Очистка почвы от загрязнения полициклическими ароматическими углеводородами на основе применения хемотаксически активных микроорганизмов ризосферы растений

Алдобаев, Владимир Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Очистка почвы от загрязнения полициклическими ароматическими углеводородами на основе применения хемотаксически активных микроорганизмов ризосферы растений
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Очистка почвы от загрязнения полициклическими ароматическими углеводородами на основе применения хемотаксически активных микроорганизмов ризосферы растений"

На правах рукописи

Алдобаев Владимир Николаевич

Очистка почвы от загрязнения полициклическими ароматическими углеводородами на основе применения хемотаксически активных микроорганизмов ризосферы

растений

03.00.23 биотехнология АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Пущино-2004

Работа выполнена в отделе экологической биотехнологии, отделе биохимии и микробиологии, отделе аналитической химии и радиобиологии Государственного научно- исследовательского центра токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем МЗ РФ.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение

доктор медицинских наук Н.Р. Дядищев

доктор биологических наук, профессор И. Н. Гоготов доктор биологических наук, профессор В. П. Холоденко Институт Физико-Химических и Биологических Проблем почвоведения РАН

Защита диссертации состоится £э. 11. 2004 г. в 9 -Р£> ч на заседании Совета по защите диссертаций^). 121, Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, проспект Науки, 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина

Автореферат разослан

№. 2004 г

Ученый секретарь по защите диссертаций

доктор биологических наук

В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) и их гибридные формы входят в состав сложных углеродистых веществ земной коры и ландшафтной оболочки Земли в виде рассеянных битуминозных веществ, нефтей, битумов, компонентов почвенного гумуса, аэрозолей воздуха, липидов растительных и животных тканей. ПАУ представляют собой высокомолекулярные органические соединения, основным элементом структуры которых является бензольное кольцо. К ПАУ относятся соединения, содержащие в своем составе несколько бензольных колец, соединенных вместе или разделенных парой соседних атомов углерода между примыкающими кольцами.

Загрязнение окружающей среды полициклицескими ароматическими углеводородами является серьезной угрозой, в том числе и для здоровья человека. ПАУ обладают мутагенными, тератогенными и канцерогенными свойствами, относятся к приоритетным загрязнителям, которые попадают в окружающую среду, в том числе и почву, в основном в виде промышленных выбросов предприятий угольной, химической и нефтехимической промышленности. Загрязнение почв ПАУ приводит к снижению их плодородия и качества сельскохозяйственной продукции. Одним из перспективных способов решения проблемы загрязнения почв ПАУ- разработка методов и подходов их очистки и детоксикации in situ, и прежде всего, биодетоксикации и биоремедиации.

Цели и задачи работы. Цель исследования состояла в изучении ризосферных хемотаксически активных микроорганизмов-деструкторов как основного элемента активных растительно-микробных ассоциаций для очистки почвы от ПАУ. Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Выделение и характеристика микроорганизмов-деструкторов из образцов ризосферы и почв, длительно загрязненных ПАУ.

2. Скрининг выделенных активных микроорганизмов-деструкторов ПАУ, по их способности к хемотаксису к отдельным ПАУ и корневым выделениям экспериментальных растений.

3. Создание коллекции и изучение условий хранения хемотаксически активных микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

4. Выявление растений, обладающих устойчивостью к повышенным концентрациям ПАУ в почве.

5. Получение и применение наиболее активных растительно-микробной ассоциации для очистки почвы, загрязненной ПАУ.

Научная новизна работы. Впервые из ризосферы растений, произрастающих на загрязненных территориях, выделены чистые культуры микроорганизмов, обладающие комбинированной способностью осуществлять деструкцию ПАУ и быть хемотаксически активными к ним и корневым выделениям растений. Созданы растительно-микробные ассоциации для очистки почвы, загрязненной ПАУ, путем фитобиоремедиации и показана их высокая эффективность в очистке почвы от ПАУ и других углеводородов нефти.

Практическая значимость. Создана коллекция хемотаксически активных штаммов-деструкторов ПАУ и разработаны условия их хранения.

Разработаны практические рекомендации по применению метода очистки нефтезагрязненных почв in situ.

На активный штамм-деструктор ПАУ - P. stutzeri MEV-S1 получен патент RU № 2228952.

1 L ¿43Шо\

развития, г. Москва, 10-14 ноября 2003 г., International Symposium: Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants, Saratov, Russia, 28-30 July 2003.

Публикации. Основные материалы диссертации представлены в семи публикациях: пяти тезисах, одном патенте и одной статье.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов списка литературы и приложения, Материалы изложены на 145 страницах машинописного текста, содержат 20 рисунков, 31 таблицу. Список литературы включает 244 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили почвы различных областей России и Украины, которые были загрязнены каменноугольной смолой, нефтью и продуктами ее переработки и штаммы микроорганизмов-деструкторов, выделенные из образцов загрязненных почв. Образцы почв отбирали трижды (апрель, июнь и октябрь) в течение вегетационного сезона 2000 года (всего 41 образец). Объектами исследования служили также растения люцерны (Medicago sativa), овса{Avena saliva),пшеницы (Triticum aestivum), овсяницы луговой (Festucapratensis), клевера белого (Tnfolium album) и красного (Tnfolmmpretense), гороха (Pisum arvense). Изучение ремедиации почвы от ПАУ было проведено в условиях вегетационного и полевого экспериментов. Вегетационный эксперимент был проведен с окультуренной дерново-подзолистой тяжелосуглинистой почвой.

Полевой эксперимент проводили на дерново-подзолистой среднесуглинистой почве, загрязненной нефтью и дизельным топливом в результате аварийного разлива.

Накопительные культуры микроорганизмов-деструкторов ПАУ готовили из образцов почвы ризосферы, отобранных с территорий, загрязненных каменноугольной смолой и нефтью на основе жидкой питательной среды (L9) с ПАУ (нафталин, фенантрен, антрацен и пирен), использованных в качестве единственного источника углерода.

Чистые культуры деструкторов ПАУ были получены путем посева разведений накопительных культур на агаризованные питательные среды, в которые были внесены ПАУ. Внесение ПАУ было осуществлено двумя приемами. Первый - поверхность агара опрыскивали 2%-ным раствором ПАУ (в смеси ацетон + гексан = 1:1 по объему). Такой прием получил название "spray-plates" и впервые описан в работе Киохара с соавторами (Kiyohara et al., 1982). Второй прием ("agar overlay plates") заключался в приготовлении двух слоев агара, из которых верхний содержал его только 0,75%, куда и были внесены накопительные культуры и раствор ПАУ в 5%-ном этаноле (Bogardt, Hemmingsen, 1992; Bastiaens et al., 2000). Колонии бактерий, способные трансформировать ПАУ, образовывали зоны просветления в нанесенном на агаре слое ПАУ и верхнем (полужидком) слое агара.

Способность выделенных культур микроорганизмов метаболнзировать ПАУ изучали на нерастущих клетках (Bastiaens et al., 2000). Клетки бактерий выращивали на жидкой питательной среде (L9). В качестве источника углерода в среду добавляли соединение ПАУ, на котором культура была выделена. Концентрация ПАУ (фенантрена и нафталина) в среде составляла 20 мг/л. Микробные клетки культивировали на качалке (180 об/мин) при 28°С в темноте в течение 5 суток. Количество ПАУ в средеjio окончании срока инкубации определяли газохроматографически.

Хемотаксические свойства штаммов-деструкторов ПАУ были изучены по отношению к соединениям ПАУ и корневым выделениям растений. Хемотаксические свойства микроорганизмов изучали капиллярным методом Адлера (Adler, 1973), когда в бактериальную суспензию помещают капилляр с атграктантом и затем подсчитывают, сколько бактерий вошло в этот капилляр. В качестве аттрактантов использовали ПАУ: нафталин, фенантрен, пирен и антрацен, а также корневые выделения растений. Корневые выделения растений были стерилизованы фильтрованием.

Родовая и видовая принадлежность выделенных микроорганизмов была установлена в соответствии с определителем Берджи 8-е издание (Вещеу, 1994).

Микробиологический анализ почвы и отдельно ризосферы растений на общее содержание аборигенной микрофлоры проводили в вегетационном и полевом экспериментах по фиторемедиации загрязненных ПАУ почв. Анализ включал оценку биомассы почвенных бактерий, актиномицетов и микроскопических грибов, численность и длину мицелия которых подсчитывали методом люминесцентной микроскопии (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). Суспензию почвы подвергали ультразвуковому диспергированию на установке УЗДН-1 (22 кГц, 0,4 А, 2 мин.), а затем наносили на предметное стекло и окрашивали акридином оранжевым (для бактерий) и калькофлуором белым (для мицелиальных микроорганизмов).

Почву ризосферы получали после отмывания корней растений с почвой (масса 5-10 г), которые помещали в колбу со 100 мл стерильного фосфатного буфера (рН 7,2). В суспензии почвы ризосферы также определяли численность и биомассу бактерий и микроскопических грибов в пересчете на единицу веса сухой почвы (высушенной при105°С).

Культивирование хемотаксически активных штаммов-деструкторов ПАУ для бактеризации семян растений проводили в условиях периодического культивирования в жидкой питательной среде (26°С, 180 об/мин, качалка, 18-20 час). Среда Ь9 содержала дополнительно ферментативный гидролизат рыбной муки, глюкозу и пептон. Выращенную в среде культуру цетрифугировали в течение 10 минут при 6000 об/мин, в культуральный осадок добавляли фосфатный буферный раствор (рН 7,2) до концентрации клеток 1х10'/мл. В подготовленный таким образом инокулят вносили семена растений.

Численность хемотаксически активных штаммов-деструкторов ПАУ (Р. акаНеепез МЕУ и Р. зШгеп МЕУ81) в почве и ризосфере растений, семена которых были предварительно перед посевом в почву инокулированы этими бактериями, определяли методом посева из разведений почвенной суспензии на агаризованную питательную среду. Среда содержала гидролизат рыбной муки и антибиотики. Штамм Р. акаЩепез МЕУ обладает природной устойчивостью к стрептомицину (100 мкг/мл) и ампициллину (50 мкг/мл), а штамм Р. зШ11еп МЕУ81 устойчив к ампициллину (100 мкг/мл) и канамицину (20 мкг/мл).

Горизонтальную и вертикальную миграции штаммов-деструкторов ПАУ в почве (вегетационный и полевой опыты) определяли следующим образом. Семена люцерны и овса (по 10 штук каждого), инокулированные штаммами псевдомонад МЕУ^1 и МБУ соответственно, высевали (кучно) на почву с радиусом посева около 5 см. На протяжении 3-х месяцев анализировали почву на наличие штаммов-деструкторов в горизонтальном (на расстоянии до 60 и с интервалом 10 см от места посева растений) и вертикальном (до 160 и с интервалом 20 см) направлениях.

Условия хранения хемотаксически активных штаммов-деструкторов ПАУ изучали в лиофилизированном состоянии при -10,4 и 28°С; на агаризованной питательной среде под слоем глицерина при 4 и 28°С; и на агаризованной питательной среде при 4 и 28°С.

Жизнеспособность бактерий после различных условий хранения определяли путем посева биомассы бактерий на агаризованную питательную среду (см. раздел получение биомассы микроорганизмов).

ЛиоФилизацию клеток проводили в "защитной" среде, содержащей 10% сахарозы, 1,5% желатина и 0,1% агар-агара.

Патогенность выделенных хемотаксичных штаммов-биодеструкторов ПАУ исследовали на лабораторных животных (ВОЗ: заключения и рекомендации, 1981; Методические инструкции.., 1982). Дли экспериментов были использованы беспородные белые мыши и крысы, которые были получены из центрального питомника лабораторных животных (отделение "Крюково", Серпуховский р-он, Московская обл.). Содержание экспериментальных животных соответствовало "Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)", утвержденным МЗ СССР 6.07.73 г., и Приказу МЗ СССР N 755 от 12.08.77 г.

Патогенность оценивали определяя токсичность, токсигенность, инфективность и летальную дозу для 50% испытуемых животных (ЛД50).

В вегетационных и полевых опытах использовали семена люцерны -сорт "Надежда", овса - сорт "Астор", пшеницы - сорт "Лпьбидум", овсяницы луговой - сорт "Перун", клевера белого • сорт "JURA" и красного - сорт "LUCRUM", гороха - сорт "Глориоза", полученных от фирмы "Semco" (Москва, Россия).

Бактеризация семян микроорганизмами осуществлялась посредством внесения на 30 минут предварительно стерилизованных семян в бактериальную суспензию (1,0хЮ9 клеток/мл). Семена, инокулированные бактериями таким приемом, высевали в почву вегетационных сосудов или на участках полевого эксперимента.

Устойчивость растений к повышенным концентрациям ПАУ в почве оценивали по всхожести семян (% от числа засеянных), а также по биомассе наземной и корневой части растений спустя 28 суток после посева растений. Рассчитывали сухой вес корневой и наземной фитобиомассы после высушивания при 105° С.

Содержание отдельных ПАУ в жидкой питательной среде определяли на газовом хроматографе "Кристалл 5000" с пламенно-ионизационным детектором (производство СКВ "Хроматэк", г. Йошкар-Ола). Для построения калибровочной прямой был использован аналитический стандарт "QTM РАН Mix" компании "Supelco", представляющий собой смесь 1б-ти ПАУ в метиленхлориде.

В дерново-подзолистой почве анализ содержания индивидуальных ПАУ (нафталин, фенантрен, антрацен, флуарантен, пирен) проводили газохроматографически, как и в случае анализа ПАУ в жидкой среде. Экстракцию ПАУ из почвы проводили метиленхлоридоч в течение 5-ти часов в приборе Сокслета.

Суммарное количество углеводородов нефти и дизельного топлива в дерново-подзолистой почве (полевой эксперимент) определяли методом инфракрасной спектроскопии после их экстракции из почвы четыреххлористым углеродом. Количественная оценка содержания минеральных углеводородов проводилась на инфракрасном спектрометре " Икар-1" с Фурье-преобразованием.

Токсичность почвы оценивали по жизнеспособности красных дождевых червей Eisenia fetich Andrei,

Фитотоксичность почвы - по прорастанию семян салата (Lactuca sativa),

генотоксичность почвы - в тесте Эймса (Ames et al., 1973; McCann et al, 1975) на штаммах Salmonella typhimunum TA98 и ТА100.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Выделение, идентификация и свойства микроорганизмов-деструкторов ПАУ Из ризосферы растений, произрастающих на загрязненных ПАУ почвах разной типовой принадлежности и географически удаленных друг от друга выделены 71-на чистая культура микроорганизмов, способных к трансформации и деградации ПАУ на питательных средах в лабораторных условиях. Выделенные микроорганизмы принадлежали к разным таксономическим группировкам. Наибольшая часть изолятов приходилась на неспоровые бактерии рода Pseudomonas (30). В меньшей степени представлены роды: Arthrobacter (7), Rhodococcus (5), Alcaligenes (6), Azospirillum (4), Mycobacterium (5) и др. Одной из задач исследования при работе с микроорганизмами-деструкторами было определение двигательной активности культуры. Большинство выделенных микроорганизмов обладали подвижностью (табл. 1). Однако 14 культур микроорганизмов, относящихся к родам Rhodococcus, Mycobacterium, Micrococcus и, Nocardia не обладали подвижностью. Это послужило основанием их исключения из рабочей коллекции для последующих экспериментов.

Таблица 1. Таксономический состав бактерий почв, загрязненных ПАУ (выделены из накопительных культур на основе ризосферной почвы)

Родовая принадлежность Число штаммов Наличие подвижности

Pseudomonas sp. 30 +

Arthrobacter sp. 7 +

Rhodococcus sp. 5 -

Alcaligenes sp. 6 +

Azospirillum sp. 4 +

Mycobacterium sp. 5 -

Micrococcus sp. 3 -

Xanthomonas sp. 4 +

Agrobacterium sp. 4 +

Nocardia sp. 1 -

Rhaobium sp. 1 +

Bacillus sp. 1 +

Примечание: + наличие подвижности; - отсутствие подвижности.

Деградация ПАУ чистыми культурами в питательной среде. Подвижные штаммы рабочей коллекции микроорганизмов-деструкторов (всего 57) были проверены на способность к росту на средах (жидких и твердых, агаризованных), в которых единственным источником углерода и энергии служили определенные ПАУ. Все выделенные штаммы обладали способностью расти на нафталине, 40 штаммов - на фенантрене, 4 - на антрацене, 5 - на пирене и 11 - на флуорантене. Затем были отобраны культуры, которые активно росли на 3-х и более различных ПАУ. Эти культуры (всего 6) принадлежали роду Pseudomonas. В таблице 2 представлены результаты экспериментов по деградации ПАУ. Было показано, что за 5 суток в жидкой среде культивирование штаммов псевдомонад приводило к существенному уменьшению содержания отдельных ПАУ в среде. Таким образом, по результатам микробной деградации индивидуальных соединений ПАУ в лабораторных условиях были выбраны шесть штаммов рода Pseudomonas, обладающих наибольшей деградирующей активностью.

Таблица 2. Деградация ПАУ разными штаммами псевдомонад (5 сут, жидкая среда)

Штамм Снижение содержания ПАУ, (% от исходного)

Нафталин Фенантрен Антрацен Пирен Флуоран тен

8А 80 66 н/о н/о 38

9А 78 52 11 - н/о

5С 82 53 н/о 16 32

2А 83 49 н/о 16 29

ЗА 76 37 8 11 32

10D 88 52 11 12 21

Примечание: н/о - не определяли

Хемотаксические свойства к отдельным ПАУ

Оказалось, что все штаммы коллекции, обладающие подвижностью в полужидком агаре, демонстрировали и хемотаксические свойства по отношению к нафталину. В таблице 3 приведены в качестве примера два штамма из коллекции, (8А и 9А) обладавшие наиболее значительными хемотаксическими свойствами к нафталину, по сравнению с другими выделенными и исследованными культурами.

Таблица 3. Подвижность и хемотаксис деструкторов ПАУ к нафталину

Штамм Подвижность бактерий в полужидком агаре Реакция хемотаксиса

Pseudomonas sp 8А + +

Pseudomonas sp. 9A + +

Pseudomonas pulida ZI 18 -

Экспериментами установлено, что нафталин и фенантрен обладали свойствами атграктантов для большинства подвижных штаммов коллекции, а пирен и антрацен - свойствами репеллентов для некоторых (10% от общего числа испытанных штаммов коллекции). В таблице 4 приведены в качестве примера хемотаксические свойства для трех наиболее активных штаммов-деструкторов ПАУ в коллекции. Среди испытанных культур аттрактантных свойств к антрацену, пирену и флуорантену и репеллентных свойств к флуорантену не было обнаружено.

Таблица 4. Хемотаксические свойства микроорганизмов-деструкторов ПАУ

Штамм Аттракганг Репеллент

Pseudomonas sp. 8А нафталин пирен

Pseudomonas sp. 9A нафталин н/о

Pseudomonas sp. 10D нафталин, фенантрен антрацен

Примечание: н/о-не определен

Скорость хемотаксиса по отношению к нафталину для штаммов, представленных в таблице 4, была в 3,2-4,0 раза выше при температуре 26°С, чем при 8°С.

Таким образом, среди выделенных микроорганизмов-деструкторов ПАУ определены штаммы, принадлежащие к роду псевдомонад и обладающие наиболее выраженными хемотаксическими свойствами к нафталину и другим ПАУ.

Хемотаксические свойства к корневым выделениям растений

Для исследования хемотаксических свойств штаммов-деструкторов ПАУ по отношению к корневым выделениям растений были отобраны культуры, обладающие подвижностью. Экспериментально показано, что корневые выделения растений обладали как аттрактантными, так и репеллентными свойствами по отношению к 20-ти штаммам псевдомонад которые демонстрировали способность осуществлять деградацию ПАУ. В табл. 5 приведены данные для трех наиболее активных в отношении ПАУ штаммов.

Таблица 5. Хемоэффекторные свойства корневых выделений растений по отношению к штаммам псевдомонад-деструкторов ПАУ

Корневые выделения

Штамм Пшеница Овес Горох в X с. а 2 Ч WnPB« белый красный = 8 1 1 t i

8А А А R А А А R

9А А А R А А А А

10D R R А А А А R

Примечание: А - аттрактантные; R - репеллентные свойства

Так, штамм Pseudomonas sp. 8А, который был хемотаксически активен к нафталину, проявил аттрактантные свойства к корневым выделениям 5-ти исследуемых растении, кроме гороха и овсяницы. А штамм 9А проявил еще большие аттрактантные свойства к корневым выделениям, только выделения гороха оказали репеллентные свойства. У штамма 10D были обнаружены аттрактантные свойства к бобовым (горох), а репеллентные - к злаковым (пшеница, овес, овсяница) культурам.

Устойчивость растений к присутствию ПАУ в почве определяли по их всхожести и росту в условиях вегетационного опыта. На Рис. 1 представлены результаты экспериментов, иллюстрирующих всхожесть семян шести растений при различных концентрациях ПАУ в почве. Оказалось, что с увеличением содержания ПАУ в почве, всхожесть посеянных семян резко уменьшилась. Причем, самая высокая концентрация ПАУ в почве (1000 мг/кг) полностью подавляла всхожесть семян гороха, клевера белого и овсяницы. Около 10% всхожести было отмечено при 1000 мг/кг почвы для семян пшеницы и клевера красного. Наибольшей устойчивостью к высокой концентрации ПАУ в почве обладали семена только люцерны и овса (37 и 35% всхожести соответственно).

Бактеризация семян хемотаксически активными штаммами-деструкторами, в целом, повысила всхожесть семян растений. На загрязненной почве наиболее значительное повышение всхожести было при инокуляции семян штаммами-деструкторами P. alcaligenes MEV (8A) и P. stuteri MEV-S1 (9А) по сравнению с неинокулированными (контрольными) семенами. Для менее чувствительных к высокому содержанию ПАУ в почве (1000 мг/кг) семян люцерны и овса отмечено и наибольшее увеличение их всхожести (на 75 и 61% соответственно) при инокуляции штаммом P. alcaligenes MEV (8А) (Рис. 2).

При концентрации ПАУ в 1000 мг/кг семена гороха, клевера и овсяницы не проросли. На их всхожесть не оказала никакого влияния и инокуляция штаммами-деструкторами, для которых корневые выделения этих растений являются аттрактантами.

Рис 1 Всхожесть семян растений при разных концентрациях ПАУ в дерново-подзолистой почве

Т.р -клевер красный, F.p - овсяница луговая, P.a.- горох, Т.а.- пшеница, А-s.- овес, M.s -люцерна.

Рис. 2 Всхожесть семян растений, предварительно обработанных культурами микроорганизмов при разных концентрациях ПАУ в дерново-подзолистой почве

Т.р. -клевер красный, Т.р.+ - клевер красный + штамм 8А, овес, А.8.+ - овес + штамм 8А, М.8 - люцерна, М.5.+ - люцерна + штамм 9А

Дальнейшая серия экспериментов была нацелена на выявление изменений формирования и накопления надземной и корневой марсы растений в присутствии различных концентраций ПАУ. Показано, что наличие ПАУ в почве приводило к уменьшению как надземной, так и корневой биомассы растений, причем с увеличением концентрации ПАУ их ингибирующий эффект на растение возрастает (Рис. 3 и 4). Содержание ПАУ, равное 500 мг/кг, существенно снижало надземную и корневую биомассу гороха (примерно на 75% по сравнению с контролем), а биомассу люцерны - только на 4-6% Высокая концентрация ПАУ в почве (1000 мг/кг) полностью ингибировала рост и накопление биомассы, у гороха, белого клевера и овсяницы Инокуляция семян гороха, люцерны, клевера белого и красного штаммом 10D не изменяла содержание массы растений по сравнению с контролем. Бактеризация семян другими хемотаксически активными микроорганизмами-деструкторами изменяла накопление биомассы растениями, увеличивая ее. Наиболее значительно накопление надземной и корневой части растений наблюдали в вариантах с внесением штаммов 8А (МЕУ) и 9А (МЕЕУ-^Н) Из исследованных растений, люцерна и овес давали наибольший прирост надземной и корневой биомассы, в том числе и почве с ПАУ. При высоком содержании ПАУ в почве (1000 мг/кг) инокуляция семян овса и люцерны штаммами 8А и 9А приводила даже к некоторому возрастанию надземной и корневой части растений (Рис. 5).

Рис. 3. Влияние степени загрязнения почвы ПАУ на рост надземной массы растений (вегетационный опыт, 28 суток).

Р.р. - овсяница луговая; Т.а1. -клевер белый, Р.а.- горох; Т.а,- пшеница; А.!.- овес; М.9. люцерна

Рис. 4 Ингибирование роста корневой массы растений на дерново-подзолистой почве загрязненной ПАУ (вегетационный опыт, 28 суток).

К.р. - овсяница луговая; Т.а1. -клевер белый; Р.а - горох; Т.а.- пшеница; А.в.- овес; М.з,-люцерна.

Рис. 5. Защитное действие инокуляции семян на рост надземной массы растений на дерново-подзолистой почве при различной степени загрязненности ПАУ (вегетационный опыт, 28 суток).

Таким образом, результаты экспериментов по накоплению биомассы растений в условиях загрязнения почвы ПАУ свидетельствовали о повышении устойчивости растений, если семена этих растений перед посадкой в загрязненную почву были инокулированы хемотаксически активными штаммами-деструкторами. Значительное повышение устойчивости растений к загрязнению ПАУ (по накоплению биомассы и всхожести семян) отмечено при инокуляции семян Р.ака^епез МЕУ(8А) и Р. зШтрп МЕУ-81 (9А). Наиболее устойчивыми растениями к загрязнению ПАУ оказались овес и люцерна

Растительно-микробные ассоциации в очистке почвы от ПАУ (вегетационный эксперимент).

Исследования по деградации отдельных ПАУ в вегетационных условиях в почве, в которую были внесены микроорганизмы-деструкторы отдельно и вместе с растениями (предварительная инокуляция), показали, что в почве без растения и с растением (люцерна, овес, пшеница, клевер белый и красный) содержание каждого индивидуального ПАУ (фенантрен, антрацен, пирен и флуорантен) мало изменялось с течением времени. Следовательно, индивидуальные ПАУ в почве вегетационного опыта практически не подвергались процессам деградации как за счет аборигенной микрофлоры почвы, так и за счет жизнедеятельности растений.

Внесение в почву штаммов-деструкторов приводило к уменьшению содержания отдельных ПАУ, особенно через 2 месяца. Так, фенантрен в почве с микробным инокулятом исчезал на 55-73% от исходного содержания через 56 суток после его внесения (Рис. 6). Антрацен и пирен исчезали в почве с микробным инокулятом только на 14-18 и 10-14% соответственно (Рис. 7 и Рис. 8), а флуорантен - на 31-34% по сравнению с нативной почвой (Рис. 9). Штамм Р. ака^епез МЁУ (8А) наиболее активен в почве по отношению к фенантрену, менее - к флуорантену, и минимальное исчезновение в почве с микробным инокулятом отмечено для антрацена и пирена,

Ассоциация Р. ака^епез МЕУ с растениями приводила к существенному снижению содержания загрязнителя в почве. Так, через 56 суток после внесения ПАУ содержание фенантрена в почве уменьшилось с 125 до 6,3 и 13,7 мг/кг, для ассоциации с люцерной и клевером красным, соответственно. Содержание антрацена и пирена через 56 суток уменьшилось незначительно (на 10-20%) по сравнению с их исходным содержанием.

Таким образом, применение ассоциации Р. ака^епез МЁУ с растениями (люцерна, овес, пшеница, клевер красный и белый) позволило снизить суммарное содержание ПАУ через 2 месяца инкубации примерно на 50% по сравнению с их исходным содержанием в почве. Причем, фиторемедиация дерново-подзолистой почвы в условиях эксперимента (ПАУ 500 мг/кг) с применением растительно-микробной ассоциации, была эффективной и примерно одинаковой для всех испытуемых растений. Инокуляция в почву только Р. ака^епез МЕУ (без растения) позволила снизить содержание ПАУ в почве на 27-32% за 56 суток, что значительно меньше, чем обработка почвы растительно-микробной ассоциацией.

Внесение в загрязненную почву другого хемотаксически активного штамма Р. $Ш1еп МЕУ-81 также способствовало очищению почвы. Так, через 56 суток ассоциация Р. $Ш1еп МЕУ-81 с люцерной, овсом, пшеницей, овсяницей, клевером белым и красным снизила содержание суммы отдельных ПАУ на 56, 53, 48, 49, 54 и 47%, соответственно, по сравнению с их исходным содержанием.

Через 56 суток в почве с бактериальным инокулятом отмечено снижение концентрации фенантрена, антрацена, пирена и флуорантена, в среднем, на 82, 25, 16 и 38%, соответственно. Для сравнения, через 56 суток в почве по воздействием растительно-микробной ассоциации штамма Р. $Ш1еп МЕУ-81 и люцерны концентрации фенантрена, антрацена, пирена и флуорантена уменьшились в среднем, на 96, 35, 26 и 55%, соответственно.

Все испытанные растительно-бактериальные ассоциации существенно уменьшали содержание фенантрена и флуорантена, и слабее содержание антрацена и пирена.

Рис 6 Изменение концентрации фенантрена в дерново-подзолистой почве при выращивании люцерны без и с предварительной бактеризацией семян Р. ака1щвт МЕУ (8А) в условиях вегетационного опыта (исходное содержание фенантрена составляло 125 мг/кг почвы)

Рис 7. Изменение концентрации антрацена в дерново-подзолистой почве при выращивании люцерны без и с предварительной бактеризацией семян Р.ака1%вт МЕУ (8А) в условиях вегетационного опыта (исходное содержание антрацена составляло 125 мг/кг почвы)

Рис 8 Изменение концентрации пирена в дерново-подзолистой почве при выращивании овса без и с предварительной бактеризацией семян Р. alcahgenes ИЕУ (8А) в условиях вегетационного опыта (исходное содержание пирена составляло 125 мг/кг почвы)

Время, сут.

Рис. 9. Изменение концентрации флуарантена в дерново-подзолистой почве при выращивании овса без и с предварительной бактеризацией семян Р. alcahgenes ИЕУ(в условиях вегетационного опыта (исходное содержание флуарантена составляло 125 мг/кг почвы).

Таким образом, внесение в почву штаммов P. Stutzen MEV-S1 и P.alcahgenes MEV приводило к ощутимому уменьшению (на 35-38%) среднего содержания ПАУ при уровне загрязнения 500 мг/кг суммарного содержания ПАУ. Растительно-микробные ассоциации вызывали более существенное уменьшение содержания ПАУ, в среднем на 50-55% по сравнению с их исходным содержанием за два месяца вегетационного эксперимента Аналогичные возможности по фитобиоремедиации дерново-подзолистых почв были продемонстрированы растительно-микробными ассоциациями в случае высоких уровней загрязнения почвы (1000 мг/кг суммарного содержания ПАУ). Изменение численности интродуцированных в почву штаммов-деструкторов В условиях лабораторного эксперимента (постоянная температура и оптимальная влажность почвы) изучалось поведение интродуцированных штаммов по изменению их численности во времени. Показано, что в почве численность интродуцированных штаммов постоянно снижалась, а особенно существенно через 4-5 недель после их внесения. В почве вблизи корней растений (ризосфера) интродуцированные штаммы сохраняли довольно высокую численность (около 3x105 кл/r) на протяжении 8 недель наблюдения (Рис.10). Очевидно, что в ризосфере люцерны и овса интродуцированные штаммы-деструкторы ПАУ сохраняли относительно высокую численность, в отличие от неризосферной почвы, что и определяло их активность в деградации ПАУ.

Рис. 10. Численность клеток P. stutzen MEVS1 в почве и ризосфере люцерны (60% полной влагоемкости, 20°С, лабораторный эксперимент).

Влияние интродуцированных микроорганизмов на микробную и грибную составляющие аборигенную микрофлоры почвы и ризосферы

Интродуцированные штаммы микроорганизмов-деструкторов ПАУ (Р. alcatigenesМЕУш Р. МЕУ-81) в количестве 5Х105 кл/г почвы не оказали заметного влияния на

содержание грибной и бактериальной биомассы аборигенной ризосферы растений. Содержание грибной и бактериальной биомассы в почве с инокулятом бактерий не отличалось от контроля. Изменения содержания биомассы (грибной и бактериальной) в контрольной и инокулированной почве в течение 30 суток были одинаковы: увеличение грибной биомассы в почве отмечено на 6-ые, а бактериальной - на 15-ые сутки наблюдения.

Биоочистка почвы, загрязненной углеводородами нефти (полевой эксперимент) Получение биомассы микроорганизмов-деструкторов для интродукции в почву Для полевых экспериментов по интродукции штаммов-микроорганизмов в почву необходимо значительное количество активной биомассы деструкторов. Для этого культуры хемотаксически активных штаммов-деструкторов ПАУ выращивали при периодическом культивировании в жидкой питательной среде на основе ферментативного щдролизата рыбной муки. К концу логарифмической и началу стационарной фазы роста (20 час) численность штамма МЕУ была 5,12x10' кл/мл, а МЕУ-81 - 4.73x10' Кл/мл питательной среды. Показано также, что жизнеспособность бактерий к началу стационарной фазы роста составляла 92 и 96% для штамма МЕУн МЕУ-8, соответственно.

Полевой эксперимент по биоочистке загрязненной нефтью и дизельным топливом дерново-подзолистой почвы проводили в 2001 г. с 15 мая по 15 сентября. Загрязненные участки почвы засевали наиболее устойчивыми к ПАУ растениями (люцерной и овсом), семена которых предварительно инокулировали штаммами-деструкторами. За 4-х месячный период наблюдения содержание нефти и дизельного топлива в почве снижалось естественным образом (табл. 6, вариант без растения). Однако введение растительно-микробной ассоциации заметно стимулировало этот процесс. Концентрация углеводородов нефти при фитомикробоочистке была, примерно, в 5-6 и 1619 раз меньше, чем на участках, загрязненных нефтью и дизельным топливом без биоочистки (табл. 6).

Оценка изменения содержания 16-ти индивидуальных ПАУ, относящихся к приоритетным загрязнителям и канцерогенным ПАУ, показала, что растительно-микробные ассоциации способны к значительной очистке почвы. Посевы люцерны, инокулированной штаммом псевдомонады МЕУ-81, уменьшали общее содержание приоритетных загрязнителей в 2,5 раза по сравнению с контролем (содержание ПАУ нефти в почве без растений). Посев овса, инокулированного штаммом МЕУ, снижал общее содержание приоритетных ПАУ почти в 2 раза по сравнению с почвой без растений (табл. 7).

Ризоремедиация почвы, загрязненной дизельным топливом, проходила более интенсивно, чем на участке с нефтью. За четыре месяца содержание ПАУ в почве уменьшилось на 79 и 85% на участках с растительно-микробными ассоциациями люцерны и овса, соответственно, по сравнению с участком без растений. Таким образом, результаты полевого эксперимента по ризоремедиации почвы от ПАУ (нефть и дизельное топливо) убедительно свидетельствуют о высокой эффективности предложенного метода биоочистки почвы. Ускорение биоремедиации загрязненной ПАУ почвы происходило за счет растительно-микробной ассоциации. Такой биотехнологический подход возможен и для очистки других типов почв от загрязнений ПАУ в условиях умеренного климата.

Таблица 6 Концентрация углеводородов нефти в дерново-подзолистой почве, загрязненной нефтью и дизельным топливом (полевой опыт)

Загрязнитель Исходное содержание углеводородов (мг/кг) Суммарное содержание углеводородов нефти в почве через 17 недель, мг/кг

Без растений Люцерна+ Р.зШОег1 МЕУ-31 Овес + Р.ЫсаЬ&пез МЕУ

Нефть 1627,2*12,4 1360,8±12,3 16* 204,4±12,7 85** 238,2±12,5 82

Дизельное топливо 2206,7±13,2 1820,3±13,6 17 116,6±12,3 94 96,4± 11,7 95

* - % естественный убыли

** - % деструкции относительно контроля

Таблица 7. Концентрация ПАУ в дерново-подзолистой почве, загрязненной нефтью и дизельным топливом (полевой эксперимент).

Загрязняющее вещество Концентрация ПАУ в почве, мг/кг

То* Через 17 недель

Без растений Люцерна+ Р. зштеп МЕУ-З! Овес + Р. ака1^епе$ МЕУ

£ 16-ти приоритетных ПАУ (нефть) 159,1±6,9 136,8±6,8 14%** 55,8±6,8 59%*** 69,9±6,8 49%

I 16-ти приоритетных ПАУ (дизтопливо) 543,4±7,1 473,9±6,9 13% 98,8±6,9 79% 73,5±6,9 84%

* - в момент начала полевого эксперимента; ** - % естественный убыли; *** - % деструкции относительно контроля

Изучение динамики численности интродуцированных штаммов в почве и прикорневой зоне растений

Для условий полевого эксперимента была определена динамика уменьшения численности интродуцированных микроорганизмов в почве и ризосфере. Так, численность штамма ИЕУ-в почве снижалась практически до нуля уже через 2 месяца после внесения, а штамма ИЕУ - через 3 месяца. Однако в ризосфере люцерны и овса численность штаммов-деструкторов на протяжении почти 2-х месяцев не уменьшалась, а был небольшой рост. Только через 3 месяца после интродукции микроорганизмов в почву (ризосфера) их численность начинала снижаться, и этот процесс продолжался до 6-7 месяцев от начала интродукции (Рис.11). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высокой жизнеспособности

интродуцированных микроорганизмов в ризосфере, особенно в период вегетативного роста растений, и их конкурентоспособности по отношению к аборигенной почвенной микрофлоре.

Рис. 11. Динамика численности клеток P. stutzen MEVS1 в почве и ризосфере люцерны (полевой эксперимент)

Изучение безвредности микроорганизмов-деструкторов ПАУ: токсичность, токсигенность. инфективность, вирулентность.

Из рабочей коллекции штаммов-деструкторов были отобраны наиболее активные штаммы (деструктивно и хемотжсически) Pseudomonasspp.: 2А, 6А, 8А, 9 А, 5В, 5С, 6С, 3D, 7D, 10D.

Токсичности штаммов выделенных культур не было обнаружено (табл. 8). Гибели экспериментальных белых мышей и крыс за период наблюдения (1 месяц) не установлено.

Токсигенность для белых мышей и крыс была установлена для следующих штаммов-деструкторов: Pseudomonas spp.: 2А, 6А, 5В, 5С, 6C,3D, 7D.

Инфективность исследованных микроорганизмов, определяемая по их способности к диссеминации в органах животных, не обнаружена. Рост ретрокультур (штаммы вводились животным внутрижелудочно) в высевах из органов и крови животных не наблюдался.

Вирулентность. Летальная доза 50% для белых мышей и крыс (ЛДя) после введения им перорально и внутрибрюшинно чистых культур микроорганизмов не была определена

Таким образом, на основании указанных признаков патогенности сделано заключение, что P. alcahgenes (штамм 8А), P. stutzen (штамм 9А) и P. sp. 10D не патогенны для теплокровных животных и, следовательно, удовлетворяют требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Таблица 8 Патогенностъ микроорганизмов-деструкторов для теплокровных животных

Штамм Признаки патогенности Патогенностъ

Токси чносп. Токсиген ность Диссеминация микроорганизмов ДД» (клетки)

2А - + - >10' +

ЗА _ + - >10® +

MEV - - - >10' _

MEV-S1 - - - >10* _

SB - + _ >10* +

5С - + — >10® +

6С - + - >10" +

3D - + _ >10' +

7D - + - >10» +

10D - - - >10* -

Примечание + наличие признака,-отсутствие признака.

Токсичность почвы, загрязненной ПАУ (полевой эксперимент) Фитотоксичность почвы. Прорастание семян салата и длина его корней были наименьшими для загрязненной почвы перед началом эксперимент В вытяжке из почвы загрязненных участков (вариант «без растений») спустя 17 недель после начала наблюдения прорастание семян салата увеличилось, примерно на 30% и, соответственно, возросла средняя длина корней этого растения И только для вытяжки из загрязненной почвы, где были посажены люцерна и овес, семена которых были предварительно бактеризованы микроорганизмами-деструкторами ПАУ (штаммы Pseudomonas), отмечено возрастание доли проросших семян салата в 2,2-2,9 раза и длины его корней в 1,7-2,3 раза по сравнению с контрольной почвой (Рис 12)

Генотоксичность почвы Число ревертантов штаммов Salmonella typhmurmm TA98 и ТА100 под воздействием водных почвенных вытяжек достоверно уменьшилось в вариантах, с почвой подвергнутой очистке растительно-микробной ассоциацией

Токсичность. Жизнеспособность красных дождевых червей Eisenia fetida Andrei оценивалась путем прямого подсчета жизнеспособных особей в образцах почв Оказалось, что загрязненная почва перед началом биоремедиации угнетала жизнеспособность червей на 95% от их общего числа, только 5% червей оставались жизнеспособными Почва загрязненных участков (вариант «без растений») спустя 17 недель после начала наблюдения, также угнетала жизнеспособность червей, которая составляла примерно 20% от их общего числа. Однако почва, подвергнутая очистке с помощью растительно-микробных ассоциаций, не оказывала значительного ингибирующего влияния на дождевых червей Только 20% из них (это в 12-13 раз больше, чем в исходно загрязненной почве) теряли жизнеспособность под влиянием очищенной почвы (Рис 13) Таким образом, эффективность очистки почвы, загрязненной ПАУ, под влиянием растительно-микробных ассоциаций подтверждена тестами, иллюстрирующими снижение ее токсичности, фитотоксичности и генотоксичности

Рис 12 Ингибирование прорастания семян салата под воздействием водной вытяжки из дерново-подзолистой почвы с участков, загрязненных нефтью и дизельным топливом

Рис 13 Жизнеспособность дождевых червей в образцах дерново-подзолистой почвы с участков, загрязненных нефтью и дизельным топливом

Патентование микроорганизмов-деструкторов ПАУ

Наиболее активные штаммы микроорганизмов-деструкторов P. alcaltgenes MEV и Р. stutzen MEV-S1 были депонированы в коллекцию промышленных микроорганизмов ГНИИгенетики (г. Москва), штамм P. alcahgenes MEV - под № В-8277, а штамм P.stutzen MEVS1 - под № 8278. На эти штаммы поданы патентные заявки в Российское агентство по патентам и товарным знакам и получены патенты RU № 2228953 и RU № 2228952 соответственно.

Заключение

Возрастающие масштабы загрязнения объектов окружающей среды, включая почвы, полициклическими ароматическими углеводородами заставляет искать пути ее очистки быстрыми, эффективными, экономически оправданными и экологичными методами. Основой предложенного биоремедиационного подхода является получение и применение чистых культур микроорганизмов-деструкторов ПАУ, обладающих комбинированными хемотаксическими свойствами к этим соединениям и корневым выделениям растений. Интродукция штаммов-деструкторов в почву осуществляется путем бактеризации семян растений, к корневым выделениям которых имеется хемотаксическая реакция микроорганизмов, с последующим выращиванием этих растений на загрязненной ПАУ почве. Такой подход, сочетающий микробный и растительный компоненты для очистки почвы, является вариантом фиторемедиации Основным и необходимым элементом такого подхода является использование культур микроорганизмов-деструкторов ПАУ, которые были выделены из ризосферы растений, произроставших на почвах, длительно загрязненных ПАУ. Был выделен широкий спектр хемотаксически активных штаммов-деструкторов и подобраны растения, обладающие устойчивостью к повышенным концентрациям ПАУ в почве, их корневые выделения обладали атграктантными свойства в отношении микроорганизмов-деструкторов. Бактеризованные микроорганизмами растения-мелиоранты показали высокую эффективность в процессе очистки почвы от ПАУ в лабораторных вегетационных и полевых условиях. Применение растительно-микробной ассоциации на дерново-подзолистой почве в условиях средней полосы России снизило общее содержание ПАУ на участках, загрязненных нефтью на 56%, а дизельным топливом - на 87% относительно контрольного участка в течение одного вегетационного периода

Интродуцированные в почву микроорганизмы были оценены на безвредность (отсутствие патогенности) по летальной дозе для лабораторных животных и наличию эндо- и экзотоксинов, выделяемых в окружающую среду. Также было показано отсутствие потенциального влияния интродуцированных штаммов на аборигенную микрофлору почвы.

Таким образом, применение растительно-микробных ассоциаций для очистки почв, загрязненных ПАУ, эффективно и экологически безвредно, что позволяет рекомендовать его для внедрения в практику.

Выводы

1. Из образцов ризосферы и почв, загрязненных нефтью и каменноугольной смолой, с территорий России и Украины, выделено 57 штаммов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), способных к активному хемотаксису к корневым выделениям опытных растений и ряду ПАУ. Наибольшая активность деградировать ПАУ обнаружена у двух хемотаксически активных штаммов P. alcahgenes MEV и P. stutzen MEV-S1

2. Создана коллекция хемотаксически активных штаммов-деструкторов ПАУ и разработаны условия их хранения. На наиболее активный штамм-деструктор P. stutzen MEVS1 получен патента на изобретение РФ.

3. Из числа испытанных растений, наиболее устойчивыми к высоким содержаниям ПАУ в почве оказались люцерна (Medtcago satwa) и овес (Avena sativa).

4. Получены активные растительно-микробные ассоциации для очистки почв, загрязненных ПАУ. В лабораторных условиях показано, что наиболее эффективными ассоциациями для очистки дерново-подзолистой почвы от ПАУ являются овес + P. alcaligenes МЕУк люцерна + P. stutzeri MEV-S1. Они обеспечивают очистку почвы от ПАУ за два месяца вегетационного периода на 53 и 55 % соответственно. Установлено, что снижение содержания ПАУ в почве сопровождается уменьшением ее фитотоксичности и генотоксичности.

5. В полевых экспериментах продемонстрирована высокая эффективность растительно-микробных ассоциаций для очистки почв, загрязненных нефтью и дизельным топливом. Степень очистки от ПАУ за 17 недель вегетационного периода составила 65 и 82 % соответственно.

Список публикаций по теме диссертации

1. Марченко А.И., Аддобаев В.Н., Воробьев А.В., Дядищев Н.Р., Соколов М.С.

Растительно-микробные ассоциации для очистки почвы от загрязнения полициклическими

ароматическими углеводородами //Агро XXI2003/2004 № 712 с. 110-112.

2. Патент RU № 2228952,20.05.2004 г., БИПМ № 14.

3. Жариков ГА, Марченко А.И., Дядищева В.П., Кобелева Т.В., Алдобаев В.Н. Лабораторная оценка интегральной токсичности и генотоксичности почв, загрязненных полициклическими ароматическими углеводородами // Тезисы докладов конференции -Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды, Пущино, 2001 г, С.9,10.

4. Алдобаев В.Н. Изучение динамики численности микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов в ризосфере растений //Международная научно-практическая конференция "Актуальные проблемы экологии в условиях современного мира", г. Майкоп, 2001 г., с. 14

5. Марченко А.И., Алдобаев В.Н., Воробьев А.В., Жариков ГА, Боровик Р.В., Соколов М.С. Ризосферная ремедиация почв от загрязнения нефтепродуктами // II Московский международный Конгресс - Биотехнология: состояние и перспективы развития, г. Москва, 10-14 ноября 2003 г., с. 19

6. Марченко А.И., Воробьев А.В., Алдобаев ВЫ., Дядищев Н.Р., Соколов М.С. Surfactant-producing strain-degraders for hydrophobic organic compound polluted soil cleanup // International Symposium: Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants, Saratov, Russia, 28-30 July 2003, C.25.

7. Алдобаев В.Н., Марченко А.И., Воробьев A.B., Дядищев Н.Р. Сурфактантобразующие

микроорганизмы для биоремедиации почв, загрязненных полициклическими

ароматическими углеводородами // Тезисы: Биотехнология - народному хозяйству 2000,

АООТ "Биохиммаш", г. Москва, С. 55,56.

Подписано в печать 14.09.2004 г. Формат 60 х 84716.

Объем 1,25 п. л. Тираж 100 экз. Заказ 2533.

ГУП МО «Серпуховская типография» Министерство по делам печати и информации Московской области

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Алдобаев, Владимир Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) в окружающей среде: содержание, источники, формы соединений, методы определения, свойства.

2. ПАУ в почвах.

3. Очищение объектов окружающей среды от ПАУ.

3.1 Очистка почв от ПАУ: способы, подходы, технологии.

3.1.1 Очистка с помощью микроорганизмов: аборигенная микрофлора, интродуцированные микроорганизмы-деструкторы.

3.1.2 Очищение растениями.

3.1.3 Хемотаксически активные микроорганизмы-деструкторы ПАУ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Микроорганизмы-дестру кторы ПАУ.

1.1 Выделение, идентификация и свойства чистых культур микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

1.2 Деградация ПАУ чистыми культурами в питательной среде.

1.3 Изучение хемотаксических свойств выделенных микроорганизмов.

1.3.1 Хемотаксические свойства к отдельным ПАУ.

1.3.2 Хемотаксические свойства к корневым выделениям растений.

2. Очистка почвы от ПАУ.

2.1 Выбор растений, устойчивых к высоким концентрациям ПАУ в почве.

2.2 Очистка почвы от ПАУ растительно-микробными ассоциациями

3. Изменение численности и биомассы интродуцированной и аборигенной микрофлоры.

3.1 Изменение численности интродуцированных в почву микроорганизмов-деструкторов.

3.2 Влияние интродуцированных штаммов на аборигенную микробную и грибную биомассу ризосферной почвы.

3.3 Вертикальная и горизонтальная миграция в почве хемотаксически активных микроорганизмов-деструкторов.

4. Биоочистка почвы, загрязненной углеводородами нефти

4.1 Получение биомассы микроорганизмов-деструкторов для интродукции в почву.

4.2 Очистка почвы растительно-микробной ассоциацией.

4.3 Изучение динамики численности интродуцированных штаммов в почве и ризосфере растений.

5. Безопасность микроорганизмов-интродуцентов и токсичность почвы при загрязнении ПАУ.

5.1 Изучение токсичности микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

5.2 Токсичность почвы, загрязненной ПАУ

6. Коллекция штаммов-деструкторов ПАУ.

6.1 Влияние условий хранения штаммов-деструкторов на их жизнеспособность.

6.2 Патентование микроорганизмов-деструкторов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Очистка почвы от загрязнения полициклическими ароматическими углеводородами на основе применения хемотаксически активных микроорганизмов ризосферы растений"

Актуальность работы. Загрязнение окружающей среды полициклицескими ароматическими углеводородами (ПАУ) является серьезной угрозой, в том числе и для здоровья человека. ПАУ обладают мутагенными, тератогенными и канцерогенными свойствами (International Agency for Research on Cancer, 1983; Phillips, 1983; Cerniglia, Heitkamp, 1989) и относятся к приоритетным загрязнителям (Lu et al., 1977; Keith, Teelliard, 1979; Пиковский, 1993), которые попадают в окружающую среду, в том числе и почву, в виде промышленных выбросов предприятий химической и нефтехимической промышленности. Загрязнение почв ПАУ приводит к уменьшению их плодородия и, соответственно, качества сельскохозяйственной продукции (Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем, 1988). Одним из перспективных способов решения проблемы загрязнения почв ПАУ -разработка методов и подходов их очистки и детоксикации, и прежде всего, биодетоксикации и биоремедиации.

Накоплен большой опыт применения микроорганизмов-деструкторов и растений-мелиорантов (Banks et al., 1993; Susarla et al., 2002) для очистки почвы от ПАУ, включая чистые культуры микроорганизмов (Гусев, Суровцева, Коронелли, 1981; Heitkamp, Cerniglia, 1988; Коронелли, 1996), их ассоциации (Барышникова и др., 2001; Кобзев и др., 2001; Белоусова и др., 2002) и бактериальные препараты (Булатов и др., 1997). Однако очистка почв от трудноразлагаемых соединений ПАУ в естественных условиях, в том числе с применением микробных культур и созданных на их основе препаратов, не всегда экологически оправдана и экономически выгодна. Поэтому в настоящее время продолжается поиск активных культур деструкторов ПАУ и биотехнологических подходов для интродукции и создания условий их активной деятельности в деградации поллютантов.

Установлено, что биодеградация ПАУ почвенными микроорганизмами наиболее интенсивно происходит в ризосфере корней растений (Schwab, Banks, 1994; Reilley et al., 1996; Siciliano, Germida, 1999; Liste, Alexander, 2000; Siciliano et al., 2003). Однако поиск микроорганизмов-деструкторов ПАУ в богатой микроорганизмами и корневыми выделениями ризосферной почве территорий, продолжительное время загрязненных ПАУ и обладающих хемотаксическими свойствами по отношению к соединениям ПАУ и корневым выделениям растений, до наших исследований не проводился.

По этому целью данной работы было - изучение ризосферных хемотаксически активных микроорганизмов-деструкторов, как основного компонента активных растительно-микробных ассоциаций для очистки почвы от ПАУ.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Выделение чистых культур микроорганизмов-деструкторов из ризосферы и почв разных типов, длительно загрязненных ПАУ.

2. Поиск микроорганизмов-деструкторов, обладающих хемотаксическими свойствами к ПАУ и корневым выделениям опытных растений.

3. Выявление растений, обладающих устойчивостью к повышенному содержанию ПАУ в почве.

4. Поиск и применение наиболее активной растительно-микробной ассоциации для очистки почвы, загрязненной ПАУ.

5. Создание коллекции и изучение условий хранения хемотаксически активных штаммов-деструкторов.

Научная новизна работы. Впервые из ризосферы растений, произрастающих на загрязненных территориях, выделены чистые культуры микроорганизмов, обладающие комбинированной способностью осуществлять деструкцию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) и быть хемотаксически активными к ПАУ и корневым выделениям растений. Создана растительно-микробная ассоциация путем бактеризации семян растений штаммами-деструкторами для посева в загрязненную ПАУ почву с целью фитобиоремедиации. Показана высокая эффективность растительно-микробных ассоциаций для очистки почвы от ПАУ и других углеводородов нефти.

В условиях вегетационных и полевых экспериментов показана высокая эффективность применения созданной растительно-микробной ассоциации для очистки почвы от ПАУ и разработаны практические рекомендации по применению метода in situ для фиторемедиации почв.

На один из наиболее активных штаммов-деструкторов P. stutzeri MEV-S1 был получен патент RU № 2228952.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на пяти конференциях: "Биотехнология - народному хозяйству 2000", АООТ "Биохиммаш", г. Москва, "Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды", Пущино, 2001 г., "Актуальные проблемы экологии в условиях современного мира", г. Майкоп, 2001 г., II Московский международный Конгресс - Биотехнология: состояние и перспективы развития, г. Москва, 10-14 ноября 2003 г., International Symposium: Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants, Saratov, Russia, 28-30 July 2003, опубликованы в Агро XXI, оформлены в виде отчетов по проекту № 1429 МНТЦ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 139 страницах машинописного текста, содержат 11 рисунков, 31 таблицу. Список литературы включает 244 наименования.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Алдобаев, Владимир Николаевич

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Микроорганизмы-деструкторы ПАУ

1.1. Выделение, идентификация и свойства микроорганизмов-деструкторов

ПАУ

Из ризосферы растений, произрастающих на загрязненных ПАУ почвах разной типовой принадлежности и географически удаленных друг от друга (табл. 4), выделены 71-на чистая культура микроорганизмов, способных к деградации ПАУ в минимальных жидких средах в лабораторных условиях. Выделенные микроорганизмы принадлежали к разным таксономическим группам. Наибольшая часть изолятов относилась к неспоровым бактериям рода Pseudomonas (30). В меньшей степени были представлены роды:

Arthrobacter (7), Rhodococcus (5), Alcaligenes (6), Azospirillum (4), Mycobacterium (5) и др. Одной из задач исследования при работе с микроорганизмами-деструкторами было определение двигательной активности культуры. Большинство выделенных микроорганизмов обладали подвижностью (табл. 5). Однако, 14 культур микроорганизмов, относящихся к родам Rhodococcus, Mycobacterium, Micrococcus и Nocardia не обладали подвижностью. Это послужило основанием для исключения этих культур из рабочей коллекции для последующих экспериментов.

1.2. Деградация ПАУ чистыми культурами в питательной среде

Штаммы рабочей коллекции микроорганизмов-деструкторов (57) были проверены на способность развиваться на средах (жидких и агаризованных), в которых единственным источником углерода и энергии служили индивидуальные ПАУ. Все выделенные штаммы обладали способностью метаболизировать нафталин, 40 штаммов - фенантрен, 4 -антрацен, 5 -пирен и 11 - флуорантен. Затем были отобраны культуры, способные метаболизировать три и более различных ПАУ. Эти культуры (всего 6) принадлежали роду Pseudomonas. Проведенные опыты по деградации ПАУ показали, что культивирование штаммов псевдомонад в течение 5 суток на минимальной жидкой среде приводит к существенному уменьшению содержания отдельных ПАУ (табл. 6). Содержание нафталина выделенными штаммами снижалось на 76-88% относительно контроля (мертвые клетки), а фенантрена - на 37-66%. Более устойчивыми к микробной деградации оказались антрацен (уменьшение на 8-11%) и пирен (11-16%). Таким образом, по результатам деградации отдельных ПАУ в лабораторных условиях были выбраны шесть штаммов Pseudomonas sp., обладающих наибольшей активностью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алдобаев, Владимир Николаевич, Серпухов

1. Абдурахманов Р.Ф. Техногенез в подземной гидросфере Предуралья., Уфа, УНЦ РАН, 1993, 208 с.

2. Алексеева Т.А., Теплицкая Т.А. Спектрофлуорометрические методы анализа ароматических углеводородов в природных и техногенных средах., Л.: Гидрометеоиздат, 1981. 215 с.

3. Алиев С.А., Гаджиев Д.А. Влияние загрязнения нефтяным органическимвеществом на активность биологических процессов почв. // Известия АН СССР, сер. биол, 1977, № 2, 46-49.

4. Андресон Р.К., Мукатанов А.Х., Бойко Т.Ф. Экологические последствиязагрязнения почв нефтью // Экология, 1980, № 6, 21-25.

5. Балашова Н.И., Кошелева И.А., Филонов А.Е., Гаязов P.P., Воронин A.M. Штамм Pseudomonas putida BS3701 деструктор фенантрена и нафталина. // Микробиология, 1997, т. 4, 488-493.

6. Барышникова, Грищенков В.Г., Уринбасаров М.У., Шкидченко А. Н., Воронин A.M. Биодеградация нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде. // Прикладная биохимия и микробиология, 2001, т. 37, № 5, 542-548.

7. Белоусова И.Н., Барышникова, Шкидченко А. Н. Отбор микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов при пониженных температурах. // Прикладная биохимия и микробиология, 2002, т. 38, №5, 513-517.

8. Белых Л.И., Серышев В.А., Пензина Э.Э., Белоголова Г.А., Хуторянский

9. В.А. Содержание бенз(а)пирена в почвах некоторых районов Иркутской области. // Почвоведение, 1998, № 3, 334-341.

10. Воронин A.M. Плазмиды резистентности и биодеградации бактерий рода

11. Pseudomonas // Дисс. на соискание. д.б.н., 1987, М., 500 с.

12. Брезгунов В.Н., Завольский Л.Ю., Лазарев А.В., Попов В.Г. Хемотаксис бактерий. // Успехи микробиологии, 1989, № 23, с. 3-27.

13. Булатов А.И., Макаренко П.П., Шеметов В.Ю. Охрана окружающей среды в нефтегазовой промышленности., М., Недра, 1997, 443 с.

14. Бельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы. // Биотехнология, 1995, № 3-4, 20-27.

15. ВОЗ: заключение и рекомендации, опасность микробных препаратов для млекопитающих. // Бюлл. ВОЗ, т. 59, № 6, 20-27.

16. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем., под ред. Глазовской М.А., М., Наука, 1988, 254 с.

17. Габбасова И.М., Абдурахманов Р.Ф., Хабиров И.К., Хазиев Ф.Х. Изменение свойств почв и состава грунтовых вод при загрязнении нефтью и нефтепромысловыми сточными водами в Башкирии. // Почвоведение, 1997, № 11, 1362-1372.

18. Габбасова И.М., Хазиев Ф.Х., Сулейманов P.P. Оценка состояния почв с давними сроками загрязнения сырой нефтью после биологической рекультивации. // Почвоведение, 2002, № 10, 1259-1273.

19. Геннадиев А.Н. и др. Динамика загрязнения почв полициклическими ароматическими углеводородами и индикация состояния почвенных экосистем. // Почвоведение, 1990, № 10, 75-85.

20. Геннадиев А.Н., Шурубор Е.И., Козин И.С. Эколого-индикационное значение полициклических ароматических углеводородов в почвах Нижнего Поволжья. // Вестник МГУ, сер. геогр., 1991, № 3, 37-44.

21. Геннадиев А.Н., Шурубор Е.И., Козин И.С. Биогенные и техногенные полициклические ароматические углеводороды в почвах охраняемых территорий дельты Волги. // Биол. науки, 1992, № 1 (337), 133-143.

22. Геннадиев А.Н., Пиковский Ю.М., Флоровская В.Н., Алексеева Т.А., Козин И.С., Оглоблина А.И., Раменская М.Е., Теплицкая Т.А., Шурубор Е.И. Геохимия полициклических ароматических углеводородов в горных породах и почвах., М., Изд-во МГУ, 1996, 196 с.

23. Геннадиев А.Н., Козин И.С., Пиковский Ю.М. Педохимия полициклических ароматических углеводородов. // Почвоведение, 1997, № 3, 290-300.

24. Геннадиев А.Н., Козин И.С., Шурубор Е.И. Динамика загрязнения почв полициклическими ароматическими углеводородами и индикация состояния почвенных экосистем. // Почвоведение, 1990, № 10, 75-85.

25. Головлева Л.А., Финкелыптейн З.И., Баскунов Б.П., Алиева P.M., Шустова Л.Г. Микробная детоксикация сточных вод коксохимического производства. // Микробиология, 1995, т. 64, № 2, 197-200.

26. Головченко А.В., Полянская Л.М. Влияние нефти на численность, биомассу и жизнеспособность грибов в верховых торфяниках. // Микробиология, 2001, т. 70 (1), 111-117.

27. Грищенков В.Г., Гаязов P.P., Токарев В.Г., Кочетков В.В., Филонов А.Е., Воронин A.M. Бактериальные штаммы-деструкторы топочного мазута: характер деградации в лабораторных условиях. // Прикладная биохимия и микробиология, 1997, 33 (4), 423-427.

28. Гузев B.C., Халимов Э.М., Волде М.И., Куличевская И.С. Регуляторное действие глюкозы на активность углеродородокисляющих микроорганизмов в почве. // Микробиология, 1997, т. 66, № 2, 154-159.

29. Гусев М.В., Коронелли Т.В. Микробиологическое разрушение нефтяного загрязнения. // Изв. АН СССР, сер. биол., 1981, № 6, 835-844.

30. Демиденко А.Я., Демурджан В.М. Пути восстановления нефтезагрязненных почв черноземной зоны Украины. // В кн.: Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем., М., Наука, 1988, 197-206.

31. Доналдсон Н. Химия и технология соединений нафталинового ряда., М., Наука, 1963, 655 с.

32. Дядечко В.Н., Нестеров И.И., Толстокорова JI.E. Способ очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений., Патент 1428809 // Бюлл. Изобр., 1988, №37.

33. Звягинцева И.С., Поглазова М.Н., Готоева М.Т., Беляев С.С. Влияние солености среды на деструкцию нефтяных масел нокардиоподобными бактериями. // Микробиология, 2001, т. 70, № 6, 759-764.

34. Елисеев С.А., Кучер Р.В. Поверхностно-активные вещества и биотехнология., под ред. Кухарь В.П., Киев, Наукова Думка, 1991, 116 с.

35. Зимовец Б.А. Распределение солей в почвах солонцовых комплексов. // Почвоведение, 1981, № 1, 126-135.

36. Израэль Ю.А., Ровинский Ф.Я. Комплексный глобальный мониторинг состояния биосферы. // В кн.: Труды 3-го Межд. Симп., Ташкент, 1986, т. 1,89-105.

37. Изъюрова А.И. Скорость распада нефтепродуктов в воде и почве. // Гигиена и санитария, 1950, № 9, 9-15.

38. Ильницкий А.П. Экологические аспекты циркуляции полициклических ароматических углеводородов. // В кн.: Экология, Киев, Наукова Думка, 1985, 64-73.

39. Интродукция микроорганизмов в окружающую среду., отв. ред. Звягинцев Д.Г., М., Изд. МГУ, 1994, 130 с.

40. Исмаилов Н.М. Микробиология и ферментативная активность нефтезагрязненых почв. // В кн.: Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем., М., Наука, 1988, 42-57.

41. Кацы Е.И. Генетико-биохимические и экологические аспекты подвижности и хемотаксиса у фитопатогенных, симбиотических и ассоциированных с растениями бактерий. // Успехи современной биологии, 1996, т. 116, в. 5, 579-593.

42. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах., 1994, Уфа, 171 с.

43. Киреева Н.А., Новоселова Е.М., Хазиев Ф.Х. Активность карбогидраз в нефтезагрязненных почвах. // Почвоведение, 1998, № 12, 1444-1448.

44. Киреева Н.А., Водопьянов В.В. Математическое моделирование микробиологических процессов в нефтезагрязняющих почвах. // Почвоведение, 1996, № 10, 1222-1226.

45. Кириллова Н.П., Кожевин П.А., Звягинцев Д.Г. Динамика накопления клубеньковых бактерий на корнях проростков гороха. // Микробиология, 1984, т. 53, в. 1, 117-122.

46. Клар Э. Полициклические ароматические углеводороды. М.: Химия, 1971. т. 1,225 с.

47. Кобзев Е.Н., Петрикевич С.Б., Шкидченко А.Н. Исследование устойчивости ассоциации микроорганизмов-деструкторов в открытой системе. // Прикладная биохимия и микробиология, 2001, т. 37, № 4, 413-417.

48. Король А.Н., Лысюк Л.С. Хроматографические методы определения полициклических ароматических углеводородов в окружающей среде. // Журнал аналитической химии, 1979. т. 34, № 3, 577-590

49. Коронелли Т.В. Аракелян Э.И., Комарова Т.И., Ильинский В.В. Способ очистки почв от нефтяных загрязнений., Патент РФ 2019527. // БИ, 1994, № 17.

50. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология, 1996, т. 32, № 6, 579-585.

51. Коронелли Т.В. Комарова Т.И., Ильинский В.В., Кузьмин Ю.И., Кирсанов Н.Б., Яненко А.С. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненую нефтью. // Прикладная биохимия и микробиология, 1997, т. 33, № 2, 198- 201.

52. Кочетков В.В., Балакшина В.В., Мордукова Е.А., Воронин A.M. Плазмиды биодеградации нафталина в ризосферных бактериях рода Pseudomonas. // Микробиология, 1997, т. 66, № 2, 211-216.

53. Кошелева И.А., Цой Т.В., Кулакова А.Н., Воронин A.M. Сравнительный анализ организации плазмиды NPL-1, контролирующей окисление нафталина клетками Pseudomonas putida и ее производных. // Генетика, 1986, т. 22,2383-2388.

54. Красильников Н.А. Микроорганизмы почвы и высшие растения., 1958, М., Изд. АН СССР

55. Кулакова И.И. О возможном механизме синтеза полициклических ароматических углеводородов в процессе эндогенного минералообразования. //Докл. АН СССР. 1982. т. 266, № 4, 1001-1003

56. Курдиш И.К., Антонюк Т.С., Чуйко Н.В. Влияние некоторых факторов внешней среды на хемотаксис Bradyrhizobium Japonicum, Микробиология, 2001, т. 70, № 1, 106-110.

57. Методические указания по гигиенической оценке микробных препаратов на основе спорообразующих микроорганизмов для защиты растений от вредителей и болезней. // МЗ СССР, № 2620-82, 1982, Киев, 23 с.

58. Методы почвенной микробиологии и биохимии., под ред. Д.С. Звягинцева, М. Изд. МГУ, 1991, 303 с.

59. Микроорганизмы и охрана почв., под ред. Звягинцева, М., Изд. МГУ, 1989, 304 с.

60. Милехина Е.И., Борзенков И.А., Звягинцева И.С., Кострикина Н.А., Беляев С.С. Свойства углеводородокислящей бактерии Rhodoccoccus erythropolis, изолированной из нефтяного месторождения. // Микробиология, 1998, т. 67, № 3, 328-332.

61. Мукатанов А.Х., Ривкин П.Р. Влияние нефти на свойства почвы. // Нефтяное хозяйство, 1980, № 4, 53-54.

62. Никифорова Е.М., Теплицкая Т.А. Полициклические ароматические углеводороды Валдайской возвышенности. // Почвоведение, 1979, № 9, 89-101.

63. Никифорова Е.М., Козин И.С., Теплицкая Т. А., Цирб К. Полициклические ароматические углеводороды в щелочных черноземах и серых лесных почвах природных и техногенных ландшафтов. // Почвоведение, 1989, № 2, 70-78.

64. Орлов Д.С., Малинина М.С., Мотузова Г.В. Химическое загрязнение почв и их охрана., М., Агропромиздат, 1991, 303 с.

65. Охрана окружающей природной среды. Постатейный комментарий к Закону России., М., 1993, 224 с.

66. Патыка В.Ф., Калиниченко А.Ф., Колмаз Ю.Т., Кислухина М.В. Роль азотфиксирующих микроорганизмов в повышении продуктивности сельскохозяйственных растений. // Микробиол. журнал, 1997, т. 59, № 4, 3-14.

67. Петухов В.Н., Фомченков В.М., Чугунов В.А., Холоденко В.П. Биотестирование почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с помощью растений. // Прикладная биохимия и микробиология, 2000, т. 36, № 5, 652-655.

68. Пиковский Ю.И. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. // В кн.: Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем., М., Наука, 1988, 7-22.

69. Пиковский Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среде. // М., Изд-во МГУ, 1993, 208 с.

70. Порядок определения размеров ущерба от загрязнений земель химическими веществами., М., 1993, 30 с.

71. Пунтус И.Ф. Микробная деградация нафталина и фенантрена в модельных почвенных системах., Дисс. на соискание уч. ст. канд. биол. наук, ИБФМ РАН, 2000, 157 с.

72. Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Кошелева И.А., Гаязов P.P., Карпов А.В., Воронин A.M. Выделение и характеристика микроорганизмов-деструкторов ароматических углеводородов. // Микробиология, 1997, т. 66, № 2, 269-272.

73. Растения и химические канцерогены., под ред. Слепяна Э.И., Д., Наука, 1979, 208 с.

74. Ровинский Ф.Я., Теплицкая Т.А., Алексеева Т.А. Фоновый мониторинг полициклических ароматических углеводородов., Гидрометеоиздат, Д., 1988, 224 с.

75. Семенов A.M., Куличевская И.С., Халимов Э.М., Гузев B.C., Паников Н.С. Лабораторные тесты для оптимизации интродукции в почву микроорганизмов-деструкторов нефти. // Прикладная биохимия и микробиология, 1998, 34, № 5, 576-582.

76. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Рева О.Н., Иванов В.Н. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв. // Прикладная биохимия и микробиология, 1995, т. 31, №5, 534-539.

77. Стадницкий Г.В., Родионов А.И. Экология., М., Высшая школа, 1988, 272 с.

78. Старовойтов И.И., Воронин A.M., Скрябин Г.К. Сравнительное изучение путей катаболизма нафталина у двух штаммов Pseudomonas putida // ДАН СССР, 1976, т. 42, 228-230.

79. Суровцева Э.Г., Ивойлов B.C., Беляев С.С. Физико-биохимические свойства штамма Beijerinckia mobilis 1ф Phn+ деструктора полициклических ароматических углеводоров. // Микробиология, 1999, т. 68, № 6, 845-850.

80. Суровцева Э.Г., Ивойлов B.C., Беляев С.С. Разрушение ароматической фракции нефти ассоциацией грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. //Микробиология, 1997, т. 66, № 1, 78-83.

81. Технология восстановления почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами., Справочник, М., РЭФИА, НИА-Природа, 2001, 185 с.

82. Толкачев Н.З. Потенциальные возможности симбиотической азотфиксации при выращивании сои на юге Украины. // Микробиол. журнал, 1997, т. 59, 34-41.

83. Угрехелидзе Д.Ш. Метаболизм экзогенных алканов и ароматических углеводородов в растениях., Тбилиси, Мецниереба, 1976, 223 с.

84. Фомченков В.М., Холоденко В.П., Ирхина И.А., Петрунина Г.А. Влияние загрязнения водной среды нефтью и нефтепродуктами на барьерные свойства цитоплазматических мембран бактериальных клеток. // Микробиология, 1998, т. 67, № 3, 333-337.

85. Хазиев Ф.Х., Тишкина Е.И., Киреева Н.А., Курухметов Г.Г. Влияние нефтяного загрязнения на некоторые компоненты агроэкосистемы. // Агрохимия, 1988, 3 2, 56-61.

86. Халимов Э.М. Эколого-микробиологические основы рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами., Автореф. дисс. канд.биол.наук, М., МГУ, 1996, 24 с.

87. Чернянский С.С., Алексеева Т.А., Геннадиев А.Н., Пиковский Ю.И. Органопрофиль дерново-глеевой почвы с высоким уровнем загрязнения полициклическими ароматическими углеводородами. // Почвоведение,2001, № 11, 1312-1322.

88. Чуйко Н.В., Антонюк Т.С., Курдши И.К. Хемотаксис Bradyzhizobium japonicum к различным органическим соединениям. // Микробиология,2002, т. 71, №4, 460-466.

89. Шилова И.И. Биологическая рекультивация нефтезагрязненных земель в условиях таежной зоны. // В кн.: Восстановление нефтезагрязненных почв почвенных экосистем., М., Наука, 1988, 112-122.

90. Шкидченко А.Н., Аринбасаров М.У. Изучение нефтедеструктивной активности микрофлоры прибрежной зоны Каспийского моря. // Прикладная биохимия и микробиология, 2002, т. 38, № 5, 509-512.

91. Штина Э.А. Особенности почвенной альгофлоры в условиях техногенного загрязнения. // Почвоведение, 1985, № 10, 97-106.

92. Штина Э.А., Некрасова К.А. Водоросли загрязненных нефтью почв: состояние вопроса и задачи исследования. // В кн.: Восстановление нефтезагрязненных почв почвенных экосистем., М., Наука, 1988, 57-81.

93. Adler J. Method for measuring chemotaxis and use of method to determine optimum condition for chemotaxis by Escherichia coli // J. Gen. Microbiol., 1973, v. 74, N 1, 77-91.

94. Alexander M. Biodegradation and bioremediation., Academic Press, San Diego, CA, USA, 1994, 670 p.

95. Ames В., Lee F., Durston W. An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens. // Proc. Natiol. Acad. Sci. USA, 1973, v. 70, 782-786.

96. Ames B.N., Mclann J., Yamashaki E. Methods for detecting carcinogens and mutagens with Salmonella/ mammalian-microsome mutagenicity test. // Mutat. Res., 1975, v.31, 347-364

97. Anderson T.A., Guthrie E.A., Walton B.T. Bioremediation in rhizosphere. // Environ. Sci. Technol., v. 27, 2360-2366.

98. Aprill W., Sims R.C. Evaluation of the use of prairie grasses fro stimulating polycyclic aromatic hydrocarbon treatment in soil. // Chemosphere, 1990, v. 20, 253-265.

99. Aquilar J.M., Ashby A.M., Richards A.J., Loake G.J., Watson M.D., Shaw C.H. Chemotaxis of Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli towards flavonoid inducers of the symbiotic nodulation genes. // J. Gen. Microbiol., 1998, v. 134, part 10, 2741-2746.

100. Armitage J., Schmitt R. Bacterial chemotaxis: Rhodobacter sphaeroides and Sinorhizobium melilory variation on a theme? // Microbiology, 1997, v. 143, N 12,3671-3682.

101. Ashok B.T., Saxena S., Singh K.P., Musarrat J. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil around mathura oil refinery, India. // World J. of Microbiology and Biotech., 1995, v. 11, 691-692.

102. Atlas R.M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective. // Microbiol. Rev., 1981, v. 45, 180-209.

103. Atlas R.M., Bartha R. Degradation and mineralization of petroleum in seawater: limitation by nitrogen and phosphorus // Biotechnol. Bioengin., 1972, v. 14, 309-317.

104. Atlas R.M., Bartha R. Hydrocarbon biodegradation and oil spill bioremediation. // Adv. Microbiol. Ecol., ed. by Marshall K.C., 1992, v. 12, 287-338.

105. Atlas R.M., Bartha R. Microbial ecology: fundamentals and applications., 3rd ed., New York: Benjamin-Cummings, 1993.

106. Atlas R.M., Busdosh M. Microbial degradation of petroleum in the Arctic. // In: Proc. 3-th Intern, biodegradation Symp., Sharpley J.M., Kaplan A.M. (eds), Applied Science Publishers Ltd, London, 1976, 79-86.

107. Bailey N.J.L., Jobson A.M., Rogers M.A. Bacterial degradation of crude oil: comparison of field and experimental data. // Chem. Geology, 1973, v. 11, 203-221.

108. Banks M.K., Lee E., Schwab A.P. Evaluation of dissipation mechanisms for benzo(a)pyrene in the rhizosphere of tall fescue. // J. Environ. Toxicol., 1999, v. 28, 294-298.

109. Barbas J.T., Sigman M.E., Dabestani R. Photochemical oxidation of phenanthrene sorbed on silica-gel. // Environ. Sci. Technol., 1996, v. 30, 1776-1780.

110. Barbour W., Hattermann D. Chemotaxis of Bradyrhizobium japonicum to soybean exudates. //Appl. Environ. Microbiol., 1992, v. 57, 2635-2639.

111. Barkay Т., Navon-Veneria S., Ron E.Z., Rosenberg E. Enhancement of solubilisation and biodegradation of polyaromatic hydrocarbons by the bioemulsifier alasan. // Appl. Environ. Microbiol., 1999, v. 65, 2697-2702.

112. Bastiaens L., Springael D., Wattiau P., Harms H., de Watcher R., Verachtert., Diels L. Isolation of adherent polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)degrading bacteria using PAH-sorbing carriers. // Appl. Environ. Microbiol., 2000, v. 66, 1834-1843.

113. Bergey's manual of determinative bacteriology, Holt J/G/ (ed), 9-th edition, 1994, Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland, 787 p.

114. Bergstein P.E., Vestal J.R. Crude oil biodegradation in Arctic tundra ponds. //Arctic, 1978, v. 31, 158-169.

115. Bertrand J.C., Bonin P., Goutx M., Gauthier M., Mille G. The potential application of biosurfactans in combating hydrocarbon pollution in marine environments. // Bioremediation: scientific and technological issues, 1994, 5356.

116. Bispo A., Jourdain M.J., Jauzein M. Toxicity and genotoxicity of industrial soils polluted by polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). // Organic Chemistry, 2000, v. 30, 947-952.

117. Blumer M. Polycyclic aromatic compounds in nature. // J. Sci. American., 1976. v. 234, 35-45.

118. Bogardt A.H., Hemmingsen B.B. Enumeration of phenanthrene-degrading bacteria by an overlayer technique and its use in evaluation of petroleum-contaminated sites // Appl. Environ. Microbiol., 1992, v. 58, 2579-2582.

119. Bossert I.D, Bartha R. Structure biodegradability relationships of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. // Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1986, v. 37, 490-495.

120. Bossert I.D, Kachel W.M., Bartha R. Fate of hydrocarbons during oil sludge disposal in soil. // Appl. Environ. Microbiol., 1984, v. 47, 763-767.

121. Bouchez M., Blanchet D., Vandecasteelem J.-P. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by pure strains and by defined strain associations: inhibition phenomena and cometabolism. // Appl. Microbiol. Biotechnol., 1995, v. 95, N43, 156-164.

122. Caetano-Anolles G., Crist-Estes D., Bauer W.D. Chemotaxis of Rhizobium metiloti to the plant flavone luteolin requires functional modulation genes. // J. Bacterid., 1988, v. 171, 3164-3169.

123. Caetano-Anolles G., Wall L.G., Micheli A.T., Macchi E.M., Bauer W.D., Favelukes G. Role of motility and chemotaxis in efficiency of nodulation by Rhizobium meliloti. //Plant Physiology, 2001, v. 86, 1228-1235.

124. Cerniglia C.E. Microbial metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons. // Appl. Adv. Microbiol., 1984, v. 30, 31-71.

125. Cerniglia C.E. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Biodegradation, 1992, N 3, 351-368.

126. Cerniglia C.E. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Curr. Opin. Biotechnol., 1993, v. 4, 331-338.

127. Cerniglia C.E., Sutherland J.B., Crow S.A. Fungal metabolism of aromatic hydrocarbons. // In: Microbial degradation of natural products., Winkelmann G. (ed), Weinheim, Germany: VCH Verlagsgeselschift, 1992, 226-232.

128. Cooney J.J., Silver S.A., Beck E.A. Factors influencing hydrocarbon degradation in three freshwater lakes. // Microbiol. Ecol., 1985, v. 11, 127137.

129. Daane L.I., Harjono I., Zylstra G.J., Haggblom M.M. Isolation and characterization of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria associated with the rhizospere of salt marsh plants. // Appl. Environ. Microbiol., 2001, v. 67, N 6, 2683-2691.

130. Davies J.I., Evans W.C. Oxidative metabolism of naphthalene by soil Pseudomonas: the ring-fission mechanism. // Biotech. J., 1984, v. 91, 251261.

131. Deziel E., Paquette G., Villemur R,, Lepine F., Bisaillon J. Biosurfactant production by a soil Pseudomonas strain growing on polycyclic aromatic hydrocarbons. // Appl. Environ. Microbiol., 1996, v. 62, N 6, 1908-1912.

132. Dibble J.T., Bartha R. Effect of environmental parameters on the biodegradation of oil sludge. // Appl. Environ. Microbiol., 1979, v. 37, 729739.

133. Edwards N.T. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in the terrestrial ecosystems: a review. // J. Environ. Quality, 1983, v. 12, 427-441.

134. Ellis В., Harold P., Kronberg H. Bioremediation of a creosote contaminated site // Environ. Technol., 1991, v. 12, 447-459.

135. Eriksson M., Ka J-O., Mohn W.W. Effects of low temperature and freeze-thaw cycles on hydrocarbon biodegradation in arctic tundra soil. // Appl. Environ. Microbiol., 2001, v. 67, N 11, 5107-5112.

136. Gibson D.T., Subramanian V. Microbial degradation of aromatic hydrocarbons I I In: Microbial degradation of organic compounds., Gibson D.T. (ed), Marcel Dekker, New York, 1984, p. 181-252.

137. Griffol M., Casellas M., Bayona J.M., Solanas A.M. Isolation and characterization of fluorine-degrading bacterium. // Appl. Environ. Microbiol., 1992, v. 58, 2910-2917.

138. Grimberg S.J., Stringfellow W.T., Aitken M.D. Quantifying the biodegradation of phenathrene by Pseudomonas stutzeri PI6 in the presence of nonionic surfactant. // Appl. Environ. Microbiol., 1996, v. 62, 2387-2392.

139. Grimm A.C., Harwood C.S. Chemotaxis of Pseudomonas spp. to the polyaromatic hydrocarbon naphthalene. // Appl. Environ. Microbiol., 1997, v. 63,N 10,4111-4115.

140. Grimm A.C., Harwood C.S. NahY- a catabolic plasmid-encoded receptor required for chemotaxis of Pseudomonas putida to the aromatic hydrocarbon naphthalene. // J. Bacteriology, 1999, v. 181, N 10, 3310-3316.

141. Grund E., Denecke В., Eichenlaub R. Naphthalene degradation via salicylate and gentisate by Rhodococcus sp. strain B4. // Appl. Environ. Microbiol., 1992, v. 58, 1874-1877.

142. Gudin C., Syratt W. Biological aspects of land rehabilitation following hydrocarbon contamination. // Environ. Pollution, 1975, v. 8, N 2, 107-112.

143. Guerin W.F., Jones G. E. Two-stage mineralization of phenanthrene by estuarine enrichment cultures. // Appl. Environ. Microbiol., 1988, v. 54, 929936.

144. Harvey R. Polycyclic aromatic hydrocarbons: chemistry and carcinogenicity. // In: M.M. Coombs, J. Ashby, M. Hicks, H. Baxter (eds.), Cambridge Monographs on Cancer Research, Cambridge University Press, Cambridge, 1991,396-444.

145. Harwood C.S., Nichols N.N., Kim M.K., Parales R.E. Identification of the pcaRKF gene cluster frpm Pseudomonas putida: involvement in chemotaxis,biodegradation, and transport of 4-hydroxybenzoate. // J. Bacteriology, 1994, v. 176, N21, 6479-6485.

146. Hambrick G.A., DeLaune R.D., Patrick W.H. Effect of estuarine sediment pH and oxidation-reduction potential on microbial hydrocarbon degradation. //Appl. Environ. Microbiol., 1980, v. 40, 365-369.

147. Hart S. In situ bioremediation: defining the limits. // Environ. Sci. Technol., 1996, v. 30, N9, 398-401.

148. Harvey R.G., Dunne F.B. Multiple regions of metabolic activation of carcinogenic hydrocarbons. //Nature, 1978, v. 273, 566-568

149. Heitkamp M.A., Cerniglia C.E. Mineralization of polycyclic aromatic hydrocarbons by a bacterium isolated from sediment below an oil field. // Appl. Environ. Microbiol., 1988, v. 54, 1612-1614.

150. Hinchee R.E., Anderson D.B., Metting F.B., Sayles J.G.D. (eds), Applied Biotechnology for site remediation., Lewis publishers, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo, 1994.

151. Horowitz A., Atlas R.M. Continuous open flow-through system as a model for oil degradation in the Arctic ocean. // Appl. Environ. Microbiol., 1977, v. 33,647-653.

152. Jamison V.M., Raymond R.L., Hudson J. Biodegradation of high-octane gasoline in groundwater. // Dev. Indust. Microbiol., 1975, v. 16, 305-312.

153. Johnston A.E. Increase in the polynuclear aromatic hydrocarbon content of agricultural soil over the last century. // Environ. Sci. Technol., 1989, v. 23, 95-101.

154. Jones K.C. Contaminent trends in soils and crops. // Environ. Pollut., 1991, v. 69,311-325.

155. Jones K.C., Stratford J.A., Waterhouse K.S., Furlong E.T., Giger W., Hites R.A., Schaffner C.,

156. Каре R., Parniske M., Werner D. Chemotaxis and nod gene activity of Bradyrhizobium in response to hydroxycinnamic acids and isoflavonoids. // Appl. Environ. Microbiol., 1991, v. 57, N 1, 316-319.

157. Kanaly R.A., Harayama S. Biodegradation of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria. // J. Bacteriology, 2000, v. 182, N 8, 2059-2067.

158. Karpati E., Sik T. Host plant specific chemotaxis of Rhizobia. // Acta Microbiol. (Hung.), 1992, v. 39, N 3-4, 352-353.

159. Kastner M., Breuer-Jammali M., Mahro B. Enumeration and characterization of the soil microflora from hydrocarbon-contaminated soil sites able to mineralize polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH). // Appl. Microbiol. Biotech., 1994, v. 41, 267-273.

160. Keith L.H., Telliard W.A. Priority pollutants: a perspective view. // Environ. Sci. TechnoL, v. 13, N 2, 416-423.

161. Keuth S., Rehm H.J. Biodegradation of phenanthrene by Arthrobacter polychromogenes isolated from a contaminated soil. // Appl. Microbiol. Biotech., 1991, v. 34, 804-808.

162. Kerr R.P., Capone D.G. The effect of salinity on the microbial mineralization of two polycyclic aromatic hydrocarbons in estuarine sediments. //Mar. Environ. Res., 1988, v. 26, 181-198.

163. Kipopoulou A.M., Manoli E., Samara C. Bioconcentration of polycyclic aromatic hydrocarbons in vegetables in an industrial area. // Environ. Pollut., 1999, v. 106,369-380.

164. Kiyohara H., Nagao К. The catabolism of phenanthrene and naphthalene by bacteria 11 J. Gen. Microbiol., 1978, v. 105, 69-75.

165. Kiyohara H., Nagao k., Yana K. Rapid screen for bacteria degrading water-insoluble, solid hydcarbons on agar plates // Appl. Environ. Microbiol., 1982, v. 43, 454-457.

166. Leahy J.G., Colwell R.R. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment. // Microbiol. Reviews, 1990, v. 54, 305-315.

167. Lee M.L., Novotny M.V., Bartle K.D. Analytical chemistry of polycyclic aromatic hydrocarbons., Academic Press, Inc., New York, 1981.

168. Liste H.-H., Alexander M. Accumulation of phenanthrene and pyrene in rhizosphere soil. // Chemosphere, 2000, v. 40, 11-14.

169. Lopez-de-Victoria G., Lovell C.R. Chemotaxis of Azospirillum species to aromatic compounds. // Appl. Environ. Microbiol., 1993, v. 59, N 9, 29512955.

170. Lu P.-Y., Metcalf R.L., Plummer N., Mandel D. The environmental fate of three carcinogens: benzo-(a)-pyrene, benzidine, and vinyl chloride evaluated in laboratory model ecosystems. // Arch. Environ. Toxicol., 1977, v. 6, 129142.

171. Lylstra G. J., Gibson D.T. Aromatic hydrocarbon degradation: a molecular approach // In: Genetic engineering: principles and methods., Setlow J.K. (ed), 1991, v. 13, Plenum Press, New York, p. 183-203.

172. Madsen Т., Kristensen P. Effect of bacterial inoculation and nonionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. // Environ. Sci. Technol., 1997, v. 16, N 4, 631-637.

173. Manilal V.B., Alexander M. Factors effecting the microbial degradation of phenanthrene in soil. // Appl. Microbiol. Biotechnol., 1991, v. 35, 401-405.

174. McCann J., Choi E., Yamasaki E., Ames B. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975, v. 72, 5135-5139.

175. Mihelcic J.R., Luthy R.G. Microbial degradation of acenaphthene and naphthalene under denitrification conditions in soil-water systems. // Appl. Environ. Microbiol., 1988, v. 54, 1188-1198.

176. Mueller J.G., Chapman P.J., Pritchard P.H. Action of fluoranthene-utilizing bacterial community on polycyclic aromatic hydrocarbon components of creosote. //Appl. Environ. Microbiol., 1989 a, v. 55, 3085-3095.

177. Mueller J.G., Chapman P.J., Pritchard P.H. Creosote-contaminated sites: their potential for bioremediation // Environ. Sci. Technol., 1989 b, v. 23, 1197-1201.

178. Mueller J.G., Chapman P.J., Blattman B.O., Pritchard P.H. Isolation and characterization of fluoranthene-utilizing strain of Pseudomas paucimobilis. // Appl. Environ. Microbiol., 1990, v. 56, 1079-1086.

179. Mueller J.G., DevereuxR, Santavy D.L., Lantz S.E., Willis S.G., Pritchard P.H. Phylogenetic and physiological comparison of РАН-degrading bacteria from geographically diverse soils. // Antonie Leewenhock, 1997, v. 71, 329343.

180. Nichols T.D., Wolf D.C., Rogers H.B., Beyrouty C.A., Reynolds C.M. Rhizosphere microbial populations in contaminated soils. // Water Air Soil Pollution, 1997, v. 95, 165-178.

181. Olivieri R., Bacchin P., Robertiello A., Oddo N., Degen L., Tonolo A. Microbial degradation of oil spills enhanced by a slow-release fertilizer. // Appl. Environ. Microbiol., 1976, v. 31, 629-634.

182. Oren A., Gurevich P., Azachi M., Henis Y. Microbial degradation of pollutants at high salt concentrations. // Biodegradation, 1992, v. 3, 387-398.

183. Pandey G., Jain R.K. Bacterial chemotaxis toward environmental pollution role in bioremediation. // Appl. Environ. Microbiol., 2002, v. 68, N 12, 57895795.

184. Panyi Т., Zolotarjav I., Karpati E., Sik T. Chemical composition of attractants from leguminous plant root exudates. // Acta Microbiol. (Hung.), 1992, v. 39, N3-4, 356-364.

185. Parales R.E., Ditty J.L., Harwood C.S. Toluene-degrading bacteria are chemotaxis toward the environmental pollutants benzene, toluene, and trichloroethylene. // Appl. Environ. Microbiol., 2000, v. 66, N 9, 4098-4104.

186. Parales R.E., Harwood C.S. Bacterial chemotaxis to pollutants and plant-derived aromatic molecules. // Current Opinion in Microbiology, 2002, v. 5, 266-273.

187. Park K.S., Sims R.C., Dupont R.R., Doucette W.J., Mattews J.E. Fate of PAH compounds in two soil types: influence of volatilization, abiotic loss and biological activity. //Environ. Toxicol. Chem., 1990, v. 9, 187-195.

188. Parke D., Rivelli M., Ornston L. Chemotaxis to aromatic and hydroaromatic acids: comparison of Bradorhyzobium japonicum and Rhizobium trifolii. // J. Bacterid., 1985, v. 163, N 2, 417-422.

189. Phillips D.H. Fifty years of benzo(a)perene. // Nature, 1983, v.303, 468-472.

190. Pothuluri J.V., Cerniglia C.E. Microbial metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons. // In: Biological degradation and bioremediation of toxic chemicals., Chaudhry G.R. (ed), 1994, Portland, OR, Dioscorides Press.

191. Pueppke S., Bolarious-Vasquez M., Werner D. Release of flavonoids by the soybean cultivars McCall and Peking and their perception as a signals by the nitrogen-fixing symbiosis Sinorhizobium fredii. // Plant Physiology, 1998, v. 117, N2, 599-608.

192. Radwan S.S., Al-Awanhi H., Sorkhoh N.A., El-Nemr I.M. Rhizospere hydrocarbon-utilizing microorganisms as potential contributors to phytoremediation for the oily Kuwaiti desert. // Microbiol. Res., 1998, v. 153, 247-251.

193. Ramdahl T. Chemical and biological characterization of emissions from small stoves burning wood and coal. // Chemosphere, 1982, v. 11, 601-611.

194. Reilley K.A., Banks M.K., Schwab A.P. Dissipation of polyaromatic hydrocarbons in the rhizosphere. // J. Environ. Qual., 1996, v. 25, 212-219.

195. Sanseverino J., Bruce M.A., Nenry King J.M., Sayler G. Plasmid-mediated mineralization of naphthalene, phenanthrene and anthracene. // Appl. Environ. Microbiol., 1993, v. 59, 292-297.

196. Schwab A., Banks M.K. Biologically mediated dissipation of polyaromatic hydrocarbons in the root zone. // In: Bioremediation through rhizosphere technology., Anderson T.A., Coats J.R. (eds), American Chemicak Society, Washington, DC, 1994, 132-141.

197. Shiaris M.P. Seasonal biotransformation of naphthalene, phenanthrene and benza.pyrene in surficial estuarine sediments. // Appl. Environ. Microbiol., 1989, v. 55, 1391-1399.

198. Shukla O.P. Biodegradation for environmental management. // Everyman's Science, 1990, v. 25, N 2, 46-50.

199. Shuttleworth K.L., Cerniglia C.E. Environmental aspects of PAH bidegradation // Appl. Biochem. Biotechnol., 1995, v. 54, 291-302.

200. Shuttleworth K.L., Cerniglia C.E. Bacterial degradation of low concentration of phenanthrene and inhibition by naphthalene. // Microbiol. Ecology, 1996, v. 31, 305-317.

201. Shonard D.R., Taylor R.T., Tompson A., Knapp R.B. Hydrodynamic effects on microcapillary motility and chemotaxis assays of Methylosinus trichosporium. II Appl. Environ. Microbiol., 1992, v. 58, N 9, 2737-2747.

202. Siciliano S.D., Germida J.J. Enhanced phytoremediation of chlorobanzoates in zhizosphere soil. // Soil Biol. Biochem., 1999, v. 31, 299-305.

203. Siciliano S.D., Germida J.J., Banks K., Greer C.W. Changes in microbial community composition and function during a polyaromatic hydrocarbonphytoremediation field trial. // Appl. Environ. Microbiol., 2003, v. 69, N 1, 483-489.

204. Sims J.L., Sims R.C., Mattews J.E. Approach to bioremediation of contaminated soil. // Hazard Waste Matter, 1990, v. 7, 117-149.

205. Sorensen D.L., Sims R.C., Qiu X. Field scale evaluation of grass-enhanced bioremediation of PAH contaminated soils., EPA Risk reduction Eng. Lab 20th Ann. Res. Symp., Cincinnati, OH, 1994.

206. Stelmack P.L., Gray M.R., Pickard M.A. Bacterial adhesion to soil contaminants in the presence of surfactants. // Appl. Environ. Microbiol., 1999, v. 65, 163-168.

207. Stewart-Tull D.E.S., Sussman M. (eds), The release of genetically modified microorganisms. REGEM 2, Plenum, 1995, New York.

208. Stringfellow W.T., Aitken M.D. Comparative physiology of phenanthrene degradation by two dissimilar pseudomonads from a creosote-contaminated soil. // Can. J. Microbiol., 1994, v. 40, 432-438.

209. Sutherland J.B., Rafll F., Khan A.A., Cerniglia C.E. Mechanisms of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation. // In: Microbial transformation and degradation of toxic organic chemicals, Wiley-Liss, Inc., 1995, 269-306.

210. Suess M.J. The environmental load and cycle polycyclic aromatic hydrocarbons. // Sci. Tot. Environ., 1976, v. 6, 239-250.

211. Survey of compounds which have been tested for carcinogenic activity, National Institute of Health (NIH), 1985, NIH Press, Washington D.C.

212. Susarla S., Medina V.F., McCutcheon S.C. Phytoremediation: an ecological solution to organic chemical contamination. // Ecological Engineering, 2002, v. 18, 647-658.

213. Tiehm A. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the presence of sythetic surfactants. // Appl. Environ. Microbiol., 1994, v. 60, N 1, 258263.

214. Vecchioli G.I., Del Panno M.T., Painceira M.T. Use of selected autochthonous soil bacteria to enhance biodegradation of hydrocarbons in soil. // Environ. Pollution, 1990, v. 67, 249-258.

215. Ventosa A., Joaaguhn J.N., Oren A. Biology of halophilic aerobic bacteria. // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1988, v. 2, 504-520/

216. Volkering F., Breure A.M., van Andel J.G., Rulkens W.H. Influence of nonionic surfactants on bioavailability and biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. // Appl. Environ. Microbiol., 1995, v. 61, 1699-1705.

217. Von Vedel R.J., Mosquera J.F., Goldsmith G.R., Wiegand J.W. Bacterial biodegradation of petroleum hydrocarbons in groundwater: in situ amended bioreclamation with enrichment isolates in California. // Water Sci. Technol., 1988, v. 20, 501-503.

218. Wakeham S.G., Schaffner C., Giger W. Polycyclic aromatic hydrocarbons in recent lake sediments: I. Compounds having anthropogenic origins. // Geochim. Et Cosmochim. Acta., 1980, v. 44, N 3, 403-413.

219. Walker J.D., Colwell R.R. Microbial degradation of model petroleum at low temperatures. // Microbial Ecology, 1974, v. 1, 63-95.

220. Walter U., Beyer M., Klein J., Rehm H.J. Degradation of pyrene by Rhodococcus sp. UW1. // Appl. Microbiol. Biotech., 1991, v. 34, 671-676.

221. Ward D.M., Brock T.D. Anaerobic metabolism of hexadecane in marinesediments. // Geomicrobiol. J., 1978, v. 1, 1-9.

222. Weisennfels W.D., Klewer J.H., Langhoff L. Adsorption of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by soil particles: Influence on biodegradability and biotoxicity. // Appl. Microbiol. Biotech., 1992, v. 36, 689-696.

223. Yen K.M., Gunsalus I.C. Plasmid gene organization: naphthalene/salicylate oxidation. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, 874-879.

224. Zhu X., Amsler C.D., Volz K., Matsumura P. Tyrosine 106 of CheY plays an important role in chemotaxis signal transduction in Escherichia coli. // J. Bacteriol., 1996, v. 178, 4208-4215.

225. Yu Z., Stewart G.R., Mohn W.W. Apparent contradiction: psychrotolerant bacteria from hydrocarbon-contaminated arctic tundra soils that degrade diterpenoids synthesized by trees. // Appl. Environ. Microbiol., 2000, v. 66, N 12,5148-5154.

226. Zhulin I.B., Armitage J.P. Motility, chemotaxis and methylation-independent chemotaxis in Azospirillum brasilense. // J. Bacterid., 1993, v. 175, N4, 952-958.

Информация о работе

Алдобаев, Владимир Николаевич
кандидата биологических наук
Серпухов, 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Очистка почвы от загрязнения полициклическими ароматическими углеводородами на основе применения хемотаксически активных микроорганизмов ризосферы растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы