Биотехнология нетоксичных композиционных материалов из отходов растительного сырья и микробиологической промышленности

Кадималиев, Давуд али-оглы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотехнология нетоксичных композиционных материалов из отходов растительного сырья и микробиологической промышленности
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнология нетоксичных композиционных материалов из отходов растительного сырья и микробиологической промышленности"

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи

КАДИМАЛИЕВ ДАВУД АЛИ - ОГЛЫ

БИОТЕХНОЛОГИЯ НЕТОКСИЧНЫХ композиционных МАТЕРИАЛОВ ИЗ ОТХОДОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

03.00.23 - Биотехнология *

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва- 2003

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Мордовского государственного университета им. Н.П.Огарева и кафедре физиологии микроорганизмов Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор

В.В.Ревин (биотехнология) В.Д.Самуилов (биохимия)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Н.Б.Градова

Е.П.Феофилова

Л.Н.Лихачев

Ведущая организация:

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г, Пущино

Защита состоится 2003 г. в 15 30 часов на заседании

диссертационного совета Д501.001 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 11^899, г. Москва, Воробьевы "

горы, д. 1, корп. 12, МГУ, биологический факультет, ауд. М1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического

факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. Автореферат разослан <<£:??.>>.^¿яГ..^/2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук //¿Ус-/^ Н.Ф.Пискункова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Комплексное использование сырья и создание безотходных технологий является одной из основных задач современного производства, и биотехнологии здесь отводится особая роль. Значительная часть растительной биомассы - отходы лесного и сельского хозяйства, перерабатывающей промышленности - используются нерационально. Промышленные лигнины скапливаются в отвалах, что приводит к загрязнению природной среды. Изготовление из отходов древесины древесно-стружечных плит (ДСП) дает возможность сохранить большие запасы леса. Формапьде-гидные и карбамидные смолы, используемые в качестве связующих в производстве композиционных материалов, токсичны и поэтому небезопасны для здоровья человека. Предложен ряд технологий древесных пластиков с использованием природных клеящих материалов, однако они не нашли широкого применения из-за низкой эффективности.

Компоненты лигноцеллюлозного сырья, в особенности лигнин, имеют сложную структуру. Лигнин - трехмерный нестереорегулярный полимер ароматической природы. Он является обязательным структурным компонентом всех наземных растений и составляет 20 - 35% их сухой массы. Лигнин высокоустойчив к химическому и микробиологическому разложению, что создает ряд проблем при переработке лигноцеллюлозного сырья. Между тем реакционноспособные группы лигнина, возникающие при соответствующей химической или биологической обработке и способные вступать во взаимодействия, придают лигноцеллюлозе пластифицирующие свойства, что позволяет изготавливать на ее основе древесные (лигноуглеводные) пластики (Болобова, 1999; НиНегшапп, 2001).

Биомодификация лигнина - многоступенчатый ферментативный процесс, зависящий от многих факторов, в котором участвуют окислительные и гидролитические ферменты. Гриб «белой гнили» Рати ¡'щппи.ч обладает высокой скоростью роста на лигноцеллюлозных субстратах, эффективно разрушает компоненты сырья. Его можно использовать для модификации древесных отходов целлюлозно-бумажной, деревообрабатывающей промышленности и отходов сельского хозяйства растительного происхождения в производстве композиционных материалов - лигноуглеводных пластиков. Однако механизмы деградации лигноцеллюлозы этим грибом в полной мере не выяснены, ко определена роль отдельных ферментов в разложении сырья, не исследованы продукты, образующиеся при биодеградации, и роль этих продуктов во взаимодействии компонентов лигноцеллюлозных субстратов. Без проведения таких исследований невозможно контролировать биомодификацию и биоконверсию лигноцеллюлозных материалов.

Для покрытия древесных пластиков шпоном часто используют синтетические дорогие клеящие материалы. Между тем отходы микробиологической промышленности (производство антибиотиков, кровезаменителей, витаминов) содержат значительное количество белков и других полимотов, ко-

торые обладают вяжущими свойствами и могут быть использованы для получения биоклеев.

Полимеры в отходах микробиологических производств находятся в связанном состоянии и недоступны для взаимодействия с поверхностью склеиваемых твердых субстратов. Для вовлечения реакционно-способных групп этих макромолекул во взаимодействие с субстратом необходимо исследовать физико-химические свойства отходов, подобрать условия повышения их адгезивных свойств.

Цель исследования - разработка биотехнологии нетоксичных композиционных материалов из отходов растительного сырья и микробиологической промышленности.

Задачи исследования:

1. Подобрать условия культивирования Р. ^ппий, обеспечивающие максимальный выход ферментов лигнолитического комплекса и высокую скорость разложения лигнина.

2. Изучить состав внеклеточного лигнолитического ферментного комплекса (ВЛФК) Р. ^гтия, определить ключевой и вспомогательные ферменты.

3. Выделить и охарактеризовать физико-химические и лигнолитические свойства лакказы и пероксидазы гриба.

4. Исследовать динамику и характер изменения химического состава различных лигноцеллюлозных субстратов при твердофазном культивировании Р. ^гтия, выращенного на различных питательных средах.

5. Исследовать влияние условий культивирования гриба на физико-механические свойства и экологические характеристики прессованных материалов из отходов растительного сырья, а также роль функциональных групп, продуктов и свободных радикалов, образующихся при биодеградации лигнина, в адгезии.

6. Разработать технологические приемы с использованием Р. tigrinlts для производства нетоксичных прессованных материалов из отходов растительного сырья.

7. Изучить физико-химические свойства отходов производства пенициллина и кровезаменителей, влияние условий модификации на адгезивные свойства этих отходов.

комплекса гриба Рапия (Ьемтт) П%ппи$ штамм ВКМ Б- 3616 В. Гриб синтезирует Мп-пероксидазу, пероксидазу, лакказу, а также Н2О2-генерирующий фермент глюкозооксидазу в условиях погруженного культивирования, но не продуцирует лигнинпероксидазу . Для получения пероксидазы и лакказы разработан новый способ погруженного культивирования

гриба, повышающий выход ферментов в несколько раз. При твердофазном культивировании на лигноцеллюлозных субстратах гриб синтезирует преимущественно пероксидазу и лакказу. Последовательность и максимумы проявления активностей зависят от вида лигноцеллюлозного сырья и способов их предварительной модификации.

Гриб продуцирует, по меньшей мерс, две изоформы оксидаз различающихся по субстратной специфичности. Одна из них относится к желтым лакказам.

Впервые из Р. п^ппия выделена и охарактеризована секреторная перок-сидаза растительного типа. Изучение физико-химических свойств показало, что этот фермент имеет рН- и температурные оптимумы не характерные для грибных псроксидаз. Фермент проявляет оксидазные и пероксидазные свойства в зависимости от условий функционирования. Характер воздействия фермента на лигнин зависит от величины рН и наличия Н2О2.

Изучены условия культивирования Р. ^ппи.ч, изменения происходящие в химическом составе отходов растительного сырья и в распределении функциональных групп лигниновой компоненты при бидеградации, влияние этих изменений на адгезивные свойства лигнина. Подобраны условия биомодификации и режимов прессования отходов растительного сырья для получения нетоксичных пластиков. Физико-механические свойства пластиков зависят от условий обработки грибом, режимов прессования, глубины и характера изменений, происходящих в лигнине растительного сырья.

Пластики, изготовленные из отходов растительного сырья, обработанных грибом, по прочности не уступают пластикам, изготовленным с применением синтетических смол.

Исследованы физико-химические свойства отходов производства пенициллина и кровезаменителей. Подобраны условия химической модификации мицелиальных отходов продуцента пенициллина для увеличения адгезивных свойств. Разработаны условия получения экологически чистых клеевых композиций на основе отходов микробиологических производств, которые можно использовать для покрытия древесных пластиков шпоном для повышения их влагостойкости и улучшения внешнего вида. Это позволяет осуществлять безотходную технологию производства пенициллина и других продуктов микробиологического синтеза.

Научно-практическая значимость работы. Предложены приемы повышения биосинтеза ферментов лигнолитического комплекса грибом Р. Н-Зппи.ч и его применения для биомодификации отходов растительного сырья с целью получения нетоксичных композиционных прессованных материалов, без использования токсичных синтетических связующих. Биотехнологическое производство пластиков, обладающих высокой прочностью на изгиб позволяет уменьшить эмиссию формальдегида в атмосферу более, чем в 30 раз, улучшить санитарно-гигиенические характеристики изготавливаемых изделий, решить проблему эффективной утилизации отходов различных отраслей промышленности (отходы древесины, хлопчатника, лигносульфонаты, цел-

лолигнин). Разработаны технические условия ТУ 5534-005-02069964-03, получены два патента РФ №2193481 от 27.11.02, №2002103196/13 от 10.02.03 на производство прессованных материалов.

Подобраны условия получения клеевых композиций из отходов производства антибиотиков и кровезаменителей. Это дает возможность перевода производства антибиотиков в безотходный режим, позволяет снизить значительные объемы энергетических затрат на утилизацию мицелиальных отходов. Разработаны технические условия производства клеев («Клеевая композиция» ТУ 9218-001-02069964-01, санитарно-эпидимиологическое заключение №13.01.04.921.Т.000026.05.03), которое можно осуществлять непосредственно на предприятиях, выпускающих антибиотики и кровезаменители, что позволит, наряду с решением проблем социального и экологического (дополнительные рабочие места, утилизация отходов) характера, получить дополнительную прибыль от производства и реализации клея. Получены два патента РФ №2132348 от 09.04.97 и №2155790 от 02.11.98. Технология получения биоклея включена в каталог «Научно-техническая продукция малых фирм университетских технопарков» Минобразования РФ.

Связь работы с научными программами. Представленные результаты были получены в ходе исследований, проведенных в рамках хоздоговорных научно-исследовательских работ с ОАО «Биохимик» - «Разработка технологии производства клеев из отходов производства пенициллина», «Исследование адгезивных свойств отходов производства кровезаменителей», грантов Правительства Республики Мордовия «Разработка новых технологий производства биоклеев из отходов предприятий Мордовии», «Получение экологически чистых строительных материалов при помощи базидиальных грибов», грантов Министерства образования РФ «Исследование свойств и роли ферментов лигнолитических грибов в биодеградации растительных субстратов и использование их для получения прессованных материалов РД 021.4-406», «Исследование физиолого-морфологических характеристик и свойств ферментов лигнолитического комплекса гриба РМ^г'ишь Е.02-6.0-112»

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены для обсуждения на Огаревских чтениях (Саранск, 1994-2001), на Всероссийской научной конференции «Экологические проблемы и пути их решения в зоне Среднего Поволжья» (Саранск, 1999), на Международных научно-практических конференциях «Рациональное использование лесных ресурсов» (Йошкар-Ола, 1999), «Интеграция фундаментальной науки и высшего лесотехнического образования по проблемам ускоренного воспроизводства, использования и модификации древесины» (Воронеж, 2000), «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001), на Республиканской научно-практической конференции «Роль науки и инноваций в развитии хозяйственного комплекса Республики Мордовия» (Саранск, 2001), на Всероссийском семинаре «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2002), на 5-й Международной конференции «Про-

блемы лесной фитопатологии и микологии» (Москва,2002), на 1 Съезде микологов России (Москва, 2002), на 1 конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы» (Москва, 2002).

Опытные образцы изделий экспонировались на Первом Международном салоне инноваций и инвестиций (Москва, ВВЦ, 2001), на Поволжской межрегиональной выставке «Роль науки в хозяйственном комплексе» (Саранск, ЭЦ, 2001).

Публикации. Материалы диссертации представлены в 33 публикациях, в число которых входят 4 патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 339 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, 5 глав собственных исследований, заключение, выводы и список литературы, включающий 554 источника.

Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научным консультантам - д.б.н., профессору В.В. Ревину и д.б.н., профессору В.Д. Самуилову за многолетнюю помощь и поддержку при выполнении работы; коллегам, участвовавшим в проведении исследований -к.б.н., доценту H.A. Атыкян, к.б.н. ст.преподавателю В.В. Шутовой., к.б.н., доценту Т.Н. Прытковой, руководству ОАО «Биохимик», студентам, выполнявшим дипломные работы по теме диссертации; другим сотрудникам МГУ им. Н.П.Огарева, помогавшим в проведении инструментальных анализов и оформлении диссертации, - И.П. Грунюшкину, A.A. Девяткину, H.A. Хохло-ву. М.Н.Гришановой.

ОСНОВНАЯ ЧАСТ>

Обзор литературы. Рассмотрены структура и свойства лигнина, микробная деструкция лигнина, лигнолитические ферменты грибов, преимущества и недостатки традиционных и перспективных технологий прессованных материалов из лигноцеллюлозных субстратов, состав и свойства клеевых композиций и отходов микробиологических производств и перспективы их рационального использования.

Материалы и методы исследования. В работе использовали штамм Panus (Lentinus) tigrinus (BulIiard:Fries) Fries 317, выделенный сотрудниками кафедры биотехнологии Мордовского госуниверситета и депонированный в ВКМ РАН под номером ВКМ F -3616 D (Ревин и др., 1998). Выращивание гриба в погруженных культурах проводили на питательных средах (Eggert et al., 1996) с добавлением витаминного раствора (Kirk et al., 1978) Чапека -Докса. В экспериментах по оптимизации условий культивирования изменяли концентрацию и источники азота и углерода и их соотношение, Твина-80, полимерных субстратов, буферов при разных значениях pH, а также использовали температурный сдвиг в процессе культивирования. При твердофазном культивировании использовали различные природные и модифицированные лигноцеллюлозные субстраты.

Для определения активности ферментов при погруженном культивировании гриба использовали супернатант после центрифугирования и фильтрования культуральной жидкости при 6000 об/мин в течение 10 мин. При твердофазном культивировании проросший субстрат заливали дистиллированной водой или ацетатным буфером (рН 5,0), оставляли на 30 мин, периодически перемешивая, центрифугировали при 6000 об/мин 10 мин супернатант фильтровали и использовали для определения активности ферментов. Активность ферментов измеряли спектрофотометрически с использованием специфических субстратов. За единицу активности принимали окисление 1 мкмоль субстрата или образование 1 мкмоль продукта за 1 минуту. Удельную активность определяли как мкмоль/мин/мг белка.

Схема очистки ферментов включала получение грубого ферментного препарата, ионообменную хроматографию на ТЭАЭ-целлюлозе (Газарян и др., 1995) в нашей модификации (Ревин и др., 2000), высаливание сульфатом аммония, ионообменную хроматографию на DEAE-Toyopearl (Япония) (Горбатова и др., 2000). Субстратную специфичность определяли, используя следующие субстраты: (2,2 азино-бис(З-этил-бензтиазолин-б-сульфонат) аммония) (АБТС), гваякол, ферроцианид, о-фенилендиамин, о-дианизидин для пероксидазы; АБТС, гваякол, о-фенилендамин, пирокатехин, сирингалдазин, RBBR (ремазол бриллиантовая синяя R) для лакказы. В качестве субстрата использовали также лигноуглеводные комплексы древесины березы и сосны, которые выделяли фракционированием на колонке с G-75 (Елкин, Любави-на, 1979). Спектры поглощения лакказ снимали в 5 мМ К-фосфатном буфере (рН 6,0), в диапазоне 200 - 700 нм на Specord М-40. Белок определяли по методу Bradford (1976).

Содержание лигнина в лигноцеллюлозных субстратах определяли весовым методом (Zadrazil, Brunnert, 1980) и спектрофотометрически после экстракции диоксаном (Janshekar et al., 1981), содержание целлюлозы - по методу Updegraff (1969) и как описано в работе Ермакова (1987), содержание легкогидролизуемых полисахаридов (ЛГП) - по методу (Шарков, Куйбина, 1967), содержание редуцирующих веществ (РВ) - как описано в работе Шапиро (1976). Перед определением белка в лигноцеллюлозных субстратах по методу Бредфорда субстраты подвергали обработке для удаления небелкового азота (Шульга, Брустовецкая, 1985). Биомассу определяли весовым методом.

Продукты биодеградации лигноцеллюлозных субстратов экстрагировали эфиром (Головлева и др., 1982) и анализировали методом тонкослойной хроматографии на закрепленном слое силикагеля. Для идентификации продуктов были использованы специфические окрашивающие реагенты, «свидетели» и значения Rf (Кирхнер, 1988). Присутствие свободных радикалов в субстратах, обработанных P. tigrinus, регистрировали на спектрометре ЭПР РЭ 1301.

Лигнин из молотых лигноцеллюлозных субстратов и прессованных материалов выделяли по модифицированному методу Бьеркмана (Грушников,

Елкин, 1973) и анализировали спектрофотометрически: регистрировали ИК-спектры на спектрофотометре "Specord 75 IR" в диапазоне от 400 до 4 ООО см"1 , снимали спектры в УФ- и в видимой области на спектрофотометре "Specord М-40" в диапазоне 220 - 500 им, определяли содержание фе-нольных гидроксильных и карбоксильных групп (Закис, 1987).

Для получения прессованных материалов растительные субстраты, обработанные инокулятом гриба, влажностью 8 - 10 % загружали в пресс-форму (5x15 см), формировали ковер холодной подпрессовкой и подвергали горячему прессованию на вулканизационном гидравлическом прессе ВП-903 M при различных режимах давления, температуры и времени воздействия. Изготовленные плиты испытывали на физико-механические свойства: определяли плотность (ГОСТ 10634-88) и предел прочности при изгибе (ГОСТ 1063-88); исследовали санитарно-гигиенические характеристики: эмиссию в воздух фенола (Бабичева, Дрегваль, 1990), формальдегида и аммиака (ЦРИА Морфлот, 1981), метанола (Инструкция РД 52.04.186-89).

Для изготовления клеевых композиций использовали отходы производства антибиотиков - сухой и сырой мицелий продуцента пенициллина -Pénicillium chrysogenum, отходы производства кровезаменителей - низкомолекулярную фракцию гидролизата декстрана и лютерную воду (ОАО «Биохимик», г. Саранск), костный клей. Содержание белка определяли по методу Бенедикта (Кочетов, 1980) и спектрофотометрическим методом с использованием номограммы Адамса (Алейникова, Рубцова, 1988).

Содержание клетчатки определяли по методу Кьельдаля (Ермаков, 1972). Сухую массу мицелия определяли весовым методом (Грачева и др., 1982). Содержание Сахаров в мицелии и лютерной воде определяли по реакции с пикриновой кислотой (Шапиро, 1976). Модификацию сухого и сырого мицелия проводили растворами НС1 и NaOH в различных концентрациях.

Все клеевые композиции испытывали, определяя вязкость (ГОСТ 206793), стойкость к воздействию плесневыми грибами (ГОСТ 2067-93), прочность склеивания по бумаге (ГОСТ 18251-87) и дереву (ГОСТ 2067-93), жизнестойкость (ГОСТ 2067-93).

Результаты подвергали статистической обработке на персональном компьютере с использованием пакета программ STAT 2 и электронных таблиц Microsoft Exel 2000. Полученная погрешность не превышала 5 - 10 % при подсчете среднего значения.

Результаты и их обсуждение

Физиологические и лигнолитические свойства P. tigrinus. В связи с относительно невысоким выходом ферментов в стандартных условиях погруженной культуры, со сложностью очистки ферментов из твердофазной культуры были проведены исследования по оптимизации условий культивирования P. tigrinus. Для этого была проверена эффективность 9 источников азота, 10 источников углерода с N-лимитированной минеральной средой,

различных соотношений СЯЧ, 5 буферных систем и рН, сдвига температуры, присутствия Твина-80, полимерных индукгоров - целлолигнина, березовых опилок. На основании полученных результатов был подобран состав среды, позволяющий повысить биосинтез внеклеточных ферментов лигнолитиче-ского комплеса Р. ^гтю. Разные концентрации индуктора - березовых опилок - позволяли получать преимущественно лакказу, пероксидазу, Мп-пероксидазу или глюкозооксидазу (рис. 1). Это позволило удешевить культивирование гриба и увеличить объем культуральной среды.

120

1 100

<в ю

л"

ш <

80 60 40 20 0

т-

0,5 1 2

Концентрация березовых опилок, %

-пероксидаза -лакказа

Мп-пероксидаза I— глюкозоксидаза

Рис. 1. Биосинтез лигнолитических ферментов Р. Нщппиз в присутствии березовых опилок в среде

Пероксидаза Р. ^гтт была выделена и очищена из культуральной жидкости в период ее максимальной активности методом анионообменной хроматографии с предварительным отделением пигментов. Температурный оптимум фермента при окислении о-данизидина соответствовал 25 °С, а рН-оптимум имел нехарактерное для пероксидаз значение 7,0. Добавление Мп (II) при измерении активности с АБТС не вызывало активации, характерной для Мп-зависимых пероксидаз. Из использованных 5 субстратов наибольшую активность фермент проявлял с гваяколом (рис. 2).

I - ■

11АБТС Я 2 Гваякол

13 Ферроцианид ■ 4 о-Фенилендиамин

1о-Дианозидин

Рис. 2. Субстратная специфичность пероксидазы Р.

Необычная для грибных перокеидаз субстратная специфичность фермента Р. ^Нпия вызвала необходимость изучения механизмов его участия в разрушении лигноцеллюлозного сырья. Методом гель-хроматографии были выделены лигноуглеводные комплексы из древесины березы (ЛУК-Б) и сосны (ЛУК-С), хорошо растворимые в водных буферных растворах и имеющие характерные спектры поглощения в УФ-области с максимумом при 280 нм (рис. 3). По изменению величины оптического поглощения в присутствии фермента можно судить о характере воздействия катализатора на лиг-ниновую компоненту ЛУК (Решетникова, Елкин, 1994). Для сравнения наряду с пероксидазой Р. ^ппиэ использовали классическую растительную пе-роксидазу, выделенную из хрена. Характер воздействия пероксидазы гриба на лигнин ЛУК березы и сосны зависел от условий среды (рис. 4 и 5 ).

В отсутствие Н2С>2 пероксидаза Р. tigrinus проявляла аналогичные с пероксидазой хрена свойства и вызывала полимеризацию низкомолекулярных олиголигнинов. Окисление лигниновой компоненты ЛУК-Б и ЛУК-С пероксидазой гриба происходило в присутствии Н2О2 и зависела от рН среды. В присутствии Н2О2 в меньшей степени в слабокислой и в большей степени в слабощелочной и нейтральной среде пероксидаза гриба вызывает окисление лигниновой компоненты ЛУК-Б и ЛУК-С. Такое сочетание свойств у пероксидазы было обнаружено нами впервые и дало основание отнести ее к секреторным пероксидазам растительного типа.

нм

•ЛУК-Б- - - ЛУК-С

Рис. 3. Спектры поглощения лигноуглеводного комплекса древесины березы (ЛУК-Б) и сосны (ЛУК-С)

6 Ж

5 Я X

Ьй

К - контроль, 1 - рН 3,6,2 - рН 4,5, 3 - рН 7,0.

к 1 2 3 Б

Рис. 4. Воздействие пероксидазы гриба на ЛУК березы в присутствии (А) и отсутствии (Б) перекиси, при разных значениях

РН

А Б

К - контроль, I - рН 3,6, 2 - рН 4,5, 3 - рН 7,0.

Рис. 5. Воздействие пероксидазы гриба на ЛУК сосны в присутствии (А) и отсутствии (Б) перекиси, при разных значениях

РН

Лакказа выделенная из погруженной культуры Р. tigппт, обнаруживалась в виде семейства оксидаз. Оксидазы I и 2 окисляли с разной скоростью одни и те же субстраты, за исключением ЯВВИ, который не окисляла ни одна из выделенных фракций (табл.1). Оксидаза 1 окисляла все использо-» ванные субстраты, причем по отношению к пирокатехину активность была

максимальной. Оксидаза 2 окисляла только АБТС и пирокатехин. Оптимум рН обеих оксидаз составлял 7,0, температуры - 60 - 65 °С.

Спектры поглощения оксидаз 1 и 2 в диапазоне 200 - 700 нм были сход-Р- ными и представляли собой обычные белковые спектры с максимумом по-

глощения при 280 нм (рис. 6). Отсутствовали максимумы, характерные для типичных голубых лакказ (610 нм), флавиновых оксидаз (360 и 460 нм) или гемсодержащих пероксидаз (390 - 420 нм).

Результаты позволяют предположить, что оксидаза 2 является изофор-мой оксидазы 1, которую можно отнести к желтым лакказам (Леонтьевский и др., 1966; Королева и др., 1998; Позднякова, 1999). Оксидаза 1 катализирует окисление сирингалдазина и пирокатехина, используемых в качестве теста на лакказную природу оксидаз.

Таким образом, нами выделены две нетипичные оксидазы, различающиеся активностями по отношению к одним и тем же субстратам, но имеющие идентичные значения рН- и температурных оптимумов и нехарактерные для голубых лакказ спектры поглощения в диапазоне 200 - 700 нм.

Таблица 1. Активность оксидаз Р. ^пти, выделенных последовательной хроматографией на ТЭАЭ-целлюлозе (лакказа) и ДЕАЕ-Тоуореаг! (оксидазы 1,2)

Оксидазы Субстраты

АБТС о-фенилен-диамин 1*ВВК гваякол пирокатехин сирин-гапдазин

лакказа 100 (64)* 2320 440 3656 19

оксидаза 1 100 (58)* 300 - 700 3770 100

оксидаза 2 100 (28)* * ■ - 2690 -

* Удельная активность с АБТС, Е/мг.

Длина волны, нм

лакказа оксидаза 1 -оксидаза2

Рис. 6. Спектры оксидаз Р. ¡¡§ппи$

При ТФК Р. щппив на березовых и сосновых опилках наблюдается преимущественное потребление лигнина, причем в большей степени лигнина

березы, что характерно для грибов данного вида (Головлева, Леонтьевский, 1998). До 4 - 6 суток более активно потребляется целлюлоза, а с 4-х по 10-е -лигнин (рис. 7). Лигнолитическая активность гриба на березовых опилках обнаруживалась начиная с 4-х суток и достигала максимального значения на 8-е сутки (рис. 8), что совпадало с периодом интенсивного потребления лигнина. Совпадение синтеза лакказы, лигнолитической активности и потребления лигнина по времени позволило сделать вывод о том, что лакказа играет ведущую роль в биодеградации лигнина грибом Р. ^ппш.

В— сосна лигн. - - О • • береза лигн. ■А— сосна цел. • • -Д • • береза цел.

Рис. 7. Динамика потребления лигнина и целлюлозы при ТФК Р. Iigrinus

Более позднее проявление пероксидазной активности, на 10-е сутки, дает основание полагать, что пероксидаза в составе ВЛФК гриба играет вспомогательную роль, дополняя действие лакказы и участвуя в нейтрализации токсичных для гриба компонентов древесины и продуктов биодеградации.

При ТФК Р. tigrim^s на сосновых опилках лигнолитическая активность и синтез ферментов были значительно ниже (рис. 9), что, вероятно, связано с присутствием в древесине сосны токсичных смол. Можно полагать, что это является и причиной более раннего проявления пероксидазы, основная роль которой - нейтрализация токсичных компонентов среды обитания гриба.

Биодеградация лигноцеллюлозных субстратов Р. Г^пш« сопровождается изменением содержания не только лигнина, но и других компонентов (рис. 10). При ТФК на березовых и сосновых опилках содержание легкогид-ролизирусмых полисахаридов (ЛГП) и водорастворимых редуцирующих веществ (ВРВ) изменяется неравномерно, что может быть связано с несовпадением по фазе образования и утилизации продуктов разрушения целлюлозы. Заметное накопление белка в березовых и сосновых опилках наблюдается

начиная с 3-х суток культивирования, причем в первом .,.угае прирост биомассы выше за счет большей интенсивности потребления лигнина и целлюлозы (рис. 7, 10).

4 6 8 10 12 14

Время культивирования, сутки -А— лакказная —•—лип'олитическая —И-пероксидазная актиш^сть

Рис. 8. Лигнолитичекая активность и синтез ферментов при ТФК Р. Ы$ппи1 на березовых опилках

—А—лакказа —•-

Время культивирования, сутки - общая лигнолитическая активность •

•пероксидаза

Рис. 9. Лигнолитическая активность и синтез ферментов при ТФК Р. tigr¡mti на сосновых опилках

60 -

3 6

Время культивирования,сутки а

35 30

±25 8

-20 «> ш"

■ • ю ч 5 0

Время культивирования,сутки б

Рис. 10. Изменение химического состава березовых (а) и СОСНОВЫХ (б) ОПИЛОК при Культивировании Р. /¡ЦППИХ с использованием инокулята, выращенного на среде Чапека

■ лигнин, % -А- 'ЛГП, % Ж белок, мг/г субстрата

'целлюлоза, % »—РВ.%

ЙЕ

с!Н

6Р ёН

■ ДЛЛЛ^ 2 -

Н-1—► -1-и

3 4 3 4

береза Н, кЭ сосна Н, кЭ

К — опилки, не обработанные грибом

1 — 6-е сутки культивирования

2 — 9-е сутки культивирования

Рис. 11. ЭПР - спектры опилок при ТФК Р. гщптч

Механизмы разрушения лигнина березовых и сосновых опилок имеют как различия, так и сходства. Методом тонкослойной хроматографии показано, что образующиеся при биодеградации березовых и сосновых опилок продукты частично различаются. Усиление сигналов ЭПР, обусловленных свободными радикалами, образующимися под воздействием Р. ^ппия на березовые и сосновые опилки, происходило в обоих случаях (рис. 11). И в первом, и во втором случае обнаруживается сверхтонкая структура (СТС) линии поглощения, вызванная присутствием ионов Мп. Изменения СТС при биодеградации свидетельствуют о трансформации окружения Мп2+, которые переходят в комплекс с Мп3+ за счет действия Мп-пероксидазы. Присутствие этого фермента в ВЛФК Р. tigrinus показано и в других работах (Леонтьев-ский и др., 1990; Ьеоп^еУБку е1 а1., 1995).

Анализ ИК- и УФ-спектров показал, что обработка опилок березы и сосны Р. ^ппий сопровождается структурными и функциональными изменениями в лигнине. В ИК-спектрах на стадии активного роста происходило увеличение интенсивности поглощения при 3400 - 3600 см"1 (колебания ОН-групп), 1700, 1650 и 1220 см"1 (колебания СО-, СООН- и фенольных ОН-групп соответственно) и снижение интенсивности поглощения при 1390 и 1130 см"1, что Связано с расщеплением арилалкильных эфирных связей между структурными единицами лигнина и деметоксилированием (Бабицкая и др., 1992; Щсрба, 1994). В УФ-спектрах лигнина березы и сосны Р. ^гтия

вызывал изменения в интенсивности спектров поглощения без сдвига характерных полос. Поглощение лигнина березы при обработке грибом ниже, чем до обработки, что является показателем снижения содержания ароматических колец (ТЬеапёег, Westerlund, 1993; 81еуапоу1сЬ 1апег1с й а1.,1993). В лигнине сосны на начальных этапах культивирования наблюдается увеличение поглощения в УФ-области, а разрушение ароматических колец начинается позже, чем в лигнине березы.

Время культивирования,сутки

□ березовые опилки

□ сосновые опилки

Время культивирования, сутки

□ березовые опилки

□ сосновые опилки

Рис. 12. Изменение содержания карбоксильных (А) и фенольных гидроксильных (Б) групп в лигнине опилок, обработанных Р. tigrinus

Количественный анализ показал, что к девятым суткам роста количество карбоксильных групп в лигнине березы возросло в 2,4 раза, а в лигнине со-

сны - в 1,7 (рис. 12А). Увеличение содержания карбоксильных групп, по-видимому, является результатом действия окислительных ферментов на ал-киларильные С-С-связи с образованием кислотных фрагментов и расщепления ароматического кольца с образованием алифатических продуктов, чаще всего карбоновых кислот (Решетникова, 1997). К 9-м суткам роста убыль лигнина в сосновых опилках возрастала, а содержание карбоксилов практически не увеличивалось. Нелинейный характер накопления карбоксильных групп в лигнине объясняется тем, что на более поздней стадии происходит удаление из полимерной матрицы окисленных при участии ферментов гриба мономеров и их вовлечение в метаболизм фенольных соединений - феруло-вой и ванилиновой кислот (Головлева и др., 1983).

На 6-е сутки биодеградации опилок сосны наблюдается увеличение (до 1,7%) фенольных гидроксильных групп, входящих в ароматическое ядро гваяцильного, сирингильного и я-гидроксифенильного типов (рис. 12Б), а к 9-м суткам их количество снижается. Колебания количественного содержания фенольных гидроксилов связано с интенсивностью расщепления арилал-кильных связей между структурными единицами лигнина с последующим удалением окисленных грибом структур и протеканием процессов конденсации (Бабицкая, 1994). Кроме того, деструкция опилок сосны сопровождается высвобождением смолистых веществ из древесины, которые ингибируют ферменты ВЛФК гриба.

Существенное влияние на интенсивность разрушения лигнина оказывала кислотность среды. При исследованных значениях рН - 3,2, 4,7, 6,2 и 7,6 -наилучшее обрастание грибом субстрата и максимальные потери массы и потребление лигнина наблюдались при рН 6,2. Исходя из этих данных, в дальнейших экспериментах при ТФК гриба значение рН среды поддерживали на уровне 6,0 - 6,5.

Физико-механические свойства древесных прессованных материалов зависели от условий обработки грибом, режимов прессования и от породы дерева. Предел прочности при изгибе для пластика, полученного из не обработанных грибом опилок сосны и березы, составлял 2,5 - 3,2 МПа. Добавление посевного материала увеличивало этот показатель почти в 4 раза. Это объясняется тем, чго в образовании связей между частицами древесины наряду с лигнином и полисахаридами участвуют и биополимеры гриба - клеточная биомасса, внеклеточные белки, а также другие вещества, например лигносульфонат, способные участвовать в конденсационных процессах при прессовании. Лучшие показатели прочности (13 - 16 для сосны и 10 - 11 МПа для березы) имели пластики, изготовленные из опилок, обработанных Р. tigrinus в течение 3-6 суток при рН 6,2, когда под действием ВЛФК гриба происходило высвобождение карбоксильных, карбонильных и фенольных гидроксильных групп. Эти перестройки в структуре лигнина и образование новых продуктов при его биодеградации увеличивали связующие свойства компонентов опилок. Снижение прочности при более длительной обработке можно объяснить значительными потерями лигнина и других компонентов

древесины (рис. 7, 10). Пластики из опилок березы имели худшие показатели, видимо, из-за особенностей породы дерева (Шварцман, Щедро, 1987), и поэтому дальнейшие исследования проводили с использованием сосновых опилок.

Обработка пред прессавангем

Контроль Обработка ге ре д

тхедаофазншп культивированием

■ Контроль -г

• Ионсл 10 М

□ Иоюп 10 М Рис. 13 Влияние ангиоксиданга ионолана прочность

прессованных мат риалов из опилок, обработанных

Р tJgrmus

Как уже отмечалось, биодеградация опилок Р. гтт сопровождается образованием свободных радикалов, которые могут играть роль в структурировании прессованных материалов (Болобова и др., 2002). Обработка ио-нолом, способным гасить свободные радикалы, субстрата при ТФК и перед прессованием снижала прочность изготовленных плит (рис. 13).

Таким образом, микробная трансформация древесной массы открывает новый путь к созданию экологически чистых материалов: строительная биотехнология с применением широко распространенных в природе грибов белой гнили, относящихся к классу съедобных, не представляет угрозы для человека. При этом устраняется главный недостаток традиционных технологий - использование токсичных для человека синтетических смол и отверди-телей. Анализ полученных данных показал, что качество плит, изготовленных биотехнологическим способом, зависит от условий биообработки, вида субстрата. Однако даже лучшие биотехнологические образцы по физико-механическим свойствам уступали образцам плит, полученным традиционным способом с применением фенолформальдегидных смол.

Качество плит в значительной степени зависит от условий прессования (Ьазарнова и др., 1997; Салин и др., 1997; Чемерис и др., 1997). Для изготовления опытных образцов биопластиков использовали те же режимы, которые разработаны для производства плит по традиционной технологии. Между

тем гриб вызывает глубокие изменения как в структуре, так и в химическом составе отходов растительного сырья. Для такого материала условия прессования, в особенности температура и давление, могут быть несколько иными. В связи с этим мы исследовали влияние температуры, давления, продолжительности прессования на свойства лигнина древесного сырья и на физико-механические свойства ДСП. При изготовлении образцов плит из обработанных грибом опилок обнаружена корреляция между режимом прессования и физико-механическими свойствами полученных плит. Как показали наши исследования, основное влияние на физико-механические свойства древесных материалов оказывает температура прессования.

Исследования показали, что пластики с лучшими свойствами получаются из обработанных Р. ¡^пиш опилок сосны, прессованных при 170 °С, давлении 5 МПа в течение 20 мин. По прочностным показателям - 26,4 МПа они не уступают выпускаемым в настоящее время в России и за рубежом плитам на основе фенолформальдегидных смол (20 - 26 МПа).

Сырьем для производства лигноцеллюлозных копозиционных материалов (ЛКЦМ) могут быть не только отходы древесины, но и другое растительное сырье, например стебли хлопчатника (гузапайя). ТФК Р. ИдН/шя на гузапайе было обнаружено, что для эффективной биодеградации необходимо использовать 3-суточный инокулят при рН 6,2. Однако в отличие от опилок сосны потери массы гузапайи к 6-м суткам значительно выше и составляют 28 %, причем гриб лучше потребляет целлюлозу, чем лигнин. Для сохранения структуры целлюлозы сырья, играющего роль каркаса при изготовлении прессованных материалов, необходимо сократить длительность обработки грибом. Как и с древесными опилками, биодеградация отходов хлопчатника сопровождалась образованием свободных радикалов (рис. 14). Добавление ионола в среду снижало как потребление лигнина, так и потерю массы образца. Это указывает на то, что участие свободных радикалов в биодеградации лигноцеллюлозных субстратов носит универсальный характер.

Исследования возможности получения ЛКЦМ из гузапайи без применения синтетических смол с помощью Р. ^ппия показали, что физико-механические свойства пластиков зависят от возраста инокулята и продолжительности ТФК (табл. 2). Добавление инокулята без культивирования вызывало увеличение предела прочности при изгибе, что объясняется участием в склеивании полисахаридов и белков гриба. Максимальное значение предела прочности при изгибе пластика из гузапайи наблюдалось при использовании трехсуточного инокулята ко 2 - 3-м суткам ТФК. Оно составило 15,4 МПа. У плит из стеблей хлопчатника, изготовленных с применением синтетических смол, этот показатель находится в пределах 15,2 - 17,0 МПа.

Таким образом, для изготовления экологически безопасных ЛКЦМ без синтетических связующих можно использовать стебли хлопчатника, обработанные Р. tlgrinus.

ар с!Н

2,5 3,0 Н, кЭ

К - необработанная гузапайя; 1 - гузапайя, обработанная Р. Н£Г1ГШ5.

Рис. 14. Спектры ЭПР гузапайи, обработанной Р.

Таблица 2. Свойства прессованных материалов из гузапайи, обработанной Р. И$г1>ии

Вариант опыта Продолжительность роста, сутки Предел прочности при изгибе, МПа Плотность, кг/м3

Трехсуточный 0 9,8±0,8 889±20'

инокулят 3 15,4±0,7 994±12

6 14,3±0,2 973±11

9 13,6±0,7 950±10

Пятисуточный инокулят 0 10,4±0,1 928±19

3 4,0±0,4 897+20

6 5,6±0,5 906±40

9 11,7±0,3 906±22

Семисуточный инокулят 0 8,6±0,2 944±16

3 5,8±0,8 932+19

6 11,2+0,3 • 925±15

9 10,6+0,4 871±19

Исследование санитарно-гигиенических характеристик показало, что как промышленные, так и опытные образцы плит не выделяют в воздух детектируемых количеств фенола и метанола, хотя они могут присутствовать в сырье, обработанном грибами, в результате разрушения лигнина ферментами. По-видимому, при прессовании в условиях повышенных температур они вовлекаются в процессы конденсации и полимеризации с образованием прочных химических связей, что препятствует их эмиссии в окружающую среду. В то же время все плиты выделяли в атмосферу формальдегид и аммиак. Как видно из представленных данных, количество формальдегида, выделяемого в воздух опытными образцами, колеблется в пределах от 0,008 до 0,014 мг/м3, зависит от вида сырья и длительности обработки и значительно ниже величины ПДК (табл. 3 ).

Различия в количестве формальдегида, выделяемого опытными образцами плит, вероятно, связаны с особенностями строения лигнина различного растительного сырья, процессов биодеградации. При разрушении лигнина лигнолитическими ферментами образуется большое количество разнообразных продуктов, в том числе формальдегид или его предшественники, из которых при прессовании на фоне высоких температур может образоваться формальдегид. Кроме того, эти же вещества в больших количествах образуются в процессе метаболизма клеток.

Таблица 3. Выделение формальдегида плитами из отходов растительного сырья, обработанных грибом, и промышленным образцом

Длительность обработки, сутки Концентрация формальдегида в воздухе, мг/м3

сосна береза гузапайя промышлен. образец ПДК

3 0,008±0,001 0,010±0,001 0,006±0,001 0,240±0,012 0,035

6 0,008±0,001 0,012+0,001 0,008±0,001

9 0,012+0,001 0,016±0,001 0,011+0,001

Таким образом, предварительная обработка отходов растительного сырья грибом Р. Н^гтиэ позволяет изготавливать плиты без использования токсичных связующих. Они выделяют в воздух значительно меньше формальдегида, чем промышленные образцы.

Изготовление биопластиков без синтетических связующих стало возможным за счет того, что биомодификация лигнина древесины грибом

Длина волны, нм контроль

""температура прессования 120°С

- - ■ температура прессования 15(ЛГ

~~ " 'температура прессования 17С?С

Рис. 15. УФ-спектры лигнинов, выделенных из прессованных материалов с предварительной обработкой Р. 1щппн5

Р. ^ппш приводит к образованию активных центров и реакционно-способных групп. Эти группы участвуют в образовании прочных химических связей между молекулами в местах контакта древесных частиц. Прессование модифицированных грибом опилок при повышенном давления на фоне высоких температур вызывает изменения, захватывающие все компоненты древесины. С увеличением температуры прессования повышается интенсив-

ность поглощения лигнина при 280 нм, что обусловлено изменением количества ароматических структур (рис. 15).

Режимы прессования: 1 - 120 °С, 2 - 150 °С, 3 - 170 °С.

Рис. 16. ИК-спектры лигнина из прессованных сосновых опилок, обработанных

P. tigrinus

Повышение интенсивности поглощения вызвано процессами поликонденсации и полимеризации с образованием сопряженных ароматических структур. Это подтверждают ИК-спектры (рис. 16). С увеличением температуры происходит снижение относительного содержания гидроксильных групп, увеличивается полоса, обусловленная колебаниями ароматического кольца (1580 см"1), снижается количество фенольных гидроксильных групп (1220 см"1).

Контроль

120 150

Температура прессования, °С

, обработанные грибом P. tigrinus

170

□ Опилки без обработки грибом

• Рис. 17. Изменение содержания фенольных гидроксильных групп в лигнине после прессования сосновых опилок

Количественные исследования подтвердили снижение содержания фенольных гидроксильных групп при прессовании на фоне высоких температур. При 170 °С снижение количества свободных гидроксилов составило более 90 % по отношению к контролю (рис. 17). Это свидетельствует о том, что при прессовании происходит конденсация за счет образования новых химических связей, по-видимому, сложноэфирных, между функциональными группами лигнина, высвобожденными в процессе биодеградации. Вследствие этого повышается молекулярная масса лигнинов и улучшаются физико-механические характеристики прессованных материалов.

Таким образом, биодеградация отходов растительного сырья сопровождается высвобождением большого количества реакционноспособных групп, прежде всего фенольных гидроксильных, которые при прессовании на

фоне высоких температур образуют химические связи между лигниновыми компонентами частиц древесины.

Отходы микробиологической промышленности содержат большое количество белков и полисахаридов, которые, как отмечалось выше, обладают адгезивными свойствами и их можно использовать для покрытия шпоном прессованных материалов, полученных биотехнологичесим способом. Это позволит повысить влагостойкость прессованных материалов и снизить себестоимость облагораживания. В частности,отходами производства антибиотиков и кровезаменителей являются мицелий и низкомолекулярная фракция декстрана (НФГД). Модификация мицелия 2-4% НС1 или №ОН позволила использовать его в качестве компонентов клеевых композиций^не уступающих по своим характеристикам декстриновому клею. Были изготовлены различные варианты клеевых композиций с использованием следующих компонентов: низкомолекулярная фракция декстрана, мицелий продуцента пенициллина, сахароза, лютерная вода, глицерин, борная кислота, вода, №ОН, глутаровый диальдегид.

Варианты клеевых композиций Рис. 18. Влияние состава клея на прочность склеивания бумаги

Свойства клеевых композиций зависели как от количественного, так и от качественного распределения компонентов. Использование НФГД и лютерной воды, отходов производства кровезаменителей позволили получить клеевые композиции для склеивания бумаги, не уступающие по своим адгезивным свойствам декстриновому клею (рис. 18. варианты 1, 2, 5, 8, 9) . При этом удалось полностью заменить декстрин, продукт гидролиза крахмалами свести к минимуму содержание сахара. Такой эффект обусловлен тем, что декстран по своим адгезивным свойствам очень близок декстрину. Кроме того, в лютерной воде содержится значительное количество моно- и полисахаридов, клеточной биомассы, которые также вносят вклад в повышение прочности

Варианты клеевых композиций

Рис. 19. Влияние состава клея на прочность склеивания древесины

клеевого соединения. Испытания показали, что прочность склеивания древесины клеевыми композициями, содержащими модифицированный мицелий, значительно выше, чем без мицелия (рис. 19. варианты 4, 11, 17.). Вероятно, это связано с присутствием в мицелиальных отходах значительного количества белков. Известно, что даже незначительные добавки к декстриновому клею белковых компонентов существенно повышает прочность клеевого соединения (Беккерман, 1989; Книлок, 1991; Духанин, Мальцева, 1994).

Таким образом, наши исследования показали, что из отходов производства кровезаменителей и антибиотиков можно изготавливать клеевые композиции, не уступающие по своим свойствам декстриновому клею. В отличие от декстринового клея предлагаемые композиции можно использовать для склеивания не только бумаги, но и древесины.

В разработанной клеевой композиции содержание мицелия не превышала 10%. Кроме того, в клее необходимо было присутствие Сахаров - сахарозы или технического декстрана. Доля последнего среди отходов предприятия составляла не более 2-4 %, тогда как мицелия накапливалось сотни и тысячи тонн. Поэтому нами были проведены работы по разработке технологии такого клея, в котором содержание мицелия было более 20%. С учетом того, что основную роль в адгезии играют белки мицелия, за основу был взят костный клей. Исходя из вышеприведенных данных клеевые композиции готовили, используя модифицированный и немодфицированный мицелий.

Модифицированный мицелий хорошо смешивался с жидким костным клеем в соотношении от 6 : 4 до 4 : 6 (по объему). Клеящая способность костного клея изменялась и зависела не только от условий модификации мицелия, но и от его количества. Добавление к костному клею мицелия, обработанного 2%- ным раствором ЫаОН, изменяло свойства клеевых композиций.

При соотношении модифицированный мицелий: костный клей 4:6 значение приклеиваемое™ увеличилось в 1,5 раза и составило 3,6 кПа. Увеличение доли мицелия несколько снижало величину приклеиваемости. Однако даже при соотношении 6 : 4 она соответствовала требованиям, предъявляемым к костному клею. Согласно ГОСТ 18251-87 величина приклеиваемое™ должна составлять не менее 2 кПа. По-видимому, увеличение адгезивных свойств связано с тем, что обработка мицелия низкими концентрациями щелочи или кислоты вызывает деструкцию хитина с высвобождением реакционно-способных групп белков и углеводов, участвующих в склеивании (КппвМ I, 1989).

Увеличение концентрации модификатора снижало адгезивные свойства клеевой композиции. При концентрации 12 % значение приклеиваемое™ было ниже контроля ( 2,0 кПа) при всех соотношениях мицелий/костный клей. Вероятно, при этих концентрациях происходят дезагрегация и гидролиз биополимеров, и прежде всего белка, изменяются их структура, вязкость, в результате чего снижается приклеиваемость.

Клеевые композиции с лучшими показателями испытывали на прочность склеивания древесины. Результаты испытаний (табл. 4) свидетельствуют, что все они по своим свойствам превосходят костный клей, прочность склеивания которого составила 7,0 МПа. Испытания показали пригодность клея также для покрытия древесных пластиков шпоном.

Таблица 4. Влияние модифицированного мицелия на прочность склеивания древесины клеевой композицией

Модификатор Соотношение мицелий/костный клей (по объему) Прочность склеивания, МПа

- 0:10 7,0±0,3

2%-ный №ОН 4:6 10,8±0,4

5:5 9,5±0,3

2% -ный НС1 5:5 10,1 ±0,4

4%-ный НС1 4:6 11,2±0,5

Таким образом, обработка мицелия 2 - 4%-ными растворами №ОН и НС1 позволяет использовать его в качестве компонента клеевых композиций на основе костного клея. С учетом количества мицелиальных отходов, потребности в клеях природного происхождения и простоты технологии производство таких композиций можно осуществить непосредственно на

предприятиях микробиологической промышленности, производящих антибиотики.

Для правильного использования клеев необходимо знать условия хранения, транспортировки и эксплуатации. Клеи биологического происхождения часто теряют свои свойства при воздействии температур, особенно при длительной выдержке на холоде. Кроме того, клей в жидком состоянии плохо хранится, теряет свои свойства и подвергается загниванию (ГОСТ 206793). Поэтому мы провели исследования по влиянию температуры на свойства клеевых композиций на основе модифицированного мицелия. Клей до использования выдерживали в течение 15 и 30 дней при -15, 5 и 20 °С. Для испытания использовали клей на основе сырого мицелия, обработанного 4%-ной щелочью (соотношение мицелий/костный клей 4 : 6).

При испытаниях на разрыв по дереву клеевой композиции, хранившейся при -15 "С, результаты хуже, чем у образцов, не подвергавшихся холодо-вой обработке, но выше, чем у чистого костного клея (8 МПа). Вероятно, клеевая прослойка на холоде впитывала в себя влагу, что и послужило причиной снижения технических характеристик.

Контрольные и опытные клеевые композиции, хранившиеся при комнатной температуре в открытых сосудах, практически не изменяли свои свойства, однако через 15 дней в костном клее присутствовал гнилостный запах, в то время как в клее на основе модифицированного мицелия признаки гниения не обнаруживались до 30 дней хранения. По-видимому, это связано с тем, что в мицелии присутствуют остатки пенициллина, препятствующие развитию посторонней микрофлоры.

С целью увеличения сроков хранения и улучшения возможности транспортировки из свежего клея была изготовлена галерта: биоклей подвергали выпариванию в течение 3 суток при 80 °С. После приготовления галер-ту подвергали развариванию до жидкого состояния и проводили испытания клеящей способности. При испытании на разрыв по дереву прочность склеивания составила 7,4 МПа, что соответствует ГОСТу.

Таким образом, клеевая композиция на основе модифицированного мицелия и костного клея по своим эксплуатационным характеристикам не уступает костному клею.

ВЫВОДЫ

1. Изучены физиологические и биохимические свойства гриба Рапив (1ептш) пцппич штамм ВКМ Р-36160 при погруженном и твердофазном культивировании.

2. Подобраны условия погруженного культивирования Р. ^пти, повышающие выход лигнолитических ферментов: минеральная среда, лимитированная по азоту, разные источники и соотношения азота и углерода, специфические полимерные индукторы синтеза ферментов, применение детергента

Твин-80, буферных растворов, рН и температурного сдвига. Выход ферментов увеличен более чем в 5 раз.

3. Изучен состав внеклеточного лигнолитического комплекса Р. и%гтт, включающего Мп-пероксидазу, пероксидазу, лакказу и НоСЬ-гснерирующий фермент глюкозооксидазу. Впервые из Р. tigrinlls выделена и охарактеризована секреторная пероксидаза растительного типа. Фермент имеет рН- и температурные оптимумы, не характерные для грибных пероксидаз, проявляет оксидазные и/или пероксидазные свойства в зависимости от величины рН и присутствия Н:СЬ. Гриб продуцирует по меньшей мере две изоформы окси-даз, различающиеся по субстратной специфичности, но имеющие одинаковые рН- и температурные оптимумы и нетипичные для «голубых лакказ» спектры поглощения в видимой и УФ-области. Одна из оксидаз относится к желтым лакказам.

4. Биосинтез ферментов лигнолитического комплекса при твердофазном культивировании зависит от природы субстрата и способов его предварительной обработки. Совпадение по времени синтеза и проявления лигноли-тической активности указывает на ведущую роль лакказы в биодеградации лигнина. Пероксидаза в основном играет вспомогательную роль, дополняя действие лакказы и участвуя в детоксикации.

5. Исследованы особенности биодеградации различных растительных субстратов Р. ^ппш' при твердофазном культивировании. В процессе роста наблюдается преимущественное потребление лигнина. Убыль лигнина была выше при культивировании на березовых опилках, чем на сосновых опилках и отходах хлопчатника. Биодеградация отходов растительного сырья иноку-лятом Р. Ндгти-ч при рН 6,2 является оптимальной для целенаправленной модификации сырья. При этом в лигнине освобождаются фенольные гидро-ксильные, карбонильные и карбоксильные группы и образуются свободные радикалы.

6. Разработаны технологические приемы и технические условия получения нетоксичных прессованных материалов из отходов древесины и стеблей хлопчатника. Обработанное Р. ^гтиз сырье пригодно для производства прессованных материалов без применения токсичных синтетических связующих. При прессовании важную роль в образовании химических связей между частицами растительного сырья, обработанного Р. ^ппий, играют лигнин и образующиеся при его биодеградации фенольные гидроксильныс группы и свободные радикалы, гемицеллюлоза, а также белки и полисахариды гриба.

7. Прессование опилок сосны, обработанных Р. ^ппих, в течение 3 -6 суток при 170 °С, давлении 5 МПа в течение 20 минут позволяет изготовить нетоксичные древесно-стружечные плиты с прочностью на изгиб до 26,4 МПа.

8. Прессование отходов стеблей хлопчатника, обработанных Р. t¡grim(s в течение 1 - 3 суток при 170 °С, давлении 5 МПа в течение 20 минут позволя-

ет изготовить нетоксичные лигноуглеводные пластики с прочностью на изгиб до 15,4 МПа.

9. Разработаны технологические основы и технические условия практического использования отходов производства антибиотиков и кровезаменителей в изготовлении клеевых композиций. Модификация NaOH и HCl повышает адгезивные свойства мицелиальных отходов производства пенициллина. Использование модифицированного мицелия и отходов производства кровезаменителей (низкомолекулярная фракция декстрана) позволяет получить клеевые композиции, не уступающие по своим свойствам декстриновому и костному клеям, и они могут быть использованы для покрытия шпоном прессованных материалов, полученных биотехнологическим способом.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Сарычева Е.С., Имайкина С.В., Кадималиев Д.А., Прыткова Т.Н. Фенолоксидазная активность гриба P. tigrimis при глубинном культивировании// 22 Огаревские чтения: Тез. докл науч конф. Саранск: Изд-во Морд-го ун-та, 1994. С. 216.

2. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Тараскин В.И., Уланова С.А. Использование отходов производства антибиотиков и кровезаменителей для получения биоклеев //Водные и наземные экосистемы и охрана природы лсвобережною Присурья: Сб. науч. тр. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 1998.С. 147-150.

3. Атыкяи H.A., Ревин В.В., Кадималиев Д.А.. Лафуткина Т.Т. Изучение ферментов лиг-политическою комплекса ксилотрофного гриба P. tigrimis штамм ВКМ F3616D, участвующих в биоде1 радации отходов древесины// Экологические проблнмы и пути их решения в зоне Среднего Поволжья: Сб. науч. тр. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 1999. С. 125 - 128.

4. Кадималиев Д А., Ревин В.В., Атыкян H.A., Ситкин Б.В., Смирнов A.B. Получение активного инокулята гриба P. tigr'mui для биомодификации древесного сырья // Рациональное использование лесных ресурсов: Материалы Междунар.науч-практ. конф. Йошкар-Ола, 20-22 апр. 1999. Йошкар-Ола: Изд-во МарГТУ, 1999. С. 71-72.

5. Ревин В.В., Кадималиев Д А., Шутова В.В., Тараканова O.A. Влияние биодеградации дрсвесною сырья грибом P.ligrimn на физико-механические свойства пластиков// Рациональное использование лесных ресурсов. Материалы Междунар.науч-практ.конф. Йошкар-Ола, 20-22 апр, 1999. - Йошкар-Ола: Изд-во МарГТУ, 1999. С. 60-62.

6 Ревин В.В.. Кадималиев Д.А., Хохлов В.А., Силкин К.В., Ширшикова Т.В. Клеевая композиция. Патент РФ 213248, МПК C09J 105/02; Опубл 27.06.1999, Бюл. № 18.

7. Атыкян H.A., Ревин В.В., Кадималиев Д.А., Лафуткина Т.Т. Изучение роли ферментов лигнолитического комплеса гриба P.tigrinus штамм ВКМ F 36I6D в биомодификации древесных отходов //Интеграция фундаментальной науки и высшего лесотехнического образования по проблемем ускоренного воспроизводства, использования и модификации древесины. Материалы Междунар науч-пракг.конф. Воронеж, 13-16 июня 2000. Воронеж: Изд-во ВорГЛТА, 2000. С. 109-113.

8. Шугова В.В., Ревин В.В., Кадималиев Д.А., СупонинаЖ.В. Использование гриба Р. lignnus штамм ВКМ F 3616D для получения прессованных материалов из отходов древесины//Интеграция фундаментальной науки и высшего лесотехнического образования по проблемем ускоренного воспроизводства, использования и модификации древесины: Материалы Междунар науч-практ.конф. Воронеж, 13-16 июня, 2000. Воронеж: Изд-во ВорГЛТА. 2000. С. 231-235..

9. Ревин В.В., Кадималиев Д.А., Ватолин А.Й., Хохлов В.А. Клеевая ком- позиция. Патент РФ №2155790, МПК СОИ 189/00; Опубл. 10.09.2000, Бюл.№25.

10. Ревин В.В., Кадималиев Д.А., Атыкян H.A., Ситкин Б.В. Выделение и свойства перок-садазы, продуцируемой грибом Р. tigrimis // Биохимия. 2000. Т. 65. № 11. С. 13051309.

11. Атыкян H.A., Ревин В.В., Кадималиев Д.А. Изучение воздействия гриба Р. tigrimis на лигноцеллюлозный комплекс древесины //Биотехнология на рубеже двух тысячелетий: Материалы Междунар. науч.конф. Саранск, 12-15 сент. 2001. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2001. С. 8-11.

12. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Грошев В.М. Получение биоклея из отходов предприятий //Биотехнология на рубеже двух тысячелетий: Материалы Междунар.науч. конф. Саранск, 12-15 сент. 2001. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2001. С. 24-26.

13. Ревин В.В., Кадималиев Д.А., Атыкян H.A., Шутова В.В., Грошев В.М. Перспектива использования биотехнологии для создания композиционных материалов // Биотехнология на рубеже двух тысячелетий: Материалы Междунар. науч. конф. Саранск, 12-15 сент. 2001. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2001. С. 38-42.

14. Шутова В.В., Ревин В.В., Кадималиев Д.А. Получение прессованных материалов из гузапаи, обработанной лигнолитическим грибом // Биотехнология на рубеже двух тысячелетий: Материалы Междунар.научн. конф. Саранск, 12-15 сент. 2001. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2001. С. 38^12.

15. Шутова В.В., Кадималиев Д.А., Ревин В.В. Влияние условий культивирования Р. tigrimis на физико-механические свойства биопластиков //Биотехнология на рубеже двух тысячелетий: Материалы Междунар.научн.конф.Саранск, 12-15 сент. 2001. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2001. С. 38- 42.

16. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Шутова В.В. Влияние прессования на свойства лигнина древесины сосны, обработанной грибом Р. tigrimis //Химия растительного сырья. 2001. №3. С. 115-123.

17. Атыкян H.A., Ревин В.В., Кадималиев Д.А. Оптимизация питательных сред для получения активного инокулята для биодеградации древесины //Роль науки и инноваций в развитии хозяйственного комплекса Республики Мордовия: Материалы респ. науч.конф. Саранск, 27-28 апр. 2001. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2001.С. 305-307.

18. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Шутова В.В Получение биопластиков с помощью бази-диальных грибов //Роль науки и инноваций в развитии хозяйственного комплекса Республики Мордовия: Материалы респ. научн.конф. Саранск, 27-28 апр. 2001. Саранск: Изд-во Мордов-го ун-та, 2001.С. 307-310.

19. Ревин В.В., Кадималиев Д.А., Шутова В.В.. Самуилов В.Д. Модификация лигнина древесины грибом Panus tigrinus/ll 1рикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. № 5. С. 450-454.

20. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Атыкян H.A. Особенности ферментов лигнолитического комплекса гриба Panus tigrimis штамм ВКМ F-3616D //1 съезд микологов России: Тез. докл. Москва, 11-14 апреля, 2002. М.: Нац. акад. микологии. 2002. С. 298.

21. Кадималиев Д.А., Шутова В.В., Ревин В.В. Получение прессованных материалов из древесного сырья, обработанного грибом Pamis(Lentimis) tigrimis /И съезд микологов России: Тез. докл. Москва, 11-14 апреля, 2002. М.: Нац. акад. микологии, 2002. С. 299.

22. Ревин В.В., Кадималиев Д.А., Грошев В.М. Использование мицелия гриба Penicilhtw chrysogenum для изготовления клеевых композиций //1 съезд микологов России: Тез. докл. Москва, 11-14 апреля, 2002. М.: Нац. акад. микологии, 2002. С. 303.

23. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Шутова В.В., Самуилов В.Д. Роль лигнина в изготовлении пластиков из отходов древесины //Проблемы лесной фитопатологии и микологии: Материалы 5-й Междун. конф. Одинцово, 7-13 окт, 2002. М.: РАН, 2002. С. 117-119.

24. Шутова В.В., Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Абрамова Ю.Н. Влияние pH среды на деструкцию опилок базидиомицетом Panus(Lentinus) tigrinus // Проблемы лесной фитопатологии и микологии: Материалы 5-й Междунар. конф. Одинцово, 7-13 окт. 2002. М.: РАН, 2002. С. 288-290.

25. Ревин В.В., Кадималиев Д.А., Ватолин А.К., Грошев В.М. Рациональное использование отходов микробиологических производств //Биотехнология: состояние и перспек-Iивы развития: Материалы 1-го Междунар.конгресса. Москва, 10-14 окт. 2002. М.: ЗАО «ПИК "Максима "»; РХТУ им. Д.И.Менделеева, 2002. С. 305-306.

26. Шутова В.В., Кадималиев Д.А., Ревин В.В. Идентификация продуктов биодеградации лш мина i рибом Paniis ligrima //Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: Материалы Всерос.семинара. Барнаул, 28-29 марта 2002. Барнаул: Им-во Алт. ун-та, 2002. С. 41- 42.

27. Ревин В.В.. Кадималиев Д.А., Шутова В.В. Способ изготовления лигноуглеводных древесных пластиков. Патент РФ 2193481, МПК-7, В27 №3/04; Опубл. 27.11.02, Бюл. №33.

28. Ревин В.В., Кадималиев Д.А., Шутова В.В. Способ изготовления лигноуглеводных пластиков из гузапаи. Патент РФ по заявке №2002103196/13, приоритет 10.02.02, МПК-7 В27 № 3/04. Решение о выдаче от 10.02.03.

29. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Ватолин А.К., Грошев В.М., Бычков М.В. Мицелиаль-ные отходы производства пенициллина как компоненты клея //Антибиотики и химиотерапия. 2002. Т. 47, № 12. С. 3-5.

30. Кадималиев Д.А., Ревин В.В.. Шутова В.В. Экологически безопасные пластики из отходов древесины // Строительные материалы и оборудование XXI века. 2003. № 2. С. 14-15.

31. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Атыкян H.A. Влияние полимерных субстратов на биосинтез ферментов лигнолитического комплекса грибом Panus tigrinus //Вестник ОГУ. 2003. № 4(22). С. 93-98.

32. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Атыкян H.A., Самуилов В.Д. Влияние модификации на потребление лигнина на синтез лигнолитических ферментов грибом Panus tigrinus II Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39, № 5. С. 555-560.

33. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Шутова В.В., Самуилов В.Д. Использование гриба Panus tigrinus для производства прессованных материалов из отходов хлопчатника // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Статья принята в печать.

Подписано в печать 13.08.03. Объем 2,25 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 1226. Типография Издательства Мордовского университета 430000 Саранск, ул. Советская, 24

¡ ('ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ 1 БИБЛИОТЕКА I С. Петербург

» ОЭ 100 акт

Р 13 8 1 5

i i I

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кадималиев, Давуд али-оглы

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биотехнология пластиков из отходов растительного сырья.

1.1.1. Химический состав лигноцеллюлозных субстратов.

1.1.2. Общая характеристика дереворазрушающих грибов.

1.1.3. Биодеградация лигноцеллюлозных субстратов.

1.1.3.1. Механизмы биодеградации лигнина.

1.1.3.2 Лигнолитический ферментный комплекс.

1.1.3.3. Физиологические условия, влияющие на биодеградацию ^ и синтез лигнолитических ферментов.

1.1.3.4. Продукты биодеградации лигнина.

1.1.4. Использование лигноцеллюлозных субстратов.

1.1.4.1. Технология пластиков из отходов растительного сырья.

1.1.4.2. Влияние физико-химических свойств и связующих на качество пластиков.

1.1.4.3. Перспективные технологии пластиков и других композ-ционных материалов.

1.2. Использование отходов микробиологических производств.

1.2.1. Физико-химические основы склеивания и компоненты клеев.

1.2.2. Состав и свойства отходов микробиологических производств

1.2.3. Использование отходов микробиологических производств.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Микроорганизм.

4' 2.2. Реактивы, субстраты и материалы.

2.3. Культивирование P. tigrinus.

2.4. Методы определения активности ферментов.

2.5. Методы выделения ферментов и исследования их свойств.

2.6. Методы выделения лигнина и исследование продуктов его биодеградации.

2.7. Аналитические методы.

2.8. Прессование и испытание биопластиков.

2.8.1. Определение физико-механических показателей.

2.8.2. Определение экологических показателей.

2.9. Изготовление и испытание клеевых композиций.

2.9.1. Методы исследования химического состава отходов.

2.9.2. Испытание клеевых композиций.

3.0. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБА PANUS TIGRINUS НА ЛИГНОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ И БИОСИНТЕЗ ФЕРМЕНТОВ ЛИГНОЛИЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА.

3.1. Погруженное культивирование.

3.1.1 Влияние буферных систем и рН.

3.1.2. Влияние температурного сдвига.

3.1.3. Влияние Твина-80.

3.1.4. Влияние индукторов-лигноцеллюлозных субстратов.

3.1.5. Влияние соотношения азотного и углеродного питания.

3.1.6. Влияние источников углеродного питания.

3.1.7. Влияние источников азотного питания.

3.1.8. Выделение, очистка и характеристика лигнолитических ферментов Partus tigrinus. fr- 3.2. Твердофазное культивирование.

3.2.1. Влияние природы и модификации лигноцеллюлозных субстратов.

ГЛАВА 4. БИОДЕГРАДАЦИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ СУБСТРАТОВ ГРИБОМ PANUS TIGRINUS.

4.1. Особенности биодеградации лигнина различных лигноцеллюлозных субстратов.

4.2. Изменение химического состава древесных опилок при различных условиях культивирования.

4.3. Изменение химического состава отходов хлопчатника при различных условиях культивирования.

ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕССОВАННЫХ МАТЕРИАЛОВ ИЗ ОТХОДОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ ОБРАБОТАННЫХ PANUS TIGRINUS.

5.1. Влияние условий обработки грибом на физико-механические свойства биопластиков.

5.2. Влияние условий обработки грибом на физико-механические свойства прессованных материалов из отходов хлопчатника.

5.3. Влияние условий прессования на физкоко-механические свойства биопластиков.

5.4. Механизмы участия лигнина в формировании свойств бипластиков. v 5.5. Экологические характеристики биопластиков.

ГЛАВА 6. ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕЕВЫХ КОМПОЗИЦИЙ ИЗ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА АНТИБИОТИКОВ И КРОВЕЗАМЕНИТЕЛЕЙ.

6.1. Химический состав отходов производства антибиотиков * и кровезаменителей.

6.2. Влияние обработки мицелия щелочью и кислотой на выход белков.

6.3. Влияние условий модификации мицелия и соотношения компонентов композиций на физико-химические свойства клеев.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнология нетоксичных композиционных материалов из отходов растительного сырья и микробиологической промышленности"

Актуальность проблемы. Комплексное использование сырья и создание безотходных технологий является одной из основных задач современного производства и биотехнологии здесь отводится особая роль. Значительная часть растительной биомассы - отходы лесного и сельского хозяйства, перерабатывающей промышленности — используются нерационально. Промышленные лигнины скапливаются в отвалах, что приводит к загрязнению природной среды. Изготовление из отходов древесины древесностружечных плит (ДСП) дает возможность сохранить большие запасы леса. Формальдегидные и карбамидные смолы, используемые в качестве связующих в производстве композиционных материалов токсичны и поэтому не безопасны для здоровья человека. Предложен ряд технологий древесных пластиков с использованием природных клеящих материалов, однако они не нашли широкого применения из-за низкой эффективности.

Компоненты лигноцеллюлозного сырья, в особенности лигнин, имеют сложную структуру. Лигнин — трехмерный, нестереорегулярный полимер ароматической природы. Он является обязательным структурным компонентом всех наземных растений и составляет 20 - 35% их сухой массы. Лигнин высокоустойчив к химическому и микробиологическому разложению, что создает ряд проблем при переработке лигноцеллюлозного сырья. Между тем, реакционно-способные группы лигнина, возникающие при соответствующей химической или биологической обработке и способные вступать во взаимодействия, придают лигноцеллюлозе пластифицирующие свойства, что позволяет изготавливать на ее основе древесные (лигноуглеводные) пластики (Болобова, 1999; Huttermann, 2001). Наиболее перспективной представляется предобработка лигниновой компоненты для увеличения ее адгезивных свойств.

Биомодификация лигнина - многоступенчатый ферментативный процесс, зависящий от многих факторов, в котором участвуют окислительные и гидролитические ферменты. Гриб «белой гнили» Panus tigrinus обладает высокой скоростью роста на лигноцеллюлозных субстратах, эффективно разрушает компоненты сырья. Его можно использовать для модификации древесных отходов целлюлозно-бумажной, деревообрабатывающей промышленности и отходов сельского хозяйства растительного происхождения в производстве композиционных материалов - лигноуглеводных пластиков. Однако механизмы деградации лигноцеллюлозы этим грибом в полной мере не выяснены, не определена роль отдельных ферментов в разложении сырья, не исследованы продукты, образующиеся при биодеградации и роль этих продуктов во взаимодействии компонентов лигноцеллюлозных субстратов. Без таких исследований невозможно контролировать биомодификацию и биоконверсию лигноцеллюлозных материалов.

Для покрытия древесных пластиков шпоном часто используют синтетические, дорогие клеящие материалы. Между тем, отходы микробиологической промышленности (производство антибиотиков, кровезаменителей, витаминов) содержат значительное количество белков и других полимеров, которые обладают вяжущими свойствами и могут быть использованы для получения биоклеев.

Полимеры в отходах микробиологических производств находятся в связанном состоянии и не доступны для взаимодействия с поверхностью склеиваемых твердых субстратов. Для вовлечения реакционно-способных групп этих макромолекул во взаимодействие с субстратом необходимо исследовать физико-химические свойства отходов, подобрать условия повышения их адгезивных свойств.

Задачи исследования:

1. Подобрать условия культивирования P. tigrinus, обеспечивающие максимальный выход ферментов лигнолитического комплекса и высокую скорость разложения лигнина.

2. Изучить состав внеклеточного лигнолитического ферментного комплекса (ВЛФК) P. tigrinus, определить ключевой и вспомогательные ферменты.

3. Выделить и охарактеризовать физико-химические и лигнолитические свойства лакказы и пероксидазы гриба.

4. Исследовать динамику и характер изменения химического состава различных лигноцеллюлозных субстратов при твердофазном культивировании P. tigrinus, выращенного на различных питательных средах.

6. Разработать технологические приемы с использованием P. tigrinus для производства нетоксичных прессованных материалов из отходов растительного сырья.

7. Изучить физико-химические свойства отходов производства пенициллина и кровезаменителей, влияние условий модификации на их адгезивные свойства.

8. Разработать технические условия производства клеевых композиций из отходов производства пенициллина и кровезаменителей. Научная новизна. Впервые исследован состав лигнолитического комплекса гриба Panus (Lentinus) tigrinus штамм ВКМ F- 3616 D. Гриб синтезирует Mn-пероксидазу, пероксидазу , лакказу, а также Н2О2генерирующий фермент глюкозооксидазу в условиях погруженного культивирования, но не продуцирует лигнинпероксидазу . Для получения пероксидазы и лакказы разработан новый способ погруженного культивирования гриба, повышающий выход ферментов в несколько раз. При твердофазном культивировании на лигноцеллюлозных субстратах гриб синтезирует преимущественно пероксидазу и лакказу. Последовательность и максимумы проявления активностей зависят от вида лигноцеллюлозного сырья и способов их предварительной модификации.

Гриб продуцирует, по меньшей мере, две изоформы оксидаз различающихся по субстратной специфичности. Одна из них относится к желтым лакказам.

Впервые из P. tigrinus выделена и охарактеризована секреторная пероксидаза растительного типа. Изучение физико-химических свойств показало, что этот фермент имеет рН- и температурные оптимумы не характерные для грибных пероксидаз. Фермент проявляет оксидазные и пероксидазные свойства в зависимости от условий функционирования. Характер воздействия фермента на лигнин зависит от величины рН и наличия Н2О2.

Изучены условия культивирования P. tigrinus, изменения происходящие в химическом составе отходов растительного сырья и в распределении функциональных групп лигниновой компоненты при бидеградации, влияние этих изменений на адгезивные свойства лигнина. Подобраны условия биомодификации и режимов прессования отходов растительного сырья для получения нетоксичных пластиков. Физико-механические свойства пластиков зависят от условий обработки грибом, режимов прессования, глубины и характера изменений, происходящих в лигнине растительного сырья.

Научно-практическая значимость работы. Предложены приемы повышения биосинтеза ферментов лигнолитического комплекса грибом Р. tigrinus и его применения для биомодификации отходов растительного сырья с целью получения нетоксичных композиционных прессованных материалов, без использования токсичных синтетических связующих. Биотехнологическое производство пластиков, обладающих высокой прочностью на изгиб позволяет уменьшить эмиссию формальдегида в атмосферу более, чем в 30 раз, улучшить санитарно-гигиенические характеристики изготавливаемых изделий, решить проблему эффективной утилизации отходов различных отраслей промышленности (отходы древесины, хлопчатника, лигносульфонаты, целлолигнин). Получены два патента №213481 от 27.11.02, №2002103196/13 от 10.02.03 на производство прессованных материалов.

Подобраны условия получения клеевых композиций из отходов производства антибиотиков и кровезаменителей. Это дает возможность перевода производства антибиотиков в безотходный режим, позволяет снизить значительные объемы энергетических затрат на утилизацию мицелиальных отходов. Разработаны технические условия производства клеев («Клеевая композиция» ТУ 9218-001-02069964-01), которое можно осуществлять непосредственно на предприятиях, выпускающих антибиотики и кровезаменители, что позволит, наряду с решением проблем социального и экологического (дополнительные рабочие места, утилизация отходов) характера, получить дополнительную прибыль от производства и реализации клея.

Получены два патента РФ №2132348 от 09.04.97 и №2155790 от 02.11.98. Технология получения биоклея включена в каталог «Научно-техническая продукция малых фирм университетских технопарков» Минобразования РФ.

Связь работы с научными программами. Представленные результаты были получены в ходе исследований, проведенных в рамках хоздоговорных научно-исследовательских работ с ОАО «Биохимик» -«Разработка технологии производства клеев из отходов производства пенициллина», «Исследование адгезивных свойств отходов производства кровезаменителей». Грантов Правительства Республики Мордовия «Разработка новых технологий производства биоклеев из отходов предприятий Мордовии», «Получение экологически чистых строительных материалов при помощи базидиальных грибов», грантов Министерства образования РФ «Исследование свойств и роли ферментов лигнолитических грибов в биодеградации растительных субстратов и использование их для получения прессованных материалов РД 02-1.4-406», «Исследование физиолого-морфологических характеристик и свойств ферментов лигнолитического комплекса гриба P. tigrinus Е.02-6.0-112»

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Кадималиев, Давуд али-оглы

284 ВЫВОДЫ

1. Изучены физиологические и биохимические свойства гриба Partus (Lentinus) tigrinus штамм ВКМ F-3616D при погруженном и твердофазном культивировании.

2. Подобраны условия погруженного культивирования P. tigrinus, повышающие выход лигнолитических ферментов: минеральная среда лимитированная по азоту, разные источники и соотношения азота и углерода, специфические полимерные индукторы синтеза ферментов, применение детергента Твин-80, буферных растворов, рН и температурного сдвига. Выход ферментов увеличен более чем в 5 раз.

3. Изучен состав внеклеточного лигнолитического комплекса P. tigrinus, включающий Mn-пероксидазу, пероксидазу, лакказу и Н2О2-генерирующий фермент глюкозооксидазу. Впервые из P. tigrinus выделена и охарактеризована секреторная пероксидаза растительного типа. Фермент имеет рН- и температурные оптимумы, не характерные для грибных пероксидаз, проявляет оксидазные и/или пероксидазные свойства в зависимости от величины рН и присутствия Н2О2. Гриб продуцирует, по меньшей мере, две изоформы оксидаз, различающиеся по субстратной специфичности, но имеющие одинаковые рН- и температурные оптимумы и нетипичные для «голубых лакказ» спектры поглощения в видимой и УФ-области. Одна из оксидаз относится к желтым лакказам.

4. Биосинтез ферментов лигнолитического комплекса при твердофазном культивировании зависит от природы субстрата и способов его предварительной обработки. Совпадение по времени синтеза и проявления лигнолитической активности указывает на ведущую роль лакказы в биодеградации лигнина. Пероксидаза в основном играет вспомогательную роль, дополняя действие лакказы и участвуя в детоксикации.

5. Исследованы особенности биодеградации различных растительных субстратов из P. tigrinus при твердофазном культивировании. В процессе роста наблюдается преимущественное потребление лигнина. Убыль лигнина была выше при культивировании на березовых опилках, чем на сосновых опилках и отходах хлопчатника. Биодеградация отходов растительного сырья инокулятом P. tigrinus при рН 6,2 является оптимальной для целенаправленной модификации сырья. При этом в лигнине освобождаются фенольные гидроксильные, карбонильные и карбоксильные группы и образуются свободные радикалы.

6. Разработаны технологические приемы получения экологически безопасных прессованных материалов из отходов древесины и стеблей хлопчатника. Обработанное P. tigrinus сырье пригодно для производства прессованных материалов без применения токсичных синтетических связующих. При прессовании важную роль в образовании химических связей между частицами растительного сырья, обработанного P. tigrinus, играют лигнин и образующиеся при его биодеградации фенольные гидроксильные группы и свободные радикалы, гемицеллюлоза, а также белки и полисахариды гриба.

7. Прессование опилок сосны, обработанных P. tigrinus, в течение 3-6 суток при 170°С, давлении 5 МПа в течение 20 минут позволяет изготовить нетоксичные древесностружечные плиты с прочностью на изгиб до 26,4 МПа.

8. Прессование отходов стеблей хлопчатника, обработанных P. tigrinus в течение 1 -3 суток, при 170°С, давлении 5 МПа в течение 20 минут позволяет изготовить экологически чистые лигноуглеводные пластики с прочностью на изгиб до 15,4 МПа.

9. Разработаны технологические основы и технические условия получения клеевых композиций из отходов производства антибиотиков и кровезаменителей. Модификация NaOH и НС1 повышает адгезивные свойства мицелиальных отходов производства пенициллина. Использование модифицированного мицелия и отходов производства кровезаменителей (низкомолекулярная фракция декстрана) позволяет получить клеевые композиции, не уступающие по своим свойствам декстриновому и костному клеям и они могут быть использованы для покрытия шпоном прессованных материалов, полученных биотехнологическим способом.

287

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследований показали, что гриб P. tigrinus ВКМ F-3616 D при погруженном культивировании синтезирует пероксидазу, лакказу, Мп-пероксидазу и НгОг-генерирующий фермент глюкозооксидазу, активность которых зависит от условий культивирования. Максимальный синтез лигнолитических ферментов грибом наблюдается в присутствии в среде лигноцеллюлозного субстрата - березовых опилок. Выделены и охарактеризованы два лигнолитических фермента - лакказа и секреторная пероксидаза растительног типа. P. tigrinus синтезирует две изоформы лакказы, одна из которых близка к желтой лакказе. Также впервые из Р. tigrinus выделена и охарактеризована секреторная пероксидаза растительного типа.

При выращивании гриба на естественных или модифицированных лигноцеллюлозных субстратах наблюдается преимущественный синтез пероксидазы и лакказы. Лакказа в составе ферментного комплекса P. tigrinus играет ведущую роль в деградации лигнина. Пероксидаза дополняет действие лакказы и участвует в детоксикации продуктов деградации лигнина.

Растительное сырье обработанное грибом P. tigrinus пригодно для производства древесностружечных плит без применения токсичных синтетических связующих. Качество прессованных материалов зависит от условий обработки растительного сырья P. tigrinus, и условий прессования.

Механизмы деградации лигнина зависят от природы лигноцеллюлозного сырья. Важную роль для твердофазного культивирования P. tigrinus и образования химических связей при прессовании сырья играет рН среды, оптимальным является рН 6,2. Базидиомицет вызывает глубокие изменения в лигниновой части лигноцеллюлозных субстратов. На начальном этапе культивирования в лигнине древесного сырья происходят полимеризационные процессы, и лишь затем идет деструкция полимера.

Показано, что важную роль в образовании химических связей между древесными частицами, обработанными P. tigrinus, играют лигнин, продукты его биодеградации и гемицеллюлозы, а также белки и полисахариды базидиомицета. Вероятно, влияние на этот процесс оказывают и свободные радикалы, образующиеся при разложении лигнина.

Модификация мицелиальных отходов производства пенициллина НС1 и NaOH позволяет получить клеевые композиции. Адгезивные свойства отходов обусловлены присутствием белков и полисахаридов. Свойства клеевых композиций зависят от условий модификации и соотношения компонентов. Разработаны технические условия для получения клеевых композиций из отходов производства антибиотиков и кровезаменителей. По своим физико-химическим параметрам полученные клеевые композиции не уступают костному и декстриновому клеям. Клей можно использовать для покрытия шпоном ДСП полученных биотехнологическим способом.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кадималиев, Давуд али-оглы, Москва

1. Аксенова Э.Н., Андрианова О.П., Арзамасцев А.П., Коваленко Л.И., Митрягина С.Ф., Печенников В.М., Рыженкова А.П., Чернова С.В. Руководство к лабораторным занятиям по фармацевтической химии./Под ред. А.П.Арзамасцева.-М.:Медицина.,1987.-304с.

2. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии./Под ред. А.Я.Николаева.-М.:Высш.шк., 1988.-239с.

3. Александрова Г.П., Петров А.Н., Медведева С.А., Бабкин В.А. Отбор лигнинразрушающих грибов для биотехнологических процессов .;. //Прикл.биохим.микробиол.-1998.-Т.34.-№3.-С.270-275.

4. Анисимова А.А., Леонтьева А.Н., Александрова И.М. Биохи-мия.М. :Высш.шк., 1986.-551 с.

5. Анненков В.Ф., Гук В.К., Янцо В.М. Изготовление прессованных деталей и изделий из отходов древесины. Киев: TexHika, 1986. - 112 с.

6. Ахмедова З.Р. Целлолитические, ксиланолитические и лигнолитические ферменты гриба Pleurotus ostreatus. II Прикл. биохим.микробиол. -1994.-Т.ЗО.- С.42-48.

7. Ахмедова З.Р., Белецкая О.П., Далимова Г.Н., Халикова М.М., Азим-ходжаева М.Н., Давранов К.Д., Шарипова А. Отбор и культивирование целлюлозо- и лигнинразрушающих грибов // Микробиология.- 1994.-Т.63, N 5.- С. 929-936.

8. Бабицкая В.Г. Ферментативная деструкция лигнина, содержащегося в растительных субстратах мицелиальными грибами // Прикл. био-хим.микробиол.- 1994.- Т. 30.- №6.- С. 827-835.

9. Бабицкая В.Г., Стахеев И.В. Изучение условий биотрансформации лигноцеллюлозных субстратов мицелиальными грибами в условиях твердофазной ферментации // Прикл.биохим.микробиол. -1986.- Т. 22.- №4.-С. 470-478.

10. Бабицкая В.Г., Щерба В.В. Деградация природных полимеров мицели-альными грибами продуцентами биологически активных веществ // Прикл. биохим. микробиол.- 1991.- №5.- С. 687-694.

11. Бабицкая В.Г., Щерба В.В. Особенности деградации лигнина природных полимеров ксилотрофами и почвенными сапротрофами // Микробиология. 1994. - № 1. - С.65-72.

12. Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Осадчая О.В. Антиокислительная активность некоторых микро- и макромицетов деструкторов лигноцеллюлозных субстратов // Прикл. биохим. микробиол.- 1997.- Т. 33.- №5.- С. 559-563.

13. Бабичева А.Ф., Дрегваль Г.Ф. Газохроматографическое определение фенола и формальдегида в воде, в водных вытяжках и в воздухе.//Гигиена. санитар.-1990.-№2.-С.90-91.

14. Бадалян С.М. Систематика, биоэкология и физиологическая активность серно-желтого опенка. Ереван: Ереванский Университет, 1993.- 196 с.

15. Базарнова Н.Г., Галочкин А.И., Глебов Л.Ю. Прессованные материалы из гидротермически обработанной древесины осины и ангидридов ди-карбоновых кислот // Химия раст. сырья. 1997а. - Т.1.- №2. - С. 15-22.

16. Базарнова Н.Г., Галочкин А.И. Крестьянников B.C. Влияние гидротермической обработки древесины на свойства древесных прессованных материалов // Химия раст. сырья. 19976. -Т. 1.- № 1. - С. 11 -16.

17. Базарнова Н.Г., Галочкин А.И., Крестьянников B.C. Влияние мочевины на свойства прессованных материалов из древесины, подвергнутой гидротермической обработке // Химия раст. сырья. —1997в. -Т.1.- №1.- С.22-30.

18. Базарнова Н.Г., Ефанов М.В. Исследование содержания связанных ацильных групп в основных компонентах ацилированной древесины //Химия раст. сырья. 1999. - №1. - С. 99-106.

19. Баскакова А.А., Яковлев П.А. Изучение динамики образования белков в процессе роста и развития P.ChrysogeniumJМат-лы научн.конф.итоги 1959г.Л.:Изд-во ЛХФИ.-1960.-С.5-9.20

Информация о работе

Кадималиев, Давуд али-оглы
доктора биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.23

Диссертация

Биотехнология нетоксичных композиционных материалов из отходов растительного сырья и микробиологической промышленности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Биотехнология нетоксичных композиционных материалов из отходов растительного сырья и микробиологической промышленности - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы