Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Деструкция нитроароматических и полиароматических соединений древоразрушающими грибами

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Деструкция нитроароматических и полиароматических соединений древоразрушающими грибами"

На правах рукописи

РГБ ОД

2 5 СЕН

козлов

Григорий Владимирович

ДЕСТРУКЦИЯ НИТРОАРОМАТИЧЕСКИХ И ПОЛИАРОМАГИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ДРЕВОРАЗРУШАЮЩИМИ ГРИБАМИ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт - Петербург - 2000

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном Технологическом Институте (Техническом Университете).

Научные руководители:

Доктор химических наук, профессор

Кандидат биологических наук, доцент

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Доктор биологических наук, профессор

ГАРАБАДЖИУ Александр Васильевич

СОКОЛОВ Виктор Николаевич

МИХАЙЛОВА Наталья Павловна

БУРЕНЬ

Валентин Мефодисвич

Ведущая организация: Санкт-Петербургская Государственная Химико-Фармацевтическая Академия

Л] //у? у у Защита состоится 2000 г

В -¿У час., в ауд. О у на заседании диссертационного совета Д 063.25.09. при Санкт-Пегербургском Государственном Технологическом Институте (Техническом Университете).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Отзывы и замечания по данной работе, заверенные печатью, в одном экземпляре просим направлять по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Московский пр., дом 26, СПбГТИ(ТУ), Ученый Совет.

Автореферат разослан "_

_»¿¿^и&ооо г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета / .

кандидат биологических наук С Т.Б. Лисицкая

f Ч1Ч. {, о

ОБЩАЯХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микробная утилизация нитроароматичсских и полиароматических соединений в последнее десятилетие стала объектом пристального внимания ученых развитых стран мира. Этот интерес вызван прежде всего накоплением большого количества отходов, содержащих эти вещества, и ужесточением законодательства в области охраны окружающей среды. Использование микроорганизмов для утилизации данных веществ открывает перспективы создания технологий утилизации отходов, содержащих нитроароматические и полиароматические соединения и очистки от них природных биоценозов. Немаловажную роль в этом вопросе играют экономические факторы: биологические методы дешевле и проще в техническом исполнении, чем большинство других.

Сейчас во всем мире утилизация нитро- и полиароматических соединений ведется с помощью бактерий и простейших в составе биоценозов очистных сооружений и рецептур биопрепаратов. Однако все больший интерес привлекает использование древоразрушающих грибов. Это обусловлено тем, что грибы из-за своей морфологии как нельзя лучше подходят для утилизации твердых отходов, содержащих эти вещества большая часть которых представляет из себя загрязненные экотоксикантами лигноцеллголозные материалы.

Древоразрушающие грибы, обладая мощными системами лигнолитических и целлюлозолитических ферментов, способны разлагать как сами экотоксиканты, так и другие компоненты твердых отходов.

Поскольку продукты деструкции содержат полезные органические и минеральные вещества, предполагается, при условии отсутствия в них радионуклидов и тяжелых металлов использовать их в качестве почвообразователей.

Работа выполнена в рамках хоздоговоров с фирмой „Umweltschutz mitte GmbH" (ФРГ) и заводом „Заря" (Украина).

Цель работы. Настоящее исследование посвящено поиску активных штаммов -деструкторов полиароматических углеводородов (ПАУ), представляющих опасность для биосферы, и 2,4,6-тринитротолуола (ТИТ). Целью работы является разработка высокоэффективных процессов утилизации этих веществ, безопасных для окружающей среды. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- выбрать наиболее чувствительный к ПАУ и ТНТ метод оценки фитотоксичности;

- оценить предельное содержание в грунте ПАУ и ТНТ, при котором не наносится вреда сельскохозяйственным растениям, т.е. определить, до какой концентрации должно быть снижено содержание ПАУ и ТНТ в продуктах переработки отходов;

- провести отбор штаммов - деструкторов ПАУ и ТНТ;

- изучить процессы деструкции ПАУ и ТНТ под воздействием различных факторов;

- оценить влияние продуктов переработки и штаммов деструкторов на

различные объекты окружающей среды.

Научиая новизна. Проведен трехэтапный скрининг штаммов грибов, в результате которого отобран высокоэффективный, экологически безопасный деструктор ПАУ Trichoderma viride. Впервые показано, что гриб Т. viride способен разрушать все шестнадцать ПАУ, представляющие опасность для окружающей среды. Их содержание в биосфере контролируется американским агентством по защите окружающей среды, в номенклатуре которого данные соединения называются ПАУ ЕРА. Впервые исследована деструкция смеси шестнадцати ПАУ ЕРА в составе древесины под воздействием ультрафиолетового излучения и грибов Т. viride и Phanerochaete chrysosporium. Показано, что на фоне снижепия суммарного содержания ПАУ в среде происходит перераспределение вещества между компонентами смеси в сторону многоядерных ПАУ как в случае микробной, так и в случае фотохимической деструкции. В результате скрининга отобран высокорезистентный к ТНТ, экологически безопасный штамм-деструктор Coriolus versicolor F-462, способный в течение шестидесяти суток полностью разрушать ТНТ в субстрате при его исходном содержании, достигающем 1% массы. Изучено воздействие ТНТ и суммарной фракции ПАУ железнодорожных шпал на развитие растений пшеницы. Предложен способ качественного обнаружения присутствия ТНТ в твердых субстратах.

Практическая значимость. Отобраны экологически безопасные штаммы-деструкторы ПАУ ЕРА и ТНТ, активно разрушающие как сами экотоксиканты, так и другие компоненты отходов (сред). Высокая резистентность штаммов-деструкторов позволяет перерабатывать отходы (среды) с высоким содержанием данных вредных веществ, что минимизирует количество вторичных отходов. Намечены пути промышленной реализации технологий.

Материалы исследований легли в основу отчетов, переданных заказчикам.

Апробация работы. Результаты работы доложены на конференции аспирантов СПбГТИ им М. М. Сычева; Всероссийской конференции "Микробиология почв и земледелие"; XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии. Публикации: 5 печатных работ.

Объем и построение работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав: обзор литературы, материалы и методы, экспериментатьная часть, обсуждение результатов, выводов и списка литературы, изложенных на 134 страницах машинописного текста. Работа содержит 22 таблицы, 36 рисунков, список литературы включает 171 наименование отечественных и зарубежиых источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы состоит из 4 разделов, в которых обобщены сведения об изучаемых экотоксикантах; биоразнообразии микроорганизмов, разрушающих эти вещества. Обсуждаются механизмы деструкции поли- и нитроароматических соединений и экологические аспекты этого процесса. Дается анализ современного состояния проблемы микробной деструкции данных соединений.

Материалы п методы. Для оценки чувствительности тест-систем измерения фитотоксичности ставили сравнительный тест с использованием

стандартного фона веществ. Отбор тест-системы проводили по параметру, который давал наибольшее расхождение контроля с опытом.

Определение предельно допустимых концентраций ТНТ и ПАУ для растений осуществляли методом биопробы на пшенице (Triíicum aestivum L. К-47882 (ВИР), далее пшеница). Опыты проводили в условиях стерильного микровегетационного опыта по выбранной методике. ТНТ вносилси в виде водных растворов, ПАУ - методом импрегнирования грунта. Влияние ТНТ на растения оценивали по длине корневой системы, влияние ПАУ по размеру надземной части т.е. по наиболее чувствительным параметрам.

В работе использовали 42 штамма из коллекций ВНИИСХМ. Отбор штаммов осуществляли визуально по характеру их роста на классических и модифицированных средах и проводили его последовательно в три этапа: 1) в условиях строгого элективного физиологического эксперимента при культивировании на среде Ван-Итерсона с фильтроватыюй бумагой /Билай и др. 1985/, При этом в качестве критерия для отбора использовали сумму балов, даваемых культуре при оценке ее роста на 2,4, б и 8-е сутки культивирования; 2) с использованием различных модельных сред, содержащих целлюлозу и экотоксиканты /Козлов и др. 1998/. Критерием отбора служила суммарная разность баллов, полученных культурой, культивируемой на контрольной среде без экотоксикантов и культурами, растущими на средах с десятью различными концентрациями этих веществ через 2, 4, 6, 8 и 10 суток инкубирования. При отборе деструкторов ТНТ учитывати также цветную реакцию с сульфитом натрия /Лурье и др. 1966/. 3) с целью обеспечения экологической безопасности изучали фитотоксические свойства отобранных культур методом биопробы по стандартной методике на проростках кукурузы (Zea mays L. К-5789 (ВИР), далее кукуруза). Для дальнейшего изучения принимали культуры, которые не проявили фитотоксической активности.

Обработку субстратов ультрафиолетовым излучением проводили с использованием лампы ПРК-7.

При изучении морфологических и культуратьно - биохимических свойств культур использовали общепринятые методы исследований.

Содержание ТНТ в растворах определяли колориметрически по методу Лурье /Лурье и др. 1966/.

Определение содержания в твердых субстратах ПАУ, ТНТ и промежуточных продуктов их деструкции осуществляли с использованием метода хромата - масс - спектрометрии.

Изучение влияния грибов - деструкторов па растения проводили на пшенице и кукурузе в условиях вегетационного опыта по стандартной методике. Растения заражали созданным инфекционным фоном.

Тестирование штамма Т. viride F-471 на патогенность и острую токсичность для теплокровных проводили методом биопробы на белых мышах по стандартной методике. Макро- и микроскопическое строение внутренних органов, гематологические и биохимические показатели крови мышей изучали, используя стандартные методы.

Токсчичность продуктов переработки экотоксикантов проверяли методом биопробы на рыбках Гуппи по стандартной методике.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа с помощью компьютерных программ "Диана" и "Диана 3" /Воробьев и др. 1995/.

Результаты и обсуждение.

1.Подбор метода оценки фитотоксичности ПАУ и ТНТ. Предельное для пшеницы содержание экотоксикантов в почве

Для четкой постановки конечной цели работы прежде всего нам необходимо было определить тот безопасный уровень, до которого следует снижать содержание экотоксикантов в субстрате, а следовательно, нужно было подобрать оптимальный метод оценки фититоксичности веществ. В связи с этим было проведено исследование по подбору метода определения фитотоксичности ТНТ и ПАУ. Сравнивали различные стандартные приемы оценки фитотоксичности. Моделью служили растения пшеницы, выращиваемые в условиях стерильного микровегетационного опыта, семена и проростки кукурузы и пшеницы. Наибольшее различие с контролем 74,9% для ТНТ получили путем измерения длины корневой системы пшеницы, в случае с ПАУ наибольшее различие 52,7% было показано при измерение длины надземной части (Табл. 1). Оценка токсичности по длине корневой системы в случае высоких концентраций в грунте ПАУ (500 мкг/кг и выше) была затруднительна, так как у пшеницы наблюдалось увеличение длины и массы корневой системы за счет образования воздушных корней. Оптимальная продолжительность опыта составляла 10 суток. Прочие методы были менее чувствительны. Для дальнейшей работы по оценки фитотоксичности химических веществ использовали данный метод.

Определение фитотоксичности веществ проводили по выбранной методике. Растения культивировали в микровегетационных стеклянных сосудах диаметром 20 мм и длиной 300 мм. В качестве грунта использовали перлитовый песок. ТНТ вносили в виде водпых растворов, ПАУ - импрегнируя грунт. В результате для пшеницы были найдены максимальные концентрации экотоксикантов, которые не оказывали отрицательного влияния на растение. Для ТНТ это составило 0,5 мг/кг грунта (Табл. 2), а для суммарной фракции ПАУ ЕПА шпал - 50 мкг/кг грунта (Табл. 3).

Таким образом, идеальной целью работы явился процесс снижения содержания экотоксикантов в субстратах до или ниже зафиксированных нами значений.

2.11аправле1шый поиск грибов - экологически безопасных деструкторов ТНТ и ПАУ, способных разлагать целлюлозу

Отбор культур осуществляли по трем критериям: способности разрушать целлюлозу, резистентности к экотоксикантам и отсутствию фитотоксических Свойств.

Таблица 1.

Чувствительность различных методов оценки фитотоксичпости

№ Метод Фитотоксичность, %

•п.п. ПАУ ТНТ

1 Определение всхожести пшеницы 6,1 ±0,1 5,8±0,7

2 Определение всхожести кукурузы 2,Ш,2 2,1±0,1

3 Измерение суммарной длинны корней 10-ти проростков кукурузы - 55,3±2,9

Выращивание пшеницы в стерильных микровегетационных условиях

4 Измерение длины надземной части 52,7±8,8 47,5±3,0

5 Определение массы надземной части 34,9±5,7 36,1±8,9

6 Измерение длины корневой системы *-39,2±22Д 74,9±3,1

7 Определение массы корневой системы *-73,7±2,7 23,0±5,9

* отрицательное значение фитотоксичпости обусловлено развитием воздушных корней

Таблица 2.

Влияние ТНТ на развитие пшеницы

№ Концентрация Длина Сухая Длина Сухая масса

п.п. вещества, надземной масса корневой корневой

мг/кг части, см надземной системы, системы, мг

части, мг см

1 Контроль 17,3 11,5 12,8 6,0

2 0,05 17,2 12,7 11,6 7,9

3 0,5 19,6 12,7 13,4 6,2

4 5 14,1 10,3 7,5 6,3

5 50 9,7 8,1 3,3 5,1

НСР 2,2 2,5 1,8 1,4

Точность опыта, % 3,9 6,3 5,1 6,1

Таблица 3.

Влияние суммарной фракции ПАУ ЕРА шпал на развитие пшеницы

№ Концентрация Длина Сухая Длина Сухая масса

п.п. вещества, надземной масса корневой корневой

мкг/кг части, см надземной системы, системы, мг

части, мг см

1 Контроль 15,7 10,7 8,2 5,3

2 0,5 18,4 12,8 7,6 5,3

3 5 15,3 9,9 7,2 5,5

4 50 14,9 9,5 8,5 6,6

5 500 6,6 6,6 11,9 8,1

НСР 3,6 2,4 2,1 1,8

Точность опыта, % 7,8 7,4 7,4 9,3

Первый критерий бьш продиктован тем, что основную массу твердых отходов составляет целлюлоза, и поэтому, в сущности, требуется обезвреживать не чистое вещество-экотокеикант, а сложную смесь целлюлозы и экотоксикантов. Отсутствие фитотоксических свойств является важной чертой для экологической оправданности технологии. Такая технология позволит решить проблему дальнейшей судьбы продуктов переработки отходов, переведя их в почвообразоватсли.

Поверхностное культивирование на селективных средах с целлюлозосодержащими субстратами и полных средах с целлюлозными субстратами, содержащими экотоксиканты, позволило нам сравнить интенсивность заселения субстратов изучаемыми культурами, оценить характер их роста и интенсивность разложения ими субстратов, а также резистентность данных культур к экотоксикантам. Наблюдения проводили визуально и с помощью микроскопирования.

Рост грибов и степень разложения целлюлозы оценивали по четырехбатльной системе: 0 баллов - отсутствие роста; 1 - слабый единичный рост; 2 - зональный рост, типичное спороношение или сплошной слабый рост; 3 -сплошной рост, обволакивание субстрата мицеллием, появление отдельных зон дезагрегации и растворения субстрата; 4 - обильный рост, образование обширных зон дезагрегации и растворения субстрата.

Отбор культур проводили по методике предложенной Волчек Е.А. /Волчек и др. 1988/. Суть данной методики в том, что активности культуры определяют не по характеру ее роста через определенный, одинаковый для всех штаммов, промежуток времени, а по набранной за весь период инкубирования сумме баллов, которые выставляют через определенные промежутки времени (в нашем случае - через двое суток) в течение всего периода (в нашем случае - восемь суток). Такая система позволяет отбирать не только активные, но и быстрорастущие штаммы. На первом этапе нами было отобрано 11 культур целлюлозолитиков, а именно: Aspergillus niger F-357, A. niger F-529, A. terreus F-519, A. niger F-350, T. viride F-471, T. viride F-488, T. viride F-530, Ph. chrisosporium F- 460, C. hirsutus F-332, C. versicolor F-462, A. oryzae F-362, они затем были испытаны на способность колонизировать субстраты, содержащие экотоксиканты. Для отбора штаммов - деструкторов нами была предложена среда - сусло с полоской фильтровальной бумаги, импрегнированной в различных концентрациях веществом, дтя которого отбирается деструктор.

На втором этапе применяли такой же метод визуальной оценки роста грибов. Критерием отбора служила суммарная разность баллов между контролем и опытными точками. В случае с ТНТ дополнительно использовали цветную реакцию с Na2S03. При нанесении сухого реактива на фильтровальную бумагу зоны разложения тротила имели менее яркую окраску, чем зоны, где тротил не был разрушен. Данный метод позволил быстро определить, является ли гриб деструктором ТНТ. В случае с ПАУ отбор культур вели визуально. Результаты второго этапа отбора представлены в табл. 4 и 5.

Рост штаммов на средах с различным содержанием ПАУ

Номер штамма Содержание ПАУ ЕРА в долях от их содержания в новых шпалах Суммарная разность баллов

Раб. Колл. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

2 Р-357 44444 44444 34444 34444 34444 34444 34444 34444 33444 33444 33444 12

5 Р-529 44444 44444 44444 34444 34444 34444 34444 34444 33444 23444 23444 13

6 Б-519 34444 34444 34444 34444 34444 33444 33444 22333 22333 22333 22333 26

8 Р-350 44444 44444 44444 44444 44444 34444 34444 34444 34444 34444 34444 6

12 Р-530 34444 34444 33444 33444 33444 33344 33344 33344 33344 23334 22334 20

13 Р-488 44444 44444 34444 34444 34444 33334 33334 33334 33334 23334 23334 29

14 Р-471 44444 44444 44444 44444 44444 44444 44444 44444 44444 34444 23444 4

15 Р- 460 34444 34444 33344 33344 33344 33344 33344 33344 22334 22334 22334 27

16 Р-332 33444 33444 33444 33444 33444 33444 33444 33344 22234 22234 22234 16

17 Р-462 23344 23344 23344 23344 23344 23344 23344 23334 22334 22234 22234 9

32 Р-362 44444 44444 44444 44444 44444 34444 34444 34444 34444 34444 34444 6

Рост штаммов на средах с различным содержанием ТНТ

Номер штамма Содержите ТНТ в % по массе Суммарная разность баллов

Раб. Колл. 0 0,1 оа 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

2 Р-357 44444 44444 44444 44444 33444 23334 22334 12234 11122 00000 00000 74

5 Р-529 44444 44444 44444 44444 33444 23333 22233 12222 11122 00011 00000 78

6 Р-519 34444 34444 34444 34444 33444 33344 22334 22223 12222 00111 00111 59

8 Р-350 44444 44444 44444 44444 44444 34444 33444 33444 33444 33344 33344 13

12 Р-530 34444 34444 34444 33444 33444 33444 33334 22233 12223 11223 11123 43

13 Р-488 44444 44444 44444 44444 33344 33344 33333 22333 00112 00000 00000 74

14 Р-471 44444 44444 44444 34444 33333 22222 11222 11122 00000 00000 00000 101

15 И- 460 34444 34444 34444 34444 34444 12334 00122 00112 00000 00000 00000 95

16 Р-332 33444 33444 33444 33444 33444 33344 33344 23334 23334 11112 01112 39

17 Р-462 23344 23344 23344 23344 23344 23344 22334 22333 22233 12222 11222 26

32 Р-362 44444 44444 44444 44444 44444 44444 44444 33444 33344 33344 33344 11

-11В качестве деструкторов ПАУ были отобраны следующие штаммы: A. niger F-350, Т. viride F-471 и A. oryzae F-362. В качестве деструкторов ТНТ: A. niger F-350, С. versicolor F-462, A. oryzae F-362.

Для обеспечения экологической безопасности разрабатываемой технологии была проведена проверка отобранных штаммов на фитотоксичность. Все исследуемые штаммы рола Aspergillus проявили фитотоксическую активность от 47% до 95% и были исключены из дальнейшего рассмотрения.

Таким образом, для дальнейших исследований были отобраны следующие штаммы: Т. viride F-471 в качестве деструктора ПАУ и С. versicolor F-462 (аналог F-90 (БИН)) в качестве деструктора ТНТ. Эталонным штаммом явился наиболее изученный деструктор различных экотоксикантов Ph. crysosporium F-460 (аналоги F-754 (БИН), F-20696 (АТСС)). Следует отметить, что данный штамм не столь успешно прошел второй этап отбора, но в то же время не проявил фитотоксической активности.

Гриб Trichoderma viride Persoon:Fries (синоним Trichoderma lignorum (Tode) Harz) штамм F-471 выделен из дерново - подзолистой почвы. Характеризуется высокой целлюлолитической активностью, максимальной среди рассмотренных штаммов резистентностью к ПАУ и отсутствием фитотоксичности. Оптимальная температура его роста составляет +30°С. Хорошо утилизирует различные углеводы и целлюлозу. Морфология характерна для данного вида. Штамм обладает способностью разрушать ПАУ. Способен расти на субстратах с содержанием ТНТ до 0,9% ог массы. Не обладает патогепностыо и острой токсичностью для животных. Не проявляет фитопатогенности.

Гриб Coriolus versicolor (Linnacus:Fries) Quelet (синоним Trametes versicolor (Linnaeus:Fries) Pilat) штамм F-462 выделен из древесины липы. Характеризуется высокой целлюлолитической активностью, высокой резистентностью к ТНТ и отсутствием фитотоксичности. Оптимальная температура его роста составляет +25°С. Хорошо утилизирует различные углеводы и целлюлозу, древесину лиственных деревьев. При росте на древесине образует плодовые тела, характерные для данного вида. Способен активно колонизировать субстраты с содержанием ТНТ до 1% от массы и разрушать ТНТ. Не обладает патогенностью и острой токсичностью для животных. Не проявляет фитопатогенности.

Гриб Ph. chrysosporium рассматривается нами в качестве эталонной культуры, а не основного объекта исследования, поэтому в работе его характеристика не приводится.

3.Деструкция ПАУ ЕРА под воздействием грибов Ph. chrysosporium F-460 и T. viride F-471 и излучения >.=257,3 нм. Процессы и механизмы

Для изучения процессов, происходящих при деструкции сложной смеси ПАУ микромицетом T. viride F-471, гриб инкубировали на среде из шпачьных опилок с содержанием ПАУ 5132 мкг/кг увлажненных суслом, при температуре 30°С в течение 14 и 20 суток. В конце периода отбирались пробы для анализа, результаты которого представлены в табл. 6.

Содержание ПАУ в экспериментальных образцах в конце 14 и 20 дневных периодов инкубации

Компонент Содержание мг/кг

Контроль 14 суток 20 суток

Нафталин 22 0,4 0.1

Аценафтен 7 2.2 0,4

Аценафтилек 86 1.5 0,4

Флуорен 86 3.1 2,9

Фенантрен 1840 87 43

Антрацен 600 24 12

Флуорантен 1430 350 210

Пирен 520 100 71

Бензантрацен 230 8 2,7

Хризен 160 22 15

Бенз(Ь)флуорантен 45 12 4,3

Бега(к)флуорантен 34 3,6 27

Бенз(а)пирен 35 5,9 2,8

Дибензантрацен 18 2,7 4,4

Бензперилен 10 4,7 21

Инденопирен 9 3,4 16

Суммарное содержание ПАУ 5132 630,5 433

Как следует из полученных экспериментальных данных в течение 14 и 20 суток Т. \тс1е Р-471 разрушает большую часть ПАУ, содержащуюся в шпалах. Однако этот процесс крайне неравномерен. Результаты анализа продуктов деструкции свидетельствуют о более быстром разрушении простых по строению ПАУ. Наряду с этим идет накопление веществ сложного строения, в первую очередь таких, как инденопирен, бензперилен, дибензантрацен, а так же бенз(к)флуорантен. На основании экспериментальных и литературных данных нами было выдвинуто предположение о том, что реакции разрушения ароматических колец протекают последовательно по механизму пероксидазного окисления Рис.1. и Рис.2., и что наряду с ними идут реакции конденсации промежуточных продуктов деструкции. При этом вещества, молекула которых состоит из 4-5 ароматических ядер разрушаются медленнее 2-3 ядерных ПАУ. Кроме того, в результате таких процессов в среде должны накапливаться наиболее сложные по строению ПАУ, в первую очередь инденопирен (Рис. 3.).

Для проверки этих данных, а также доведения технологии до промышленных масштабов бьио проведено изучение деструкции ПАУ в шпальной щепе (1X1X2 см). Условия эксперимента были выдержаны прежние. Отбор образцов для анализа производили по истечении 30 и 40 суток инкубации.

Наряду с изучением деструктора ПАУ - Т. \iride Р-471 был исследован гриб РИ. с\1гу$о$рог\ит, известный как активный деструктор экотоксикантов, который способен разрушать все компоненты древесины и широкий спектр экотоксикантов. В связи с этим представляло интерес проанализировать его способность разрушать ПАУ ЕРА в сравнении с Т. V¡гШе Р-471. Результаты анализа приведены в табл. 7.

Нафталин

Н2О2 Н2ог

' >2-дигидроксинафталин

Окспбензойиая кислота

СООн

С=0

СН)

Рис.¡.Окисление ПАУ через диолы

2Н,0 Ц н20г

Антрацен Антрахинон Оксибензойная кислота

Рис.2. Окисление ПАУ через хиноны

Рис.3. Предполагаемая схема образования инденопирена

Таблица 7.

Содержание ПАУ в экспериментальных образцах после их обработки Т. \iride Р-471 и Р1г. скгугозрогшт р-460

Компонент смеси Содержание мг/кг

Контрольный вариант 30 суток 40 суток

Р-471 Р-460 Р-471 Р-460

Нафталин 14 3,8 2,1 2,1 1,1

Аценафтен 32 2,5 1,2 1,1 1,9

Аценафтилен 340 1,7 0,98 0,31 0,54

Флуорен 673 8,3 2,9 0,29 0,82

Фенантрен 1593 1230 790 0,87 14

Антрацен 606 320 190 0,94 5,4

Флуорантен 1237 1450 840 7.9 210

Пирен 763 630 280 0.32 64

Бензантрацен 187 37 23 0,99 11

Хризен 100 42 30 1,3 32

Бенз(Ъ)флуорантен 11 29 5,7 0.42 9,4

БензООФлуорантен 47 39 36 3.1 20

Бенз(а)пирен 30 9,6 4,4 7,4 0,49

Дибещантрацен 7 24 8,3 9,8 9,5

Бензперилен 20 69 17 0,91 3,8

Инленогогоен 2 49 21 3.8 7,9

Суммарное содержание ПАУ 5662 3945,9 2252,58 42,55 391,85

Экспериментальные данные говорят о способности Т. \iride Р-471 и Р1г. скгуяозропит Р-460 разрушают все ПАУ ЕРА. Причем, очень важно отметить, что наблюдаемое ранее явление перераспределения вещества между различными компонентами смеси ПАУ сохранилось и в случае их деструкции Рк сЬгуьозропит, что свидетельствует об общности механизма процесса. Данные результаты подтверждают гипотезу о реакциях образования сложных ПАУ. Так содержание инденопирена возрастало с 2 до 49 мкг/кг к исходу 30 суток и затем резко снижалось к исходу 40 суток, при этом, что содержание нафталина снижалось лишь вдвое. Это легко объяснить тем, что количество относительно простых ПАУ резко уменьшилось и микроорганизмы стали разрушать накопленные высококонденсированные ПАУ, а нафталин является продуктом их последовательного расщепления.

В природных условиях ПАУ разрушаются под воздействием целого ряда факторов: атмосферный кислород и озон, микроорганизмы, ионизирующие излучения, солнечный свет и так далее. Одним из наиболее мощных факторов является ультрафиолетовая часть солнечного спектра. В этой связи нами было изучено влияние излучения \=257,3 нм на полиароматическую фракцию каменноугольной смолы.

Опилки шпал помещали в чашки Петри и подвергали облучению. Облучение продолжалось 4 часа в сутки. Толщина слоя составляла 5 мм, субстрат увлажнялся водопроводной водой. По истечении четвертых и шестых суток эксперимента отбирались пробы для анализа. Результаты эксперимента представлены в табл. 8.

Таблица 8.

Изменение состава смеси ПАУ при воздействии излучения /,=257,3 нм

Компонент Содержание мг/кг

Контроль 16 часов 24 часа

Нафталин 22 0.26 0.10

Аценафтен 7 0,58 0,76

Аценафтилен 86 0,40 0,52

Флуорен 86 14 8,9

Фенантрен 1840 140 93

Антрацен 600 24 24

Флуорантен 1430 640 110

Пнрен 520 490 27

Бегаантрацен 230 3 9,9

Хризен 160 24 41

Бенз(Ь)флуорантен 45 24 23

Бенз(Юфлуорантен 34 13 14

БензСа^пирен 35 7,3 4

Дибензантрапен 18 5.8 5,3

Бензперилен 10 16 6,5

Инденопирен 9 14 21

Суммарное содержание ПАУ 5132 1416,34 388,98

Было обнаружено, что излучение Х=257,3 нм разрушает все ПАУ ЕРА и может быть использовано на практике как метод предобработки старой древесины шпал перед микробной утилизацией. Имеются данные о том, что продукты фотолиза ПАУ (хиноны, диолы, карбоновые кислоты) более токсичны, чем исходные вещества /Сопсеу et al. 1994/. Нами было установлено, что использование фотолиза с последующей микробной деструкцией позволит снизить токсичность до норм ПДК, причем, продукты фотоокисления разлагаются микробами активнее, чем исходные ПАУ.

Нами установлено, что и при фотоокислении полной деструкции в первую очередь подвергаются более простые соединения, такие как нафталин, аценафтен и фенантрен. В тоже время ПАУ, имеющих более 4-5 ароматических колец (пирен, хризен, 3,4-бензпирен и другие), требуют более длительного времени воздействия. Явление перераспределения вещества между различными компонентами смеси ПАУ при фотохимической деструкции сохраняется. Это связано, как и в случае с микроорганизмами, с протеканием сложных реакций конденсации промежуточных продуктов окисления.

4.Дсструкция ТНТ

Для изучения деструкции ТНТ грибом С. versicolor F-462 использовали среду следующего состава: фильтровальная бумага импрегнированная ТНТ (до 1% ТНТ по сухому весу), увлажненная суслом. Грибы инкубировали при температуре 30°С, пробы для анализа отбирали по истечении 60-ти суток, когда анализ показал полное отсутствие ТНТ и промежуточных ароматических продуктов его деструкции в образцах. Изучение механизма деструкции ТНТ не проводили.

5.Взапмодействие штаммов - деструкторов и продуктов переработки экотоксикаптов с объектами биосферы. Прогнозирование экологических последствий процесса

Для оценки экологических последствий внедрения технологии было проведено изучение взаимодействия Т. viride F-471, С. versicolor F-462 и Ph. chrysosporium F-460 с различными объектами окружающей среды.

Была проверена на фитосанитарная безопасность грибов - деструкторов на пшенице и кукурузе в условиях вегетационного опыта, результаты которого представлены в табл. 9 и 10.

Таблица 9.

Влияние грибов па пшеницу

Параметры раптений Контроль F-471 F-462 F-460 НСР Точность опыта, %

Длина надземной части, см 36,0 39,3 37,7 40,2 1,7 1,5

Масса надземной части, мг 170 204 152 186 30,0 5,7

Длина корневой систсмы, см 18,3 20,4 20,1 21,5 2,4 4,1

Масса корневой системы, мг 41,2 57,6 35,3 52,0 6,5 4,7

Таблица 10.

Влияние грибов на кукурузу

Параметры растений Контроль F-471 F-462 F-460 НСР Точность опыта, %

Длина надземной части, см 36,1 36,2 33,6 35,5 2,6 2,5

Масса надземной части, мг 443 396 350 400 63 5,3

Длина корневой системы, см 36,3 34,1 38,3 41,4 8,0 7,1

Масса корневой системы, мг 287 239 228 255 45 6,0

Статистическую обработку данных проводили методом одно- и двухфакторного дисперсионного анализа. При инокуляции семян пшеницы грибом Т. viride F-471 наблюдали достоверное увеличение длины и массы надземной части, а так же длины корневой системы. Инокуляция грибом С. versicolor F-462 вызывала увеличение длины надземной части. В случае Ph. chrysosporium F-460 наблюдали увеличение длины надземной части, а так же длины и массы корневой системы. Ни в одном варианте не было отмечено достоверного ингибирования пшеницы. Инокуляция семян кукурузы грибом Ph. chrysosporium F-460 вызвала снижение массы надземной части и корневой системы. Положительного влияния инокуляции семян кукурузы грибами не наблюдалось. Таким образом, при использовании продуктов деструкции в качестве почвообразователей, основное

внимание должно уделяться выбору растительной культуры под которую они будут вноситься. Т. viride F-471, С. versicolor F-462 безопасны для пшеницы и кукурузы; Ph. chrysosporium F-460 безопасен для пшеницы но не рекомендуется для внесения под кукурузу.

При культивировании других растений следует проверять влияние грибов в каждом конкретном случае, дабы избежать угнетения растения.

Для изучения патогенности вегетативного мицеллия и спор Т. viride F-471 тест ставили на белых мышах массой 20-22 г, которым в брюшную полость вводили взвесь микроорганизма в количестве 0,510'-2"106 микробных тел. Наблюдения за состоянием мышей велись в течение 30 суток.

При определении динамики распространения и длительности обнаружения Т. viride во внутренних органах мышей установлено, что в кровь животных микроорганизм пе проник, оп был обнаружен обнаруживается только на поверхности внутренних органов: сердца, печепи, почек и селезенки. При максимальной дозе заражения (2 млн. м.т.) Т. viride F-471 не был обнаружен уже на 30-й день наблюдений за состоянием внутренних органов мышей, при меньших дозах заражения мы не могли зафиксировать наличие Т. viride F-471 на 12-24 день табл. 11.

Таблица 11.

Изучение длительности носительства Т. viride F-471

Доза заражения м.т./мл Дни наблюдения

6 12 18 24 30

контроль - - - - -

5 105 + - - - -

1,0 10" + + - - -

1,5 106 + + + - -

2 106 + + + + -

Введение препарата гриба в организм белых мышей не оказало влияния на размеры, внешний вид, цвет, кровенаполненность, консистенцию и структуру их внутренних органов, состояние серозных и слизистых покровов, кожи и подкожной клетчатки. Все перечисленное соответствовало возрастным и анатомо-физиологическим показателям. Гистологическое исследование показало отсутствие каких либо изменений в структуре органов и морфологии клеток.

Гематологические и биохимические показатели крови находились пределах физиологической нормы табл. 12.

Токсичность штамма определяли методом биопробы на белых мышах. Мышам вводили прогретую в течение часа при 100°С взвесь культуры.

При определении токсичности штамма Т. viride Р-471 в течение опыта (14 суток) гибели мышей не наблюдалось, температура тела животных соответствовала физиологическим показателю 38,5°С, сердечная деятельность и дыхание, состояние кожных покровов и видимых слизистых не имели отклонений. Аппетит, поведение и масса тела подопытных мышей не изменились и были такими же, как у контрольных.

Гематологические и биохимические показатели крови белых мышей

Показатели Опыт Контроль

Количество лейкоцитов, 10' 6,44+0,60 5,20±0,72

Количество эритроцитов, 109 5,70±0,81 5,85±0,35

Гемоглобин, г/л 139,27+15,75 140,75±12,01

СОЭ, мл/г 1,33±0,50 1,40+0,48

Содержание общего белка, мг % 5,60+0,60 5,80+0,35

Содержание глюкозы, ммоль/л 3,90+0,53 4,07±0,55

Содержание общих липидов, мг % 29,94+1,67 35,09±2,70

Все приведенные данные позволяют утверждать, что штамм Т. viride F-471 не вирулентен и не токсичен для белых мышей, не обладает способностью длительно сохраняться в организме, не вызывает стуктурных изменений в тканях органов, не влияет на биохимические и гематологические показатели крови в течение месяца после введения в брюшную полость. Следовательно, штамм Т. viride F-471 не обладает патогенностью.

Изучение токсичности водного экстракта продуктов переработки ПАУ и

ТНТ для рыб

Исследовали водный экстракт продукта переработки железнодорожных шпал грибом Т. viride F-471 и ТНТ грибом С. versicolor F-462 (соотношение продукт:экстрагент 1:10, время экстракции 24 часа).

В экспериментальные аквариумы добавляли по 5, 10, 15, 20 и 25 мл исследуемого экстракта на 500 мл аквариумной воды. Объектом наблюдения служили аквариумные рыбы. Наблюдение вели 24 часа. За время эксперимента ни в одном аквариуме не погибла ни одна рыба. Следовательно, водные экстракты продуктов переработки этих отходов не токсичны.

Приведенные данные позволяют сделать вывод, что использование рассмотренных процессов утилизации ТНТ и ПАУ не нанесет урона окружающей среде.

-19-выводы

1. Проведен трехэтапный скрининг штаммов грибов, в результате которого отобран высокоэффективный штамм-деструктор ПАУ Т. viride F-471. Впервые показано, что гриб Т. viride способен разрушать все шестнадцать ПАУ ЕРА.

2. Впервые исследована деструкция шестнадцатикомпонентной смеси ПАУ ЕРА в составе древесины под воздействием УФ-излучения и грибов Т. viride и Ph. chrysosporium. Показано, что в процессе биологической и фотохимической деструкции смеси ПАУ на фоне снижения суммарного содержания ПАУ, происходит перераспределение вещества между компонентами смеси. Предложен механизм этого явления.

3. В результате скрининга штаммов грибов отобран высокорезистентный штамм-деструктор ТНТ С. versicolor F-462 способный в течение 60 суток полностью разрушать ТНТ в субстрате при исходной концентрации 1% по массе.

4. Проведено комплексное изучение проблем утилизации старых шпал и снаряженных ТНТ боеприпасов с истекшим сроком хранения. Намечены подходы к разработке технологий утилизации этих отходов.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1.Выделение из природных биоценозов микроорганизмов целлюлозодеструкторов, резистентных к биоцидным веществам/ Г.В. Козлов, Ю.В. Марьяновская, Я.А. Калей, Е.А. Цветкова, В.Н. Соколов, A.B. Гарабаджиу// Тез. докл. конф. аспирантов СПб технол. ин-та. посвященной памяти М.М. Сычева/СПб технол. ин-т. - Сапкт-Петербург, 1997. - с. 173.

2.Деструкция полиароматических углеводородов грибом Trichoderma sp. в модельной системе/ В.Н. Соколов, Г.В. Козлов, Ю.С. Оследкин, В.В. Кочетков, A.B. Гарабаджиу// Микробиология почв и земледелие: Тез. докл. Всеросс. конф. - Санкт-Петербург, 1998. - с.104.

3.Модифицированная среда Ван-Итерсона для выделения и селекции грибов, резистентных к ароматическим соединениям/ Г.В. Козлов, В.Н. Соколов, Я.А. Калей, Ю.В. Марьяновская, А.И. Гинак// Микробиология почв и земледелие: Тез. докл. Всеросс. конф. - Санкт-Петербург, 1998. - с.ИЗ.

4.Исследование процесса микробной деструкции ароматических полициклических углеводородов методом хромато-масс-спектроскопии/ Соколов В.Н. Гарабаджиу A.B. Козлов Г.В. Гинак А.И.// Тез. докл. XVI Менделеевского съезда по общей и прикладной химии 25-29 мая 1998. Часть 1. - М.: Изд. ВИНИТИ, 1998. - с. 284.

5. Исследование процесса микробной деструкции полиароматических

углеводородов в составе древесины/ Г.В. Козлов, A.B. Гарабаджиу, | В.Н.| | Соколов] , А.И. Гинак, В.В. Кочетков, Ю.С. Оследкин// Биотехнология. - 1999. № 4. - С. 63-67.

31.03.00г. Зак.64-60 РТП ИК «Синтез» Московский пр., 26

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Козлов, Григорий Владимирович

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика рассматриваемых экотоксикантов

1.1.1. Характеристика веществ

1.1.1.1. Полициклические ароматические углеводороды

1.1.1.2. 2,4,6-Тринитротолуол

1.1.2. Происхождение и природные аналоги экотоксикантов

1.1.2.1. Лигнин

1.1.2.2. Полиароматические компоненты биомассы растений

1.1.2.3. Карбонизация древесины • • • - >

1.2. Биоразнообразие деструкторов экотоксикантов

1.2.1. Видовое разнообразие деструкторов ПАУ

1.2.2. Видовое разнообразие деструкторов ТНТ '

1.3. Механизмы деструкции экотоксикантов

1.3.1. Биодеструкция ПАУ

1.3.2. Биодеструкция ТНТ

1.4. Экологические аспекты использования технологий биоремедиации

2. Материалы и методы 2.1. Материалы

2.1.1. Штаммы грибов

2.1.2. Среды и субстраты

2.1.2.1. Жидкие и агаризованные среды

2.1.2.2. Твердые субстраты

2.1.2.3. Среды, содержащие твердые субстраты

2.1.3. Стандартные растворы и ГСО

2.1.4. Тест-организмы 2.2. Методы

2.2.1. Определение ТНТ в растворе

2.2.2. Методы оценки токсичности ТНТ и ПАУ

2.2.3. Оценка пороговых концентраций экотоксикантов в грунте, оказывающих негативное влияние на растения

2.2.4. Отбор штаммов - деструкторов

2.2.5. Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств грибов

2.2.6. Определение оптимальной температуры культивирования

2.2.7. Твердофазное культивирование грибов на средах с экотоксикантами

2.2.8. Обработка субстратов ультрафиолетовым излучением

2.2.9. Определение ПАУ в твердых образцах

2.2.10. Определение ТНТ в твердых образцах

2.2.11. Изучение влияния грибов на развитие кукурузы и пшеницы

2.2.12. Изучение патогенности гриба Т. утс1е Р

2.2.13. Определение острой токсичности гриба Т. гтс^е Р

2.2.14. Изучение токсичности продуктов переработки

2.2.15. Статистическая обработка результатов 3. Экспериментальная часть

3.1. Выбор метода оценки фитотоксичности ТНТ и ПАУ

3.2. Определение минимальных содержаний ПАУ и ТНТ в грунте под пшеницей, при которых наблюдается угнетение растений

3.3. Отбор и характеристика штаммов-деструкторов 3.3.1. Изучение целлюлолитической активности грибов

3.3.2. Изучение резистентности грибов к экотоксикантам

3.3.2.1. Изучение резистентности грибов к ПАУ

3.3.2.2. Изучение резистентности грибов к ТНТ

3.3.3. Изучение фитотоксической активности грибов

3.3.4. Характеристика штаммов-деструкторов

3.3.4.1. Характеристика Т. viride F

3.3.4.2. Характеристика С. versicolor F

3.3.4.3. Характеристика Ph. chrysosporium F

3.3.5. Изучение деструкции экотоксикантов

3.3.5.1. Деструкция ПАУ ЕРА Т. viride F-471 в течение 14 и 20 суток

3.3.5.2. Деструкция ПАУ ЕРА Т. viride F-471 и Ph. chrysosporium F-460 в течение 30 и 40 суток

3.3.5.3. Изучение влияния излучения Х=257,3 нм на ПАУ ЕРА каменноугольной смолы

3.3.5.4. Деструкция ТНТ С. versicolor F

3.4. Изучение взаимодействия штаммов - деструкторов с окружающей средой

3.4.1. Изучение влияния штаммов - деструкторов на развитие кукурузы и пшеницы

3.4.2. Изучение патогенности и острой токсичности вегетативного мицеллия и спор штамма Т. viride F-471 для белых мышей

3.4.3. Изучение токсичности водного экстракта продуктов переработки экотоксикантов для рыб

4. Обсуждение результатов

4.1. Концепция и принципиальная схема процесса утилизации экотоксикантов

4.2. Выбор метода оценки фитотоксичности ПАУ и ТНТ. Предельное для пшеницы содержание экотоксикантов в почве

4.3. Направленный поиск грибов - экологически безопасных деструкторов нитроароматических и полиароматических соединений, способных разлагать целлюлозу

4.4. Деструкция ПАУ ЕРА под воздействием грибов

Ph. chrysosporium F-460 и Т. viride F-471 и излучения А,=257,3 нм. Процессы и механизмы

4.5. Деструкция ТНТ под воздействием гриба С. versicolor F

4.6. Взаимодействие штаммов - деструкторов и продуктов переработки экотоксикантов с объектами биосферы. Прогнозирование экологических последствий процесса

5. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Деструкция нитроароматических и полиароматических соединений древоразрушающими грибами"

Актуальность проблемы Интенсивное развитие химической и обрабатывающей промышленности привело к накоплению в природе значительных количеств токсичных веществ. В большинстве развитых стран история развития промышленных технологий насчитывает сотни лет. Техногенное воздействие на окружающую среду, связанное, в первую очередь, с давно накопленными экотоксикантами, вызывает необходимость разработки технологий по очистке загрязненных почв, водоемов, ландшафтов и т.д.

В связи с этим, в начале 90-х годов сформировалось новое направление в биотехнологии, которое получило название биоремедиации или биовосстановления. Технологии биоремедиации используются для борьбы с разливами нефти, уничтожения токсичных и вредных отходов, очистки почвы и грунтовых вод. Придавая большое значение новому направлению в развитии науки, Организация ООН создала программу исследований по биоремедиации (Programm of Clear Industry, UNIDO 1994) III.

Одним из перспективных направлений развития технологий биоремедиации является утилизация ароматических нитрозамещенных и полиароматических углеводородов (ПАУ). Этот интерес вызван прежде всего накоплением большого количества отходов (в частности, просроченных боеприпасов, снаряженных 2,4,6-тринитротолуолом (ТНТ), и отработанных деревянных железнодорожных шпал), содержащих эти вещества, а также ужесточением законодательства в области охраны окружающей среды. Токсичность, мутагенность и канцерргенность ПАУ и ТНТ доказана множеством экспериментов /2-5/. Данные о канцерогенности ПАУ обобщены в справочнике Международного агенства по изучению рака /6/. Использование грибов открывает перспективы создания технологий утилизации отходов, содержащих эти вещества, и очистки от них природных биоценозов.

Немаловажную роль играет экономический фактор: биологические методы дешевле и проще в техническом исполнении, чем другие.

Сейчас во всем мире утилизация нитро- и полиароматических соединений ведется, в основном, с помощью бактерий и простейших в составе биоценозов очистных сооружений и в качестве рецептур биопрепаратов. Однако все больший интерес привлекает использование грибов различных таксономических групп. Это обусловлено тем, что грибы как нельзя лучше подходят для утилизации содержащих эта вещества твердых отходов, большая часть которых представляет из себя загрязненные экотоксикантами лигноцеллюлозные материалы.

Лигноцеллюлолитические грибы, обладая мощными системами гидролитических ферментов, способны разлагать как сами экотоксиканты так и другие компоненты твердых отходов.

Поскольку продукты деструкции содержат полезные органические и минеральные вещества, предполагается использовать их в качестве почвообразователей в случае отсутствия в них радионуклидов и тяжелых металлов.

Работа выполнена в рамках хоздоговоров с фирмой "Umweltschutz Mitte GmbH & Со" (ФРГ) и заводом "Заря" (Украина) и является начальным этапом исследований данной проблемы, которые осуществляются кафедрой молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского Государственного Технологического Института.

Состояние разработки проблемы

Анализ литературы показал, что в США и Европе (особенно в ФРГ) ведутся многочисленные исследования по биодеградации нитроароматических и полиароматических экотоксикантов непосредственно в природных биоценозах и в составе отходов: сточных вод, городского мусора и т.д. В СНГ такие исследования проводятся, в основном, в России. На сегодняшний день описано более шестидесяти родов микроорганизмов, разрушающих ПАУ (раздел 1.2. настоящей работы), и 19 родов, представители которых способны в той или иной степени метаболизировать ТНТ (раздел 1.2. настоящей работы). Основные работы ведутся в направлении детоксикации сточных вод военных и коксохимических производств. В 1988 году Наумова с соавторами впервые опубликовала данные, свидетельствующие о возможности глубокой бактериальной деструкции ТНТ III. После этого появилось множество работ по деструкции как самого ТНТ /8,9/, так и продуктов его метаболизма /10/. Прямых сведений о технологиях утилизации боеприпасов, содержащих ТНТ нам обнаружить не удалось, однако есть все основания полагать, что данной проблемой занимается Hess с соавторами /11/, ведущий работы по комбинированной деструкции ТНТ фотохимическими и микробиологическими методами.

Деградация ТНТ грибами белой гнили была описана в 1990 году /12/. Все последующие работы по данной тематике направлены на разработку либо процессов очистки почв, либо сточных вод. Наибольшее число работ посвящено грибам белой гнили и прежде всего Phanerochaete chrysosporium. Сведения о деструкции ТНТ небазидиальными грибами появились значительно позже /13,14/.

Помимо использования живых клеток бактерий или грибов Spiker в 1992 году /15/ предложил, ввиду высокой чувствительности Ph. chrysosporium к ТНТ, использовать для детоксикации сильно загрязненных почв иммобилизованные ферменты этого гриба.

Исследования по биодеградации ПАУ носят более широкий характер. На наш взгляд это обусловлено тем, что, во-первых, ведется изучение деструкции целого класса химических соединений и, во-вторых, эти вещества чрезвычайно опасны для окружающей среды. На сегодняшний день показано, что все шестнадцать ПАУ, содержание которых в окружающей среде контролируется американским Environmental Protection Agency (ПАУ ЕРА) в той или иной степени подвержены микробной деструкции (раздел 1.2. настоящей работы). Наибольшее количество видов-деструкторов приходится на фенантрен, далее следуют пирен и бенз[а]пирен. Наименьшее - на бенз[к]флуорантен, бенз [g,h, i] пери лен и индено[1,2,3-сс1]пирен. Наиболее широким спектром разрушаемых ПАУ ЕРА обладают грибы белой гнили /16,17/.

Исследования по биодеградации ПАУ начались в первой половине 70-х годов. Dunn с соавторами в 1973 году изучали плазмиды,несущие гены, которые кодируют способность бактерий к биодеградации нафталина /18/. Во второй половине 80-х годов различные группы исследователей показали деструкцию разных ПАУ почвенными микроорганизмами /19,20/. В начале 90-х годов поиск деструкторов ПАУ велся, в основном, среди грибов белой гнили и бактерий рода Pseudomonas. В дальнейшем все большее внимание исследователей стали привлекать представителей родов Mycobacterium и Rodococcus.

Технологические приемы микробной очистки, приводимые в литературе, можно свести к следующим типам:

1 Использование чистых отсел екционированных культур микроорганизмов- деструкторов и их ассоциаций;

2)использование специальных питательных сред для активизации дикой почвенной микрофлоры;

3комбинированные методы.

В первом случае в почву единовременно, или через определенные интервалы, вносятся микроорганизмы, которые разлагают вешества-загрязнители.

Во втором случае в почву вносится специальная питательная среда, содержащая азот, фосфор, микроэлементы и стимуляторы роста

- 10микроорганизмов. В состав смеси входят добавки, способствующие солюбилизации гидрофобных соединений. При использовании таких сред почвенная микрофлора разлагает экотоксиканты значительно быстрее.

В третьем варианте либо совместно используются питательные среды и микроорганизмы и/либо производится предобработка субстрата.

Резюмируя вышесказаное, можно сказать, что сегодня в России и развитых зарубежных странах ведутся интенсивные исследования в области биодеградации техногенных загрязнителей биоценозов, причем основная роль в процессах детоксикации отводится грибам белой гнили (особенно Ph. chrysosporium) и бактериям рода Pseudomonas и Mycobacterium. Сведения об использовании для деструкции ароматических веществ грибов, не относящихся к базидиомицетам, немногочисленны. Данных о процессах, происходящих при деструкции многокомпонентных смесей экотоксикантов (10 и более компонентов), в литературе также оказалось немного.

Цели и задачи исследования

Настоящая работа посвящена поиску активных штаммов - деструкторов полиароматических углеводородов, содержание которых в окружающей среде контролируется, и 2,4,6-тринитротолуола (ТНТ), а также изучению различных аспектов процесса деструкции этих веществ. Практическая цель работы заключается в поиске путей решения проблем утилизации ТНТ, содержащегося в просроченных боеприпасах и отслуживших свой срок старых железнодорожных шпал. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- выбрать наиболее чувствительный к ПАУ и ТНТ метод оценки фитотоксичности;

- оценить предельное содержание в грунте ПАУ и ТНТ, при котором не наносится вреда сельскохозяйственным растениям, т.е. определить, до какой

-11 концентрации должно быть снижено содержание ПАУ и ТНТ в продуктах переработки отходов;

- провести отбор штаммов деструкторов ПАУ и ТНТ;

- изучить процессы деструкции ПАУ и ТНТ под воздействием различных факторов;

- оценить влияние продуктов переработки и штаммов-деструкторов на различные объекты окружающей среды.

Научная новизна работы

Впервые показано, что гриб Trichoderma viride способен разрушать все шестнадцать ПАУ ЕРА. Впервые исследована деструкция смеси 16-ти ПАУ ЕРА в составе древесины под воздействием ультрафиолетового излучения и грибов Т. viride и Ph. chrysosporium. Показано, что процесс перераспределения вещества между компонентами смеси характерен как для случая микробной, так и для случая фотохимической деструкции ПАУ. Для ряда штаммов оценены предельные концентрации ТНТ в субстрате, установлена деструкция ТНТ штаммом Coriolus versicolor F-462. Изучено воздействие ТНТ и суммарной фракции ПАУ железнодорожных шпал на развитие пшеницы. Предложен способ качественного обнаружения ТНТ в твердых субстратах. Разработана среда для отбора деструкторов труднорастворимых экотоксикантов.

- 121. Обзор литературы

В работе рассматривается деструкция ТНТ и шестнадцати ПАУ ЕРА. Эти соединения являются весьма опасными и широко распространенными экотоксикантами, представляя две группы веществ: ксенобиотики (ТНТ) и природные вещества (ПАУ). Сравнительное изучение таксономии их деструкторов и процессов биоразрушения позволят подобрать оптимальные микроорганизмы-деструкторы и технологические приемы утилизации.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Козлов, Григорий Владимирович

- 114-£.Выводы

1. Проведен трехэтапный скрининг штаммов грибов, в результате которого отобран высокоэффективный штамм-деструктор ПАУ Т. viride F-471. Впервые показано, что гриб Т. viride способен разрушать все шестнадцать ПАУ ЕРА.

2. Впервые исследована деструкция шестнадцатикомпонентной смеси ПАУ ЕРА в составе древесины под воздействием УФ-излучения и грибов Т. viride и Ph. chrysosporium. Показано, что в процессе биологической и фотохимической деструкции смеси ПАУ на фоне снижения суммарного содержания ПАУ происходит перераспределение вещества между компонентами смеси. Предложен механизм этого явления.

3. В результате скрининга штаммов грибов отобран высокорезистентный штамм-деструктор ТНТ С. versicolor F-462, способный в течение 60 суток полностью разрушать ТНТ в субстрате при исходной концентрации 1% по массе.

4. Проведено комплексное изучение проблем утилизации старых шпал и снаряженных ТНТ боеприпасов с истекшим сроком хранения. Предложены подходы к разработке технологий утилизации этих отходов.

- 115

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козлов, Григорий Владимирович, Санкт-Петербург

1.Биотехнология и устойчивое развитие: опыт и новые инициативы ЮНИДО. Бимотехнология и биоремедиация/ Обозрение по генетической инженерии и биотехнологии. Изд-во Комиссия ООН по промышленному развитию. - 1994. -Т. 1, №4. - С. 9-17.

2. Bioassay directed chemical analysis of Los Angeles airborne particulate matter using a human cell mutagenicity assay/ M.P. Hannigan, G.R. Cass, B.W. Penman, et al.// Environ. Sci. Technol. 1998. - V.32, N 22. p.3502-3514.

3. Estradiol metabolism an endocrine biomarker for modulation of human mammary carcinogenesis/ N.T. Telang, M. Katdare, H.L. Bradlow, M.P. Osborne // Environ. Health Perspect. - 1997. - V.105, N 3. - p.559-564.

4. Lee B.H., Lee S.J. In vitro chromosome aberration assay using human bronchial epithelial cells// J. Toxicol. Environ. Health. 1998. - v. 55, N 5. - P.325-329.

5. Neumann H., van Dorp C., Zwirner-Bayer J. The risk assessment of measuring the relative contribution to exposure from occupation, adducts from amino- and nitro-arenes// Toxicol. Lett. 1995. - v. 82, N 83. - P. 712-778.

6. Канцерогенные вещества: Справочник/ Пер с англ. А.Ф. Карамышевой. М.: Медицина, 1987. - 336 с.

7. Наумова Р.П., Селивановская С.Ю., Мингатина Ф.А. Изучение возможности глубокой бактериальной деструкции 2,4,6-тринитротолуола// Микробиология. 1988. - т.57, № 2. - С. 218-222.

8. Biologischer Abbau von TNT/ P.J. Umkefer, E. Margiotta, M. Stenger et al.// BlOforum.- 1992. v.15, № 5.- p.178.

9. Preuss A., Fimpel J., Diekert G. Anaerobic transformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT)// Arch. Microbiol. 1993. - 159, № 4. - p. 345-353.-116

10. О.Яковлев Г.Ю., Зарипова С.К. Метаболизм 2,4-дамино-6-нитротолуола// 5 Конф. Росс. Федерации "Нов. направления биотехнол.": Тез. докл. Пущино, 18-22 мая, 1992 г. с. 188.

11. Combined photocatalytic and fungal treatment for the destruction of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT)/ T.F. Hess, T.A. Lewis, R.L. Crawford et al.// Water Res. -1998. -v.32,N5.-p. 1481-1491.

12. Fernando T., Rumpus J.A., Aust S.D./ Biodégradation of TNT (2,4,6-trinitrotoluene) by Phanerochaete chrysosporium// Appl. and Enwiron. Microbiol.-1990. v. 56, N 6.- p. 1666-1671.

13. Isolation of bacteria and fungi from TNT-contaminated compost and preparation of C-14-ring labeled TNT/ J.W. Bennett, P. Hollrah, A. Waterhouse, K. Horvath// International biodeterioration & biodégradation. 1995. - v.35, N 4. - p. 421-430.

14. Removal of 2,4,6-trinitrotoluene and 2,4-dinitrotoluene by fungi (Ceratocystis coerulescens, Lentinus lepideus and Trichoderma harzianum)/ J. Samson, E. Langlois, J. Leiet al.// Biotechnol. Lett. 1998. - v.20, N 4. - p. 355-358.

15. Исследование процесса микробной деструкции полиароматических углеводородов в составе древесины/ Г.В. Козлов, А.В. Гарабаджиу, , и др.//Биотехнология. 1999. - № 4. - с. 63-67.1. В.Н.Соколов

16. Majcherczyk A. Johannes C. Huttermann A./ Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) by laccase of Trametes versicolor// Enzyme Microb. Technol. 1998. - v. 22, N 5. - p. 335-341.-117

17. Dunn N.W., Gunsalus I.C. Transmissible plasmida coding early enzumes of naphtalene oxidation in Pseudomonas putida // J. Bacteriol. 1973. - V. 114. - P. 974-979.

18. Stetzenbach L.D., Sinclair N.A. Degradation of antracene and pyrene by soil bacteria// "Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol., 1986. 86th Annu. Meet., Washington, D.C., 23-28 March, 1986" Washington. 1986. - p. 302.

19. Weissenfels W., Beyer M., Klein J. Bacterieller Abbau von Phenantren, Fluoren und Fluoranten// Forum Microbiol.- 1989.- v. 12, N 1-2.- p. 104.

20. Рейвн П., Эверт P., Айркхон С. Современная ботаника: Пер. с англ. М.: Мир, 1990. -348 с.

21. Silvio В. Untersuchungen zum biologischen Abbau teerolbelasteter Althollzer: Diplomarbeit/Fachhochschule Merseburg. Merseburg., 1996. - 119 c.

22. Справочник химика В 6-ти т. Т.2. Основные свойства неорганических и органических соединений/ 2-е изд. перераб. и доп. - M.-JL: Гос. Изд. Науч.-техн. химич. Лит., 1963. - 1168 с.

23. Гордон А., Форд Р. Спутник химика: Пер с англ. М.: Мир, 1976. - 542 с.

24. Вредные вещества в промышленности: Справочник: В 3 т. Т.1. Органические вещества/ Под. ред. A.B. Лазарева, Э.Н. Левиной. - Изд.7-е, перераб. и доп. - Л.: Химия, 1976. - 592 с.

25. Neumann H.G. Toxic equivalence factors, problems and limitations// Food Chem. Toxicol. 1996. - V. 34. - P. 1045-1051.

26. Some altered concentrations of elemente in semen of wokers exposed to trinitrotoluenes/ N.X. Liu, W.H. Qiun, G.R. Wang et al.// Occup. Environ. Med. -1995.-V. 52.-p. 842-845.

27. Fu P.P. Metabolic activation of nitropolycyclic aromatic hydrocarbons// Drug Metab. Rev. 1990. - v. 22. - P. 209-268.- 118

28. Донат Э., Лиснер А. Уголь и нефть: Пер с англ. Научн. Хим.-техн. изд-во, 1923. - 107 с.

29. Фенгел Д., Вегенер Г. Древесина (химия, ультраструктура, реакции): Пер. с англ. М.: Лесная пром-сть, 1988.-512 с.

30. Эринын П. П. Строение и свойства древесины как лигнокомпонентной полимерной системы// Химия древесины.-1977.-N 1.-С. 8-25.

31. Огарков В. И., Киселев О. М., Быков В. А. Биотехнологические направления использования растительного сырья// Биотехнология. 1985. - № 3.- С. 1-15.

32. Sricscen M., Larsson S., Miksche G.E. Gaschromatographische Analuse von Ligninoxydationsprodukten. VIII. Zur Struktur des Lignins der Fichte// Acta Chem. Scand. V. 27. - P. 903-914.

33. Yang H. H., Effland M. J., Kirk T. K. Factors influencing fundal degradation of lignin in a representative lignocellulosic thermomechanical pulp// Biotechnol. Bioeng. 1980. - V. 22, №1. P. 65-77.

34. Агабекян Э.Л. Влияние дисперсности соломы на целлюлолитическую активность гриба Asp. terreus 17 р// Микробиол. пром. 1982.- № 3.- С. 10-11.

35. Градова Н. Б., Касим-заде И. Э., Винаров А. Ю. Сравнительная оценка эффективности способов биоконверсии гребней винограда// Биотехнология. -1991.- №1.- С. 85-88.-119

36. Structural properties of cellulose and cellulase reaction mechanism/ S. B. Lee, I. H. Kim, D. D. Ryn, H. Taguchi// Biotechnol. Bioeng. 1983. - V. 25, №1. - P. 33-51.

37. Влияние механохимической обработки соломы на качество получаемых кормовых гранул/ Ю.Ю. Каткевич, А. Соммер, 3. Чернякова и др. // Химия древесины. 1990. - №5. - С. 72-78.

38. Guerin W.F., Boyd S.A. Maitenance and induction of naphtalene degradation activity in Pseudomonas putida and an Alcaligenes sp. under different culture conditions// Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61, N 11. - p. 4061-4068.

39. Ashok B.T., Saxena S., Musarrat J. Isolation and characterization of four polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria from soil near an oil refinery// Letters in Applied Microbiology. 1995. - v. 21, N 4. - p. 246-248.

40. Degradation of fluorene and fluorantene: Intermediatesand the metabolism of related compounds / W. Weissenteis, M. Beyer, J. Klein, H.J. Kenm// Forum Microbiol. 1990. - 13, № 1-2. - C. 79.

41. Катаболизм аценафтена штаммами Alcaligenes eutrophus и Alcaligenes pradoxus/ C.A. Селифонов, A.B. Слепенькин, B.M. Аданин, Г.М. Гречкина// Микробиология. 1993. - Т. 62, Вып. 1. - С. 120-128.

42. Суровцева Э.Г., Ивойлов B.C., Беляев С.С. Разрушение ароматической фракции нефти ассоциацией грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов// Микробиология. 1997. - Т. 66, № 1. - с. 78-83.

43. Two alternative pathways of fluorene biodégradation by an Arthrobacter sp./ Casellas M., Grifoll M., Bayona J.M., Scianas A.M.// 6th Int. Sump. Microbiol. Ecol.: Abstr. Barcelona, 1992 - p. 220.

44. Grifoll M., Casellas M., Bayona J.M. Isolation and characterization of a fluorene -degrading bacterium: Identification of ring oxidation and ring fission products// Appl. Environ. Microbiol. 1992. - v. 58, № 9. - p. 2910-2917.

45. Shen H., Pritchard P.H., Sewell G.W. Kinetics of chromate rediction during naphtalene degradation in a miched culture// Biotech. Bioeng. 1996. - v. 52, № 3. -p. 357-363.

46. Strandberg G.W., Abracham T.J., Frazier G.C. Phenantrene degradation by Beijerinckia sp. B8/36// Biotechnol. Bioeng. 1986. - v 28, №1. - p. 142-145.

47. Trenz S.P. Der mikrobielle Abbau von Fluoren als Modell fur Verbingen vom Diphenilenmethan: Diss. . Dokt. Naturwiss./ Univ. Stuttgart. Stuttgart, 1995. -119 p.

48. Trzesickamlynarz D., Ward O.P. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHS) by a mixed culture and ITS component pure cultures, obtained from PAH contaninated soil// Can. J. Microbiol. - 1995. - v. 41, N 6. - p. 470-476.

49. Mahro В., Rode K., Kasche V. Not selective precultivation of bacteria able to degrade different polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH)// Acta Biotechnologica. - 1995. - v. 15, N 4. - p. 337-345.

50. Characteristics of phenantrene degradating bacteria isolated from soils contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons/ M.D. Aitcen, W.T.-121

51. Stringfellow, R.D. Nagel et al.// Can. J. Microbiol. 1998. - v. 44, N 8. - p. 743752.

52. Biodégradation of C-14. Benzo<a>purene added in crude oil to uncontaminated soil/ R. Kanaly, R. Bartha, S. Folgel, M. Findlay// Appl. Environ. Microbiol. -1997 v. 63, N 11. -p. 4511-4515.

53. Bouchez M., Blanchet D., Vandecasteele J.P. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by pure strains and by defined strein associations inhibition phenomena and cometabolism// Appl. Microbiol. Biotechnol. -1995. - v. 43, N 1. -p. 156-164.

54. Andreas T. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the presense of syntetic surfactants// Appl. Environ. Microbiol.- 1994,- v. 60, №1. p. 258-263.

55. Sepic E., Bricelj M., Leskovsek H. Biodégradation studies of polyaromatic hydrocarbons in aqueous media// J. Appl. Microbiol. 1997. - v. 83, N 5. - p. 561568.

56. Pyrene degradation by Mycobacterium sp. strain KR2/ K. Recmann, H.P. Noll, E.W. Streinberg, A.A. Kettrup // Chemosphere. 1998. - v. 36, N 14. - p. 29772992.

57. Deanross D., Cerniglia C.E. Degradation of pyrene by Mycobacterium flavescens// Appl. Microbiol. Biotechnol. -1996. -v. 46, N 3. p. 307-312.

58. Eschenbach A., Wienberg R., Machro B. Fate and stability of nonextractable residues of C-14. PAH in contaminated soils under environmental stress conditions//Environ. Sci. Technol. -1998. v. 32, N 17. P. 2585-2590.- 122

59. Выделение и характеристика микроорганизмов деструкторов полициклических ароматических углеводородов/ И.Ф. Пунтус, А.Е. Филонов, И.А. Копелева и др.// Микробиология. - 1997. - т. 66, №2. - с. 269272.

60. Degradation of light highly condensed polycyclic aromatic hydrocarbons by Pleorotus sp. florida in soil wheat stran substrate/ M. Wolther, F. Zadrazil, R. Martens, M. Bahadiun// Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. -v. 48, N 3. - p. 398404.

61. Romero M.C., Cazau M.C., Giorgieri S., Arambarri A.M./ Phenantrene degradation by microorganisms isolated from a contaminated stream// Environ. Pollut. -1998. -v. 101, N3.-p. 355-359.

62. Biodegradation of naphtalene in montmorillonite/polyaryamide suspensions/ S. Magdaliniuk, J.C. Block, C. Leyval et al.// Water Sei. Technol. -1995. v. 31, N 1.- p.85-94.

63. Actions of a versatile fluorene degrading bacterial isolate on polycyclic aromatic compounds/ M. Grifoll, S.A Selifonov., C.V. Gatlin, P.J. Chapman// Appl. Environ. Microbiol. - 1995. - v. 61, N 10. - p. 3711-3723.

64. Juhasz A.L., Britz M.L., Stasnley G.A. Degradation offluorantene, pyrene, benza.antracene and dibenz[a,h]antracene by Burkholderia cepacia/ J. Appl. Microbiol. 1997. - v. 83, N 2. - p. 189-198.

65. Juhasz A.L., Britz M.L., Stanlly G.A. Degradation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons by Pseudomonas cepacia// Biotechnology Letters. 1996. - v. 18, N 5. - p. 577-582.

66. Juhasz A.L., Britz M.L., Stanley G.A. Degradation of benzoa.pyrene, dibenz[a,h] anthracene and coronene by Burkholderia cepacia// Water Sei. Technol. 1997. - v. 36, N 10. - p. 45-51.

67. Jochnesen K., Andersen S., Jacobsen C.S. Phenotypic and genotypic characterization of phenantrene degrading fluorescent Pseudomonas biovars// Appl. Environ. Microbiol. 1996. - v. 62, N 10. - p. 3818-3825.

68. Cenci G., Caldini G./ Catechol dioxygenase epression in a Pseudomonas fluorescens strein exposed to different aromatic compounds// Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 47, N 3. - p. 306-308.

69. The ability of an environmental isolate of Pseudomonas fluorescens to utilize chrysene and four-ring polynuclear aromatic hydrocarbons/ G. Caldini, G. Cenci, R. Manenti, G. Morozzi// Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - v. 44, N 1-2. -225-229.

70. Burd G., Ward O.P. Bacterial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons on agar plates the role of biosurfactants// Biotechnol. Techniques. -1996. - v. 10, N 5. - p. 371-374.

71. Пат. 5132224 США, МКИ5 С 12S 5/00; D 06М 16/00/. Biological remediation of creosote- and similary-contaminated sites/ J.G. Mueller, P.J. Chapman (США). -№ 371241; Заявл. 21.06.89; Опубл. 21.07.92; НКИ 435/262. 3 с.

72. Плазмиды биодеградации нафталина в ризосферных бактериях рода Pseudomonas/ B.B. Кочетков, B.B. Балакшина, Е.А. Мордухова, A.M. Воронин//Микробиология. 1997. - т. 66, №2. - с.211-216.

73. Cloning of the genes for and characterisation of the early stages of toluene and o-xylene catabolism in Pseudomonas stutzeri ОХ1/ G. Bertoni, F. Belognese, E. Galli, P. Barbieri// Appl. Environ. Microbiol. 1996. - v. 62, N 10. - p. 3704-3711.

74. Grimberg S.J., Stringfellow W.T., Aitken H.D. Quantifuing the biodégradation of phenantrene by Pseudomonas stutzeri P16 in the presence of a nonionic surfactant// Appl. Environ. Microbiol. 1996. - v. 62, N 7. - p. 2387-2392.

75. Tongpim S., Picard M.A. Growth of Rhodococcus SI on antracene// Can. J. Microbiol.- 1996.- 42, №3- p. 289-294.

76. Aromatic degrading Sphingomonas isolates from the deep subsurface/ J.K. Fredricson, D.L. Balkwill, G.R. Drake et al.// Appl. Environ. Microbiol. - 1995. V. 61, N5. - p. 1917-1922.

77. Degradation of polynuclear aromatic hudrocarbons by Sphingomonas paucimobilis/ D.Y. Ye, M.A. Siddigi, A.E. Maccubbin et al.// Environ. Sei. Technol. 1996. -v. 30, N 1. - p. 136-142.

78. Metabolism of the polycyclic aromatic hydrocarbon pyrene by Aspergillus niger SK9317/ T. Wunder, S. Kremer, O. Sterner, H. Anke// Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. - v. 42, N 4. - p. 636-614.

79. Colombo J.C., Cabello M., Arambarri A.M. Biodegradation of aliphatic and aromatic hydrocarbons by natural soil microflora and lignolitic fungi// Environ. Pollution 1996. - v. 494, N 3. - p. 355-362.

80. Biological elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons in solvent extracts of polluted soil by the white rot fungus, Bjerkandera sp. strein BOSS55/ J.A. Field, H. Baten, F. Boelsma, W.H. Rulkens// Environ. Technol. 1996. - v. 17, N 3. - p. 317-323.

81. The physiology of anthracene biodégradation by the white rot fungus Bjerkandera sp. strain BOS55 / M.J. Kotterman, E. Heessels, E. Dejong, J.A. Field// Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1994. - v. 42, N 1. - p. 179-186.

82. Transformation of chrysene and other polycyclic aromatic hydrocarbon mixtures by the fungus Cunninghamella elegans/ J.V. Pothyluri, A. Selby, F.E. Evans et al.// Can. J. of Botany-Revue Canadienne de Botanique. 1995. - v. 73, N 1. - p. 1025-1033.

83. Initiation oxidative and subsequent conjgative metabolites produced during the metabolism of phenantrene by fungi/ R.P. Casillas, S.A. Crow, T.M. Heince et al.// J. Ind. Microbiol. 1996. - v. 16, N 4. - p. 205-215.

84. Sack U., Fritsche W. Enhancement of pyrene mineralization in soil by wood-decaying fungi// Microbiol. Ecol. 1997. - v. 22, N 1. - p. 77-83.

85. Enzymatic combustion of aromatic and aliphatic compounds by manganese peroxidase from Nematoloma frowardii/ M. Hofrichter, K. Scheibner, I. Schneegass, W. Fritsche// Appl. Environ. Microbiol. 1998. - v. 64, N 2. - p. 399-404.

86. Kiehlmann E., Pinto L., Moore M. The biotransformation of chrysene to trans-l,2-dihydroxy-l,2-dihydrochrysene by filomentous fungi// Can. J. Microbiol.1996.-v. 42, N6.-p. 604-608.

87. Wischmann H., Steinhart H. The formation of PAH oxidation products in soils and soil/compost mixtures// Chemosphere. 1997. - v. 35, N 8. -p. 1681-1698.

88. Barclay C.D., Farquhar G.F., Legge R.L. Biodégradation and sorption of polyaromatic hydrocarbons by Phanerochaete crysosporium// Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - v. 42, N 6. - p. 958-963.

89. Eggen T., Majcherczyk A. Removal of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in contaminated soil by white rot fungus Pleurotus ostreatus// Int. Biodeterior. Biodegrad. 1998. -v. 41, N2. -p. 111-117.

90. Microsomal and cytosolic cytochrome p450 mediated benzoa.pyrene hydroxylation in Pleurotus pulmonarius/ S. Masaphy, D. Levanon, Y. Henis et al.// Biotechnology Letters. 1995. - v. 17, N 9. - p. 969-974.

91. Degradation phenantrene and hudraulic characteristics in a constructed wetland/ T. Machate, H. Noll, H. Behrens, A. Kettrup// Water research. 1997. - v. 31, N 3.-p. 554-560.

92. Johannes C., Majcherczyk A., Hutterman A. Degradation of antracene by laccase of Trametes versicolor in the presence of different mediator compounds// Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - v. 46, N 3. - p. 313-317.

93. Ruhl O. Microbiologische Verfaren zur Sanierung von Altlasten/kontaminierter Boden. Vorlesungsmaterial, Bad Lauchstadt. 1996.

94. Bamberger rearrangement during TNT metabolism by Clostridium acetobutylicum/ J.B. Hughes, C. Wang, K. Yesland et al.// Environ. Sei. Technol.- 1998.-v. 32, N4. p. 494-500.

95. Products of anaerobic 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) transformation by Clostridium bifermentans/ T.A. Lewis, S. Goszczynski, R.L. Crawford et al.// Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - p.4669-4674.-129

96. Moller К., Ahrens P. Comparison of toxicity neutralization-, elisa- and PCR test for typing of Clostridium perfringens and detection of the enterotoxin gene by PCR// Anaerobe. 1996. - v. 2, N 2. - p. 103-110.

97. Sembries S., Crawford R.L. Production of Clostridium bifermentans spores as inoculum for bioremediation of nitroaromatic contaminants// Appl. Environ. Microbiol. 1997. - v. 63, N 5. - p. 2100-2104.

98. Costa V., Boopathy R., Manning J. Isolation and characterization of sulfate-reducing bacterium that re mowed TNT (2,4,6-trinitrotoluene) under sulfate- and nitrate- reducing conditions// Bioresource Technol. 1996. - v. 56, N 2-3. - p. 273-278.

99. Bopathy R., Manning J.F. Characterization of partial anaerobic metabolic pathway for 2,4,6-trinitrotoluene degr adation by a sylfate reducing bacterial consortium// Can. J. Microbiol. - 1996. V. 42, N 12. - p. 1203-1208.

100. French C.E., Nickiin S., Bruce N.C. Aerobic degradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Enterobacter cloacae PB2 and by pentaerythritol tetranitrate reductase// Appl. Environ. Microbiol. 1998. - v. 64, N 8. - p. 2864-2868.

101. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола лактобациллами с образованием токсичных гидроксиламино- производных/ A.B. Наумов, Е.С. Суворова, A.M. Воронин и др.// Микробиология. 1999. - т. 68, №1, - с.56-62.

102. Vanderberg L.A., Perry J.J., Unkefer P.J. Catabolism of 2,4,6-trinitrotoluene by Mycobacterium vacceae// Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - v. 43, N 5. - p. 937-945.

103. Haidour A., Ramos J.L. Identification of products resulting from the biological reduction of 2,4,6-trinitrotoluene, 2,4-dinitrotoluene, and of 2,6-dinitrotoluene by Pseudomonas sp.// Environ. Sei. Technol. V. 30, N 7. - p. 2365-2370.

104. Fiorella P.D., Spain J.C. Transformation of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas pseudoalcaligenes JS52// Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - p.2007-2015.

105. Denitration of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas savastanoi/ J.L. Martin, S.D. Comfort, P.J. Sheaet al.// Can. J. Microbiol. 1997. - V. 43, N 5. - p. 447-455.

106. Degradation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) in aerobic reactor/ S.L. Colline, K.C. Dennelly, B.H. Bae et al.// Chemosphere. 1995. - v. 31, N 4. - p. 3025-3032,

107. Degradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Serratia marcescens/ S. Montpas, J. Samson, E. Langlois et al.// Biotechnol. Lett. 1997. - v. 19, N 3. - p. 291-294.

108. Screening for fungi intensively mineralizing 2,4,6-trinitrotoluene/ E. Scheibner, M. Hofrichter, A. Herre et al.// Appl. Microbiol. Biotechnol. -1997. v. 47, N 4. -p. 452-457.

109. Utility of four streins of white-rot fungi for the detoxification of 2,4,6-trinitrotoluene in liquid culture/ K.C. Donnelly, J.C. Chen, H.J. Huebner et al.// Environ. Toxicol. Chemestry. 1997. - v. 16, N 6. - p. 1105-1110.

110. Biodegradation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by the write-rot basidiomycete Phlebia radiata/ B. Vanacen, K. Skubisz, H. Naveau, S.N. Agathos// Biotechnol. Lett. 1997. - v. 19, N 8. - p. 813-817.

111. Эсилашвили В.И. Физиологическая регуляция лигнолитической активности высших базидиальных грибов// Микробиология. 1993. - Т.62, N 5. - с. 801815.

112. Collins P.J., Dobson A.W. Extracellular lignin and manganese peroxidase production by the white-rot fungus Coriolus versicolor 290// Biotechnol. Lett. -1995.-v. 17, N9.-p. 989-992.

113. Vares Т., Nimenmaa O., Hatakka A. Sekretion of ligninolytic enzymes and mineralization of C-14-ring-labellet syntetic lignin by three Phlebia tremillosa streins// Appl. Environ. Microbiol. 1994. - v. 60, N 2. - p. 569-575.

114. Mester Т., Dejong E., Field J.A. Manganese regulation of veratril alcohol in white rot fungi and its indirect effect on lignin peroxidase// Appl. Environ. Microbiol. -1995.-v. 61, N5.-p. 1881-1887.

115. Sayadi S., Ellouz R. Roles of ligninperoxidase and manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium in the decolorization of olive mill wastewaters// Appl. Environ. Microbiol. 1995. - v. 61, N 3. - p. 1098-1103.- 132

116. Мп-Зависимая пероксидаза и оксидаза Panus tigrinus 8/18: очистка и свойства/ А.А. Леонтьевский, Н.М. Мясоедова, О.В. Мальцева и др.// Биохимия. 1990. т. 55, N 10. - с. 1841-1846.

117. Мп-Зависимая пероксидаза из Pleurotus ostreatus: выделение, очистка и некоторые свойства/ Е.Г. Беккер, Д.О. Пирцхалаишвили, В.И. Элисашвили, А.П. Синицын // Биохимия. 1992. - т. 57, вып. 8. - с. 1248-1254.

118. В.И. Элисашвили, M.K. Гошадзе, А.Б. Циоменко И.А. Очистка и свойства лакказы базидиального гриба С. versicolor// Прикл. биохимия и микробиология. 1992. - Т. 28. - с. 512-518.

119. Методы селекции продуцентов антибиотиков и ферментов/ Р.А. Жукова, А.Д. Коммунарская, М.И. Прошина и др. Л.: Медицина, 1978. - 160 с.

120. Трансформация костры льна в белок мицеллиальными грибами/ В.Г. Бабицкая, И.В. Стахеев, В.В. Щерба и др.// Микол. и фитопатол. -1986. Т. 20, № 2. - с.113-119.

121. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. 2-е Изд. - Киев: Наук. Думка, 1973. - 592 с.

122. Зависимость величины индуцированного 2.А fS-r^,»тринитротолуоломмутагенеза от физиологического состояния тестерных Штамп*1. Мов Salmonellatyphimurium/ О.Н. Ильинская, О.Б. Иванченко, Ы.С. Карамова и др.//одственныхаи,

123. Микробиология. 1996. - Т. 65, № 1. - с. 84-88.

124. Лурье Ю.Ю., Рыбникова А.И. Химический анализ про из в сточных вод. 4-е изд. -М.: Химия, 1974. - 335 с.

125. Методы экспериментальной микологии: Справочник/ Под. Рел r> т• f д. «.й.Бид

126. Киев: Наук. Думка, 1982.-550 с.

127. Nodule formation in поп nodulating soybean lines in resno«cponse to 2,4-Dtreament/ S. Akao, B. Perigio, J.R. Francisco et. al.// Int. Sum« xT1. UP- Щпг(

128. Fixation: Abstr. Sandong, 1993. - p. 110-122.

129. Билай Т.И. Термофильные грибы и их ферментативные свойства Наук, думка, 1985. 172 с.

130. Волчек Е.А. Изучение биоконверсии целлюлозосодержащих1. Уостратовмикромицетами рода Aspergillus: Дис. . канд. биол. наук/ лти Ленсовета. Л., 1989. - 181 с.rogen1. Киев:йм.

131. Бондарцев A.C. Трутовые грибы европейской части СССР и Кавказа М jj Изд-во. АН СССР, 1953. 684 с.

132. Юинг Г. Инструментальные методы химического анализа: Пер. с англ Мир, 1989. 608 с.

133. Клейн P.M., Клейн Д.Т. Методы исследования растений: Пер с англ jyj Колос, 1974 - 528 с.

134. Борйсов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по медецинской микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учеб. пособие. М.: Медицина, 1993. - 240 с.- 134

135. Васильева Е.К. Клиническая биохимия сельскохозяйственных животных. -М.: Рос. сельхоз. из дат., 1974. -192 с.

136. Никитин В.Н. Атлас клеток крови сельскохозяйственных и лабораторных животных. М.: Колос, 1949. - 296 с.

137. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. Пособие для биол. спец. ВУЗов. 4-е изд. - М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.

138. Dictionary of the Fungi/ D.L. Hawksworth, P.M. Kirk, B.C. Sutton, D.N. Pegler. -Cambridge: Eighth Edition. International Mycological Institute, 1995. 616 p.

139. Concey B.J., Dixon D.G., Greenberg B.M. A preliminary toxicity assessment of photodegradation products of polycyclic aromatic hydrocarbons// 37 th. Conf. Int. Assoc. Great Laces Res. and Estuarine Res. Fed.: Abstr. Windsor, 1994. - p. 116.

140. Билай В.И., Пидопличко H.M. Токсинообразующие микроскопические грибы. Киев: Наук, думка, 1970. -286 с.

141. Пшеницы мира/ Под. ред. В.Ф. Дорофеева. -2-е изд., перераб. и доп. JL: Агропрмиздат, 1987. - 560 с.