р221 после его культивирования получали нейтральные и кислые этил-ацетатные экстракты среды МБМ, в которых определяли содержание ПАУ и присутствие метаболитов. Обнаружение продуктов трансформации фенантрена проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), газовой хроматографии (ГХ), высокоэффективной жидкостной хроматограф™ (ВЭЖХ) и масс-спектрометрии. Идентификацию метаболитов проводили с использованием стандартных образцов исследуемых соединений, а также с привлечением данных библиотеки масс-спектров и опубликованных исследований.

Устойчивость микроорганизмов к солям тяжелых металлов изучали, определяя минимально-ингибирующие и максимально-толерантные концентрации (МИК и МТК) ионов металла в среде в ряду 1-5 мМ.

Для характеристики стимулирующей рост растений активности у исследуемых микроорганизмов определяли способность к фиксации азота (по росту на безазотистой среде), к продукции ИУК (по выявлению фитогормона с использованием ВЭЖХ), синтезу фермента АЦК-деаминазы (ВеНшоу & а1„ 2004), растворению фосфатов (Методы почвенной микробиологии..., 1991), хемотаксису (Ко-ронелли и Комарова, 1982), колонизации корней и собственно стимуляции роста надземной и подземной биомассы растений на проростках в чашках Петри и в вегетационных сосудах. Для исследования колонизации корней бактериями семена растений, стерилизованные диацидом или смесью перекиси водорода со спиртом (1:1) (Большой практикум..., 1978), инкубировали в суспензии микроорганизма в течение 2-3 ч, после чего проращивали на поверхности минеральной среды в чашках Петри или при глубинном культивировании в вегетационном сосуде. По окончании опытов с растениями проводили ре-изоляцию микроорганизмов-интродуцентов. Соответствие ре-изолятов исследуемым штаммам А. ЬгаяНепяе 81180 и Е. теШой Р221 подтверждали с помощью иммунодиффузионного анализа

с использованием полученных ранее штаммоспецифичных кроличьих антител (Матора,1998).

Исследование фитотоксичности загрязненного углеводородами грунга проводили, проращивая семена на поверхности почвы в чашках Петри. При оценке результатов учитывали всхожесть, длину корней и побегов проростков. В зависимости от задач эксперимента растения выращивали в условиях гидропоники, в песчаной культуре или в почве в вегетационных сосудах; в субстрат вносили углеводородный загрязнитель в различных концентрациях, а также азотное удобрение - аммиачную селитру (как правило, в концентрации 0,25 г/кг), компенсируя дисбаланс углерода и азота, вызванного загрязнением. Во всех экспериментах с растениями семена предварительно калибровали, растения культивировали в контролируемых условиях освещения (день/ночь - 14 ч/10 ч), температуры (24°/20°С), относительной влажности воздуха (70%), необходимость полива определяли взвешиванием сосудов.

Анализ растений включал в себя определение всхожести, энергии (скорости) прорастания семян, приживаемости растений, измерение надземной и подземной биомассы (по длине или по сухому весу), в некоторых экспериментах -оценку площади поверхности корней. Сбор корневых экссудатов проводили согласно (Egle et al. 2003), разделение на фракции и анализ - по Johnson et al. (1996). Определение хлорофиллов в листьях растений проводили по (Методы биохимического анализа растений, 1978). Содержание белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Активность ферментов оксидазы, пероксидазы и тирозина-зы в тканях и корневых экссудатах растений определяли спектрофотометрически (Criquet et al., 2000). Ферментативную активность корневых выделений сорго по отношению к ПАУ и их производным изучали, используя методику Gunther et al. (1998).

Анализ образцов грунта включал в себя определение его влажности содержания общего органического углерода (Практикум по агрохимии, 1987), нитратного азота (Андреюк с соавт., 1988), водорастворимого аммония и подвижного фосфора (Р2О5) (ОСТ 46 41-76) с использованием фотоэлектроколориметриче-ских методов, а также остаточной концентрации углеводородного загрязнителя.

Содержание в жидкой среде сырой нефти или в почве нефтешлама определяли гравиметрическим методом с предварительной экстракцией растворителем (ССЦ или CHCI3) и селективной жидкостной колоночной хроматографией (Методы анализа органического вещества, 1977; Яковлев, 1987). Содержание дизельного топлива в жидкой среде или в почве проводили методом экстракции его из среды растворителем (CCU) и ГХ-анализом экстрактов. Анализ фенантрена и других ПАУ после экстракции их из грунта одним из указанных растворителей проводили с использованием ГХ или ВЭЖХ.

Все варианты описанных экспериментов и анализов имели не менее, чем трехкратную повторность. Для всех полученных данных вычисляли средние значения, для сравнения которых использовали показатели стандартного отклонения и наименьшей существенной разницы. Статистическую обработку полученных результатов проводили при Р < 0,05 с помощью программного обеспечения Statis-tica software version 7 (StatSoft Russia) и Microsoft Excel 2003.

Глава 3. Результаты и обсуждение

Влияние углеводородного загрязнения на структуру и функции ризо-сферного микробного сообщества

Попадание углеводородов в окружающую среду влечет за собой качественные и количественные изменения почвенной микрофлоры как на популяцион-ном уровне, так и на уровне микробной клетки. Анализ таких изменений может представлять интегральную информацию о состоянии окружающей среды и использоваться как биологический индикатор почвенного здоровья (А1койа й а1., 2003; Ра1ттоЙ1 а1., 2007; Оно й а1., 2012). К настоящему времени воздействие нефтяных углеводородов на почвенную микрофлору хорошо изучено, однако эколого-функциональные реакции ризосферных микробных сообществ на углеводородное загрязнение исследованы недостаточно. Вместе с тем, особенности ризосферы как экологической ниши (насыщенность питательными веществами, повышенная численность и физиологическая активность микроорганизмов) предполагают иной характер реакций микрофлоры на загрязнение в сравнении с почвой без растений. Исследование структуры и функций микробного сообщества корневой зоны растений в условиях углеводородного загрязнения позволяет выяснить причины и следствия повышения деградации органического загрязнителя в почве с растениями, которое лежит в основе эффекта фиторемедиации.

Анализ образцов ризосферы растений, выращенных в чистой и загрязненной различными поллютантами (нефтешламом, дизельным топливом, битумом и ПАУ) почве, позволил выявить качественные и количественные изменения в .микробном сообществе корневой зоны и ряд общих закономерностей влияния углеводородного загрязнения на формирование ризосферного микробоценоза. Обобщенные результаты пяти независимых экспериментов, проведенных в разное время в разных условиях с десятью видами растений, представлены на рис. 1 и 2.

8,00

7,50

^ 7,00 о

^ 6,50 ш §6,00

5,00

Рис.

- 8,00

7,50 | 7,00

¿6,50 ш

§.6,00 о>

5,50 5,00

2 недели 2 месяца 2 года 2 недели 2 месяца 2 года

а б

1. Влияние углеводородного зшрязнения на численность почвенных гетеротрофных микроорганизмов в незасеянной почве (а) и в ризосфере растений (б): И - чистая почва; ЁЁШ - почва, загрязненная углеводородами.

Во-первых, в ризосфере в отличие от почвы без растений увеличенная под влиянием поллютанта численность почвенных микроорганизмов продолжи-

тельное время поддерживается на высоком уровне (рис. 1.). Установлено, что через 2 недели после загрязнения, т.е. поступления в среду дополнительного источника углерода (углеводородов), происходило увеличение общей численности микроорганизмов в почве как с растениями, так и без них с той лишь разницей, что в ризосферной почве численность микроорганизмов по определению выше. Регрессионный анализ полученных данных подтвердил, что на первых этапах наибольшее влияние на повышение численности почвенных гетеротрофных микроорганизмов оказывал загрязнитель ((> = 0,738; Р < 0,0001). С течением времени этот показатель приобретал зависимость от присутствия растений, а также внесения азотного удобрения. Так, через 2 года в загрязненной почве без растений происходило отчетливое снижение численности микробной популяции, тогда как в почве под растениями она, как и прежде, оставалась на высоком уровне, (рис. 1, б). Обнаружена тесная положительная корреляция между биомассой растений и численностью гетеротрофных микроорганизмов (R2 = 0,47, Р < 0,05). Большая плотность ризосферных микробных популяций свидетельствует о более благоприятных и стабильных условиях ризосферы по сравнению с почвой без растений. Таким образом, растение в условиях загрязнения является фактором, поддерживающим и/или увеличивающим численность почвенных микробных популяций, предоставляя им нишу и дополнительное питание для размножения и выполнения защитных функций от воздействия поллютанта, интенсифицируя тем самым процессы самоочищения загрязненной почвы.

Отчетливое влияние на изменение численности почвенных гетеротрофных микроорганизмов оказывал тип (химический состав) поллютанта. Так, в первые недели загрязнения увеличение микробного числа в случае дизельного топлива было более значительным, чем в случае нефтешлама - в 6 и в 3,4 раза соответственно. В опыте с дизельным топливом (10 г/кг) численность микроорганизмов в почве без растений снизилась почти до исходного значения к 72 сут, а в опыте с нефтешламом (15,6 г/кг) - оставалась в 4,5 раза выше и к 120 сут. Мы полагаем, что наблюдаемые различия отражали преобладающее развитие в почвенных популяциях микроорганизмов той или иной экологической стратегии: г-стратегов - в случае дизельного топлива и К-стратегов - в случае нефте шлама. Это предположение хорошо согласуется с данными по биодоступности углеводородов различных групп. Предельные углеводороды с числом углеродных атомов от С8 до С26, представляющие основную часть дизельного топлива являются более доступными для биотрансформации/биодеградации широким спектром микроорганизмов (Chaineau et al., 2005; Fritsche and Hofrichter, 2008) по сравнению с высокомолекулярными парафинами и ПАУ, составляющими основу неф-тешлама и разрушающимися специфичной микрофлорой заметно медленнее (Hasanuzzamana 2007; Mrozik et al., 2003).

Во-вторых, физиологическая структура микробных сообществ в ризосфере характеризуется большей устойчивостью и меньше подвержена изменениям под влиянием загрязнителя, чем в почве без растений. Загрязнение почвы углеводородами приводит к нарушению баланса основных питательных элементов - углерода, азота, фосфора и др., что влечет за собой существенные перестройки физиологической структуры почвенного микробоценоза. Однако эти пе-

рестроики неоднозначны и зависят от присутствия и вида растений, корневые выделения которых могут по-разному изменять баланс питательных элементов в почве. Анализ основных физиологических групп почвенных микроорганизмов (аммонифицирующих, нитрифицирующих, денитрифицирующих, азотфикси-рующих, фосфатрастворяюших, сероокисляющих и целлюлозолитических), показал, что численность всех исследованных групп в ризосферном сообществе выше, а изменения его структуры под влиянием поллютанта менее выражены, чем в почве без растений. Следовательно, выращивание растений в загрязненной почве приводит к увеличению численности микроорганизмов всех основных физиологических групп, обеспечивающих трансформацию важнейших минеральных и органических компонентов в почве, что свидетельствует об активизации главных биохимических процессов, связанных с превращениями соединений азота, фосфора, серы, целлюлозы и др.

В-третьих, в ризосфере растений, выращенных в загрязненной почве, абсолютная численность деструкторов выше, чем в почве без растений, а их доля в общей ризосферной микробной популяции -меньше (рис. 2).

Чистая ¡Загрязненная Чистая ¡Загрязненная Без растений С растениями

Рис. 2. Доля деструкторов в общей популяции почвенных гетеротрофных микроорганизмов: ШИ - деструкторы углеводородов; И - культивируемые гетеротрофные микроор-

Показано, что загрязнение углеводородами почвы без растений приводило к увеличению не только абсолютной численности микроорганизмов, в том числе и деструкторов, но также и доли деструкторов в почвенной микрофлоре с 38 до 46%. В ризосфере растений абсолютная численность микроорганизмов-деструкторов также увеличивалась, но ее доля в общей микробной популяции была значительно ниже (12 и 31% в чистой и загрязненной почве соответственно). Высокий процент деструкторов при их сравнительно невысокой численности в почве без растений свидетельствовал о нарушенном состоянии ее микробоцено-за, где главная роль отведена организмам, способным противостоять воздействию стрессового фактора (Saxtone and Atlas, 1977). Большая насыщенность ризосферы разнообразными углеродными субстратами, выделяемыми корнями, обеспечивает рост микроорганизмов с более широкими метаболическими возможностями по сравнению с почвой без растений, где появление дополнительного источника уг-

лерода при внесении углеводородного поллютанта стимулирует рост лишь специфической популяции деструкторов. Таким образом, большая микробная плотность и широкий спектр метаболизируемых субстратов в ризосфере могут обеспечивать более активную и полную деградацию поллютанта по сравнению с почвой без растений.

Проведенные исследования выявили отличия в реакциях ризосферной и неризосферной (почвы без растений) микрофлоры на загрязнение среды углеводородами, количественные и качественные преимущества микробных сообществ корневой зоны растений, обеспечивающие эффективность фиторемедиации и ее достоинства - стабильность и пролонгированность очистки.

Деструктивный потенциал ризосферных микроорганизмов

по отношению к нефтяным углеводородам

Для изучения деструктивного потенциала микроорганизмов корневой зоны растений по отношению к нефтяным углеводородам было проанализировано 49 образцов нефтезагрязненной ризосферной почвы, из которых были изолированы микроорганизмы-деструкторы. Исследование спектра деструктивной активности выделенных ризосферных микроорганизмов позволило создать коллекцию из 115 штаммов, способных подвергать деградации сырую нефть, дизельное топливо и ПАУ (нафталин, фенантрен, антрацен и флуорен).

Деградация фенантрена ризосфгрпым штаммом Ensifer meliloti Р221

Подробное исследование углеводородокисляющей активности у одного из выделенных ризосферных штаммов - Ensifer meliloti Р221, изолированного с поверхности корней тростника южного (Phragmites australis), выращенного в загрязненном ПАУ грунте, представляло интерес в связи с таксономической принадлежностью этого микроорганизма. До недавнего времени сведения о способности к деградации каких-либо углеводородов представителями рода Ensifer (ранее Sinorhizobium) отсутствовали и до сих пор очень ограничены (Keum et al., 2005).

Установлено, что штамм Е. meliloti Р221 способен подвергать деградации флуорен и фенантрен как в качестве единственных источников углерода и энергии, гак и в присутствии косубстрата - янтарной кислоты. За 5 сут культивирования в среде, содержащей фенантрен в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрации от 0,1 до 1,0 г/л, штамм разрушал от 60 до 10% ПАУ соответственно. Исследование ростовых характеристик бактерии при ее культивировании в среде с фенантреном (0,1 г/л) как единственным источником углерода и энергии, так и в присутствии янтарной кислоты (1 г/л) показало, что Е. meliloti Р221 характеризовался невысокой скоростью роста как на ПАУ (0,045 ч" '), так и на органической кислоте (0,07 ч"1) - типичном для этих бактерий источнике углерода.

Е. meliloti Р221 демонстрировал выраженную способность к деградации фенантрена как в качестве единственного источника углерода и энергии, так и в присутствии косубстрата (янтарной кислоты или даже при росте на МПА), что

дало основание для изучения метаболизма ПАУ у этого микроорганизма. Идентификация образующихся метаболитов показала, что фенантрен разрушается штаммом Е. теШой Р221 неполностью, с накоплением мажорного интермедиата 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты (рис. 3.).

40 г-~

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 сут.

Рис. 3. Динамика деградации фенантрена

(0,3 г/л) и накопления 1-щцрокси-2-нафтойной кислоты в среде после культивирования штамма Е. теШоН Р221: А и в - среда с добавлением янтарной кислоты (1 г/л); с и Д - среда с фенантре-ном в качестве единственного источника углерода и энергии; » и о - фенантрен; А и Д - 1-гидрокси-2-нафтойная кислота

По результатам всех проведенных анализов кроме 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты в экстрактах среды после культивирования штамма Е. теШой Р221 были идентифицированы 9,10-дигидро-9,10-дигидроксифенантрен, 9,10-

фенантренхинон, бензокумарин (предположительно 7,8-бензокумарин) и салициловая кислота (табл. 1).

Таблица 1 - Масс-спектрометрические и хроматографические характеристики метаболитов, идентифицированных в экстрактах среды после культивирования штамма Е. meliloti Р221 в присутствии фенантрена (0,3 г/л) в качестве единствешюго источника углерода и энергии

Метаболит RS (ТСХ) Rt, мин Характеристические пики в масс-спектре, m/z фрагментных ионов (интенсивность, %) Идентификация Ссылки

1 0,25 15,0 М* 212 (66), 194 (42), 181 (75), 165 (100), 152(28), 139(7), 115(10), 82 (8), 77 (11), 55 (8), 41 (8) 9,10-дигидро-9,10-дигидрокси-фенантрен Moody et al., 2001

2 0,39 13,4 М+209 (100), 181 (88), 163(10), 121(10) 9,10-фенантренхинон Hadibarata and Tachibana, 2010

3 0,42 М+ 235 (10), 197 (100), 169 (66), 153 (22), 141 (15), 123 (10) бензокумарин Seo et al., 2006; Baboshin et al., 2008

4 0,58 14,2 Мт 188 (41), 170 (100), 165 (14), 143 (13), 115 (34), 114 (23), 81 (18), 69 (31), 55 (20), 43 (27) 1-гидрокси-2-нафтойная кислота Seo et al., 2006; Baboshin et al., 2008

5 0,50 8,1 М+ 138(37), 120(100), 92 (90), 64 (46) салициловая кислота Mallick et al., 2007

Биоконверсия фенантрена осуществляется по двум параллельным путям: (а) через расщепление терминального ароматического кольца (по связи СЗ-С4) с образованием бензокумарина (предположительно 7,8-бензокумарина) и 1-

гидрокси-2-нафтойной кислоты; (б) через окисление центрального ароматического кольца по связи С9-С10 с образованием 9,10-дигидро-9,10-дигидроксифенантрена и 9,10-фенантренхинона. Судя по количественному преобладанию 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты во всех образцах, первый путь является доминирующим, характеризуется накоплением этого метаболита, дальнейшее разрушение которого затруднено и/или протекает очень медленно с образованием салициловой кислоты. Предположительно, среди продуктов первых этапов трансформации фенантрена до бензокумарина, должен быть 3,4-дигидро-3,4-дигидроксифенантрен (на рис. 4 обозначен в скобках). Присутствие этого метаболита, впрочем, могло маскироваться 9,10-дигидро-9,10-дигвдроксифенантреном, имеющим с ним одинаковую молекулярную массу и характеристические пики в масс-спектре, но идентифицированного по характерной интенсивности пиков.

Анализ данных проведенных исследований позволил представить следующую схему превращения фенантрена штаммом Е. теШой Р221 (рис. 4).

о9

фенангрен

он

3,4-дигидро-3,4-дигидрокси-фенангрен

он

•СООН

но

7,8-бензкумарин 1-гидрокси-

2-нафтойная кислота

салициловыи альдегид

ХЗН

он

9,10-дигидро-9,10-дигидрокси-фенактрен

о 9,10-фенантренхинон

Ч/ч СООН СООН

2,2'-дифеновая кислота

он

^ХООН

салициловая кислота

Рис. 4. Предполагаемая схема деградации фенантрена штаммом Ensifer meliloti Р221

Второй путь превращения фенантрена приводит к образованию 2,2'-дифеновой кислоты, Диоксигенирование фенантрена по С9 и СЮ атомам, доказанное идентификацией характерных метаболитов - 9,10-дигидро-9,10-дигидроксифенантрена и 9,10-фенантренхинона, является крайне интересным фактом, ранее описанным лишь для высших грибов, позже обнаруженным у но-кардиоподобных микроорганизмов Mycobacterium и Arthrobacter, и впервые показанным нами для представителя симбиотических бактерий, в частности рода Ensifer.

Деградация углеводородов и устойчивость к тяжелым металлам

Присутствие тяжелых металлов в нефти означает загрязнение окружающей среды в результате нефтеразливов не только органическими, но и неорганическими поллютантами (Арене с соавт., 1999). Обладая ингибирующим действием на окислительные ферменты, тяжелые металлы могут препятствовать деградации углеводородов. В этой связи, выделение микроорганизмов-деструкторов уг-

леводородов, обладающих устойчивостью к тяжелым металлам, с одной стороны, и ризосферных бактерий, способных увеличивать поглощение тяжелых металлов растениями, с другой стороны, представлялось целесообразным и перспективным. В результате была собрана коллекция из 52 штаммов, проявляющих устойчивость к одному из основных «нефтяных металлов» № (II), при его концентрации в среде от 1 до 5 мМ. Из числа выделенных микроорганизмов 16 проявляли перекрестную устойчивость к Сс! (II), РЬ (П) и Аз (III), а 5 сочетали устойчивость к тяжелым металлам со способностью к деградации углеводородов (табл. 2).

Таблица 2 - Деградация дизельного топлива (10 г/л) устойчивыми к никелю ризосферными штаммам!

I Итамм МИК Ni2+, мМ Деградация дизельного топлива (10 г/л), % за 5 сут.

Mycobacterium komosserise N1 4 31,0±2,3

Rhodococcus sp. N3 >5 23,0±4,5

Rhodococcus sp. N6 5 34,4+1,1

Mycobacterium sp. N7 >5 45,5+2,3

Mycobacterium komossense N8 4 27,(Н: 1,4

Среди отобранных штаммов особый интерес представлял Mycobacterium sp. N7, выделенный из ризосферы мелколепестника канадского (Erigeron canadensis), способный расти в присутствии 5 мМ двухвалентного никеля и подвергать деградации дизельное топливо (10 г/л), содержащееся в минеральной среде в качестве единственного источника углерода и энергии, на 45 % за 5 сут культивирования. Тестирование свойств этого штамма при культивировании в среде, содержащей гексадекан в концентрации 1 г/л и Ni (II) в концентрации 1 мМ, показало несущественное снижение деструктивной активности в отношении углеводорода под влиянием ионов тяжелого металла: с 95% в варианте без никеля до 80% в присутствии металла. Таким образом, выделенный штамм может быть перспективным интродуцентом для использования в технологиях био- и фитореме-диации почв, загрязненных углеводородами в сочетании с тяжелыми металлами.

Деградация углеводородов ассоциативными бактериями рода Azospirillum

С целью выявления микроорганизма, способного улучшать рост растений в загрязненной углеводородами почве как за счет стимуляции роста растений, так и за счет снижения фитотоксичности грунта путем деградации поллютанта, был проведен скрининг коллекции ризоссферных микроорганизмов ИБФРМ РАН, основу которой составляют бактерии рода Azospirillum - типичные ризосферные микроорганизмы, тесно ассоциированные с корнями растений и, как правило, обладающие выраженной стимулирующей рост растений активностью. В результате исследований было впервые установлено, что азоспириллы обладают устойчивостью к сырой нефти (10 г/л), а некоторые штаммы - способностью к ее биодеградации. Из 33 коллекционных азоспирилл 18 проявляли рост в присутствии сырой нефти на среде, содержащей яблочную кислоту (2 г/л) в качестве дополнительного источника углерода и энергии. На минимальной солевой среде М9 в

присутствии нефти как единственного источника углерода и энергии были способны расти только 2 штамма: АгохртПит ьр. БЯ4 и Аго.чртИит яр. 81166. Количественная оценка деструктивной активности азоспирилл по отношению к нефти позволила выявить штаммы А. Иро/егит 81142 и А. ЬгаяИепяв 81180, демонстрирующие максимальную убыль углеводородного субстрата через 14 сут культивирования в среде с яблочной кислотой (58 и 57% соответственно). Спектр нефтепродуктов, в присутствии которых отобранные штаммы проявляли рост, включал в себя кроме сырой нефти керосин, дизельное топливо, вазелиновое и смазочное масла.

Подробное исследование деструктивной активности по отношению к углеводородам сырой нефти у А. Ъгах'йете БК80 показало, что по сравнению с абиотическим контролем в присутствии яблочной кислоты штамм способен разрушать 25% сырой нефти при ее исходной концентрации в среде 10 г/л. Деградации подвергались преимущественно предельные алифатические углеводороды и это подтверждалось изменением соотношения фракций остаточной нефти (табл. 3 и рис. 5).

Таблица 3 - Измените концентрации и соотношения фракций сырой нефти (10 г/л) в среде под влиянием штамма A. hrasilense SR80 (14 сут)

Концентрация, г/л Соотношение, %

Фракции Исходная Абиотический контроль А. brasilense SR80 Исходное Абиотический кошроль А. brasilense SR80

Парафины 3,81±0,27 2,96±0,21 1,60±0Д1 56 52 41

Нафтены 1,35±0,09 1,06±0,07 0,73±0,05 15 19 17

МБЦА 0,63±0,04 0,48±0,03 0,55±0,04 9 8 14

ПАУ 0,57±0,05 0,53±0,04 0,4±0,03 8 9 10

СБС 0,78±0,05 0,67±0,05 0,64±0,05 11 12 16

Рассчитанная скорость биодеградации сырой нефти штаммом А. brasilense SR80 (0,18 г/л в сут) несколько уступает аналогичным показателям, описанным для типичных родов нефтеокисляющих микроорганизмов Rhodococ-cus, Mycobacterium и Pseudomonas в оптимальных лабораторных условиях (0,25 -2,5 г/л в сут, Atlas, 1991), Несмотря на это, полученные данные позволяют нам утверждать, что в условиях нефтяного загрязнения азоспириллы могут вносить существенный вклад в деградацию углеводородов не только стимулируя рост растений, которые, в свою очередь, поддерживают численность этих микроорганизмов в своей корневой зоне, но также посредством прямой деградации поллю-танга.

2500

С11 С12 С13 С14 С15 С16 С17 С18 С19 С20 С21 длина углеродной цепи

Рис. 5. Деградация сырой нефти штаммом Л. brasilense SR80 (газовая хроматография): И - контроль (14 сут); 111 -A. brasilense SR80 (7 сут);

ИЗ -A. brasilense SR80 (14 сут)

Таким образом, в результате проведенных исследований выявлена и изучена деструктивная активность в отношении углеводородов нефти у представителей типичных ризосферных бактерий, принадлежащих к родам Azospirillum, Ensi-fer и Mycobacterium. Деструктивная активность штаммов проявлялась в присутствии карбоновых кислот - мажорных компонентов корневых экссудатов растений, которые могут использоваться бактериями в качестве косубстратов в процессах соокисления углеводородов. Это молено считать особенностями бактерий, находящихся в постоянном взаимодействии с корневой системой растений. Полу ченные характеристики ризобактерий-деструкторов представляют самостоятельный научный интерес, а также позволяют рассматривать их как потенциальных ин-тродуцентов для использования в технологиях биоаугментации и фиторемедиа-ции.

Реакции растений на загрязнение окружающей среды углеводородами

Отбор растений, проявляющих выраженную устойчивость к загрязнению почвы углеводородами, служит важным первым шагом на пути скрининга перспективных фиторемедиантов, а изучение особенностей их прорастания и развития в присутствии поллютанта позволяетт определить параметры искусственной интроду кции растительности на загрязненных территориях с целью их фитореме-диации.

Фитотоксичностъ загрязненной углеводородами почвы исследовали в чашечных тестах и в вегетационных опытах с 8 (в случае дизельного топлива) или 16 (в случае нефтешлама) видами растений. Обобщенные данные по влиянию углеводородных поллютантов на всхожесть, рост корней и побегов растений представлены на рис. 6.

Всхожесть Энергия Побеги Корни прорастания

-20

" Всхожесть Энергия Побеги Корни

Всхожесть Побеги Корни прорастания

в г

Рис. 6. Фитотоксический эффект почвы, загрязненной нефтешламом (с/ ,б - 15,6 г/кг) и дизельным топливом (в, г - 10 г/кг): а, в - чашечные тесты; б, г - вегетационные опыты

Проведенные исследования показали, что углеводородное загрязнение грунта как легкими нефтепродуктами (дизельное топливо), так и тяжелыми нефтяными фракциями (нефтешлам) оказывало выраженный эффект на растительность, который проявлялся преимущественно ингибированием, но в некоторых случаях и стимулированием развития растений. Наиболее чувствительными показателями фитотоксичности почвы являлись энергия прорастания (скорость прорастания) семян и накопление растительной биомассы. Характер фитотоксиче-ского эффекта почвы зависел от типа углеводородного загрязнения (например, развитие овсяницы и райграса ингибировалось нефтешламом, но стимулировалось дизельным топливом), вида растений и условий их культивирования - на поверхности почвы в чашках Петри или в толще почвы в вегетационных сосудах.

Выявлены различия в результатах оценки фитотоксичности загрязненной почвы в чашечном тесте и в вегетационном опыте, что, связано с разницей в условиях проращивания семян и продолжительностью наблюдений. Временные ограничения чашечного теста (5 сут) позволяют регистрировать лишь начальные проявления фитотоксичности, а иногда и еще отсутствие таковых. Так, показано, что углеводородный загрязнитель ингибировал не столько способность, сколько скорость прорастания семян, что не позволял зарегистрировать чашечный тест, в котором всхожесть семян оказывалась заниженным показателем, хотя и демонст-

ЕЭбез удобрения 0с аммиачной селитрой

рировала отрицательную зависимость от концентрации загрязнителя (рис. 6, а, б). В целом, при одинаковом объеме выборки данных (не менее 3-х повторностей для 8-16 видов растений) чашечные тесты показывали больший разброс данных. Поэтол1у при использовании чашечного теста в качестве экспресс-метода для скрининга перспективных для фиторемедиации видов растений полученные данные необходимо уточнять вегетационными экспериментами.

При анализе фитотоксичности в чашечном тесте традиционно используемые в фиторемедиации пастбищные злаки обнаруживали наибольшую степень чувствительности к присутствию нефтешлама в грунте, тогда как зерновые -наименьшую, что может быть связано с большей массой их семян (Robson et al., 2004). Бобовые занимали промежуточное положение. Овес и ячмень демонстрировали увеличение корней и побегов проростков под действием нефтешлама, однако оно сопровождалась их дистрофией (утончением, нарушением ориентации). По данным вегетационных опытов максимальный фитотоксический эффект загрязненной нефтешламом почвы отмечался для бобовых, пастбищные злаки подтвердили высокую степень чувствительности к загрязнителю, а для зерновых злаков фитотоксичность почвы складывалась из двух противоположных эффектов. С одной стороны, все исследованные зерновые злаки выгодно отличались от других растений, обнаруживая отчетливую стимуляцию всхожести в почве, загрязненной нефтешламом (15,6 г/кг), с другой стороны - снижение биомассы под влиянием токсиканта у зерновых было более значительным по сравнению с пастбищными злаками, среди которых наибольшей толерантностью отличался райграс. Чувствительность растений к токсичности нефтешлама проявлялась на разных этапах онтогенеза: у одних - на стадии всходов, у других - через месяц-полтора культивирования.

Для почвы, загрязненной дизельным топливом (10 г/кг), было показано, что в условиях чашечного теста загрязнитель оказывал преимущественно стимулирующее, а в условиях вегетационного - ингибирующее воздействие на растения (рис. 6, в, г). О стимуляции роста и развития растений нефтяными углеводородами сообщалось и ранее, что, предположительно может быть связано с гормо-но-подобным эффектом загрязнителя, а также использованием его как питательного субстрата (Salanitro et al., 1997; Liste and Prutz, 2006). В то же время, по данным нашего вегетационного опыта установлено, что стимуляция всхожести семян дизельным топливом не обеспечивала их успешное развитие и приживаемость в условиях длительного культивирования: наблюдалось отчетливое ингибирующее воздействие поллютанта на прирост биомассы растений в течение всего опыта (70 сут) (рис. 6, г). Внесение в загрязненную почву азотного удобрения незначительно компенсировало ее фитотоксичность.

Токсическое действие углеводородов на развитие растений в загрязненном дизельным топливом грунте сопровождалось пожелтением и засыханием листьев, что могло быть связано с транспирацией через растение токсичных соединений. Углеводороды оказывали заметное влияние на фазы онтогенеза растений, например, стимулируя фазу цветения у одних и замедляя развитие других.

Изменение морфометрических параметров растений под влиянием углеводородов связано с изменением их биохимических характеристик, отражающих

токсическое воздействие поллютанта и адаптивные реакции растения на стресс в условиях загрязнения. Обнаружено отчетливое токсическое воздействие углеводородов на фотосинтетические пигменты растений, что проявлялось в уменьшении содержания в листьях хлорофиллов а и b и увеличении их соотношения {alb). Чувствительность аппарата фотосинтеза к углеводородам отличалась у растений разных видов и определялась химическим составом токсиканта.

Изменения биохимических и физиологических характеристик растения в ответ на стресс проявляются раньше, чем становятся видны его морфологические изменения (Radetski et al., 2000; Alkio et al., 2005). Учитывая это, в условиях загрязнения углеводородами можно ожидать отчетливые изменения биохимических и физиологических процессов, среди которых корневая экссудация имеет фундаментальное значение для фиторемедиации, т.к. корневые выделения являются связующим звеном в сложной системе растение-микроорганизмы-загрязнитель.

Влияние ПАУ на корневую экссудацию растения

На примере трехкольцевого ПАУ фенантрена было показано (табл. 4), что корневая экссудация сорго не изменялась под влиянием фенантрена, внесенного в грунт в концентрации 0,01 г/кг. Уменьшение числа прижившихся растений и значительное угнетение корневой системы (массы корней почти в 3 раза, поверхности корней - более чем в 2 раза) наблюдалось при концентрации фенантрена 0,1 г/кг. Это приводило к отчетливому (на 65%) сокращению общего количества корневых выделений в грунте, однако интенсивность корневой экссудации под влиянием указанной концентрации ПАУ существенно не изменялась. Таким образом, можно заключить, что фенантрен в концентрации до 0,1 г/л не оказывает существенного влияния на процесс выделения веществ корнями.

Фракционирование корневых выделений сорго веничного позволило определить в их составе карбоновые кислоты, свободные сахара, аминокислоты и белки, и выявить изменения под влиянием фенантрена.

В корневых экссудатах растения было идентифицировано 7 карбоновых кислот, среди которых преобладали яблочная, транс-аконитовая и лимонная. Среди обнаруженных 13 аминокислот количественно доминировали аланин, лейцин, серии и глицин. Из числа свободных Сахаров были выявлены галактоза, мальтоза, глюкоза и фруктоза, содержание последней составляло более половины всех углеводов. По сравнению с незагрязненным контролем экссудация этих соединений, казалось, увеличилась при уровне фенантрена 0,01 г/кг. Более детальное исследование выявило достоверное увеличение количества выделяемой мальтозы (на 12%). Мы предполагаем, что такое увеличение экссудации Сахаров может быть следствием изменений биохимических процессов (например, распад крахмала) в растении в ответ на стресс, вызванный присутствием в окружающей среде поллютанта. Других изменений в качественном составе исследованных низкомолекулярных водорастворимых соединений, выделяемых с корневыми экссудатами сорго, под влиянием фенантрена не обнаружено.

Таблица 4 - Влияние фенантрена на развитее корневой системы и выделение основных водорастворимых компонентов корневых экссудатов сорго веничного, выращенного в песчаной культуре

Параметр Фенантрен, г/кг

0 0,01 0,1

Сухая биомасса побегов, г/растение 0,311 а 0,286 а 0,119 г»

Сухая биомасса корней, г/растение 0,147 а 0,127 Ь 0,052 с

Площадь корневой поверхности, дм2/растение 1,041 а 1,035 а 0,494 Ъ

Количество корневых выделений, мг/ч на растете 1,322 а 1,200 а 0,466 Ъ

Интенсивность корневой экссудации, мг/дм2'ч 1,278 а 1,163 я 1,033 а

Выделение основных водорастворимых компонентов

корневых экссудатов, мг/дм2 "ч:

карбоновые кислоты 221,5 а 203,8 а 187,4 о

свободные сахара 42,4 аЪ 67,1 а 25,2 Ъ

свободные аминокислоты 9,5 а 9,1 а 1,6 а

белки 20,7 а 11,7 Ъ 5,3 с

Примечание. Значения в строке, помеченные одинаковыми строчными буквами, достоверно не отличаются друг от друга (Р=0,05).

В ответ на воздействие фенантрена отмечалось снижение выделения корнями белковых соединений (см. табл. 4), но одновременно в экссудатах, так же как и в тканях растения, увеличивалась активность оксидоредуктаз, коррелируя с увеличением концентрации углеводорода в среде (табл. 5). С использованием тест-субстратов в корневых экссудатах сорго веничного была обнаружена ферментативная активность оксидазы, пероксидазы и тирозиназы. Пероксидазы являюсь доминирующими окислительными ферментами в корневых выделениях сорго веничного.

Таблица 5 - Влияние фенантрена на активность ферментов, выделяемых с корневыми экссудатами сорго веничного (Е/мг белка)

Фермент Фенантрен, г/кг

0 0,01 0,1

Оксидаза

АБТС (рН 3,6) 0,058 а 0,264 а 0,184 а

Пероксидаза

АБТС (рН 3,6) 0,085 Ь 0,485 а 0,706 а

Сирингальдазин, (рН 7,5) 0,004 а 0,034 а 0,092 а

2,7-ДАФ, (рН 6,0) 0,001 с 0,009 Ъ 0,017 а

Тирозиназа

ОЬ-ДОФА (рН 7,5) 0,075 с 0,174 Ъ 0,248 а

Примечание. Значения в строке, помеченные одинаковыми строчными буквами, достоверно не отличаются друг от друга (/'=0,05).

Активность ферментов корневых экссудатов по отношению к ПАУ и их производным

Увеличение продукции и активности растительных оксидоредуктаз, выделяемых в среду корнями растений, делает возможным их участие в ризосфер-ной детокискации/деградации поллютанта. Для проверки этого предположения с использованием лиофилизированных препаратов корневых экссудатов сорго ве-ничного изучали активность выделяемых в ризосферу растительных оксидоре-дуктаз по отношению к ряду ПАУ и их частично окисленным производным -микробным метаболитам. Согласно полученным данным (табл. 6), восстановленные корневые экссудаты сорго не окисляли нативные ПАУ в качестве единственного субстрата. В присутствии синтетических медиаторов окислению подвергались флуорен и пирен, а также наблюдалось окисление ПАУ-производных - 1-гидрокси-2нафтойной кислоты, 2-карбоксибензальдегида, 1,2-

дигидроксинафалина и нафтолов. Пероксидазное оксиление 1,2-дигидроксинафталина нами обнаружено впервые.

Таблица 6 - Окисление ПАУ и их производных препаратами корневых экссудатов сорго вешиного в присутствии медиаторов (в % убыли субстрата)

Субстрат Используемые медиаторы

АБТС АБТС+ Н202 ПЬ-ДОФА

Фенантрен 0 0 0

Антрацен 0 0 0

Флуорен 0 0 13,8±3,6

Флуорантен 0 0 0

Пирен 10,9+4,7 0 0

1 -1 'идрокси-2-нафтойная кислота 15,3±11,3 71,0±11,5 0

2-Карбоксибензальдегид 0 0 9,5±2,7

1,2-Дигадроксинафталин 0 32,1±12,1 35,6±6,6

1 -Нафтол 26,7±4,9 38,6±4,0 0

2-Нафтол 0 82,4±3,1 33,7±5,4

Увеличение тирозиназной активности корневых экссудатов сорго, выращенного в загрязненном фенантреном грунте, и окисление некоторых ПАУ-производных (2-карбоксибензальдегида, 1,2-дигидроксинафталина и 2-нафтола) в присутствии ОЬ-ДОФА в качестве медиатора позволили утверждать, что тирози-наза также может быть вовлечена в ризосферную деградацию ПАУ.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности непосредственного участия растений в деградации ПАУ. При этом растительные ферменты, по-видимому, не играют существенной роли в первичной атаке на молекулы этих соединений в окружающей среде. В ходе ризосферной деградации ПАУ эту функцию выполняют преимущественно микробные оксидоредуктазы. В свою очередь, частично окисленные ими ПАУ, которые являются более биодоступными и биодеградабельными, затем могут служить субстратами для выделяемых корнями растительных ферментов. Изложенное выше указывает на возмож-

ность сопряженного растительно-микробного метаболизма ПАУ в ризосферной зоне.

Растительно-микробные взаимодействия в условиях

углеводородного загрязнения

Реализация адаптационного и деструктивного потенциала растений и ассоциированных с ними микробных комплексов в условиях углеводородного загрязнения может приводить к усилению очистки среды, с одной стороны, и изменению растительно-микробных взаимодействий - с другой. Взаимоотношение растений и микроорганизмов в ризосфере складывается из направленных друг на друга воздействий партнеров. Влияние растений на формирование микробоцено-зов в почве реализуется через предоставление ниши для обитания микроорганизмов (собственно корневой системы) и корневые выделения, регулирующие развитие ризомикрофлоры. В свою очередь, метаболическая активность микроорганизмов, их способность к продукции биологически активных веществ в значительной степени обеспечивают рост и развитие растений. Выявление изменений влияния партнеров растительно-микробных ассоциаций друг на друга под действием углеводородного загрязнения являлось задачей приведенных ниже исследований.

Влияние растений на почвенные микроорганизмы в чистой и загрязненной углеводородами почве различается и, как показали проведенные исследования, в присутствии поллютанта имеет некоторые особенности:

- присутствие загрязнителя влияет на проявление ризосферного эффекта - феномена повышенной численности и активности почвенных микроорганизмов в корневой зоне растений, обогащенной корневыми экссудатами;

- некоторые растения селективно подцерлшвают в своей ризосфере численность .микроорганизмов-деструкторов;

- пространственная локализация микроорганизмов - деструкторов углеводородов в корневой зоне растения зависит от типа загрязнителя.

Анализ образцов почвы из-под растений, выращенных в условиях вегетационного опыта, показал, что в загрязненной углеводородами почве ризосферный эффект (R/S; отношение численности микроорганизмов в ризосфере к численности микроорганизмов в незасеянной почве) был в 1,6-17,5 раз больше, чем в чистой. Таким образом ризосферный эффект более выражен в присутствии загрязнителя (рис. 7, А).

Установлено, что растения по-разному стимулируют почвенную микрофлору и ризосферный эффект, рассчитанный для гетеротрофов в целом отличался от показателя R/S для деструкторов у большинства растительных видов (рис. 7, Б). Так, в загрязненной нефтешламом почве максимальная численность гетеротрофов и соответствующий показатель R/S наблюдались в ризосфере ячменя, пшеницы и люцерны, а максимальные численность деструкторов ПАУ и ризосферный эффект для этих микроорганизмов - в ризосфере люцерны, причем с большим отрывом от остальных испытанных видов. Таким образом, расчет показателя R/S отдельно для популяции углеводородокисляющих микроорганизмов

позволил обнаружить виды растений, селективно поддерживающие в своей ризосфере популяции деструкторов. К таким растениям была отнесена люцерна посевная, в ризосфере которой численность деструкторов ПАУ в 14,5 раз превышала аналогичный показатель для почвы без растений.

А Б

Рис. 7. Влияние загрязнения почвы углеводородами на проявление ризосферного эффекта (R/S): А - показатель R/S для общей численности гетеротрофных микроорганизмов в чистой почве (ЩИ) и загрязненной дизельным топливом (ШЯ); Б - показатель R/S для общей численности гетеротрофных микроорганизмов (ШИ) и для деструкторов ПАУ (ШИ) в почве, загрязненной нефтешламом.

В другом эксперименте мы сравнивали микробные популяции в ризосфере тростника южного и люцерны посевной, выращенных в почве, содержащей остаточное загрязнение ПАУ (79,8 мг/кг). Было обнаружено, что по сравнению с незасеянной почвой выращивание люцерны увеличивало численность ПАУ-окисляющих микроорганизмов почти в семь раз, тогда как в ризосфере тростника популяция деструкторов ПАУ сократилась вчетверо. Выделение микроорганизмов-деструкторов из ризосферы растений показало, что наиболее активные деструкторы присутствовали в ризосфере люцерны, их средняя деструктивная активность была выше, чем деструктивный потенциал ризосферных деструкторов тростника (соответственно 55 против 38% в среднем разрушали ризосферные штаммы 0,4 г/л фенантрена за 5 сут). Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о том, что в ПАУ-загрязненной почве растения могут специфически регулировать численность углеводородокисляющих микроорганизмов, а также подтвердили факт селективного поддержания высокой численности и активности деструкторов ароматических углеводородов в ризосфере люцерны.

Сравнительный микробный анализ корневых зон растений выявил различную локализацию микроорганизмов деструкторов парафинов и ПАУ (рис.8).

Установлено, что парафинокисляющие микроорганизмы преимущественно концентрировались в ризоплане, а деструкторы ПАУ - в ризосфере. Такая дифференцированная пространственная локализация деструкторов предположительно свидетельствует о том, что зона ризосферы более благоприятна для деградации ПАУ, чем ризоплана, где повышенная концентрация выделяемых корнями

экссудатов может ингибировать микробную деградацию ПАУ, как это показано для некоторых органических кислот (Renz et al., 2004).

Воздействие растений на почвенные микроорганизмы и проявление их деструктивной активности происходит через корневые экссудаты. Исследование влияния мажорных компонентов растительных корневых выделений на деградацию углеводородов исследовали на примере представителей типичных родов ри-зобактерий - Azospirillum, Pseudomonas и Ensifer,

без растений тростник люцерна без растений тростник люцерна

а б

Рис. 8. Численность микроорганизмов-деструкторов парафинов в загрязненной битумом (а) почве; численность микроорганизмов - деструкторов ПАУ в загрязненной ПАУ почве (б): ВВП -почва без растений; ШЯ- ризосфера; НШ - ризоилана

Проведенные эксперименты показали, что характер влияния органических кислот корневых выделений варьировал от ингибирующего до стимулирующего и зависел от их вида, концентрации в среде и микроорганизма (рис. 9).

Так, янтарная, яблочная и щавелевая кислоты могут служить косубстра-тами при деградации сырой нефти азоспириллой, обеспечивая рост микроорганизма, тогда как в присутствии уксусной или фталевой кислот деградации сырой нефти штаммом А. brasilense SR80 не происходило. В опытах с деструкторами П АУ {Р. stutzen L3 и Е. meliloti Р221) кислоты использовали в двух концентрациях- ростовой 1,0 г/л и близкой к реально присутствующей в ризосфере (0,1 г/л). Установлено, что в ростовой концентрации янтарная и яблочная кислоты подавляли деградацию фенантрена у штамма Р. stutzen L3 (на 70 и 75% соответственно), но стимулировали ее у Е. meliloti Р221 (яблочная кислота), а в концентрации 0,1 г/л не оказывали влияния на деструктивную активность штамма Р221, слабо стимулируя ее у псевдомонады. Лимонная кислота оказывала противоположное действие на деградацию ПАУ: в концентрации 1,0 г/л вдвое увеличивала деструктивную активность Р. stutzeri L3, но снижала ее у Е. meliloti Р221.

Салициловая и фталевая кислоты были исследованы как типичные продукты микробной деградации ПАУ, в том числе и фенантрена, содержащиеся также в корневых выделениях растений. Из них салициловая кислота не являясь субстратом для роста Р. stutzeri L3 и Е. meliloti Р221, в концентрации 0,1 г/л не препятствовала деградации ими фенантрена, а в концентрации 1,0 г/л снижала ее на 33 и 94% соответственно. Эффект фталевой кислоты был схожим с лимонной. Являясь продуктом деградации фенантрена штаммом Р. stutzeri L3, эта кислота в

концентрации 1,0 г/л стимулировала его рост, но в концентрации 0,1 г/л выступала как альтернативный более доступный для этого микроорганизма субстрат. По сравнению с карбоновыми кислотами углеводы не оказывали существенного влияния на деградацию ПАУ.

Azospirillum brasilense SR80; сырая нефть

/yvvvvy

Pseudomonas stützen L3; фенантрен

60:

Ensifer meliloti Р221; фенантрен

^ У У

Ensifer meliloti Р221; фенантрен

^ ¿Г

в г

Рис. 9. Деградация углеводородного загрязнителя в присутствии компонентов корневых выделений: а - дарадация сырой нефти (10 г/л) штаммомЛ. ЬгахИете 81180 в присутствии органических кислот; б - дирадация фенантрена (0,1 х'/л) штаммом Р. sШzeri ЬЗ в ирисутст-вии органических кислот; в - деградация фенантрена (0,1 г/л) штаммом Е. теШой Р221 в присутствии органических кислот; г - деградация фенантрена (0,1 г/л) штаммом Е. теШой Р221 в присутствии Сахаров; концентрациякосубстрата: ШШ- 1,0 г/л; ШШ-ОЛ г/л

Таким образом, полученные данные доказывают, что корневые экссудаты, в присутствии которых протекает ризосферная микробная деградация углеводородов, могут оказывать как стимулирующий, так и ингибирующий эффект на этот процесс в зависимости от своего состава.

Влияние почвенных микроорганизмов на растения в условиях загрязненной среды может быть связано как с непосредственным проявлением ризосфер-ной микрофлорой фитостимулирующего эффекта через обеспечение растения минеральными питательными веществами (азотом, фосфором), воздействие фи-тогормонами микробного происхождения, другими фитоактивными веществами, так и с опосредованным - через подавление развития фитопатогенной микрофло-

ры и деструкцией загрязнителя. Стимулирующее рост растений влияние ризобак-терий может проявляться при условии успешной колонизации ими ризосферы и приживания там.

Исследование фитостимулирующего потенциала у некоторых ризосфер-ных штаммов-деструкторов позволило обнаружить проявление таких признаков РСРЯ как азотфиксация, биосинтез фитогормона ИУК, реже - способность растворять фосфаты и продуцировать фермент АЦК-деаминазу (табл. 7).

Таблица 7 - Стимулирующий рост растеиий потенциал некоторых исследованных ризосферных штаммов-деструкторов углеводородов

Фиксация азота Растворение фос- Синтез Продукция

Штамм фатов (Са3(Р04)2), ИУК, АЦК-деаминазы,

d, мм мкг/мл мкмоль (х-КЬ/мкл-ч

A. lipofenim SR42 + - 5,0±0,7 -

A. brasilense SR80 + - 24,0±3,2 -

Е. meliloti Р221 + 2-3 39,0±3,6 -

Rhodococus sp. N3 - - 13,6±2,2 -

Rhodococus sp. N6 - - - 0,58±0,02

Mycobacterium sp. N7 - - - 0,55±0,07

P. stutzen L3 - - 2,6±0,5 0,22±0,08

P. viridiflava P422 - - 4,1±0,3 -

Примечания: «+» - наличие признака; «-» - отсутствие признака; способность к фиксации молекулярного азота оценивали по росту на среде Эшби; а-КБ - а-кетобутират.

При бактеризации семян растений ризобактериями была доказана их способность стимулировать развитие корневой системы у 4-сут проростков: для А. brasilense SR80 - пшеницы мягкой (20%), ржи озимой (32%) и сорго веничного (70%), а для Е. meliloti Р221 - люцерны посевной (16%). Для штамма Mycobacterium sp. N7 не было обнаружено достоверного воздействия на развитие проростков сорго и люцерны и выявлен фитотоксическмй эффект по отношению ко ржи. Идентификация клеток штаммов-инокулянтов на корнях 4-сут проростков показала, что азоспирилла успешно приживалась на корнях стимулируемых ею растений, Е. meliloti Р221 - активно колонизировал корни сорго веничного и люцерны посевной, a Mycobacterium sp. N7 в невысокой численности приживался на корнях проростков ржи, сорго и люцерны.

Исследование влияния углеводородов на проявление признаков PGPR изучаемыми микроорганизмами показало, что сырая нефть в концентрации до 20 г/л и фенантрен в концентрации до 0,01 г/л не влияли на продукцию фитогормона ИУК бактериями A. brasilense SR80 и Е. meliloti Р221, а отсутствие источника азота в среде не препятствовало деградации ими углеводородного субстрата. Кроме того, штамм A. brasilense SR80 проявлял положительный хемотаксис по отношению к гомогенату корней пшеницы, а также к сырой нефти. Эти результаты дают основание полагать, что в условиях загрязненной ризосферы исследуемые бактерии способны проявлять свою колонизирующую и рост-стимулирующую активность по отношению к растению. Это предположение подтверждается обнаруженной повышенной численностью клеток A. brasilense SR80

на корнях инокулнрованных этим штаммом 9-сут проростков пшеницы, выращенной в присутствии сырой нефти в стерильных условиях гидропоники (в 7 раз больше, чем в контроле без нефти), а также увеличением прироста биомассы инокулнрованных корней (на 23 и 21% соответственно в вариантах с нефтью и без нее).

Влияние углеводородного загрязнителя на проявление ассоциативных свойств и рост-стимулирующей активности ризобактериями исследовали также в вегетационных опытах с песчаной культурой. Инокуляция штаммом Е. теШой Р221 молодых проростков сорго веничного и люцерны посевной увеличивала всхожесть, энергию прорастания семян, но неоднозначно влияла на приживаемость растений, снижая ее для люцерны на10%. Эффект микроорганизма-инокулянта на указанные растения зависел от присутствия загрязнителя (табл. 8).

Таблица 8. - Влияние фенантрена и инокуляции штаммом Ensifer meliloti Р221 на развитие и корневую экссудацию сорго веничного

Фенашрен, г/кг

Показатели 0 0,01 од

-Р221 +Р221 -Р221 +Р221 -Р221 +Р221

Приживаемость растений, % 93,3 аА 100,0 аА 100,0 аА 96,6 аА 56,7 сС 70,0 ьв

Масса побегов, г/растение 0,311 аА 0,245 ьв 0,286 аЬА 0,287 ЬА 0,119сС 0,171 cD

Масса корней, г/растение 0,147 аА 0,131 ЬВ 0,127 ЬВ 0,115 АС 0,052 CD 0,058 cF

Площадь корневой поверхности, дм2/растеш1е 1,04 аА 1,07 аА 1,04 аА 1,01 аА 0,49 ьв 0,91 аА

Количество корневых экссудатов, мг/ч на растение 1,32 Ьв 1,73 аА 1,20 ьв 1,25 ьв 0,47 dD 0,73 се

Интенсивность экссудации, мг/дм2,ч 1,28 ьв 1,60 аА 1,16 ЬВС 1,23 ьвс 1,03 ЬсС 0,80 CD

Корневая экссудация, мкг/дм2^:

карболовых кислот 227,5 аЬВ 327,7 аС 203,8 аЬВ 243,0 аЬВ 187,4 ЬВ 48,7 сА

свободных Сахаров 42,4 ЪсВ 90,3 аА 67,1 аЬАВ 68,3 аЬАВ 25,2 сВС 17,1 се

свободных аминокислот 9,5 ЬВ 16,8 аА 9,1 ьвс 10,0 ьв 7,6 ьвс 4,7 ЬсС

белков 20,7 аА 13,5 ьв 11,7 ьв 5,4 сС 5,3 сС 5,4 сС

Примечание: Значешга в строке, помеченные одинаковыми строчными буквами (оценка влияния зшрязнителя), достоверно не отличаются друг от друга (Р=0,05); значения в строке, помеченные одинаковыми заглавными буквами (оценка влияния инокуляции), достоверно не отличаются друг от друга (Р=0,05).

В чистом грунте штамм снижал прирост биомассы побегов сорго и люцерны на 21 и 15% соответственно, в меньшей степени ингибируя корневую систему этих растений (-11% для сорго и +7% для люцерны). В загрязненном фенан-треном грунте (0,1 г/кг) бактеризация растений Е. теШой Р221 имела прямо противоположный эффект и, тем самым, способствовала преодолению растением

поллютантного стресса: инокулянт увеличивал прирост надземной биомассы на 44 и 27%, а корней - на 12 и 15% соответственно для сорго и люцерны. Эффект Е. meliloti Р221 при инокуляции им злака был более выраженным. Особенно отчетливо он проявлялся на изменении площади поверхности корневой системы сорго (увеличивая ее на 86%) и тем самым на ее морфологии в сторону формирования более тонких и разветвленных корней, выделяющих больший объем корневых экссудатов (на 55% по сравнению с небактеризованными растениями). Изменение морфологии корней у бактеризованных растений являлось следствием фитогор-мональной активности Е. meliloti Р221 в ризосфере сорго, наблюдаемой как в чистом, так и в загрязненном грунте. Подтверждением этому служила обнаруженная корреляция между увеличением площади корневой поверхности и повышением содержания фитогормона ПУК в ризосфере сорго под влиянием штамма (R2 -0,70, Р < 0,05). Увеличение концентрации фитогормона в ризосфере, в свою очередь, достоверно коррелировало со снижением концентрации предшественника ИУК - триптофана (R2 = 0,24, Р < 0,05), что могло быть связано с использованием этой аминокислоты микроорганизмом, в том числе, и для синтеза ИУК.

Наряду с увеличением количества корневых выделений за счет расширения площади поверхности корней было установлено, что под влиянием штамма интенсивность корневой экссудации ингибировалась в загрязненном грунте на 22%. Наблюдаемые изменения в корневой экссудации отражали изменения проницаемости клеточных мембран корневых тканей растений, которая, как известно (Meharg and Killham, 1995), зависит от самого физического присутствия микроорганизма на поверхности корней и от и выделяемых им метаболитов и ферментов. В данном случае метаболическая активность бактерии-инокулянта зависела от присутствия в среде фенантрена. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об активном влиянии штамма на развитие корневой системы и процесс экссудации у растения в зависимости от присутствия загрязнителя (ПАУ) в среде.

Учитывая важную роль корневых экссудатов в микробной деградации углеводородов, особое внимание уделялось определению влияния бактеризации и присутствия загрязнителя на качественный и количественный состав корневых выделений. Установлено, что в чистом грунте штамм Р221 усиливал корневую экссудацию карбоновых кислот (на 44%), свободных Сахаров (на 113%), свободных аминокислот (на 77%), но снижал выделение белковых соединений (на 35%). В присутствии фенантрена (0,1 г/кг) эффект инокулянта был прямо противоположным: наблюдалось снижение выделения карбоновых кислот (на 74%), свободных Сахаров (на 32%) и свободных аминокислот (на 38%). При инокуляции сорго Е. meliloti Р221 достоверных изменений в выделении белков не отмечалось, но отчетливо повышалась активность оксидоредуктаз в его корневых экссудатах, что может быть связано как с сигнальной функцией выделяемых ферментов (De-la-Pefta et al., 2008) во взаимодействии растеши и микроорганизма, так и с появлением в ризосфере субстратов для этих ферментов, в образовании которых мик-роорганизм-инокулянт мог играть активную роль. Полученные данные подтверждают, что изменение корневой экссудации происходило под влиянием метаболической активности микроорганизма, которая зависела от присутствия поллю-танта. Таким образом, установлено, что стимулирующая рост растения актив-

ность штамма-деструктора ГТАУ Е. теЫоН Р221 проявляется именно в условиях загрязненного грунта, что имеет важнейшее значение для рекомендации этого микроорганизма к использованию в технологии фиторемедиации.

Мониторинг штамма Е. те!Поп Р221 с использованием иммунодиффузи-онного анализа позволил сравнить долю бактерии-инокулянта в общей численности гетеротрофных микроорганизмов в загрязненном и незагрязненном грунте в присутствии растений и без них. Установлено, что к концу эксперимента (30 сут) численность интродуценга в грунте с растениями для концентраций фенантрена 0, 00,1 и 0,1 г/кг составляла соответственно 17, 56 и 19% от исходно внесенной. В грунте без растений численность штамма сохранялась на уровне 12-17% от внесенной независимо от концентрации фенантрена. Расчет доли штамма в общей численности культивируемых гетеротрофных микроорганизмов свидетельствовал о стимулирующем действии загрязнителя и растения на поддержание Е. теШоН Р221: доля штамма в грунте с сорго, содержащем 0,01 г/кг фенантрена, достигала 51%, а в грунте, загрязненном 0,1 г/кг фенантрена - 32%. Повышенное содержание штамма в общей микробной популяции загрязненного грунта под сорго стабильно превышало аналогичные показатели для чистого контроля, хотя и снижалось при приближении к корню, что подтверждает локализацию деструкторов ПАУ в зоне ризосферы. Сопоставление данных с численностью штамма в контрольном незагрязненном варианте с сорго и в загрязненном варианте без растений, где стимулирующими микробную численность факторами являлись корневые экссудаты и органический загрязнитель по отдельности, позволило сделать вывод о том, что сорго селективно поддерживало популяцию пггамма-инокулянта в условиях загрязнения. Полученные результаты позволяют предположить эффективность использования искусственной ассоциации сорго веничное - Е. теШоН Р221 для очистки ПАУ-загрязненного грунта. Проверенная в экспериментах эффективность сочетания свойств активного деструктора ПАУ и стимулятора роста растения у штамма Е. теШоИ Р221 позволила рекомендовать этот микроорганизм для инокуляции растений с целью повышения эффективности фиторемедиации загрязненной углеводородами почвы. Эта разработка защищена патентом (Патент РФ № 2406758).

Отработка приемов фиторемедиации загрязненного углеводородами

грунта

Описанные выше исследования продемонстрировали, что и растения, и микроорганизмы, и, особенно, их ассоциации обладают значительным потенциалом адаптации и деструктивной активности по отношению к нефтяным углеводородам различных классов. Направленное использование этого потенциала для решения проблемы загрязнения окружающей среды составляет основу современной технологии фиторемедиации. Максимальная реализация способностей растительно-микробных комплексов очищать почвенную среду от нефтяного загрязнения требует подбора и апробации различных приемов, связанных с культивированием растений, внесением активного штамма микроорганизма-деструктора и/или фитостимулятора, созданием эффективных растительно-микробных ассоциаций и мелиоративной обработкой почвы. Отработке таких приемов, а также

выяснению целесообразности применения фиторемедиации в зависимости от типа загрязнителя были посвящены представленные ниже исследования.

С целью исследования эффективности использования растений и ассоциированных с ними микроорганизмов в очистке почвы от углеводородов были проведены лабораторные вегетационные опыты по фиторемедиации почв, загрязненных различными углеводородными поллютантами - нефтешламом, дизельным топливом, а также битумом и ПАУ. Эксперименты с нефтешламом и дизельным топливом проводили на типичных для Саратовской области почвах - черноземах южном и выщелоченном - в помещении для выращивания растений с контролируемыми условиями освещения, температуры и полива. Опыты с битумом и ПАУ проводили в теплице. Эксперименты имели различную продолжительность - от 70 сут до 27 мес. Эффективность фиторемедиации оценивали по разнице в элиминации поллютанта в почве с растениями и без них.

В экспериментах по фиторемедиации почвы, загрязненной парафини-стым битумом (79,7 г/кг), и грунта с железнодорожного полотна, содержащего остаточное загрязнение ПАУ (0,08 г/кг), использовали люцерну посевную и тростник южный (рис. 10).

мес.

Рис. 10. Деградация бшума (а) и ПАУ (б) в загрязненной почве в присутствии растений и в незасеянном контроле: ♦ - незасеянная почва, » - люцерна посевная, Д - тростник южный

Согласно полученным результатам эффект растений наиболее отчетливо был выражен в течение первых 12-18 мес. рекультивации почвы как от парафиновых углеводородов, так и от ПАУ. С течением времени процесс фиторемедиации замедлялся и в случае парафиновых углеводородов (рис. 10, а), ее эффективность существенно не отличалась от таковой процесса самоочищения почвы. В случае ПАУ (рис.10, б) фиторемедиация действительно значительно способствовала деградации загрязнителя: через 24 мес. снижение концентрации ПАУ под люцерной составило 75%, под тростником - 69%, а в незасеянном контроле - 45%. Таким образом, люцерна посевная интенсифицировала процесс ремедиации загрязненной почвы на 30, а тростник южный - на 24% относительно незасеянного контро-

ля. Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование растений целесообразно для деконтаминацип почвы от персистентных ароматических углеводородов, таких как ПАУ, тогда как для углеводородов парафинового ряда оно сравнимо с эффективностью процессов самоочищения без использования растительности.

Возможность фиторемедиации почвы, загрязненной нефтешлмом (15 г/кг) исследовали в лабораторном вегетационном опыте продолжительностью 72 сут с использованием 15 видов растений - представителей семейств Злаковые и Бобовые. Согласно полученным результатам наиболее успешно нефтешлам элиминировал в почве под рожью (52%), а также под пастбищными злаками в убывающем порядке (%): райграс пастбищный (46) > житняк гребенчатый (45) > пырей бескорневищный (44) > овсяница луговая (41). Среди бобовых лучшие результаты получены для люцерны (41%). При этом в контрольном варианте без растений убыль нефтешлама составила 34% (табл. 9).

Таблица 9 - .Изменение содержания фракций нефтешлама в почве в условиях вешгационного опыта (г/кг)

Варианты опыта Фракции нефтешлама Сумма

парафины нафтены МБЦА ПАУ СБС

Исходная почва 7,20 я 2,20 а 1,27 a 1,73 ab 3,20 be 15,59 a

Контроль без растений 3,32 с 1,48 ab 0,80 abed 1,28 be 3,40 be 10,27 ede

Почва с растениями: пшеница 3,59 be 0,94 Ь 0,66 ede 1,45 abe 3,29 be 9,92 ede

рожь 3,18 с 0,83 b 0,40 e 0,97 с 2,13 c 7,52/

овес 3,01 с 1,29 ab 0,90 abed 1,40 be 3,07 be 9,67 edef

ячмень 3,61 с 2,16 а 0,72 bede 1,82 ab 2,67 be 10,24 edef

просо 4,10 be 1,13 Ь 1,00 abed 2,22 ab 2,92 be 11,31 bed

сорго 3,67 be 1,61 ab 0,84 abed 1,38 be 2,66 be 10,16 ede

кукуруза 4,89 b 1,02 b 0,72 bade 1,32 be 2,55 be 10,49 ede

кострец 3,88 be 0,98 b 1,19 ab 2,38 a 3,26 be 11,68 be

овсяница 3,44 с 0,94 b 0,83 abc-d 1,41 abe 2,63 be 9,24 def

райграс 3,53 с 0,96 b 0,49 de 1,22 c 2,29 c 8,48 ef

житняк 3,19 с 0,95 b 0,89 abed 1,10 c 2,51 be 8,63 ef

пырей 3,08 с 1,15 b 0,49 de 1,10 c 2,92 be 8,74 ef

клевер 4,09 be 0,88 b 1,16 abe 1,49 abe A,21 ab 11,88 bed

люцерна 3,25 с 0,95 b 0,66 ede 1,47 abe 2,81 be 9,14 def

эспарцет 4,24 be 1,28 ab 0,70 abede 1,68 abe 5,31a 13,26 ab

Примечания: Значения в столбце, помеченные одинаковыми строчными буквами достоверно не отличаются друг от друга (Р=0,05).

Фракционный анализ остаточного загрязнения показал, что в первую очередь элиминации подвергались парафины (в среднем 50% с растениями и 54% без них), нафтены (в среднем 48% с растениями и 33% без них) и moho-, бицик-лические ароматические углеводороды (МБЦА; в среднем 39% с растениями и 37% без них). Было обнаружено неоднозначное влияние растений на изменение содержания ПАУ и спирто-бензольных смол (СБС) в загрязненном грунте. Наблюдалось как увеличение концентрации этих веществ (ПАУ - до 37% в ризосфере костреца; СБС - до 68% в ризосфере эспарцета), так и снижение (в ризосфере ржи ПАУ - на 44%, СБС - на 33%). В незасеянном контроле содержание ПАУ снизилось на 26%, а СБС - повысилось на 26%.

Таким образом, тестирование 15 видов растений в вегетационных опытах позволило подтвердить эффективность для фиторемедиации загрязненной углеводородами почвы таких представителей Злаковых и Бобовых как овсяница, райграс, люцерна и выявить перспективность ржи озимой. В ризосфере ржи регистрировалась деградация всех основных компонентов нефтешлама, включая наиболее персистентные соединения - ПАУ и смолы. Кроме того, было показано, что концентрация основных биогенных элементов (в виде N03", NH4+, Р205) в ризосфере ржи и некоторых других растений увеличивается в процессе фиторемедиации, что создает в почве благоприятные условия для процессов, связанных с ее рекультивацией.

По результатам проведенного скрининга рожь озимая, райграс пастбищный и люцерна посевная были отобраны как растения, перспективные для фиторемедиации загрязненного нефтсшламом грунта. Для дальнейшего повышения эффективности фиторемедиации была исследована возможность применения различных добавок, обогащающих почву биогенными элементами и способствующих приживаемости, росту и активности растительно-микробных ассоциаций. В качестве основных компонентов двух испытанных фиторемедиационных систем были взяты рожь и райграс, а в качестве дополнительных - люцерна, минеральное азотное удобрение (аммиачная селитра, 0,25 г/кг) и штамм PGPR-деструктор A. brasilense SR80, использованные по отдельности и в различных сочетаниях.

Использование всех испытанных добавок положительно влияло на содержание хлорофиллов в листьях ржи (рис. 11, а). Бактеризация штаммом A.brasilense SR80 увеличивала суммарное содержание хлорофиллов на 65%, а минеральное удобрение - на 50%, однако совместное использование PGPR и удобрения не оказывало значительного эффекта.

Наибольшее влияние на содержание хлорофиллов оказал совместный посев растений с люцерной: количество фотосинтетических пигментов в листьях райграса и ржи увеличилось в 5,7 и 4,1 раза соответственно. При этом для райграса дополнительный положительный эффект наблюдался от бактеризации азоспи-риллой, а для ржи - от внесения минерального удобрения. Полученные результаты показали, что исследованные злаки выраженно реагировали (в основном, положительно) на биохимическом уровне как на инокуляцию PGPR, так и на подсев бобового растеши и внесение азотного удобрения при их культивировании в загрязненной нефтешламом почве. Следствием этого являлось увеличение прироста биомассы ржи и райграса, на что наиболее значительное влияние оказывали лю-

церна и азотное удобрение (р<0,0001) (рис. 11, б, в).Численность культивируемых гетеротрофных микроорганизмов была выше в ризосфере ржи, чем в ризосфере райграса. Внесение азотного удобрения значительно (р<0,000001) стимулировало почвенных гетеротрофов под рожью, особенно в присутствии люцерны (на 63% -по абсолютным значениям КОЕ/г почвы). Определяющим фактором стимуляции численности деструкторов ПАУ в ризосфере ржи являлась люцерна (р<0,05), использование которой приводило к увеличению этой популяции в 19 раз (по абсолютным значениям КОЕ/г почвы) (рис. 11, г, б).

г д

Рис. 11. Влияние различных добавок на суммарное содержание хлорофиллов а и Ь в листьях

растений (а), накопление биомассы ржи (б) и рашраса (в), численность культивируемых гетеротрофных микроорганизмов (г) и деструкторов ПАУ (д) в ризосфере растений, культивируемых в почве с нефтешламом (11,5 г/кг).

0.9

0,8

0,7

0> 0,6

1 0,5

0,4

0,3

0.2

0.1

О Б А АБ Л ЛБ ЛА ЛАБ

Обозначения по шкале абсцисс: О - растения без добавок, Ь - бактеризация штаммом А. Ьгс&Иете БЛвО, А - внесение удобрения (аммиачной селитры); АБ - бактеризация + удобрение; Л - подсев люцерны; ЛБ - люцерна + бактеризация; ЛА - люцерна + удобрение; ЛАБ - люцерна +удобрение + бактеризация.

ЕЯ Райграс

П Побеги

О Б А АБ Л ЛБ ЛА ЛАБ б

О Побеги н Корни

63 Рожь № Райграс

Анализ остаточного содержания нефтешлама в почве показал, что через 4 месяца культивирования без каких-либо дополнительных обработок концентрация нефтешлама в варианте без растений снизилась на 45%, в ризосфере ржи - на 58%, а в ризосфере райграса - на 51%. Использование различных добавок, как правило, стимулировало очистку почвы (рис. 12).

Рис. 12- Деградация нефтешлама в ризосфере растений и в незасеянной почве: ЩИ - без растений; I I - рожь озимая ШШ - райграс пастбищный (обозначения по шкале абсцисс см. рис. А ■()

Для почвы без растений фактором, интенсифицирующим очистку, служило внесение азоспириллы, особенно в сочетании с азотным удобрением и подсевом люцерны, что увеличивало ремедиацию почвы до 59, 61 и 62% (соответственно для вариантов почвы без растений Б, АБ и ЛАБ). Полученные результаты показывают, что использованные приемы позволили повысить эффективность биоремедиации загрязненной нефтешламом почвы на 17%. По-видимому, обогащение рекультивируемой почвы азотом (различного происхождения - минерального и/или биологически связанного), оказывало решающее значение для ее очистки.

Бактеризация растений азоспириллой и, особенно, подсев люцерны позволили на 16-18% улучшить фиторемедиацию почвы на основе райграса, увеличив ее с 51 до 69%. По-видимому, райграс в сочетании с люцерной образовывали эффективную для фиторемедиации травосмесь. Наиболее эффективная стимуляция фиторемедиации на основе ржи озимой наблюдалась также в вариантах с дополнительным посевом люцерны. Использование люцерны позволило увеличить эффективность очистки почвы на основе ржи с 58 до 64%, в сочетании с азотным удобрением - до 70%, а с удобрением и азоспириллой - до 68%.

Таким образом, апробация различных приемов, направленных на повышение эффективности фиторемедиации почв от углеводородного загрязнения, показала перспективность использования бобово-злаковой травосмеси, бактери-

зации растений стимулирующими их рост штаммами-деструкторами, а также внесения азотного удобрения. Выявлена принципиальная роль люцерны как компонента травосмеси на основе ржи или райграса, улучшающего развитие злаков, стимулирующего потаенную микрофлору и, наконец, усиливающего очистку почвы от нефтешлама.

Исследование фиторемедиации почвы от углеводородов дизельного топлива проводили в условиях лабораторного вегетационного опыта с 8 видами растений.

Анализ дизельного топлива в почве до и после вегетационного опыта показа! перспективность использования растений для очистки загрязненного грунта, особенно в сочетании с внесением азотного удобрения (табл. 10). В почве без растений деструкция дизельного топлива составляла 24% за 70 сут, а в почве под растениями - 30-54%. Лучшие результаты продемонстрировали кукуруза (54%) и рожь (51%).

Таблица 10 - Изменение концентрации загрязнителя в почве в процессе фиторемедиации

Растение Концентрация дизельного топлива в почве, г/кг

Без удобрения С удобрением

Исходная почва 8,080 а 8,080 a

Контроль без растений 5,940 аЬ 1,243 bed

Почва с растениями: 3,990 cd 1,070 cd

рожь

сорго 4,420 bed 0,430 e

кукуруза 3,723 d 0,990 cde

райграс 5,027 bed 1,730 /;

овсяница 5,640 abc 1,777 b

люцерна 4,903 bed 0,947 de

клевер 4,153 bed 1,587 be

эспарцет 3,900 bed 1.520 bed

Примечание. Значения в столбце, помеченные одинаковыми строчными буквами, достоверно не отличаются друг от друга (Р=0,05).

При внесении аммиачной селитры деструкция дизельного топлива в незасеянной почве составила 84%, а в почве под растениями - 78-95%. Лучшие показатели получены для сорго (95%), кроме него хорошие результаты показали люцерна, кукуруза и рожь.

Таким образом, по результатам проведенных исследований, для очистки почвы от дизельного топлива могут быть рекомендованы сорго, кукуруза, люцерна и рожь. Внесение минерального азотного удобрения в виде аммиачной селитры оказывало решающее влияние на восстановление почвы от загрязнения.

При отработке приемов фиторемедиации почвы, загрязненной дизельным топливом, с использованием травосмеси сорго веничное - люцерна посевная и аммиачной селитры дополнительная инокуляция растений штаммом Р(1РЯ (А.

brasilense SR80) не оказывала заметного эффекта, но отчетливо влияла на почвенные микроорганизмы, увеличивая их численность в ризосфере сорго и люцерны на 27 и 10%, а в ризоплане этих растений - на 65 и 49% соответственно.

Апробацию эффективности исследованных приемов проводилив условиях микрополевого опыта на делянках площадью 1 м2, загрязненных нефтешламом или дизельным топливом. Задачей исследования являлась рекультивация загрязненной почвы с использованием комбинации приемов - фиторемедиации (присутствия растений), биоаугментации (внесения штамма-деструктора) и мелиорации (полива и внесения удобрения) и оценка эффективности очистки. На основании результатов предыдущих экспериментов в качестве растений фиторемедиан-тов для очистки почвы от нефтешлама были выбраны райграс пастбищный и люцерна посевная, а для дизельного топлива - сорго веничное и райграс пастбищный. Для бактеризации растений был выбран штамм Е. meliloti Р221, проявляющий стимулирующую рост активность по отношению к люцерне, сорго и деструктивную активность к ПАУ, составляющих значительную часть нефтешлама. Для указанного микроорганизма было получено свидетельство о его непатоген-носги, что позволяло вносить его в открытую систему В качества удобрения использовали аммиачную селитру (120 г/м2). Согласно полученным данным (рис.13), за 80 сут рекультивации 73% нефтешлама было элиминировано из почвы с растениями и 59% - из незасеянной почвы. Такую эффективность ремедиа-ции можно оценить как удовлетворительную, учитывая высокую исходную концентрацию (43 г/кг) и состав загрязнителя, представленного тяжелыми нефтяными углеводородами, скорость его деградации на опытных участках была достаточно высока (0,365 г/сут). При этом деградации подвергались все основные фракции нефтешлама.

Рис.

„ . „_,,, _.„ _ С11 С12 С13 С14 С15 С16 С17 С18 С19 С20 С21

Сумма Парафины Нафтены МБ lía ПАУ Смолы

длина углеродной цепи

фракции нефтешлама

13. - Изменение содержания в почве основных фракций нефтешлама (а) и углеводородов дизельного топлива (б) в процессе фиторемедиации: до очистки; lililí - контроль без растений; I I - опыт с растениями

Оценка остаточного содержания дизельного топлива в почве показала, что за 80 сут его концентрация снизилась с 19,3 до 0,9 и 5,1 г/кг в вариантах с растениями и без них соответственно. Таким образом, очистка почвы составила 95 и 73% для опытных и контрольных участков соответственно, скорость очистки

достигала 0,223 г/сут, что является хорошим результатом для исходной концентрации загрязнителя (20 г/кг) и продолжительности процесса рекультивации.

Микробиологический анализ почвы показал, что райграс поддерживал наибольшую численность гетеротрофных микроорганизмов в своей корневой зоне как в почве, загрязненной нефтешламом, так и в почве с дизельным топливом. В конце эксперимента из образцов ризосферы растений были выделены реи-золяты бактерии-интродуцента Е. meliloti Р221. Было установлено, что в случае нефтешлама численность интродуцента в ризосфере люцерны и райграса составляла 2,4 и 3,9%, а в ризоплане этих растений - 2,7 и 0,3% от общей микробной численности. В случае дизельного топлива доля Е. meliloti Р221 в общей популяции гетеротрофов корневой зоны растений была еще выше: 8,5 и 6,0% в ризосфере и 4,4 и 3,3% - в ризоплане сорго и райграса соответственно. Полученные данные свидетельствовали об успешной приживаемости интродуцированного микроорганизма в ризосфере исследованных растений в условиях открытого грунта в течение 80 сут.

На основе отработанных приемов фиторемедации с элементами биоаугментации и мелиорации загрязненной углеводородами почвы был разработан способ фиторемедиации грунта, загрязненного углеводородами (с вариантами; Патент РФ №2403102).

Заключение

Растительно-микробные ассоциации играют важнейшую роль в процессах адаптации и противодействия антропогенному загрязнению окружающей среды органическими и неорганическими поллютантами. Обладая гибким метаболизмом и уникальными механизмами детоксикации различных ксенобиотиков, микроорганизмы и растения вызывают к себе повышенный интерес с точки зрения перспективы решения проблемы всевозрастающего загрязнения природы. За последние два десятилетия отчетливо интенсифицировались исследования, связанные с использованием растений и ассоциированных с ними микроорганизмов для очистки загрязненных объектов окружающей среды (фиторемедиацией). Вместе с тем, научные основы феномена фиторемедиации изучены недостаточно.

В ходе сравнительного изучения микрофлоры почв, загрязненных различными углеводородными поллютантами (дизельным топливом, нефтешламом, битумом, ПАУ), как в присутствии растений, так и без них были выявлены особенности организации ризосферных микробных сообществ в условиях поллю-тантного стресса. Показано, что формирование структуры ризосферных защитных популяций, включая пространственную локализацию микроорганизмов-деструкторов углеводородов различных классов, а также проявление их метаболической активности, на первых этапах определяется загрязнителем, а позже зависит от растения и его вида.

Исследование метаболизма углеводородов у типичных представителей ризосферной микрофлоры позволило установить важную роль корневых экссудатов в проявлении деструктивной активности ризобактерий. Впервые показано, что ассоциативные бактерии рода Azospirillum могут вносить существенный вклад в деградацию нефтяных углеводородов в корневой зоне растений, а на

примере представителей других ризосферных родов Ensifer и Pseudomonas продемонстрировано участие мажорных компонентов корневых выделений растений - карбоновых кислот - в микробной деградации ПАУ.

Проведенные исследования позволили увидеть взаимодействия растений и микроорганизмов, направленные не только на взаимное улучшение условий для роста и развития партнеров, но также и на детоксикацию/деградацию ими загрязнителя в окружающей среде. Так, накоплены данные, на основании которых можно утверждать, что некоторые виды растений (например, люцерна посевная) способны селективно поддерживать численность деструкторов ПАУ в своей ризосфере. На примере ассоциации Е. meliioti Р221 - Sorghum bicolor показано изменение взаимоотношения партнеров под влиянием поллютанта (фенантрена) в среде. Установлено, что в присутствии ПАУ микроорганизм стимулирует рост растения, изменяя его корневую экссудацию, тогда как в отсутствие загрязнителя эффект штамма прямо противоположный. В свою очередь в загрязненном грунте сорго веничное поддерживает высокую численность штамма-инокулянта, что не наблюдается в чистом грунте. Наконец, выявление ферментативной активности корневых экссудатов сорго веничного по отношению к микробным метаболитам ПАУ свидетельствует о возможности сопряжения растительного и микробного метаболизмов ПАУ в ризосфере растения.

Выявленные физиолого-биохимические особенности функционирования растительно-микробных комплексов в условиях загрязнения окружающей среды углеводородами объясняют базовые механизмы фиторемедиации, в частности, ризодеградации органических поллютантов. Испытанные в настоящей работе приемы интенсификации очистки углеводородзагрязненных почв с использованием растительно-микробных ассоциаций продемонстрировали основные достоинства этой технологии: ускорение деградации персистентных углеводородов, таких как ПАУ, стабильность очистки благодаря длительному поддержанию высокой численности популяции деструкторов и экологичность.

Выводы

1. Выявлены специфические эколого-функциональные реакции ризосферных микробных сообществ на углеводородное загрязнение. Эти реакции выражаются в увеличении общего числа почвенных микроорганизмов, поддержании высокой численности деструкторов поллютантов при их меньшей доле в общей микробной популяции и большей стабильности физиологической структуры микробоце-ноза ризосферы растений по сравнению с почвой без растительности.

2. Выделены и охарактеризованы новые перспективные для биотехнологии штаммы ризосферных бактерий: Mycobacterium sp. N7 способен подвергать деградации углеводороды и одновременно проявлять устойчивость к тяжелым металлам; Ensifer meliioti Р221 и Azospirillum brasilense SR80 способны подвергать деградации углеводороды и стимулировать рост растений. Для азоспирилл деструктивная активность в отношении углеводородов нефти охарактеризована впервые. Деструктивная активность ризосферных штаммов проявляется и находится под существенным влиянием мажорных компонентов корневых выделений растений - карбоновых кислот.

3. Биоконверсия фенантрена у ризобактерии Е. meliloti Р221 осуществляется двумя параллельными путями: (1) через расщепление терминального ароматического кольца с образованием бензокумарина и 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты; (2) через окисление центрального ароматического кольца по связи С9-С10 с образованием 9,10-дигидро-9,10-дигидроксифенантрена и 9,10-фенантренхинона. Второй путь для бактерий рода Ensifer показан впервые.

4. На примере фенантрена и сорго веничного (Sorghum bicolor) впервые установлено влияние ПАУ на корневую экссудацию растения. В концентрации 0,01 г/кг фенантрен стимулирует экссудацию корнями свободных Сахаров (мальтозы), не оказывая существенного влияния на количество выделяемых карбоновых кислот, аминокислот и снижая выделение белковых соединений. В концентрации 0,1 г/кг фенантрен значительно ингибирует развитие корневой системы растения, что приводит к отчетливому сокращению количества выделяемых карбоновых кислот, свободных Сахаров и аминокислот, а также белков. В изученных концентрациях фенантрен не оказывает влияния на качественный состав корневых экссудатов и на интенсивность их выделения.

5. Под влиянием фенантрена увеличивается активность оксидоредуктаз в тканях растения и его корневых выделениях. Среди выявленных оксидоредуктаз доминирующей является пероксидаза, активность которой коррелирует с увеличением концентрации фенантрена в среде культивирования.

6. .Впервые показано окисление ПАУ и их микробных метаболитов (флуоре-на, пирена, 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты, 2-карбоксибензальдегида, 1,2-дигидроксинафталина, 1- и 2-нафтолов) корневыми экссудатами сорго веничного и экстрактами корней люцерны посевной, что доказывает возможность участия растительных оксидоредуктаз в ризосферной деградации углеводородов ароматического ряда и указывает на возможность сопряженного растительно-микробного метаболизма загрязнителей в ризосфере.

7. Ризосферный эффект, характеризующий влияние растений на почвенные микроорганизмы, в присутствии углеводородов повышается. Выявлены растительные виды, способные селективно увеличивать популяцию деструкторов ПАУ в своей ризосфере.

8. Присутствие сырой нефти в концентрации до 20 г/л и фенантрена в концентрации 0,01 г/кг не оказывает влияния на синтез фитогормона ИУК ризобак-териями A. brasilense SR80 и Е. meliloti Р221 соответственно. Указанные загрязнители не препятствуют проявлению ассоциативных свойств (хемотаксис, колонизация корней) ризобактериями и формированию растительно-микробных ассоциаций азоспирилла - пшеница и ризобия - сорго.

9. Бактеризация растений PGPR-деструкторами углеводородов способствует преодолению растением поллютантного стресса, увеличивая прирост надземной и подземной биомассы, оказывает влияние на фотосингетический аппарат растений, морфологию корней и корневую экссудацию. Изменение корневой экссудации происходит под влиянием метаболической активности микрооргаизма-инокулянта, которая в свою очередь зависит от присутствия в среде поллютанта. Мониторинг бактерии-инокулянта показал, что сорго веничное селективно поддерживает популяцию штамма Е. meliloti Р221 в условиях загрязнения.

10. Обоснована эффективность использования растительно-микробных ассоциаций на основе ряда растений для фиторемедиации загрязненной углеводородами почвы: рожь озимая (Secale cerealе), кукуруза обыкновенная (Zea mays) и сорго веничное (Sorghum bicolor) - для очистки почвы от дизельного топлива; люцерна посевная (Medicago sativa), рожь озимая, и райграс пастбищный (Lolium peremné) - для очистки почвы от нефтешлама.

11. Отработаны приемы фиторемедации, обеспечивающие максимальную эффективность очистки почвы от углеводородов. На основе созданных растительно-микробных ассоциаций разработан и апробирован способ фиторемедиации грунта, загрязненного углеводородами (Патент РФ № 2403102).

список работ, опубликованных по теме диссертации

Экспериментальные статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Muratova А„ Hübner Th., Tisher S., Turkovskaya О., Möder M., Kuschk P. Plant -rhizosphere-microflora association during phytoremediation of PAH-contaminated soil // Int. J. Phytorem. - 2003. - Vol.5, N 2. - P. 137-151.

2. Muratova A., Hübner Th., Narula N., Wand H., Turkovskaya O., Kuschk P., Jahn R., Merbach W. Rhizosphere microflora of plants used for the phytoremediation of bitumen-contaminated soil//Microbiol. Res.-2003. -Vol. 158.N2.-P. 151-161.

3. Муратова А.Ю.. Турковская O.B., Хюбнер Т., Кушк П. Изучение эффективности использовашга люцериы и тростника для фиторемедиации загрязненного углеводородами грунта // 11рикл. биохим. и микробиол. - 2003. - Т. 39, № 6. - С.681-688.

4. Муратова А.Ю.. Турковская О.В., Антонюк Л.П., Макаров O.E., Позднякова Л.И., Игнатов В.В. Нефтеокисляющий потенциал ассоциативных ризобактерий рода Azospirillum/l Микробиология. - 2005. - Т.74, № 2. - С. 248-254.

5. Muratova A.Yu., Dmitrieva T.V., Panchenko L.V., Turkovskaya O.V. Phytoremediation of oil-sludge-contaminated soil // Int. J. Phytorem. - 2008. - Vol. 10, N 6. - P. 486-502.

6. Панченко JI.B., Муратова А.Ю.. Бондаренкова А.Д., Турковская О.В., Малаховская Л.В. Естественная и экспериментальная фиторемедиация загрязненной тяжелыми металлами почвы с территории нефтеперерабатывающего завода // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2009 - спецвыпуск Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала». - Часть IV. - С. 585-589.

7. Muratova A.. Pozdnyakova N., Golubev S., Wittenmayer L., Makarov O., Merbach W., Turkovskaya O. Oxidoreductase activity of sorghum root exudates in a phenanthrene-contaminated environment // Chemosphere. - 2009. - Vol. 74, N 8. - P. 1031-1036.

8. Golubev S.N., Schelud'ko A.V., Muratova A.Yu., Makarov O.E., Turkovskaya O.V. Assessing the potential of rhizobacteria to survive under phenanthrene pollution // Water Air Soil Pollut. - 2009. - Vol. 198. - P. 5-16.

9. Муратова А.Ю., Голубев C.H., Мербах В., Турковская O.B. Биохимические и физиологические особенности взаимодействия Sinorhizobium meliloti и Sorghum bicolor в присутствии фенантрена // Микробиология - 2009. - Т. 78, № 3. - С. 347-354.

10. Muratova A., Golubev S., Wittenmayer L., Dmitrieva T., Bondarenkova A., Hirche F., Merbach W., Turkovskaya 0. Effect of the polycyclic aromatic hydrocarbon phenanth-rene on root exudation of Sorghum bicolor (L.) Moench // Environ. Experim. Bot. -2009. - Vol. 66, N 3. - P. 514-521.

11. Бондаренкова А.Д., Муратова А.Ю.. Турковская O.B. Влияние нефти на ассоциативную ризобактерию Azospirillum brasilense // Вестник Саратовского госагро-университета им. Н.И. Вавилова . - 2009. - № 9. - С. 5-10.

12. Муратова А.Ю., Бондаренкова А.Д., Панченко J1.B., Турковская О.В. Использование комплексной фиторемедиации для очистки почвы, загрязненной нефтеш-ламом // Биотехнология. - 2010. - № 1. - С. 77-84.

13. Golubev S.N., Muratova A.Yu., Wittenmayer L., Bondarenkova A.D., Hirche F., Matara L.Yu., Merbach W., Turkovskaya O.V. Rhizosphere indole-3-acetic acid as a mediator in the Sorghum bicolor-phenanthiene-Sinorhizobium meliloti interactions // Plant Physiol. Biochem. - 2011. - Vol. 49. - P. 600-608.

14. Лойко Н.Г., Кряжевских H.A., Сузина H. Е., Демкина Е.В., Муратова А.Ю.. Турковская О.В., Козлова А.Н., Гальченко В.Ф., Эль-Решстан Г.И. Покоящиеся формы Sinorhizobium meliloti // Микробиология. - 2011. - Т. 80, № 4. - С. 465-476.

15. Плешакова Е.В., Муратова А.Ю.. Турковская О.В. Изменение биологической активности загрязненной углеводородами почвы // Поволжский экологический журнал. - 2011. - № 4. - С. 490-496.

16. Muratova A.Yu.. Golubev S.N., Dubrovskaya E.V., Pozdnyakova N.N., Panchenko L.V., Pleshakova E.V., Chernyshova M.P., Turkovskaya O.V. Remediating abilities of different plant species grown in diesel-fuel-contaminated leached chernozem // Appl. Soil Ecol. - 2012. - Vol. 56. - P. 51- 57.

Обзор

17. Турковская O.B., Муратова А.Ю. Биодеградация органических поллютантов в корневой зоне растений // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / Отв. ред. В.В. Игнатов. - М.: Наука, 2005. -С. 180-208.

Статьи в сборниках

18. Турковская О.В., Панченко JI.B., Дубровская Е.В., Плешакова Е.В., Муратова А.Ю.. Позднякова H.H., Игнатов В.В. Биотехнологии для очистки окружающей среды // Высокие технологии - путь к прогрессу: Сб. науч. тр. - Саратов: «Науч. книга», 2003.-С. 76-81.

19. Бондаренкова А.Д., Муратова А.Ю.. Турковская О.В. Деградация нефтяных углеводородов ассоциативными ризобактериями рода Azospirillum. Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Сборник статей / Под ред. О.В. Турковской. Саратов: Изд-во Научная книга, 2005. - С. 96-103.

20. Дзичковская М.И., Муратова А.Ю.. Турковская О.В. Деградация полициклического ароматического углеводорода фенашрена штаммом Rhizobium sp. Страте-пи взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Сборник статей / Под ред. О.В. Турковской. Саратов: Изд-во Научная книга, 2005. - С. 163-170.

21. Голубей С.Н., Шелудько A.B., Муратова А.Ю., Макаров O.E., Турковская О.В. Оценка адаптационного потенциала ризосферных бактерий к загрязнению почв ПАУ. Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Сборник статей / Под ред. О.В. Турковской. Саратов: Изд-во Научная книга, 2005. - С. 112-123.

22. Бондаренкова А.Д., Муратова А.Ю. Деградация нефтяных углеводородов стимулирующей рост растения ризобактерией рода AzospiriUum. Биотехнология будущего. В рамках Междунар. симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной Программе», 5-9 июня 2006, Санкт-Петербург: Сборник статей. - М.: ОАО «Авиаиздат», 2006. - С. 5-6.

23. Wittenmayer L., Merbach W., Muratova A.Ju.. Golubev S.N. Bestimmung von 3-Indolylessigsäure in der Rhizosphäre von Hirse (Sorghum bicolor (L.) Moench.). In: Reaktionen und Stoffflüsse im wurzelnahen Raum., Hrsg.: W. Merbach, W. Gans, J. Augustin. - Beuren [u.a.] : Verlag Grauer. - 2006, S. 50-57. (in German, abstract in English)

24. Merbach W., Wittenmayer L., Muratova A.. Golubev S., Gans W. Einfluss des polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffs Phenanthren auf Wachstum, Entwicklung und Wurzelexsudation von Sorghum bicolor (L.) Moench. In: Physiologische, chemische und mikrobiologische Prozesse im Wurzelraum., Hrsg.: W. Merbach, A. Deubel, J. Augustin. - Beuren-Stuttgart: Verlag Grauer. - 2008, S. 44-50. (in German, abstract in English)

25. Muratova A.. Turkovaskaya O. Phytotoxicity assay and phyto-remediation of the oil-sludge-contaminated soil with Sorghum bicolor (L.) Moench. In Sustainable Agriculture for Food , Bio-energy and Livelihood Security., Eds R.K. Behl, D.P. Singh, V.S. Tomar, M.S. Bhale, D. Khare and S.D. Upadhyaya. -Jodhpur (India): Agrobios (International) Publishers. - 2009, P. 311-322.

26. Muratova A.Yu.. Kapitonova V.V., Chernyshova M.P., Turkovskaya O.V. Enzymatic activity of alfalfa in a phenanthrene-contaminated environment // World Academy of Science, Engineering and Technology. - 2009. - Vol. 58. - P. 317-322.

27. Muratova A.. Panchenko L., Dubrovskaya Ye., Pleshakova Ye., Turkovskaya O. Phyto-remediation of oil-sludge-contaminated soil: from laboratory to field experience // Trends in Bioremediation and Phytoremediation / Ed. G. Plaza - Kerala: Research Signpost. 2010. - P. 403-427.

Патенты

28. Муратова А.Ю.. Бондаренкова А.Д., Голубев С.Н., Папченко JI.B., Турковская О.В. Способ фиторемедиации грунта, загрязненного углеводородами (варианты). Патент РФ № 2403102. - 2010. Бюл. № 31. - 10 с. с приоритетом от 15.05.2009.

29. Муратова А.Ю.. Голубев С.Н., Турковская О.В. Штамм бактерий Sinorhizobium meliloti Р221, деструктор полициклических ароматических углеводородов и стимулятор роста растений для повышения эффективности фиторемедиации. Патент РФ № 2406758. - 2010. Бюл. № 35. - 7 с. с приоритетом от 11.03.2009.

Тезисы докладов на конференциях - 36.

Подписано в печать 12.04.2013 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Шрифт Times New Roman. Усл. неч. л. 3,02. Уч.-изд. л. 2,93. Тираж 100 экз. Заказ № 1165.

ООО «Издательство КУБиК» 410056, Саратов, ул. Чернышевского, 94а тел.: (8452) 60-33-20

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Муратова, Анна Юрьевна, Саратов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

На правах рукописи 052 013 5109? ^¡^^К

МУРАТОВА Анна Юрьевна

РАСТИТЕЛЬНО-МИКРОБНЫЕ АССОЦИАЦИИ В УСЛОВИЯХ УГЛЕВОДОРОДНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант -д.б.н., профессор О.В.Турковская

Саратов - 2013

Содержание

Содержание..............................................................................................................2

Обозначения и сокращения..................................................................................6

Введение...................................................................................................................7

Глава 1. Обзор литературы..................................................................................18

1.1. Характеристика углеводородов как загрязнителей окружающей среды. 18

1.1.1. Определение и классификация нефтяных углеводородов............19

1.1.2. Тяжелые металлы как компонент нефтяного загрязнения............20

1.1.3. Токсикология нефтяных углеводородов и тяжелых металлов.....22

1.2. Реакции почвенных микроорганизмов на присутствие нефтяных углеводородов в окружающей среде................................................................24

1.2.1. Микрорганизмы-деструкторы нефтяных углеводородов.............24

1.2.2. Микробная деградация нефтяных углеводородов.........................25

1.3. Реакции растений на присутствие нефтяных углеводородов в окружающей среде..............................................................................................38

1.3.1. Фитотоксичность нефтяных углеводородов...................................38

1.3.2. Адсорбция нефтяных углеводородов на поверхности корней, поглощение и аккумуляция загрязнителя растением..................................41

1.3.3. Транспирация и выделение растением летучих углеводородов из почвы в воздух.................................................................................................43

1.3.4. Физиологические и биохимические реакции растений на поллютантный стресс......................................................................................44

1.3.5. Деградация нефтяных углеводородов в растении.........................46

1.4. Растительно-микробные взаимодействия в условиях загрязнения окружающей среды углеводородами................................................................49

1.4.1. Корневые экссудаты как инструмент влияния растений на почвенные микроорганизмы..........................................................................50

1.4.2. Влияние ризосферных микроорганизмов на растения..................59

1.5. Биоремедиация и фиторемедиация почв, загрязненных нефтяными углеводородами...................................................................................................66

1.5.1. Роль растения в фиторемедиации почв, загрязненных нефтяными углеводородами...............................................................................................69

1.5.2. Роль микроорганизмов в фиторемедиации.....................................76

1.5.3. Повышение эффективности фиторемедиации...............................78

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.....................................................................84

Глава 2. Материалы и методы............................................................................84

2.1. Объекты исследования.............................................................................84

2.2. Среды.........................................................................................................86

2.3. Выделение и изучение бактерий из образцов почвы и корневой зоны растений...............................................................................................................89

2.4. Изучение деструктивной активности микроорганизмов.....................91

2.5. Исследование стимулирующей рост растения активности ризосферных микроорганизмов........................................................................97

2.6. Тесты на фитотоксичность загрязненной углеводородами почвы ... 102

2.7. Вегетационные опыты...........................................................................103

2.8. Анализ образцов грунта.........................................................................111

2.9. Методы статистической обработки данных........................................115

Глава 3. Влияние углеводородного загрязнения на структуру и функции ризосферного микробного сообщества..........................................................116

3.1. Влияние углеводородов на численность микроорганизмов корневой зоны растений....................................................................................................117

3.1.1. Влияние дизельного топлива на изменение численности микроорганизмов в ризосфере растений....................................................118

3.1.2. Влияние нефтешлама на изменение численности микроорганизмов в ризосфере сорго веничного........................................119

3.1.3. Влияние битума на изменение численности микроорганизмов в ризосфере растений.......................................................................................120

3.2. Влияние углеводородов на физиологическую структуру микробного сообщества корневой зоны растений..............................................................124

3.2.1. Влияние углеводородов на основные физиологические группы почвенных микроорганизмов.......................................................................124

3.2.2. Влияние углеводородов на популяцию микроорганизмов-деструкторов ..................................................................................................129

Глава 4. Деструктивный потенциал ризосферных микроорганизмов по отношению к нефтяным углеводородам.......................................................137

4.1. Выделение и исследование природных ризосферных штаммов с экологически значимыми свойствами............................................................138

4.1.1. Скрининг ризосферных штаммов-деструкторов ПАУ................138

4.1.2. Скрининг ризосферных микроорганизмов, проявляющих устойчивость к тяжелым металлам.............................................................143

4.1.3. Исследование деградации дизельного топлива выделенными ризосферными штаммами, устойчивыми к никелю..................................146

4.2. Исследование коллекционных ассоциативных ризобактерий на наличие деструктивного потенциала по отношению к углеводородам......149

4.2.1. Рост азоспирилл в присутствии нефтяных углеводородов.........150

4.2.2. Количественные показатели деструктивной активности штамма Azospirillum brasilense SR80 по отношению к нефтяным углеводородам.... 158

4.2.3. Спектр деструктивной активности штамма Azospirillum brasilense SR80...............................................................................................160

4.3. Деградация фенантрена ризосферным штаммом Ensifer meliloti Р221.. 162

4.3.1. Деструктивная активность штамма Ensifer meliloti Р221 по отношению к фенантрену.............................................................................163

4.3.2. Исследование метаболизма фенантрена штаммом Ensifer meliloti Р221...................................................................................................168

Глава 5. Реакции растений на загрязнение окружающей среды углеводородами................................................................................................181

5.1. Влияние углеводородов на рост и развитие растений в загрязненном грунте.................................................................................................................182

5.1.1. Влияние нефтешлама на рост и развитие растений.....................183

5.1.2. Влияние дизельного топлива на рост и развитие растений........192

5.1.3. Влияние фенантрена на рост и развитие растений......................198

5.2. Влияние углеводородов на фотосинтетические пигменты растений.....201

5.3. Влияние углеводородов на корневую экссудацию растений............205

5.4. Влияние углеводородов на ферментативную активность растений......215

5.4.1. Влияние фенантрена на активность ферментов в тканях и в ризосфере люцерны посевной......................................................................216

5.4.2. Влияние фенантрена на активность ферментов в корневых экссудатах и в ризосфере сорго веничного................................................221

5.4.3. Активность растительных ферментов по отношению к ПАУ и их

производным..................................................................................................227

Глава 6. Растительно-микробные взаимодействия в условиях углеводородного загрязнения.........................................................................233

6.1. Влияние растений на формирование ризосферного микробоценоза233

6.1.1. Ризосферный эффект.......................................................................234

6.1.2. Влияние корневых выделений растений на проявление деструктивной активности ризосферными микроорганизмами...............245

6.2. Влияние микроорганизмов на развитие растений в условиях углеводородного загрязнения..........................................................................254

6.2.1. Стимулирующая рост растений активность ризосферных штаммов-деструкторов нефтяных углеводородов......................................................254

6.2.2. Влияние углеводородов на стимулирующую рост растений активность ризосферных штаммов в вегетационных опытах..................263

Глава 7. Отработка приемов фиторемедиации загрязненного углеводородами грунта....................................................................................283

7.1. Исследование процессов фиторемедиации загрязненной углеводородами почвы в условиях лабораторных вегетационных опытов283

7.1.1. Фиторемедиация почвы, загрязненной битумом и ПАУ............284

7.1.2. Фиторемедиация почвы, загрязненной нефтешламом................287

7.1.3. Приемы повышения эффективности фиторемедиации почвы, загрязненной нефтешламом.........................................................................296

7.1.4. Фиторемедиация почвы, загрязненной дизельным топливом.... 307

7.2. Полевые испытания технологии...........................................................312

7.2.1. Ремедиация почвы, загрязненной нефтешламом.........................312

7.2.2. Ремедиация почвы, загрязненной дизельным топливом.............315

Заключение..........................................................................................................319

Выводы.................................................................................................................336

Список литературы.............................................................................................340

Приложения.........................................................................................................382

Обозначения и сокращения

АБТС - 2,2-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) аммония

АЦК - 1-аминоциклопропан-1-карбоновая кислота

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

1Г2НК - 1-гидрокси-2-нафтойная кислота

ГХ - газовая хроматография

2,7-ДАФ - 2,7-диаминофлуорен

DL-ДОФА - 3,4-дигидрокси-ОЬ-фенилаланин

ИУК - индолил-3-уксусная кислота

а-КБ - а-кетобутират

КОЕ - колониеобразующие единицы

МБЦА - моно-, бициклические ароматические углеводороды

МИК - минимальная ингибирующая концентрация

МПА - мясо-пептонный агар

МТК - максимальная толерантная концентрация

НВЧ - наиболее вероятное число

ОФЭ - общий фитотоксический эффект

ОЧГ - общая численность гетеротрофных микроорганизмов

ПАВ - поверхностно-активное вещество

ПАГЭ - электрофорез в полиакриламидном геле

ПАУ - полициклический ароматический углеводород

ПДК - предельно допустимая концентрация

ПХБ - полихлорированные бифенилы

СБС - спирто-бензольные смолы

ТМС — трис-минимальная среда

ТСХ - тонкослойная хроматография

УОМ - углеводородокисляющие микроорганизмы

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

PGPR - plant growth-promoting rhizobacteria (ризобактерии, стимулирующие рост растения)

R/S - ризосферный эффект - отношение численности микроорганизмов в ризосфере (R) к численности микроорганизмов в почве без корней (S)

Введение

Актуальность

Спрос на углеводородное сырье в современном мире неуклонно растет, отвечая потребностям цивилизации. Россия занимает одно из ведущих мест по добыче, транспортировке и переработке нефти. К сожалению, в сочетании с несовершенными технологиями, изношенностью оборудования и низкими темпами реконструкции в нефтяной отрасли всевозрастающие объемы извлечения и обработки углеводородного сырья на сегодняшний день сделали Россию главным загрязнителем природы нефтью в мире. При добыче более 500 млн т нефти в год ее потери составляют от 1,5 до 10%, что сопровождается увеличением нефтезагрязненных территорий, общая площадь которых исчисляется сотнями тысяч гектаров. Таким образом, нефть и нефтепродукты признаны приоритетными загрязнителями окружающей среды не только в нашей стране, но и за рубежом [14]. Решение этой проблемы требует всестороннего междисциплинарного подхода - от законодательного и конструктивного предотвращения поступления загрязнителя в окружающую среду до научно-обоснованного прогнозирования и направленного использования реакций противодействия токсиканту со стороны объектов природы.

Попадая в окружающую среду, нефть и нефтепродукты оказывают выраженное воздействие на все компоненты экосистемы [27]. Среди них растения и микроорганизмы - продуценты и редуценты - заслуживают особое внимание, т.к. представляют собой базовые природные системы синтеза и разложения органических соединений. Процессы аккумуляции, трансформации и деградации нефтяных углеводородов растениями и микроорганизмами активно изучаются в последнее время, как для оценки риска и предотвращения попадания токсикантов в пищевые цепи, так и с целью поиска природных механизмов детоксика-ции и деградации антропогенных загрязнителей. Результатами этих исследований стали с одной стороны - выделение штаммов микроорганизмов-

деструкторов, описание путей микробного катаболизма углеводородов [244, 253], ас другой - характеристика метаболизма некоторых углеводородов в растениях [320].

Микробная деградация углеводородов составляет основу современной технологии биоремедиации (биоаугментации) нефтезагрязненных объектов окружающей среды [433, 491]. Однако за годы практического использования этой биотехнологии выявился ряд ее недостатков, связанных с вытеснением интродуцированных микроорганизмов-деструкторов аборигенной микрофлорой, опасностью интродукции как таковой (т.е. введением в природные экосистемы селекционных микроорганизмов, включая генетически модифицированных), а также высокой стоимостью процесса обработки загрязненных объектов, особенно на значительных площадях.

Выявление эффекта повышенной биодеградации нефтяных углеводородов в корневой зоне растений послужило поводом объединения усилий физиологов растений и микробиологов в разработке биотехнологии фиторемедиации -использования растений и ассоциированных с ними микроорганизмов для очистки окружающей среды [234, 270, 271, 287, 291, 292, 285, 358, 418, 503, 504]. Растительно-микробные ассоциации и симбиозы, обладающие гибким метаболизмом и уникальными ферментными системами, имеют большие преимущества при выживании в неблагоприятных условиях окружающей среды, обусловленные не только повышенной толерантностью к ксенобиотикам, но и способностью к активному удалению токсикантов из сферы обитания.

Преимущества фиторемедиации как экономически выгодной, экологически безопасной и эстетически привлекательной биотехнологии восстановления загрязненных территорий in situ показаны многими исследователями [160, 222, 397], но ее научные основы До сих пор изучены недостаточно. В частности, не понятно, почему одни виды растений стимулируют элиминацию органического поллютанта (например, углеводородов) из почвы, а другие - нет; как растения в своей корневой зоне формируют микробное сообщество, активно разрушающее

загрязнитель; какова роль в деградации поллютанта микроорганизмов, тесно ассоциированных с корневой зоной растений; как инокуляция растений стимулирующими их рост микроорганизмами-деструкторами способствует очистке почвы; участвуют ли непосредственно растения в ризосферной деградации углеводородов. Кроме того, особенностью фиторемедиации является ее сайт-специфичность, т.е. использование растений в одних почвенно-климатических условиях не гарантирует их успешного применения в других. Поэтому расширение спектра растительных видов-фиторемедиантов и выяснение закономерностей самого процесса являются основой успешного распространения и применения этой экологической биотехнологии. Предпринятые нами научные исследования растительно-микробных ассоциаций в условиях углеводородного загрязнения основаны на убежденности в перспективности фиторемедиации, направлены на выяснение ее механизмов и могут послужить фундаментом для решения новых задач в биотехнологии.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

2. Провести скрининг микроорганизмов, выделенных из корневой зоны растений, по проявлению способности к деградации нефтяных углеводородов, в том числе полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Охарактеризовать деструктивную активность отобранных штаммов.

3. Изучить пути микробной деградации фенантрена у штамма ризосферной бактерии Ет1/ег теШой Р221

4. Изучить физиологические и биохимические реакции растений на стресс, связанный с присутствием в среде углеводородов, оценивая воздействие

•ч

загрязнителя на рост, развитие и фотосинтетический аппарат растений, изменение корневой экссудации, эндогенной и экзогенной ферментативной активности.

6. Исследовать выделенные штаммы микроорганизмов на наличие признаков, характерных для стимулирующих рост растений ризобактерий (PGPR): азотфиксацию, синтез фитогормона индолил-3-уксусной к

Информация о работе

Муратова, Анна Юрьевна
доктора биологических наук
Саратов, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Растительно-микробные ассоциации в условиях углеводородного загрязнения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Растительно-микробные ассоциации в условиях углеводородного загрязнения ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Растительно-микробные ассоциации в условиях углеводородного загрязнения"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Муратова, Анна Юрьевна, Саратов

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Растительно-микробные ассоциации в условиях углеводородного загрязнения
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология