Влияние модификации лигноцеллюлозного субстрата на рост и развитие ксилотрофных базидиомицетов

Лыков, Юрий Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние модификации лигноцеллюлозного субстрата на рост и развитие ксилотрофных базидиомицетов
ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Влияние модификации лигноцеллюлозного субстрата на рост и развитие ксилотрофных базидиомицетов"

-т

На правах рукописи

404ои1- ■

Лыков Юрий Сергеевич

Влияние модификации лигноцеллюлозного субстрата на рост и развитие ксилотрофных базидиомицетов

Специальность 03.02.12 - микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о 3 ОЕе 2011

Москва-2011

4843621

Диссертационная работа выполнена в лаборатории биохимии кафедры биологии животных и ветеринарии ФГОУ ВПО «Пензенская ГСХА» и в Региональном Центре государственного экологического контроля и мониторинга по Пензенской области ФГУ «ГосНИИЭНП», г. Пенза

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Ильина Галина Викторовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Громовых Татьяна Ильинична кандидат биологических наук Сафрай Алла Иосифовна Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН» (г. Саратов)

Защита состоится 11 февраля 2011 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1, тел./факс: (495) 939-39-70

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Автореферат диссертации размещен на сайте www.bio.msu.ru Автореферат разослан « $ » января 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Традиционно в культуре выращивается множество видов ксилотрофных базидиомицетов. В последние десятилетия все больше внимания обращает на себя группа грибов-ксилотрофов, обладающих лечебно-профилактическими свойствами. Исследования, проводящиеся в этом направлении, позволили установить наличие лечебных свойств у значительного числа видов. Перечень медицинских грибов постоянно растет, поскольку те или иные ценные свойства выявляются у новых видов. Кроме того, большое внимание уделяется изучению возможностей использования ферментных комплексов ксилотрофных базидиомицетов. Высокий окислительный потенциал и неспецифический характер ферментов лигнолитического действия позволяют использовать их для разрушения органических ксенобиотиков, очистки сточных вод, получения модифицированной древесины (Кадималиев и др., 2006; Горбатова и др., 2007; Королева, 2007). Естественные местообитания в своем разнообразии представляют собой богатый природный резерват штаммов и видов, способных обладать уникальными индивидуальными особенностями. Это свидетельствует о необходимости мониторинга видового разнообразия ксилотрофных базидиомицетов в различных регионах и изучения их экологии. Большой интерес представляет влияние на ход развития гриба со стороны его природного субстрата. По мнению ряда авторов, лигнин, как компонент этого субстрата, может влиять на морфогенез культуры в естественных условиях (Фенгел, 1988). Довольно сложно создать условия, приближенные к природным, при выращивании видов и штаммов в культуре. В то же время одной из проблем практического грибоводства является поиск оптимальных субстратов для культивирования, способных обеспечить максимальную реализацию природного потенциала вида в условиях культуры. Использование доступных древесных субстратов (опилок) не всегда обеспечивает нормальное развитие культуры и ее высокую продуктивность. Кроме того, известно, что ксилотрофные базидиомицеты различаются по отношению к степени деструкции древесины, которую колонизируют (облигат-ные и факультативные паразиты, сапротрофы). В связи с этим актуальным представляется поиск путей подготовки субстрата для культивирования, с тем, чтобы оптимизировать развитие культур не только традиционных, но и вновь вводимых в искусственную культуру видов.

Цель и задачи исследований. Целью работы было изучение влияния модификаций лигноцеллюлозного субстрата на процессы роста и развития видов ксилотрофных базидиомицетов в чистой культуре.

Для достижения цели предполагалось решение следующих задач:

1. создать коллекцию видов ксилотрофных базидиомицетов, распространенных в районе исследований и отличающихся субстратной специализацией;

2. изучить культуралыю-морфологические особенности развития видов на традиционных питательных средах;

3. изучить возможности культивирования и особенности развития видов ксилотрофных базидиомицетов с различной субстратной специализацией в природе, а также вызывающих разные типы гнилей древесины, на экстрагированных опилках и их метоксилированных дериватах;

4. изучить влияние внесения в различные питательные среды различных по структуре источников целлюлозы и лигнина (нативных экстрагированных опилок и их метоксилированных дериватов) на процессы роста и развития культур;

5. определить роль нативного и дериватизированного лигнина, как компонентов субстратов, в регуляции плодоношения у перспективных в биотехнологии видов.

Научная новизна. Определено, что субстратная приуроченность ксилотроф-ных базидиомицетов к древесине разной степени разложения определяет особенности их развития в чистой культуре. Впервые обнаружены возможности культивирования видов, независимо от их субстратной специфичности в природе, на субстратах, содержащих экстрагированные метоксилированные лигноцеллюлозные компоненты. Установлено стимулирующее влияние метоксильных групп лигнина на процесс синтеза эргостерина и плодоношение в культуре у грибов белой гнили.

Практическая значимость. Установлена целесообразность использования метаиолизных (обогащенных мегоксильными группами) лигноцеллюлозных источников в качестве компонентов питательных сред для культивирования ксило-трофных базидиомицетов. Предложены рецептуры питательных сред для выращивания биомассы мицелия, а также твердых органических субстратов для получения плодовых тел Ganoderma lucidum.

Положения, выносимые на защиту:

1. Процессы экстрагирования и метанолиза материала дубовых опилок обеспечивают получение линоцеллюлозного субстрата, пригодного для культивирования ex situ видов ксилотрофных базидиомицетов независимо от их субстратной специфичности в природе.

2. Введение нативных и метоксилированных лигноцеллюлозных источников в рецептуру питательных сред интенсифицирует обменные процессы и стимулирует развитие культур ксилотрофных базидиомицетов.

3. Метоксильные группы лигнина стимулируют накопление биомассы мицелия большинства видов ксилотрофных базидиомицетов, а также интенсифицируют процесс синтеза эргостерина у грибов белой гнили.

4. Включение в состав субстратов метоксилированных лигноцеллюлозных компонентов стимулирует процессы образования примордиев (зачатков плодовых тел) у грибов белой гнили, а также способствует плодоношению при реализации интенсивной технологии культивирования.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Мониторинг природных экосистем» (Пенза, 2008); Научно-практической конференции «Образование, наука, практика: инновационный аспект» (Пенза, 2008); Научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные идеи молодых исследователей для агропромышленного комплекса России» (Пенза, 2009); II Междисциплинарном Микологическом форуме (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 - в печатных изданиях перечня ВАК РФ, 1 работа находится в Центральной печати.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно спланированы и осуществлены полевые и лабораторные исследования, проведены статистическая обработка и интерпретация данных, полученных в ходе выполнения работы.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 152 источника, и приложений, содержащих материалы статистической обработки. Текст изложен на 157 страницах. Основная часть работы содержит 12 таблиц и 52 иллюстрации (диаграммы, рисунки, фотографии).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава состоит из трех разделов. В первом разделе анализируются существующие взгляды относительно экологического статуса ксилотрофных базидиомицетов (Бондар-цев, 1953; Степанова, Мухин, 1979; Мухин, 1985; Бурова, 1986; Стороженко и др., 1992; Мухин, 1993; Бондарцева, 2000). Рассматривается роль организмов этой группы в природных экосистемах, факторы, определяющие трофическую структуру ксилотрофного микоценоза (Мухин, 1993; Сафонов, 2003). Обсуждаются проблемы субстратной приуроченности к древесине различных пород и сукцессионной динамики видов на разных стадиях разложения древесины (Гордиенко, 1979; Стороженко, 2002). Рассматриваются дискуссионные вопросы, связанные с трофическими стратегиями отдельных видов (Синадский, 1977; Гарибова, 2005). Во втором разделе описана структура и свойства древесных субстратов, используемых грибами в природе, рассматривается структура, свойства и специфические особенности молекул лигнина (Фенгел, 1988; Дудкин, 1991; Азаров, 1999). Приводится описание хода биодеградации лигнина ксилотрофными базидиомицетами (Umezawa, Higuchi, 1988; Akamatzu, 1990; Leonowicz et al., 1991; Gold, Alie, 1993), указывается на приоритетную утилизацию метоксильных групп в ходе этого процесса (Фенгел, 1988). Описаны процессы деструкции древесины грибами различных типов гнилей, с учетом особенностей их ферментативных комплексов (Kirk at al., 1986; Rayner, Boddy, 1988; Boominathan, Reddy, 1992 Blanchette, 1995; Решетникова, 1997; Королёва, 2006; Ребриков, 2006 Айзенштадг, 2009). Третий раздел посвящен анализу трофических потребностей ксилотрофных базидиомицетов в чистой культуре. Описаны традиционные и оригинальные подходы к выбору субстрата в зависимости от цели культивирования (Беккер, 1988; Бухало, 1988; Краснопольская, 2001; Горшина, 2008; Ковалёва, 2007; Древаль, Бойко, 2009; Антоненко и др., 2009; Обрезкова и др., 2010; Шахсеванимуджарад и др., 2010).

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в течение 4-х лет (2006-2010 гг.) на базе биохимической лаборатории Пензенской государственной сельскохозяйственной академии и Центральной экоаналитической лаборатории Регионального центра государственного экологического контроля и мониторинга по Пензенской области. Исследования включали несколько этапов, в том числе полевые (сбор, определение, наблюдения в природе) и лабораторные: выделение чистых культур и весь комплекс исследований для решения поставленных задач.

Объектами исследования послужили 10 видов дереворазрушаюцщх грибов, из числа широко распространенных на территории Пензенской области: Inonotus obliquus (Pers.: Fr.) Pilât (трутовик скошенный), Phellittus tremulae (Bondartsev) Bondartsev & P.N. Borisov (ложнотрутовик осиновый), Fomitopsis pinícola (Sw.) P. Karst, (трутовик окаймленный), Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill (трутовик серно-желтый), Ganoderma ap-planatum (Pers.) Pat (трутовик плоский), Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst (трутовик лакированный), Fomes fomentarius (L.) J.J. Kickx (трутовик настоящий), Heterobasidion annosum (Fr.) Bref, (корневая губка) Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) Р. КагеЦтрутовик киноварно-красный), Fistulina hepático (Schaeff.) Sibth (трутовик печёночный). В эксперименты включено по три штамма каждого вида. Определение базидиом проводили с помощью определителей (Бондарцева, Пармасто, 1986), сбор и последующее выделение чистых культур проводили по общепринятым методикам (Бухало, 1988). При определении трофической специализации изученных видов грибов использовали взгляды

ряда учёных (Боцдарцев, 1953; Бовдарцева, 1986; Стороженко, 2002, 2007), а так же личные наблюдения автора в районе исследований. При определении степени разложения древесных субстратов использовали пятибалльную шкалу (Гордиенко, 1979). Описание колоний проводили при культивировании на сусло-агаре при температуре +26 С (Stalpers, 1978), определяли средние скорости роста линейным методом (Билай, 1982) и ростовой коэффициент (Бухало, 1988). Культуры грибов, культивируемые в чашках Петри, инкубировали в термостате при +24 -+26°С. Культивирование в глубинных условиях осуществлялось в колбах Эрленмейера на эксцентриковой качалке при скорости вращения 225 обУмин с эксцентриситетом 2,5 см, и температуре +24 -+26°С.

Дубовые опилки, используемые в опыте, были подвергнуты экстракции в аппарате Сокслета спирто-толуольной смесью и диэтиловым эфиром в течение 8 часов (Оболенская, 1991), затем высушивались до постоянной массы на водяной бане с прямым холодильником. В дальнейшем половина этого материала была подвергнута процессу метанолиза, то есть обработке 0,3 % раствором НС1 в метаноле при нормальных условиях в течение 4 суток. Эта процедура позволяет увеличить число доступных метоксильных (-ОСН3) групп в молекуле лигнина, а также повысить содержание всевозможных мономерных, димерных и олигомерных производных фенолов, которые могут образоваться посредством разрыва эфирных связей в молекуле лигнина (Закис, 1987). Определение содержания метоксильных групп в субстратах осуществлялось методом Цейзеля в модификации с применением газо-жидкостной хроматографии (Закис, 1987). Использован газовый хроматограф «Varían CP 3800» с пламенно-ионизационным детектором, оснащённый капиллярной колонкой CP-Wax 52 СВ (полиэтиленгликоль). В части исследований в условиях глубинного культивирования использовали экстракты (перколяты) модельных соединений лигнина, полученных из нативных (не подвергнутых меганолизу) и метанолизных опилок (Трутников, 1973; Фенгел, 1988; Оболенская, 1991; Боголицин, 1994).

Общую оксидазную и общую пероксидазную активность определяли спектро-фотометрически. О целлюлазной активности судили косвенно по осахариванию экстрагированных нативных и метанолизных опилок, определяя концентрацию глюкозы глюкозооксидазным методом и по убыли холоцеллюлозы (сумма целлюлозы и геми-целлюлозы) в субстратах в конце периода культивирования.

Определение содержания целлобиозы в культуральной жидкости и эргостерина в мицелии грибов осуществлялось методом газо-жидкостной хроматографии (Гёрёг, 1985) на хроматографе «Кристалл-2000 М» с пламенно-ионизационным детектором, оснащённым набивной колонкой с насадкой - 5% SE-30 на инертоне с использованием соответствующих стандартов фирмы «Merck».

Активность дегидрогеназ определяли с помощью гистохимической методики, основанной на индикаторных свойствах нитросинего тетразолия (Барыкина и др., 2000). Выгонка плодовых тел проводилась по общепринятым методикам при интенсивном способе культивировании на твердых органических субстратах.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью компьютерной программы для обработки и анализа статистических данных «Statistica 6.0». Для оценки достоверности влияния структуры и состава субстратов на определяемые параметры проводился дисперсионный анализ полученного массива данных (ANOVA), использовался t-критерий Стьюдента при уровне значимости 0,95 (Хала-фян, 2007). В ходе работы велась фотодокументация.

3 ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ВИДОВ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ В УСЛОВИЯХ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ

3.1 Культурально-морфологические особенности исследованных видов

Были изучены морфолого-культуральные особенности видов и штаммов. Установлено высокое разнообразие этих показателей, причем выявлена тенденция связи между широтой субстратной приуроченности вида в природе и разнообразием культурально-морфологических характеристик в условиях чистой культуры.

Виды-эвритрофы, встречающиеся в природе на древесине разных пород и разной степени разложения, имеют внутривидовые отличия в скоростях роста, макро- и микроскопических особенностях мицелия. Виды-стенотрофы более однообразны в культуре. Однако для установления более четких закономерностей потребуется исследование значительно большего числа штаммов в пределах каждого вида.

3.2 Особенности развития штаммов с различными трофическими стратегиями на традиционных питательных средах

Проведенное сравнение средних скоростей роста и ростовых коэффициентов видов с различными трофическими стратегиями в природе на разных средах (КГА, сусло-агар) выявило отличия между облигатными паразитами, факультативными паразитами и факультативными сапротрофами (рис. 1). Так, средние скорости роста видов факультативных паразитов на сусло-агаре выше, чем обли-гатных, почти в 3,5 раза (Р=0,0001), а факультативных сапротрофов — в 2,5 раза (Р=0,001). Следует отметить, что визуально заметное сравнительно более интенсивное развитие факультативных паразитов по сравнению с факультативными сапротрофами может объясняться большей долей аминного азота, наличием доступных Сахаров (мальтозы) и присутствием витаминов группы В в сусло-агаре. Выявлены отличия в динамике развития мицелия разных видов на указанных средах (рис. 2). Установлено, что более растянутая во времени фаза адаптации характерна для видов с паразитической стратегией в природе на картофельно-глюкозном агаре.

я 8 н

о £ 6 а о о ъ

8 I 4 и а х

<Л <Н7 <ГС

Трофически; арвтеши вносе

СП <И"1 <ю

Тртф^чззае стршели видзв

□ САИКГА

□ саёкга

Рис. 1 - Средние значения скоростей роста (слева) и ростовых коэффициентов

(РК, справа) у видов ксилотрофных базидиомицетов разных трофических стратегий на разных агаризованных средах. Условные обозначения: ОП - облигатные паразиты; ФП - факультативные паразиты; ФС - факультативные сапротрофы

2 Э 4 5 6 7 С^тки роста

Ожрпа ' К1 исммН>5 Н апнщ 1шш11»1 Т.^пх^пкмбрЗ

I . Ызрелка, ияамиВ>5

НаноБицшямНп-! Е рпхЛа, иажмРркЗ

Рис. 2 — Динамика скоростей роста мицелия видов ксилотрофных базидиомице-тов - представителей разных трофических стратегий на разных средах (слева — сусло-агар, справа - картофельно-глкжозный агар, 26°С)

На основании полученных данных можно прийти к выводу о нецелесообразности использования крахмалистых питательных сред для культур паразитических видов, и, напротив, сапротрофы лучше развиваются на средах, содержащих «пролонгированные» источники Сахаров.

4 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСНЫХ ИСТОЧНИКОВ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И ЛИГНИНА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ШТАММОВ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ

4.1 Влияние различных по структуре комплексных источников целлюлозы и лигнина на рост и развитие мицелия ксилотрофных базидиомицетов

В ходе исследований проведено изучение особенностей развития мицели-альных культур изученных видов на субстратах из экстрагированных дубовых опилок, содержащих одинаковое количество целлюлозы, но формы лигнина с разной степенью конденсации молекулы (нативные и метанолизные опилки). Содержание метоксильных групп в нативных опилках составляло 18,9 мг/г материала или 0,61 мМ/г; содержание метоксильных групп в опилках, подвергшихся метанолизу, было более, чем вдвое выше и составляло 41,6 мг/г (1,32 мМ/г). Содержание холоцеллюлозы в образцах опилок было приблизительно на одном уровне и составляло от 78,7 до 81,6%.

Культуры всех изученных видов, независимо от субстратной специфичности и типа гнили развивались на опилочных субстратах. Даже виды, никогда не встречающиеся в природе на древесине дуба, росли и развивались на материале опилок. Этот факт мы объясняем результатом глубокого экстрагирования, которое позволило «обезличить» материал. Рост культур по сравнению с развитием на агаризованных средах был замедлен.

Мицелий, растущий на метанолизных опилках, характеризовался большей плотностью и лучше развитым воздушным мицелием, хотя темпы роста чаще были ниже, чем в альтернативном варианте (табл. 1).

Таблица 1 - Средние скорости роста мицелия штаммов изученных видов на стерильных дубовых опилках (мм/сут, 26°С, повторность трехкратная)

Вид, штамм Штаммы Особенности субстрата

Нативные опилки Метанолизные опилки

I. obliquus IO-l 3,7±0,3* 1,5±0,1

IO-2 3,6±0,4 1,5±0,2

10-3 3,5±0,3 1,7±0,1

Ph. íremulae Pht-1 3,5±0,5 0,8±0,2

Pht-2 3,5±0,6 1,1±0,3

Pht-3 3,1±0,6 1,9±0,2

F. pinícola Fpi-1 1,5±0,3 2,5±0,5

Fpi-2 1,2±0,3 2,3±0,5

Fpi-3 1,8±0,4 2,1±0,4

L. sulphureus PD-99 2,б±0,3 2,8±0,4

PD-01 2,7±0,3 2,5±0,4

Ah-02 2,5±0,4 2,6±0,3

G. applanatum G-l 1,8±03 5,2±0,8

G-2 1,7±0,5 3,4±0,7

G-3 1,5±0,3 6,6±0,9

G.lucidum Gl-1 0,6±0,2 2,8±0,6

Gl-3 0,7±0,2 2,6±0,5

Gl-6 0,4±0,1 3,0±0,6

F.fomentarius AH-96 5,2±0,5 5,0±1,3

Nic-02 5,7±0,6 5,3±0,5

Lp-05 5,3 ±0,5 4,9±0,7

P.cinnabarinus PyC-1 3,9±0,4 3,7±0,5

PyC-2 4,0±0,4 3,8±0,б

PyC-4 4,1±0,4 3,5±0,4

H. annosum Han-1 2,6±0,3 1,9±0,3

Han-2 2,5±0,4 2,1±0,3

Han-3 2,8±0,4 1,9±0,3

F. hepático Fh-1 5,2±0,7 3,6±0,6

Fh-la 4,8±1,1 2,9±0,3

Fh-5 4,3±0,7 3,1±0,4

♦жирным показаны достоверные отличия, Р<0,05.

Исключение составили два изученных вида: Ь. т1р1тге№ и Р.с'тпаЬаппиз. У них, напротив, формировался более густой мицелий на нативных опилках и более тонкий - на метанолизных. Низкие скорости роста на метанолизном субстрате можно объяснить относительно более высоким содержанием фенольных соединений.

Установлено, что активнее осваивают метанолизный субстрат представители видов, чаще встречающихся в природе на древесине высокой степени разложения, причем вне зависимости от типа вызываемой гнили (рис.3).

Э Нативные опилки в Метанолизные опилки

Рис. 3 - Средние скорости роста видов ксилотрофных базидиомицетов на различных субстратах (среднее по трем штаммам каждого вида)

Это достоверно отмечено для F. pinícola, G. applanatum, G. lucidum. Вероятно, эти виды эволюционно адаптированы к эффективному использованию обилия метоксиль-ных групп в значительной степени разрушенной древесины. L. sulphureus, F. fomen-tarius, F. hepático, I. obliquus, чаще встречающиеся на живых деревьях, Ph. tremulae, Н. annosum - только на живых, древесина которых содержит относительно низкие концентрации мегоксильных групп, лучше развиваются на нативных опилках.

4.2 Активность некоторых ферментов ксилотрофных базидиомицетов при твердофазном культивировании

Интерес представляло сравнение ферментативной активности культур при их развитии на экстрагированных опилках и их меганолизных дериватах, для чего на 13-16 сутки роста проведено ее определение.

У F. pinícola, G. applanatum, G.lucidum, т.е. видов с широкой трофической специализацией, общая оксидазная активность выше на метанолизном субстрате, чем на нативном (табл. 2). Однако на меганолизных опилках снижается общая оксидазная активность у Ph. tremulae, Н. annosum и F. hepatica. Это, вероятно, определяется воздействием фенольных компонентов субстрата и может быть связано с приуроченностью видов к живым деревьям, древесина которых на начальных этапах колонизации имеет, небольшое, по сравнению с фаутной, содержание мономерных фенольных структур.

Пероксидазная активность, как выяснилось, является индивидуальной особенностью видов, поскольку ее уровни на изученных субстратах у разных культур не поддаются систематизации. На метанолизном субстрате у изученных грибов белой гнили отмечаются более высокие показатели, чем на нативных. Все возбудители бурой гнили, а также некоторые представители белой при культивировании как на нативных, так и на метанолизных опилках показали относительно низкую активность пероксидаз.

О целлюлазной активности судили по утилизации холоцеллюлозы в материале опилок и по концентрации глюкозы в вытяжке из субстрата. Практически

для всех культур, независимо от типа гнили и субстратной специфичности в природе, характерна более высокая целлюлазная активность на метанолизном материале. Согласно литературным данным, отдельные фенольные компоненты лигнина способны индуцировать выработку целлюлазных ферментов некоторых грибов (Muller, 1988). Наши результаты подтверждают это положение.

Таблица 2 - Общая оксидазная, проксидазная и целлюлазная активность мицелия _изученных видов на нзтивных (Н) и метанолизных (М) опилках_

Вид, штамм Ферментативная активность

Общая оксидазная, ед.оп.пл.* 100/г*сек Общая пероксидазная, ед.оп.пл. *100/г*сек Убыль холоцеллюлозы, %

Н м Н М Н М

1. obliquus, IO-3 0,65±0,13 3,6 (±0,12 0,53+0,11 5,8+1,16 8,3+1,66 18,3+3,66

Ph. tremulae, Pht-3 0,24+0,05* 0,11+0,02 2,64+0,53 1,12+0,22 1,7+0,34 3,6+0,72

F. pinícola, Fpi-3 0,09+0,02 9,33+0,071 0,26+0,05 0,00 14,1+2,82 20,3+4,06

L. sulphureus, Ah-02 0,11±0,02 0,00 0,13+0,03 0,00 13,7+2,74 17,6+3,52

G. applanatum, G-3 0,09±0,02 0,19+0,04 1,75+0,35 4+0,80 7,8+1,56 18,2+3,64

G. lucidum, Gl-6 0,38+0,08 0,58+0,12 2,06+0,41 5,9+1,18 8,1+1,62 19,6+3,92

F. fomentarius, Lp-05 0,15±0,03 0,27+0,05 1,8+0,36 2,9+0,58 5,9+1,18 9,6+1,92

P. cinnabarinus, PyC-4 0,62±0Д2 р,51+0,10 0,53+0,11 0,00 6,9+1,38 14,6+2,92

H. annosum, Han-3 0,31 ±0,06 0,13+0,03 0,45+0,09 0,00 10,3+2,06 17,5+3,5

F. hepático, Fh-5 0,32+0,06 0,19+0,04 0,47+0,09 0,00 15,9+3,18 16,5+3,3

*жирным отмечены достоверные отличия (р<0,05)

4.3 Влияние внесения источников целлюлозы и лигнина в агаризованные среды на рост и развитие культур ксилотрофных базидиомицетов

Интерес представляло изучение влияния добавления лигноцеллюлозных материалов в состав традиционных сред. При этом создается «эффект разбавления», элиминирующий токсическое действие избытка метоксильных групп и олиго-мерных соединений лигнина, устраняются такие лимитирующие развитие факторы как дефицит легкодоступных Сахаров и влаги. Для оценки влияния изученных факторов на развитие того или иного вида был произведен расчет коэффициентов отзывчивости, то есть отношений средних по штаммам показателей скоростей роста на экспериментальных средах к средним скоростям роста в контроле. Обнаружено, что лигноцеллюлозные источники, добавленные в низких концентрациях (2% от массы) к агаризованным средам, стимулируют развитие большинства изученных видов (рис. 4).

На видовом уровне прослеживается разная степень стимуляции развития мицелия путем добавления к питательному субстрату источников целлюлозы и лигнина. Причем заметно, что в целях интенсификации роста культур целесообразно использование именно метанолизных опилок. Несомненен факт включения составляющих компонентов добавок в метаболизм культур, а «рыхлое» состояние молекул в метанолизном источнике целлюлозы и лигнина делает его более доступным для ферментативных систем гриба. Отдельного внимания заслуживает факт оптимизации роста видов-паразитов, обычно слабо развивающихся в культуре, посредством обогащения питательной среды лигноцеллюлозными компонентами в низких концентрациях.

Виды

1^—Натавные опилки сгиМетанолизные опилки-К0 = 1~|

Рис. 4 - Сравнение значений коэффициентов отзывчивости на внесение в агаризованную питательную среду опилок, подготовленных различным образом (культивирование в течение 7 суток, КГА, три повторное™, 26°С)

4.3.1 Влияние внесения источников целлюлозы и лигнина в агаризованные среды на дегидрогеназную активность культур

Одним из показателей интенсивности энергетических процессов у культур может служить уровень активности ферментов дегидрогеназ. Для получения иллюстрации дегидрогеназной активности мицелия использовали гистохимическую методику качественной оценки с использованием нитросинего тетразолия. Индикатор акцептирует отщепленные дегидрогеназами электроны, и, восстанавливаясь, превращается в ярко окрашенный формазан. Интенсивность окраски оценивали с использованием пятибалльной шкалы, описанной в методике.

На примере К /отеШагтэ показано, что дегидрогеназная активность мице-

Рис. 5 - Иллюстрация дегидрогеназной активности мицелия [•\fomentarius, штамм N¡0-02 при помощи индикаторных свойств нитросинего тетразолия: вариант 1 - добавление нативных опилок, вариант 2 - добавление метанолизных опилок, вариант 3 — контроль

В варианте с добавлением в агаризованную среду метанолизных опилок отмечено наиболее интенсивное окрашивание, оцененное на 4 балла. В варианте с нативными опилками интенсивность окрашивания оценена на 3 балла, в контроле на 1 балл. Такие результаты косвенно подтверждают факт интенсификации обменных процессов мицелия на обогащенных опилками агаризованных субстратах.

4.3.2 Использование лараамилобензойной кислоты в качестве фактора, оптимизирующего развитие мицелия ксилотрофных базидиомицетов на субстратах, содержащих липюцеллюлозные компоненты

Нами изучено воздействие парааминобензойной кислоты на рост и развитие культур, в результате чего была установлена концентрация, позитивно влияющая на рост большинства культур — 0,005 г/л. Установлено, что ПАБК оказывает позитивное влияние на темпы и характер развития мицелия большинства штаммов изученных видов, что особенно замелю на лигноцеллюлозных субстратах (табл. 3).

Таблица 3 — Средние скорости роста мицелия ксилотрофных базидиомицетов на КГА и КГА, обогащенном метанолизными опилками (МО, 2% от массы) и _ПАБК (0,005 г/л) (мм/сут, 26°С, повторность трехкратная)_

Вид, штамм Особенности субстрата

КГА (контроль) КГА+МО КГА+ПАБК КГА+ПАБК+МО

1. obliquus, Ю-1 3,1±0,2 3,9±0,4 4,2±0,4 5,0±0,4

Ph. tremulae, Pht-1 0,2±0,01 0,25±0,03 0,31±0,03 0,49±0,06

F. pinicola, Fpi-2 8,5±0,9 12,2±0,8 9,2±1,7 11,0*1,0

L sulphureus, PD-01 8,2±1,2 11,5±1,4 8,6±2,4 10,4±1,1

G. applanatum, G-3 9,8±0,7 12,7±0,5 11,2±2,3 12,7±1,5

G. lucidum, Gl-6 6,4±1,5 9,9±1,3 7,7±0,7 11,Sil,4

F. fomentarius, AH-96 5,1±1,3 12,3±0,3 8,0±1,1 14,2±1,3

P. cinnabarinus, PyC-1 5,1 ±0,9 11,2±0,9 7,4±0,4 12,6±0,9

H. annosum, Han-3 0,2±0,04 0,5±0,01 0,4±0,01 0,6±0,01

F. hepatica, Fh-5 4,2±0,8 8,3±1,0 4,8±0,6 9,8±0,6

*жирным показаны достоверные отличия от контроля, Р<0,05.

Полученные данные свидетельствуют о целесообразности включения ПАБК в рецептуру сред для культивирования ксилотрофных базидиомицетов, особенно в состав субстратов, содержащих липюцеллюлозные компоненты.

5 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОДЕЛЬНОГО ЛИГНИНА И ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МАТЕРИАЛОВ ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ

5.1 Влияние продуктов перколяции лигнина Классона на накопление биомассы мицелия ксилотрофных базидиомицетов в условиях глубинной культуры

На следующем этапе экспериментов нами было изучено влияние лигноцеллюлозных компонентов на процесс накопления биомассы мицелия в глубинных условиях. Опилки, как нерастворимый материал, при добавлении в жидкую питательную среду будут помехой для отделения биомассы мицелия, поэтому внесе-

ние их в обычном состоянии нецелесообразно. Решением проблемы может быть предварительная перколяция лигноцеллюлозных субстратов для получения экстрактов. Однако, используя субстрат, подготовленный таким образом, невозможно судить о влиянии на развитие мицелия целлюлозы, а также гемицеллюлоз, которые в процессе перколяции разрушаются до олигомерных и мономерных компонентов (в основном, целлобиозы, глюкозы, ксилозы и т.д.). Таким образом, можно судить только о влиянии со стороны метоксильных групп лигнанов, перешедших в раствор. Влияние же олигомерных и мономерных компонентов углеводов учесть сложно, но и исключить нельзя, поскольку их спектр (как качественный, так и количественный) чрезвычайно широк. В этой связи логично полное удаление углеводной составляющей из лигноцеллюлозного субстрата, то есть получение модельного лигнина (лигнина Классона).

Два варианта лигнинов были получены удалением углеводов из исследованных лигноцеллюлозных материалов. Затем лигнины подвергнуты перколяции. Проведенный методом газовой хроматографии анализ содержания метоксильных групп в составе перколятов показал, что их значение, полученное для метанолиз-ного лигнина (7,4 мМ/г) почти втрое выше, чем для нативного (2,5 мМ/г). Перко-ляты в количестве 2% от массы среды вносили в среду Чапека, до стерилизации.

Как в опытных, так и в контрольных вариантах на видовом уровне сохраняются особенности морфологии глубинного мицелия. Некоторые виды характеризовались филаментным, а другие - пеллетным ростом. Различия не связаны ни с трофическими стратегиями видов, ни с типами вызываемых грибами гнилей. Возможно, это своеобразная иллюстрация отношения культуры к концентрации кислорода в среде. Однако для установления каких-либо зависимостей потребуются дополнительные исследования. Установлено стимулирующее влияние обоих вариантов перколятов лигнина на процесс накопления биомассы мицелия у большинства штаммов изученных видов: F. pinícola, G. applanatum, G. lucidum, F. fomentarius, F. hepático, P. cinnabarinus (табл. 4).

Таблица 4 — Накопление биомассы мицелия культурами ксилотрофных базидиомицетов на различных средах (26°С, 7 сут. развития, повторность трехкратная, сухой мицелий, г), в пересчете на 1л питательной среды

Вид Штамм Варианты опыта

Экстракт лигнина из нативных опилок* Экстракт лигнина из метанолизных опилок* Среда Чапека модифицирванная (контроль)

!. obliquus IO-l 2,57±0,10 2,72±0,02** 2,18±0,04

IO-2 3,11±0,13 3,02±0,10 2,98±0,18

10-3 2,38±0,14 2,46±0,02 2,20±0,07

Ph. tremulae Pht-1 2,05±0,15 1,34±0,07 1,91±0,13

Pht-2 1,80±0,04 1,19±0,01 1,75±0,01

Pht-3 1,02±0,07 1,10±0,11 1,48±0,11

F. pinícola Fpi-1 7,53±0,51 8,5±0,15 5,69±0,08

Fpi-2 5,24±0,09 6,2±0Д0 4,82±0,22

Fpi-3 5,36±0,35 3,90±0,12 3,47±0,11

L. sulphureus PD-99 6,11±0,28 6,83±0,23 5,78±0,08

PD-01 4,12±0,05 5,69±0,11 4,34±0,35

Вид Штамм Варианты опыта

Экстракт лигнина из нативных опилок* Экстракт лигнина из метанолизных опилок* Среда Чапека модифицирваниая (контроль)

АЬ-02 4,91±0,17 6,72±0,30 4,57±0,09

С?. арр!апашт С-1 3,60±0,39 5,28±0,13 3,10±0,15

в-2 4,32±0,22 4,75±0,24 3,18±0,10

С-З 4,26±0,10 5,13±0,12 3,77±0,22

0.1ис1^ит а-1 3,21±0,13 3,75±0,21 2,59±0,19

а-з 4,29±ОДО 5,30±0,14 3,64±0,27

С1-6 ЗД0±0,12 6,22±0,25 3,04±0,24

Р. /отепШгш АН-96 4,51±0,32 4,67±0,28 2,28±0,02

N¡0-02 5,83±0,16 4,10±0,11 3,08±0,08

Ьр-05 5,76±0,40 5,61±0,32 3,33±0,06

Р. стпаЬагтт РуС-1 5,06±0,24 3,62±0,17 3,29±0,09

РуС-2 4,43±0,19 4,60±0,01 3,77±0,09

РуС-4 4,60±0,09 4,96±0,04 3,65±0,05

Н. аппозит Нап-1 2,63±0,19 2,01±0,19 2,09±0,07

Нап-2 2,77±0,10 1,65±0,02 2,89±0,11

Нап-3 3,06±0,01 2,66±0,09 2,63±0,02

Е ИераИса РЬ-1 4,18±0,12 4,61 ±0,20 2,89±0,01

РЬ-1а 4,06±0,26 5,01±0,42 2,58±0,13

РЬ-5 3,58±0,13 4,64±0,18 2,09±0,04

* Экстракты адаптированы к среде Чапека экзогенными сахарами ** Достоверные (Р<0,05) отличия показаны жирным шрифтом

Однако для штаммов таких видов как I. оЫ'щиш, РИ. 1гети1ае и Н. аппохит не установлено фактов стимуляции развития. Мы связываем это с особенностями трофики выраженных биотрофов, для которых порог ингибирования роста фе-нольными соединениями, содержащимися в древесине, ниже, чем у сапротроф-ных видов. Тот факт, что торможение роста обнаружено у паразитных видов (РИ. 1гети!ае и Н. аппояит) в вариантах с экстрактами лигнина из метанолизных опилок, косвенно свидетельствует в пользу этого предположения.

Таким образом, можно рекомендовать подобные приемы для выращивания биомассы мицелия этих видов в глубинных условиях. Стимуляция развития мицелия, более заметная в вариантах с перколятами лигнина метанолизных опилок может объясняться структурой лигнинового компонента последних. Она более рыхлая и доля метоксильных групп, доступных для утилизации мицелием, выше, чем у нативных опилок, где лигнин находится в конденсированном состоянии.

5.2 Влияние экстракта перколированного лигнина на процесс синтеза эргостерина штаммами изученных видов ксилотрофных базндномицетов

Важным показателем метаболизма культуры может служить синтез эргостерина, участвующего в формировании структуры мембран. Эргостерин также представляет собой исходное вещество для синтеза многих продуктов стероидной природы, многие из которых рассматриваются как вторичные метаболиты. Содержание эргостерина выше в образцах мицелия, выращенного на средах с

добавлением перколятов лигнина, причем это достоверно отмечено для видов -представителей белой гнили, и, как исключение - для представителя бурой гнили Ь. ¡и1ркигеии (табл. 5).

Таблица 5 — Показатели содержания эргостерина в образцах мицелия штаммов исследованных видов ксилотрофных базидиомицетов

(26°С, 7 сут. развития, повторность т| эехкратная)

Вид, штамм Среда Чапека модифицированная (контроль) Среда с перкалятом из метанолизного лигнина (опыт)

Масса навески, (мг) Эргостерин, %* Масса навески, (мг) Эргостерин, %

!. obliquus, Ю-2 2983,7± 182,1 0,74±0,04 3023,0±104,3 1,31±0,02**

Ph. íremulae, Pht-1 1911,2±13 ,0 0,41±0,01 1339,7±713 0,69±0,02

F. pinícola,Fpi-1 5694,0±82,4 0,38±0,03 8506,1±153,8 0,39±0,01

L. sulphureus, PD-99 5782,1 ±80,7 0,37±0,01 6832,3±232,1 0,49±0,01

G. applanatum, G-2 3179,3±102,2 0,70±0,09 4751,1±244,4 1,03±0,09

G. lucidum, Gl-3 3638,2±274,2 0,87±0,01 5303,2±139,1 1,49±0,02

F. fomentarius, Nic-02 3081,7±83,7 1,06±0,04 4107,2±112,6 1,42±0,05

P. cinnabarinus, PyC-1 3292,2±90,3 1,08±0,03 3619,5±172,9 1,50±0,03

H. annosum, Han-2 2894,3±10,2 0,61±0,01 1652,3±23,9 0,76±0,04

F. hepatica, Fh-5 2093,3±389,6 1,60±0,04 4643,4±184,8 1,56±0,06

*% эргостерина от воздушно-сухой массы мицелия

Отсутствие зависимости между накоплением биомассы и содержанием эргостерина означает, что помимо затрат на пластический обмен, культуры накапливают материал для синтеза веществ и образования структур на последующих стадиях развития. Возможно, это резерв для репродуктивных процессов.

5.3 Утилизация мицелием ксилотрофных базидиомицетов различных компонентов питательной среды в условиях глубинного культивирования

Настоящий эксперимент был организован с целью изучения темпов утилизации мицелием разных видов компонентов среды в глубинных условиях. Для этого в среду Чапека добавляли непосредственно метанолизные опилки. Анализ накопления биомассы в этом случае не предполагался. Темпы утилизации глюкозы из питательной среды различались у разных видов. Максимальными они были у культур-представителей видов с выраженной паразитической стратегией питания в природе, у сапротрофных видов снижение концентрации глюкозы происходило медленнее (рис.6). Однако, начиная с 6-7 суток культивирования, у представителей грибов бурой гнили была отмечена своеобразная «пульсация» концентраций глюкозы в культуральной жидкости, что мы объясняем процессом гидролиза углеводов из материала опилок. В связи с этим, нам представилось вероятным обнаружение в культуральной жидкости целлобиозы, как промежуточного продукта гидролиза.

Сутки культивирования ♦ Ph. tremulae, Pht-1, К и Н. amtosum.Han-1, К

Ph. tremulae, Pht-1,0 —Ж— Н. annosum,Han-l, О

—I. оbliqus,10-1, К —-—F. hepatica, Fh-5, К —I. о bliq us,10-1, 0 —ж—F. hepatica, Fh-5, 0

Сутки культивирования ♦ G.lucidum, GH, К —■—F.pinicola, Fpi-1, К G.lucidum, Gl-1, О —ж—F.pinicola, Fpi-1, О Рис. 6 - Динамика утилизации глюкозы из питательной среды культурами разных видов при глубинном культивировании (К - контроль, среда без добавления метоксильных опилок, О - опыт, среда с добавлением метанолизных опилок)

Действительно, значительные концентрации целлобиозы обнаружены в культуральной жидкости грибов белой гнили I. obüquus и G.lucidum на средах, содержащих источники целлюлозы и лигнина по истечении 7 суток культивиро-

вания. Максимумы концентраций целлобиозы в культуральной жидкости составили соответственно 3,6 мМ/л - на десятые и 3,9 мМ/л - на двенадцатые сутки культивирования. В культуральной жидкости некоторых прочих видов в опытных вариантах были обнаружены следовые количества целлобиозы, а в контрольных вариантах этот углевод отсутствовал полностью. Появление в культуральной жидкости грибов белой гнили целлобиозы может объясняться только процессом гидролиза целлюлозы опилок. Этот факт, особенно с учетом относительно слабой утилизации грибами этой группы глюкозы питательной среды, может свидетельствовать об особой трофической стратегии их в культуре в присутствии лигноцеллюлозных компонентов.

Затем отделенные от среды опилки были высушены до постоянной массы и проанализированы на остаточное содержание холоцеллюлозы и метоксильных групп. Содержание холоцеллюлозы изменилось незначительно у обоих видов с паразитической стратегией питания в природе. Выявлены достоверные отличия в плане более интенсивной утилизации холоцеллюлозы грибами бурой гнили, что вполне согласуется с особенностями этой группы (табл. 6).

Таблица 6 - Содержание целлюлозы и метоксильных групп в материале метанолизных опилок, извлеченных из среды после глубинного культивирования _мицелия разных видов ксилотрофных базидиомицетов_

Вид, штамм Трофическая Тип гнили Содержание Содержание

стратегия видов целлюлозы, % метоксильных

в районе от исходного групп,

исследовании содержания % от исходного содержания

Ph trermdae, Pht-1 Облигатные белая 97,5 81,8

Н. annosum, Han-1 паразиты мешанная 86,5 80,6

!. obitquus, IO-l Факультативные белая 69,8 66,7

F. hepática, Fh-5 паразиты бурая 55,5 71,9

G.tucidum, Gl-1 Факультативные белая 62,1 57,8

F.pinícola, Fpi-1 сапротрофы бурая 48,9 55,3

Концентрация метоксильных групп почти не изменилась у видов — паразитов. У прочих видов содержание метоксильных групп уменьшилось почти по сравнению с исходным, причем у типичных сапротрофных видов - почти вдвое. Вопреки ожиданиям, утилизация метоксильных групп, как выяснилось, происходит с примерно одинаковой интенсивностью у грибов белой и бурой гнили. Такая парадоксальная ситуация может объясняться тем, что грибы белой гнили утилизируют метоксилы для деградации лигнина, а бурой - для его вторичной модификации.

6 ВЛИЯНИЕ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ КОМПОНЕНТОВ СУБСТРАТА НА ПРОЦЕССЫ ИЛОДООБРАЗОВАНИЯ У КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ В УСЛОВИЯХ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ

6.1 Влияние внесения метанолизных опилок в агаризованные среды на образование зачатков плодовых тел у некоторых видов ксилотрофных базидиомицетов

Отдельным блоком исследований было изучение влияния лигноцеллюлозных компонентов субстратов на процессы формирования зачатков плодовых тел в

стерильных условиях. Была проведена 5-суточная холодовая стимуляция плодо-образования, после чего культуры выдерживали при комнатной температуре. У ряда культур, причем только у грибов — представителей белой гнили через 12-15 суток было отмечено формирование примордиев. Появившиеся узелки на мицелии Ph. tremulae в вариантах с добавлением как нативных, так и метанолизных опилок, дальнейшее развитие прекратили. На 20-25 сутки у прочих представителей белой гнили (I. obliquus, F.fomentarius, G. applanatum, G. lucidum, P. cinna-6аг/им.^сформировались типичные Примордии (рис.7). В вариантах с метанолиз-ными опилками, и, реже, в вариантах с нативными у примордиев появилась тенденция к дифференциации.

Рис. 7 - Образование примордиев у некоторых видов: а) /. оЪИциш, штамм Ю-1; б) Р. /отеЫагтз, штамм N¡0-02; в) Р. с 'тпаЪагтю штамм РуС-1

Образование примодиев G. lucidum наблюдали и в контрольных вариантах, но в опыте заметна выраженная дифференциация (рис. 8).

Gl-1),

Формирование дифференцированных примордиев в варианте с метанолиз-ными опилками, обогащенными метоксильными группами, свидетельствует о том, что эти компоненты лигнина (концентрация которых заметно выше в древесине, уже подвергшейся процессам деструкции в природе) (Фенгел, 1988), могут служить факторами плодоношения не только в искусственных, но и в естественных условиях.

6.2 Возможности включения метанолизных источников целлюлозы и лигнина в состав твердофазных органических субстратов для получения плодовых тел Ganoderma lucidum

На основании полученных данных по стимуляции плодообразования культур ксилотрофных базидиомицетов на стерильных субстратах внесением в среду метанолизных опилок было организовано исследование их влияния на процесс плодоношения G.lucidum при культивировании по интенсивной технологии.

В качестве контрольного субстрата использована ржаная солома, в опытах к ней добавлены нативные и метанолизные опилки в количестве 10 % от массы субстрата. В контроле на 20-25 сутки развития мицелия отмечены кожистые уплотнения, которые со временем приобретали бурую окраску. Мицелиальная корка высыхала и отторгалась от субстрата. В опытных вариантах на 38-45 сутки были отмечены тенденции к формированию плодовых тел. В вариантах с использованием метанолизных опилок процессы морфогенеза протекали более интенсивно, на 55-е сутки сформированная на таком субстрате типичная базидиома приступила к спороношению (рис.9). Это подтверждает наше предположение о том, что метоксильные группы могут служить фактором, стимулирующим переход культуры к вторичному метаболизму, поскольку одной из иллюстраций этой фазы развития служит плодоношение.

Рис. 8 - Дифференцированный примордий на мицелии G. lucidum (штамм сформированный на среде с добавлением метанолизных опилок, 20 сутки

Рис. 9 - Базидиома G. lucidum на твердом органическом субстрате, содержащем метанолизные дубовые опилки в момент начала спороношения

Безусловно, на процесс плодообразования в искусственной культуре влияет целый ряд внешних факторов, прежде всего микроклимат, однако определение оптимального субстрата представляется нам существенным моментом. На основании полученных данных была разработана рецептура субстрата, который используется нами для получения плодовых тел G. lucidum.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении подводятся и обсуждаются итоги проделанной работы, дается обоснование целесообразности использования экстрагированных метанолизных источников целлюлозы и лигнина в практике культивирования видов ксилотроф-ных базидиомицетов.

ВЫВОДЫ

1. Субстратная приуроченность ксилотрофных базидиомицетов к древесине разной степени разложения определяет особенности их развития в чистой культуре.

2. Изученные виды ксилотрофных базидиомицетов, несмотря на различную субстратную специализацию в природе (по отношению к древесным породам и степени разложения древесины) с разной интенсивностью развиваются на экстрагированном системой полярных и неполярных растворителей нативном и мета-нолизном (обогащенном метоксильными группами) материале дубовых опилок в условиях чистой культуры.

3. Структура лигноцеллюлозного субстрата влияет на ферментативную активность мицелия изученных видов. Метанолизный субстрат ингибирует окси-дазную активность большинства видов с паразитной специализацией в природе и стимулирует таковую у большинства сапротрофных видов; он стимулирует пе-роксидазную активность у некоторых видов - представителей белой гнили; виды - представители бурой гнили на нативном субстрате в культуре интенсивнее разрушают целлюлозу, чем представители белой; на метанолизном субстрате эта

закономерность сохраняется. Метанолизный лигноцеллюлозный субстрат обеспечивает увеличение целлюлазной активности большинства изученных видов.

4. Метанолизный лигноцеллюлозный субстрат в количестве 2% от массы агаризованной питательной среды является фактором, стимулирующим развитие большинства изученных видов ксилотрофных базидиомицетов. Интенсификация обменных процессов косвенно подтверждается повышением активности дегидро-геназ у мицелия, развивающегося на агаре, обогащенном метанолизным лигно-целлюлозным материалом.

5. Установлена стимуляция накопления биомассы глубинного мицелия большинства изученных видов при внесении в среду перколятов метанолизного лигнина.

6. У видов - представителей белой гнили, и, как исключение у представителя бурой гнили L. sulphureus обогащение глубинной среды метоксильными группами стимулирует процесс синтеза эргостерина.

7. Установлено позитивное влияние метанолизных лигноцеллюлозных источников на формирование зачатков плодовых тел у видов - представителей белой гнили в условиях чистой культуры. Обнаружена стимуляция морфогенетиче-ских процессов при развитии базидиом G. lucidum на твердых органических субстратах с добавлением метанолизных компонентов. Можно рекомендовать включение метанолизных лигноцеллюлозных материалов в субстрат для получения плодовых тел G. lucidum.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лыков, Ю.С. Особенности роста штаммов ксилотрофных базидиомицетов на плотных питательных средах различного состава / Г.В. Ильина, Ю.С. Лыков Н Тезисы докладов II съезда микологов России «Современная микология в России». - Национальная Акадамия Микологии, Москва, 2008. - С. 509-510.

2. Лыков, Ю.С. Специфика питательных сред для культивирования ксилотрофных базидиомицетов в лабораторных условиях / Ю.С. Лыков // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной памяти профессора А.Ф. Блинохватова «Образование, наука, практика: инновационный аспект». -Пенза, 2008.-С. 64.

3. Лыков, Ю.С. Роль специфики лигнинсодержащих субстратов при культивировании ксилотрофных грибов in vitro / Г.В. Ильина, Д.Ю. Ильин, Ю.С. Лыков // Микология и Фитопатология, Том 43, Вып. 2, Санкт-Перербург, «Наука», 2009. - С. 135-141.

4. Лыков, Ю.С. Влияние некоторых микроэлементов на развитие мицелия ксилотрофных базидиомицетов в искусственной культуре / Ю.С. Лыков П Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России». - Пенза, 2009. -С. 188-189.

5. Лыков, Ю.С. Изучение антимикробной активности местных штаммов Laetiporus sulphureus (FR.) BOND. ET SING / Г.В. Ильина, Ю.С. Лыков, A.A. Костычев И Международный научно-практический рецензируемый журнал «Иммунопатология, аллергология, инфектология». Труды междисциплинарного микологического форума, № 2. Москва, изд-во «Национальная академия микологии», 2009. - С. 178-179.

6. Лыков, Ю.С. Биологические особенности видов ксилотрофных базидио-мицстов лесостепи правобережного Поволжья in situ и ex situ / Г.В. Ильина, Ю.С. Лыков // Поволжский экологический журнал, № 3,2010, С. 263-273.

7. Лыков, Ю.С. Особенности развития мицелиальных культур паразитных видов базидиальных макромицетов EX SITU / Ю.С. Лыков, Г.В. Ильина // Международный научно-практический рецензируемый журнал «Иммунопатология, аллергология, инфектология» / Труды второго междисциплинарного микологического форума, № 1. Москва, изд-во «Национальная академия микологии», 2010. - С. 115.

8. Лыков, Ю.С. Возможности стимуляции синтеза эргостерина мицелием ксилотрофных базидиомицетов в условиях глубинной культуры / Ю.С. Лыков, Г.В. Ильина // Известия Пензенского государственного педагогического университета имени В.Г. Белинского. Естественные науки. № 21 (25), Пенза, 2011 (в печати).

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю, Г.В. Ильиной, за внимательное и чуткое отношение, сотрудникам РЦГЭКиМ по Пензенской области за помощь в организации исследований. Отдельные слова благодарности автор выражает профессору кафедры микологии и альгологии МГУ им. Ломоносова, д.б.н. Л.В. Гарибовой и ведущему научному сотруднику названной кафедры, д.б.н. А.Н. Лихачеву за неоценимую всестороннюю поддержку.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии «Копи-Шэо» ИП Попова М.Г. г. Пенза, ул. Московская, 74 27.12.2010 г., тираж 100 экз., 1,25 усл. печ. л., заказ 299

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лыков, Юрий Сергеевич

Введение

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Природный статус ксилотрофных базидиомицетов: современное состояние вопроса

1.2 Структура древесины и процесс её биодеградации

1.3 Трофические потребности ксилотрофных базидиомицетов в условиях чистой культуры

Глава 2 Материал и методы исследований

2.1 Природо-климатические особенности района исследований

2.2 Объекты и методы исследования

Глава 3 Особенности развития видов и штаммов ксилотрофных базидиомицетов в условиях чистой культуры

3.1 Культурально-морфологические особенности исследованных видов

3.2 Особенности развития штаммов с различными трофическими стратегиями на традиционных питательных средах

Глава 4 Использование комплексных источников целлюлозы и лигнина при культивировании штаммов ксилотрофных базидиомицетов

4.2 Активность некоторых ферментов ксилотрофных базидиомицетов при твердофазном культивировании

4.3.2 Использование парааминобензойной кислоты в качестве фактора, оптимизирующего развитие мицелия ксилотрофных базидиомицетов на субстратах, содержащих лигно-целлюлозные компоненты

Глава 5 Использование модельного лигнина и лигноцеллюлозных материалов при глубинном культивировании ксилотрофных базидиомицетов

5.2 Влияние экстракта перколированного лигнина на процесс синтеза эргостерина штаммами изученных видов ксилотрофных базидиомицетов

Глава б Влияние лигноцеллюлозных компонентов субстрата на процессы плодообразования у ксилотрофных базидиомицетов в условиях чистой культуры

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние модификации лигноцеллюлозного субстрата на рост и развитие ксилотрофных базидиомицетов"

В настоящее время активно проводятся исследования, касающиеся экологии и практического использования различных видов древоразрушающих грибов, в частности, ксилотрофных базидиомицетов (Дьяков и др., 2010; Псурцева, 2010). Однако практически нет сведений относительно изучения природных особенностей видов и штаммов различного происхождения, их трофических потребностей в культуре. Также невелик объем информации о возможностях модификации морфолого-культуральных и физиолого-биохимических характеристик штаммов различных видов под влиянием субстратных факторов на разных этапах развития. С этих позиций, актуальными представляются исследования коллекционных штаммов различных видов, разного эколого-географического происхождения, выделенных с разных древесных пород, отличающихся трофической специализацией (истинные паразиты, сапротрофы, факультативные виды). Естественные местообитания, представленные разнообразием экотопов, представляют собой природный резерват штаммов ксилотрофных базидиомицетов, которые могут обладать уникальными индивидуальными особенностями. Безусловно, экосистемы бо-реальных лесов в связи с обилием субстрата характеризуются высоким разнообразием древоразрушающих базидиомицетов. Биота ксилотрофных базидиомицетов в таежных микоценозах изучена достаточно полно, однако данных о ее состоянии в средней полосе России, в частности, в зоне лесостепи, недостаточно. Экотонные системы, расположенные в этой зоне, могут представлять особый интерес, поскольку в них отмечаются сложные сочетания природно-климатических и биотических факторов. Так, здесь проходят границы ареалов многих видов растений, что говорит о наличии для них песси-мальных условий и некоторой дестабилизации иммунных систем. Это определяет своеобразие видового состава ксилотрофных базидиомицетов и свидетельствует в пользу актуальности проведения исследований физиолого-биохимического потенциала местных штаммов.

Проявление физиологической активности грибов-ксилотрофов в природных условиях сопряжено с целым комплексом внешних параметров: влиянием гидрологических, эдафических, климатических факторов, взаимодействием с другими организмами, в том числе, с растением-хозяином, видами-конкурентами и т.д. Существенный интерес представляет возможность влияния на ход развития гриба со стороны его природного субстрата: здоровой древесины, а также древесины на определенной стадии разложения. По мнению многих авторов, лигнин, как компонент этого субстрата, способен оказывать влияние на процессы развития и морфогенез культуры in situ (Фенгел, 1988). Среди биотехнологически перспективных видов значительную долю составляют грибы белой гнили, то есть группа грибов, осуществляющих процесс биодеградации лигнина. Молекула лигнина характеризуется нестереорегулярной структурой, в связи с чем его деструкция предполагает наличие у грибов эффективных полиэнзиматических комплексов, что подразумевает определенную многофункциональность ферментативной системы и разнообразие продуктов метаболизма. Логичной представляется связь между богатым биохимическим потенциалом грибов белой гнили и их биотехнологической ценностью. При этом по сей день остается открытым вопрос о том, является ли лигнин трофической субстанцией или, скорее, служит регуля-торным фактором метаболизма, или же его разрушение носит только сопутствующий потреблению целлюлозы характер?

Довольно сложно ex situ создать условия, максимально приближенные к природным. На этом фоне адекватное и достоверное изучение потенциала вида и штамма в чистой культуре нередко представляет собой определенную проблему. В то же время одной из проблем практического грибоводства является поиск оптимальных субстратов для культивирования, то есть таких субстратов, которые были бы способны обеспечить максимальную реализацию природного потенциала вида в условиях культуры. Основной и наиболее доступный субстрат, используемый при культивировании ксилотрофных ба-зидиомицетов, представляют собой опилки различных древесных пород. Однако известно, что использование таких материалов не всегда обеспечивает нормальное развитие культуры и ее высокую продуктивность. Кроме того, известно, что ксилотрофные базидиомицеты различаются по отношению к степени деструкции древесины, которую колонизируют (облигатные и факультативные паразиты, сапротрофы). В связи с этим актуальным представляется поиск путей подготовки субстрата для культивирования, с тем, чтобы оптимизировать развитие культур не только традиционных, но и вновь вводимых в искусственную культуру видов. Интерес представляет модификация питательных субстратов внесением нативного и дериватизированного лигно-целлюлозного материала, использование некоторых ростовых и регулятор-ных факторов.

Все вышеперечисленное свидетельствует об актуальности и перспективности проведения исследований по изучению трофики и особенностей развития на различных субстратах древоразрушающих базидиомицетов в культуре.

В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение влияния модификаций лигноцеллюлозного субстрата на процессы роста и развития видов ксилотрофных базидиомицетов в чистой культуре.

Для достижения поставленной цели необходимо решение задач:

- создать коллекцию видов ксилотрофных базидиомицетов, распространенных в районе исследований и отличающихся субстратной специализацией;

- изучить культурально-морфологические особенности развития видов на традиционных питательных средах;

- изучить возможности культивирования и особенности развития видов ксилотрофных базидиомицетов с различной субстратной специализацией в природе, а также вызывающих разные типы гнилей древесины на экстрагированных опилках и их метоксилированных дериватах;

- изучить влияние внесения в различные питательные среды различных по структуре источников целлюлозы и лигнина (нативных экстрагированных опилок и их метоксилированных дериватов) на процессы роста и развития культур;

- определить роль нативного и дериватизированного лигнина, как компонентов субстратов, в регуляции плодоношения у перспективных в биотехнологии видов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Процессы экстрагирования и метанолиза материала дубовых опилок обеспечивают получение лигноцеллюлозного субстрата, пригодного для культивирования ex situ видов ксилотрофных базидиомицетов независимо от их субстратной специфичности в природе.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Лыков, Юрий Сергеевич

Заключение

Сформулированное Л.Г. Буровой (1986) положение о том, что только экологические исследования, проводимые в природных условиях и параллельно в лабораторных, способны дать ключ для объективного решения целого ряда проблем и внести определенный вклад в теорию, на наш взгляд, бесспорно. В настоящей работе сделана попытка выяснения связи между экологическими особенностями видов в природе и характером их развития в условиях культуры. Установлена тенденция связи между широтой субстратной приуроченности вида в природе (по отношению к породам деревьев и степени разложения древесного субстрата) и разнообразием культурально-морфологических характеристик в культуре. Однако для установления более четких закономерностей необходимо расширение подобных исследований с привлечением большего количества штаммов. При этом привязанность вида в большей степени к древесине на ранней, или, напротив, на поздней стадии разложения, оказывает достоверное влияние на его характер развития и трофические потребности в культуре.

С другой стороны, опираясь на значительный объем современной информации об исключительных свойствах ксилотрофных базидиомицетов в качестве продуцентов биологически активных веществ, актуальной проблемой следует считать исследование роли лигноцеллюлозного субстрата как трофического и регуляторного факторы при культивировании ex situ. Основной и наиболее доступный субстрат, используемый при культивировании грибов этой трофической группы, представляют собой опилки различных древесных пород. Однако использование таких материалов не всегда обеспечивает нормальное развитие культуры и ее высокую продуктивность. Кроме того, известно, что ксилотрофные базидиомицеты различаются по отношению к степени деструкции древесины, которую колонизируют (облигатные и факультативные паразиты, сапротрофы). В связи с этим актуальным представляется поиск путей подготовки субстрата для культивирования, с тем, чтобы оптимизировать развитие культур не только традиционных, но и вновь вводимых в искусственную культуру видов.

В ходе настоящей работы установлено, что процессы экстрагирования и метанолиза дубовых опилок обеспечивают получение линоцеллюлозного субстрата, пригодного для культивирования ex situ видов ксилотрофных ба-зидиомицетов независимо от их субстратной специфичности в природе. Однако высокая концентрация фенольных соединений в метанолизном субстрате замедляет развитие видов, в природе колонизирующих субстрат на ранней стадии разложения (виды с облигатной или факультативной паразитической стратерией развития). Показано, что введение нативных и метоксилирован-ных лигноцеллюлозных источников в количестве 2% от массы среды в рецептуру агаризованных питательных сред (где возникает эффект разбавления) интенсифицирует обменные процессы и стимулирует развитие культур исследованных видов ксилотрофных базидиомицетов.

Изучено влияние метанолизного лигноцеллюлозного субстрата в сравнении с нативным материалом, не подвергнутым процессу метанолиза, на ферментативную активность мицелия культур. Установлено, что метанолиз-ный субстрат ингибирует оксидазную активность большинства видов с паразитной специализацией в природе и стимулирует таковую у большинства са-протрофных видов; он стимулирует пероксидазную активность у некоторых видов - представителей белой гнили; виды — представители бурой гнили на нативном субстрате в культуре интенсивнее разрушают целлюлозу, чем представители белой; на метанолизном субстрате эта закономерность сохраняется. Метанолизный лигноцеллюлозный субстрат обеспечивает увеличение целлюлазной активности большинства изученных видов.

В качестве исслюстрации интенсификации обменных процессов в мицелии присутствием в среде источников целлюлозы и лигнина исследована активность дегидрогеназ. Установлено повышение активности дегидрогеназ под влиянием названных компонентов. Полученные результаты указывают на то, что, кроме Сахаров, входящих в состав агаризованной питательной среды, источником углерода в опытных вариантах служит и материал опилок. Обнаруженный факт наиболее активной работы дегидгрогеназ в варианте с метанолизными опилками обусловлен именно состоянием лигнина и большей доступностью целлюлозы в материале, подготовленном таким образом.

В ходе исследований изучено влияние предшественника фолиевой кислоты - парааминобензойной кислоты на развитие мицелия изученных видов в контроле и в присутствии лигноцеллюлозных источников. Установленные факты стимуляции роста у некоторых видов косвенно свидетельствуют в пользу утверждения, что исследованная группа организмов утилизирует ПАБК для синтеза фолиевой кислоты de novo, а также в пользу предположения о том, что синтезированная фолиевая кислота как кофактор участвует в переносе одноуглеродных соединений, вовлекаемых в метаболические превращения. Причем в роли доноров таких соединений могут выступать компоненты лигноцеллюлозных субстратов. Однако для более конкретных заключений потребуется комплекс допонительных исследований.

Изучен характер глубинного роста культур изученных видов. При культивировании штаммов изученных видов в условиях погруженной культуры в присутствии перколятов лигнина с известной концентрацией меток-сильных групп установлено, что последние стимулируют накопление биомассы мицелия большинства видов ксилотрофных базидиомицетов, а также интенсифицируют процесс синтеза эргостерина у грибов белой гнили. Отсутствие прямой зависимости между процессами накопления биомассы мицелия и интенсивностью синтеза эргостерина в опыте и в контроле свидетельствует о том, что помимо затрат этого вещества на пластический обмен, культуры накапливают материал для синтеза на его основе веществ и образования структур на последующих стадиях развития. Возможно, это резерв для синтеза вторичных метаболитов, связанных с протеканием репродуктивных процессов. В этой связи установленные закономерности предполагают исследование влияния изученных компонентов лигнина на процессы образования репродуктивных структур.

В отдельном эксперименте изучены процессы утилизации глюкозы и компонентов лигноцеллюлозных субстратов из питательной среды при культивировании в глубинных условиях. Установлены отличия в темпах утилизации глюкозы у видов — представителей различных трофических стратегий (облигатные и факультативные паразиты, факультативные сапротрофы). Так, представители группировки с паразитической стратегией развития утилизируют глюкозу более интенсивно. Культуры грибов бурой гнили утилизировали глюкозу в среднем более интенсивно, чем культуры грибов белой гнили, но на поздних сроках глубинного роста в составе культуральной жидкости в опытных вариантах (с добавлением метанолизных опилок) обнаружены характерные колебания концентраций глюкозы. Такая «пульсация» представляет, на наш взгляд, определенный теоретический интерес. При этом в контрольном варианте происходил относительно равномерный спад концентраций глюкозы. Такие данные могут свидетельствовать об использовании культурой гриба бурой гнили целлюлозы из материала опилок, гидролиз которой приводит к появлению молекул глюкозы в культуральной жидкости.

При анализе культуральной жидкости на присутствие целлобиозы, ее довольно значительные концентрации были обнаружены у грибов белой гнили I. obliquus и G. lucidum. В культуральной жидкости прочих изученных видов в опытных вариантах были обнаружены следовые количества целлобиозы, а в контрольных вариантах этот углевод отсутствовал полностью. Появление в культуральной жидкости грибов белой гнили целлобиозы может объясняться только процессом гидролиза целлюлозы опилок. Этот факт, особенно с учетом относительно слабой утилизации грибами этой группы глюкозы, может свидетельствовать об особой трофической стратегии их в культуре в присутствии лигноцеллюлозных компонентов.

По истечению 13 суток глубинного культивирования отделенные от культуральной жидкости опилки были высушены до постоянной массы и проанализированы на остаточное содержание холоцеллюлозы и метоксиль-ных групп. Выявлены достоверные отличия в плане более интенсивной утилизации холоцеллюлозы грибами бурой гнили, что вполне согласуется с особенностями этой группы.

Концентрация метоксильных групп почти не изменилась у видов - паразитов. У прочих видов содержание метоксильных групп уменьшилось почти по сравнению с исходным, причем у типичных сапротрофных видов — почти вдвое. Утилизация метоксильных групп, как выяснилось, происходит с примерно одинаковой интенсивностью у грибов белой и бурой гнили. Опираясь на данные литературы, такия ситуация может объясняться тем, что грибы белой гнили утилизируют метоксилы для деградации лигнина, а бурой -для его вторичной модификации (Фенгел, 1988).

При исследовании влияния метоксилированных лигноцеллюлозных компонентов на процессы образования примордиев (зачатков плодовых тел) на мицелии изученных видов на стерильных питательных средах получены интарасные результаты. Установлено, что включение в состав субстратов названных компонентов стимулирует процессы плодообразования у грибов белой гнили. В частности, в вариантах с добавлением в агаризованные среды метанолизных опилок, активнее происходили процессы формирования и дифференцирования примордиев- у I. obliquus, F. fomentarius, G. applanaturn, G. lucidum, P. cinnabarinus.

Введение метанолизных опилок (10%) в органический субстрат на основе ржыной соломы также способствует плодоношению G. lucidum при реализации интенсивной технологии культивирования.

Таким образом, получены достоверные данные, свидетельствующие о целесообразности использования экстрагированных метанолизных источников целлюлозы и лигнина в практике культивирования видов ксилотрофных базидиомицетов.

Информация о работе

Лыков, Юрий Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.12

Диссертация

Влияние модификации лигноцеллюлозного субстрата на рост и развитие ксилотрофных базидиомицетов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы