Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка комплексного метода рекультивации нефтезагрязненных почв

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Разработка комплексного метода рекультивации нефтезагрязненных почв"

На правах рукописи

КОКАНИНА АНАСТАСИЯ ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО МЕТОДА РЕКУЛЬТИВАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ

03.02.08 - Экология (в химии и нефтехимии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2012

005046901

005046901

Работа выполнена на кафедре физической и коллоидной химии Российского государственного университета нефти и газа имени И.М. Губкина и в лаборатории биосинтеза биологически активных соединений НИИНА им. Г.Ф. ГаузеРАМН.

Научный руководитель:

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, Винокуров Владимир Арнольдович

доктор биологических наук, Краснопольская Лариса Михайловна

доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой биотехнологии МГУ инженерной экологии, Бирюков Валентин Васильевич

доктор технических наук, профессор кафедры промышленной экологии РГУ нефти и газа имени И.М. Губкина, Мазлова Елена Алексеевна

Ведущая организация: Открытое Акционерное Общество

«Всероссийский Научно-исследовательский Институт по Переработке Нефти» (ОАО «ВНИИ НП»)

Защита диссертации состоится 26 июня 2012 г. в -/2. часов в аудитории 202 на заседании диссертационного совета Д 212.200.12 при Российском государственном университете нефти и газа имени И.М. Губкина по адресу: 119991, ГСП-1, г. Москва, Ленинский проспект, д. 65.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного университета нефти и газа имени И. М. Губкина.

Автореферат разослан « » мая 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат технических наук ^..■•'/" '—- Иванова Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Проблема разливов углеводородов нефтяного происхождения, в результате которых большие массы токсичных соединений попадают в почву и воду, занимает особое место. В России существует устойчивая тенденция к увеличению аварийности промышленных производств, связанных с переработкой углеводородного сырья или применением больших объемов растворителей на его основе, из-за несовершенства технологических процессов, изношенности оборудования, а также коррозии трубопроводных систем. По данным Международного социально-экологического союза, размеры утечек углеводородов на предприятиях нефтехимической, химической и нефтеперерабатывающей отраслей составляют от 1,5 до 11% от объемов годовой добычи жидкого углеводородного сырья. Содержание углеводородов в почве на территориях ряда предприятий достигает 4 т/га, а в среднем составляет около 1,8 т/га.

При рекультивации загрязненных углеводородами почвенных экосистем применяются различные методы: физико-химические, механические, биологические. На биологическом этапе рекультивации и при низкой концентрации углеводородов в почве, не превышающей 5-20%, в зависимости от типа почвы, используются препараты на основе бактерий - или дрожжей-деструкторов углеводородов, или же происходит стимулирование почвенных микроорганизмов за счет введения питательных веществ в загрязненную систему.

Основной проблемой при использовании известных биопрепаратов для рекультивации загрязненных углеводородным сырьем почв является снижение численности или даже полная гибель внесенных микробных популяций. Причинами этого могут быть вытеснение или выедание внесенных микроорганизмов местной почвенной микрофлорой, их вымывание из верхних почвенных горизонтов, неустойчивость углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) к ароматическим углеводородам.

Токсическое действие залпового характера углеводородов на местную

микробиоту, а также накопление в почве токсичных соединений значительно

снижает микробиологическую активность почв, в том числе ее

углеводородокисляющий потенциал. Кроме того, важным негативным

з

фактором являются низкие средние температуры основных промышленных регионов России, в особенности районов Восточной и Западной Сибири, где проблема углеводородного загрязнения почв стоит особенно остро. Это значительно ограничивает временной интервал активной работы известных биопрепаратов в процессе рекультивации.

В связи с этим большую актуальность для процессов рекультивации природных почвенных экосистем приобретает использование высших древоразрушающих грибов (базидиомицетов) как агентов-деструкторов углеводородов. Эти грибы способны вырабатывать широчайший спектр ферментов, расщепляющих такие сложные вещества, как, лигнин, целлюлоза, алканы, конденсированная ароматика, углеводороды других групп и т.д. В процессе роста они способны обеспечить доступ кислорода по почвенному профилю, что благоприятно сказывается на состоянии почвенной экосистемы и развитии флоры и фауны почвы, процессах восстановления экосистем после негативной техногенной нагрузки. Базидиомицеты, образуя консорциум с представителями аборигенной микробиоты почвы или УОМ промышленных биопрепаратов, способны усваивать чужеродные для живых организмов химические вещества (ксенобиотики), в том числе многочисленные токсичные соединения, не доступные для окисления другим группам организмов почвенной экосистемы. Кроме того, в составе указанных грибов содержится большое количество питательных веществ и микроэлементов, которые могут быть полезными для обитателей микробиоценоза почвы.

Эффективность исследуемых биодеструкторов на основе высших древоразрушающих грибов для восстановления почвенных экосистем может быть значительно увеличена за счет объединения в одном препарате бактериальных и грибных организмов или продуктов их метаболизма. Более широкий температурный диапазон, в котором исследуемые грибные организмы сохраняют достаточно высокую активность (до 5-10°С) также способствует повышению эффективности биопрепаратов на их основе.

Таким образом, высшие нетоксигенные грибы, способные утилизировать широкий набор различающихся по химической природе субстратов и являющиеся источником разнообразных питательных веществ и микроэлементов, представляются весьма актуальными и перспективными

объектами-деструкторами углеводородов в практике рекультивационных мероприятий загрязненных почв.

Цель работы и задачи исследования

Основная цель данного исследования заключалась в разработке метода рекультивации загрязненных углеводородами почв за счет совместного применения биодеструкторов на основе высших древоразрушающих грибов и УОМ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести отбор видов и штаммов высших древоразрушающих грибов, способных колонизировать загрязненный углеводородами субстрат -потенциальных биодеструкторов углеводородов;

2. Разработать систему оценки и провести изучение способности отобранных объектов к деструкции углеводородов различной структуры;

3. Выявить аспекты взаимодействия между исследуемыми биодеструкторами и УОМ в процессе их жизнедеятельности - совместный нефтедеструктивный потенциал;

4. Провести оценку деструкции углеводородов при комплексном воздействии биодеструкторов и УОМ на ксенобиотики;

5. Оценить деструкцию углеводородов отобранными грибными биодеструкторами в условиях полевых испытаний.

Научная новизна

Впервые установлено, что более интенсивное восстановление нефтезагрязненных почв за счет отобранных биодеструкторов вызвано спецификой их развития как на поверхности, так и в объёме загрязненного субстрата.

Показана возможность совместного применения исследованных грибных биодеструкторов и УОМ промышленного биопрепарата «Деворойл» с целью интенсификации процессов восстановления загрязненных почвенных экосистем.

Впервые установлена высокая устойчивость отобранных штаммов грибов к токсическому действию полиароматических углеводородов (ПАУ) в высокой концентрации (2 % масс.).

Практическая значимость

Доказана эффективность окисления углеводородов отобранными биодеструкторами в условиях лабораторных и полевых испытаний. Натурные испытания показали, что биодеструкторы на основе исследуемых представителей высших древоразрушающих грибов могут являться основой для создания высокоэффективного комплексного биопрепарата для ликвидации разливов углеводородов и применяться в технологиях рекультивации почв как самостоятельные углеводородные биодеструкторы.

Результаты, полученные в данной работе, могут иметь значение как для проведения биологического этапа технологических работ по рекультивации загрязненных углеводородами почв, а также могут использоваться в качестве учебных материалов для чтения курса лекций по промышленной экологии: «Охрана почв, рекультивация земель и утилизация отходов на предприятиях нефтепереработки, нефтехимии и газохимии», «Экологические проблемы нефте- и газопереработки и нефтехимии», «Промышленная экология».

Апробация работы

Основные результаты исследований были представлены в докладах и презентациях на российских и зарубежных научных конференциях: III Международная научная конференция «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 24-28 мая 2010г.); SPE Russian Oil and Gas Conférence and Exhibition (October 26-28, 2010, Moscow); Вторая международная студенческая научная и практическая конференция «Нефтегазовые горизонты» (Москва, 6-7 декабря 2010г.); Первый Российский Нефтяной Конгресс (Москва, 14-16 марта 2011г); 65-ая международная студенческая научная конференция «Нефть и газ 2011» (Москва, 11-14 апреля 2011г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, 2 тезиса докладов конференций и 3 доклада в сборниках материалов научно-технических конференций.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из аннотации, списка сокращений, введения, трех глав, заключения, списка использованной литературы, трех приложений. Библиография включает наименований 119, в том числе 33 иностранных источника. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами, 28 рисунками.

Работа посвящается памяти моей мамы Коканиной Анны Прокопьевны, которая подарила мне жизнь, была надежной опорой и поддержкой для меня каждую минуту своей жизни и сделала все, чтобы эта работа была завершена.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснованы целесообразность, перспективность и экологическая направленность в проведении исследований, связанных с технологиями рекультивации загрязненных углеводородами почв за счет применения высших древоразрушающих грибных биодеструкторов, предложены возможные варианты их использования на биологическом этапе рекультивации почв.

Первая глава посвящена обзору современного состояния изучаемой проблемы, анализу результатов исследований в области биологического этапа рекультивации загрязненных углеводородами почв, а также роли грибных препаратов в процессах восстановления загрязненных ксенобиотиками почв.

Освещены данные статистики разливов углеводородов на территории Российской Федерации. Приведены методы восстановления загрязненных углеводородами почв и особенности их применения. Дана характеристика наиболее известных биопрепаратов для ликвидации разливов углеводородов.

Уделено внимание роли представителям высших древоразрушающих грибов как биодеструкторам углеводородов в процессах восстановления загрязненных углеводородами почвенных экосистем. Показано, что грибные древоразрушающие биодеструкторы обладают значительным потенциалом для применения их в практике рекультивации загрязненных углеводородами почв, поскольку в природных условиях используют лигнин (биополимер, имеющий в своем составе ароматические кольца) как источник углерода и энергии, а также способны деградировать широкий спектр поллютантов.

Деградация ксенобиотиков в природе под действием лигнолитических ферментов высших древоразрушающих грибов является процессом, интенсивное изучение которого, прежде всего, вызвано потребностями создания экологически безопасных технологий. Несмотря на то, что исследования деструкции ароматических соединений грибами, например, белой гнили, проводятся довольно давно, до настоящего времени сведения о деградации широкого спектра углеводородов нефти высшими древоразрушающими грибами в почве крайне ограничены.

Таким образом, принимая во внимание ситуацию в отрасли на сегодняшний день, ее потребности и изложенные выше положения, применение биодеструкторов на основе высших древоразрушающих грибов для восстановления почв, загрязненных углеводородами и углеводородными растворителями, представляется весьма перспективной и актуальной областью научных исследований.

Во второй главе приведено описание лабораторных установок, методик проведения экспериментальных исследований, применяемых методов анализа и обработки полученных результатов.

Объектами исследования выступали биодеструкторы на основе культур грибов класса базидиомцетов — группа высших древоразрушающих грибов (ксилотрофов), для которых характерным признаком является способность разрушать лигнин в процессе жизнедеятельности.

В качестве источников, содержащих УОМ, использовали промышленные биопрепараты для ликвидации нефтяных разливов «Родер» и «Деворойл». Биопрепарат «Родер» состоит из двух штаммов-деструкторов углеводородов из рода Rhodococcus, не патогенных для животных, растений и человека. Биопрепарат «Деворойл» представляет собой ассоциацию непатогенных штаммов УОМ, принадлежащих к родам Rhodococcus (3 штамма), Pseudomonas, Candida.

В качестве модельных ароматических углеводородов использовали нафталин, фенантрен, пирен, псевдокумол, а также смесь углеводородов в виде сырой туркменской нефти со следующим содержанием углеводородов во фракциях НК-200 °С: парафиновых — 50-60 %, нафтеновых — 26-33 %, ароматических — 11-20 %. Во фракциях, выкипающих выше 200 °С,

содержание ароматики несколько выше. Относительная плотность нефти при 20 °С р420=0,864 г/мл.

В качестве моделей грунта, использовали кварцевый песок, рН сол. вытяжки - 6,9; почву Московской области (рН сол. вытяжки 6,5); торфогрунт (содержание питательных элементов, мг/л, не менее: азот (NH4+NO3) - 150; фосфор (Р205) - 270; калий (К20) - 300;) рН сол. вытяжки - 6,5; торфяную почву Западной Сибири, рН сол. вытяжки - 6,2.

Содержание нефтепродуктов в почве измеряли гравиметрическим методом в соответствии с РД 52.18.647-2003 «Определение массовой доли нефтепродуктов в почвах. Методика выполнения измерений гравиметрическим методом»; методом ИК-спектрометрии на концентратомере КН-2м в соответствии с ПНД Ф 16.1:2.2.22-98 «Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в почвах и донных отложения методом ИК-спектрометрии».

Содержание углеводородов в жидкофазной системе определяли гравиметрическим методом в соответствии с ПНД Ф 14.1:2.116-97 «Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах природных и сточных вод методом колоночной хроматографии с гравиметрическим методом»; методом ИК-спектрофотометрии в соответствии с ПНД Ф 14.1:2646168-2000 (2004) «Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в пробах питьевых, природных и очищенных сточных вод методом ИК-спектрофотометрии».

Микроскопию грибных препаратов проводили методом световой фазово-контрастной микроскопии.

Влияние экзометаболитов исследуемых биодеструкторов на культуры УОМ оценивали луночным методом по величине зоны задержки роста УОМ вокруг лунок с культуральными жидкостями грибных биодеструкторов.

Для проведения селективного отбора потенциальных биодеструкторов углеводородов культуры грибов выращивали на плотной питательной среде -глюкозо - картофельном агаре (ГКА). Для следующих экспериментов рабочий материал культуры биодеструкторов получали культивированием их в жидкой питательной среде состава, г/л: MgS04-7H20 - 0,5; КН2Р04 - 1; глюкоза - 20; мука пшеничная - 10; вода водопроводная- до 1000 мл. Среду стерилизовали в

9

автоклаве при 120°С в течение 1 часа. Твердофазное культивирование штаммов вели на соломе.

Контроль стерильности углеводородных сред осуществляли путём их посева на плотные питательные среды: ГКА и сусло-агар.

В третьей главе представлены результаты экспериментальных исследований по выявлению возможности совершенствования технологий рекультивации загрязненных углеводородами почв за счет применения исследуемых биодеструкторов.

В результате проведения селективного тестирования из имеющихся в коллекции грибов отобраны культуры, способные к росту на поверхности диагностического питательного субстрата на основе древесных опилок и углеводородных загрязнений в течение длительного промежутка времени. Первый компонент отвечал известным пищевым потребностям культур грибов и обеспечивал тем самым поддержание их вегетативного роста в ходе эксперимента. Второй компонент представлял собой нефть известного состава. В процессе эксперимента (14 суток при 27 °С, аэробные условия) проводили визуальный контроль скорости роста, интенсивности развития культур базидиальных грибов и способности колонизировать нефтяное пятно в условных баллах: 1 — отсутствие роста на лигноцеллюлозном субстрате с нефтяным загрязнением; 2-слабый рост на лигноцеллюлозном субстрате, отсутствие роста на нефтяном загрязнении; 3 — активное развитие на лигноцеллюлозном субстрате и медленный рост на нефтяном загрязнении; 4 -активное развитие на лигноцеллюлозном субстрате, развитие на части нефтяного пятна; 5 - интенсивное развитие с покрытием всей поверхности, заполненной нефтью.

Эксперимент выявил наиболее перспективные культуры грибов, которые быстро переходили с лигноцеллюлозного субстрата на нефтяное пятно и активно развивали на нем воздушный мицелий. Для дальнейших исследований из 15 были отобраны два штамма: Т. versicolor {Биодеструктор-1) и F. pinícola (Биодеструктор-2) - таблица 1.

Анализ отобранных грибных культур методом световой фазово-контрастной микроскопии подтвердил наличие на их мицелии пряжек -микроморфологических структур, характерных для представителей базидиомицетов.

Таблица 1 - Динамика колонизации загрязненного углеводородами нефти субстрата исследуемыми биодеструкторами

Вид, штамм биодеструкторов

Время,сутки

Ganoderma lucidum 1

Trametes versicolor

Pleurotus ostreatus 1

Fomitopsis pinicola

Следующий эксперимент подтвердил предположение о том, что отобранные биодеструкторы в процессе жизнедеятельности способны использовать углеводороды нефти как единственный источник углерода и энергии. В качестве субстрата взяли прокаленный кварцевый песок, что исключило возможность использования как источника углерода органические соединения, которые могли бы присутствовать в субстрате. В подготовленный песок внесли источник углеводородов - нефть. В ходе эксперимента оценивали увеличение площади колоний исследуемых биодеструкторов в течение трех недель. Для этого поверхность крышек чашек Петри с внешней стороны разлиновали на квадраты со стороной 1 см. Каждые три дня оценивали прирост

И

площади поверхности грунта, занятой биодеструктором. Структура эксперимента представлена в таблице 2.

Таблица 2 - Структура эксперимента «Исследование способности грибных биодеструкторов использовать углеводороды нефти как источник углерода и энергии». Содержание нефти в системе - 5 % масс.

Биодеструктор-1 Биодеструктор-2

опыт контроль опыт контроль

П,+Н+ БД П.+ БД П,+Н+ БД П,+ БД

Где П, - песок; Н - нефть; БД - биодеструктор

Увеличения площади, занятой Биодеструктором-2, в контроле не наблюдалось с 13 дня, в то время как в опыте он колонизировал новую поверхность до 16 дня включительно. Максимальная колонизированная биодеструктором в контроле площадь составила 7,2 балла. В опыте - 9,8 баллов. Разница между контролем и опытом составила 2,6 балла - рисунок 1:1.

>-—1

2,6

Время, сутки Контроль ♦ Опыт

Г

- т

V

- -[ —

6 9 12 15 18 21

Время, сутки А Контроль ■ Опыт

1 2

Рисунок 1 - Динамика роста базидиомицетов на прокаленном нефтезагрязненном песке: 1 — Биодеструктор-2; 2 - Биодеструктор-1 Увеличения площади, занятой Биодеструктором-1, в контроле не наблюдалось с 12 дня, в то время как в опыте он колонизировал новую поверхность до 18 дня включительно. Максимальная колонизированная биодеструктором в контроле площадь составила 7,9 балла, в опыте - 11 баллов. Разница между контролем и опытом составила 3,1 балла (рисунок 1: 2).

Таким образом, из двух биодеструкторов максимальную активность проявил последний. Разница в активностях деструкторов незначительна.

Результаты эксперимента наглядно демонстрируют способность обоих биодеструкторов использовать углеводороды нефти как источник углерода.

Количественная оценка способности отобранных биодеструкторов утилизировать углеводороды в нефтезагрязненной почве (содержание нефти в почве 5 % масс.) показала, что углеводородокисляющая активность обоих объектов примерно одинакова как в стерильной почве, так и в присутствии аборигенной микробиоты. Эксперимент проводился на модельной системе в чашках Петри в течение 3 недель. Результаты анализа почвы на остаточное содержание углеводородов нефти через три недели экспозиции представлены на рисунках 2, 3.

Таблица 3 - Структура эксперимента «Количественная оценка утилизации углеводородов грибами в почве». Твердофазное культивирование

опыт контроль

Биодеструктор-1 Биодеструктор-2

п2+бд+н п2+бд+н п2+бд+с

Где П2 - почва; Н - нефть; БД - биодеструктор; С - солома.

О 3 6 9 12 15 18 21 24

Время, сутки

-*-Биодеструктор-2 -Ш Биодестркутор-1 -к- Контроль

Рисунок 2 - Изменение суммарного

содержания углеводородов в экспериментальных образцах почвы. Стерильная почва

О 1 6 9 12 15 18 21 »

Время, сутки

-Биодеструнтор-2 -Ш Биодеструктор-1 -¡е-Контроль

Рисунок 3 - Изменение суммарного

содержания углеводородов в экспериментальных образцах почвы. Нестерильная почва

Разницы в нефтедеструктивной активности биодеструкторов не наблюдалось (рисунок 4). Это может свидетельствовать о том, что в нестерильной, изначально не загрязненной почве углеводородокисляющая микробиота сформирована не была за короткий промежуток времени. Однако факт высокой активности по отношению к утилизации углеводородов говорит о перспективности исследованных объектов как деструкторов углеводородов.

13

36 * 50.0

£ о

Биодеструктор-1 Биодеструктор-2 Контроль

Нестерильная почва

Стерильная

Рисунок 4 - Сравнительный анализ снижения углеводородов нефти в опытах с использованием отобранных биодеструкторов в различных условиях

Эксперимент выявил, что рост биомассы отобранных биодеструкторов наблюдался как на поверхности, так и в объеме нефтезагрязненного субстрата, что можно наблюдать на рисунке 5. Описанный выше рост наблюдали для обоих образцов.

1 2

Рисунок 5 - Рост биомассы исследуемых биодеструкторов: 1 — по поверхности нефтезагрязненного субстрата, 2 - в объеме нефтезагрязненного субстрата

Количественная оценка способности исследуемых биодеструкторов утилизировать углеводороды нефти в условиях погруженного культивирования (суммарное содержание углеводородов в культуральной жидкости 1 % масс.) показала, что оба штамма проявляют активность и в данных условиях. Эксперимент проводился на модельной системе в колбах на ротационной

качалке 2 недели. Результаты анализа остаточного содержания углеводородов нефти в жидкой фазе через две недели экспозиции представлены на рисунке 6.

Время, сутки

Биодеструктор-1 -*-Биодеструктор-2 -А- Контроль

Рисунок 6 - Изменение суммарного содержания углеводородов в экспериментальных образцах. Погруженное культивирование

70

¡S

к ш 60

п

v н so

а *

ш и

et со 40

0 со и О

Ф Ч 30

S о

1 а

Ш о * ? 20

s 2 X ш

и « 10

27,4

I

Контроль Биодеструктор-2 Биодеструктор-1

Рисунок 7 - Снижение содержания углеводородов нефти в опытах с

использованием отобранных биодеструкторов. Погруженное культивирование

Деструкция углеводородов нефти в контрольном образце составила 27,4 %. Количество утилизированных углеводородов нефти в опыте с Биодеструктором-1 составило 59,1 % по отношению к начальному содержанию углеводородов. Для экспериментального образца с Биодеструктором-2 это значение составляет 56,5 % соответственно. В этом эксперименте углеводородокисляющая активность Биодеструктора-1 была выше. Аналогичная тенденция наблюдалась и во всех предыдущих опытах.

Существенным источником поступления ПАУ в окружающую среду являются разливы углеводородов нефти и ароматических растворителей, при этом ПАУ могут накапливаться в экосистеме, поскольку очень важную роль играет их стабилизация в адсорбированном состоянии в почвах. Содержание ПАУ в окружающей среде может достигать опасного для живых организмов уровня, в том числе и для человека. Благоприятные условия для разложения ПАУ микроорганизмами создаются в присутствии кислорода, относительно высоких температурах и достаточном количестве питательных веществ.

Исследование устойчивости грибных биодеструкторов и УОМ к действию

полиароматических углеводородов (ПАУ) (концентрация ПАУ в системе 2 %

масс.) показало, что грибы проявляют высокую устойчивость к их токсичному

действию, в то время как для углеводородокисляющей микробиоты

15

биопрепаратов «Родер» и «Деворойл» данное свойство не замечено. Эксперимент проводили на модельной системе (почвогрунт: песок = 1:1 по массе) пластиковых контейнерах, навеска почвы 400 г. Модельный раствор ПАУ готовился путем растворения 50 % масс, смеси нафталина, фенантрена и пирена в равной массовой концентрации в псевдокумоле. Этот раствор в количестве 4% масс, добавляли к модельной почвенной смеси и равномерно перемешивали.

По истечении 30 суток с момента постановки опыта ни в опытных образцах, где в роли деструкторов углеводородов выступали УОМ промышленных биопрепаратов, ни в контрольных образцах почвы микробных форм жизни обнаружено не было. При использовании исследуемых грибных биодеструкторов была зафиксирована структура (поперечная пряжка), характерная для представителей класса базидиомицетов, что можно проследить на рисунке 8.

Рисунок 8 - Микрофотография Рисунок 9 - Внешний вид

Биодеструктора-1. Световая экспериментального образца почвы,

микроскопия, фазовый контраст (Х400) Биодеструктор-1

Экспозиция - 30 суток Отбор пробы - 30-е сутки эксперимента

В ходе исследования также был отмечен рост биомассы деструкторов на поверхности почвы после рыхления и перемешивания почвенных образцов (поднятие на поверхность глубинных слоев почвы), что можно увидеть на рисунке 9. Это еще раз подтверждает способность грибных биодеструкторов осуществлять жизнедеятельность не только по поверхности, но и в объеме нефтезагрязненного субстрата и возможности создания благоприятных условий для развития и жизнедеятельности нефтеокисляющих микроорганизмов.

1 2 Рисунок 10 - Адгезия УОМ биопрепарата «Деворойл» на поверхности грибного Биодеструктора-1, 1 — чистый препарат «Деворойл»; 2 - Биодеструктор-1 и препарат «Деворойл» Световая микроскопия, фазовый контраст (Х400)

С целью изучения взаимодействия друг на друга потенциальных компонентов биопрепаратов для ликвидации разливов углеводородов исследовали адгезию УОМ биопрепаратов «Деворойл» и «Родер» на поверхности грибного биодеструктора. Установлено, что УОМ с теми же морфологическими характеристиками, что и в суспензии биопрепарата, фиксируются на поверхности грибного биодеструктора (рисунок 10).

1 2 Рисунок 11 - Адгезия УОМ биопрепарата «Родер» на поверхности грибного

Биодеструктора-1, 1 - чистый препарат «Родер»; 2 — Биодеструктор-1 и препарат «Родер» Световая микроскопия, фазовый контраст (Х400)

УОМ другой таксономической принадлежности и других морфологических форм, являющиеся составляющей биопрепарата «Родер», также были способны прикрепляться к поверхности биодеструктора (рисунок 11).

■г О

¡ЙЕ

Отмечено, что адгезированные У ОМ продолжали делиться (рисунок 12). Это говорит о том, что соответствующие окружающие условия и среда являются благоприятными для развития и жизнедеятельности микроорганизмов. Данный факт подтверждает возможность создания комплексной технологии для ликвидации разливов углеводородов нефти и растворителей на их основе с использованием исследуемых грибных биодеструкторов. Явление адгезии обеспечит эффективное распространение УОМ в объеме почвы благодаря активно растущей биомассе деструкторов углеводородов по почвенному профилю. Проникая вглубь почвы, она создаст естественные магистрали для проникновения воды, воздуха и углеводородокисляющей микробиоты. Это явление, с одной стороны, увеличивает интенсивность биодеградации углеводородов нефти в объеме грунта, а с другой - создает благоприятные условия для процесса восстановления биоценоза почвы в целом.

Рисунок 12 - Деление адгезированных Рисунок 13 - Влияние метаболитов

УОМ препарата «Деворойл» на биодеструкторов на УОМ (препарат поверхности Биодеструктора-1. «Деворойл»)

Световая микроскопия, 1 - Биодеструктор-1;

фазовый контраст (Х400) 2 - Биодеструктор-2

Известно, что грибы способны продуцировать антибиотические вещества, обладающие специфичностью действия к чувствительным к ним культурам микроорганизмов. Установление специфики влияния продуктов жизнедеятельности отобранных грибных биодеструкторов на УОМ промышленных биопрепаратов и возможности их объединения в одном препарате с целью повышения интенсивности процессов восстановления загрязненных углеводородами почв показало следующие результаты.

Биодеструктор-2 не подавлял рост УОМ биопрепарата «Деворойл» (рисунок 13). Фильтрат культуральной жидкости Биодеструктора-1 проявлял антибиотическую активность в отношении УОМ биопрепарата. Однако, незначительный диаметр зоны угнетения роста, не превышающий 10 мм, свидетельствует о возможности использования данного биодеструктора вместе с УОМ биопрепарата для деструкции углеводородов.

В то же время известно, что под воздействием продуктов жизнедеятельности многих грибов бактерии способны активизировать свои метаболические процессы, в том числе ферментативную деятельность. Эксперимент, направленный на определение возможности утилизации углеводородов нефти при совместном действии на них грибных биодеструкторов и УОМ, был проведен в условиях погруженного культивирования.

Изучение накопления биомассы исследуемых биодеструкторов показало, что ее выход увеличивается при внесении в питательную среду углеводородов нефти. В контрольных точках показатель роста биомассы в колбах с биодеструктором и углеводородами нефти (содержание в системе 1 % масс.) превышал его аналогичное значение в опыте без углеводородов, что косвенным образом свидетельствует о том, что грибы использовали углеводороды в качестве источника питания. В то же время было установлено, что присутствие УОМ затормаживало прирост биомассы биодеструкторов по сравнению с его приростом в точках контроля в аналогичных опытах в отсутствии УОМ. (рисунок 14: 1,2).

Этот факт свидетельствует о том, что оба компонента конкурируют за доступный питательный субстрат, в том числе углеводороды нефти. Многие более устойчивые к окислению алканы, циклоалканы и голоядерные ароматические углеводороды в виде моносубстратов не потребляются микроорганизмами, а разлагаются в режиме со-окисления с другими более доступными углеводородами.

Время, сутки — Биодеструнтор-2 • Биодеструнтор-2 + нефть ■ Биодеструнтор-2 + УОМ + нефть

Время, сутки — Биодеструктор-1

■ • Биодеструктор-1 * нефть

■ Биодеструктор-1 + УОМ * нефть

1 2

Рисунок 14 - Динамика накопления биомассы грибами в присутствии УОМ препарата «Деворойл»: 1 — Биодеструктор-1', 2 — Биодеструктор-2

Таким образом, можно предположить, что в данном случае имеет место конкуренция за доступный питательный субстрат в начале эксперимента с последующей адаптацией деструкторов углеводородов к условиям среды посредством установления «выгодной» стратегии использования источника питания: грибы, обладая мощной ферментной системой, трансформируют менее доступные для УОМ углеводороды в более привлекательные с точки зрения способности УОМ к их окислению. Данное предположение подтверждают результаты, полученные в следующих экспериментах.

Выявлен синергетический эффект при утилизации углеводородов УОМ и грибными биодеструкторами в условиях погруженного культивирования (содержание углеводородов в системе 1 % масс.). Несмотря на условия конкуренции между двумя компонентами-деструкторами углеводородов за питательный субстрат, наибольшее значение биодеструкции углеводородов было замечено в опыте с их совместным культивированием. Контролем в этой серии экспериментов служила стерильная нефть без добавления нефтеокисляющих агентов. Контроль был выполнен в двух вариантах: при постоянном перемешивании и в стационарных условиях, при этом разница в уровне естественной убыли нефти выявлена не была. Активность обоих исследуемых биодеструкторов зафиксирована на достаточно высоком уровне. Анализ на остаточное содержание углеводородов в системе проводили гравиметрическим методом (рисунок 15: 1,2).

Время, сутки —Биодеструктор-1 + нефть ~Ш~УОМ + нефть

■•А- Биодеструктор-1 + УОМ + нефть

Время, сутки Биодеструктор-2 + нефть ■~Ш~УОМ + нефть

Биодеструктор-2 + УОМ + нефть

1 2

Рисунок 15 - Динамика снижения содержания углеводородов нефти в системе под воздействием изучаемых биодеструкторов. Жидкофазное культивирование.

1 - Биодеструктор-1; 2 - Биодеструктор-2

Максимальный эффект по снижению содержания углеводородов нефти в культуральной жидкости наблюдается когда на загрязненный субстрат воздействуют деструкторы различного происхождения - грибной и УОМ биопрепарата «Деворойл». Для Биодеструктора-/(БД-1) это значение достигает 74,3 %, в случае Биодеструктора-2 (БД-2) деструкция нефти при синергетическом воздействии составила 71,2%. Когда деструкторы работали самостоятельно, снижение нефти в почве в опыте для Биодеструктора-1 составило 51,3%, для Биодеструктора-2 - 47,4%, для биопрепарата «Деворойл» - 62,0 % соответственно. Тенденция отображена на рисунке 16.

Рисунок 16 - Сравнительный анализ деструкции углеводородов нефти в опытах с использованием отобранных биодеструкторов и УОМ. Погруженное

культивирование

Контроль Бл ' —. / ^

УОМ

БД + УОМ

Таким образом, совместное применение грибных биодеструкторов и УОМ препарата «Деворойл» обеспечило более активную утилизацию углеводородов нефти, несмотря на снижение биомассы исследуемых биодеструкторов. Возможно, этот факт следует рассматривать, как предпосылку для снижения нагрузки на естественную микробиоту почвы при обработке ее известными нефтеокисляющими биопрепаратами.

Для проведения полевых испытаний был получен опытный образец биопрепарата на основе Биодеструктора-1, показавшего наибольшую активность в лабораторных исследованиях. Для получения биопрепарата биодеструктор получали на лигноцеллюлозном субстрате в полипропиленовых пакетах, снабженных фильтром.

Испытания биопрепарата проводили в летний период 2011 года на нефтезагрязненном участке Ватинского месторождения, ХМАО в течение трех недель. Расход биопрепарата составил 125 г/м2 почвы при его влажности 74 %. Среднесуточная температура окружающего воздуха в течение времени проведения эксперимента составляла 20-22 °С. Результаты, полученные в ходе проведения испытания, приведены в таблице 4 и на рисунке 17.

Таблица 4 - Изменение содержания углеводородов нефти в почвенных образцах экспериментального участка

Вариант Содержание углеводородов в почве, % массовый Снижение содержания углеводородов, %

Начало эксперимента Конец эксперимента

Опыт 4,7 ±0,5 1,8 ±0,2 62,8

Контроль 4,6 ± 1,0 4,2 ± 1,4 8,6

гк ' 62,8

54,2 ■ 1

* !-> 50'° о X 5Г и

0 со u о | ^ 30,0 х а | | 20,0 1 8 ■ ■ 9

бй В I

8,6 1 1

> нш I

Контроль Биодеструктор Опыт

Рисунок 17 - Изменение содержания углеводородов на экспериментальном

участке на момент окончания эксперимента 22

Сохранение высокой нефтеокисляющей активности биодеструкторов при содержании нефтепродуктов в почвенной экосистеме на уровне 5 % массовых, и эффективное их окисление за 3 недели экспериментальных работ говорит о том, что исследуемые биодеструкторы могут применяться для ликвидации разливов углеводородов как самостоятельно, так и в комплексе с УОМ. Применение лигноцеллюлозных материалов (солома, опилки) в качестве ростового субстрата для грибных биодеструкторов положительно влияет на процессы восстановления почвенных экосистем, а так же позволяет решить вопросы утилизации лигноцеллюлозсодержащих отходов промышленности.

Вместе с тем, комплексное решение проблем восстановления почвенных экосистем за счет применения грибных биодеструкторов решает и экологическую составляющую вопроса - система не подвергается угнетающему воздействию чужеродных агентов: как ростовой субстрат деструктора, так и сам деструктор представляют собой часть почвенного ценоза.

В заключении представлены выводы по проведенным исследованиям, оценка полноты решения поставленных задач и предложения по дальнейшему использованию результатов диссертации.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

• Разработан комплексный метод рекультивации нефтезагрязненных почв с использованием базидиальных грибов, утилизирующих углеводородные загрязнения.

• Предложен селективный метод определения активности базидальных грибов, колонизирующих углеводородные загрязнения, выделены наиболее эффективные - Т. versicolor {Биодеструктор-1) и F. pinícola (Биодеструктор-2), способные использовать в качестве единственного источника углерода углеводороды нефти.

• Количественно оценена степень разложения углеводородов нефти биодеструкторами на основе грибов в стерильной и нестерильной почве. Эффективность очистки Биодеструктором-1 составила 58 % в стерильной и 56 % в нестерильной почве за три недели эксперимента. Для Биодеструктора-2 эти показатели составили 46 % и 44 %, соответственно.

• Доказано, что совместное применение биодеструкторов и промышленного

биопрепарата «Деворойл» приводит к интенсификации процесса

23

восстановления нефтезагрязненных почвенных экосистем, продукты метаболизма грибов не оказывают угнетающего влияния на углеводородокисляющие микроорганизмы.

• Показан синергетический эффект при совместном применении исследуемых грибных биодеструкторов и УОМ в экспериментах деструкции углеводородов нефти в условиях погруженного культивирования. Сравнение эффективности применения биодеструкторов и комплекса биодеструктор-УОМ показало увеличение деструкции углеводородов нефти за 9 суток эксперимента от 51,3 до 74,3 % для Биодеструктора-1 и от 47,4 до71,2 % -для Биодеструктора-2.

• Влияние полиароматических соединений на исследуемые грибные биодеструкторы, в отличие от промышленных микробных биопрепаратов, незначительно, они способны активно развиваться в почве с содержанием полиароматических углеводородов до 2 % масс.

• Определено, что Биодеструктор-1 сохраняет высокую нефтедеструктивную активность в условиях полевых испытаний Ватинского месторождения (Западная Сибирь) при содержании углеводородов нефти в почве 5 % массовых: деструкция углеводородов нефти в системе под воздействием биопрепарата на его основе составляет 54,2 % за 3 недели.

Основные положения диссертации изложены в следующих работах:

1. Винокуров В.А., Ботвинко И.В., Барков A.B., Сребняк Е.А., Фролова М.А., Никитин Д.А., Стексова Е.В., Панкратова М.А., Коканина A.B.. Арапов К.А., Татаринов A.M., Новиков A.A., Котелев М.С., Бородина О.М., Чжан Данянь. Биотехнологические альтернативы традиционным технологиям в нефтегазовой отрасли // Труды РГУ нефти и газа имени И.М. Губкина. -2009. - №2(255) - С.45-57.

2. Заявка на получение патента РФ. Штамм гриба Fomitopsis Pinícola (Sw.; Fr.) P.Karst. INA 01068, обладающий способностью к деструкции углеводородов нефти и биоремедиации нефтезагрязненных почв, способ получения его биомассы и биомасса гриба. Краснопольская JI.M., Автономова A.B., Леонтьева М.И., Барков A.B., Винокуров В.А., Новиков A.A., Коканина A.B. // Заявка № 2010138985. Заявлено 22.09.2010. (По данным на 23.05.2012 состояние делопроизводства: экспертиза по существу)

3. A.B. Коканина. М.Ю. Марченко, A.B. Барков, М.И. Леонтьева, A.B. Автономова, В.А. Винокуров, Л.М. Краснопольская. Возможности использования базидиальных грибов с целью повышения эффективности

рекультивации нефтезагрязненных почв // Башкирский химический журнал.-2010-Том 17-№3-С. 123-129.

4. А.В. Барков, М.И. Леонтьева, Е.А. Некрасова, А.В. Савин, А.В. Коканина. Л.М. Краснопольская. Микобиотехнологический метод утилизации отходов производства биоэтанола // Башкирский химический журнал. - 2010 -Том 17 -№3 - С. 130-135.

5. Ивасишин П.Л., Марютина Т.А., Коканина А.В., Савонина ЕЛО. Эффективность использования биопрепаратов, сорбентов, гуматов при рекультивации участков Самотлорского месторождения // III Международная научная конференция «Современные проблемы загрязнения почв»: Сборник материалов, 24-28 мая 2010г. - М.: МГУ - 2010 - С. 512.

6. А.У. Kokanina, M.I. Leont'yeva, A.V. Barkov, L.M. Krasnopolskaya, V.A. Vinokurov. Possibility of Using Basidiomycetes for Enhancing Efficiency of Oil-contaminated Land Recultivation // SPE Russian Oil and Gas Conference and Exhibition, October 26-28, 2010, Moscow, Russia.

SPE Library Paper 138082-MS. Possibility of Using Basidiomycetes for Enhancing Efficiency of Oil-contaminated Land Recultivation. Digital object identifier 10.2118/138082-MS.

7. А.В. Коканина. B.A. Винокуров. Новый подход к рекультивации нефтезагрязненных почв за счет применения базидиальных грибов // Вторая международная студенческая научная и практическая конференция «Нефтегазовые горизонты»: Сборник материалов, 6-7 декабря 2010г. - М.: РГУНГ имени И.М. Губкина - 2010 - С.211 (Третье место).

8. Коканина А.В., Барков А.В., Краснопольская Л.М., Винокуров В.А. Новые технологические решения в процессах рекультивации нефтезагрязненных почв. // Первый российский нефтяной конгресс: Сборник материалов, 14-16 марта 2011г. - г. Москва, 2011 - С. 228-231 (Диплом за активное участие в работе конгресса).

9. А.В. Коканина. А.В. Барков, Л.М. Краснопольская, В.А. Винокуров. Восстановление нефтезагрязненных почв: комплексный подход к решению задач повышения эффективности процессов // 65-я международная студенческая научная конференция «Нефть и газ 2011»: Сборник тезисов, 1114 апреля 2011г. - М.: РГУНГ имени И.М. Губкина - 2011 - С.8 (Диплом лауреата).

Благодарю своих дедушку Каракчиева П.С. (ветеран ВОВ, разведчик Калининского фронта) и бабушку Каракчиеву Н.В. (ветеран ВОВ, зенитчица Мурманского фронта) за то, что я могу жить и работать под мирным небом над головой.

Благодарю родных, друзей и близких за поддержку.

Благодарю всех, кто принимал участие в работе, за поддержку и ценные советы.

Коканина Анастасия Владимировна

Разработка комплексного метода рекультивации нефтезагрязненных

Подписано в печать 24.05.2012. Формат 60x84 1/16. Печать трафаретная. Уч.-изд. л. Объём 1 и.л. Тираж 100 экз. Заказ № 7401. Отпечатано в типографии «11-й ФОРМАТ» 115230, г. Москва, Варшавское ш., д. 36.

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Коканина, Анастасия Владимировна

АННОТАЦИЯ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ТЕХНОЛОГИИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПОЧВ, ПОДВЕРЖЕННЫХ УГЛЕВОДОРОДНОМУ ЗАГРЯЗНЕНИЮ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1 Борьба с последствиями разливов нефти.

1.1.1 Причины и статистика нефтяных разливов.

1.1.2 Экологические последствия загрязнений нефтью природных почвенных экосистем.

1.1.3 Технологии восстановления нефтезагрязненных почв.

1.2 Механизмы деградации ксенобиотиков в почве на примере нефти, как сложной системы химических веществ.

1.2.1 Деструкция нефти под воздействием микроорганизмов.

1.2.2 Математическое моделирование процессов биодеструкции углеводородов в нефтезагрязненной почве.

1.3 Биопрепараты, применяемые в промышленности, с целью восстановления подверженных углеводородным загрязнениям почв.

1.4 Роль высших древоразрушающих грибов (ксилотрофных базидиомицетов) в процессах восстановления нефтезагрязненных почв.

1.4.1 Трансформация лигноцеллюлозных материалов и ксенобиотиков различной химической природы базидиальными грибами.

1.4.2 Возможности восстановления экологического равновесия почвенных экосистем, загрязненных углеводородсодержащими средами, с помощью базидиальных грибов.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Материалы, объекты и методы проведения исследований.

2.2 Методики проведения исследований.

2.2.1 Выбор потенциальных биодеструкторов углеводородов.

2.2.2 Исследование способности отобранных объектов использовать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода.

2.2.3 Количественная оценка утилизации углеводородов нефти отобранными биодеструкторами в почве.

2.2.4 Количественная оценка утилизации углеводородов нефти отобранными биодеструкторами в условиях погруженного культивирования.

2.2.5 Изучение влияния ПАУ на активность исследуемых биодеструкторов и УОМ промышленных биопрепаратов.

2.2.6 Исследование адгезии УОМ на поверхности отобранного биодеструктора.

2.2.7 Исследование возможности совместного применения исследуемых биодеструкторов и УОМ промышленных биопрепаратов для восстановления загрязненных углеводородами почв

2.2.8 Оценка деструкции углеводородов нефти при совместном применении отобранных биодеструкторов и УОМ промышленного биопрепарата «Деворойл».

2.2.9 Полевые испытания биодеструктора.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Выбор потенциальных биодеструкторов углеводородов.

3.2 Исследование способности отобранных объектов использовать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода.

3.3 Количественная оценка утилизации углеводородов нефти отобранными биодеструкторами в почве.

3.4 Количественная оценка утилизации углеводородов нефти отобранными биодеструкторами в условиях погруженного культивирования.

3.5 Изучение влияния ПАУ на активность исследуемых биодеструкторов и УОМ промышленных биопрепаратов.

3.6 Исследование адгезии УОМ на поверхности отобранного биодеструктора.

3.7 Исследование возможности совместного применения исследуемых биодеструкторов и УОМ промышленных биопрепаратов для восстановления загрязненных углеводородами почв

3.8 Оценка деструкции углеводородов нефти при совместном применении отобранных биодеструкторов и УОМ промышленного биопрепарата «Деворойл».

3.9 Полевые испытания биодеструктора.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка комплексного метода рекультивации нефтезагрязненных почв"

Несмотря на все возрастающие темпы потребления, в последние десятилетия запасы углеводородного сырья остаются на высоком уровне (доказанные запасы нефти на начало XXI века составляют 140 млрд. т [1]), не прекращается строительство новых трубопроводов, увеличиваются объемы добычи и транспортировки нефти. Все это неизбежно сопровождается возникновением различного рода аварийными ситуациями, в результате которых углеводороды нефтяного происхождения попадают в различные экосистемы: атмосфера, почва, акватории. Наибольшее воздействие на окружающую среду оказывается при аварийных ситуациях на трубопроводах в результате нарушения их герметичности - разрыва трубопровода [2]. Из-за низкой эффективности способов борьбы с коррозией срок службы трубопроводов составляет от нескольких месяцев до 5-10 лет, т.е. надежность системы значительно ниже нормативной. Площади загрязнения от разлитой нефти варьируются от 0,01 до 10 га на одну аварию, а объем потерянной нефти достигает 17000-20000 т. Ежегодно происходит более 60 категоризированных аварий, а с учетом промысловых эта цифра возрастает до 30 тыс. случаев с соответствующими экологическими последствиями[3]. Таким образом, загрязнение окружающей среды в процессе добычи и транспортировки углеводородного сырья сегодня является объективным фактором и требует разработки эффективных мер по предотвращению такого загрязнения и ликвидации его последствий.

Аналогичные негативные последствия наблюдаются в нефтехимической и химической отраслях, в которых доля углеводородов, используемых в качестве сырья, полупродуктов или растворителей очень высока. Значительные утечки углеводородов в этих отраслях наблюдаются на всех стадиях производства, начиная от хранилищ и заканчивая транспортировкой конечной продукции.

При ликвидации нефтяных разливов с целью восстановления почвенных экосистем применяют механические, физико-химические и биологические методы. Конечно, ни один из реализуемых на практике методов в отдельности не является эффективным на сто процентов и не позволяет достичь фоновых концентраций углеводородов в почве, поэтому специалисты на всех этапах рекультивации нефтезагрязненных экосистем применяют комплекс различных методов, с помощью которых удается повысить эффективность рекультивационных работ. На биологическом этапе рекультивации и при низкой концентрации углеводородов в почве, не превышающей 5-20%, в зависимости от типа почвы, используются биопрепараты на основе бактерий-деструкторов углеводородов, или же происходит стимулирование почвенной микробиоты за счет интродукции в загрязненную систему биогенных элементов и добавок. С недавних пор получило развитие новое направление биоремедиации - использование грибов в рекультивации нефтезагрязненных почв. Применение высших древоразрушающих грибов (базидиомицетов) и прежде всего таких их представителей, как грибы белой гнили, для процессов биоремедиации природных почвенных экосистем, безусловно, перспективно. Эти грибы способны вырабатывать широчайший спектр ферментов, расщепляющих, в том числе такие сложные вещества, как углеводороды различных групп, лигнин, целлюлоза, конденсированная ароматика. Мицелий высших древоразрушающих грибов в процессе роста способен обеспечить доступ кислорода по почвенному профилю, что благоприятно сказывается на состоянии почвенной экосистемы и развитии флоры и фауны почвы, процессах восстановления экосистем после негативной техногенной нагрузки, в том числе, после попадания углеводородных сред в почву.

Базидиомицеты, образуя консорциум с представителями аборигенной микробиоты почвы или УОМ промышленных биопрепаратов, способны выступать ко-метаболитами чужеродных для живых организмов химических веществ (ксенобиотиков), не доступных для окисления другим группам 8 организмов почвенной экосистемы. Кроме того, в клеточной стенке и цитозоле грибов содержится большое количество питательных веществ и микроэлементов, которые могут быть полезными для других членов микробиоценоза почвы, например, углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ). Современные знания о базидиомицетах позволяют отобрать для работы виды, которые не образуют токсические вещества ни на одной из стадий онтогенеза, что позволяет обеспечить экологическую безопасность препаратов на их основе. Эффективность биопрепаратов на основе высших базидиальных грибов для восстановления почвенных экосистем может быть принципиально увеличена за счет объединения в одном препарате бактериальных и грибных организмов или продуктов их метаболизма.

Таким образом, высшие нетоксигенные грибы, способные утилизировать широкий набор различающихся по химической природе субстратов и являющиеся источником разнообразных питательных веществ и микроэлементов, представляются весьма актуальными и перспективными объектами-деструкторами углеводородов в практике рекультивационных мероприятий загрязненных углеводородами почв с точки зрения повышения их эффективности и соблюдения вопросов экологической безопасности.

Фоном исследования являются процессы рекультивации загрязненных углеводородами почв, используемые в ТЭК Российской Федерации, в контексте обеспечения экологической безопасности и повышения эффективности рекультивационных работ.

Объект исследования представляют собой биологические методы рекультивации почв, подверженных углеводородному загрязнению.

Предметом исследования выступают представители класса базидиомицетов как реагенты, повышающие интенсивность процессов восстановления почв, загрязненных углеводородами, и обеспечивающие соблюдение вопросов экологической безопасности.

В связи с этим цель работы заключалась в разработке метода рекультивации загрязненных углеводородами почв за счет совместного применения биодеструкторов на основе высших древоразрушающих грибов и УОМ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести отбор видов и штаммов высших древоразрушающих грибов, способных колонизировать загрязненный углеводородами субстрат -потенциальных биодеструкторов углеводородов;

2. Разработать систему оценки и провести изучение способности отобранных объектов к деструкции углеводородов различной структуры;

3. Выявить аспекты взаимодействия между исследуемыми биодеструкторами и УОМ в процессе их жизнедеятельности — совместный нефтедеструктивный потенциал;

4. Провести оценку деструкции углеводородов при комплексном воздействии биодеструкторов и УОМ на ксенобиотики;

5. Оценить деструкцию углеводородов отобранными грибными биодеструкторами в условиях полевых испытаний.

Научная новизна. Впервые установлено, что более интенсивное восстановление нефтезагрязненных почв за счет отобранных биодеструкторов вызвано спецификой их развития как на поверхности, так и в объёме загрязненного субстрата.

Показана возможность совместного применения исследованных грибных биодеструкторов и УОМ промышленного биопрепарата «Деворойл» с целью интенсификации процессов восстановления загрязненных почвенных экосистем.

Впервые установлена высокая устойчивость отобранных штаммов грибов к токсическому действию полиароматических углеводородов (ПАУ) в высокой концентрации (2 % масс.).

Практическая значимость. Доказана эффективность окисления углеводородов отобранными биодеструкторами в условиях лабораторных и полевых испытаний. Натурные испытания показали, что биодеструкторы на основе исследуемых представителей высших древоразрушающих грибов могут являться основой для создания высокоэффективного комплексного биопрепарата для ликвидации разливов углеводородов и применяться в технологиях рекультивации почв как самостоятельные углеводородные биодеструкторы.

Результаты, полученные в данной работе, могут иметь значение как для проведения биологического этапа технологических работ по рекультивации загрязненных углеводородами почв, а также могут использоваться в качестве учебных материалов для чтения курса лекций по промышленной экологии: «Охрана почв, рекультивация земель и утилизация отходов на предприятиях нефтепереработки, нефтехимии и газохимии», «Экологические проблемы нефте- и газопереработки и нефтехимии», «Промышленная экология».

Публикации и апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы докладывались на 5 конференциях (3 международных и 2 всероссийских). По материалам работы опубликовано 3 статьи, 2 тезиса докладов конференций и 3 доклада в сборниках материалов научно-технических конференций, подана заявка на получение патента Российской Федерации (По данным на 23.05.2012 состояние делопроизводства: экспертиза по существу).

Благодарности.

Автор выражает признательность заведующему кафедрой физической и коллоидной химии РГУ нефти и газа имени И.М. Губкина проф., д.х.н. Винокурову В.А. и заведующей лабораторией биосинтеза биологически активных соединений НИИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН д.б.н. Краснопольской Л.М. за постоянное внимание, поддержку и помощь при выполнении работы.

Благодарю сотрудников кафедры физической и коллоидной химии РГУ нефти и газа имени И.М. Губкина Марченко М.Ю. и лаборатории биосинтеза И биологически активных соединений НИИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН Баркова A.B. за помощь в проведении исследований.

Спасибо моим друзьям за то, что всегда рядом со мной, и за то, что чувствую их поддержку даже на расстоянии тысяч километров.

Благодарю своих дедушку Каракчиева П.С. (ветеран ВОВ, разведчик Калининского фронта) и бабушку Каракчиеву Н.В. (ветеран ВОВ, зенитчица Мурманского фронта) за то, что я Moiy жить и работать под мирным небом над головой.

Работа посвящается моей маме Коканиной А.П., которая подарила мне жизнь, была надежной опорой и поддержкой для меня каждую минуту своей жизни и сделала все, чтобы эта работа была завершена.

Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Заключение Диссертация по теме "Экология (по отраслям)", Коканина, Анастасия Владимировна

выводы

1. Разработаны основы для создания комплексного метода рекультивации нефтезагрязненных почв с использованием базидиальных грибов, утилизирующих углеводородные загрязнения.

2. Предложен селективный метод определения активности базидиальных грибов, колонизирующих углеводородные загрязнения, выделены наиболее эффективные - Т. versicolor {Биодеструктор-Г) и F. pinícola (Биодеструктор-2), способные использовать в качестве единственного источника углерода углеводороды нефти.

3. Количественно оценена степень разложения углеводородов нефти биодеструкторами на основе грибов в стерильной и нестерильной почве. Эффективность очистки Биодеструктором-1 составила 58 % в стерильной и 56 % в нестерильной почве за три недели эксперимента. Для Биодеструктора-2 эти показатели составили 46 % и 44 %, соответственно.

4. Доказано, что совместное применение биодеструкторов и промышленного биопрепарата «Деворойл» приводит к интенсификации процесса восстановления нефтезагрязненных почвенных экосистем, продукты метаболизма грибов не оказывают угнетающего влияния на углеводородокисляющие микроорганизмы.

5. Показан синергетический эффект при совместном применении исследуемых грибных биодеструкторов и УОМ в экспериментах деструкции углеводородов нефти в условиях погруженного культивирования. Сравнение эффективности применения биодеструкторов и комплекса биодеструктор-УОМ показало увеличение деструкции углеводородов нефти за 9 суток эксперимента от 51,3 до 74,3% для Биодеструктора-1 и от 47,4 до71,2 % - для Биодеструктора-2.

6. Влияние полиароматических соединений на исследуемые грибные биодеструкторы, в отличие от промышленных микробных биопрепаратов, незначительно, они способны активно развиваться в почве с содержанием полиароматических углеводородов до 2 % масс.

7. Определено, что Биодеструктор-1 сохраняет высокую нефтедеструктивную активность в условиях полевых испытаний

Ватинского месторождения (Западная Сибирь) при содержании углеводородов нефти в почве 5 % массовых: деструкция углеводородов нефти в системе под воздействием биопрепарата на его основе составляет 54,2 % за 3 недели.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Коканина, Анастасия Владимировна, Москва

1. Другов Ю.С. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов. Практическое руководство: 2-е изд., перераб. и доп. / Ю.С. Другов, А. А. Родин. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007. -270 е.: ил. - (Методы в химии).

2. В.В. Притула. Проблемы эксплуатации трубопроводов. Коррозия // Территория Нефтегаз. 2006. - № 9. - С. 56-59.

3. Р. Мелокян. Экологические проблемы в нефтегазовом комплексе и пути их решения // Бурение и нефть. 2006. - № 1. - С. 40-42.

4. О.В. Куликов. Техногенные загрязнения нефтепродуктами почв и водных объектов // Бурение и нефть. 2002. - № 2. - С. 26-28.

5. Ликвидация разливов нефти // ЭКОГИД. 2003. - № 2 (84). - С. 72-86.

6. Орлов Д.С. Экология и охрана биосферы при химическом загрязнении: Учеб. пособие для хим., хим.-технол. и биол. спец. Вузов / Д.С. Орлов, Л.К. Садовникова, И.Н. Лозановская. — М.: Высш. шк., 2002. -334 е.: ил.

7. Каменщиков Ф.А., Богомольский Е.И. Нефтяные сорбенты. Москва-Ижевск: Институт компьютерных исследований, 2003. - 268 с.

8. Абросимов A.A. Экология переработки углеводородных систем: Учебник / Под ред. д-ра хим. наук, проф. М.Ю. Доломатова, д-ра техн. наук, проф. Э.Г. Теляшева. М.: Химия, 2002. - 608 е.: ил.

9. Технология переработки нефти. В 2-х частях. Часть первая. Первичная переработка нефти / Под ред. О.Ф. Глаголевой и В.М. Капустина. М.: Химия, КолосС, 2007. - 400 е.: ил. - (Учебники и учебные пособия для студентов высших учебных заведений).

10. Садов А.П., Кречетов П.П., Варущенко С.С. Экологические проблемы промыслов по добыче углеводородного сырья // Нефтяное хозяйство. -2008. -№ 12.-С. 116-119.

11. Нефть и окружающая среда Калининградской области (суша). Т. 1 / Под ред. Ю.С. Каджояна и Н.С. Касимова. М.-Калининград: Янтарный сказ, 2008.-359 с.

12. Мартынюк В.Ф., Прусенко Б.Е. Защита окружающей среды в чрезвычайных ситуациях: Учебное пособие для вузов. М.: ФГУП Изд-во «Нефть и газ» РГУ нефти и газа им. И.М. Губкина, 2003. - 336 с.

13. Давыденко Н.М. Проблемы экологии нефтегазоносных и горнодобывающих регионов Севера России. Новосибирск: Наука. Сибирские предприятия РАН, 1998. - 224 с.

14. В.Д. Данкин, С.М. Ушанов, P.C. Гаспарянц. Экономические аспекты использования труб с антикоррозионным покрытием при строительстве трубопроводов ТЭК. Коррозия // Территория Нефтегаз. 2006. - № 5. -С. 20-24.

15. Войно Л.И. Биодеградация нефтезагрязненных почв и акваторий // Фундаментальные исследования. 2006. - № 5. - С. 48.

16. Кузнецов А.Е., Градова Н.Б. Научные основы экобиотехнологии: Учебное пособие для студентов. М.: Мир, 2006. - 504 с.

17. Пиковский Ю.И., Солнцева Н.П. Геохимическая трансформация дерново-подзолистых почв под влиянием потоков нефти // Техногенные потоки вещества в ландшафтах и состояние экосистем. М.: Наука, 1981.-С. 149-154.

18. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем / Под ред. М.И. Глазовской. М.: Наука, 1988. - 254 с.

19. Коробкин В.И., Передельский Л.В. Экология. 12-е изд., доп. и перераб. — Ростов н/Д: Феникс, 2007. — 602 с.

20. Кесельман Г. С, Махмудбеков Э. А. Защита окружающей среды при добыче, транспорте и хранении нефти и газа. М.: Недра, 1981. - 256 с.

21. O.S. Uzkikh, D.M. Khomyakov. Method of multi-substrate testing in oil-polluted soils diagnostics // International Scientific journal for alternative energy and ecology. 2009. - Vol. 72 - № 4 - P. 105-109.

22. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем / Под ред. М.А. Глазовской. М.: Наука, 1988. - 254 с.

23. Технологии восстановления почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Справочник. М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2001. -185 с.

24. Atlas R.M. Fate of petroleum pollutants in arctic ecosystems // Water Science and Technology. 1986. - V. 18. - № 2. - P. 59-67.

25. Мишустин E.H. Ассоциации почвенных микроорганизмов. M.: Наука, 1975.-109 с.

26. Кузнецов Ф.М. Рекультивация нефтезагрязненных почв / Ф.М. Кузнецов, С.А. Илларионов, В.В. Середин и др. Пермь: ПГТУ, 2000 -105 с.

27. Atlas R.M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective // Microbial. Rev. — 1981. Vol. 45. - № 2. — P. 180-209.

28. Sherill T.W., Sayler G.S. Phenanthrene biodegradatic in freshwater environments // Appl. Environm. Microbiol. 1980. - Vol. 39. - № 1. -P. 172-178.

29. Мерициди И.А., Ивановский B.H., Прохоров A.H. и др.Техника и технология локализации и ликвидации аварийных разливов нефти инефтепродуктов: Справочник / Под ред.И.А. Мерициди. СПб.: НПО «Профессионал», 2008. - 824 с.:ил.

30. Мурыгина В.П. Сравнительная оценка эффективности применения методов стимуляции аборигенной микрофлоры и биоагументации для биоремедиации загрязненных нефтью болотистых почв Западной Сибири / В.П. Мурыгина, C.B. Калюжный. М., 2001. - 231 с.

31. Jobson A., Cook F.D., Westlake D.W.S. Microbial utilization of crude oil // Appl. Microbiol. 1972. - Vol. 23. - P. 1082-189.

32. Смагин A.B. Режимы функционирования динамических биокосных систем // Почвоведение. 1999 - № 12 - С.1433-1447.

33. Водопьянов В.В. Оптимизация биологической очистки нефтезагрязненных почв с использованием математической модели / В.В. Водопьянов, H.A. Киреева, Т.С. Онегова // Нефтяное хозяйство. -2008.-№4.-С. 108-111.

34. Способ очистки почвы и водоемов от нефтяных загрязнений: патент №2198748 РФ / Т.С. Онегова, H.A. Киреева, Н.В. Жданова и др. Б.И. 2003-№5.

35. Консорциум микроорганизмов, используемых для очистки почвенных солоновато-водных экосистем от загрязнения нефтепродуктами: патент №2023686 РФ / И.А. Борзенков, Е.И. Милехина, С.С. Беляев, М.В. Иванов Б.И. - 1994 - №22.

36. McGill W.B., Rowell M.J. Determination of oil content of oil contaminated soil // Sei. Total Environ. 1980. - Vol. 14. - № 3. - P. 245-253.

37. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991. - 304 с.

38. Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Приемы стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры // Биотехнология. 2005. — №1. - С. 42-50.

39. Шеин Е.В., Полянская JI.M., Девнн Б.А. Перенос микроорганизмов в почве: физико-химический подход и математическое описание // Почвоведение. 2002. - № 5. - С. 564-573.

40. Водопьянова В.В. Математическое моделирование численности микроорганизмов и биодеградации нефти в почве // Вестник УГАТУ. -2006. Т.8. - № 1(17).-С. 132-137.

41. Киреева H.A., Водопьянова В.В., Мифтахова A.M. Биологическая активность нефтезагрязненных почв. Уфа: Гилем, 2001. - 356 с.

42. Сребняк Е.А. Использование микробиологического метода для очистки акватории Балтийского моря от нефти и нефтепродуктов: Дис. . маг. техники и технологии 55.35.01 / РГУНГ имени И.М. Губкина. - М., 2005. - 95 с.

43. Илларионов С.А. Экологические аспекты восстановления нефтезагрязненных почв / С.А. Илларионов. Екатеринбург: УрО РАН, 2004.-194 с.

44. Мукашева Т.Д. Стратегия отбора углеводородокисляющих микроорганизмов и их биотехнологический потенциал: Дис. . докт. техн. наук 03.00.07: РХТУ им. Д.И. Менделеева - Алматы: КазНУ им. Аль-Фабри МОН PK, 2008. - с. 10-50.

45. Физиология и биохимия культурных растений // Тез. докл. I Междунар. регион, семинара "Охрана окружающей среды: Современные исследования по экологии и микробиологии", 1997 / Ужгород. — Ужгород: ПиАр, 1997. № 5. - 84с.

46. Биопрепарат «Ленойл» биотехнология рекультивации нефтезагрязненных объектов Электронный ресурс. - Режим доступа: http.7/www.bmch.su/?Menu=10&SecondMenu=100 - Загл. с экрана.

47. Микрозим(1т) «Петротрит» препарат-биодеструктор нефтяного загрязнения Электронный ресурс. - Режим доступа: http://www.microzym.ru/oilspills.htm - Загл. с экрана.

48. Биопрепарат «Родер» для очистки почв, почвогрунтов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов Электронный ресурс. — Режим доступа:http://www.sibpatent.ru/patent.asp?nPubl=2174496&mpkcls=C02F003&ptncl s=C02F003/34&sort=2 Загл. с экрана.

49. Ермоленко З.М., Чугунов В.А., Герасименко В.Н. Влияние некоторых факторов окружающей среды на выживаемость внесенных бактерий, разрушающих нефтяные углеводороды // Биотехнология. 1997. - № 5 -С. 12-19.

50. Ботоер М. Микробные сообщества в мерзлотных почвах Сибири / М. Ботоер // Тезисы, докл. II Межвуз. конф. Сыктывкар, 1997 / Сыктывкар.- Сыктывкар, 1997. С. 54-55.

51. Stewart R.S., Emmons С., Porfirio D., Wiggers R.J. Distribution of multiple oil tolerant and oil degrading bacteria around a site of natural crude oil seepage // Texas Journal of Science. 1997. - Vol. 49. - № 4. - P. 339-344.

52. Киреева H.A. Ферменты азотного обмена в нефтезагрязненных почвах / H.A. Киреева, Е.И. Новоселова, Ф.Х. Хазиев // Изв. РАН. Сер. биол. -1997.-№6.-С. 203-206.

53. Sancez С. Lignocellulosic residues: biodégradation and bioconversion by fungi // Biotechnol. Adv. 2009. - V. 27. - P. 185-194.

54. Dashtban M., Schraft H., Qin W. Fungal bioconversion of lignocellulosic residues; opportunities & perspectives // Int. J. Biol. Sci. 2009. - Vol. 5. -№6.-P. 578-595.

55. Lacina C., Germin G., Spiros A. Utilization of fungi for biotreatment of raw wastewaters // Afr. J. Biotechnol. 2003. - Vol. 2. - P. 620-635.

56. Mougin C., Boukcim H., Jolivalt C. Advances in Applied Bioremediation (Soil Biology) // Berlin, Heidelberg: Springer Verlag. 2009. - Vol. 17. -P. 123-149.

57. С химической точки зрения лигнин является ароматической частью древесины Электронный ресурс. Режим доступа: http://ru.wikipedia.org/wiki/jlhrhhh - Загл. с экрана.

58. Целлюлоза белое твердое вещество, нерастворимое в воде Электронный ресурс. — Режим доступа: ЬЦр://ш^к1реё1а.ога/ш1кШеллюлоза - Загл. с экрана.

59. Kumar R., Singh S., Singh O.V. Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical and molecular perspectives // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. -2008.-Vol.35.-P.377-391.

60. Baldrain P., Valaskova V. Degradation of cellulose by basidiomycetous fungi //FEMS Microbiol. Rev. 2008. - Vol. 32. -P. 501-521.

61. Дзедзюля Е.И.Участие некоторых грибных ферментов в биодеградации лигноцеллюлозных субстратов: автореф. дис. канд. биол. наук (03.00.24) / Е.И. Дзедзюля. Москва: МГУ им. М.В.Ломоносова. Биол. фак., 2000. - 25 с.

62. Арефьев В.А., Лисовенко Л.А. Англо-русский толковый словарь генетических терминов / Науч. ред. Л.И.Патрушев. Москва: Изд-во ВНИРО, 1995.-407с.

63. Reddy С.A. The potential for white-rot fungi in the treatment of pollutants // Current Opinion in Biotechnology. 1995. - Vol. 6. - № 3. - P. 320-328(9).

64. Asgher M., Bhatti H.N., Asharf M., Legge R.L. Recent developments in biodégradation of industrial pollutants by white rot fungi and their enzyme system // Biodégradation. 2008. - Vol.19. - P. 771-783.

65. Robles-Hernández L., Cecilia-Gonzalez-Franco A., Crawford D.L., Chun W.W.C. Review of environmental organopollutants degradation by white rot basidiomycete mushrooms // Tecnociencia Chihua-hua. 2008. - Vol. 2. -№ 1. - P. 32-40.

66. Aust S.D., Benson J.T. The fungus among us: use of white rot fungi to biodegrade environmental pollutants // Environ. Health Perspectives. -1993.-Vol. 101.-№3.-P. 232-233.

67. Gramss G. The Influence of the Concomitant Microflora on Establishment and Dieback of Decay Fungi in Standing Timber //Journal of Phytopathology. -1987.-Vol. 120-№3.-P. 205-215.

68. Позднякова H.H., Никитина B.E., Турковская O.B. Биоремедиация нефтезагрязненной почвы комплексом гриб Pleurotus ostreatus -почвенная микрофлора // Прикладная биохимия и микробиология. — 2008.-№ 1.-С. 69-75.

69. Sack U., Heinze Т.М., Deck J., Cerniglia C.E., Martens R., Zadrasil F., Fritsche W. Comparison of phenanthrene and pyrene degradation by different wood-decaying fungi // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - Vol. 63. -№ 10.-P. 3919-3925.

70. Brodkorb T.S., Legge R.L. Enhanced biodegradation of phenanthrene in oil tar-contaminated soils supplemented with Phanerochaete chrysosporium И Appl. Environ. Microbiol. 1992. - Vol. 58. -№ 9 -P. 3117-3121.

71. Davis M.W., Glaser J.A., Evans J.W., Lamar R.T. Field evaluation of the lignin-degrading fungus Phanerochaete sórdida to treat creosote-contaminated soil II Environ. Sci. Technol. 1993. - Vol. 27. - № 12. - P. 2572-2576.

72. Marques-Rocha F.J., Hernandez-Rodriquez V., Lamela M.A.T. Biodegradation of Diesel Oil in Soil by a Microbial Consortium // Water, Air and Soil Pollution. 2001. - Vol. 128. -№ 3-4. - P. 313-320.

73. Губайдуллина T.C. Дыхательный газообмен почвы, загрязненной нефтью. Казань, 1983 - 16 с. - (Деп. ВИНИТИ 15.11.83; № 6074-831. Дел.).

74. Loynachan Т.Е. Low-temperature mineralization of crude oil in soil // J. Environm. Qual. 1978. - Vol. 7. - № 4. - P. 494-500.

75. Казакова Е.Н., Оборин А.А. Поиски методов стимуляции биодеградации нефти в почве // Освоение Севера и проблема рекультивации: Докл. II междунар. конф. Сыктывкар 1994г- г. Сыктывкар, 1994 С.214-217.

76. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы / Д.Г. Звягинцев. М.: Изд-во МГУ, 1987.-256 с.

77. Ramos С. Active biological containment for bioremediation in the rhizosphere / C. Ramos, L. Molina, C. Ronchel et al. // Novel Approaches for bioremediation of Organic Pollution: Plenum Publishers New York, 1999. -New York, 1999-P. 151-156.

78. Сидоров Д.Г. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании биопрепарата Деворойл / Д.Г. Сидоров, И.А. Борзенков, Е.И. Милехина и др. // Прикл. биохим. и микроб. 1998. - Т. 34. - № 3. -С. 281-286.

79. Steinbera С. Localization of the bacteria in the soil aggregates / C. Steinbera, J.L. Gouze, G. Faurie // Abstr. of the 5th Int. Symp Microbiol. Ecol. Kyoto, 1990.- Kyoto, 1990. — S. l.-P. 143.

80. Суржко Л.Ф. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками / Л.Ф. Суржко, З.И. Финкелыптейн, Б.П. Баскунов и др. // Микробиология. 1995. - Т. 64. - № 3. - С. 393-398.

81. Маркарова М.Ю. Микробиологическая очистка загрязненных нефтью водоемов и резервуаров / М.Ю. Маркарова, И.Б. Арчегова, В.В. Полшведкин // Химия в интересах устойчивого развития. 1998. — Вып. 6. - С. 343-348.

82. Гайнутдинов М.З. Рекультивация нефтезагрязненных земель лесостепной зоны Татарии / М.З. Гайнутдинов, С.М. Самосова, Т.И. Артемьева и др. // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем: Сб. науч. Тр. М.: Наука - 1988. - С. 82-98.

83. Оборин А.А. Самоочищение и рекультивация нефтезагрязненных почв Предуралья и Западной Сибири / А.А. Оборин, И.Г. Калачникова. Т.А. Масливец и др. // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М.: Наука - 1988. - С. 140-159.

84. Шилова И.И. Биологическая рекультивация нефтезагрязненных земель в условиях таежной зоны / И.И. Шилова // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем: Сб. науч. тр. М.: Наука, 1988.-С. 159-167.

85. Молчанова О.С. физико-химические методы защиты водно-болотных экосистем от нефтяного загрязнения / О.С. Молчанова, М.П. Нестерова, Н.М. Антонова // Нефтяное хозяйство 1992. - № 3. - С.35-37.

86. Рабинович M.JL Разложение природных ароматических структур и ксенобиотиков грибами (обзор) / M.JI. Рабинович, А.В. Болобкова, Л.Г. Васильченко // Прикл. биохим. и микроб. 2004. - Т. 40 - № 1. — С. 5-23.

87. Yateem A. White rot fungi and their role in remediation oil-contaminated soil / A. Yateem, M.T. Balba, N.Al-Awadhi et al. // Environ. Intern. 1998. -Vol. 24.-№ 1/2.-P. 181-187.

88. Gramms G. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons with three to seven aromatic rings by higher fungi in sterile and unsterile soils / G. Gramms, K.D. Voight, B. Kirsche // Biodégradation. 1999. - Vol. 10. -P. 51-62.

89. Pointing S.B. Feasibility of bioremediation by white-rot fungi / S.B. Pointing // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 57 - P.20-33.

90. Donnelly P.K. Growth of PCB-degrading bacteria on compounds from photosynthetic plants / P.K. Donnelly, R.S. Hedge, J.S. Fletcher // Chemosphere. 1994. - Vol. 28. - № 5. - P. 981-988.

91. Hedge R.S. Influence of plant growth stage and season on the release of root phenolics by mulberry as related to development of phytoremediation technology / R.S. Hedge, J.S. Fletcher // Chemosphere. 1996. - Vol. 32. -№ 12.-P 2471-2479.

92. Grûnther T. Effects of ryegrass on biodégradation of hydrocarbons in soil / T. Griinther, U. Domberger, W. Fritsche // Chemosphere. 1996. - Vol. 33. -№2.-P. 203-215.

93. Bioremediation, detoxication and plant-growth enhancing compositions and methods of making and using such compositions: US Patent №6268206 B1 / D. Liptak. -№09/417571; Appl. Oct. 14, 1999; Publ. Jul. 31, 2001. 18 p.

94. ГОСТ 26483-85. Почвы. Приготовление солевой вытяжки и определение ее рН по методу ЦИНАО (Soils. Preparation of salt extract and determination of its pH by CINAO method). Введен 1986-07-01. - M.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2009. - 6 с.

95. РД 52.18.647- 003. Методические указания. Определение массовой доли нефтепродуктов в почвах. Методика выполнения измерений гравиметрическим методом. Утвержден 2003-06-01. - М.: Росгидромет, 2003. - 10 с.

96. ПНД Ф 16.1:2.2.22-98. Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в почвах и донных отложениях методом ИК-спектрометрии. Утвержден 1998-11-10. - М.: ГК РФ по ООС, 1998 -21 с.

97. ПНД Ф 14.1:2:4.168-2000 (2004). Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в пробах питьевых, природных и очищенных сточных вод методом ИК-спектрофотометрии. Утвержден 2003-03-17. - М.: ГК РФ по ООС, 2003. - 10 с.

98. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, JI.M. Захарчук и др.; Под ред. А.И. Нетрусова. М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с.

99. Кузин Ф.А. Диссертация: Методика написания. Правила оформления. Порядок защиты. Практическое пособие для докторантов, аспирантов и магистрантов. М: Ось-89, 2001. - 320 с.

100. ГОСТ 7.1.2003. Библиографическая запись. Библиографическое описание. Общие требования и правила составления. Введен 2001-0701. - М.: Изд-во стандартов, 2001. - 52 с.1. ПУБЛИКАЦИИ

101. Основные положения диссертации изложены в следующих публикациях.

102. A.B. Барков, М.И. Леонтьева, Е.А. Некрасова, A.B. Савин, A.B. Коканина. Л.М. Краснопольская. Микобиотехнологический метод утилизации отходов производства биоэтанола // Башкирский химический журнал. -2010-Том 17-№3 С. 130-135.

103. SPE Library Paper 138082-MS. Possibility of Using Basidiomycetes for Enhancing Efficiency of Oil-contaminated Land Recultivation. Digital object identifier 10.2118/138082-MS.

104. Методы рекультивации нефтезагрязненных почв 25.

105. Методы Вариант реализации / техн.средство Достоинства Недостаткипереработкой последнего.

106. Методы Вариант реализации / техн.средство Достоинства Недостатки

107. Фитомелиора-ция дешевизна; не требует сложного технического обслуживания применяется в крайних случаях и при малых концентрациях загрязняющих веществ; эффективность растений на определенной глубине; остатки растений являются отходами

108. Биопрепараты, применяемые в России для ремедиации нефтезагрязненных почв

109. Название биопре парата Производи тель Внешний вид Состав биопрепарата Подкормка Условия применения Количество обработок Источ ник

110. Количест во штаммов Титр, КОЕ/г Прочие элементы

111. Биоойл-Югра ЗАО «Биоойл» Порошок 5 5,6x10" Стимулятор роста бактерий, сбалансированная смесь удобрений и микроэлементов Не требуется t: от+1 до+41°С (W+7-+27°C) pH: 5,0-9,0 Зависит от содержания нефти в почве 52.

112. Деворойл ООО «Сити-Строй», Суспензия цвета кофе с молоком (раб. суспензия) 5, бактерии, дрожжи 2,8x108 Нет Не требуется t: от +5 до +45°С (W+20-+37°C) pH: 4,5-9,5 (рНопт: 7) Соленость: □ 150 г/л Зависит от степени загрязненност и грунта 53,54.

113. Название биопре парата Производи тель Внешний вид Состав биопрепарата Подкормка Условия применения Количество обработок Источ ник

114. Количест во штаммов Титр, КОЕ/г Прочие элементыго режимов

115. Ленойл ЗАО НПП «Биомедхим» порошок 2, бактерии 1,0х108 нет Биодобавки, дизельное топливо і: от +3°С до + 50°С рН: 6-8 Соленость: □ 60 г/л Влажность почвы >30%, Зависит от содержания нефти в почве 56.

116. МД (жидкий) ООО «Экойл» Суспензия коричневого цвета >1 1,0* ю10 Маточная культура Минеральные удобрения, травы от +5 до +37°С рН: 5,0 8,5 Зависит от степени загрязнения грунта, водного и температурно го режимов 57.

117. МД (сухой) Порошок от светло-бежевого до >1 1,0x10й Органоминеральны е носители, микроэлементы, Минеральные удобрения, травы ї: от +5 до +37°С рН: 5,0 8,5 Зависит от степени загрязнения

118. Название биопре парата Производи тель Внешний вид Состав биопрепарата Подкормка Условия применения Количество обработок Источ ник

119. Количест во штаммов Титр, КОЕ/г Прочие элементыкоричневого цвета со специфическим запахом стимуляторы роста микроорганизмов грунта, водного и температурно го режимов

120. Копия протокола испытаний почвенных образцов на содержание нефтепродуктов. Полевые испытания опытного образца биопрепарата на основе исследуемого биодеструктора

121. ЗАКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО

122. ИСПЫТАТЕЛЬНАЯ ЛАБОРАТОРИЯ БУРОВЫХ РАСТВОРОВ (ИЛБР)1. ЗАО «БИОТЕХАЛЬЯНС»

123. Аттестат аккредитации Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии № РОСС К.ШЮ01.21СН39 действителен до 08 09 2016 г. На техническую компетентность и иемвисимость628680, ХМАО-Югра, г. Мегион, ул. Строителей, д.2

124. ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ № 1-К от «10» августа 2011 г.1.