Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Инновационные методы видовой идентификации лактобактерий в оценке состояния микробиоты влагалища у беременных женщин

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Инновационные методы видовой идентификации лактобактерий в оценке состояния микробиоты влагалища у беременных женщин"

005535158

На правах рукописи

МЕЛКУМЯН АЛИНА РАНТИКОВНА

ИННОВАЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛАКТОБАКТЕРИЙ В ОЦЕНКЕ СОСТОЯНИЯ МИКРОБИОТЫ ВЛАГАЛИЩА У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 ОКТ 2013

Москва - 2013

005535158

Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители: Припутиевич Татьяна Валерьевна кандидат медицинских наук Трофимов Дмитрий Юрьевич доктор биологических наук Официальные оппоненты: Меньшиков Дмитрий Дмитриевич

доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В.Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы», главный научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии Кафарская Людмила Ивановна

доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой микробиологии и вирусологии педиатрического факультета

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (г.Москва).

Защита состоится «_£/» 2013 года в Jfcfl? часов на заседании

диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова Д. 10. '

Автореферат разослан « » 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, /*'

доктор медицинских наук Борисова Ольга Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Внедрение инновационных технологий в микробиологическую диагностику расширяет наши познания в области медицинской микроэкологии. Впервые исследования микрофлоры влагалища у женщин были проведены А.Додерлейном в 1892 году. До середины XX века вагинальный микроценоз считался однородным и представленным, в основном, Lactobacillus acidophilus -«палочками Додерлейна». К девяностым годам прошлого столетия было показано, что нормальный микроценоз гениталий женщин репродуктивного возраста неоднороден и представлен как Lactobacillus spp. - 95-98%, так и большой группой условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) - Staphylococcus spp., E.coli, G.vaginalis, С.albicans с частотой выявления 10-50% (Анкирская А.С., 1999; Черкасов С.В. 1998).

У здоровых женщин доминирующими видами микробиоты влагалища являются лактобактерии, преобладающее количество которых, по мнению большинства исследователей, определяет высокий уровень противомикробной защиты (Радзинский В.Е., 2007; Кочеровец В.И., 2012).

Видовая идентификация лактобактерий долгое время была трудновыполнимой задачей из-за невозможности преодоления методических сложностей при изучении их биологических свойств. Более века морфологические свойства лактобактерий оставались единственным критерием их родовой идентификации. В 80-х годах прошлого века прогресс в технологиях позволил выполнить работы, выявившие фенотипическое разнообразие штаммов лактобактерий. Опыт применения биохимических панелей от различных производителей показывал, что данная методика трудоемка, длительна и малодостоверна (Муравьева В.В., 1997; Brolazo Е.М., 2011). Несмотря на все недостатки, морфологические и биохимические методы идентификации лактобактерий до последнего времени оставались единственными критериями при определении видовой принадлежности этих микроорганизмов.

Альтернативой классической биохимической идентификации явились методы молекулярно - генетического типирования, а в последнее время прочную нишу стала занимать масс-спектрометрия, в частности MALDI TOF MS (Матрично-Активированной Лазерной Десорбции/Ионизации времяпролетная масс-спектрометрия), основанная на регистрации белковых спектров микроорганизмов, которые уникальны для семейств, родов и видов микроорганизмов (Говорун В.М., Ильина Е.Н., 2009).

Развитие лабораторной техники, молекулярно-биологических и генетических методов исследования позволило установить высокую

гетерогенность бактерий рода Lactobacillus и их широкое видовое разнообразие, достигающее сотни видов. Молекулярно-биологические методы открывают новые возможности в развитии представлений не только о составе микроценоза влагалища в норме и при патологии, а также позволяют обоснованно определить, какие же виды лактобактерий могут быть перспективными в качестве исходного сырья для производства биопрепаратов. Степень разработанности темы

В последние два десятилетия в связи с методологическими прорывами в клинической микробиологии открылись новые возможности для более углубленного анализа микробной экологии влагалища (Ворошилина Е.С., 2010; Ferris M.J., 2007; Jakobson Т., 2007; Hernandez-Rodriguez С., 2011), многие вопросы которой остаются неизученными и являются предметом дискуссий. Задачи, связанные с разработкой и внедрением в рутинную практику микробиологических лабораторий новых эффективных подходов по идентификации, характеристике и типированию представителей микробиоты влагалища и клинически-значимых патогенов, являются актуальными и своевременными.

Лактобактерии представляют интерес как объект изучения для разработки пробиотических препаратов, продуктов функционального питания, способов коррекции микробиотических нарушений, так как, обладая многогранными биологическими свойствами, они играют важную роль в обменных и регуляторных процессах организма человека (Глушанова Н.А, 2003).

Возможность видовой идентификации лактобактерий позволит ближе подойти к пониманию механизмов развития оппортунистических вагинальных инфекций, установить корреляцию между видовым составом этих микроорганизмов и инфекционной патологией и станет новым шагом в разработке стратегий диагностики и лечения оппортунистических урогенитальных инфекций. Цель исследования

Определить видовой состав лактобактерий, представленных в отделяемом влагалища у беременных женщин с нормоценозом и оппортунистическими инфекциями, с помощью бактериологического, масс-спектрометрического и молекулярно-генетического методов исследования. Задачи исследования

1. Провести сравнительное изучение микроценоза влагалища у беременных женщин с помощью комплексного микробиологического исследования (микроскопия мазка, культуральное исследование) и молекулярно-генетического метода количественной ПЦР.

2. Сравнить результаты видового типирования лактобактерий, выделенных из

отделяемого влагалища беременных женщин, методами MALDI TOF MS и количественной ПЦР.

3. Определить частоту выявления лактобактерий при различных состояниях микробиоты влагалища у беременных женщин.

4. Выявить особенности видового состава лактобактерий у беременных женщин при вагинитах различной этиологии (бактериальный вагиноз, аэробный вагинит, кандидозный вагинит) в сравнении с нормоценозом.

5. Изучить антибиотикочувствительность различных видов лактобактерий, выделенных из отделяемого влагалища.

Научная новизна

На популяции российских беременных женщин впервые проведено комплексное микробиологическое и молекулярно-генетическое исследование микробиоты влагалища с видовой идентификацией лактобактерий. Показано наличие в составе микробиоты влагалища 18 видов лактобактерий, ведущими из которых являются L.crispatus, L. iners, L.jensenii и L.gasseri.

Получены новые данные о видовом составе лактобактерий, представленных в микробиоте влагалища беременных женщин с нормоценозом и оппортунистическими инфекциями, расширяющие представление о формировании микробиоценозов.

Определена частота встречаемости различных видов лактобактерий во влагалище беременных женщин с преобладанием вида L.crispatus (63,2±12,6%) при нормоценозе и L.iners (84,6%; ДИ 95%: 67,8-96,1) при бактериальном вагинозе. Установлено большее видовое разнообразие лактобактерий при бактериальном вагинозе в сравнении с нормоценозом.

Исследование антибиотикочувствительности клинических штаммов лактобактерий, выделенных из влагалища беременных женщин, выявило вариабельную чувствительность различных видов лактобактерий к АБП, что может вести к селективному подавлению роста или, напротив, к увеличению уровня отдельных видов в общем пуле лактобактерий в зависимости от схемы антибактериальной терапии. Теоретическая и практическая значимость

Результаты проведенной работы позволили усовершенствовать микробиологическую (культуральную и молекулярно-генетическую) диагностику инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища. Полученные новые данные о частоте встречаемости различных видов лактобактерий при вагинитах в сравнении с нормоценозом, позволяют теоретически обосновать перспективы использования определенных видов лактобактерий в качестве исходного сырья для производства пробиотических препаратов. При изучении морфо-фенотипических свойств лактобактерий, выявлена их морфологическая

мимикрия, что ограничивает возможности микроскопического метода для качественной оценки микрофлоры влагалища.

Разработанный алгоритм микробиологического обследования беременных женщин дает возможность комплексно оценить состояние микрофлоры влагалища с целью своевременной коррекции дисбиотических нарушений и/или назначения адекватной антимикробной терапии. Определена область клинического применения метода количественной ПЦР и комплексного микробиологического исследования в диагностике инфекций влагалища.

При изучении морфологии колоний и клеток, выделенных культур лактобактерий, создана цифровая библиотека слайдов с изображением колоний и микропрепаратов клеток, предназначенных для углубленного изучения биологических свойств лактобактерий и информационного обеспечения коллекционной работы. Методология и методы иследования

Работа выполнялась в период с марта 2010 года по июль 2012 года на базе лаборатории микробиологии и лаборатории молекулярно-генетических методов исследования ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России, бактериологической лаборатории и отделения патологии беременности родильного дома ГБУЗ «Городская клиническая больница № 36 ДЗ г.Москвы». Проведено комплексное микробиологическое исследование влагалищного отделяемого 155 беременных женщин во II- III триместре в возрасте от 18 до 40 лет, с использованием трех методов: микроскопического, культурального и метода количественной ПЦР.

В результате проведенной работы выделено 722 культуры лактобактерий. По результатам масс-спектрометрического типирования с ислючением повторных идентификаций получено 267 штаммов лактобактерий.

Для обработки и анализа социально - демографического статуса беременных разработана учетно - отчетная штрих-кодируемая «Индивидуальная регистрационная форма», содержащая клинико-анамнестические данные о пациентках.

Поступивший в лабораторию биоматериал и все результаты, полученные в ходе исследования, регистрировались в рабочих журналах, в «Системе микробиологического мониторинга «Микроб-2» и в специально разработанной форме «Протокол ведения микробиологического исследования». Микроскопическое исследование вагинального отделяемого

Для приготовления мазков отделяемое влагалища забирали с заднего свода влагалища стерильным ватным тампоном (.Medical Wire, Англия) и переносили на предметные стекла. Окраску по Граму и метиленовым синим осуществляли

набором реагентов по общепринятой методике в соответствии с приложенной к наборам инструкцией (ЗАО «ЭкоЛаб»).

Микроскопическое исследование проводили с учетом: состояния вагинального эпителия, лейкоцитарной реакции и состава микрофлоры.

Количественный и качественный состав микрофлоры оценивали по 4-х-бальной системе с использованием критериев Nugent R.P. (1991) в модификации Анкирской A.C., Муравьевой В.В. (2011). Для определения выраженности лейкоцитарной реакции эмпирически была разработана собственная бальная шкала в зависимости от наличия сегментоядерных лейкоцитов и лимфоцитов в поле зрения.

Культуральное исследование вагинального отделяемого с определением антибиотикочувствительности выделенных УПМ

Клинический материал для культурального исследования забирали до проведения мануального обследования - с заднего свода влагалища стерильными ватными тампонами в две пробирки с транспортной угольной средой Amies {Medical Wire, Англия). Первичный посев с полуколичественной оценкой роста микроорганизмов осуществляли на 5% кровяной агар с дефибринированной бараньей кровью (Conda, Испания; ЭкоЛаб, Россия), маннит-солевой агар (Conda, Испания), среду Эндо, энтерококкагар и агар Сабуро (ФГУН «ГИЦПМ и Б» г.Оболенск). Все посевы культивировали при температуре 36°С в течение 24-48 часов.

Для выделения лактобактерий клинический материал, взятый во вторую пробирку с транспортной средой, засевали на чашки Петри с селективными питательными средами отечественных (Лактобакагар, ФГУН «ГИЦПМиБ» г.Оболенск) и иностранных производитей (агар MRS, Conda, Испания) с последующим культивированием в условиях С02 инкубатора и анаэростате (Jouan, Франция) при температуре 36°С в течение 48 часов. На основе эмпирических исследований была проведена полуколичественная оценка микробного роста. Идентификацию выделенных УПМ и определение чувствительности по уровню МПК к антибактериальным препаратам выполнено на полуавтоматическом бактериологическом анализаторе AutoScan-4 (Siemens, США).

Контроль качества проводили с применением контрольных штаммов Microtrol (Becton Dickinson, США) - P.aeruginosa (АТСС 27853), E.coli (АТСС 25922), S.aureus, (АТСС 25923), E.faecalis (АТСС 29212). Биохимическая идентификация культивированных лактобактерий

Видовую принадлежность штаммов лактобактерий определяли биохимическим методом с помощью панелей быстрой идентификации анаэробных бактерий (Rapid Anaerobe ID) на анализаторе AutoScan-4 (Siemens,

США) и карт для идентификации анаэробных бактерий Vitek2 ANC на анализаторе Vitek2Compact (BioMerieux, Франция).

Для проведения контроля качества использовались контрольные штаммы Microtrol (Becton Dickinson, США) Clostridium perfringens (АТСС 13124). Масс-спектрометрическое типирование вагинальных лактобактерий и других труднодиагностируемых микроорганизмов

Видовую идентификацию Streptococcus spp., Corynebacterium spp., Actinomyces spp., и др., в том числе и 722 культур лактобактерий, осуществляли методом масс-спектрометрического анализа с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI TOF MS AutoFlex III с программным обеспечением Maldi BioTyper 3,0 (Bruker Daltonics, Германия).

Программное обеспечение Maldi BioTyper 3,0 проводит идентификацию микроорганизмов и расчет коэффициента достоверности (Score). Уровень достоверности идентификации выше 2,0 свидетельствует о точной видовой идентификации, уровень достоверности от 1,7 до 2,0 - о точной идентификации до рода. Для каждого результата идентификации приводится ссылка на NCBI (National Center for Biotechnology Information).

Молекулярно-генетическое исследование микроценоза влагалища методом количественной ПЦР

Исследование биоценоза влагалища проводили, используя тест-систему «Фемофлор-16» (ООО «НПО ДНК-Технология») в детектирующем амплификаторе ДТ-96, согласно инструкции производителя (ООО «НПО ДНК-Технология»),

Молекулярно-генетическое типирование лактобактерий

Для оценки видового состава лактобактерий провели определение общего количества Lactobacillus spp. и генотипирование шести видов лактобактерий (L.crispatus, L.iners, L.jensenii, L.gasseri, L.johnsonii, L.vaginalis) в исходном материале методом количественной ПЦР (ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени) с использованием тест-системы для научного применения (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва). Методы оценки состояния микроценоза влагалища

Оценку состояния микроценоза влагалища проводили в соответствии с медицинской технологией «Интегральная оценка состояния микробиоты влагалища. Диагностика оппортунистических вагинитов» (Анкирская А.С., Муравьева В.В., 2011) и методом «Способ диагностики дисбаланса микробиты человека и степени его выраженности» (Липова Е.В. с соавторами, 2009).

Комплексная микробиологическая оценка состояния микроценоза влагалища включала интегральную оценку результатов микроскопии (состояние вагинального эпителия, лейкоцитарная реакция, разнообразие морфотипов) и

культуралыюй диагностики с видовой идентификацией и количественной оценкой роста микроорганизмов. По результатам этой диагностики женщины (т?=155) разделены на 7 групп в зависимости от «микробиологического диагноза»: нормоценоз (Н), бактериальный вагиноз (БВ), аэробный (неспецифический) вагинит (AB), кандидозный вагинит (KB), бессимптомное носительство грибов (БНГ), мезоценоз (М) и цитолитический вагиноз (ЦВ).

В основу «Способа диагностики дисбаланса микробиоты человека и степени его выраженности» положена комплексная количественная оценка биоты «некультивационным» методом (ПЦР в режиме реального времени) с проведением сравнительного анализа количества конкретных представителей нормо - и условно-патогенной биоты с общим количеством микроорганизмов для выявления дисбаланса биоты и степени её выраженности. Классификация состояния микробиоты методом количественной ПЦР включает: нормоценоз, дисбаланс I (умеренный), дисбаланс II (выраженный). Дисбаланс в зависимости от этиологической структуры может быть анаэробный, аэробный, смешанный.

На основании комплексной количественной оценки биоты методом количественной ПЦР беременные общей группы (и=155) были разделены на 7 групп: нормоценоз, умеренный (аэробный, анаэробный, смешанный) дисбаланс, выраженный (аэробный, анаэробный, смешанный) дисбаланс. Определение чувствительности лактобактерий к АБП

Определение чувствительности лактобактерий к антибиотикам проводили диско-диффузионным методом в соответствие с МУ 2.3.2.2789-10.2.3.2. «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов». Исследовали чувствительность к 12 АБП: ампициллин, гентамицин, цефазолин, цефотаксим, эритромицин, клиндамицин, левофлоксацин, ципрофлоксацин, тетрациклин, триметоприм/сульфаметоксазол, метронидазол, с использованием коммерческих дисков с антибиотиками (BioRad, Франция).

Всего изучено 123 штамма лактобактерий, из них L.crispatus - 21 штамм, L.iners - 68 штаммов, L.jensenii - 16 и L.gasseri - 18 штаммов. Статистическая обработка полученных данных выполнялась в программе Microsoft Excel, в программе микробиологического мониторинга «Микроб-2» и включала построение гистограмм для визуальной оценки характера распределения, оценки точности и надежности относительных величин частоты и оценки значимости различия относительных величин частоты в независимых выборках по t- критерию Стъюдепта.

Клинический материал предоставлен врачом отделения патологии беременности родильного дома ГБУЗ «ГКБ №36 ДЗ г.Москвы» Ягодкиной М.А.,

молекулярно-генетические исследования проведены сотрудниками лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И.Кулакова» Минздрава России (зав.лабораторией - Трофимов Д.Ю.). Основные положения, выносимые на защиту:

1. При сравнительной оценке микроценоза влагалища беременных женщин с помощью комплексного микробиологического исследования и метода количественной ПЦР значимых различий в оценке состояния микроценоза не выявлено (р >0,05).

2. Ведущими видами лактобактерий в общей группе беременных были L.crispatus, L.iners, L.jensenii, L.gasseri. Метод MALDI TOF MS позволил провести видовую идентификацию лактобактерий, выделенных из отделяемого влагалища беременных женщин. Методом количественной ПЦР выявлен вид L.iners, некультивируемый на селективных питательных средах для лактобактерий.

3. Лактобактерии обнаружены во влагалище у всех обследованных беременных женщин: L.crispatus - ведущий вид при нормоценозе, L.iners в высоком титре обнаружен у большинства беременных женщин с бактериальным вагинозом. В группах женщин с кандидозным и аэробным вагинитами значимой разницы в видовом составе лактобактерий не обнаружено.

Степень достоверности и апробация результатов

При обследовании 155 беременных женщин использован комплекс инновационных общеклинических и специальных методов исследования: комплексное микробиологическое исследование микроценоза влагалища, биохимическая идентификация культивированных лактобактерий, с использованием современных бактериологических анализаторов, масс-спектрометрическое типирование вагинальных лактобактерий и других труднодиагностируемых микроорганизмов, с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI TOF MS AutoFlex III с программным обеспечением Maldi BioTyper 3,0 (Bruker Daltonics, Германия), молекулярно-генетическое исследование микроценоза влагалища с видовым типированием лактобактерий методом количественной ПЦР. Достаточный объем выборки анализируемых групп, и адекватная статистическая обработка результатов свидетельствует о достоверности полученных результатов. Научные положения документированы таблицами, рисунками, диаграммами.

На основании результатов проведенной работы разработан алгоритм микробиологического обследования беременных женщин, который используется в практической работе клинических отделений и отдела микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И.Кулакова»

Минздрава России и внедрен в практическую работу бактериологической лаборатории и отделения патологии беременности родильного дома ФГБУ «Городской клинической больницы № 36 ДЗ г.Москвы».

Материалы диссертации используются в учебном процессе при подготовке лекционного материала на курсах повышения квалификации врачей, обучении клинических ординаторов и аспирантов и на семинарах, проводимых в ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И.Кулакова» Минздрава России.

Диссертация апробирована на заседании апробационной комиссии ФГБУ «Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, протокол №7 от 24 июня 2013 г.

Результаты работы представлены, доложены и обсуждены на российских и международных конференциях и конгрессах: VI Международном конгрессе по репродуктивной медицине, Москва, 17-20 января 2012 г.; Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика

- в эпицентре женского здоровья», Москва, 20-23 марта 2012г.; XIV Международном конгрессе по антимикробной терапии MAKMAX/ESCMID, Москва, 23-25мая 2012г.; XIII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя», Москва, 25-28 сентября 2012г.; VII Международном конгрессе по репродуктивной медицине, Москва, 21-24 января 2013г.; 23rd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Berlin, Germany, 27-30 April 2013; XV Международном конгрессе по антимикробной терапии MAKMAX/ESCMID, Москва, 22-24 мая 2013г.

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи

- в рецензируемых изданиях, 7 - в материалах конференций.

Диссертация изложена на 159 страницах компьютерного набора и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, перспективы дальнейшей разработки темы. Работа иллюстрирована 26 рисунками, 12 таблицами и 19 фотографиями. Список литературы содержит 225 источников, из них 62 отечественных и 163 зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Комплексная лабораторная оценка микроценоза влагалища у обследованных беременных На основании комплексной оценки результатов микроскопии и культуральной диагностики в общей группе беременных («=155) состояние микроценоза оценено как Н у 57 (36,8%) женщин, а у 98 (63,2%) диагностированы различные варианты вагинальных инфекций. KB выявлен у 34 (21,9%) пациенток, АВ, ассоциированный с факультативно-анаэробными УПМ - у 22 (14,2%), БВ - у

26 беременных (16,8%), промежуточный вариант микроценоза (мезоценоз) - у 3 (1,9%), БНГ - у 7 (4,5%) и ЦВ - у 6 (3,9%) беременных (рис.1).

и Нормоценоз

■ Бактериальный вагиноз

■ Кандидозный вагинит

■ Аэробный вагинит

и Бессимптомное носительство грибов

■ Мезоценоз

■ Цитолитический вагиноз

Рисунок 1. Комплексная оценка микроценоза влагалища беременных женщин (/7=155). Микроскопия и культуральная диагностика.

В исследовании детально изучены микробиотические состояния оцененные как Н, БВ, КВ и АВ. Вследствие непрезентативности выборки пациентки с М, БНГ и ЦВ исключены из дальнейшего анализа.

При обследовании беременных (п= 155), с использованием метода количественной ПЦР, у 55 (35,5%) женщин состояние микробиоты оценено как Н, у 100 (64,5%) - диагностированы различные варианты дисбиотических состояний (рис.2).

Выражений

Я11(6Ш1Ш(

4-25(16.2«»)

Анаэробный

п-15(9."«о)

Смешанный

И-1в(6,5«в)

Умеренный дисбаланс Ю-75(48.3«»о)

Смешанный

11-36 <23.1°о)

11-15(9,7»»)

Аэробный II = 1©(6,5°о)

иггяр1йяш1крр. -418: 11 = 14(9.0«»)

Рисунок 2. Оценка микроценоза влагалища у обследованных беременных женщин по результатам количественной ПЦР.

Умеренный дисбаланс (дисбаланс I степени) выявлен у 75 (48,3%) беременных. В зависимости от этиологической структуры возбудителей у этой группы диагностированы: у 10 женщин (6,5%) - аэробный дисбаланс, у 36 (23,1%) - смешанный, у 14 (9,0%) дисбаланс, обусловленный Ureaplasma spp. в титре >4 lg ГЭ/образец и у 15 (9,7%) - вызванный Candida spp. в титре >3 lg ГЭ/образец. Выраженный анаэробный дисбаланс (дисбаланс II степени) диагностирован у 15 (9,7%) беременных и у 10 (6,5%) - выраженный смешанный дисбаланс (дисбаланс II степени).

При оценке микроценоза влагалища беременных женщин с помощью комплексного микробиологического исследования и метода количественной ПЦР значимых различий не выявлено (р>0,05). Нормоценоз диагностирован в 36,8±7,7% и 35,5±7,7% случаев, вагиноз в 16,8% (ДИ 95%: 11,2-22,9) и 16,2% (ДИ 95%: 10,9-22,9) случаев и вагиниты, ассоциированные с УПМ бактериальной и грибковой этиологии в 36,1±7,7% и 39,3±7,8% случаев, соответственно.

На основании проведенных исследований предложен алгоритм микробиологического обследования беременных женщин, позволяющий исключить дублирование анализов в лабораториях различного уровня и применять метод количественной ПЦР и культуральное исследование в диагностике инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища в зависимости от степени выраженности воспалительного процесса (рис.3).

Рисунок 3. Алгоритм микробиологического обследования беременных женщин (после исключения ИППП).

Видовое типирование лактобактерий методами MALDITOFMS и количественной ПЦР Идентификация лактобактерий методом времяпролетной масс-спектром етрии

При культуральном исследовании отделяемого влагалища у наблюдаемых беременных женщин выделено 722 культуры лактобактерий. Учитывая фенотипическое разнообразие колоний лактобактерий в зависимости от условий культивирования, а также способность лактобактерий к диссоциации и синергизму, все, фенотипически различающиеся колонии с кровяного агара и АЖ^-агара (при росте в С02 - инкубаторе и в анаэростате) отбирали для дальнейшего исследования. Видовая идентификация полученных 722 культур была проведена методом MALDI TOF MS.

С высокой степенью достоверности (score > 2,0) идентифицировано 545 (75,5%) культур, средней (score 1,7 -2,0) - 117 (16,2%) и низкой (score <1,7) - 33 (4,6%) культуры. Была отмечена зависимость коэффициента достоверности от состава питательной среды и условий культивирования. При культивировании на агаре MRS в облигатно-анаэробных условиях коэффициент достоверности идентификации был наиболее высоким (92,8%), в то время как видовая идентификация лактобактерий, выросших на кровяном агаре в микроаэрофильных условиях, лишь в 24,4% случаев оказалась с высоким score.

По результатам масс-спектрометрического типирования 722 культур с вычетом повторных идентификаций проанализировано 267 штаммов лактобактерий, среди которых лидирующее положение занимали 3 вида: L.crispatus (37,5%), L.jensenii (23,6%) и L.gasseri (18,1%). Долевое участие остальных видов (L.fermentum, L.salivarius, L.plantarum, L.mucosae, L.delbrueckii, L.oris, L.rhamnosus, L.ultunensis, L.casei, L.paracasei, L.zeae, L.reuteri) в общем пуле лактобактерий колебалась от 0,4 до 5,9%.

Сравнительный анализ результатов видового типирования лактобактерий методом MALDI TOF MS и количественной ПЦР

Методом количественной ПЦР в отделяемом влагалища проведена индикация 368 штаммов лактобактерий 6 видов: L.iners (27,4%), L.crispatus (24,7%), L.vaginalis (16,6%), L.jensenii (15,2%), L.gasseri (12,2%), L.johnsonii (3,8%).

Результаты видового типирования лактобактерий двумя методами не могли быть полноценно сравнимы, так как для ПЦР типирования мы использовали праймеры только 6 видов лактобактерий, которые считались наиболее распространенными видами в составе микробиоты влагалища. Тем не менее, основное несовпадение в результатах состояло в том, что только использование ПЦР-диагностики позволило установить наличие и значительное место в

микробиоте влагалища вида Ь.тегз среди видового разнообразия лактобактерий влагалища (таблица 1). При этом культуральный метод позволил показать, что видовое разнообразие пула лактобактерий не ограничивается четырьмя часто встречающимися видами.

Таблица 1. Различия в обнаружении видов лактобактерий методом количественной ПЦР и культуральным методом.

Вид лактобактерий Количественная ПЦР л=368 Посев я=267 Посев / Количественная ПЦР %

L.iners 101 0 0

L.crispatus 91 89 97,8

L.jensenii 56 56 100

L.gasseri 45 41 91,1

С целью выявления L.iners и изучения условий его культивирования в рамках данного исследования проведено (параллельно с утвержденным дизайном) пилотное исследование с включением расширенного набора питательных и селективных сред для стимуляции роста лактобактерий. Исследование подтвердило, что L.iners является некультивируемым микроорганизмом на стандартных селективных для лактобактерий питательных средах. Культивирование лактобактерий с последующей MS идентификацией показали, что ростовые потребности L.iners включают дефибринированную баранью кровь и зависят от рН среды культивирования.

На сегодняшний день в мировой литературе имеются публикации по изучению L.iners. Иследование генома L.iners зарубежными исследователями показало, что он обладает наименьшим из геномов зарегистрированных лактобактерий. В геноме L.iners выявлены 26 чужеродных генов и до 80% аминокислот нехарактерных для рода Lactobacillus (Maidak B.L. et al., 2001; Macklaim J.M. et al., 2011). В ряде работ изучены возможности культивирования L.iners на кровяном агаре, но данные, полученные при сравнении с генно-молекулярными методами, показывают низкую высеваемость (47,6%) этих лактобактерий (Tamrakar R. et al., 2007).

Учитывая оба метода видовой идентификации, в нашем иследовании установлено, что у 36,1% беременных биота содержала один вид лактобактерий, у 63,9% были ассоциации лактобактерий (28,4% - двух видов, 20,6% - трех и 14,9%- четырех и более). У 27,0% беременных встречались ассоциации L.crispatus/L.iners, у 26,5% - L.iners/L.jensenii и у 21,4% L.crispatus/L.jensenii. В ассоциациях трех видов лактобактерий превалировали сочетания L.crispatus/L.iners/L.jensenii (14,3%).

Среди 267 штаммов лактобактерий, выделенных нами у 155 беременных женщин как с нормоценозом влагалища, так и при других состояниях микробиты, ни разу не был идентифицирован вид L. acidophilus, что опровергает представление о его ведущей роли среди молочно-кислых бактерий вагинальной микробиоты.

Полученные данные согласуются с результатами других исследователей, проводивших идентификацию вагинальных лактобактерий с использованием биохимических панелей и метода мультиплексной ПЦР. Исследования подтвердили ненадежность идентификации с учетом фенотипических свойств лактобактерий. Показано, что L.acidophilus при биохимической идентификации представляет собой комплекс различных видов лактобактерий, отличных по генотипическим характеристикам (Du Plessis Е.М. & Dicks, 1995; Brolazo Е. М. et al., 2011).

При анализе результатов посевов отделяемого влагалища беременных женщин была определена вероятность ассоциативных связей различных видов лактобактерий с УПМ, возбудителями оппортунистических инфекций влагалища. Достоверные данные по видовой сопряженности лактобактерий с теми или иными видами УПМ не были получены. Хотя прослеживается достоверная связь между высеваемостью часто встречающихся видов лактобактерий с коагулазонегативными стафилококками (р<0,001), гемолитическими стрептококами (р<0,001) и грибами рода Candida (р<0,001) в сравнении с другими УПМ (рис.4).

Рисунок 4. Ассоциации ведущих видов лактобактерий с УПМ.

Биохимическая идентификация лактобактерий на автоматических бактериологических анализаторах

При идентификации 100 штаммов лактобактерий на анализаторе AutoScan - 4 в 76% случаев был получен отрицательный результат, в 22% случаев лактобактерии с высокой вероятностью (99,99%) были отнесены к видам Eubacterium lentum (20%) и Eubacterium limosum (2%) и лишь в 4 случаях с высокой вероятностью (99,75-99,99%) определена родовая принадлежность.

В результате тестирования 30 штаммов лактобактерий на анализаторе Vitek2Compact были получены «недопустимые» результаты идентификации: в 30% случаев идентификация была отрицательной, а в 60% случаях лактобактерии с высокой вероятностью (96-98%) были отнесены к роду Clostridium spp. Из них 12 штаммов (40%) к виду Clostridium bifermentas и 6 к другим видам клостридий (C.hystoliticum, C.baratii, C.difficile). По 1 из изолятов лактобактерий (3,3%) были отнесены с высокой вероятностью (85-95%) к Bifidobacterium spp., Actinomyces naeslundii, Corynebacterium jeikeium.

Морфологическая характеристика лактобактерий, выделенных из отделяемого влагалища беременных женщин

В ходе исследования выполнена микроскопия 180 чистых культур лактобактерий. Проведенное исследование показало широкое морфологическое разнообразие штаммов лактобактерий одного и того же вида, в зависимости от условий культивирования (питательная среда, степень аэрации), а также от возраста культуры.

Многие виды лактобактерий оказались сходными по морфологии с условно-патогенными факультативно-анаэробными и облигатно-анаэробными микроорганизмами. Например, L.jensenii, занимающая по нашим результатам 3 место по распространенности среди лактобактерий, представленных в микробиоте влагалища, имели сходную морфологию с коринебактериями. Среди L.iners выделены штаммы как с типичным морфотипом лактобактерий, так и сходные с микроорганизмами, которые чаще присутствуют в отделяемом влагалища женщин с БВ, а именно с гарднереллами, бактероидами, то есть с микроорганизмами, которые принято считать «морфотипом гарднерелл». Антибиотикочувствительность различных видов лактобактерий

Изучена чувствительность к АБП 4-х ведущих видов лактобактерий: L.iners, L.crispatus, L.jensenii, L.gasseri. Все штаммы оказались чувствительными к ампициллину, цефазолину, цефотаксиму, ванкомицину и нечувствительными к метронидазолу, триметоприм/сульфаметоксазолу и левофлоксацину. К ряду АБП различные виды лактобактерий демонстрировали вариабельную чувствительность. Учитывая данное обстоятельство, можно полагать, что терапия метронидазолом, левофлоксацином и триметоприм/сульфаметоксазолом не

оказывает влияния на уровень присутствия видов лактобактерий часто встречающихся в составе микробиоты влагалища. В то время как лечение препаратами из группы пенициллинов, цефалоспоринов и гликопептидов может привести к уменьшению пула лактобактерий во влагалище. Вариабельная чувствительность, возможно, может влиять на уровень отдельных видов лактобактерий в зависимости от схемы антибактериальной терапии. Например, терапия клиндамицином может вести к селективному увеличению Ьлпеп и Ь^а.ыеп, подавлению роста, а может быть и к полной элиминации Ь.спьраЫз из микробиоты влагалища (рис.5).

Рисунок 5. Частота выделения устойчивых к АБП видов лактобактерий, преобладающих в составе микроценоза влагалища.

Особенности видового и количественного состава лактобактерий при различных состояниях микробиоты влагалища у беременных женщин с учётом М8-идентификации и ПЦР-типирования

При оценке частоты выявления лактобактерий различными методами с учётом состояния микробиоты влагалища отмечено, практически полное совпадение результатов по всем нозологическим группам, за исключением БВ. По данным ПЦР-диагностики при БВ в 100% случаев выявлены лактобактерии в высоком титре (>7 ^ ГЭ/мл), хотя ведущими микроорганизмами в составе микробиоты были строгие анаэробы. При культуральной диагностике лактобактерии выявлены у 76,9% беременных с БВ, всегда в невысоком титре, в том числе в 19,2% случаев в умеренном титре (4-5 КОЕ/мл), в 57,7% - отмечены низкие титры лактофлоры (<4 ^ КОЕ/мл). У 23,1% пациенток с БВ лактобактерии не обнаружены культуральным методом.

При нормоценозе преобладал вид Ь.спэраШз (63,2% М5; 61,4% ПЦР-типирование), а состав лактобактерий представлен 11 видами. У пациенток с КВ

ведущими видами были L.jensenii (32,3%), L.iners (31,6%), L.crispatus (26,4%), спектр лактобактерий в данной группе состоял из 7 видов. Среди женщин с AB также превалировали виды L.crispatus (36,4%), L.iners (27,3%), L.gasseri {22,1%), а «лактобациллярный пейзаж» включал 10 видов.

Наиболее широкое видовое разнообразие лактобактерий выявлено при БВ, которое включало 18 различных видов: L.iners, L.crispatus, L.gasseri, L.jensenii L.fermentum, L.salivarius, L.mucosae, L.oris, L.ultunensis, L.delbrueckii, L.plantarum, L.rhamnosus, L.casei, L.paracasei, L.zeae, L.reuteri, L. vaginalis, L.johnsonii (рис.6).

Беременные II-III триместр N=155

Вагинальная инфекция 63,2%

L.crispalus-63,1% L.jensenii -33,4%

Liners -28,1 Lgasseri- 17,5%

Ljensenii -32,3 % Liners -31,6% Lcrispatus-16,4% Lgasseri =17,6%

Liners -84,6% Lcrispatus-12,9% L.jensenii -12,9% L.gasseri -12,9%

L.crispatus-3f,,Wa L.iners -27,3 % L.gasseri -22,7% Ljensenii -9,1%

ЦВ

3,9%

M 1,9%

Рисунок 6. Видовой состав лактобактерий при различных состояниях микроценозах влагалища.

Исследования, проведенные в этой области, показывают широкое варьирование результатов видового спектра влагалищных лактобактерий в зависимости от конкретных этнических групп обследованных женщин. Возможно, это связано с генетическими факторами, а также бытовыми условиями жизни (Brown С. J. et al., 2007; Kiss Н. et al., 2007; Verstraelen H. et al., 2009; Hernandez-Rodriguez С. et al., 2011; Lehrer R.I. et al, 2011; Ravel J. et al., 2011; SpearG.T. et al., 2011).

Анализ видового спектра лактобактерий с учетом только высоких титров (рис.7) показал, что L.crispatus обнаружены обоими методами более чем у 63,2±12,6% женщин с Н. Разница в частоте встречаемости L.jensenii и L.gasseri не была статистически достоверной, хотя можно отметить, что L.jensenii чаще других выделены при KB, a L.gasseri при AB. По данным ПЦР - диагностики вид L.iners при БВ присутствовал у 84,6% (ДИ 95%:67,8-96,1) пациенток.

!.. ¡пег\ Ь.]еп$епи Ь^аэвеп I ассоциации

Рисунок 7. Частота выявления лактобактерий, с учетом титра > 7 ^ КОЕ/мл в посеве и >80% ОБМ при количественной ПЦР.

Изучение биологических свойств ЬЛпегз показало, что этот вид требователен к составу питательной среды, фенотипически отличен от других видов лактобактерий и очень изменчив по морфологическим (морфотип лактобактерий, гарднерелл, строгих анаэробов) и тинкториальным (грамвариабельность) свойствам. Таким образом, получены новые данные о морфологической мимикрии и культуральной уникальности этого вида лактобактерий, а также отмечена его высокая встречаемость именно у пациенток с БВ, что ранее естественно не учитывалось при изучении этиологии и патогенеза БВ. Поэтому можно полагать, что существующая концепция патогенеза бактериального вагиноза оказывается недостаточно аргументированной. Нуждается, в частности, в пересмотре положение о том, что БВ формируется на фоне резкого снижения или отсутствия лактофлоры. Возможно также, что именно наличие Х.шега может стать индикатором предрасположенности к бактериальному вагинозу, и женщины, у которых этот вид лактобактерий встречается в высоких титрах, входят в группу риска по развитию или рецидивам БВ. Для доказательства или опровержения этой гипотезы требуется проведение дополнительных исследований непосредственно в группах женщин с БВ в течение длительного периода времени.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выводы

1. Значимых различий при оценке микроценоза влагалища беременных женщин с помощью комплексного микробиологического исследования и метода количественной ПЦР не выявлено (р>0,05). Нормоценоз влагалища диагностирован в 36,8% и 35,5% случаев, вагиноз в 16,8% и 16,2% случаев и вагиниты, ассоциированные с УПМ бактериальной и грибковой этиологии, в 36,1% и 39,3% случаев, соответственно.

2. Видовой спектр лактобактерий, выделенных из влагалища беременных женщин, отличается широким разнообразием и представлен 18 видами: Ь.спзраШя, Ь. тег5, Ь.}е№епи, Ь. ча^таИъ, Ь./егтепШт, Ь.заНуагтз, Ь.тисояае, Ь.ойя, Ь.и1шпет1з, Ь.с1е1ЬгиескИ, Ь.р1ап1агит, Ь.гЪатпозт, Ь.саяеи Ь.рагасаяег, Ь.геае, Ь.геШеп, Ь.)оЪтопп. Установлено, что ведущими видами лактобактерий, выделенных из отделяемого влагалища беременных российских женщин, являются Ь.сг\8ра1т, Ь.тегэ, Ь.]'етепИ, Ь^аэвеп.

3. У беременных женщин с нормоценозом преобладающим во влагалище видом лактобактерий является Ь.спяраШз (63,2±12,6%).

4. У подавляющего большинства беременных женщин с бактериальным вагинозом (84,6%; ДИ 95%: 67,8-96,1) методом количественной ПЦР в высоком титре выявлен Ьлпеп, некультивируемый на селективных для лактобактерий питательных средах, что определяет необходимость дальнейшего изучения морфо-фенотипических признаков, геномной конфигурации данного микроорганизма и определения его роли в развитии БВ.

5. В группах женщин с кандидозным и аэробным вагинитом преобладания определенных видов лактобактерий не выявлено.

6. Выделенные из влагалища лактобактерии чувствительны к ампициллину, цефазолину, цефотаксиму, ванкомицину и нечувствительны к метронидазолу, триметоприму/сульфаметоксазолу и левофлоксацину. Чувствительность изолятов лактобактерий к другим исследованным АБП (макролиды, фторхинолоны, линкозамиды) варьировала в зависимости от вида. Большинство штаммов, устойчивых к АБП, относились к видам Ь.тегз и Ь^аяхеп.

Практические рекомендации

1. Метод МАЬИ1 ТОР МБ рекомендуется для применения в практике микробиологических лабораторий для видовой идентификации культивируемых лактобактерий. Культивирование лактобактерий рекомендуется проводить в облигатно-анаэробных условиях, что позволяет идентифицировать культуры с высоким коэффициентом достоверности.

2. Молекулярно-генетическая диагностика оппортунистических инфекций влагалища должна включать индикацию в отделяемом влагалища Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, как наиболее частых возбудителей АВ.

3. При назначении антибактериальной терапии необходимо применять схемы лечения, которые не приводят к подавлению роста лактобактерий влагалища. Антибактериальная терапия вагинитов метронидазолом и фторхинолонами предпочтительнее, чем терапия цефалоспоринами, пенициллинами, линкозаминами и тетрациклинами.

4. При разработке биопрепаратов с лактобактериями для лечения урогенитальных инфекций следует учитывать преобладание вида L.crispatus при нормоценозе влагалища.

5. Разработанный алгоритм лабораторного обследования беременных женщин рекомендует назначение молекулярно-генетического или культурального исследования по результатам микроскопии вагинальных мазков в зависимости от степени выраженности воспалительной реакции.

Перспективы дальнейшей разработки темы

1. Для уточнения роли L.iners в составе микробиоты влагалища в норме и патологии необходимы исследования по разработке селективных питательных сред для этого вида лактобактерий.

2. С точки зрения необходимости повышения клинической эффективности пробиотических препаратов и, учитывая доминирование вида L.crispatus во влагалище здоровых женщин, могут быть перспективными исследования по разработке биопрепаратов из штаммов лактобактерий этого вида.

3. Для доказательства или опровержения гипотезы о роли вида L.iners в патогенезе бактериального вагиноза, необходим анализ динамики титров L.iners, как в ходе лечения эпизода БВ, так и достаточно длительного периода времени после него, с учётом возможных рецидивов. Референс группой должны быть женщины с БВ, в микробиоте влагалища которых присутствуют поп - L.iners виды лактобактерий.

4. У женщин различных регионов России необходимо продолжить изучение видового разнообразия влагалищных лактобактерий с использованием молекулярных методов исследования (секвенирование, масс-спектрометрия)

5. Для определения роли пула лактобактерий кишечника, как возможного резервуара для колонизации вагинальной биоты, интересны параллельные исследования видового состава лактобактерий вагинальных и ректальных образцов с использованием современных методов типирования (секвенирование, масс-спектрометрия).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Анкирская, A.C. Видовой состав лактобацилл, выделенных из отделяемого влагалища беременных женщин при различных состояниях вагинального микроценоза / А.С Анкирская., Т.В. Припутневич, А.Р. Мелкумян, В.В. Муравьева, М.Г. Завьялова, JI.A. Любасовская, М.К. Меджидова // Материалы VI Международного конгресса по репродуктивной медицине. Проблемы репродукции - Москва, 2012. - С.27.

2. Припутневич, Т.В. Сравнение видового состава вагинальных лактобацилл беременных и небеременных женщин репродуктивного возраста. / Т.В. Припутневич, A.C. Анкирская, А.Р. Мелкумян, В.В. Муравьева, Л.А. Любасовская, М.К. Меджидова, М.Г. Завьялова // Сборник тезисов Всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика - в эпицентре женского здоровья» - Москва, 2012.-С.100- 101.

3. Припутневич, Т.В. Видовой состав влагалищных лактобактерий, выделенных у беременных женщин. / Т.В. Припутневич, A.C. Анкирская, Д.Ю. Трофимов, А.Р. Мелкумян, В.В. Муравьева, С.М. Муллабаева, М.Г. Завьялова // Тезисы XIV Международного конгресса МАКМАХ по антимикробной терапии. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия - Москва, 2012. - Том 14, №2 (1). - С.43.

4. Припутневич, Т.В. Использование современных лабораторных технологий в видовой идентификации лактобактерий при оценке состояния микробиоты влагалища у женщин репродуктивного возраста / Т.В. Припутневич, А.Р. Мелкумян, A.C. Анкирская, Д.Ю. Трофимов, В.В. Муравьева, М.Г. Завьялова // Акушерство и гинекология. - 2013. - №1. - С.76 - 80.

5. Припутневич, Т.В. Анализ внедрения масс-спектрометрии в микробиологическую практику центра акушерства, гинекологии и перинатологии / Т.В. Припутневич, А.Р. Мелкумян, В.В. Муравьева, М.Г. Завьялова, С.А. Зайцева // Материалы VII Международного конгресса по репродуктивной медицине - Москва, 2013. - С.75 - 77.

6. Мелкумян, А.Р. Видовая идентификация лактобактерий при оценке состояния микробиоты влагалища у женщин репродуктивного возраста / А.Р. Мелкумян, Т.В. Припутневич, A.C. Анкирская, Д.Ю. Трофимов, В.В. Муравьева, С.М. Муллабаева, М.Г. Завьялова // Материалы VII Международного конгресса по репродуктивной медицине — Москва, 2013. — С.70 - 71.

7. Мелкумян, А.Р. Видовой состав лактобактерий при различном состоянии микробиоты влагалища у беременных / А.Р. Мелкумян, Т.В. Припутневич, А.С. Анкирская, Д.Ю. Трофимов, В.В. Муравьева, С.М. Муллабаева, М.Г. Завьялова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2013. - Том 15, №1. - С.72 - 79.

8. Мелкумян, А.Р. Сравнительное изучение микроценоза влагалища у беременных женщин / А.Р. Мелкумян, Т.В. Припутневич, О.Е. Орлова, А.С. Анкирская, В.В. Муравьева // Тезисы XV Международного конгресса МАКМАХ по антимикробной терапии. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия — Москва, 2013. - Том 15, №2 (1). — С.30.

9. Мелкумян, А.Р. Влагалищные лактобактерии - современные подходы к видовой идентификации и изучению их роли в микробном сообществе / А.Р. Мелкумян, Т.В. Припутневич // Акушерство и гинекология. - 2013. - № 7. - С.18 - 23.

10.Priputnevich, Т. Usage of modern technologies in laboratory in lactobacilli species identification in assessment of vaginal microbiota in women of reproductive age / T. Priputnevich, G. Sukhikh, A. Melkumyan, A. Ankirskaya, D. Trofimov, V. Muravieva // Programme and Abstract 23rd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID) - Germany, Berlin, - 27-30 April 2013. - Abstract # P 1925.

Список сокращений

АБП - Антибактериальные препараты

АВ - Аэробный вагинит

БВ - Бактериальный вагиноз

БНГ - Бессимптомное носительство грибов

ГЭ - Геном эквивалент

ДЦМ- Диско-диффузионный метод

ДИ 95% - 95% доверительный интервал

KB - Кандидозный вагинит

КОЕ - Колониеобразующая единица

М - Мезоценоз

МПК - Минимальная подавляющая концентрация Н - Нормоценоз

ПЦР - Полимеразная цепная реакция УПМ - Условно-патогенные микроорганизмы ЦВ - Цитолитический вагиноз

MALDI (МАЛДИ) - Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization

Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация TOF MS - Time Of Flight Mass-Spectrometry, Времяпролетная масс-спектрометрия

Отпечатано в издательско-полиграфической фирме ЗАО «Лика» Россия, Москва, 105203, ул. Нижняя Первомайская, д. 47 Тел.:(495)465-1154; Факс:(495)465-4769 www.licka.ru; e-mail: likal28@yandex.ru Заказ № 551 Подписано в печать 02.10.2013 Усл. п.л. 1.56 Формат (60x84) 1/16. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Мелкумян, Алина Рантиковна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ И ПЕРИНАТОЛОГИИ ИМ. АКАДЕМИКА В.И. КУЛАКОВА» МИНЗДРАВА РОССИИ

На правах рукописи

МЕЖУМЯН АЛИНА РАНТИКОВНА

ИННОВАЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛАКТОБАКТЕРИЙ В ОЦЕНКЕ СОСТОЯНИЯ МИКРОБИОТЫ ВЛАГАЛИЩА У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН

03.02.03 - Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

кандидат медицинских наук Т.В. Припутневич доктор биологических наук Д.Ю. Трофимов

04201 36421 2

МОСКВА-2013

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................4

Актуальность темы исследования..........................................................................4

Методология и методы иследования......................................................................8

Глава 1. Современные лабораторные методы видовой идентификации влагалищных лактобактерий (обзор литературы)...............................................31

1.1. Микроэкология влагалища......................................................................34

1.2. Лактобактерии как представители микробиоценоза организма человека...................................................................................................................38

1.3. Классификация и морфо-фенотипическая характеристика лактобактерий.........................................................................................................43

1.4. Молекулярно - генетическая характеристика лактобактерий.............48

1.5. Видовая структура лактобактерий влагалища.......................................48

1.6. Чувствительность лактобактерий к антибактериальным препаратам...............................................................................................................52

1.7. Лабораторные методы идентификации лактобактерий в оценке

состояния микробиоты влагалища........................................................................56

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................................................64

Глава 2. Комплексная лабораторная оценка микроценоза влагалища

у обследованных беременных...............................................................................64

2.1. Анализ клинико - анамнестических данных беременных...................64

2.2. Комплексная оценка микроценоза влагалища с учетом результатов микроскопии и культуральной диагностики.......................................................65

2.3. Оценка микроценоза влагалища с учетом результатов метода

количественной ПЦР (тест - система Фемофлор - 16)......................................72

Глава 3. Результаты видового типирования лактобактерий методом

MALDITOFMS и количественной ПЦР..............................................................76

3.1. Видовая идентификация влагалищных лактобактерий методом времяпролетной масс - спектрометрии................................................................76

3.2. Сравнительный анализ результатов видового типирования лактобактерий методом MALDI TOF MS и количественной ПЦР.....................79

3.3. Биохимическая идентификация лактобактерий на автоматических бактериологических анализаторах........................................................................82

3.4. Морфологическая характеристика влагалищных лактобактерий, выделенных у беременных женщин.....................................................................86

3.5. Результаты определения антибиотикочувствительности различных

видов влагалищных лактобактерий диско - диффузионным методом.............87

Глава 4. Особенности видового состава лактобактерий при различных состояниях микробиоты влагалища......................................................................90

4.1. Оценка частоты выявления лактобактерий различными

методами..................................................................................................................90

4.2. Интегральная оценка видового спектра влагалищных лактобактерий с

учетом MS - идентификации и ПЦР - типирования...........................................93

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................95

Выводы..................................................................................................................103

Практические рекомендации...............................................................................105

Перспективы дальнейшей разработки темы......................................................106

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ...............................................107

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................109

ПРИЛОЖЕНИЯ....................................................................................................137

Приложение 1........................................................................................................137

Приложение 2........................................................................................................143

Приложение 3........................................................................................................147

Приложение 4........................................................................................................148

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Внедрение инновационных технологий в микробиологическую диагностику расширяет наши познания в области медицинской микроэкологии. Впервые исследования микрофлоры влагалища у женщин были проведены А.Додерлейном в 1892 году. До середины XX века вагинальный микроценоз считался однородным и представленным, в основном, Lactobacillus acidophilus - «палочками Додерлейна». К девяностым годам прошлого столетия было показано, что нормальный микроценоз гениталий женщин репродуктивного возраста неоднороден и представлен как Lactobacillus spp. - 95-98%, так и большой группой условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) -Staphylococcus spp., E.coli, G.vaginalis, С.albicans с частотой выявления 10-50% [4,42,58].

У здоровых женщин доминирующими видами микробиоты влагалища являются лактобактерии, преобладающее количество которых, по мнению большинства исследователей, определяет высокий уровень противомикробной защиты [26,47,48]. В последние годы наблюдается снижение частоты воспалительных заболеваний урогенитального тракта женщин, вызванных абсолютными патогенами, в то время как частота оппортунистических инфекций этой локализации неуклонно растет [12,51,131]. Нарушение состава микробиоты влагалища возникает вследствие неблагоприятных внешних воздействий, при подавлении локального и общего иммунитета, при ряде инфекционных и соматических заболеваний, широкого использования антибактериальных и контрацептивных препаратов [12,13,49]. Нарушения вагинальной микрофлоры во время беременности провоцируют восходящее инфицирование плодного яйца, задержку роста плода, преждевременные роды или их сочетание [48,51,69,100,144]. Причиной этого может быть вытеснение лактобактерий из микробиоты влагалища и доминирование условно -патогенной микрофлоры, увеличение общего количества бактерий и местная

лейкоцитарная реакция. Поэтому необходимо пристальное изучение состава микробиоты влагалища.

Видовая идентификация лактобактерий долгое время была трудновыполнимой задачей из - за невозможности преодоления методических сложностей при изучении их биологических свойств. Более века морфологические свойства лактобактерий оставались единственным критерием их родовой идентификации. В 80-х годах прошлого века прогресс в технологиях позволил выполнить работы, выявившие фенотипическое разнообразие штаммов лактобактерий. Опыт применения биохимических панелей от различных производителей показывал, что данная методика трудоемка, длительна и малодостоверна. Несмотря на все недостатки, морфологические и биохимические методы идентификации лактобактерий до последнего времени оставались единственными критериями при определении видовой принадлежности этих микроорганизмов [40,74,95,143].

Альтернативой классической биохимической идентификации явились методы молекулярно - генетического типирования, а в последнее время прочную нишу стала занимать масс-спектрометрия, в частности MALDI TOF MS (Матрично-Активированной Лазерной Десорбции/Ионизации времяпролетная масс-спектрометрия), основанная на регистрации белковых спектров микроорганизмов, которые уникальны для семейств, родов и видов микроорганизмов [14,22,23].

Развитие лабораторной техники, молекулярно-биологических и генетических методов исследования позволило установить высокую гетерогенность бактерий рода Lactobacillus и их широкое видовое разнообразие, достигающее сотни видов. Молекулярно - биологические методы открывают новые возможности в развитии представлений не только о составе микроценоза влагалища в норме и при патологии, а также позволяют обоснованно определить, какие же виды лактобактерий могут быть перспективными в качестве исходного сырья для производства биопрепаратов.

Степень разработанности темы

В последние два десятилетия в связи с методологическими прорывами в клинической микробиологии открылись новые возможности для более углубленного анализа микробной экологии влагалища

[15,16,75,76,108,122,131], многие вопросы которой остаются неизученными и являются предметом дискуссий. Задачи, связанные с разработкой и внедрением в рутинную практику микробиологических лабораторий новых эффективных подходов по идентификации, характеристике и типированию представителей микробиоты влагалища и клинически - значимых патогенов, являются актуальными и своевременными.

Лактобактерии представляют интерес как объект изучения для разработки пробиотических препаратов, продуктов функционального питания, способов коррекции микробиотических нарушений, так как, обладая многогранными биологическими свойствами, они играют важную роль в обменных и регуляторных процессах организма человека [20].

Возможность видовой идентификации лактобактерий позволит ближе подойти к пониманию механизмов развития оппортунистических вагинальных инфекций, установить корреляцию между видовым составом этих микроорганизмов и инфекционной патологией и станет новым шагом в разработке стратегий диагностики и лечения оппортунистических урогенитальных инфекций. Цель исследования

Определить видовой состав лактобактерий, представленных в отделяемом влагалища у беременных женщин с нормоценозом и оппортунистическими инфекциями, с помощью бактериологического, масс - спектрометрического и молекулярно - генетического методов исследования. Задачи исследования

1. Провести сравнительное изучение микроценоза влагалища у беременных женщин с помощью комплексного микробиологического исследования (микроскопия мазка, культуральное исследование) и молекулярно -

генетического метода количественной ПЦР.

2. Сравнить результаты видового типирования лактобактерий, выделенных из отделяемого влагалища беременных женщин, методами МАЮ1 ТОР МБ и количественной ПЦР.

3. Определить частоту выявления лактобактерий при различных состояниях микробиоты влагалища у беременных женщин.

4. Выявить особенности видового состава лактобактерий у беременных женщин при вагинитах различной этиологии (бактериальный вагиноз, аэробный вагинит, кандидозный вагинит) в сравнении с нормоценозом.

5. Изучить антибиотикочувствительность различных видов лактобактерий, выделенных из отделяемого влагалища.

Научная новизна

На популяции российских беременных женщин впервые проведено комплексное микробиологическое и молекулярно - генетическое исследование микробиоты влагалища с видовой идентификацией лактобактерий. Показано наличие в составе микробиоты влагалища 18 видов лактобактерий, ведущими из которых являются Ь.спБраШя, ЬлпегБ, Ь^етепп и ¿.^¿ш'еп.

Получены новые данные о видовом составе лактобактерий, представленных в микробиоте влагалища беременных женщин с нормоценозом и оппортунистическими инфекциями, расширяющие представление о формировании микробиоценозов.

Определена частота встречаемости различных видов лактобактерий во влагалище беременных женщин с преобладанием вида Ь.спБраШБ (63,2±12,6%) при нормоценозе и Ь.тегя (84,6%; ДИ 95%: 67,8-96,1) при бактериальном вагинозе. Установлено большее видовое разнообразие лактобактерий при бактериальном вагинозе в сравнении с нормоценозом.

Исследование антибиотикочувствительности клинических штаммов лактобактерий, выделенных из влагалища беременных женщин, выявило вариабельную чувствительность различных видов лактобактерий к АБП, что может вести к селективному подавлению роста или, напротив, к увеличению

уровня отдельных видов в общем пуле лактобактерий в зависимости от схемы антибактериальной терапии. Теоретическая и практическая значимость

Результаты проведенной работы позволили усовершенствовать микробиологическую (культуральную и молекулярно - генетическую) диагностику инфекционно - воспалительных заболеваний влагалища. Полученные новые данные о частоте встречаемости различных видов лактобактерий при вагинитах в сравнении с нормоценозом, позволяют теоретически обосновать перспективы использования определенных видов лактобактерий в качестве исходного сырья для производства пробиотических препаратов. При изучении морфо - фенотипических свойств лактобактерий, выявлена их морфологическая мимикрия, что ограничивает возможности микроскопического метода для качественной оценки микрофлоры влагалища.

Разработанный алгоритм микробиологического обследования беременных женщин дает возможность комплексно оценить состояние микрофлоры влагалища с целью своевременной коррекции дисбиотических нарушений и/или назначения адекватной антимикробной терапии. Определена область клинического применения метода количественной ПЦР и комплексного микробиологического исследования в диагностике инфекций влагалища.

При изучении морфологии колоний и клеток, выделенных культур лактобактерий, создана цифровая библиотека слайдов с изображением колоний и микропрепаратов клеток, предназначенных для углубленного изучения биологических свойств лактобактерий и информационного обеспечения коллекционной работы. Методология и методы иследования

В период с марта 2010 года по июль 2012 года на базе лаборатории микробиологии отдела микробиологии и клинической фармакологии, лаборатории молекулярно - генетических методов исследования ФГБУ «Центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И.Кулакова» Минздрава России, бактериологической лаборатории и отделения патологии

беременности ГБУЗ «Городская клиническая больница №36 ДЗ г.Москвы» было проведено клинико - микробиологическое обследование 163 беременных женщин. Данное научное исследование имело характер одномоментного исследования (cross-sectional). Критерии включения Беременные:

• II - III триместр;

• возраст от 18 до 40 лет;

• наличие информированного согласия. Критерии исключения

Беременные с инфекциями, передающимися половым путем (И11Ш1):

• ВИЧ - инфекция, сифилис - по данным иммуноферментного анализа (ИФА).

• гонорея, трихомониаз, хламидиоз, инфекции, вызванные M.genitalium - по данным ПЦР - исследований.

В анализ включены 155 беременных, у которых было проведено микробиологическое исследование влагалищного отделяемого с использованием трех методов: микроскопия мазков (окрашенных по Граму и метиленовым синим), культуральное исследование и молекулярная диагностика методом количественной ПЦР. Из исследования были исключены 8 женщин.

Взятие клинического материала проводили во время первичного приема пациенток одновременно для бактериоскопической, культуральной и ПЦР диагностики:

• Бактериоскопическое исследование - 2 предметных стекла.

• Микробиологическое исследование - 2 штрих - кодируемых тупфера с транспортной средой Amies с углем (Medical Wire, Англия).

• Молекулярно - генетическое исследование -1 штрих - кодируемая пробирка типа Eppendorf с транспортной средой (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Диагностика ВИЧ - инфекции и сифилиса проводилась в соответствие со стандартной процедурой, принятой для всех пациентов стационара.

Для обработки и анализа социально - демографического статуса беременных нами была разработана учетно - отчетная штрих - кодируемая «Индивидуальная регистрационная форма» (приложение 1) с указанием: Ф.И.О. пациентки; демографических данных; результатов лабораторно -инструментальных обследований; гинекологического статуса; клинической картины; диагноза заболевания; даты обследования; данных о приеме за последние 6 месяцев антибактериальных, пробиотических препаратов и иммуномодуляторов.

«Индивидуальная регистрационная форма» прилагалась к клиническому материалу и доставлялась в бактериологическую лабораторию.

Поступивший в лабораторию ГБУЗ «ГКБ №36 ДЗ г.Москвы» биоматериал регистрировали в информационной программе «Система микробиологического мониторинга «Микроб - 2». Все результаты, получаемые в ходе проведенного исследования, регистрировали в рабочих журналах, в «Системе микробиологического мониторинга «Микроб - 2» и в специально разработанной форме «Протокол ведения микробиологического исследования» (Приложение 2).

Лабораторные методы исследования

В соответствие с поставленой целью и задачами был использован комплекс инновационных лабораторных методов исследования микробиоты влагалища и видовой идентификации лактобактерий. В работе использовали стандартные и специальные методы исследования.

1. Клинико - инструментальное и лабораторное обследование с использованием стандартных методик.

• Микроскопическое исследование вагинального отделяемого.

• Культуральное исследование вагинального отделяемого с определ�