Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация микробиологической диагностики оппортунистических инфекций у беременных и новорожденных на основе протеометрических и молекулярно-генетических методов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация микробиологической диагностики оппортунистических инфекций у беременных и новорожденных на основе протеометрических и молекулярно-генетических методов"

На правах рукописи

ПРИПУТНЕВИЧ ТАТЬЯНА ВАЛЕРЬЕВНА

ОПТИМИЗАЦИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЙ У БЕРЕМЕННЫХ Ч НОВОРОЖДЕННЫХ НА ОСНОВЕ ПРОТ*ЮМЕТРИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации :-:? "отекание ученой степени док"эра медицинских наук

25 СЕН 2014

Москва-2014

005552671

005552671

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Пау-.ный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

доктор биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна Официальные оппоненты:

Жебрун Анатолий Борисович, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФБУН НИИЭиМ им. Пастера

Костюкова Наталья Николаевна, доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, ведущий научный сотрудник научной части ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Ефимов Борис Алексеевич, доктор медицинских наук, профессор, кафедра микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Смоленск)

Защита состоится «31» октября 2014 года в 11 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу г. Москва, ул. Гамалеи д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России по адресу г. Москва, ул. Гамалеи д. 18 и на сайте института www.gamaleya.org.

Автореферат разослан «

»

2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Русакова Екатерина Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Проблема репродуктивного здоровья женщин в России в течение последнего десятилетия относится к числу приоритетных задач в демографической политике государства. Реализация национальных программ в сфере здравоохранения способствует динамичному развитию и неонатальной службы, что позволило перейти на международные стандарты выхаживания новорождённых с низкой и экстремально низкой массой тела (ОНМТ, ЭНМТ), родившихся раньше срока (Национальный проект «Здоровье», 2006; ФЗ от 21 ноября 2011г. №323-Ф3; Приказ МЗ РФ от 27 декабря 2011г. №1687н). Одним из основных направлений развития медицинской помощи является совершенствование диагностики и профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний (ИВЗ) и мониторинг возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП) в условиях стационара (Сергевнин В.И., 2008; Крапивина И.В., 2010). Согласно Национальной концепции профилактики ИСМП, стратегической задачей здравоохранения является обеспечение качества медицинской помощи и создание безопасной среды пребывания для пациентов в организациях, осуществляющих медицинскую деятельность (Концепция профилактики ИСМП, 2011).

Несмотря на постоянный поиск новых быстрых методов диагностики, способов лечения и профилактики инфекционных осложнений в акушерстве и гинекологии, гнойно-воспалительная заболеваемость при данной патологии по-прежнему остаётся высокой, а летальность достигает 5-26% (Сидорова И.С., 2006; Серов В.Н., 2011). По опубликованным данным, среди живорождённых детей внутриутробно инфицированы от 27 до 36%, из них доля недоношенных новорождённых достигает 60%. В 16% случаев причиной мертворождаемости, а в 11-45% - смертности новорождённых являются инфекции (Кафарская Л.И., 2002; Боровкова Е.И., 2005; Зубков В.В., 2009).

Особый интерес в настоящее время заслуживают оппортунистические инфекции - заболевания, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), которые обычно не приводят к болезни у здоровых людей. УПМ, в норме колонизирующие кожные покровы, слизистые оболочки урогенитального и желудочно-кишечного трактов (ЖКТ), нередко способны вызывать ИВЗ у пациентов с приобретёнными иммунодефицитными состояниями, в том числе у беременных, родильниц и новорождённых, в особенности недоношенных (Анкирская A.C., 2004; Петерсен Э., 2007).

Наличие огромного числа возбудителей оппортунистических инфекций, среди которых представители родов Staphylococcus, Enterococcus, Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Acinetobacter, Serratia и дрожжевых грибов рода Candida, существенно осложняет этиологическую диагностику и проведение своевременного, адекватного лечения на всех этапах оказания медицинской помощи

(Бондаренко В.М., 2011). Известно, что широкое и не всегда оправданное применение антимикробных препаратов ведёт к росту частоты инфекций, вызванных антибиотикорезистентными микроорганизмами (Козлов P.C., 2007; Руднов В.А., 2011; Сидоренко C.B., 2003, 2009), которые легко реализуют свои патогенные свойства в отношении иммунокомпрометированных лиц. Несомненно, складывающаяся ситуация требует расширения и совершенствования методической базы выполнения микробиологических исследований с целью ускорения получения результатов и наиболее полного выявления всех возможных этиологических агентов (Шагинян И.А., 2000; Clark A., Fournier Р., 2013).

В конце XX века произошла революция в методах, которые могут быть использованы для идентификации возбудителей оппортунистических инфекций, в том числе бактериальной природы. Наряду с традиционной культуральной диагностикой, появился целый арсенал молекулярно-генетических способов, а также протеомный анализ, основанный на использовании физических технологий, к числу которых относится матрично-активированная лазерная дезорбционная/ ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия - MALDI-TOF-MS.

Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР), уже нашедшей достаточно широкое применение в практике, позволяет быстро провести индикацию микроорганизмов в клиническом образце без культурального исследования, но в условиях преобладания оппортунистических инфекций этого оказывается недостаточно для установления истинного возбудителя. В частности, нет разработанных и сертифицированных комплексных диагностических панелей, отсутствуют способы быстрого определения детерминант резистентности к антибактериальным препаратам и возможность проводить штаммовую дифференциацию возбудителей инфекций (Weile J., 2009; Володин H.H., 2010).

Постепенно накапливаемый мировой опыт применения MALDI-TOF-MS для видовой идентификации микроорганизмов, выделенных из клинического материала, подтверждает высокую ценность данного метода, а потенциальная возможность проводить прямую индикацию бактерий в клиническом материале значительно сокращает сроки выполнения анализов и открывает новые ресурсы для использования в различных схемах микробиологической диагностики (Dare D., 2006; Seng P., 2009; Ильина E.H., 2009; El-Bouri К., 2012).

Учитывая специфику акушерско-гинекологических и неонатальных стационаров, где от быстроты принятия решения часто зависит жизнь пациента, внедрение MALDI-TOF-MS может оказаться высокозначимым и важным процессом. Совершенствование комбинаций молекулярно-генетического и протеомного тестирования, дающих возможность быстрой и точной видовой идентификации микроорганизмов, проведения молекулярного типирования лекарственно устойчивых штаммов, и, тем самым, улучшение качества диагностики и лечения оппортунистических инфекций в целях сохранения здоровья матери и ребёнка является приоритетным в данном научном исследовании.

Степень разработанности темы. Идея исследования базируется на анализе имеющихся в научной литературе работ по использованию современных молекулярно-биологических методов диагностики оппортунистических инфекций (Трофимов Д.Н., 2010; Ворошшшна Е.С., 2012), а также обусловлена появившейся возможности проводить видовую идентификацию УПМ с помощью MALDI-TOF-MS на основе анализа специфичных для каждой бактерий - профилей белковых спектров. В начале XXI столетия метод MALDI-TOF-MS предложен как способ идентификации бактерий, выделенных на питательных средах (Lay О., 2001; Wilkins С., 2006; Ильина E.H., 2009), а в 2002 году за его открытие К. Tanaka и J. Fenn присуждена Нобелевская премия.

Начиная с 2000-х годов, в мире проводятся исследования по изучению достоверности MALDI-TOF-MS идентификации различных родов бактерий, грибов и простейших, а также по определению целесообразности её использования в рутинной практике микробиологических лабораторий (Clark А., 2013). За это время постепенно создавались системы и базы данных масс-спектров микроорганизмов. Однако несмотря на то, что анализ микробных изолятов проводится по принципу отпечатка пальцев («finger print»), его дискриминационная способность по видам нередко варьирует. Примечательно, что влияние на воспроизводимость масс-спектров и достоверность результатов оказывают отсутствие в базах данных сведений о ряде бактериальных таксонов, а также стандартов культивирования и подготовки проб (Yen-Peng Но, 2010; Reich М., 2013). Малоизученными пока остаются возможности использования MALDI-TOF-MS при видовой идентификации трудноидентифицируемых микроорганизмов, прямой индикации УПМ в клиническом материале, определении антибиотикорезистентности и штаммовой дифференциации микроорганизмов.

Проблема микробиологического мониторинга за возбудителями ИВЗ и нозокомиальных инфекций является актуальным вопросом на протяжении последних десятилетий (Анкирская A.C., 2004; Крапивина И.В., 2010). Необходимость определения методологических основ, как комплексной, так и дифференцированной диагностики оппортунистических инфекций в клинической практике и разработки алгоритмов обследования беременных и новорождённых не вызывает сомнений. Цель исследования: оптимизировать микробиологическую диагностику оппортунистических инфекций у беременных и новорождённых на основе комплекса автоматизированных бактериологических, MALDI-TOF-MS и молекулярно-генетических (ПЦР, секвенирование) технологий. Задачи исследования

1. Изучить диагностические возможности метода MALDI-TOF-MS анализа при видовой идентификации и штаммовой дифференциации микроорганизмов, а также усовершенствовать преаналитические этапы исследования для повышения достоверности результатов.

2. Сравнить диагностическую ценность MALDI-TOF-MS с традиционными бактериологическими и молекулярно-генетическими методами при видовой идентификации условно-патогенных микроорганизмов, выделенных из различных локусов у пациентов акушерско-гинекологического и неонатального профилей.

3. Разработать технологию прямого MALDI-TOF-MS анализа микроорганизмов в клиническом материале (моча, кровь) и оценить возможность его применения при скрининге бактериурии и бактериемии.

4. Изучить особенности микроценоза влагалища у беременных женщин в норме и при различных вариантах его нарушений, используя сочетание культурального метода, MALDI-TOF-MS анализа и количественной ПЦР.

5. Обосновать целесообразность использования MALDI-TOF-MS анализа и количественной ПЦР в системе микробиологического мониторинга у новорождённых с высоким риском развития инфекционной патологии.

6. Разработать методологические подходы к созданию диагностических панелей молекулярно-генетического выявления условно-патогенных микроорганизмов и детерминант их лекарственной устойчивости.

7. Разработать диагностические алгоритмы микробиологического обследования беременных и новорождённых с использованием современных методов диагностики оппортунистических инфекций.

Научная новизна

Впервые проведена комплексная сравнительная оценка методов видовой идентификации УПМ, выделенных из различных локусов у пациентов акушерско-гинекологического и неонатального профиля, с применением современных технологий: бактериологические (биохимические) методы, MALDI-TOF-MS, количественная ПЦР, секвенирование рРНК. Показаны преимущества и недостатки каждого из этих методов в диагностике оппортунистических инфекций.

Расширены знания о составе микробиоты влагалища беременных женщин российской популяции в норме и при патологии. Впервые в этом экотопе выявлены лактобациллы 21 вида, основными, из которых являются L. crispatus, L. iners, L.jensenii и L. gasseri. Лактобациллы обнаружены во влагалище всех обследованных женщин, причем: L. crispatus - ведущий вид при нормоценозе (79,8%), L. iners - при бактериальном вагинозе (84,0%). Опровергнуто представление о ведущей роли вида L. acidophilus в пуле молочно-кислых бактерий вагинальной микробиоты российских беременных женщин; вид L. acidophilus составил лишь 0,3% от общего количества идентифицированных лактобацилл.

Впервые изучение условий культивирования L. iners определило необходимость наличия в составе среды дефибринированной крови и обнаружило подавление их роста при низких значениях рН, а анализ воздействия аэрации определил предпочтение для роста L. iners облигатно-анаэробные условия.

Совокупность методов классической бактериологии, MALDI-TOF-MS анализа и секвенирования рРНК позволила выявить широкий спектр дрожжевых грибов, включающий 21 вид 6 родов (Candida, Saccharomyces, Rodotorulla, Trichosporon, Pichia, Malassezia), при кандидозах у женщин репродуктивного возраста и у новорождённых. Установлена этиологическая роль грибов видов Candida поп-albicans в развитии поздних неонатальных инфекций у новорождённых с низкой и экстремально низкой массой тела. Метод MALDI-TOF-MS оказался наиболее эффективным и достоверным способом видовой идентификации грибов. Получены отсутствующие в базе данных MALDI BioTyper воспроизводимые масс-спектры для штаммов Candida famata, Pichia fabianii, Malassezia furfur.

Оптимизация и усовершенствование преаналитических этапов MALDI-TOF-MS позволили систематизировать микробиологический анализ и ускорить видовую идентификацию труднодиагностируемых микроорганизмов (лактобацилл, грибов, коринебактерий, актиномицетов, строго анаэробных бактерий, нейссерий), а также проводить прямую индикацию возбудителей в биоматериале (моча, кровь).

Впервые на госпитальных штаммах S. epidermidis и S. haemolyticus различных сиквенс-типов путём кластеризации индивидуальных масс-спектров с построением корреляционных матриц показана принципиальная возможность применения MALDI-TOF-MS для внутривидовой дифференциации этих бактерий.

Впервые предложена концепция дифференцированной микробиологической диагностики оппортунистических инфекций с включением протеометрических и молекулярно-генетических методов в протоколы микробиологического обследования беременных женщин и систему микробиологического мониторинга неонатального стационара третьего уровня. Теоретическая и практическая значимость

Проведённое исследование обосновало достоверность и воспроизводимость результатов видовой идентификации микроорганизмов с помощью времяпролетной масс-спектрометрии и показало целесообразность её внедрения в практику клинической микробиологии. Реализована возможность применения метода MALDI-TOF-MS анализа в рутинной практике бактериологической лаборатории для видовой идентификации ряда грамположительных, грамотрицательных УПМ (в том числе строгих анаэробов) и дрожжевых грибов, а также для их прямой индикации в клиническом материале (кровь, моча). Показана целесообразность применения метода MALDI-TOF-MS анализа в комплексной диагностике оппортунистических инфекций влагалища у беременных женщин и ИВЗ у новорождённых.

Значительная диагностическая ценность метода MALDI-TOF-MS анализа при видовой идентификации редко встречающихся и/или труднодиагностируемых микроорганизмов, таких как лактобациллы, нейссерии, коринебактерии, актиномицеты, ряд строго анаэробных бактерий, открывает возможность изучения их роли в формировании нормоценозов и развитии патологических состояний.

Полученные новые данные о частоте встречаемости различных видов лактобацилл при вагинитах в сравнении с нормоценозом, а именно доминирование вида Ь. страш во влагалище здоровых женщин, позволили теоретически обосновать использование I. сгкраШ при производстве пробиотических препаратов. Результаты исследования учтены при разработке отечественного биопрепарата Вагинормин-1, содержащего комплекс пробиотических штаммов Ь. сгкраш, Ь. gasseri, р1ап1агит (акт внедрения утверждён Генеральным директором ОАО «Институт инженерной иммунологии» 14.04.2014г.).

Для проведения скрининга бактериурии, бактериемии и быстрого тестирования возбудителей внутриутробных, нозокомиальных, в т.ч. грибковых инфекций впервые разработаны комплексные диагностические панели, основанные на молекулярных технологиях и данных многолетнего микробиологического мониторинга инфекций в акушерско-неонатальном стационаре.

Полученные сравнительные результаты прямой МАШ1-ТОР-МБ индикации микроорганизмов в моче, традиционных методов бактериологической диагностики и проточной уроцитофлюориметрии позволили определить оптимальный способ скрининга бактериурии. Предложенный «Способ скрининга бактериурии с помощью МАЮ1-ТОР масс-спектрометрии и проточной цитофлюориметрии» оформлен в виде патента (заявка на патент от 23.12.2013г., регистрационный №2013156910). На основании полученных данных предложена к разработке диагностическая панель для комплексной детекции уропатогенов в моче, основанная на молекулярных технологиях («Инфекции. Уро-панель»),

Сравнительные результаты индикации микроорганизмов в положительной гемокультуре методом прямой МА Ш1- ТОР-МП и количественной ПНР с применением разработанной диагностической панели для скрининга бактериемии («Инфекции. Септи-панель») показали возможность определять патогены в крови каждым из этих методов.

В рамках Государственного контракта № 16.522.12.2009 «Разработка и организация производства комплекса диагностических тест-систем на основе полимеразной цепной реакции в реальном времени для решения задач репродуктивной медицины и неонатологии», заключенному в целях осуществления мероприятий 2.2 Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 года» совместно с ООО «НПО ДНК-Технология», разработаны и апробированы комплексные диагностические наборы для идентификации ряда УПМ при скрининге внутриутробных, внутрибольничных бактериальных и грибковых инфекций: «Инфекции. Неонатальный скрининг» и «Инфекции. Нозокомиальный скрининг». Дата подачи на регистрацию 28.10.2013г. №ММ40797 и ММ40810. Показана целесообразность использования панелей для быстрой диагностики ИВЗ у новорождённых.

Материалы исследования и рекомендации нашли отражение в «Руководстве по лабораторной диагностике инфекций урогенитального тракта» (под ред. Домейка М. и др. - СПб.: Изд-во H-JI, 2012); в разработанных алгоритмах микробиологического обследования беременных и новорождённых, внедрённых в практику стационара 3 уровня (утверждены Главным врачом ФГБУ НЦАГиП им. В.И. Кулакова Минздрава России 13.01.2014г.). Методология и методы исследования

В работе использованы следующие методы исследования: классические микробиологические (микроскопический, культуральный) и инновационные высоко технологичные (протеометрический (MALDI-TOF-MS анализ); молекулярно-биологические (количественная ПЦР, секвенирование 16S (или 18S) рРНК, мультилокусное секвенирование (MLST)); проточная уроцитофлюориметрия). Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения

Алгоритм обследования беременных женщин и усовершенствованный вариант микробиологического мониторинга в отделениях новорождённых используются в практической работе отдела микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ НЦАГиП им. В.И. Кулакова Минздрава России: внедрены в работу научно-поликлинического и акушерско-гинекологических отделений, а также отдела неонатологии и педиатрии Центра. Материалы диссертации используются в лекционном материале при обучении на курсах повышения квалификации врачей, обучении клинических ординаторов и аспирантов, на семинарах и конференциях, проводимых в Центре, на сертификационных курсах повышения квалификации НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО СГМА Минздрава России по специальности «Бактериология».

«Руководство по лабораторной диагностике инфекций урогенитального тракта» (под ред. Домейка М. и др. - СПб.: Изд-во H-JI, 2012г.) используется при диагностике инфекций урогенитального тракта в Российской Федерации. Степень достоверности результатов исследования

Для решения поставленных задач в работе использованы современные средства и методы проведения анализа. Результаты исследования достоверны, что определяется достаточным объёмом выборки анализируемых данных и их адекватной статистической обработкой. Научные положения документированы таблицами, рисунками и диаграммами. Сделанные выводы строго обоснованы и вытекают из результатов проведённых исследований. Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: 15th International Pathogenic Neisseria Conferens, Квинсленд, 2006; 12th International Union against Sexually Transmitted infections World Congress (IUSTI), Нью Дели, 2011г.; VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием

«Рациональная фармакотерапия в Урологии 2012», Москва, 2012г.; Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика в эпицентре женского здоровья», Москва, 2012г.; XVII научно-практической конференции «Интеграция в лабораторной медицине», Москва, 2012г.; заседании Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2012г.; 22nd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, (ECCMID), Лондон, 2012г.; V научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ», Москва, 2012 г.; XIV Международном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии (MAKMAX/ESCMID), Москва, 2012г.; 18th Congress of the International Society for Human and Animal Mycology (ISHAM), Берлин, 2012г.; XIII Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя», Москва, 2012г.; 13th Asia-Pacific Congress of Clinical Microbiology and Infection (APCCMI), Пекин, 2012г.; V научно-образовательном конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии», Москва, 2012г.; II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Казань, 2012г.; VII Международном конгрессе по репродуктивной медицине, Москва, 2013г.; 23rd ECCMID, Берлин, 2013г.; XV MAKMAX/ESCMID, Москва, 2013г.; 28th International Congress of Chemotherapy and Infection (ICC 2013), Якохама, 2013г.

Обсуждение диссертационной работы состоялось на заседании апробационной комиссии 16 декабря 2013 года и Учёном Совете ФГБУ НЦАГиП им. В.И. Кулакова Минздрава России 14 января 2014 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 52 научные публикации, в том числе 29 в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ. Основные положения, выносимые на защиту

1. Усовершенствованные преаналитические этапы в технологии MALDI-TOF-MS анализа повышают объективность и значительно сокращают сроки тестирования ряда грамположительных, грамотрицательных бактерий и дрожжевых грибов, а также позволяют быстро проводить видовую идентификацию микроорганизмов, ранее не диагностируемых традиционными классическими методами.

2. Разработанные технологии прямой MALDI-TOF-MS индикации микроорганизмов в моче и гемокультуре значительно (минимум на 24 часа) ускоряют выявление инфекционных агентов и могут использоваться как основной метод «быстрой микробиологии» при скрининге бактериурии и бактериемии.

3. Для достоверной оценки состояния микроценоза влагалища беременных женщин необходимо использовать комплекс протеометрических и молекулярно-генетических методов, что позволяет повысить качество диагностики дисбиотических нарушений и оппортунистических инфекций.

4. Дифференцированный подход и рациональное применение молекулярно-генетических и протеометрических методов в системе микробиологического мониторинга позволяют оперативно реагировать на негативные тенденции в течение эпидемического процесса в стационарах новорождённых, а также ускорить назначение этиотропной терапии в каждом конкретном случае. Личный вклад автора в получении научных результатов. Автор самостоятельно планировала проведение данной научной работы, составляла дизайн исследования и план комплексного микробиологического обследования беременных и новорождённых. Для обработки и анализа результатов разработан «Протокол ведения микробиологического исследования», опытным путём подобраны протоколы пробоподготовки, на лабораторных и контрольных штаммах различных микроорганизмов отработаны этапы проведения масс-спектрометрического исследования. Автором лично выполнены анализ и интерпретация полученных результатов, формулировка выводов и практических рекомендаций, оформление диссертации и автореферата, предложены алгоритмы обследования беременных и новорождённых.

Клинический материал предоставлен врачами акушерско-гинекологических отделений (заведующие отделениями - д.м.н. Кан Н.Е., д.м.н., профессор Аполихина И.А., д.м.н. Байрамова Г.Р.) и отдела неонатологии и педиатрии (заведущий отделом - д.м.н. Зубков В.В.) ФГБУ НЦАГиП им. В.И. Кулакова Минздрава России. Лабораторные штаммы патогенных нейссерий получены в отделе микробилогии ФГБУ ГНЦДиК Минздрава России (заведующая отделом - д.м.н. Фриго Н.В.). Молекулярно-генетические исследования проводились в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России (заведующая лабораторией - д.м.н. Ильина E.H.) и молекулярно-генетических методов исследования ФГБУ НЦАГиП им. В.И. Кулакова Минздрава России (заведующий лабораторией - д.м.н. Трофимов Д.Ю.).

Формы внедрения: руководство, журнальные статьи, выступления на российских и международных конгрессах, патент, биопрепарат, диагностические тест-системы для научного и практического применения.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации и результаты проведённого исследования соответствуют паспорту научной специальности 03.02.03 - микробиология.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 7 глав, включающих обзор литературы, собственные исследования и их результаты, заключения, выводы, практические рекомендации, список литературы, содержащий 90 отечественных и 210 зарубежных источников. Работа изложена на 293 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 44 таблицами, 50 рисунками, 2 фотографиями и 7 приложениями.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы исследования

Работа проведена в период с ноября 2006 года по июль 2013 года в лабораториях микробиологии и молекулярно-генетических методов исследования ФГБУ НЦАГиП им. В.И. Кулакова Минздрава России; лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России и отдела микробиологии ФГБУ ГНЦДиК Минздрава России.

Исследовано 19974 клинических образцов биологического материала, полученного от:

- 8120 женщин (3904 беременных / 4216 небеременных). Исследовали: отделяемое влагалища, соскоб из цервикального канала, материал (мочу, аспираты эндометрия, асцитическую жидкость, кровь и др.) из очагов ИВЗ (инфекции мочевыводящих путей (ИМП), эндометриты, хориоамниониты, абсцессы, перитониты, сепсис и др.).

- 928 новорождённых: 405 из отделения реанимации (ОРИТ) и 513 из отделения патологии новорождённых (ОПН). Исследовали: кал (в т.ч. меконий), мазки из зева в режиме мониторинга, а также материал (отделяемое конъюнктивы, пупочной ранки, мокрота, моча, кровь и др.) из очагов ИВЗ (конъюнктивиты, омфалиты, риниты, пневмонии, ИМП, некротизирующий энтероколит, сепсис и др.).

Комплексно изучено состояние микроценоза влагалища в норме и при различных вариантах его нарушений у 212 беременных женщин с помощью микроскопии мазков, окрашенных по Граму, культурального исследования с видовой идентификацией микроорганизмов по биохимическим показателям, методом МАЮ1-ТОР-МБ и количественной ПЦР.

Проанализированы результаты культурального, прямой M4LD/-ГОF-M5 и уроцитофлюориметрического исследований 790 образцов мочи, полученных от пациентов с подозрением на ИМП. Проведён сравнительный анализ прямой \iALDI-ТОР-МБ, количественной ПЦР и культурального исследования 50 положительных гемокультур, полученных от пациентов с подозрением на сепсис. Бактериологические методы

Выполняли микроскопию мазков отделяемого влагалища, окрашенных 1% водным раствором метиленового синего и по Граму.

Посевы биологического материала (кал, мазки из зева, отделяемое конъюнктивы, уретры, цервикального канала, ран и др.) проводили на 5% кровяной агар, Шадлер агар, шоколадный агар, кандиселект агар (Вю11а<1, Франция), манит-солевой агар, среду Эндо (Сопс1а, Испания), агар Сабуро, энтерококкагар (ФГУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск). Первичный посев отделяемого влагалища с полуколичественной оценкой роста микроорганизмов проводили на 5% кровяной агар, Колумбия агар, среду Эндо, агар Сабуро, лактобакагар (ФГУН ГНЦ ПМБ,

г. Оболенск) и MRS агар (Conda, Испания). Культивировали в условиях термостата, С02 инкубатора и анаэростата при t°36±l°C в течение 24-48 часов.

Количественный посев мочи осуществляли на 5% кровяной агар и среду Сабуро с последующим учетом результатов по международной методике «Clinical Microbiology Procedures» (Isenberg H., 1992).

Для посева крови, ликвора, асцитической и плевральной жидкостей использовали флаконы с питательной средой для культивирования в автоматическом гематологическом анализаторе Bact/alert (BioMerieux, Франция).

В работе использовали 27152 изолята УПМ, выделенных при культуральном исследовании; родовую и видовую идентификацию проводили методом MALDI-TOF—MS анализа на масс-спектрометре AutoflexIII (Broker Daltonics, Германия). Параллельно изучили 2005 штаммов УПМ по биохимическим свойствам с помощью автоматического бактериологического анализатора VITEKICompact 30 (BioMerieux, Франция). Контроль осуществляли с использованием референс-штаммов микроорганизмов из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Протеометрические методы исследования

Для видовой идентификации выделенных микроорганизмов методом MALDI-TOF—MS использовали изолированные колонии, полученные при первичном росте на плотных питательных средах. В большинстве измерений бактериальные культуры не подвергали предварительной пробоподготовке (экстракции) и использовали метод прямого нанесения материала на мишень тонким мазком. Ионизацию бактериальных белков осуществляли с помощью матрицы й-циано-4-гидроксикоричной кислоты (ri-СНСА) (Bruker Daltonics, Германия) и 50% ацетонитрила/2,5% трифторуксусной кислоты (Sigma Aldrich GmbH).

Накопление масс-спектров, их анализ, сопоставление с базой данных и кластеризацию проводили с помощью программных пакетов ßexControl 2.4, flexAnalysis 2.4 (Build 11), MALDI Biotyper версии 2.0 и 3.0 (Bruker Daltonics, Германия). Расчет коэффициента достоверности видовой идентификации (score) для каждого результата выполнялся автоматически.

Уровень достоверности идентификации с полученным значением score 2,0 и выше свидетельствовал о точной видовой идентификации, score от 1,7 до 2,0 - об идентификации до рода, отрицательными считали результаты со score ниже 1,7. При отсутствии удовлетворительных спектров и низких показателях score использовали ручной режим, меняя мощность лазерного излучения.

В виду отсутствия на момент начала исследования стандартизованных протоколов проведения прямой MALDI-TOF-MS индикации микроорганизмов в моче и положительной гемокультуре нами разработаны собственные оригинальные методики.

Молекулярно-биологические методы

Секвенирование 16S (или 18S) рРНК применяли как референс-метод в случаях спорных результатов идентификации другими способами.

Состояние микроценоза влагалища оценивали с помощью тест-системы «Фемофлор-16» в детектирующем амплификаторе ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва). Методом количественной ПЦР определяли общую бактериальную массу и количество Lactobacillus spp. С использованием специально подобранных праймеров проводили индикацию в исходном материале семи видов лактобацилл (L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. johnsonii, L. vaginalis, L. acidophilus).

Проводили молекулярно-генетическое типирование 41 штамма S. haemolyticus— на основании схем мультилокусного секвенирования (MLST) по методике Ворониной O.K. (2010г.) и 28 - S. epidermidis - по схеме, представленной на сайте http://sepidennidis.mlst.net/. Цитофлуориметрический анализ мочи

Образцы мочи (/1=790) исследовали методом уроцитофлюориметрического анализа осадка мочи с помощью автоматического анализатора UF-500i (Sysmex Corp., Япония) на наличие или отсутствие бактериурии. В ручном режиме измеряли количество лейкоцитов и бактерий с ориентировочным их разделением на грамотрицательные и грамположительные.

Статистическую обработку полученных результатов выполняли в специально разработанной форме «Протокол ведения микробиологического исследования», программе Microsoft Excel, программе микробиологического мониторинга «Микроб-2» и с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 10 (StatSoft Inc., USA), где для расчетов использован модуль Basic Statistics/Tables. 2. Результаты и их обсуждение

2.1 Изучение диагностических возможностей метода MALDI-TOF-MS анализа при видовой идентификации и штаммовой дифференциации микроорганизмов

Проведена оценка диагностических возможностей MALDI-TOF-MS при видовой идентификации выделенных на питательных средах культур грамотрицательных и грамположительных (в т.ч. трудноидентифицируемых) бактерий, дрожжевых грибов, а также влияния различных факторов (условия культивирования, пробоподготовка) на воспроизводимость и достоверность результатов. С целью повышения достоверности тестирования, на примере нейссерий, лактобацилл, стафилококков и дрожжевых грибов, отработаны и усовершенствованы преаналитические этапы подготовки изолятов для получения воспроизводимых масс-спектров. Нейссерии. На первом этапе, совместно с Ильиной Е.Н. и Верещагиным В.А., на модели штаммов нейссерий изучена возможность с помощью MALDI-TOF-MS анализа определять трудноидентифицируемые микроорганизмы. Материалом для исследования служили штаммы непатогенных нейссерий (N. flavescens (и = 10), N. тасасае (и=10), N. mucosa («=10), N. perflava (п= 10)), лабораторные штаммы

N. gonorrhoeae (л=120) и N. meningitidis («=10), референс-штамм N. gonorrhoeae АТСС 49226. Для контроля - охарактеризованный штамм Е. coli DH5a.

Проведена оценка схемы пробоподготовки с белковой экстракцией, рекомендуемой производителем прибора Bruker Daltonics. В качестве экстрагирующего раствора использовали 50 мкл смеси, содержащей 50% ацетонитрила/2,5% трифторуксусной кислоты. На образцы белковых экстрактов наслаивали по 2 мкл насыщенного раствора матрицы - а-СНСА и раствора, содержащего 50% ацетонитрила/2,5% трифторуксусной кислоты (рис. 1).

...V

1

экстрагирующий

изолированная , 1Лпп ооразец на 3 ,,

раствор + 14000 оо/мин MS tlexAnalysis

колония лунки

матрица

Рисунок 1. Схема исследования с использованием предварительной белковой экстракции.

На момент начала исследования белковый профиль N. gonorrhoeae был не изучен и не представлен в базах данных, поэтому анализ накапливаемых масс-спектров белковых профилей изучаемых штаммов N. gonorrhoeae производили с привлечением данных геномного секвенирования N. gonorrhoeae и N. meningitidis. В результате экспериментально получен и зарегистрирован воспроизводимый масс-спектр для N. gonorrhoeae АТСС 49226, свидетельствующий о его дифференциации от N. meningitidis. При сравнительном анализе масс-спектров клинических штаммов N. gonorrhoeae отмечено 3 различных протеотипа: 1 тип (m/z 4473/8165), соответствующий контрольному штамму (75,0%); 2 тип (m/z 4487/8165) - 15,0%, 3 тип (m/z 4487/8147) - 10,0%. Выявленная штаммовая вариабельность не влияла на качество видовой идентификации, все изоляты N. gonorrhoeae определялись с высокой степенью достоверности (score >2,0). Полученные данные занесены в созданную внутрилабораторную базу масс-спектров микроорганизмов.

В дальнейшем на штаммах различных видов нейссерий нами изучена возможность использования методики прямого (без экстракции) нанесения бактериального изолята на мишень (рис. 2), а также влияние на воспроизводимость и достоверность результатов различных факторов (питательная среда, температурный режим, возраст культур).

vj

N;

t

изолированная колония образец на 3 лунки MS BioTvper 2.0

Рисунок 2. Схема исследования при прямом нанесении образца на мишень

Проведенное исследование показало, что видовая идентификация нейссерий получена в 100% случаев при использовании методики пробоподготовки, рекомендуемой производителем. С применением способа прямого нанесения бактериального изолята на мишень видовая идентификация также получена с высокой степенью достоверности (score >2,0): в 87,0% случаев с кровяного агара и в 92,0% - с шоколадного. Сравнение результатов идентификации культур разного возраста, выращенных на кровяном агаре, показало снижение качества идентификации через 48 часов до 68,3% (р<0,05) и на шоколадном агаре до 78,3% (р<0,05), при этом снижение качества идентификации в зависимости от возраста культур особенно выражено у гонококка.

MALDI-TOF-MS оказался надёжным способом видовой идентификации нейссерий. Однако, в случаях выявления патогенных нейссерий (N. meningitidis и N. gonorrhoeae) и, учитывая важность этиологической расшифровки менингита и постановки безошибочного диагноза гонореи, проведение дополнительных бактериологических тестов в соответствии с нормативной документацией остается обязательным.

Лактобациллы. Для выбора оптимального метода идентификации трудноидентифицирумых бактерий совместно с Мелкумян А.Р. изучена способность MALDI-TOF-MS определять вид лактобанилл, культуры которых отбирали с учётом фенотипических отличий и условий культивирования на различных питательных средах в микроаэрофильных или облигатно-анаэробных условиях. Всего отобрано и идентифицировано 789 изолятов, из которых score >2,0 получен у 588 (74,5%). В результате исследования отмечена зависимость коэффициента достоверности идентификации {score) от состава питательной среды и условий культивирования (таб. 1).

Таблица 1.

Зависимость значения score от состава питательной среды и условий

культивирования лактобацилл

score Кровяной агар Шадлер агар MRS агар MRS агар

С02 условия анаэробные С02 условия анаэробные

н = 119 условия л = 256 условия

л =67 л =347

1 2 3 4 5

>2,3 29 (24,4%) 43 (64,2%) 194(75,8%) 322 (92,8%)

1,9-2,2 44 (36,9%) 16(23,9%) 48(18,8%) 25 (7,2%)

<1,8 46 (38,7%) 8(11,9%) 14 (5,4%) 0

"р" при >2,0 р 2-4 < 0,0001 р 2—3< 0,0001 р 4-5 <0,0001 р 2-5 <0,0001

р - различия достоверны, вероятность ошибки стремится к нулю (р<0,0001)

При культивировании на среде MRS-агар в облигатно-анаэробных условиях score был наиболее высоким (92,8%), в то время как идентификация лактобацилл,

выросших на кровяном агаре в микроаэрофильных условиях, лишь в 24,4% случаев имела score >2,0.

Анализ выявления различных видов лактобацилл культуральным методом и количественной ПЦР показал значительное место вида L. iiiers среди видового разнообразия лактобацилл влагалища при отсутствии их роста на селективных для лактобактерий питательных средах российских и иностранных производителей. Изучение условий культивирования этого вида выявило необходимость наличия в составе среды дефибринированной крови и подавление их роста при низких значениях pH, а анализ воздействия аэрации определил предпочтение для роста L. iners облигатно-анаэробные условия. Благодаря применению Шадлер-агара с добавлением 5% дефибринированной бараньей крови в облигатно-анаэробных условиях нам удалось выделить вид L. iners и идентифицировать его с помощью MALDI-TOF-MS анализа.

Полученные данные свидетельствуют о необходимости разработки селективных питательных сред для L. iners, а учитывая нехарактерную для других видов лактобацилл гемолитическую активность, требуется детальное изучение их потенциальной патогенетической роли в составе микробиоты влагалища в норме и при патологии.

Стафилококки. Применение MALDI-TOF-MS для видовой идентификации различных видов стафилококков проанализировано на 165 культурах, среди которых: S. aureus - 55 изолятов и коагулазоотрицательные стафилококки (CoNS'): S. epidermidis - 50, S. haemolyticus - 30, S. hominis - 30. Изучено влияние типа питательной среды (кровяной, маннит-солевой, Мюллера-Хинтон агары), времени культивирования (24, 48 часов) на воспроизводимость и достоверность результатов.

Использование метода прямой (без экстракции) детекции белков позволило идентифицировать до вида 100% изолятов, при этом результаты тестирования суточных культур получены со score >2,0 у 164 (99,7%) независимо от типа питательной среды, а через 48 часов у 150 (90,9%) (р =0,0003), что свидетельствует о надежности метода MALDI-TOF-MS анализа при тестировании различных видов стафилококков.

На группе госпитальных штаммов CoNS, выделенных у новорождённых отделения реанимации (28 - S. epidermidis и 41 - S. haemolyticus) совместно с Корниенко М.А. и Любасовской Л.А. проведено изучение возможности применения MALDI-TOF-MS для их штаммовой дифференциации. Кластерный анализ индивидуальных масс-спектров проводили путем построения корреляционной матрицы (CCI matrix), используя стандартный пакет программ MALD! Biotyper (рис. 3).

А. 5. epidermidis (п = 28)

ЖГП

■ I I: I £=:

В. 5. haemolyticus (п =

"■цветовая шкала «красный—желтый-синий-зеленый» отражает снижение индекса корреляции от 1,0 до 0,0

Рисунок 3. Цветовая визуализация значений корреляционных индексов между масс-спектрами тестируемых коагулазоотрицательных стафилококков

Полученное распределение сопоставляли с данными мультилокусного секвенирования (M¿5'71) (рис. 4).

A. S. epidermidis (п = 28)

В. S. haemolyticus (п = 41)

'>7

Ir.

f 1

, Ч ч

// "î- rï sS

%

Рисунок 4. Распределение клинических изолятов эпидермального и гемолитического стафилококков по данным MLST

Использование метода кластеризации масс-спектров путём построения корреляционных матриц продемонстрировало исключительную гетерогенность 5. epidermidis (рис. 3, А). По данным MLST выделено семь различных сиквенс-типов, с незначительным превалированием ST2, ST22, ST59 (рис. 4, А).

Кластеризация масс-спектров S. haemolyticus позволила выделить группу высокогомологичных штаммов (протеогип) (рис. 3, В). Вариации значений CCI между масс-спектрами внутри этого кластера составили 0.89±0,07, в то время как корреляция с масс-спектрами других штаммов составляла не более 0.6. По данным MLST, большинство штаммов S. haemolyticus относились к двум основным сиквенс-типам ST5 и ST19, формирующим общий клональный комплекс (единую

генетическую ветвь) (рис. 4, В). Полученная прямая корреляция между наблюдаемой кластеризацией и сиквенс-типами указывает на принципиальную возможность применения MALDI—TOF—MS анализа для штаммовой дифференциации бактерий. Дрожжевые грибы. На различных штаммах дрожжевых грибов (С. Albicans, АТСС 10231) и клинических изолятах (С. glabrata, С. parapsilosis, С. kriisei, С. kefyr, С. lusitaniae, С. norvegensis, С. guilliermondii, С. dubliniensis, Saccharomyces cerevisiae) изучено влияние условий культивирования и методических особенностей пробоподготовки на результаты MALDI-TOF-MS идентификации. Оценка осуществлялась по трём параметрам: тип питательной среды (колумбийский агар, среда Сабуро); время культивирования (24, 48 часов); температурный режим (32,37°С). Кроме того, сравнивали результаты идентификации, полученные с использованием способа прямого нанесения образца на мишень (без экстракции) и с предварительной экстракцией. В качестве экстрагирующего раствора применяли смесь, содержащую 300 мкл деионизированной воды и 900 мкл этанола (EtoH'), а в качестве матрицы — 20 мкл смеси 50% ацетонитрила и 35% муравьиной кислоты (Sigma Aldrich GmbH).

Использование метода прямой детекции белков и снижение порога оценочного коэффициента (score от 1,7) позволило идентифицировать 100% исследованных штаммов грибов, причём 80,0% - с высокой степенью достоверности (score >2,0). Анализ полученных данных в зависимости от условий культивирования не показал влияния температурного режима на результаты идентификации и не выявил существенного преимущества какой-либо из использованных питательных сред. В то же время степень достоверности заметно улучшалась через 48 часов инкубации в сравнении с результатами идентификации через 24 часа.

Сопоставление MALDI-TOF-MS результатов с применением метода прямого нанесения образца на мишень со стандартным методом экстракции белков и биохимической идентификацией продемонстрировало совпадение определений видовой принадлежности дрожжевых грибов. Прямая детекция белков без предварительной экстракции заметно сокращает время идентификации и экономически менее затратна.

2.2 Оценка диагностической значимости MALDI—TOF—MS в сравнении с традицонными бактериологическими и молекулярно-генетическнми методами

Методом MALDI-TOF-MS тестированы 27152 изолята УПМ, выделенных от пациентов акушерско-гинекологического и неонатального профилей. В 24552 случаях (91,0%) получена идентификация с высокой степенью достоверности на уровне вида (score >2,0); с низкой степенью (score >1,7), определяющей родовую принадлежность - 1639 культур (6,0%) и в 3,0% случаев, т.е. 961 микроорганизм, не был идентифицирован (score <1,7). После исключения повторных идентификаций в анализ включены 18585 изолятов (10269 - грамположительных (в т.ч.

трудноидентифицируемых лактобацилл, коринебактерий, анаэробов и др.), 5747 -грамотрицательных бактерий и 2569 - дрожжевых грибов.

Параллельно проведена сравнительная оценка видовой идентификации 2005 изолятов УПМ по биохимическим показателям (VITEK2Compact). Все случаи несовпадений проверяли дополнительными диагностическими тестами классической микробиологии и/или секвенированием генов 16S (или 18S) рРНК.

Оценка достоверности видовой идентификации грамположительных бактерий Стафилококки. Проанализировано 3304 изолята стафилококков 16 различных видов: S. aureus («=455) и 15 видов CoNS: S. epidermidis («=1341); S. haemolyticus («=919); и S. hominis («=402), S. warneri («=57), S. lugdunensis («=45), S. capitis («=22), S. simulans («=18), S. pasteuri (л=11), S. cohnii («=10) и другие («=24).

Методом MALDI-TOF-MS с высокой степенью достоверности до вида {score >2,0) определены 95,6% изолятов. Лучше идентифицировались S. aureus -100% изолятов со score >2,0, что является особенно ценным с клинической точки зрения, учитывая патогенность данного вида, хуже - S. cohnii - 60,0% со score <2,0. Остальные виды более чем в 90% случаев идентифицированы с score >2,0.

Параллельно с помощью VITEK2Compact до вида определены 117 изолятов стафилококков. Методом MALDI-TOF-MS в 99,0% случаев идентификация получена со score >2,0, а на VITEK2Compact с вероятностью более 80%. Результаты совпали в 115 случаях (98,3%). Имеющиеся расхождения при идентификации видов S. warneri, S. vidimus и S. pasteuri подтверждены секвенированием генов 16S рРНК в пользу MALDI-TOF-MS.

Таким образом, MALDI-TOF-MS может использоваться как самостоятельный метод в рутинной практике для видовой идентификации представителей рода Staphylococcus.

Стрептококки. Проанализировано 1787 изолятов стрептококков 24 видов: S. agalactiae («=593), S. pneumoniae («=502), S. salivarius («=275), S. anginosius («=83), S. parasangidnis {n=73), S. gallolyticus («=50), S. vestibularis («=41), S. pyogenes («=35), S. oralis («=27), S. peroris («= 16), S. lutetiensis («= 13) и другие («=79).

Среди всех протестированных методом MALDI-TOF-MS анализа с score >2,0 идентифицированы 78,0% изолятов. Параллельно произведена идентификация 96 изолятов с помощью VITEK2Compact и получены неоднозначные результаты (таб. 2).

Идентификация (3-гемолитических стрептококков совпадала в 93,2% случаев, при этом полное совпадение отмечено при тестировании S. agalactiae и S. pyogenes. Что касается а-гемолитических стрептококков то, например, виды 51. equinus и S. salivarius расценивались VITEK2Compact как различные виды микрококков.

Наибольшие разночтения обнаружены у S. pneumoniae {п=Ъ1\ 15 из которых VITEK2Compact с вероятностью более 80,0% идентифицировал как S. mitis/oralis. Учитывая, что в клинической практике наибольшую значимость имеют S. pneumoniae, S. agalactiae и S. pyogenes, для определения достоверности их идентификации параллельно проводили реакцию латекс-агглютинации с

сыворотками, тест с оптохином и бацитрацином. Дополнительно учитывали морфологию колоний.

Таблица 2.

Результаты сравнительной идентификации стрептококков (/>=96)

Вид MALDI-TOF-MS количество изолятов VITEK2 Compact количество изолятов

S. agalactiae 22 22

S. pneumoniae 37 22

S. pyogenes 22 22

S. mitis/ oralis 12 24

S. equinus 1 0

S. salivarius 2 0

S. sanguinis 0 1

S. parasanguinis 0 1

S. infantarius 0 1

Kocuria kristinae 0 2

Granulicatella adiacens 0 1

Изоляты, идентифицированные MALDI-TOF MS как S. pyogenes (/г =35) и S. agalactiae (л =593), в 100% случаев давали положительную реакцию латекс-агглютинации, соответствовали виду по морфологии и наличию ß-гемолиза колонии, что подтверждало правильность определения методом MALDI-TOF-MS анализа.

В результате изучения 502 изолятов, идентифицированных MALDI-TOF-MS как S. Pneumonia, 479 изолятов (95,4%) классическими бактериологическими тестами были отнесены к а-гемолитическим стрептококкам — S. mitis/oralis.

Метод MALDI-TOF-MS анализа точно идентифицирует клинически значимые виды ß-гемолитических стрептококков серогрупп А и В, тогда как идентификация S. pneumoniae в настоящее время не имеет диагностической ценности. Поскольку многие а-гемолитические стрептококки (mitis, oralis и др.) определяются методом MALDI-TOF-MS как S. Pneumoniae, учитывая их близкое генетическое родство, необходимо разграничивать эти виды, с помощью дополнительных диагностических тестов. Наши данные сопоставимы с данными отечественных (Икрянникова Л.Н., 2012) и зарубежных (Wessels Е„ 2012) исследователей.

Энтерококки. Методом MALDI-TOF-MS изучен 1791 изолят энтерококков 10 различных видов: Е. faecalis (/¡=1580), Е. faecium (/¡=189). Количество менее 10 составили виды Е. durons, Е. avium, Е. gallinarum, Е. raffinosus, Е. casseliflavus, Е. hirae, Е. italicus, Е. thailandicus. Идентификация 97,5% изолятов получена со score >2,0.

Параллельно исследовано 155 культур с помощью VITEK2Compact. В 99,0% случаев отмечено полное совпадение идентификаций. В одном случае, определенный методом MALDI TOF-MS Е. casseliflavus был идентифицирован на VITEK2Compact как Е. casseliflavus или Е. gallinarum с равной вероятностью 50,0%. Секвенированием генов 16S рРНК подтверждена правильность идентификации методом MALDI-TOF-MS анализа.

MALDI-TOF—MS анализ показал высокую достоверность видовой идентификации изолятов различных видов энтерококков, а совпадение с биохимическим и молекулярно-генетическим тестированием дает основание использовать его в рутинной практике как самостоятельный метод. Оценка достоверности видовой идентификации грамотрицателъных бактерий Энтеробактерии. Методом MALDI TOF-MS анализа идентифицировано 4110 изолятов условно-патогенных энтеробактерий 28 видов: Escherichia coli (л=1965,), Klebsiella pneumoniae (п-\01Ъ), Enterobacter cloacae (п=5Ъ1), Proteus mirabilis (n-\()2), Enterobacter asburiae (n=80), Enterobacter aerogenes (n=l\), Klebsiella oxytoca (n=6S), Citrobacter freundii (n-53), Serratia marcescens (n=4S), Morganella morganii (n= 24), Enterobacter kobei (n—19), Hafnia alvei (n=\Ъ), Proteus vulgaris (n=\0) и другие (п=А1). Среди микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae 98,4% изолятов идентифицированы со score >2,0.

Параллельно 145 культур энтеробактерий исследованы с помощью VITEK2Compact и в 97,9% случаев отмечено совпадение результатов обоих методов. Однако в базе данных VITEK2Compact отсутствуют некоторые виды энтеробактерий, несмотря на то, что они имеются в базе данных масс-спектрометра и идентифицируются с высокими score. Так, например, отсутствующий в VITEK2Compact и определённый MALDI-TOF-MS вид Е. kobei расценивался по биохимическим показателям как Brevundimonas spp. или Е. asburiae (ludwigii), а Escherichia vulneris как Pantoea spp.

При секвенировании генов 16S рРНК штамма Е. vulneris, результаты совпали с MALDI-TOF-MS, тогда как два штамма, идентифицированные MALDI-TOF-MS как Е. kobei, с 99,0% вероятностью определены Е. kobei/cloacae/ludwigii, что говорит о близкородственном как генетическом, так и белковом профиле и невозможности на сегодняшнем этапе чёткого разделения этих видов.

MALDI-TOF-MS анализ, на наш взгляд, предпочтительнее использовать для идентификации условно-патогенных энтеробактерий в рутинной практике микробиологических лабораторий, поскольку в базе данных MALDI Biotyper версии 3.0 представлено значительно большее разнообразие видов, чем можно определить по биохимическим показателям.

Неферментирующне грамотрицательные бактерии (НГОБ). За период исследования методом MALDI-TOF-MS анализа идентифицировано 828 изолятов

НГОБ, относящихся к представителям 33 видов: Acinetobacter baumannii (п=2Ъ4), Stenotrophomonas maltophilia (п = \\%), A. genomospecies (n=104,), Pseudomonas aeruginosa (n=%\), A. junii (n=l\), A. Iwoffli (n=(iQ), A. schindleri (n=3\), A. johnsonii (ч=27), P. putida (n=\2) и другие (n=90). Co score >2,0 идентифицированы 93,6%

И30ЛЯТ0В.

Все виды НГОБ более чем в 90% случаев имели высокую степень достоверности идентификации, за исключением A. schindleri - 74,2% и P. putida — 75,0%. В 3,6% случаев получен одинаково высокий score для двух и более видов (S. maltophilia, P. beteli, P. hibiscicola). Двоякую видовую идентификацию имели 19,2% штаммов 5. maltophilia, правильность определения которых особенно важна с клинической точки зрения.

Параллельно с помощью VITEK2Compact проведена видовая идентификация 140 изолятов НГОБ и отмечено совпадение лишь в 53.6% случаев.

Расхождения касались в основном A. genomospecies, A. ursingii, P. hibiscicola, S. maltophilia, что обусловлено более широким видовым разнообразием НГОБ в базе масс-спектрометра, по сравнению с VITEK2Compact, а также неоднозначной (двоякой) видовой идентификацией MALDI-TOF-MS некоторых видов (таб.3).

Таблица 3.

Примеры расхождений в результатах идентификации НГОБ методом \1ALDI-TOF-MS и по биохимическим показателям

MALDI-TOF-MS score VITEKlCompact %

Acinetobacter genomospecies 2,51 Acinetobacter baumannii 99

Acinetobacter ursingii 2,1 Acinetobacter spp.

Pseudomonas beteli/ Pseudomonas hibiscicola 2,36/2,35 Stenotrophomonas maltophilia 99

Pseudomonas beteli/ Stenotrophomonas maltophilia/ Pseudomonas hibiscicola 2,36/2,35/ 2,33 Stenotrophomonas maltophilia 94

Pseudomonas hibiscicola 2,27 Stenotrophomonas maltophilia 99,8

Stenotrophomonas maltophilia 2,43 Pseudomonas luteola 91

Существующие трудности заставляют прибегать к дополнительным способам идентификации.

Секвенированием генов 16Э рРНК 15 штаммов, определенных методом МА1В1-ТОР-МБ как 5. таНорЫНа/Р. ЫЫ$с1со1а, был определён вид 5. такорЫИа.

Методом \1ALDI- ТОР-МБ анализа получен более широкий видовой спектр НГОБ, чем при идентификации по биохимическим показателям.

Оценка достоверности видовой идентификации трудноидентифицируемых (в т.ч. анаэробных) бактерий

Лактобациллы. Методом MALDI-TOF-MS анализа идентифицировано 2525 изолятов 31 вида лактобацилл, выделенных из отделяемого влагалища (рис. 5).

2,5%

2,4%

1,7%

11,8%

. ■ L. crispatus

■ L. jensettii L. gasseri

■ L. iners ш L. plantarum

■ L. rhamnosus L. fermentum L. salivarius L delbrueckii другие

Рисунок 5. Частота встречаемости различных видов лактобацилл выделенных из отделяемого влагалища

С высокой степенью достоверности - score >2,0 идентифицировано 79,1% изолятов лактобацилл.

При проведении параллельной видовой идентификации 30 изолятов по биохимическим показателям с помощью VITEK2Compact ни в одном случае не получен правильный результат. Для 9 штаммов (30,0%) идентификация не была достоверной, для 21 (70,0%) - получены ложные результаты, из которых в 63,3% случаев лактобациллы с вероятностью 85,0-98,0% отнесены к роду Clostridium и Bifidobacterium или к Actinomyces naeslundii и Corynebacterium jeikeium. Правильность определения лактобацилл методом MALDI-TOF-MS подтверждена данными морфофенотипических признаков, ростом на питательных средах для лактобактерий в микроаэрофильных условиях, а также методом ПЦР анализа.

Метод MALDI-TOF-MS анализа даёт возможность достоверно и быстро определять видовую принадлежность лактобацилл.

Коринебактерий. За период исследования методом MALDI-TOF-MS анализа проведена видовая идентификация 301 изолята коринебактерий, выделенных из отделяемого влагалища женшин, в результате чего, получен 21 вид (рис. 6). Со score >2,0 идентифицировано 66,4% изолятов коринебактерий. Высокое качество идентификации (score >2,0) отмечено лишь для одного вида коринебактерий -Corynebacterium amycolatum (более 80,0%). тогда как остальные идентифицировались с меньшими значениями score.

■ С.атусо latum

■ С

aurimucosum

■ С. coyleae

■ C.minutissimuni

■ С. propinquum

■ С. imitons

■ C.pseudodiphtheriticum

■ C.simulans С. riegelii

« C.accolens С. argentoratense C.glucuronolyticum С. striât и m C.singulare другие

Рисунок 6. Частота встречаемости различных видов среди выделенных из отделяемого влагалища коринебактерий

Метод МАЮ1-ТОГ-МБ анализа расширяет наши представления о видовом разнообразии коринебактерий в составе микробиоты влагалища у женщин репродуктивного возраста и даёт основание для изучения их возможной роли как в поддержании состояния нормоценоза, так и в развитии патологических состояний. Анаэробные бактерии. Всего из отделяемого влагалища женщин в облигатно-анаэробных условиях выделено и идентифицировано методом МАЬ01-Т0Р-МЗ анализа 166 изолятов строго анаэробных бактерий 27 различных видов (рис. 7).

ш Anaerococcus spp.

■ Bifidobacterium longum Alloscardovia omnicolens

■ Propionibacterium acnes

■ Veillonella parvula

■ Weissella viridescens Atopobium vaginae Finegoldia magna

■ Peptoniphilus harei

■ Prevotella bivia

■ другие

Рисунок 7. Частота встречаемости различных видов строго анаэробных бактерий среди выделенных из отделяемого влагалища

С высокой степенью достоверности до вида (score >2,0) идентифицировано 71,1% изолятов. Наилучшие результаты получены для рода Prevotella spp., 92,3% культур идентифицированы с высокой степенью достоверности (score >2,0).

В нашем исследовании методом MALDI-TOF-MS анализа впервые идентифицированы не определяемые ранее традиционными бактериологическими методами многие виды анаэробных бактерий, выделенные из отделяемого влагалища. Полученное широкое разнообразие видов подчёркивает ценность данного метода при видовой идентификации этой группы микроорганизмов.

Другие бактерии. Методом MALDI-TOF-MS проведена идентификация 111 изолятов Gardnerella vaginalis, выделенных от пациенток с бактериальным вагинозом.

Среди других труднокультивируемых и трудноидентифицируемых аэробных и факультативно-анаэробных бактерий получено 115 изолятов грамотрицательных палочек рода Haemophilus (п=54), Moraxella (п=17), другие (и=44). всего 21 вида. С высокой степенью достоверности (score >2,0) идентифицировано 80,9% изолятов.

Определено 178 грамположительных кокков 20 различных видов, не относящихся к стафилококкам, стрептококкам, энтерококкам и идентификация которых затруднена из-за отсутствия видов в базах данных существующих классических тест-систем и бактериологических анализаторов. Из них к роду Rothia относились 46,6% изолятов и к Micrococcus - 21,0%. Со score >2,0 получена идентификация 73,0% микроорганизмов этой группы.

Выделены и идентифицированы 156 изолятов других грамположительных палочек 31 вида, из которых 54,5% относились к роду Bacillus, а 5,1% - к роду Actinomyces. Со score >2.0 идентифицировано 71,8% изолятов.

Случаев возникновения ИВЗ. вызванных перечисленными микроорганизмами, в ходе нашего исследования отмечено не было. Ввиду отсутствия альтернативы быстрой и простой видовой идентификации редко встречающихся бактерий фенотипическими и биохимическими способами метод MALDI-TOF-MS анализа может применяться для их тестирования.

Оценка достоверности видовой идентификации дрожжевых грибов

За период исследования методом MALDI-TOF-MS анализа изучено 2569 изолятов дрожжевых грибов. Всего идентифицирован 21 вид дрожжевых грибов. Результаты со score >2,0 получены у 55,7% культур С. albicans и 67,9% С. non-albicans видов.

Из вагинального отделяемого женщин выделено и идентифицировано 2304 штамма дрожжевых грибов, среди которых к роду Candida принадлежали 2235 изолята (97,0%) и 69 (3,0%) к другим родам - Saccharomyces, Rhodotorula, Trichosporon, Pichia. К виду С. albicans отнесены 1762 изолята, к С. non-albicans -542. Наиболее часто среди видов С. non-albicans встречались С. glabrata (42,3%), С. parapsilosis (13,7%) и S. cerevisiae (11,8%).

Выделенные от новорождённых детей дрожжевые грибы («=265) отнесены к 3 родам - Candida (99,2%), Saccharomyces (0,4%), Malasseziae (0,4%). С. albicans составила 36,2%, а среди Candida non-albicans 39,8% - С. famata, 15,1% - С. glabrata и 8,0% - С. parapsilosis.

Параллельно с помощью VITEK2Compact изучено 1294 дрожжевых изолята (1009 - С. albicans и 285 - С. non-albicans видов) и в 99,4% («=1287) получено полное совпадение результатов: у всех С. albicans (100%) и у 278 (97,5%) - С. non-albicans видов.

Несовпадения отмечены у 7 изолятов 4-х видов: С. nivariensis, С. lambica, C.famata и P.fabianii. Два изолята С. nivariensis и один - С. lambica не совпали из-за отсутствия этих видов в базе данных VlTEK2Compact. Один изолят не был идентифицирован с помощью MALDI-TOF-MS и определен VITEK2Compact как С. utilis. У 3-х изолятов С. famata (VITEK2Compact"), из-за отсутствия в базе MALDI Biotyper, получена идентификация как С. parapsilosis. В пользу большей достоверности идентификации как С. famata свидетельствовала ее неспособность в отличие от С. parapsilosis формировать псевдомицелий.

Секвенированием гена 18S рРНК неидентифицированный MALDI-TOF-MS изолят определен как P. fabianii и подтверждена правильность идентификации MALDI-TOF-MS видов С. nivariensis и С. lambica.

Сравнение идентификаций свидетельствует о высокой частоте идентичных результатов (99,4%), что дает основание доверять MALDI-TOF-MS и применять его как самостоятельный метод.

В результате проведенной работы нами установлен уровень достоверности видовой идентификации для различных видов УПМ, который представлен на рисунке 8.

Рисунок 8. Сопоставление качества видовой идентификации методом М41£)/-ГО/7-М5 анализа различных групп микроорганизмов

Проведённое исследование позволяет сделать следующее заключение, что метод МАЬ01-Т0Р-М5 анализа в целом значительно превосходит используемые в настоящее время способы видовой идентификации микроорганизмов по объективности, быстроте и простоте пробоподготовки (5-10 мин/образец), в особенности при использовании прямого нанесения (без экстракции) колонии на мишень, а также по скорости измерения (1 мин/образец).

2.3 Разработка технологии прямого МАЮ1-ТОР-М8 анализа микроорганизмов в клиническом материале (моча, кровь) и оценка возможности ее применения при скрининге бактериурии и бактериемии

Методом МА и)/-ТОР—МБ проводили прямую индикацию микроорганизмов в осадке мочи при различной степени бактериурии. Учитывая отсутствие на момент начала исследования стандартных протоколов пробоподготовки осадка мочи к МАЬ01-Т0Г-М8 анализу, нами разработана собственная оригинальная технология поэтапной подготовки образца к исследованию.

Проведён комплексный анализ 790 клинических проб мочи, полученных от беременных и новорождённых, параллельно тремя способами: проточной уроцитофлюориметрией, прямой МАЮ1-ТОР-М5 и классическим культуральным методом.

Результаты всех трех методов были отрицательными в 422 случаях (53,4%); положительными - в 96 (12,2%) и в 272-х (34.4%) имелись расхождения (рис. 9).

Отрицательные Положительные Расхождения п=422 п=96 п=272

■ Культуральный метод

■ Прямой анализ МАЬ01-Т0р-М8

(8соге>1,7)

Проточная

уроиитофлюориметрия ир-50(Н (ВАСТ>104)

Рисунок 9. Результаты комплексного исследования проб мочи тремя методами (я=790)

При посеве мочи в 249 образцах отмечен рост микроорганизмов в различных титрах. Истинная бактериурия (титр>Ю5К0Е/мл) установлена в 136 случаях (54.6%), при этом выделено и идентифицировано методом МАШ1-ТОГ-М8 анализа до вида 152 штамма УПМ (рис. 10). В 17 пробах обнаружен рост микроорганизмов двух видов с высокими титрами одного из них.

Escherichia coli (77) Klebsiella pneumoniae (21) Streptococcus agalactiae (16) Enterococcus faecalis (13) Staphylococcus epidermidis (4) Enterobacter cloacae (4) Proteus mirabilis (3) Staphylococcus haemolyticus (3) Staphylococcus hominis (3) Pseudomonas aeruginosa (2) Candida albicans (2) Candida glabrata (1) Stenotrophomonas maltophilia (1) Staphylococcus lugdunensis (1) Acinetobacter baumannii (1)

Рисунок 10. Этиологическая структура ИМП в группе беременных и новорождённых

В посевах с ростом микроорганизмов в титре>Ю5КОЕ/мл результаты совпали с титром на UF-500i. Прямой MALDI-TOF-MS индикацией микроорганизмов из образцов мочи с истинной бактериурией («=136) в 97 случаях (71,3%) получена точная идентификация, а в 39 (28,7%) не получено надёжной идентификации; в 24 образцах с монокультурой ив 16 - со смешанной.

Сравнительный анализ расхождений в результатах 272 проб показал, что из 267 образцов, где отмечались показатели титра бактерий В А С7>104 (UF-500i); в 139 случаях отмечен рост УПМ и в высоких и в низких титрах; в 126 случаях при повышенных значениях титра бактерий на UF-500i рост микроорганизмов отсутствовал, а в двух случаях при отрицательном посеве методом прямой MALDI-TOF-MS получена идентификация Е. coli и S. epidermidis с титром бактерий ВАСТ> 108 и ВАСТ>\0Ь соответственно {UF). В пяти пробах обнаружен рост микроорганизмов, тогда как результаты при других методах были отрицательны.

Таким образом, на сегодняшний день культуральное исследование мочи остается «золотым стандартом» в диагностике ИМП, но при этом использование MALDI-TOF-MS для идентификации выделенных культур сокращает время исследования на 24 часа.

При наличии истинной бактериурии прямая MALDI-TOF-MS осадка мочи позволяет за несколько минут идентифицировать микроорганизмы в высоких титрах (^Ю'КОЕ/мл). что значительно сокращает время до начала этиотропной терапии.

По анализу мочи на проточном уроцитофлуориметре можно с высокой вероятностью полагать о наличии бактериурии при концентрации бактерий >105 либо ее отсутствие при отрицательном результате и отсутствии лейкоцитов. В условиях крупного стационара и большого количества проб мочи с помощью анализатора UF-500i возможно проведение скрининга в целях сокращения числа проб для бактер иологическогоисследования.

Данные методы можно использовать как вспомогательные при скрининге бактериурии. не отменяя классического культурального исследования. Полученные

2,6% <■ 1.9% Р 1,9% 'f 1,9% ■ 1,3% « 1,3% f 0,7% f 0,7% J 0,7% < 0,7%

нами результаты подтвердили данные зарубежных и отечественных авторов о ведущей этиологической роли Е. coli в развитии ИМП, а также позволили сформировать и предложить к разработке диагностическую ПЦР-панель для комплексной детекции уропатогенов («Инфекции. Уро-панель»).

В целях разработки и усовершенствования технологии прямого масс-спектрометрического профилирования микроорганизмов в гемокультуре выполнено 334 посева крови при подозрении на сепсис у родильниц и новорождённых.

Для индикации микроорганизмов в положительной гемокультуре (п=50) использовали прямую MALDI-TOF-MS и количественную ПЦР с применением диагностической панели «Инфекции. Септи-панель» (разработана совместно с сотрудниками лаборатории молекулярно-генетических методов) содержащей праймеры 8 родов и 11 видов микроорганизмов: Staphylococcus spp., S. aureus. Streptococcus spp., S. agalactiae, S. pyogenes, S. pneumoniae, Enterococcus spp., Enterobacteriaceae, E. coli, К. pneumoniae/K. oxytoca, E. cloacae, P. aeruginosa, Proteus spp., Acinetobacter spp., S. mahophilia, C. freundii, Burkholderia spp., Haemophilus spp., Candida spp., C. albicans.

В качестве референтного метода проводили культуральное исследование с последующей видовой идентификацией возбудителей MALDI-TOF-MS анализом.

По результатам посева выделено 53 штамма УПМ: 15 грамотрицательных бактерий (Е. coli (5), К. pneumoniae (3), К. oxytoca (1), Е. cloacae (3), Е. aerogenes (1), A. baumannii (1), R. ornithinolytica (1)); 34 - грамположительных (Е. faecalis (5), Е. avium (1), Е. casselißavus (1), S. warneri (1), S. parasanguinis (1), S. aureus (5), S. haemolyticus (3), 5. hominis (3), S. epidermidis (13), C. amycolatum (1)); 4 - культуры дрожжевых грибов рода Candida (С. albicans (I), С. parapsilosis (3)). В 1 пробе обнаружен рост двух видов бактерий (S. epidermidis и S. parasanguinis) и в I - рост трех видов (S. epidermidis, S. haemolyticus, A. baumannii).

Прямой MALDI-TOF-MS у далось идентифицировать УПМ в 38 образцах (38/50; 76,0% случаев) и количественной ПЦР - в 46 (46/50; 92,0%). Положительный результат одновременно тремя методами получен в 33 образцах (33/50; 66,0%) (рис. 11).

30

ю

0

Ь 25

4

| 20

5 15

Ь

Й 10

1 5 —

о

к

V

ты ,

ЯГ «1

1

" MALDI -TOF -MS выделенных культур

" MALDI - TOF - MS прямая идентификация р<0,3

Количественная ПЦР р<0,1

Грам "-" Грам "+" Грибы Ассоциации

Рисунок 11. Результаты идентификации гемокультур тремя методами

ПЦР-анализ в 4 образцах выявил второй микроорганизм, который не был обнаружен в гемокультуре другими методами, а в 1 образце - смесь 2-х культур {Acinetobacter spp. и Staphylococcus spp.), тогда как при посеве определены три микроорганизма (A. baumannii, S. epidennidis, S. haemolyticus), а прямой MALDI-TOF-MS только один - S. epidennidis. Из-за недостаточной специфичности праймеров в 1 случае ПЦР ошибочно определила Е. aerogenes как К. pneumoniae, а в 2-х случаях не удалось получить результат, тогда как двумя другими методами идентифицирован S. epidennidis.

Учитывая отсутствие на момент начала исследования стандартизованных протоколов пробоподготовки для проведения прямой MALDI-TOF-MS индикации микроорганизмов в гемокультуре, нами разработана собственная оригинальная методика пробоподготовки образца из флаконов с угольной средой (BioMerieux, Франция). Учёт результатов идентификации начинали с заниженных значений достоверности — score= 1,6.

Из 50 образцов положительных гемокультур в 76,4% случаев получена положительная видовая идентификация УПМ, из них: в 36,4% случаев с высокими значениями score >2,0; в 32,7% - со score 1,7-1,9; в 7,3% со score ниже 1,7. Идентификация до вида получена в 13 из 14 образцов с грамотрицательными микроорганизмами (92,9%) и в 23 из 30 грамположительных гемокультур (76,6%).

Методом MALDI-TOF-MS видовая идентификация микроорганизмов, выделенных при рекультивировании из гемокультуры на плотных питательных средах, получена в 100% случаев.

Таким образом, культуральное исследование крови остается «золотым стандартом» в микробиологической диагностике септических состояний, при этом использование MALDI-TOF-MS для видовой идентификации выделенных культур сокращает время исследования на 24 часа.

ПЦР диагностика с применением экспериментальной панели «Инфекции. Септи-панель» позволяет в кратчайшие сроки с высокой точностью определять широкий спектр возможных патогенов в крови.

Прямая MALDI-TOF-MS положительных гемокультур позволяет в большинстве случаев в течение нескольких минут достоверно проводить скрининг бактериемии, вызванной одним возбудителем, тем самым значительно сокращая время до начала этиотропной терапии.

2.4 Изучение особенностей микроценозов у беременных и новорождённых в норме и патологии с использованием инновационных методов

Проанализированы результаты комплексного микробиологического обследования беременных и новорождённых с проведением оценки значимости различных микробиологических методов при изучении состояния микроценоза влагалища у женщин и при диагностике ИВЗ у новорождённых.

Результаты изучения состояния микроценоза влагалища беременных женщин на основе комплексной микробиологической (культуральной, протеометрической и молекулярно-генетической) оценки

В соответствии с медицинской технологией «Интегральная оценка состояния микробиоты влагалища. Диагностика оппортунистических вагинитов» (Анкирская А. и Муравьева В., 2011) проведено комплексное микробиологическое обследование 212 беременных женщин во 11-111 триместре беременности. При исследовании (микроскопии мазков и культуральной диагностики) отделяемого влагалища нами выявлено 7 различных состояний микроценоза (рис.12).

в Нормоценоз

■ Бактериальным вагиноз Кандидозный вагиннт "Аэробный вагиннт

Бессимптомное носнтельство грибов в Мезоценоз

Цнтолнтнческий вагиноз

Рисунок 12. Состояния микроценоза влагалища в группе обследованных беременных женщин

Женщины с мезоценозом, бессимптомным носительством грибов и цитолитическим вагинозом в виду непрезентативности выборки исключены из анализа. Беременные с нормоценозом («=109) разделены на 3 подгруппы:

- I подгруппа с «абсолютным нормоценозом» (п=71), где на фоне доминирования лактобацилл отмечено отсутствие лейкоцитарной реакции в мазках и роста УПМ. При этом, методом количественной ПЦР (тест-система «Фемофлор-16») в 47 (66,2%) случаях состояние микроценоза оценено как нормоценоз, а у 24 (33.8%) диагностирован умеренный дисбаланс; в 17 (23,9%), связанный с обнаружением Ureaplasma spp. в титре 4-5 lg ГЭ/образец. а у 7 (9,9%) с выявлением грибов рода Candida в титре 3 lg ГЭ/образец. Во всех случаях количество лактобацилл соответствовало норме и абсолютно преобладали L. crispatus - 87,3%. - II подгруппа (я=24) где отмечено отсутствие лейкоцитов и наличие полиморфной микрофлоры в мазках с абсолютным доминированием лактоморфотипов. В посеве обнаружен рост в высоком титре (> 7 lg КОЕ/мл) - L. crispatus (66,7%), L. iners (33,3%) и в низких титрах УПМ (рис.13). Методом ПЦР только в 4-х случаях (16,7%) из 24 диагностирован нормоценоз. В остальных случаях (83.6%) различные варианты его нарушений: в 3-х случаях (12,5%) - выраженный анаэробный дисбаланс, в 9 (37,5%) случаях умеренный аэробно-анаэробно-грибковый дисбаланс и в 8 (33,3%) умеренный дисбаланс с титром Ureaplasma spp. 4 - 5 lg ГЭ/образец.

с f г

/ / / / / л* V' (/ Ь с.»

Л4 „<Y чР

<<f СЯ

^ ж

«г

Рисунок 13. Частота выделения УПМ во II подгруппе беременных с нормоценозом (MALDI-TOF-MS идентификация)

— III подгруппа (л=14) женщины, у которых в вагинальных мазках доминировали лактоморфотипы и отмечена умеренно выраженная (1=10-20 в п/зр) (8/57.1%) и выраженная (¿.=20-50 в п/зр) лейкоцитарная реакция (6/42.6%). В посеве у всех в низких титрах выделены УПМ: в 100% - CoNS, в 28.6% - Е. faecalis. Количество лактобацилл соответствовало норме (>7 lg КОЕ/мл); L. crispatus выделена у 9 (64.3%), а L. iners у 5 (35,7%) пациенток. Однако с помощью ПЦР только в 21.4% (3) диагностирован нормоценоз, а в 78,6% случаев отмечен умеренный дисбаланс, обусловленный наличием Ureaplasma spp. и анаэробных бактерий.

Таким образом, в общей группе беременных с нормоценозом («= 109), установленном при классическом культуральном исследовании, количественная ПЦР выявила различные варианты дисбалансов у 55 (50.5%) пациенток (рис. 14).

80,0%

40,0%

0,0%

33,8°/

66,2"/

_,_

78,6"/

21.4°/

I подгруппа Нормоценоза (11=71)

II подгруппа III подгруппа Нормоценоза Нормоценоза (п=24) (п=14)

Выраженный дисбаланс

■ Умеренный дисбаланс

■ Нормоценоз

Рисунок 14. Сравнительная оценка состояния нормоценоза влагалища. Метод классической микробиологии ув количественная ПЦР

В группе женщин с бактериальным вагинозом (БВ) («=25) в мазках в 76,0% случаев лактоморфотипы в мазках не выявлены. В 64,0% случаев при посеве отмечен рост лактобацилл в низких титрах. В результате культуральной диагностики с MALDI-TOF-MS анализом и количественной ПЦР обнаружено 18 видов лактобацилл с преимуществом L. iners (84,0%), L. vaginalis (32,0%) и L. gasseri (28,0%) (рис. 15).

100,0% ---

80,0% -

60,0%

40,0%

20,0% —

0,0%

Liners L.vaginalis L.gasseri L.crbpatus Ljensenii

другие

Рисунок 15. Частота встречаемости различных видов лактобацилл у беременных с бактериальным вагинозом (МАЮ1-ТОР-М5 и количественная ПЦР)

При посеве в аэробных условиях при БВ обнаружен рост разнообразных УПМ (рис. 16).

100,0% 50,0% 0,0%

I

Рисунок 16. Частота выделения УПМ у беременных с бактериальным вагинозом (MALDI—TOF—MS идентификация)

В группе беременных с БВ, количественной ПЦР, нормоценоз отмечен в 16,0% случаев. В тоже время в мазках этих пациенток выявлены «ключевые клетки» и морфотипы анаэробов/гарднерелл. В 28.0% методом ПЦР установлен умеренный смешанный дисбаланс, обусловленный повышенными показателями анаэробов, аэробов, генитальных микоплазм (> 4 lg ГЭ/образец) и грибов (> 3 lg ГЭ/образец). В 56,0% случаев методом ПЦР установлен выраженный анаэробный дисбаланс, чем подтвержден диагноз БВ.

Группу беременных с аэробным вагинитом (АВ) (п = 20) составили пациентки с резко выраженной лейкоцитарной реакцией (L > 40 в п/зр) в мазках. В посевах отмечен рост Е. faecalis, Е. coli, S. agalactiae, S. aureus в монокультуре и высоком титре (> 5 lg КОЕ/мл) (рис. 17). Однако с помощью количественной ПЦР у женщин с

AB в 55,0% случаев установлен нормоценоз, в 45,0% - умеренный или выраженный дисбаланс, обусловленный высокими титрами аэробно-анаэробных УПМ и генитальных микоплазм. Частота выявления лактобацилл при AB отличалась от Н и БВ и составила: 35,0% - L. crispatus, по 30,0% L. iners и L. vaginalis, 25,0% — L. gasseri и 15,0%- L. jensenii.

Enterococcus Escherichia coli Streptococcus Staphylococcus faecalis agalactiae aureus

Рисунок 17. Частота выделения УПМ у беременных с аэробным вагинитом

Во всех пробах у беременных с кандидозным вагинитом (KB) («=38) культуральным методом в высоких титрах (>5 lg КОЕ/мл) выделены грибы рода Candida. Вид С. albicans составил 92,1%, С. glabrata - 13,2%. При KB методом ПЦР в 92,1% случаев обнаружены грибы рода Candida в высоких титрах (>4 lg ГЭ/образец), а в 7,9 % определен нормоценоз. Однако при этом в посеве у пациенток выделены в высоком титре С. glabrata.

Лактобациллы у беременных с KB обнаружены обоими методами в 100% случаев и представлены в других соотношениях чем при Н. АВ и БВ: L. jensenii (31,8%), L. iners (28,9%), L. crispatus (23,7%), L. gasseri (15,8%), L. vaginalis (15.8%) и L. fermentum (13,2%).

Таким образом, в группе женшин с вагинальными инфекциями («=83) количественной ПЦР у 18 (21.7%) женщин определен нормоценоз, а у 65 (78,3%) различные варианты дисбалансов (рис. 18).

В результате обследования 212 беременных женщин с использованием культуральной диагностики с видовой идентификацией MALD1-TOF-MS и метода ПЦР выявлены лактобациллы 21 вида («=794): L. crispatus, L. jensenii, L. iners, L. gasseri, L. vaginalis, L. fermentum, L. salivarius, L. mucosae, L. oris, L. ultunensis, L. delbrueckii, L. plantarum, L. rhamnosus, L. casei, L. paracasei, L. johnsonii, L. zeae, L. reuteri, L. kitasatonis, L. viridescens (Weissella v.), L. acidophilus. У женщин с «абсолютным нормоценозом» доминировал вид L. crispatus (87,3±7,8%). У подавляющего большинства женщин с бактериальным вагинозом (84.0%; ДИ 95,0%:59,9-95,8) количественной ПЦР в высоком титре выявлен вид L. iners. Следует

отметить, что вид L. acidophilus составил лишь 0.3% в пуле молочно-кислых бактерий вагинальной микробиоты беременных женщин российской популяции.

100,0% 80.0% 60.0% 40,0% 20,0% 0.0%

/ ¿шяашня шцпг ■■" А м Я

20,0% 13,2%

56,0% 25,0%

. . » т 55,0% 78,9%

28,0%

lft.ll-.-,.

кшшЛР

Выраженный дисбаланс

■ Умеренный дисбаланс

Ё Нормоценоз

Бактериальный Аэробный

вагиноз вагинит

Кандндозный вагинит

Рисунок 18. Оценка методом количественной ПЦР состояния микробиоты влагалища при различных нозологических формах вагинальных инфекций

Сравнение результатов оценки микроценоза влагалища беременных различными методами (микроскопия, посев с видовой идентификацией MALDI-TOF-MS и количественная ПЦР) выявило преимущества и недостатки каждого из них, что помогло улучшить качество диагностики оппортунистических инфекций и дисбиотических состояний влагалища. Расхождения в результатах можно объяснить заниженными пороговыми значениями оценки некоторых возбудителей в тест-системе «Фемофлор-16» (грибы, генитатьные микоплазмы). а также отсутствием праймеров для ряда УПМ (S. aureus, S. agalactiae, Е. coli, Е. faecalis, грибов С. поп-albicans) в составе набора.

Мы считаем, что оптимальным методом лабораторной диагностики оппортунистических инфекций влагалища бактериальной (AB) и грибковой (KB) этиологии в настоящее время является комплексное микробиологическое исследование (микроскопия мазков, окрашенных по Граму и культуральное исследование с видовой идентификацией УПМ методом MALDI-TOF-MS анализа), в то время как оценка дисбиотических нарушений микроценоза влагалища (БВ) — микроскопией мазков, окрашенных по Граму и количественной ПЦР (Фемофлор-16). Молекулярно-генетическая диагностика оппортунистических инфекций влагалища должна включать индикацию в отделяемом влагалища Е. faecalis, Е. coli, S. agalactiae, S. aureus, как наиболее частых возбудителей AB.

В результате проведённого исследования с целью прогноза возможного развития ИВЗ у матери и ребенка нами разработан и внедрен в практику акушерских отделений алгоритм микробиологического обследования рожениц.

Алгоритм микробиологического обследования рожениц

Комплексное микробиологическое обследование:

1. Оценка состояния микробиоты влагалища «Фемофлор-16»

2. Исследование методом ПЦР: S. agalactiae, S. aureus, Е. faecalis, Е. coli

3.УРО-паиель (+ MALDI-TOF-MS - прямая индикация микроорганизмов в образце)

4. Посев крови + ПЦР-панель «Инфекции. Неонатальный скрининг»

Бактериологическое обследование:

1. Микроскопии отделяемого влагалища (мазки, окрашенные по Граму)

2. Культуралыюе исследование отделяемого влагалнша

Результаты выявления различньши микробиологическими методами особенностей микробной колонизации и этиологии ИВЗ у новорождённых, находящихся на выхаживании в стационаре

В период с января 2011 по декабрь 2012 года, с целью изучения особенностей колонизации слизистых оболочек УПМ и этиологии ИВЗ у новорождённых, а также для оценки различных методов микробиологической диагностики, проведено комплексное обследование 928 новорождённых, находящихся на выхаживании в отделениях Центра (405 в ОРИТ и 523 в ОПН). Для оперативной профилактики формирования эпидемических вариантов возбудителей изучена динамика циркуляции госпитальных штаммов в различных отделениях.

В обследованной группе новорождённых более 50% детей родились недоношенными с низкой массой тела (от 500 до 2500 грамм), в том числе с ЭНМТ и ОНМТ. В структуре заболеваемости пациентов неонатальных отделений инфекционная патология в среднем составляла в ОРИТ 20%, а в ОПН - 46%. Среди всех нозологий в обоих отделениях первое место занимали пневмонии (71,0% в ОРИТ и 76,5% в ОПН). Инфекции мочевыводящих путей составляли 7,5% в обоих отделениях; сепсис в ОРИТ - 4,7%, в ОПН - 7,5%; локальные формы инфекционной патологии (ринит, конъюнктивит, дакриоцистит, омфалит) — 5,6% в ОРИТ и 1,0% в ОПН; грибковые инфекции - 7,5% в ОРИТ и 2,5% в ОПН.

С подозрением на внутриутробную инфекцию (ВУИ) в первые сутки жизни нами обследованы 296 новорождённых: у 257 (86,8%) детей роста микроорганизмов не отмечено; у 39 (13,2%) обнаружены УПМ в кате и зеве, из них у 20 детей ВУИ подтверждены клинико-лабораторными данными, при этом в посевах у 8 детей выявлены S. agalactiae, у 4 - Е. coli, у 5 - С. albicans, у 2 - энтеробактерии (Е. asburiae, К. pneumoniae) и у 1 — С. amyco/atum.

Таким образом, в этиологической структуре ВУИ новорождённых ведущую роль играли S. agalactiae (40,0%), Е. coli (20,0%) и С. albicans (25,0%), что сопоставимо с результатами отечественных и зарубежных исследований. Аналогичные микроорганизмы обнаружены при обследовании отделяемого влагалища у рожениц -матерей этих детей.

Полученные данные позволили предложить к разработке диагностическую ПЦР-панель для комплексной детекции патогенов внутриутробных инфекций «Инфекции. Неонатальный скрининг», содержащую праймеры наиболее часто встречающихся при этой нозологии бактерий (в т.ч. S. agalactiae, Е. coli, Е. faecalis и др.), грибов (С. albicans, С. non-albicans). С целью повышения частоты выявления возбудителей ВУИ нами предложен алгоритм обследования новорождённых в первые сутки после рождения.

Алгоритм обследования новорождённого в первые сутки после рождения

ПЦР панель «Инфекции. Неонатальный скрининг» Посев аспирата из желудка (мазок из зева) Посев крови с прямой МАЮ1-ТОР-М5 индикацией микроорганизмов в положительной гемокультуре

ПЦР панель «Инфекции. Септи-панель»

Посев аспирата из желудка (мазок из зева)

Посев крови с прямой МАЬ01-ТОР-МЗ индикацией микроорганизмов в положительной гемокультуре

* — кандидоз, аэробный вагинит, бактериальный вагиноз

** - наличие минимум двух лабораторных и одного клинического признака инфекции *** - состояние после трансплантации органов, наличие иску сственных имплантов, хронических воспалительных процессов, неоднократные курсы антибиотикотерапии (риск наличия госпитальных штаммов микроорганизмов) и т.д.

С целью изучения особенностей колонизации слизистых оболочек (ЖКТ и зев) у новорождённых ОРИТ и ОПН проводили в динамике (2 раза в неделю) бактериологическое исследование клинического материала. В результате выделено, идентифицировано методом МАЬй1-ТОР-М5 анализа, и протестировано на чувствительность к АМП 4991 изолят УПМ.

Наблюдение за колонизацией новорождённых в условиях стационара позволило выявить доминирующие группы УПМ, циркулирующие среди пациентов и определить различия микробного пейзажа двух отделений (рис. 19).

ОРИТ

опн

Рисунок 19. Группы УПМ. колонизирующие ЖКТ новорождённых в ОРИТ и ОПН

Чаще всего в обоих неонатальных отделениях слизистые ЖКТ и зева новорождённых колонизировали CoNS (36,7% в ОРИТ: 48.7% в ОПН), видовой состав которых представлен 8 видами, с преобладанием в обоих отделениях трёх видов: S. epidermidis, S. haemolyticus и S. hominis (рис. 20).

ОРИТ 6,8%

0.7%

■ S.epiclermiäis

* S. haemolyticus S. hominis

* Другие виды

Рисунок 20. Частота выделения различных видов CoNS из кала и зева новорождённых

Доля метициллин-резистентных (MR) штаммов CoNS (MRCoNS) составила в ОРИТ - 93,0%, в ОПН - 76,0%. S. aureus выявлены в 0.8% случаев в ОРИТ и 5,0% в ОПН. MRSA среди них не обнаружено.

Второй группой микроорганизмов по частоте выделения из ЖКТ и зева новорождённых оказались представители семейства Enterobacteriaceae; в ОРИТ -20,0%), в ОПН - 43,6%. Всего выделено 23 вида бактерий 9 родов: Escherichia; Klebsiella; Enterobacter; Pantoea; Proteus; Morganella; Hafnia; Serratia; Citrobacter. В обоих отделениях преобладали в основном три вида: Е. coli, К. pneumoniae и Е. cloacae. Продуцентами бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) в ОРИТ были 55,0% энтеробактерий, в ОПН - 24,6% штаммов.

Третью группу по частоте колонизации слизистых новорождённых в обоих отделениях составили энтерококки (98,0% из них виды Е. faecalis и Е. faecium), а также зеленящие стрептококки (Streptococcus oralis, mitis, mutans, salivarius) в зеве новорождённых ОПН, которые обнаруживали у 81,0% детей. Интенсивная колонизация индигенными для зева видами, на наш взгляд, обусловлена меньшим антибиотическим прессом в ОПН. более старшим возрастом детей, и постоянными контактами с матерью.

НГОБ и дрожжевые грибы рода Candida занимали четвёртое место среди основных групп УПМ. колонизирующих слизистые новорождённых в обоих отделениях. НГОБ представлены в основном Р. aeruginosa, различными видами Acinetobacter (с преобладанием А. Ъаитаппп) и S. maltophilia. В ОРИТ - Р. aeruginosa (35,2%), Acinetobacter spp. (35,7%), 5. maltophilia (21,7%). В ОПН среди НГОБ 50,0% составили Acinetobacter spp., затем Р. aeruginosa - 25,0% и S. maltophilia - 18,0%. Кроме трех основных видов у новорождённых ОПН обнаружены ранее не выявляемые в неонатальных отделениях виды; Wautersia paucula, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas paucimobilis, Chryseobacterium indologenes. Особое беспокойство вызвала колонизация новорождённых последними двумя видами, из-за их природной полирезистентности к антибиотикам.

Частота выделения дрожжевых грибов в ОРИТ и ОПН составила 6,0% и 4.2% соответственно. Подавляющее большинство дрожжевых грибов принадлежали к роду Candida. В ОПН 91,1% штаммов составил вид С. albicans, а в ОРИТ доля С. albicans была лишь 23.7%, остальные 76,3% принадлежали к С. non-albicans видам (С. famata, С. glabrata и С. parapsilosis). Преобладал устойчивый к флюконазолу вид С. famata -48,2% среди всех С. non-albicans изолятов (94/195). У одного ребенка в ОПН выделен штамм S. cerevisiae и у одного - M.furfur.

В посевах из очагов инфекции УПМ обнаруживали в 28,5% случаев у новорождённых ОРИТ и в 73,0% ОПН. Всего выделено и протестировано на чувствительность к АМП 279 изолятов. Среди возбудителей доминировали CoNS, как в ОРИТ (56.1%), так и в ОПН (60.5%) (рис. 21).

ОРИТ

ft 7°/„

3,9% 3,3%

■ CoNS

■ Enterobacteriacae

4.0%

ОПН

mS. а иге us

Candida spp.

я НГОБ

■ Enterococcus spp.

другие

Рисунок 21. Группы УПМ, выделенных из очагов инфекций у новорождённых

Более 80% штаммов стафилококков, выделенных из очагов инфекций, составила группа MRCoNS, представленная теми же тремя видами, что и при колонизации ЖКТ. Чаще всего выделяли метициллин-резистентный S. epidermidis (74,0%). Второй группой в этиологической структуре ИВЗ новорождённых ОРИТ были НГОБ (17,5%), в то время как в ОПН не зафиксировано случаев инфекций, вызванных этими микроорганизмами. Третьей группой в равных долях - энтеробактерии и дрожжевые грибы. Следует отметить, что хотя энтеробактерии в 55,0% обладали множественной лекарственной устойчивостью (продуцировали БЛРС). их роль в возникновении ИВЗ у новорождённых не была столь значимой, как CoNS и НГОБ.

Дрожжевые грибы рода Candida (и=14), были выделены из очагов инфекции у недоношенных новорождённых с ОНМТ и ЭНМТ и принадлежали к видам С. поп-albicans: C.famata (64,3%), С. glabrata (28,6%), С. sake (7,1%).

В ОПН вторыми в этиологической структуре инфекций оказались энтеробактерии (18,0% из них продуценты БЛРС) и энтерококки (£. faecalis - 64,0%, Е. faecium - 36,0%).

Таким образом, проведённое исследование ещё раз подтвердило, что этиология ИВЗ тесно связана с составом доминирующих групп УПМ. колонизирующих слизистые оболочки новорождённых. Нами отмечено небольшое разнообразие видов УПМ циркулирующих в обоих неонатальных отделениях Центра, среди которых лидируют MRCoNS. С эпидемиологической и клинической точки зрения особенно значимо изучение видового состава энтеробактерий. грибов и неферментирующих бактерий, выделяемых от новорождённых. При этом важна срочность выполнения анализа с определением их видовой принадлежности и генов антибиотикорезистентности у выделенных УПМ. Проведённая видовая идентификация с помощью метода MALDI-TOF-MS анализа расширила спектр выявляемых микроорганизмов (CoNS, энтеробактерии, НГОБ, дрожжевые грибы), что имеет значение в слежении за гетерогенностью микробных популяций, циркулирующих в конкретных отделениях.

В последние годы появилась возможность наряду с традиционным выделением возбудителей культуральными методами использовать молекулярно-генетические способы быстрой идентификации патогенов в клиническом материале. В силу относительной новизны методики, а также изменчивости микробного пейзажа стационаров, роль и клиническая значимость метода ПЦР в практике микробиологического мониторинга до настоящего времени полностью не определена.

В ходе работы проанализированы результаты тестирования 272 образцов клинического материала (кал, зев, отделяемое из очагов инфекции), полученного у 68 новорождённых ОРИТ. Впервые параллельно с культуральным методом и видовой идентификацией выделенных УПМ методом MALDI-TOF-MS анализа проводили прямую индикацию микроорганизмов непосредственно в клиническом материале

методом количественной ПЦР с использованием тест-панели «Инфекции. Нозокомиальный скрининг» (разработано совместно с сотрудниками ОРИТ новорождённых и лаборатории молекулярно-генетических методов).

Панель позволяет проводить в первичном клиническом материале индикацию следующих микроорганизмов: Staphylococcus spp. / тес А+/—; S. aureus тес А +/—; Enterobacter spp.; S. marcescens; E. coli; K. pneumoniae/ K. oxytoca; Proteus spp. (mirabilis/vulgaris/ M. morganii); Citrobacter spp.: S. maltophilia; Acinetobacter spp.; P. aeruginosa; B. cepacia; E. faecium; E. faecalis; Streptococcus spp.; B. fragilis group (B.fragilis, B. vulgates, B. thetaiotaomicron); Candida spp.; C. albicans.

Совпадение результатов идентификации получено в 204 случаях (75,0%), в том числе в 142 случаях (69,6%) определён одинаковый возбудитель, а в 62 случаев (30,4%) оба метода дали отрицательные результаты. Детекция возбудителя методом ПЦР, не подтверждённая посевами отмечена в 34 случаях (12,5%). что объясняется проводимой антибактериальной терапией. Положительные посевы при отрицательной ПЦР-диагностике получены в 23 случаях (8,5%), что связано с обнаружением УПМ. не заявленных в составе панели. Полное несовпадение идентификаций зарегистрировано в 11 случаях (4,0%) и объясняется недостаточной специфичностью праймеров ряда микроорганизмов, — в частности фибов (рис. 22).

Рисунок 22. Результаты параллельного обследования пациентов количественной ПЦР и культуральным методами (н=272)

Таким образом, количественная ПЦР с применением комплексной панели может быть использована как метод экстренной диагностики возбудителей ИВЗ в ситуациях клинико-лабораторного ухудшения состояния новорождённых.

Сочетание молекулярно-генетического и культурального методов (с использованием MЛL£)/-Г0F-Л/5) диагностики позволяет существенно повысить обоснованность и быстроту принятия клинических решений. На основании получаемых данных и в условиях дефицита времени (стремительное ухудшение состояния пациента) можно с наибольшей вероятностью выбирать адекватную

Положительные посевы при

O I JHHKI IIV" ■■".<

результат

4,0%

Полное несовпадение (+) результатов ПЦР

Положительный. результат ПЦР не

подтвержденный посевами

этиотропную терапию ещё до получения результатов культурального исследования.

Разработана концепция комплексной диагностики оппортунистических инфекций с применением протеомных и молекулярно-генетических методов в системе микробиологического мониторинга. Концепция опирается на методологию дифференцированного применения методов в протоколах обследования пациентов неонатального профиля и положена в основу диагностического алгоритма комплексного микробиологического обследования новорождённых детей после первых 24 часов жизни.

Алгоритм микробиологического обследования новорождённого после первых

24 часов жизни (в неонатальных отделениях)

Признаки инфекции у новорожденного

ЕСТЬ

НЕТ

Возраст ребенка 72 часа жизни

Более 72-х часов

Менее 72-х часов

Масса тела

при рождении более 1500г

Масса тела

при рождении менее 1500г

Посев кала 1 раз в неделю

мазка из зева 1 раз в неделю

Посев кала и

ШШ/-ТОГ-М$

индикацией

микроорганизмов в

гемокультуре

3.Посев отделяемого из

очага инфекции*

1 .ПЦР - панель «Инфекции. Нозокомиальный скрининг»

2.Посев крови с прямой

1 .ПЦР - панель «Инфекции.

Неонатальный скрининг»' + ПЦР - панель «Нозокомиальный скрининг»

2. Посев крови с прямой \iALDI-TOF-MS индикацией микроорганизмов в гемокультуре

3.Посев кала (мекония)

4.Посев отделяемого из очага инфекции**

* - при отсутствии исследования при рождении

**- аспират из трахеи, кал, моча, ликвор, отделяемое пупочной ранки н т.д.

Проведённое исследование даёт основание считать, что протеометрические и молекулярно-генетические методы открывают качественно новый этап в микробиологических исследованиях, заметно потеснив фенотипические (биохимические) методы. Внедрение их в практику клинической микробиологии позволяет объективизировать, ускорить, удешевить видовую идентификацию многих микроорганизмов, упрощает диагностику оппортунистических инфекций, а также даёт возможность оперативно проводить штаммовое типирование УПМ, что имеет первостепенное значение в системе микробиологического мониторинга по профилактике формирования эпидемических вариантов госпитальных штаммов в стационарах неонатального профиля.

Выводы

1. Внедрение усовершенствованных преаналитических этапов технологии MALDI-TOF-MS анализа в алгоритм микробиологического исследования привело к повышению достоверности видовой идентификации лактобацилл (р<0,0001), нейссерий (р<0,01) и дрожжевых грибов (р<0,05).

2. Сравнительное сопоставление полученной кластеризации индивидуальных масс-спектров и сиквенс-типов госпитальных изолятов S. epidermidis и S. haemolyticus позволило установить наличие положительной корреляционной зависимости и подтвердить возможность применения MALDI-TOF-MS анализа для штаммовой дифференциации микроорганизмов.

3. Метод MALDI-TOF-MS анализа показал высокую достоверность (score >2) видовой идентификации стафилококков (95,8%), энтерококков (97,5%), условно-патогенных энтеробактерий (98,4%), неферментирующих бактерий (93,6%), и |3-гемолитических стрептококков (93,8%), что обосновывает приоритет MALDI-TOF-MS при видовой идентификации микроорганизмов этих групп. Видовую идентификацию а-гемолитических стрептококков, в т.ч. пневмококков, необходимо подтверждать дополнительными тестами.

4. При скрининге бактериурии методом проточной уроцитофлюориметрии и прямой MALDI-TOF-MS результаты исследования целесообразно учитывать в случаях выраженной бактериурии (титр>Ю5КОЕ/мл), либо при её отсутствии. Культуральное исследование мочи остаётся «золотым стандартом» в диагностике инфекций мочевыводящих путей.

5. Прямой MALDI-TOF-MS анализ и/или метод количественной ПЦР с использованием разработанной комплексной системы «Инфекции. Септи-панель» позволяют в кратчайшие сроки (менее 24 часов) определять патогены в положительной гемокультуре и назначать этиотропную терапию.

6. Использование протеомно-геномных технологий при изучении различных микроценозов у беременных женщин и новорождённых детей позволило расширить существующие представления о видовом разнообразии бактерий, трудноидентифицируемых классическими культуральными методами (33 вида неферментирующих бактерий, 31 вид лактобацилл, 21 вид коринебактерий и 27 видов

строгих анаэробов), что даёт основание для дальнейшей оценки их роли при формировании микроценоза в норме и при патологии.

7. В результате комплексного применения методов MALDI-TOF-MS анализа и количественной ПЦР опровергнуто представление о ведущей роли вида L. acidophilus в пуле молочно-кислых бактерий вагинальной микробиоты у российских беременных женщин: вид L. acidophilus составил 0,3% от общего количества идентифицированных лактобацилл. Во влагалище российских беременных женщин выявлены лактобациллы 21 вида при этом: L. crispatus - ведущий вид при нормоценозе, L. iners - при бактериальном вагинозе.

8. Совокупность методов классической бактериологии, MALDI-TOF-MS анализа и секвенирования рРНК позволила определить широкий спектр дрожжевых грибов, включающий 21 вид 6 родов (Candida, Saccharomyces, Rodotorulla, Trlchosporon, Pichia, Malassezia), которые могут вызывать кандидозы у женщин и новорождённых. Установлена этиологическая роль дрожжевых грибов С. non-albicans видов при поздних неонатальных инфекциях у новорождённых детей с очень низкой и экстремально низкой массой тела.

9. Оптимальным подходом в диагностике оппортунистических инфекций влагалища бактериальной и грибковой этиологии является комплексное бактериологическое исследование (микроскопия мазков, окрашенных по Граму, и культуральное исследование с видовой идентификацией УПМ методом MALDI-TOF-MS анализа), в то время как для оценки дисбиотических нарушений микроценоза влагалища предпочтительнее использовать метод количественной ПЦР.

10. Дифференцированный подход к использованию микробиологических тестов в значительной мере решают проблемы как ургентной медицины (комплесные ПЦР -панели), так и отсроченной диагностики ИВЗ (культуральный метод) при формировании антибиотикополитики и стратегии эпидемиологического контроля в акушерских и неонатальных стационарах.

Практические рекомендации

1. Метод MALDI-TOF-MS анализа рекомендуется для применения в рутинной практике микробиологических лабораторий при видовой идентификации УПМ. Технологическое усовершенствование условий культивирования и методологических способов ведения масс-спектрометрического исследования позволяют достоверно повысить качество видовой идентификации труднодиагностируемых микроорганизмов: лактобацилл, неферментирующих бактерий, коринебактерий, нейссерий и дрожжевых грибов, а также проводить прямую индикацию патогенов в клиническом материале.

2. Для диагностики оппортунистических инфекций в акушерско-неонатальных отделениях рекомендуется использование комплексных ПЦР-панелей, дающих возможность быстро и точно идентифицировать наиболее часто встречающиеся условно-патогенные микроорганизмы.

3. При диагностике бактериурии рекомендуется учитывать результаты скрининговых методов (метод проточной уроцитофлюориметрии и прямой MALDI-

TOF-MS) только в случае выраженной бактериурии (титр >Ю5КОЕ/мл), либо при ее отсутствии. В остальных случаях требуется обязательное проведение культурального исследования мочи.

4. Изучение микроценоза влагалища беременных женщин необходимо проводить с учётом дифференцированного методологического подхода в зависимости от результатов скрининга по микроскопии вагинальных мазков: при вагинитах бактериальной и грибковой этиологии проводить культуральное исследование с видовой идентификацией УПМ методом MALDI-TOF-MS анализа, для оценки дисбиотических нарушений микроценоза влагалища (бактериальный вагиноз) -количественную ПЦР.

5. Предложенные алгоритмы обследования беременных, рожениц и новорождённых стандартизируют и оптимизируют микробиологическую диагностику оппортунистических инфекций в учреждениях различного уровня.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Муравьева, В.В. Сравнительная оценка видовой идентификации вагинальных изолятов дрожжевых грибов методом MALDI-TOF-MS и традиционными (биохимическим и фенотипическим) методами / В.В. Муравьева, Т.В. Припутневич, М.Г. Завьялова, A.C. Анкирская, E.H. Ильина // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.-2014.— Т. 16, №1.-С. 1-7.

2. Припутневич, Т.В. Прямая идентификация микроорганизмов из гемокультур с помощью метода MALDI-TOF-MS в сравнении с методом ПЦР / Т.В. Припутневич, А.Р. Мелкумян, E.H. Ильина, С.Д. Митрохин, Д.Ю. Трофимов, O.A. Непша, O.A. Бурменская // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия

2014.-Т. 16, №1.-С. 21-26.

3. Зубков, В.В. Микробиологический мониторинг в системе инфекционного контроля неонатальных стационаров / В.В. Зубков, JI.A. Любасовская, И.И. Рюмина, Т.В. Припутневич, A.C. Анкирская, В.Л. Тютюнник // Российский вестник перинатологии и педиатрии. — 2014. — №1. — С. 51-56.

4. Калакуцкая, А.Н. Частота встречаемости и чувствительность к антибиотикам Streptococcus agalactiae, выделенных от пациентов акушерско-гинекологического центра третьего уровня / А.Н. Калакуцкая, В.В. Муравьева, Т.Е. Королева, О.В. Мотузова, O.E. Орлова, Т.В. Припутневич // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2014. — Т. 16, №2. - С. 22.

5. Мотузова, О.В. Частота встречаемости и чувствительность штаммов Malassezia furfur, выделенных от новорождённых неонатальных отделений / О.В. Мотузова, O.E. Орлова, Ю.В. Родченко, В.В. Муравьева, А.Н. Калакуцкая, Т.В. Припутневич // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2014. - Т. 16, №2.-С. 29.

6. Мелкумян, А.Р. Сравнительное изучение микроценоза влагалища у беременных женщин / А.Р. Мелкумян, Т.В. Припутневич, O.E. Орлова, A.C. Анкирская, В.В. Муравьева // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия -Москва, 2013.-Т. 15, №2 (1).-С. 30.

7. Любасовская, Л.А. Роль коагулазонегативных стафилококков в этиологии госпитальных инфекций у новорождённых ОРИТ / Л.А. Любасовская, Т.В. Припутневич, E.H. Ильина, М.А. Корниенко // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - Москва, 2013. - Т. 15, №2 (1). - С. 27-28.

8. Припутневич, Т.В. Анализ внедрения масс-спектрометрии в микробиологическую практику центра акушерства, гинекологии и перинатологии / Т.В. Припутневич, А.Р. Мелкумян, В.В. Муравьева, М.Г. Завьялова, С.А. Зайцева // Материалы VII Международного конгресса по репродуктивной медицине - Москва, 2013.-С. 75-77.

9. Мелкумян, А.Р. Видовая идентификация лактобактерий при оценке состояния микробиоты влагалища у женщин репродуктивного возраста / А.Р. Мелкумян, Т.В. Припутневич, A.C. Анкирская, Д.Ю. Трофимов, В.В. Муравьева, С.М. Муллабаева, М.Г. Завьялова // Материалы VII Международного конгресса по репродуктивной медицине - Москва, 2013. - С. 70-71.

10. Припутневич, Т.В. Прямая идентификация микроорганизмов из гемокультур с помощью метода МALDI-TO F-MS / Т.В. Припутневич, Д.Ю. Трофимов, М.Г. Завьялова, А.Р. Мелкумян // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2013. - Т. 15, №2 (1). - С. 35.

11. Любасовская, Л.А. Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика коагулазонегативных стафилококков, выделенных у новорождённых отделения реанимации и интенсивной терапии / Л.А. Любасовская, М.А. Корниенко, Т.В. Припутневич, E.H. Ильина, А.И. Щеголев // Антибиотики и химиотерапия. -2013.-№3,-С. 25-32.

12. Мелкумян, А.Р. Видовой состав лактобактерий при различном состоянии микробиоты влагалища у беременных / А.Р. Мелкумян, Т.В. Припутневич, A.C. Анкирская, Д.Ю. Трофимов, В.В. Муравьева, С.М. Муллабаева, М.Г. Завьялова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. — 2013.-Т. 15, №1,-С. 72-79.

13. Мелкумян, А.Р. Влагалищные лактобактерии - современные подходы к видовой идентификации и изучению их роли в микробном сообществе / А.Р. Мелкумян, Т.В. Припутневич //Акушерство и гинекология.-2013. -№ 7,- С. 18-23.

14. Припутневич, Т.В. Сравнительный анализ применения масс-спектрометрии и автоматизированной проточной цитометрии для скрининга бактериурии / Т.В. Припутневич, С.А. Зайцева, М.Г. Завьялова, А.Р. Мелкумян, Т.А. Тетерина, E.H. Ильина, С.Д. Митрохин, И.А. Аполихина // Акушерство и гинекология. -2013. -№9,- С.53-58.

15. Ионов, О.В. Роль метода ПЦР в диагностике врожденных и нозокомиальных инфекций у новорождённых / О.В. Ионов, И.В. Никитина, О.В. Бурменская, О.С. Непша, Д.Ю. Трофимов, А.Е. Донников, С.Д. Митрохин, Т.В. Припутневич, Л.А. Любасовская, Д.Н. Дегтярев // Акушерство и гинекология,- 2013. - № 11. -С.59-64.

16. Любасовская, Л.А. Особенности микробной колонизации новорождённых, госпитализированных в отделение реанимации и интенсивной терапии /

JI.A. Любасовская, T.B. Припутневич, А.С. Анкирская, Д.Н. Дегтярев, А.Г. Антонов, О.В. Ионов, И.В. Никитина, Н.А. Приходько // Российский вестник перинатологии и педиатрии. -2013. - №3. - С.87-91.

17. Зубков, В.В. Обзор потребления антимикробных препаратов у новорождённых с инфекционно-воспалительными заболеваниями / В.В. Зубков, И.И. Рюмина, Т.В. Припутневич, H.B. Евтеева, С.Д. Митрохин, B.J1. Тютюнник // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2013.-Т. 58, №2,- С. 12-16.

18. Припутневич, Т.В. Использование современных лабораторных технологий в видовой идентификации лактобактерий при оценке состояния микробиоты влагалища у женщин репродуктивного возраста / Т.В. Припутневич, А.Р. Мелкумян,

A.С. Анкирская, Д.Ю. Трофимов, В.В. Муравьева, М.Г. Завьялова // Акушерство и гинекология. - 2013. - №1. - С.76-80.

19. Припутневич, Т.В. Колонизация неферментирующими бактериями детей, госпитализированных в отделение патологии новорождённых перинатального центра 3 уровня / Т.В. Припутневич, JI.A. Любасовская, А.С. Анкирская, И.И. Рюмина,

B.В. Зубков // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. -Москва, 2012. - Т. 14, №2 (1). - С. 43-44.

20. Корниенко, М.А. Молекулярно-генетическая характеристика клинических изолятов Staphylococcus haemolyticus по данным MLST и анализа масс-спектров / М.А. Корниенко, Е.Н. Ильина, Л.А. Любасовская, Т.В. Припутневич, В.М. Говорун // Материалы III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине».- Казань, 2012. - С. 163-164.

21. Приходько, Н.А. Роль Candida non-albicans в развитии грибковой инфекции у новорождённых с очень низкой и экстремально низкой массой тела / Н.А. Приходько, Д.Н. Дегтярев, Т.В. Припутневич, А.Г. Антонов, А.С. Анкирская // Материалы XIII Всероссийского научного форума «Мать и Дитя». - Москва, 2012. - С. 426-27.

22. Зубков, В.В. Микробиологический мониторинг в системе инфекционного контроля в неонатологическом стационаре / В.В. Зубков, И.И. Рюмина, Т.В. Припутневич, Л.А. Любасовская, А.С. Анкирская // Академический журнал Западной Сибири, 2012. - №1. - С. 49-50.

23. Антонов, А.Г. Лечение грибковой инфекции у глубоконедоношенных детей / А.Г. Антонов, Н.А. Приходько, А.С. Анкирская, А.А. Рудакова, Т.В. Припутневич // Российский вестник перинатологии и педиатрии.-2012-№5.- С. 13-16.

24. Припутневич, Т.В. Особенности микробной колонизации новорождённых, госпитализированных в отделение реанимации и интенсивной терапии / Т.В. Припутневич, Л.А. Любасовская, О.В. Ионов, И.В. Никитина, Н.А. Приходько // Материалы V Научно-образовательного конгресса «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии» - Москва, 2012. - С. 107-109.

25. Анкирская, А.С. Видовой состав лактобацилл, выделенных из отделяемого влагалища беременных женщин при различных состояниях вагинального микроценоза / А.С. Анкирская., Т.В. Припутневич, А.Р. Мелкумян, В.В. Муравьева,

М.Г. Завьялова, JI.A. Любасовская, М.К. Меджидова // Проблемы репродукции -Москва, 2012.-С.27.

26. Припутневич, Т.В. Сравнение видового состава вагинальных лактобацилл беременных и небеременных женщин репродуктивного возраста. / Т.В. Припутневич,

A.C. Анкирская, А.Р. Мелкумян, В.В. Муравьева, JI.A. Любасовская, М.К. Меджидова, М.Г. Завьялова // Сборник тезисов Всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика - в эпицентре женского здоровья» - Москва, 2012. - С. 100-102.

27. Руководство по лабораторной диагностике инфекций урогенитального тракта / под ред. Домейка М. и др. - СПб.: ООО «Издательство Н-Л». - 2012.

28. Припутневич, Т.В. Внедрение масс-спектрометрии для улучшения качества микробиологической диагностики в практике акушерства, гинекологии и перинатологии / Т.В. Припутневич, A.C. Анкирская, E.H. Ильина, В.В. Муравьева, Л.А. Любасовская, А.Р. Мелкумян, М.Г. Завьялова, В.В. Зубков, И.В. Никитина // Лаборатория. - Москва, 2012. - №2. - С. 52.

29. Припутневич, Т.В. Результаты сравнительного исследования применения масс-спектрометрии и автоматизированной проточной цитометрии в диагностике бактериурий / Т.В. Припутневич, A.C. Анкирская, Л.А. Любасовская, М.Г. Завьялова,

B.В. Муравьева // Материалы VI Всероссийской научно-практическая конференции с международным участием «Рациональная фармакотерапия в Урологии». - Москва, 2012.-С. 91-93.

30. Сухих, Г.Т. Опыт практического применения масс-спектрометрии в рутинной микробиологической диагностике центра акушерства, гинекологии и перинатологии / Г.Т. Сухих, Т.В. Припутневич, A.C. Анкирская, М.Г. Завьялова, В.М. Говорун, E.H. Ильина // Материалы V научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ». - Москва, 2012. - С. 30-31.

31. Любасовская, Л.А. Колонизация неферментирующими бактериями детей, госпитализированных в отделение патологии новорождённых перинатального центра 3 уровня / Л.А. Любасовская, A.C. Анкирская, Т.В. Припутневич, И.И. Рюмина, В.В. Зубков // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия — Москва, 2012. - Т. 14, №2 (1). - С. 43-44.

32. Припутневич, Т.В. Видовой состав влагалищных лактобактерий, выделенных у беременных женщин / Т.В. Припутневич, A.C. Анкирская, Д.Ю. Трофимов,

A.Р. Мелкумян, В.В. Муравьева, С.М. Муллабаева, М.Г. Завьялова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия - Москва, 2012. - Т. 14, №2 (1). -

C. 43.

33. Анкирская, A.C. Использование масс-спектрометрии для идентификации клинических изолятов дрожжевых грибов / A.C. Анкирская, Т.В. Припутневич,

B.В. Муравьева, М.Г. Завьялова, Л.А. Любасовская, Т.Е. Королева, Т.Г. Миронова, В.Л. Писарницкая // Проблемы медицинской микологии - 2011.-Т. 13, №2. - С. 6162.

34. Рюмина, И.И. Целесообразность проведения бактериологического исследования крови у новорождённых детей с бронхолегочной патологией / И.И. Рюмина, В.В. Зубков, О.В. Милая, А.С. Анкирская, JI.A. Любасовская, Т.В. Припутневич // Материалы Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 80-летаю кафедры эпидемиологии и доказательной медицины «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе». - Москва, 2011. -С.344—345.

35. Ильина, Е.Н. Прямая оценка параметров лекарственной устойчивости гонококка / Е.Н. Ильина, М.В. Малахова, В.А. Верещагин, М.В. Говорун, Т.В. Припутневич,

A.А. Кубанова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. -Т. 144, №8. -С. 194-97.

36. Боровская, А.Д. Анализ вклада молекулярных механизмов в формирование устойчивости гонококка к тетрациклину / А.Д. Боровская, М.В. Малахова,

B.А. Верещагин, Е.Н. Ильина, В.М. Говорун, Т.В. Припутневич, Н. Аль-Хафаджи,

A.А. Кубанова // Бюллетень экспериментальной биологии медицины. - 2007. -Т. 144, №3.-С. 432-37.

37. Кубанова, А.А. Первый опыт применения метода прямого белкового профилирования для идентификации и типирования N. gonorrhoeae / А.А. Кубанова,

B.М. Говорун, Е.Н. Ильина, В.А. Верещагин, Н.В. Фриго, Т.В. Припутневич // Вестник дерматологии и венерологии. - 2006. - №5. — С. 25-29.

38. Малахова, М.В. Анализ генетических маркеров резистентности N. gonorrhoeae к Р-лактамным антибиотикам / М.В. Малахова, В.А. Верещагин, Е.Н. Ильина, М.В. Говорун, М.М. Зубков, Т.В. Припутневич, В.И. Кисина, А.А. Кубанова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 141, № 5. —

C. 549-54.

39. Кубанова, А.А. Мониторинг антибиотикорезистентности N. gonorrhoeae и молекулярных механизмов ее развития в Российской Федерации / А.А. Кубанова, В.М. Говорун, Н.В. Фриго, А.А. Кубанов, Т.В. Припутневич, И.Н. Лесная II Вестник дерматологии и венерологии. - 2006. - №5. - С. 17-24.

40. Верещагин, В.А. Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии для выявления в генах gyrA и рагС N. gonorrhoeae однонуклеотидных замен, определяющих формирование устойчивости к фторхинолонам / В.А. Верещагин, Е.Н. Ильина, М.М. Зубков, Т.В. Припутневич, А.А. Кубанова, В.М. Говорун // Молекулярная биология. - 2005. - Т. 39. - № 6. - С. 923-32.

41. Kornienko, М. Detection of pathogenicity factors of Staphylococcus epidermidis by whole genome sequencing / M. Kornienko, V. Kopyltsov, I. Karpova, A. Larin, T. Semashko, E. Kostiyukova, E. Ilina, L. Lubasovskaya, T. Priputnevich, G. Sukhikh, V. Govorun // Abstract # P 24rd ECCMID. - Spain, Barselona. -2014. - P. 0197.

42. Priputnevich, T. The introduction of mass spectrometry in routine practice in obstetrics, gynaecology and neonatology / T. Priputnevich, G. Sukhikh, A. Melkumyan,

D. Trofimov, V. Muravieva, L. Lyubasovskaya, I. Ilina, A. Ankirskaya, V. Zubkov // Abstract 24rd ECCMID. - Spain, Barselona. - 2014. - R276.

43. Kushnir, A. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis of Neisseria gonorrhoeae Isolates in Russia / Kushnir A., Ilina E., Malakhova M., Priputnevich T., Filipenko M. // Infect Genet Evol. - 2013. - Vol. 14. - P. 8-14.

44. Priputnevich, T. Usage of modern technologies in laboratory in lactobacilli species identification in assessment of vaginal microbiota in women of reproductive age / T. Priputnevich, G. Sukhikh, A. Melkumyan, A. Ankirskaya, D. Trofimov, V. Muravieva // Abstract # P 23rd ECCMID. - Germany, Berlin. - 2013. - P. 1925.

45. Sukhikh, G. Efficiency of application of Vancomycin in newborns in NICU / G. Sukhikh, L. Lyubasovskaya, T. Priputnevich, O. Ionov, E. Ilina // Abstract # P 28th ICC. - Yokohama, Japan. - 2013 - P. ICC 13-1351.

46. Sukhikh, G. Comparison of yeast-like fungi clinical isolates identification with classic microbiological methods and MALDI-TOF mass spectrometry. / G. Sukhikh, V. Govorun, T. Priputnevich, A. Ankirskaya, V. Muravyeva, M. Zavyalova, E. Ilina // J. Mycoses-2012.-Vol. 55 (4).-P. 83-84.

47. Lyubasovskaya, L. Nonfermenting Bacteria Colonization of Newborn Infants Hospitalized in the Department of Pathology of Neonatal Perinatal Centre / L.A. Lyubasovskaya, A.S. Ankirskaya, T.V. Priputnevich, M.G. Zavyalova, I.I. Rumina, V.V. Zubkov // Abstracts # P 13th APCCMI. - Beijing, China. - 2012. - P. 253.

48. Sukhikh, G.T. The effectiveness of MALDI-TOF mass spectrometry for screening bacteriuria compared with an automated-flow cytometry. / G.T. Sukhikh, V.M. Govorun, A.S. Ankirskaya, T.V. Priputnevich, L.A. Lyubasovskaya, M.G. Zavyalova, V.V. Muravyeva, E.N. Ilina // Abstracts # P of the 22nd ECCMID. - J.Clinical Microbiology and Infectious Diseases Special Issue. - London, United Kingdom. - 2012. - Vol. 18 (3). -P.682.

49. Ankirskaya, A. Mass-spectrometric analisis VS classic methods for identification of clinically relevant Yeast. / A. Ankirskaya, T. Priputnevich, V. Muravieva, M. Zavyalova, L. Lubasovskaya, G. Bairamova // Abstract # P 12-th IUSTI World Congress. - New Delhi, India.-2011.-P. 106.

50. Vereshagin, V. Intact-cell MALDI-TOF mass-spectrometry for identification and subtyping of pathogenic Neisseria / V. Vereshagin, E. Ilina, T. Priputnevich, N. Al.-Khafaji, A. Kubanova, S. Sidorenko, V. Govorun // Abstracts # P 15th International Pathogenic Neisseria Conference. - Australia. - 2007. - P. 77.

51. Savicheva, A. Guidelines for laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in East-European countries. Parti. Gonorrhoeae, sampling and microscopy for diagnosis / A. Savicheva, E. Sokolovsky. N. Frigo, T. Priputnevich, T. Brilene, J. Deak, R. Ballard, C. Ison, A. Hallen, M. Domeika, M. Unemo // Acta Medica Lituanica. - 2007. -Vol. 14(1).-P. 65-74.

52. Savicheva, A. Guidelines for laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in East-European countries. Part 2. Culture, non-culture methods, determination of antibiotic resistance, and quality assurance / A. Savicheva, E. Sokolovsky. N. Frigo, T. Priputnevich, T. Brilene, J. Deak, R. Ballard, C. Ison, A. Hallen, M. Domeika, M. Unemo // Acta Medica Lituanica. - 2007. - Vol. 14 (2). - P. 123-134.

Список используемых сокращений

АБП - Антибактериальные препараты

АВ - Аэробный вагинит

БВ - Бактериальный вагиноз

ВУИ - Внутриутробные инфекции

ЖКТ - Желудочно-кишечный тракт

ИВЗ — Инфекционно-воспалительные заболевания

ИМП - Инфекции мочевыводящих путей

ИСМП - Инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи

KB - Кавдидозный вагинит

КОЕ - Колониеобразующая единица

МУК - Методические указания

H - Нормоценоз

НГОБ - Неферментирующие грамотрицательные бактерии

ОРИТ - Отделение реанимации и интенсивной терапии

онмт - Очень низкая масса тела

ПЦР - Полимеразная цепная реакция

РНК - Рибонуклеиновая кислота

СГВ - Стрептококки группы В

УПМ - Условно-патогенные микроорганизмы

энмт - Экстремально низкая масса тела

АТСС - American type culture collection (Американская коллекция типовых

культур)

а-СНСА - а-циано-4-гидроксикоричная кислота

CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute (институт клинических и

лабораторных стандартов)

CCI - Composite Con-elation Index (композитный индекс корреляции)

CoNS - Coagulase-Negative staphylococci (коагулазоотрицательные

стафилококки)

ESBL (БЛРС) - Extended-spectrum beta-lactamase (бета-лактамазы расширенного

спектра)

MALDI-TOF-MS - Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass-

(МАЛДИ) Spectrometry (Матрично-активированная лазерная

десорбция/ионизация времяпролетная масс-спектрометрия)

MLST - Multilocus Sequence Typing

MRCoNS - Метициллин - резистентные CoNS

MRS - среда для выделения лактобацилл (Man, Rogosa, Sharpe)

MRSA - Метициллин - резистентные S. aureus

Real-Time PCR — Real-time Polymerase Chain Reaction (полимеразная цепная реакция в

режиме «реального времени»)

SCCmec - Staphylococcal chromosome cassette mec

Подписано в печать: 27.06.2014. Заказ № 720

Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 2,9 Тираж 150 экз.

Отпечатано в типографии «Реглет» 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т д.74 корп.1 +7 (495) 363-78-90, www.reglet.ru