Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосенсорные системы на основе бактерий-деструкторов ε-капролактама и их применение для экологического контроля и биотехнологических исследований

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биосенсорные системы на основе бактерий-деструкторов ε-капролактама и их применение для экологического контроля и биотехнологических исследований"

¥

На правах рукописи

003444897

РОССИЙСКАЯ ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ-ДЕСТРУКТОРОВ Е-КАПРОЛАКТАМА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

03 00 23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 4 ИЮ/1 200Н

МОСКВА-2008

003444897

Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета

Научный руководитель

кандидат химических наук, доцент Понаморева Ольга Николаевна

Официальные оппоненты доктор химических наук,

профессор

Каплун Александр Петрович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Зякун Анатолий Маркович

Ведущая организация

Институт биохимии им А Н Баха РАН

Защита диссертации состоится огнУЗ-бЪ» 2008 г в if

ч на заседании

Диссертационного Совета Д 212 120 01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М В Ломоносова по адресу 119571 Москва, пр Вернадского 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им М В Ломоносова по адресу 119571 Москва, пр Вернадского 86 С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www mitht ru

Автореферат разослан » 1ЛЛОКД 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

А И Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы:

s-Каиролактам является сырьем для получения полимерных материалов (капрон, найлон-6), применяемых в различных областях промышленности, сельского хозяйства, медицины, быта Обратимость процесса получения поликапроамида приводит к тому, что продукты полимеризации всегда содержат определенное количество низкомолекулярных фракций олигомеров как линейных, так и циклических Отходы производств капролактама и полимерных материалов в настоящее время подвергаются захоронению или сжигаются, что нецелесообразно с экономической и экологической точек зрения Кроме того, широкое применение поликапроамида вместе с его низкой биодоступностью создает проблему утилизации капроновых изделий, пришедших в негодность В связи с этим необходимо уделять внимание разработке экспресс-метода контроля, ориентированного на детекцию опасного уровня загрязнения и разрабатывать методы утилизации капролактама и его полимеров и олигомеров

В настоящее время перспективными считаются методы биохимической диагностики загрязнения, в частности, биосенсорные методы, сочетающие чувствительность методов биотестирования и операционные характеристики физико-химических сенсоров Первый подход к созданию биосенсора для детекции капролактама в водных средах представлен в работе Риделя, где показана принципиальная возможность получения аналитических сигналов сенсора кюветного типа, основанного на иммобилизованных клетках штамма - деструктора Pseudomonas putida К14 и кислородном электроде, при добавлении капролактама в измерительную ячейку [Riedel К, 1989] Способность к окислению капролактама у большинства штаммов бактерий рода Pseudomonas контролируется конъюгативными плазмидами биодеградации капролактама - САР-плазмидами К настоящему времени описан ряд САР-плазмид, которые отличаются по характеру детерминируемой ими способности к утилизации капролактама и его интермедиатов Находясь в одном и том же бактериальном хозяине, они в значительной степени различаются по характеру регуляции процесса трансформации указанного ксенобиотика

Использование микроорганизмов в биосенсорных системах предполагает предварительный отбор наиболее активных в отношении исследуемых субстратов штаммов Ранее немецкими исследователями была показана возможность проведения скрининга микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков при помощи биосенсорных технологий (на основании оценки их дыхательной активности в присутствии потенциальных субстратов) [Beyersdorf-Radeck В, 1998] Биосенсорный подход для экспресс-оценки окислительной активности штаммов микроорганизмов, в том числе с разным сочетанием «бактериальный хозяин -плазмида», является перспективным для исследований в области биотехнологии защиты окружающей среды

Вопрос о биотрансформации олигомеров капролактама изучен в меньшей степени В литературе описан ряд бактерий, утилизирующих линейные и циклические олигомеры капролактама, показана принципиальная возможность еградации найлона-6 лигнинразрушающими грибами Однако возможность применения микроорганизмов для биологической очистки сточных вод и отходов

производств, содержащих олигомеры капролактама, а также для создания биосенсорных систем в настоящее время только исследуется

Работа выполнялась при частичной поддержке гранта РФФИ 04-04-96705 «Изучение процессов окисления ксенобиотиков бактериальными штаммами на основе их дыхательной активности», в рамках проекта ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники 2002-2006 годы» (Госконтракт 02 438 11 7021 ), проекта аналитической программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (РНП 2 1 1 7789) Автор работы является победителем Всероссийского конкурса инновационных проектов «Живые системы» в 2005 г (г Киров), победителем конкурса Программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2007 г (г Пущино)

Цель работы:

Выявление закономерностей аэробной деградации капролактама и его олигомеров бактериальными штаммами с помощью биосенсорного подхода и разработка макета биосенсора для определения капролактама в водных средах

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи

- создать лабораторную модель биосенсорной установки, позволяющую проводить количественную оценку окислительной активности различных бактериальных штаммов - деструкторов капролактама,

провести сравнительное изучение окислительной активности бактериальных штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин - САР-плазмида» с использованием биосенсорной установки;

- выявить корреляцию между параметрами градуировочных графиков, полученных с помощью биосенсоров на основе штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин - САР-плазмида», и удельными активностями ферментных систем т vivo этих бактериальных штаммов, предложить подход для экспресс-оценки окислительной активности микроорганизмов,

- на основе наиболее активного штамма - деструктора капролактама разработать макет микробного сенсора (биосенсора проточно-инжекционного типа) для детекции капролактама в водных средах, определить его аналитические и метрологические характеристики,

- применить разработанный макет биосенсорной установки для экспресс-оценки содержания капролактама в процессе его биологической утилизации в модельных системах и реальных образцах технологических вод и отходов производств,

- показать возможность применения биосенсорного подхода в сочетании с другими физико-химическими методами для изучения процессов микробиологической трансформации олигомеров

Научная новизна

Впервые показана возможность экспресс-оценки окислительной активности бактериальных штаммов с различными комбинациями «бактериальный хозяин -САР-плазмида» с помощью биосенсорного подхода. Получены значения удельных активностей ферментных систем деградации капролактама in vivo для бактериальных штаммов-деструкторов капролактама Установлена корреляция между величинами удельной ферментативной активности исследуемых штаммов и параметрами градуировочных зависимостей микробных сенсоров Выявлено, что процесс утилизации капролактама зависит в первую очередь от выбора штамма-бактериального хозяина САР-плазмиды

Установлено, что селективность биосенсорного определения капролактама при проточно-инжекционном способе регистрации ответов сенсора выше, чем при юоветном способе

Впервые выявлен механизм трансформации линейных олигомеров бактериальными клетками штамма Pseudomonas putida BS394, содержащего плазмиду биодеградации капролактама pBS268 - окислительное переаминирование до соответствующих дикарбоновых кислот. Установлено, что процесс трансформации линейных олигомеров находится под генетическим контролем САР-плазмиды pBS268

Практическая значимость

Разработан и опробован на реальных образцах макет биосенсора проточно-инжекционного типа для анализа содержания капролактама в водных средах Разработанный макет биосенсора характеризуется экспрессностью, высокой чувствительностью и селективностью и может быть использован в научных исследованиях, в учебном процессе и как прототип опытного образца прибора Оригинальность и практическая значимость разработки подтверждена патентом РФ.

Показана возможность применения биосенсорной системы для быстрого скрининга бактериальных штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин - САР-плазмида», что может быть использовано при создании эффективных биопрепаратов с высокой способностью к биодеградации капролактама и продуктов его полимеризации.

Выявленные закономерности процесса биодеградации олигомеров капролактама могут использоваться при создании биосенсоров для детекции олигомеров в водных средах и при разработке технологии биологической очистки отходов, содержащих эти соединения

Апробация работы и публикации

Результаты работы докладывались на Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» в 2007 г {медаль конкурса), 11-м Московском международном салоне промышленной собственности «Архимед» в 2008 г, Международном конгрессе по аналитическим наукам «ICAS-2006» (г Москва) в 2006 г., Всероссийском конкурсном отборе и конференции инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Живые системы» (г Киров) в 2005 г

(диплом победителя), IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (г Томск) в 2006 г, Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология -современные биоаналитические системы, методы и технологии» (г Пущино) в 2006 г (диплом лауреата конкурса), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» (г Москва) в 2005 г, Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -Наука XXI века» (г Пущино Московской области) в 2005 г

По теме диссертации опубликовано 4 статьи, 8 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций, получен 1 патент РФ

Структура и объем работы

Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, анализа результатов исследований, выводов и списка использованной литературы Диссертационная работа изложена на 127 страницах, содержит 47 рисунков и 21 таблицу Список литературы включает 80 источников

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. В первой главе дается анализ научно-технической литературы, посвященной исследованиям в области биодеградации капролактама, его олигомеров, а также полимерных материалов Изложены основные подходы к биологической обработке стоков, содержащих капролактам и его олигомеры, проведен краткий обзор физико-химических методов анализа водных сред, содержащих капролактам и олигомеры

Глава 2. Во второй главе дано описание методов исследования В работе использованы штамм Pseudomonas putida BS394, содержащий одну из плазмид деградации капролактама (pBS268, pBS265, pBS276), и штаммы Pseudomonas fluorescens 38a(pBS268) и Pseudomonas chlororaphis PCL1391(pBS268) (Коллекция лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. ГЛССкрябина РАН)

Бактерии выращивали в жидкой и агаризованной синтетической среде Эванса с добавлением источников углерода (капролактам, линейный димер, глюкоза) и цистеина, необходимого для роста ауксотрофных штаммов Культивирование проводили при 28°С в динамических (круговая качалка, 180 об/мин) и в статических условиях.

В работе применяли высокочувствительный электрохимический метод регистрации окислительной активности биологического материала, позволяющий производить высокоточные измерения в наноамперном диапазоне токов, что дает возможность исследовать свойства микрограммовых количеств биомассы Дыхательную активность микроорганизмов регистрировали с помощью кислородного электрода, на рабочей поверхности которого фиксировали иммобилизованные в агаровом геле бактериальные клетки Электрохимические измерения проводили с помощью гальваностата-потенциостата «IPC2000» (ЗАО «Кронас», Россия) (кюветный способ) и анализатора растворенного кислорода «Биолан» (ЗАО «Кронас», Россия) (проточно-инжекционный способ), интегрированных с персональным компьютером Ток регистрировали в интервале

0,1 нА - 20 нА, в качестве измеряемого параметра использовали амплитуду и максимальную скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстратов. Обработку данных проводили с помощью компьютерных программ «Microsoft Excel» и «SigmaPlot 8.0».

Удельную активность ферментных систем деградации капролактама in vivo рассчитывали по убыли субстрата при инкубации бактерий в растворе, содержащем капролактам (начальная концентрация 2 мМ).

Для оценки степени биодеградации капролактама в модельных и реальных объектах проводили инкубацию образцов с исследуемым штаммом P.putida BS394(pBS268) в течение 6 часов, после чего определяли содержание капролактама в культуральной жидкости.

Определение концентрации капролактама проводили с помощью биосенсорного метода, фотометрического метода и метода тонкослойной хроматографии.

Изучение процесса трансформации линейных олигомеров проводили с использованием биосенсорной оценки дыхательной активности иммобилизованных бактерий в присутствии олигомеров; посредством длительной инкубации бактерий в присутствии олигомеров с последующим анализом культуральной жидкости методом масс-спектрометрии, а также по росту бактериальных клеток на субстрате.

Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение.

1. Разработка лабораторной модели биосенсора кюветного типа на основе штаммов-деструкторов капролактама с различными сочетаниями «бактериальный хозяин - САР-плазмида»; применение ее для экспресс-оценки окислительной активности бактерий

Определение параметров градуировочных зависимостей биосенсоров

Принцип работы микробного сенсора на основе кислородного электрода основан на том, что при окислении субстрата иммобилизованными на поверхности кислородного электрода микроорганизмами возрастает их дыхательная активность, и в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода (рис.1).

б

Рис. 1. а) схема работы биосенсора кюветного типа; б) внешний вид лабораторной модели микробного биосенсора кюветного типа

В качестве преобразователя использовали гальваностат-потенциостат IPC2000, представляющий собой блок регистрации и обработки данных, позволяющий производить непрерывную регистрацию сигнала, его обработку, оценку основных параметров - амплитуды и начальной скорости изменения сигнала.

При формировании биорецепторных элементов сенсора для определения концентрации капролактама в водной среде использовали: штамм P.putida BS394, содержащий различные плазмиды биодеградации капролактама (pBS268, pBS265, pBS276) и штаммы P.fluorescens 38а и P.chlororaphis PCL 1391, содержащие одну и ту же САР-плазмиду - pBS268. Таким образом, для сравнительного изучения были отобраны, с одной стороны, бактериальные штаммы, относящиеся к разным видам рода Pseudomonas, содержащие одну и ту же плазмиду биодеградации капролактама, с другой стороны, один и тот же штамм - бактериальный хозяин различных САР-плазмид.

Формирование рецепторного элемента проводили иммобилизацией бактериальных клеток в агаровый гель; все биорецепторные элементы содержали одинаковое количество клеток микроорганизмов, что обеспечивало количественный подход в получении сравнительных оценок окислительной активности штаммов бактерий в отношении различных субстратов. На рис.2 представлен типичный отклик биосенсора на введение в измерительную ячейку капролактама.

Рис. 2. Отклик биосенсора кюветного типа на добавление в измерительную ячейку капролактама Связь дыхательной активности бактерий с концентрацией субстрата в кювете позволяет получить градуировочные зависимости откликов сенсора от концентрации капролактама для биосенсоров на основе каждого штамма (рис.3).

концентрация капрапактама, мМ концентрация капролактама, мМ

а б

Рис 3 Градуировочные зависимости микробных сенсоров а - на основе шталшов-бактериальных хозяев плазмиды рВБ268, б-на основе штамма Р риПс1а ВБ394 с разными плазмидами Анализ экспериментальных данных показывает, что полученные зависимости можно аппроксимировать уравнением гиперболы типа Михаэлиса-Ментен, описывающим экспериментальную зависимость начальной скорости потребления кислорода бактериями от исходной концентрации субстрата Параметры градуировочных зависимостей биосенсоров на основе исследуемых штаммов приведены в таблице 1

Таблица 1 — Параметры градуировочных зависимостей биосенсоров

Штамм Эффективная константа Михаэлиса К'м, мМ Коэффициент чувствительности Ь, нА/(с*мМ)

Pputida BS394(pBS268) 0,12±0,06 0,08±0,01

Р putida BS394(pBS265) 0,14±0,03 0,11±0,01

Р putida BS394(pBS276) 0,14±0,05 0,020±0,006

P fluorescens 38a(pBS268) 0,6±0,1 0,002±0,002

P chlororaphis PCL1391(pBS268) 0,71±0,06 0,003±0,002

Эффективные константы Михаэлиса для первых трех штаммов ниже, чем для штаммов Рfluorescens 38a(pBS268) и Р chlororaphis PCL 1391(pBS268), биосенсоры на основе штаммов Pputida BS394(pBS268) и Pputida BS394(pBS265) характеризуются наибольшими коэффициентами чувствительности Полученные оценки позволяют заключить, что использование штаммов Р putida BS394(pBS265) и Pputida BS394(pBS268) как основы биосенсоров является более предпочтительным

Выбор рабочих параметров биосенсора на основе Р putida BS394(pBS268). опенка селективности и определение аналитическьх и метрологических

характеристик лабораторной модели биосенсора В случае биосенсорного анализа селективность - возможность определения каждого компонента анализируемого объекта независимо от других - определяется

субстратной специфичностью бактериальных клеток рецепторного элемента, т.е. изменением дыхательной активности иммобилизованных бактерий в присутствии спектра потенциальных субстратов.

Изменение дыхательной активности иммобилизованных бактерий Р.риИс1а В8394(рВ8268) при введении в измерительную кювету капролактама более чем в два раза выше, чем при введении промежуточных продуктов его биодеградации (аминокапронат, адипинат), циклогексанола и циклогексанона (рис.4). Следует отметить, что бесплазмидный штамм Р.рЫгйа В 83 94 не способен окислять капролактам и его интермедиаты, но проявляет дыхательную активность в присутствии циклогексанола и циклогексанона, окисление которых не зависит от наличия плазмиды деградации в клетке, тогда как штамм Р.рийс1а В8394(рВ8268) проявляет дыхательную активность в присутствии всех используемых субстратов, в том числе интермедиатов деградации капролактама.

0,05 -1-

т Р.риМа Вв394(рВ3268) I т С2ШЭ Р.рММа ВБ394

11 к I

0 1 2 3 4 5 6

Рис. 4. Субстратная специфичность иммобилизованных клеток в рецепторном элементе биосенсора кюветного типа. Субстраты:

1-капролактам, 2-аминокапронат, 3- адипинат, 4-циклогексанол, 5-циклогексанон. Концентрация субстратов в кювете составляла 1 мМ Таким образом, биосенсоры на основе целых клеток микроорганизмов можно использовать, совместно с другими методами, как один из инструментов установления биохимических путей аэробной деградации органических соединений микроорганизмами.

Для лабораторной модели биосенсора на основе штамма Р.ри^с1а В8394(рВ8268), характеризующейся наилучшей операционной стабильностью, определили рабочие параметры функционирования биосенсора (рН среды измерения, концентрация солей буферного раствора, содержание бактерий в рецепторном элементе). Рабочим считали значение параметра, при котором величина ответа сенсора была максимальной. Рабочие параметры составили: рН среды 7,6; концентрация солей буферного раствора 33 мМ; содержание клеток в рецепторном элементе 25 мг (по сырому весу)/мл агарового геля. Было установлено, что использование динамического режима культивирования является предпочтительным по сравнению со статическим при получении биомассы бактерий-деструкторов капролактама - основы рецепторного элемента биосенсора.

2. о,оз

0

и

1 0,02 &

ш

5 0,01

о

Основные аналитические и метрологические характеристики лабораторной модели биосенсора кюветного типа на основе штамма Р рипйа В8394(рВ8268)

- длительность единичного измерения 15 минут,

- предел обнаружения 0,02 мМ;

- операционная стабильность (стандартное отклонение по 14 последовательным измерениям) 9,8%,

- долговременная стабильность сенсора более 15 суток (падение активности микроорганизмов на протяжении этого времени составило 25 %)

Таким образом, лабораторная модель биосенсора на основе штамма Р риШа В8394(рВБ268) характеризуется экспрессностью, чувствительностью и селективностью и может быть использована для определения концентрации капролактама водных средах В настоящем исследовании разработанная лабораторная модель биосенсора была использована при изучении влияния различных сочетаний «бактериальный хозяин - САР-плазмида» на окислительную активность бактерий-деструкторов капролактама и явилась основой при разработке макета биосенсора проточно-инжекционного типа

Определение удельных активностей ферментных систем деградации

капролактама бактериальными штаммами с различными сочетаниями «бактериальный хозяин — САР-плазмида»

Эффективность работы бактериальной ферментной системы катаболизма капролактама оценивали по скорости его утилизации микроорганизмами

За удельные активности ферментных систем принимали изменение концентрации субстрата за единицу времени (мин) на единицу сырого веса клеток (мг) (таблица 2)

Штамм Удельная активность ферментных систем деградации капролактама а, мкМ/(мг мин) Степень деструкции капролактама, %

Р риийа В8394(рВ8268) 0,17±0,03 80

Р риийа В8394(рВ8265) 0,16±0,03 80

Р риМа В8394(рВ8276) 0,11±0,03 56

Р Аиогевсет 38а(рВ8268) 0,09±0,03 48

Р сЫогогарИи РСЫ391(рВ8268) 0,06±0,03 24

Полученные результаты свидетельствуют о том, что перенос плазмиды рВБ268 в ризосферные штаммы РАиоге&сет 38а и Р сЫогогарУих РС1Л391 приводит к снижению активности ферментной системы деградации капролактама у полученных трансконъюгантов Удельные активности ферментной системы катаболизма капролактама штамма РриМа В8394 с разными плазмидами

биодеградации капролактама - pBS268, pBS265 или pBS276 оказались наиболее высокими и близкими по величине Следовательно, процесс утилизации капролактама зависит в первую очередь от выбора бактериального хозяина

Наибольшая степень деструкции капролактама (отношение изменения концентрации капролактама к его исходному содержанию) свойственна штаммам Рputida BS394(pBS268) и Рputida BS394(pBS265)

Сравнительный анализ величин удельной ферментативной активности исследуемых штаммов с параметрами градуировочных зависимостей биосенсоров Для выявления взаимосвязи активности ферментных систем деградации капролактама бактериальных штаммов и эффективности их функционирования в качестве рецепторного элемента биосенсора была проведена сравнительная оценка величин удельной ферментативной активности пяти выбранных штаммов (таблица 2) с одной стороны с эффективными константами Михаэлиса (К'м) и коэффициентами чувствительности (Ь) градуировочных зависимостей микробного сенсора (таблица 1) с другой стороны Для количественной оценки взаимосвязи наборов данных рассчитывали коэффициент корреляции между этими величинами, который составил 0,89 и 0,92 (по модулю) соответственно Оценку активности ферментной системы, отвечающей за деградацию капролактама, для различных бактериальных штаммов предпочтительнее проводить по коэффициенту чувствительности биосенсора (коэффициент корреляции 0,92) Таким образом, биосенсорный подход может быть использован для сравнения способности к утилизации капролактама штаммов-деструкторов с различными комбинациями «бактериальный хозяин - САР-плазмида»

2. Макет микробного сенсора проточно-инжекциониого типа для детекции капролактама, его селективность, аналитические и метрологические

характеристики

Макет биосенсора проточно-инжекционного типа для определения капролактама в водных средах был разработан на базе анализатора растворенного кислорода «Биолан» Прибор «Биолан» создан в рамках программы РАН и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Активизация инновационной деятельности в сфере уникального научного приборостроения», разработчики ТулГУ, ИБФМ РАН (г Пущино), ООО «Аналитик-ВНИПИМ» (г Тула), ЗАО «Кронас» (г. Москва) (Госконтракт № 1872 р/3859)

В разработанном макете микробного сенсора в качестве измерительного электрода использовали кислородный электрод типа Кларка с иммобилизованными на его поверхности бактериальными клетками - деструкторами капролактама Принцип работы такой системы заключается в следующем в проточно-инжекционной системе биосенсорный элемент встроен в канал, по которому постоянно прокачивается буферный раствор Проба впрыскивается в поток и через определенное время поступает в зону измерительного электрода, где микроорганизмы окисляют субстрат, содержащийся в пробе При этом в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что

регистрируется с помощью электрода Кларка, сопряженного с гальваностатом-потенциостатом (рис.5).

Рис. 5. а) схема работы проточно-инжекционного биосенсора; б) внешний вид анапизатора растворенного кислорода «Биолан» На монитор компьютера, интегрированного с биосенсорной системой, выводится графическое отображение изменения силы тока, протекающего в системе, во времени (рис.6):

Рис. 6. Отклики биосенсора на различные конг/ентрации капролактама: 1 - 0,05 мМ; 2 - 0,1 мМ; 3 -1 мМ; 4 - 2 мМ; 5 - 5 мМ

В качестве рецепторного элемента биосенсора проточно-инжекционного типа использовали иммобилизованный в агаровый гель бактериальный штамм Р.putida BS394(pBS268), показавший наибольшую активность при окислении капролактама. Градуировочные зависимости ответов биосенсора от концентрации капролактама для нескольких рецепторных элементов приведены на рис.7.

Для биосенсора проточно-инжекционного типа на основе штамма Р.putida BS394(pBS268) получены аналитические и метрологические характеристики:

- длительность единичного измерения 10 мин;

- нижний предел обнаружения 0,005 мМ, что позволяет определять концентрации капролактама ниже ПДК (ПДК капролактама в водоемах составляет 1 мг/л (0,009 мМ));

- операционная стабильность 5,3 %;

- долговременная стабильность 10 сут. (падение активности клеток составило 31%.).

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1.2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2

концентрация капролактама, мМ

Рис. 7. Типичные градуировочные зависимости биосенсора на основе штамма Р.рШс1а ВЯ394(рВ8268')

Сравнение селективности определения капролактама при кюветном и проточно-инжекционном способах измерения проводили по ряду субстратов: капролактам, промежуточные продукты биодеградации капролактама (аминокапронаг, адипинат), а также циклогексанон и циклогексанод - вещества, используемые при производстве капролактама, содержание которых в технологических водах предприятий может достигать 4%.

Рис. 8. Селективность биосенсорного определения капролактама при кюветном и проточно-инжекционном способах регистрации ответа. За 100% принимали ответ сенсора на 1 мМ капролактам. Субстраты (концентрация 1 мМ): 1-капролактам, 2-адипинат, 3-аминокапронат, 4-циклогексанол, 5-циклогексанон Для проточно-инжекционного сенсора ответ на капролактам по крайней мере в 20 раз превышал ответы сенсора на интермедиаты капролактама и органические примеси, что позволяет селективно определять концентрацию капролактама в сточных водах. Следует отметить, что специфичность разработанного биосенсора юоветного типа (рис.8) соответствует специфичности описанного в литературе биосенсора [Riedel К., 1989]. В то же время в проточно-инжекционном формате селективность определения капролактама выше. Вероятно, при снижении времени контакта биорецепторного элемента с пробой в проточной системе транспорт субстрата к ферментным системам становится лимитирующим фактором и определяет величину ответа биосенсора.

Разработанный макет биосенсора проточно-инжекционного типа был применен для анализа реальных образцов, содержащих капролактам

3. Биосенсорный анализ содержания капролактама в реальных образцах

В работе использовали два образца, содержащих капролактам Образец №1 представлял собой технологические воды цеха предприятия по производству капролактама «Щекиноазот» (г Щекино, Тульская область), в которых содержатся капролактам, органические примеси - циклогексанон, циклогексанол и сульфат аммония, образец №2 - капролактам-олигомерный концентрат дистилляции -твердые отходы с предприятия по производству полимерных волокон «Химволокно» (г Щекино, Тульская область), содержащие капролактам и его олигомеры Результаты анализа содержания капролактама в этих образцах представлены в таблице 3 В качестве референтных использовали метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) и фотометрический метод

Таблица 3 - Содержание капролактама в образцах

Метод определения Образец №1 Образец №2

Биосенсор проточно-инжекционного типа на основе РриЫа ВБ394(рВ5268) 5,2±0,2 % 75±4%

ТСХ 5,0±0,5 % 80±8%

Фотометрический метод 5,3±0,2 % не определяли

Результаты определения содержания капролактама в образцах №1 и №2 показывают, что макет биосенсора проточно-инжекционного типа можно применять для определения концентрации капролактама в реальных образцах

Далее исследовали возможность применения разработанного макета биосенсора для мониторинга процесса биологической очистки капролактамсодержащих производственных отходов Для этого к разбавленным до концентрации капролактама 2 мМ образцам №1 и №2 добавляли клетки штамма-деструктора РриХиНа В5394(рВ5268) в количестве 2,3x109 КОЕ/мл и определяли содержание капролактама в реакционной смеси в ходе биодеградации Полученные результаты приведены в таблице 4

Таблица 4 - Степень утилизации капролактама в реальных объектах

при их инкубации со штаммом Р putida BS394(pBS268)

Объект Время утилизации, ч Концентрация капролактама, мМ Степень утилизации, %

Образец №1 0 2,00 -

1 0,70±0,04 65

6 < 0,005 100

Образец №2 0 2,00 -

1 0,65±0,03 70

6 < 0,005 100

Инкубирование клеток штамма-деструктора с образцами, содержащими капролактам, приводило к уменьшению концентрации капролактама на 65 и 70% в течение часа и к полной его утилизации через 6 часов В присутствии бесплазмидного штамма Р риЫа В Б394 снижения концентрации субстрата не наблюдали

Таким образом, разработанный макет биосенсора проточно-инжекционного типа на основе штамма Pputida BS394(pBS268) характеризуется чувствительностью, селективностью и экспрессностью определения капролактама и может быть использован как прототип опытного образца прибора для анализа капролактама в водных средах Показано, что разработанный макет позволяет проводить мониторинг биологической очистки капролактамсодержащих производственных отходов

4. Изучение процесса биодеградации линейных олигомеров капролактама с применением биосенсорного подхода

Некоторые микроорганизмы характеризуются способностью к одновременной деградации капролактама и его линейных и циклических олигомеров, кроме того, было показано, что бактерии Flavobacterium sp KI72 [Negoro S, 2000] и Pseudomonas aeruginosa PAOl [Pryambada I, 1995], не проявлявшие изначально катаболической активности по отношению к олигомерам, могли адаптироваться к данным субстратам и приобретать способность к деструкции олигомеров

В данной работе исследование возможности биодеградации олигомеров штаммом-деструктором капролактама проводили путем культивирования бактерий Р putida BS394(pBS268) на минеральной среде с добавлением димера и тримера капролактама в качестве единственных источников углерода и энергии* Роста бактериальных клеток на данных субстратах не наблюдали, следовательно, штамм Рputida BS394(pBS268) не способен к биодеградации линейных олигомеров

Оценка дыхательной активности бактерий в присутствии олигомеров Отсутствие процесса биодеградации олигомеров бактериальными клетками не исключает возможности трансформации этих субстратов — частичной деструкции, которая существенно изменяет структуру органического вещества, но не приводит к его полной утилизации Для изучения данного вопроса использовали биосенсорный подход, основанный на измерении дыхательной активности иммобилизованных бактерий в присутствии субстратов. Дыхательная активность штамма-деструктора P.putida BS394(pBS268) увеличивалась в присутствии не только капролактама и его интермедиатов, но и линейных димера и тримера (рис 9), что свидетельствует о способности исследуемого штамма трансформировать линейные олигомеры

Экспериментальная работа выполнена в Лаборатории биологии плазмид Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН

Рис. 9. Субстратная специфичность Р.риНс1а ВБ394(рВ5268). За 100% принимали ответ сенсора на 1 мМ капролактам. Субстраты (концентрация 1 мМ): 1-капролактам, 2-димер, 3-тример, 4-аминокапронат, 5-адипинат

Для выявления локализации генов (хромосомной или плазмидной), контролирующих трансформацию олигомеров исследуемым штаммом, изучали дыхательную активность штамма Р.риМа В8394, не содержащего САР-плазмиды. Откликов биосенсора на основе бесплазмидного штамма Р.риййа В8394 в присутствии линейного димера, тримера, капролактама и его интермедиатов не наблюдали, следовательно, процесс трансформации линейных олигомеров находится под генетическим контролем плазмиды биодеградации рВ8268.

Следует отметить, что изменение дыхательной активности штамма Р.риМа В8394(рВ8268) количественно зависит от концентрации олигомеров в измерительной кювете (в отсутствии капролактама). На рис. 10 представлена градуировочная зависимость ответов биосенсора от концентрации димера. Нижний предел обнаружения димера составил 0,02 мМ.

0,06

концентрация димера, мМ

Рис. 10. Градуировочная зависимость биосенсора на основе штамма Р.риШа ВБ394(рВБ268) Полученные результаты могут явиться основой при разработке биосенсора для детекции, олигомеров капролактама в водных средах.

Трансформация пинейных отигомеров бактериальными клетками Для установления возможного пути трансформации олигомеров проводили длительную (до 48 ч) инкубацию штамма-деструктора капролактама Р риЫа В8394(рВ8268) в присутствии линейных димера и тримера с последующей идентификацией содержащихся в культуральной жидкости веществ с помощью метода масс-спектрометрии+

После инкубации в масс-спектрах культуральной жидкости обнаруживаются пики, отвечающие молекулярным массам 259 и 372, которые совпадают с молекулярными массами продуктов окислительного переаминирования линейного димера и тримера (рис 11) Идентификацию продуктов трансформации проводили по результатам МС/МС-анализа пиков Мг=259 и Мг=372 При инкубации клеток бесплазмидного штамма Р риЫа В3394 в присутствии линейных олигомеров изменений в составе культуральной жидкости не происходило

ш2-(сн2)5-с1(сн2)5-соон в^о^с-сшДснсн^ш,

Мг - 244 О О

линейный димср капротактама >4 -357

лгасиньй тригер кацюлакга\в

Н ' Н

Н00С-(СН2)4-С1(СН2)5-С00Н нхс^^с-ссн^-с-сшл-аш

0 Мг = 259 И=372

продукт трансформации димера 1рщукгтриипр м-ра

Рис 11 Схема трансформация димера и тримера

Полученные данные позволяют предположить, что бактериальные клетки, содержащие САР-плазмиду, способны к трансформации линейных олигомеров за счет широкой субстратной специфичности двух ферментов биодеградации капролактама трансаминазы и дегидрогеназы (рис 12)

* Экспериментальная работа выполнена в Секторе масс-спектрометрии Инстит>та биохимии и физиологии им Г К Скрябина РАН

Ш2-(СН2)5

<

н

С-К-(СН2)5-0

соон

трансаминаза

а-кетогяугарат глугамаг

н

I

Н-С-(СН2)4- С-К-(СН2)5 -соон о 6

дегидрогепаза

Снадф+-ш2о (НАД*)

НАД®Н+Н+-

НАДФН+Н*-». Дьиагельнал (НАДН Н ) «ет йи^срий

н

НООС-(СН2)4- С-К-(СН2)5|соон [о

Рис 12 Схема трансформации линейных олигомеров под действием ферментов биодеградации капролактама

Образующиеся в ходе трансформации дикарбоновые кислоты накапливаются в культуральной жидкости

Биологическая очистка промышленных сточных вод, содержащих капролактам и его олигомеры, затрудняется тем, что в таких объектах оптимальное для микроорганизмов соотношение (БПК) N Р сдвинуто в сторону увеличения содержания азота Поэтому для полного удаления капролактама биологическими методами прибегают к дополнительному внесению в сточную воду углеродсодержащих веществ или к предварительной химической обработке -дезаминированию Отщепление ЫН2-группы от олигомеров с помощью бактериальных клеток, приводящее к снижению содержания азота, может стать альтернативой существующим методам предварительной подготовки капролактам-и олигомерсодержащих стоков для дальнейшей биологической очистки

Выводы

1 Разработана лабораторная модель биосенсора кюветного типа, которая позволяет проводить сравнительную оценку окислительной активности штаммов -деструкторов калролактама Рабочие параметры биосенсорной модели на основе штамма Pseudomonas putida BS394(pBS268) составили pH среды 7,6, концентрация солей буферного раствора 33 мМ; содержание клеток в рецепторном элементе 25 мг (по сырому весу)/мл агарового геля

2 Впервые показана возможность применения биосенсорного подхода для быстрого скрининга бактериальных штаммов с различными комбинациями «бактериальный хозяин - САР-плазмида» Выявлено, что на процесс утилизации капролактама большее влияние оказывает выбор бактериального хозяина

3 Получены значения удельных активностей ферментных систем деградации капролактама т vivo для бактериальных штаммов-деструкторов капролактама Наиболее высокую удельную активность наблюдали для штаммов Рputida BS394(pBS268) и Рputida BS394(pBS265) 0,17±0,02 и 0,16±0,02 мкМ/(мгмин) соответственно

4 Разработан и опробован на реальных образцах макет биосенсора проточно-инжекционного типа на основе штамма Рputida BS394(pBS268) для анализа капролактама в водных средах. Основные характеристики биосенсорной системы длительность единичного измерения 10 мин, нижний предел обнаружения 0,005 мМ; операционная стабильность 5,3 %, долговременная стабильность 10 суток

5 Впервые выявлен механизм трансформации линейных олигомеров капролактама под действием бактериальных клеток, содержащих плазмиду биодеградации капролактама окислительное переаминирование до соответствующих дикарбоновых кислот. Показана принципиальная возможность создания биосенсора для детекции линейных олигомеров в водных средах

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Российская И.В., Есикова ТЗ, Понаморева ОН, Решетилов АН Биосенсорная оценка катаболической активности штаммов-деструкторов е-капролактама с различными сочетаниями «САР-плазмида - бактериальный хозяин»//Биотехнология 2008 №4 С 44-47

2 Российская И.В., Понаморева О Н, Есикова Т 3 , Власова Ю А, Алферов В А, Решетилов А Н Детекция капролактама двумя типами микробных биосенсоров // Вода Химия и Экология 2008 №1 С 30-38

3 Российская И.В., Понаморева О Н, Алферов В А , Есикова Т 3 , Кошелева И А, Решетилов А Н Сравнительная оценка окисляющей активности ферментных систем бактерий-деструкторов капролактама и эффективности функционирования этих штаммов в качестве биорецеторного элемента биосенсора // Известия ТулГУ Серия «Химия» Тула Изд-во ТулГУ 2005 Вып 5 С 78-88

4 Российская И.В., Понаморева О Н, Алферов В А, Есикова Т 3 Характеристика биохимического поведения штамма Pseudomonas putida BS394(pBS268) биосенсорным методом в условиях естественного и электрокаталитического окисления субстратов // Известия ТулГУ Серия «Химия» Тула Изд-во ТулГУ 2006. Вып 6 С 161-165

5 Патент №70661 Российская Федерация, МПК C12N 1/00 (2006 01) Устройство для определения е-капролактама / Понаморева О Н, Российская И.В., Есикова Т 3 , Решетилов А Н, заявитель и патентообладатель Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г К Скрябина РАН - № 2007128608/22, заявл 26 07 2007, опубл 10 02 2008, Бюл №4 - 3 с

6 Российская И.В., Алферов В А, Понаморева О Н, Решетилов А Н, Кошелева И А Изучение путей деградации ксенобиотиков с помощью микробного сенсора // Материалы II Международной научной конференции «Ксенобиотики и живые системы» Мн БГУ Минск, 11-15 ноября 2003 г С 36-40

7. Российская И.В., Понаморева О Н, Алферов В А Микробный биосенсор для детекции s-капролактама // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» Секция «Химия», т 1 М 2005. Москва, 12-15 апреля 2005 года С 42

8 Российская И.В., Понаморева О Н, Алферов В А, Есикова Т 3 , И А Кошелева Биосенсоры на основе бактериальных клеток как инструмент изучения процессов биодеградации ксенобиотиков // Материалы IV международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» Том 2 Томск изд-во ТПУ Томск, 11-16 сентября 2006 С 428-429

9 Российская И.В. Понаморева ОН Биосенсорная система для экспресс-характеристики штаммов-деструкторов ксенобиотиков и детекция капролактама в водных средах // Материалы Четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития» Часть 3 М ЗАО «Экспо-биохим-технологии» Москва, 12-16 марта 2007 С 13

10 Российская И.В. Аэробная деградация ксенобиотиков иммобилизованными бактериями рода Pseudomonas II 9-я Путцинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино), 18-22 апреля 2005 г. Тезисы докладов С. 362

11 Российская И.В. Биосенсор для детекции капролактама на основе плазмидсодержащих бактерий-деструкторов ксенобиотиков // Всероссийский конкурс инновационных проектов «Живые системы» (Киров), 24-26 ноября 2005 г. Тезисы докладов С 241-245

12 Rossinskaya I.V., Ponamoreva O.N, Alferov V.A, Kosheleva IA, Esikova T Z Reshetilov A N Biosensor for detection of 8-caprolactam // International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 (Москва), 25-30 июня 2006 г Сборник тезисов Т 1. С 368

13 Российская И.В., Алферов С В , Денисова А А, Петрухина И А Разработка условий культивирования микроорганизмов для получения биокаталитических материалов с заданными свойствами // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино), 24-25 мая 2007 г С. 5758

Подписано в печать 23 Об 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 553 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495)975-78-56 (499)788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Россинская, Ирина Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ 1 '

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Промышленное производство и потребление капролактама

1.2 Биологическая обработка отходов, содержащих капролактам и его олигомеры

1.3 Физико-химические методы определения екапролактама и его олигомеров в водных средах

1.4 Биохимические основы и генетический контроль деградации капролактама

1.4.1 Влияние капролактама на живые организмы и параметры его токсичности

1.4.2 Микробиологическая деградация синтетических лактамов

1.4.3 Бактерии-деструкторы капролактама

1.4.4 Микробный метаболизм капролактама

1.4.5 Ферменты биодеградации капролактама

1.4.6 Генетический контроль биодеградации капролактама: плазмиды деградации

1.5 Биохимия микробиологической деградации линейных и циклических олигомеров капролактама

1.5.1 Биохимические пути и ферменты биодеградации олигомеров

1.5.2 Биодеградация циклического димера 6аминогексаноата,

1.5.3 Приобретенная способность к деградации олигомеров

1.6 Микроорганизмы-деструкторы синтетических полимеров

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биосенсорные системы на основе бактерий-деструкторов ε-капролактама и их применение для экологического контроля и биотехнологических исследований"

Капролактам является сырьем для получения полимерных материалов (капрон, найлон-6), применяемых в различных областях промышленности, сельского хозяйства, медицины, быта. Обратимость процесса получения поликапроамида приводит к тому, что продукты полимеризации всегда содержат определённое количество низкомолекулярных фракций олигомеров, как линейных, так и циклических. Отходы производств капролактама и полимерных материалов в настоящее время сбрасываются в водоемы, подвергаются захоронению или сжигаются, что нецелесообразно с экономической и экологической точек зрения. Кроме того, широкое применение поликапроамида вместе с его низкой биодоступностью создаёт проблему утилизации капроновых изделий, пришедших в негодность. В связи с этим необходимо уделять внимание разработке экспресс-метода контроля, ориентированного на детекцию опасного уровня загрязнения и разрабатывать методы утилизации капролактама и его полимеров и олигомеров.

В настоящее время перспективными считаются методы биохимической диагностики загрязнения, в частности применение биосенсорных методов, сочетающих чувствительность методов биотестирования и операционные характеристики физико-химических сенсоров. Первый подход к созданию биосенсора для детекции капролактама в водных средах представлен в работе Риделя (Riedel), где показана принципиальная возможность получения аналитических сигналов сенсора, основанного на иммобилизованных клетках штамма - деструктора Pseudomonas putida К14 и кислородном электроде, при добавлении капролактама в измерительную ячейку [1]. Способность к окислению капролактама у большинства штаммов бактерий рода Pseudomonas контролируется конъюгативными плазмидами биодеградации капролактама - САР-плазмидами. К настоящему времени описан ряд САР-плазмид, которые отличаются по характеру детерминируемой ими способности к утилизации капролактама и его интермедиатов. Находясь в одном и том же бактериальном хозяине, они в значительной степени различаются по характеру регуляции процесса трансформации указанного ксенобиотика. Гетерогенность плазмид с точки зрения их функциональной экспрессии дает возможность конструирования практически полезных штаммов с повышенной способностью к разложению ксенобиотика;

Использование микроорганизмов в биосенсорных системах предполагает предварительный отбор- наиболее активных в отношении исследуемых субстратов- штаммов. Ранее:немецкими исследователями была показана возможность проведения скрининга микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков при помощи биосенсорных технологий (на основании оценки, их дыхательной активности в присутствии потенциальных субстратов)'[2]; Биосенсорный' подход для экспресс-оценки- окислительной активности штаммов микроорганизмов,, в том числе с разным сочетанием»; «бактериальный хозяин - плазмида», является перспективным; для исследований в области биотехнологии защиты окружающей среды.

Вопрос о биотрансформации олигомеров; капролактама изучен в меньшей степени. Описан1 ряд бактерий^ утилизирующих линейные и циклические олигомеры капролактама, показана принципиальная возможность деградации найлона-6,6 лигнинразрушающими грибами. Однако возможности применения микроорганизмов для биологической очистки сточных вод и отходов производств, содержащих олигомеры капролактама, а также для создания биосенсорных систем, в настоящее, время только исследуется.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Россинская, Ирина Владимировна

выводы

1. Разработана лабораторная модель биосенсора кюветного типа, которая позволяет проводить сравнительную оценку окислительной активности штаммов — деструкторов капролактама. Рабочие параметры биосенсорной модели на основе штамма Pseudomonas putida BS394(pBS268) составили: pH среды 7,6; концентрация солей буферного раствора 33 мМ; содержание клеток в рецепторном элементе 25 мг (по сырому весу)/мл агарового геля.

2. Впервые показана возможность, применения биосенсорного подхода для быстрого скрининга бактериальных штаммов с различными комбинациями «бактериальный хозяин — САР-плазмида». Выявлено, что на процесс утилизации капролактама большее влияние оказывает выбор бактериального хозяина. ,

3. Получены значения удельных активностей ферментных систем деградации капролактама in vivo для бактериальных штаммов-деструкторов капролактама. Наиболее высокую удельную активность наблюдали для штаммов P.putida BS394(pBS268) и P.putida BS394(pBS265): 0,17±0,02 и 0,16±0,02 мкМ/(мг-мин) соответственно.

4. Разработан и опробован на образцах производственных отходов макет биосенсора проточно-инжекционного типа на основе штамма P.putida BS394(pBS268) для анализа капролактама в водных средах. Основные характеристики биосенсорной системы: длительность единичного измерения 10 мин; нижний предел обнаружения 0,005 мМ; операционная стабильность 5,3 %; долговременная стабильность 10 суток.

5. Впервые выявлен механизм трансформации линейных олигомеров капролактама под действием бактериальных клеток, содержащих плазмиду биодеградации капролактама: окислительное переаминирование до соответствующих дикарбоновых кислот. Показана принципиальная возможность создания биосенсора для детекции линейных олигомеров в водных средах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По 'результатам литературного анализа можно заключить, что нерешенными к настоящему времени, однако имеющими важное значение для разработки экспресс-методов контроля степени очистки и методов биологической очистки отходов производств капролактама и полимерных материалов на его основе, являются следующие вопросы:

- выявление влияния видовых и штаммовых различий бактерий и комбинаторики «плазмида-бактериальный хозяин» на деградативную активность штаммов-деструкторов капролактама; поиск метода, позволяющего проводить быстрый скриннинг наиболее активных деструкторов капролактама; исследование фундаментальных закономерностей процессов биодеградации олигомеров капролактама как антропогенных поллютантов окружающей среды, в том числе механизмов приобретения микроорганизмами способности к деградации олигомеров капролактама, генетического контроля и путей деградации олигомеров бактериями различных родов;

- разработка способов оценки эффективности биотрансформации олигомеров капролактама, содержащихся в значительных количествах в промышленных отходах производств полимерных материалов.

Биосенсорные системы вследствие их экспрессности, возможности работы on-line, умеренной стоимости являются хорошей альтернативой существующим методам анализа водных сред. Количество различных типов биосенсоров как сочетаний какой-либо специфической биологической системы и определенного вида преобразователя практически неограниченно.

Биосенсоры на основе целых клеток микроорганизмов (микробные сенсоры) широко используют для экологического мониторинга объектов окружающей среды [73]. Кроме того, такие биосенсоры могут быть использованы не только для аналитических целей, но и для изучения влияния различных факторов на бактериальную клетку in vivo. Благодаря возможности применения "мягких" методов иммобилизации обеспечивается минимальное повреждение клеток микроорганизмов, что дает возможность достоверной оценки прямого воздействия внешних факторов на живые клетки [16].

Выбор бактериальных штаммов-деструкторов капролактама в качестве объекта исследования продиктован актуальностью разработки методов анализа и биологической очистки сточных вод, содержащих данный ксенобиотик. Капролактам - один из наиболее востребованных на мировом рынке и широко используемых химических продуктов, суммарные годовые мощности по его производству в СНГ в 2005 г. составили 446 тыс. тонн. Так, на территории Тульский области расположен один из пяти основных производителей капролактама в СНГ - ОАО «Щекиноазот» (мощность - 50 тыс. тонн капролактама в год).

Целью данной диссертационной работы являлось выявление закономерностей аэробной деградации капролактама и его олигомеров бактериальными штаммами с помощью биосенсорного подхода и разработка макета биосенсора для определения капролактама в водных средах.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

Ьоздать лабораторную модель биосенсорной установки, позволяющую проводить количественную оценку окислительной активности различных бактериальных штаммов - деструкторов капролактама; провести сравнительное изучение окислительной активности бактериальных штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин — САР-плазмида» с использованием биосенсорной установки;

- выявить корреляцию между параметрами градуир'овочных графиков, полученных с помощью биосенсоров на основе штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин - САР-плазмида», и удельными активностями ферментных систем in vivo этих бактериальных штаммов; предложить подход для экспресс-оценки окислительной активности микроорганизмов;

- на основе наиболее активного штамма — деструктора капролактама разработать макет микробного сенсора (биосенсора проточно-инжекционного типа) для детекции капролактама в водных средах, определить его аналитические и метрологические характеристики;

- применить разработанный макет биосенсорной установки для экспресс-оценки содержания капролактама в процессе его биологической утилизации в модельных системах и реальных образцах технологических вод и отходов производств;

- показать возможность применения биосенсорного подхода в сочетании с другими физико-химическими методами для изучения процессов микробиологической трансформации олигомеров.

В результате анализа литературных данных по микробной деградации капролактама и его производных в работе в качестве бактерий-деструкторов были выбраны представители рода Pseudomonas, для которых хорошо изучены генетический контроль и ферменты деградации данных ксенобиотиков.

В диссертационной работе, выполненной на базе Тульского государственного университета, бактерии-деструкторы капролактама рода Pseudomonas были использованы как основа лабораторной модели биосенсора, с помощью которого изучали физиолого-биохимические основы и генетический контроль процессов деградации капролактама и его олигомеров, проводили разработку макета биосенсора проточно-инжекционного типа для детекции капролактама (рис. 1.16).

Биосенсорные системы на основе бактерий-деструкторов капролактама разработка лабораторной модели биосенсора кюветного типа I выбор рабочих параметров биосенсора для детекции капрйлактама и выявление наиболее ативного штамма-деструктора изучение регуляция деградации капролактама бактериями с различным сочетанием "бактериальный хозяиин-С АР-плазм ида" исследование процесса трансформации олигомеров капролактама с помощью биосенсорного подхода разработка макета биосенсора проточио-нижекционного тина для определения содержания капролактама в водных средах оценка влияния САР-плазмиды и бактериального хозяина на регуляцию процесса утилизации капролактама выявление пути трансформации олигомеров бактриальными клетками

•о определение содержания капролактама в реальных объектах определение удельных активностей ферментных систем деградации квпррлякмфи?' установление продуктов биотрансформации; олигомеров с помощью масс-. с№КЩ>ометр ии .

Рис.1.16 Схема проводимых исследований На первом этапе проводили разработку лабораторной модели микробного сенсора кюветного типа, позволяющую проводить сравнительную оценку окислительной активности штаммов - деструкторов капролактама, В качестве основы рецепторных элементов биосенсоров использовали пять бактериальных штаммов с различным сочетанием «бактериальный хозяин - С АР-плазм ида». Были получены параметры градуировочных зависимостей биосенсоров на основе исследуемых штаммов (эффективная константа Михаэлиса, коэффициент чувствительности, предел обнаружения, линейный диапазон), которые использовали далее для сравнительной характеристики бактериальных штаммов.

Для пяти исследуемых штаммов по скорости утилизации капролактама определили удельную активность ферментных систем деградации капролактама ш vivo, что позволило выявить наиболее активный штамм-деструктор капролактама. Далее провели сравнительную оценку активностей ферментных систем и параметров градуировочных зависимостей биосенсоров. Было показано, что с помощью микробного биосенсора можно проводить экспресс-оценку активности ферментной системы, отвечающей за деградацию капролактама.

Для • биосенсора на основе бактериального штамма, показавшего на предыдущем этапе исследования наибольшую эффективность деструкции капролактама, определили рабочие параметры биосенсорной модели, такие как рН среды измерения, концентрация солей буферного раствора, содержание клеток в рецепторном элементе. Кроме того, были исследованы операционная и долговременная стабильность и селективность микробного биосенсора юоветного типа. Полученные данные послужили основой для разработки макета биосенсора проточно-инжекционного типа, который применили для анализа промышленных образцов технологических и сточных вод производств, содержащих капролактам.

На завершающем этапе изучали способность исследуемых бактерий к трансформации олигомеров капролактама — веществ, содержащихся в значительных количествах в отходах производств полимерных материалов на основе капролактама (на территории Тульской области - предприятие по производству полимерных волокон «Химволокно», г. Щекино; мощность 17,8 тыс. тонн полиамида-6 в год). Оценили возможность создания биосенсора для детекции олигомеров в водных средах. С целью выявления пути трансформации линейных олигомеров провели инкубацию линейных олигомеров с исследуемыми бактериальными клетками с последующей идентификацией продуктов трансформации методом масс-спектрометрии.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1 Биосенсорные измерения

Для определения концентрации органических соединений применяли микробные сенсоры на основе кислородного электрода, в основе работы которых лежит регистрация изменения дыхательной активности бактериальных клеток, иммобилизованных на поверхности электрода, в присутствии субстратов. Ток восстановления кислорода на платиновом катоде прямопропорционален концентрации кислорода в приэлектродном пространстве. При добавлении субстрата (например, капролактама) в измерительную кювету происходит его окисление, вследствие чего снижается концентрация Ог. При биосенсорных исследованиях регистрацию сигнала сенсора проводят, как правило, по максимальной скорости изменения силы тока и/или по величине амплитуды изменения силы тока. При этом для построения графических зависимостей используют систему координат «ответ сенсора — концентрация субстрата».

В исследованиях применяли два режима измерений: кюветный и проточно-инжекционный. Типичные отклики сенсоров (графическое отображение изменений силы тока) приведены на рис. 3.4 и 3.19. При юоветном режиме измеряемым параметром (ответом сенсора) являлась максимальная скорость изменения силы тока (нА/с), при проточно-инжекционном - амплитуда изменения силы тока (нА). I

2.1.1 Формирование рецепторного элемента

Клетки бактерий осаждали центрифугированием (8000 об/мин, центрифуга «MiniSpin» (Eppendorf, Германия), 10 мин), отмывали 33 мМ фосфатным буфером рН=7,6 (соли Na2HP04 и КН2РО4, Диа-М, Россия), сырую массу клеток разбавляли в 5 раз (по массе) буферным раствором, полученную суспензию смешивали в соотношении 1:7 с 2% агаровым гелем (агар-агар бактериологический, Диа-М, Россия), охлажденным до 50°С. Полученную смесь выдерживали при температуре 20-24 °С в течение часа до полного застывания геля и отделяли фрагмент толщиной 1 мм и диаметром 5 мм. Подготовленный биорецепторный элемент помещали на поверхность кислородного электрода (ЗАО "Кронас", Москва) и фиксировали с помощью капроновой сетки. Содержание клеток в агаровом геле составляло 25 мг сырого веса клеток/мл, что соответствует 9x10 КОЕ/мл.

2.1.2 Кюветный способ регистрации сигнала В качестве преобразователя использовали гальваностат-потенциостат 1РС2000 (ЗАО "Кронас", Москва): рабочий потенциал -700 мВ; объем кюветы 4 мл. Используемый буферный раствор - фосфатный, рН=7,6, концентрация солей 33 мМ; перемешивание магнитной мешалкой 200 об/мин; ввод пробы осуществляли автоматическими микропипетками переменного объема (20-200 мкл, 200-1000 мкл) («ЛЕНПИПЕТ», Россия).

2.1.3 Проточно-инжекционный способ регистрации сигнала Клеточное дыхание регистрировали с помощью проточно-инжекционного анализатора растворённого кислорода «БиоланЮЮ», используя кислородный электрод Кларка (ЗАО "Кронас", Москва), на I поверхности которого располагали рецепторный элемент. Рабочий потенциал -700 мВ; скорость протока 0,6 мл/мин; объём пробы 50 мкл; общее время анализа 300 секунд; 100 секунд - предпромывка системы; 100 секунд -конечная промывка системы. Для работы использовали фосфатный буферный раствор рН=7,6, концентрация солей 33 мМ.

Обработка результатов проводилась с помощью встроенной программы «Вю1ап1010».

2.2 Калибровка биосенсора При определении содержания капролактама в модельных растворах и образцах промышленных отходов биосенсорным методом в качестве референтных использовали методы тонкослойной хроматографии и фотометрии.

2.2.1 Тонкослойная хроматография Измерение концентрации капролактама проводили согласно [20]. 100 мкл анализируемой пробы разбавляли до 10 мл, подкисляли добавлением 100 мкл ледяной уксусной кислоты и экстрагировали хлороформом (х.ч.) дважды по 5 мл в течение 2 мин. Хлороформенный экстракт упаривали до5 объема 1 мл. Аликвотную часть 50 мкл наносили на пластинку силуфол с помощью хроматографического шприца. Пластинку помещали в хроматографическую камеру с подвижным растворителем (хлороформ — уксусная кислота 40:1). После окончания операции хроматографирования- пластинку извлекали из камеры, высушивали до удаления паров растворителя и проявляли спиртовым раствором нингидрина.* Затем пластинку экспонировали при 130°С в течение 301 мин. Количественное определение осуществляли по площади пятна по предварительно построенному калибровочному графику.

2.2.2 Фотометрический метод Содержание капролактама проводили фотометрическим методом с гидроксиламином согласно [72]. Отбирали 50 мл анализируемой сточной воды, переносили в колбу вместимостью 100 мл и нейтрализовали 0;1 н раствором кислоты, или щелочи. Добавляли 20 мл 3 М раствора гидрохлорида гидроксиламина, 5 мл 1 н раствора гидроксида натрия, присоединяли к колбе обратный холодильник и кипятили 30 мин. После охлаждения к раствору добавляли^,5 мл 2 н раствора соляной-кислоты, 15 мл 10% раствора хлорида железа (III) и доводили объем до 100 мл. Через 10 мин измеряли оптическую плотность при А,=500 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см. Количественное определение осуществляли по предварительно построенному калибровочному графику.

2.3 Определение удельной активности ферментной системы деградации капролактама

Удельные активности ферментных систем бактерий-деструкторов определяли по убыли концентрации капролактама при инкубации с бактериальными- клетками. Для этого в реакционный сосуд помещали суспензию клеток (концентрация клеток 190 мг сырого веса/мл, что соответствует 2x109 КОЕ/мл) в буферном растворе (33 мМ фосфатный буфер, рН=7,6), затем добавляли е-капролактам до конечной концентрации 2,5 мМ.

Общий объеме реакционной смеси' 1 мл. Измерения проводили при 20°С и постоянном перемешивании. На начальной стадии1 и через, 60 минут с ♦ момента добавления отбирали 300 мкл раствора, центрифугировали 5 мин, 12000 об/мин. В'- супернатанте определяли: концентрацию капролактама методом тонкослойной! хроматографии; [20] и биосенсорным методом. За удельную активность ферментной системы in vivo принимали изменение концентрации, субстрата за единицу времени (мин),, отнесенную к сырой" массе клеток (мг).

2:4 Практическое применение биосенсорных систем 2.4.1 Определение концентрации капролактама в образцах промышленных отходов В работе использовали образцы двух типов — технологические воды цеха' предприятия по;, производству капролактама, полученные на. предприятии, «Щекиноазот», г. Щёкино (образец №1), и капролактам-олигомерный концентрат (КОК) предприятия;но производству полимерных, волокощ предприятие «Химволокно», г. Щекино (образец №2). Концентрацию7 капролактама; в, образцах определяли с помощью биосенсора на основе P.putida BS394(pBS268), фотометрическим- методом; и методом тонкослойной хроматографии.

2.4.2. Оценка степени биодеградации капролактама в образцах промышленных отходов Для определения степени биодеградации капролактама образцы; разбавляли фосфатным- буфером так, чтобы концентрация содержащегося в них. капролактама' составляла 2 мМ; Клетки штамма-деструктора P.putida BS394(pBS268) добавляли в количестве 2,3x109 КОЕ/мл. Смесь, инкубировали при 24°С в течение 6 ч, после чего отбирали» пробы, клетки? удаляли центрифугированием, в супернатанте определяли; содержание капролактама биосенсорным методом.

2.5 Определение пути биотрансформации олигомеров

2.5.1 Оценка способности бактериальных клеток к росту на олигомерах Культивирование бактерий P.putida BS394(pBS268) проводили на жидкой минеральной среде Эванса (Е) с добавлением олигомеров капролактама в качестве единственных источников углерода и энергии. Линейные олигомеры добавляли в количестве 0,05-0,1%. Среду стерилизовали автоклавированием в течение 30 мин при 1 атмосфере. Необходимый для роста ауксотрофных штаммов цистеин добавляли в концентрации 50 мкг/мл. Культивирование культуры осуществляли на орбитальном шейкере-инкубаторе BIOSAN ES-20/60 (Латвия) при 28°С и скорости вращения 180 об/мин.

2.5.2 Инкубация бактерий-деструкторов капролактама в присутствии олигомеров

Изучение процесса трансформации олигомеров бактериальным штаммом P.putida BS394(pBS268) проводили в условиях длительной инкубации бактериальных клеток в присутствии субстрата (табл.2.1). Клетки штамма-деструктора капролактама P.putida BS394(pBS268) добавляли в фосфатный буферный раствор, содержащий 2 мМ линейного олигомера, в количестве 2,3x109 КОЕ/мл. Смесь инкубировали при 24°С в течение 24-48 ч при постоянном перемешивании.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Россинская, Ирина Владимировна, Москва

1.Riedel К., Naumov .A.V., Grishenkov V.G., Boronin A.M., Stein H.J., Scheller F., Mueller H.-G. Plasmid-containing microbial sensor for e-caprolactam // Appl. Microbiol Biotechnol. 1989. № 31. P. 502-504

2. Beyersdorf-Radeck В., Riedel K., Karlson U., Bachmann T.T., Schmid R.D.

3. Screening of xenobiotic compounds degrading microorganisms using biosensor techniques // Microbiol Res. 1998. V. 153. №3. P. 239-243 З.Овчинников В.И., Ручинский P.P. Производство капролактама. М.: Химия. 1977. 263 с. .

4. Леванова С.В., Герасименко В.И., Глазко И:Л., Соколов А.Б.,

5. Сумарченкова И.А., Канаев А.В. Синтез сложных эфиров из жидких отходов производства капролактама // Рос. Хим. Ж. (Ж. Рос. Хим.об-ва им. Д.И. Менделеева). 2006. Т.1. №3. С.37-42

6. Глазко И. Л., Леванова С. В., Канаев А. В., Сабитов С. С., Петров Г. Г.,

7. Носикова Е. А. Оптимизация стадии дистилляции, капролактама // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2006. Т. 1. № 3. С.59-64

8. Соколов А.Б., Печатников М;Г., Крижановский А.С., Петров Г.Г.

9. Комбинирование химических и биологических способов очистки капролактамсодержащих стоков // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2006. Т. 1. № 3. С.48-53

10. Наумова Р.П. Разрушение в-капролактама бактериями // Прикладнаябиохимия и микробиология. 1969. Т.5. Вып.1. С. 43-46

11. Колесов Ю.Ф. // Изв. высш. уч. заведений: Строительство иархитектура. 1971. Т.6. С. 127

12. Kulkarni R.S., Kanekar P.P. Bioremediation of e-caprolactam from nylon-6waste water by use of Pseudomonas aeruginosa MCM B-407 // Current microbiology. 1998. V. 37. P.191-194

13. Steinbechel A. Biopolymers // Matsumura S. (eds.): Vol. 9: Miscellaneous Biopolymers and Biodégradation of Synthetic Polymers. Euro: Wiley-VCH, Weinheim. 2002. 598 p.

14. П.Наумова Р.П. Микробный метаболизм неприродных соединений. Казань: Изд-во КГУ. 1985. 126 с.

15. Shama G., Wase D.AJ. The biodégradation of caprolactam and some related compounds. A review // International Biodeterioration Bulletin ISSN 0020-6164. 1981. V.17. №1. P.l-9

16. Яковлев C.B., Карелин Я.Н., Ласков Ю.М., Воронов Ю.В. Очистка производственных сточных вод. М.: Стройиздат. 1985. 333 с.

17. Мишуков Б.Г. Биологическое удаление азота и, фосфора из городских сточных вод // Вода и экология: проблемы и решения. 2004. №3. С. 1518

18. Baxi N.N., Shah А.К. Biological treatment of the components of solid oligomeric waste from a nylon-6 production plant // World Journal of Microbiology & Biotechnology. 2000. V. 16. P. 835-840

19. Baxi N.N., Shah А.К. e-Caprolactam-degradation by Alcaligenes faecalis for. bioremediation of wastewater of a nylon-6 production plant // Biotechnology Letters. 2002. V.24. P. 1177-1180

20. Churacek J., Riha J., Jurecek M. N,N-Dimethyl-p-aminobenzenazobenzoyl chloride as a new reagent for the identification of alcohols (in German) // Fresenius Z Anal Chem. 1970. V. 249. P. 120-121

21. Тихомирова Ю.М., Безвершенко В.И., Архангельский Д.Н. // Химические волокна. 1966. №6. С.37

22. A.c. 1679362 СССР, МКИ G 01 N 30/02. Способ количественного определения капролактама в водных растворах / Э.Д. Мактаз,. JI.E. Ботвинова (СССР). 4673772/25; Заявлено 4.04.89; Опубл. 23.09.91. Бюл. № 35.-2 с.

23. Воронин A.M., Грищенков В.Г., Кулаков Л.А., Наумова Р.П. Характеристика плазмиды pBS271, контролирующей деградацию в-капролактама бактериями рода Pseudomonas II Микробиология. 1986.

24. Т.55. Вып. 2. С. 231-236 »

25. МУК 4.1.1209-03. Разработаны Сотниковым Е.Е., Малышевой А.Г., Кирьяновой Л.Ф., Каменецкой Д.Б. (Москва). Газохроматографическое определение е-капролактама в воде. 2003. 7 с.

26. Сборник Н.С. Аналитический контроль производства в азотной промышленности. М.: Химия. 1986. Вып. 6. 102 с.

27. Prijambada I., Negoro S., Yomo Т., Urabe I. Emergence of nylon oligomer degradation enzymes in Pseudomonas aeruginosa РАО through experimental evolution // Applied and Environmental Microbiology. 1995. V.61. №5. P.2020-2022

28. Kulkarni R.S., Kanekar P.P. Effect of some curing agents on phenotypic stability in Pseudomonas putida degradation e-caprolactam // World Journal of Microbiology and Biotecnology. 1998. V. 14. P. 255-257

29. Беспамятнов Г.П. Кротов Ю.А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде: Справочник. Д.: Химия, 1985. 528 с.

30. Грищенков В.Г., Аминов Р.И., Воронин A.M. Конкурентные взаимодействия в смешанных культурах изогенных штаммов Pseudomonas putida В S394, несущих четыре разные природные плазмиды утилизации капролактама // Микробиология. 1993. Т.62. Вып.З. С. 460-468

31. Есикова Т.З., Грищенков В.Г., Воронин A.M. Плазмиды деградации капролактама // Микробиология. 1990. Т.59. Вып. 4. С. 547-552

32. Есикова Т.З., Грищенков В.Г. Регуляция экспрессии плазмидных детерминантов, ответственных за деградацию капролактама бактериями рода Pseudomonas II Микробиология. 1992. Т.61. Вып.5. С.843-851

33. Kinoshita S., Okada H. Degradation of e-caprolactam by subcellular fraction of Achromobacter guttatus II J. Ferment. Technol. 1973. V.51. P. 753-756

34. Negoro S. Biodégradation of nylon oligomers // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. V. 54. P. 461-466

35. Shevtsova I.I. The use of caprolactam by yeasts // Visn. Kiyyiv. Univ. Ser. Biol. 1969. V. 11. P. 149-151

36. Наумова Р.П., Голованова Э.В., Губернаторова В.А., Волков Б.В. Контроль биохимической очистки стоков производства капролактама // Вест. техн. и экон. информации. 1963. №8. С. 30

37. Fukumura Т. Bacterial breakdown of e-caprolactam and its cyclic oligomers // Plant Cell Physiol. 1966. V.7. P. 93-104

38. Наумова Р.П. Изучение превращения капролактама бактериями // Итоговая научная аспирантская конференция: Тезисы докладов. Казань. 1964 г. 65 с.

39. Наумова Р.П. Превращение капролактама бактериями: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Казань. 1966. 30 с.

40. Kinoshita S., Kageyama S., Iba К., Yamada Y., Okada H. Utilisation of cyclic and linear oligomers of e-aminocapronic acid by Achromobacter guttatus KI72 // Agr. Biol. Chem. 1974. V.39. №6. P. 1219-1223

41. Наумова Р.П., Белов И.С. Превращение s-аминокапроновой кислоты при бактериальном разрушении капролактама // Биохимия. 1968. Т.ЗЗ. С. 946

42. Boronin A.M., Naumova R.P., Grishchenkov V.G., Ilijunskaya O.N. Plasmid specifying e-caprolactam degradation in Pseudomonas strains // FEMS Microbiol. Lett. 1984. V. 22. P. 167-171

43. Davey J.F., Trudgill P.W. The metabolism of trans-cyclohexan-1,2-diol by an Acinetobacter species 11 Eur. J. Biochem. 1977. V.74. P. 115-127

44. Есикова Т.З. Плазмиды биодеградации s-капролактама бактерий рода Pseudomonas: Дисс. канд. биол. наук. Пущино. 1990. 133 с.

45. Esikova T.Z., Grishchenkov V.G., Kulakov L.A., Morenkova M.A., Boronin A.M. Incompatibility groups of epsilon-caprolactam biodégradation plasmids from bacteria of Pseudomonas genus // Mol Gen Mikrobiol Virusol. 1990. №4. P. 25-33

46. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. Пер. с англ. Петровой Т.А., Позмоговой И.Н./ Под ред. Работновой И.Л. М.: Мир. 1978. 325 с.

47. Наумова Р.П., Есикова Т.З., Ильинская О.Н. Метаболизм капролактама у псевдомонад в связи с его плазмидной обусловленностью //Микробиология. 1988. Т.57. Вып. 3. С. 426-430

48. Herai S., Hashimoto Y., Higashibata'Н., Maseda H., Ikeda H., Omura S., Kobayashi M. Hyper-inducible expression system for streptomycetes // Applied Biological Sciences. 2004. V. 101. №39. P. 14031-14035

49. Литвиненко Л.А., Петрикевич С.Б., Кравчук A.B., Грищенков В.Г. Катаболизм капролактама и' его интермедиатов производными штамма Pseudomonas putida В S394, содержащими различные сар-плазмиды //Микробиология. 1993. Вып.З. С. 447-452

50. Kinoshita S., Muranaka М., Okada Н. // J. Ferment. Technol. 1975. V. 53. 223-229

51. Deguchi Т., Yoshihisa К., Kakezawa M., Nishida T. Purification and characterization of a nylon-degrading enzyme // Appl Environ Microbiol. 1998. V. 64. №4. P. 1366-1371

52. Fukumura T. Hydrolysis of cyclic and linear oligomers of 6-aminocaproic acid by a bacterial cell extract // Journal of Biochemistry. 1966. №59. P. 531-536

53. Negoro S., Taniguchi Т., Kanaoka M., Kumura H., Okada H. Plasmid-determined enzymatic degradation of nylon oligomers // J. Bacteriol. 1983. V. 155. P. 22-31

54. Tsuchiya K., Fukuyama S., Kanzaki N., Kanagawa K., Negoro S., Okada^ H. High homology between 6-aminohexanoate-cyclic-dimer hydrolases of Flavobacterium and Pseudomonas strains // J. Bacteriol. 1989. V. 171. P. 3187-3191

55. Negoro S., Shinagawa H., Nakata A., Kinoshita S., Hatozaki Т., Okada H. Plasmid control of 6-aminohexanoic acid cyclic dimer degradation enzymes of Flavobacterium sp. strain KI72 // J. Bacteriol. 1980. V. 143. P. 238-245

56. Obst M., Steinbüchel A. Microbial degradation of Poly(aminoacid)s // Biomacromolecules. 2004. №5. P. 1166-1176

57. Kinoshita S., Terada T., Taniguchi T., Takene Y., Masuda S., Matsunaga N., Okada H. Purification and characterization of 6-aminohexanoic acid oligomer hidrolase of Flavobacterium sp. KI72 // Eur. J. Biochem. 1981. V.116. P.547-551

58. Kato K., Fujiyama K., Hatanaka H., Prijambada I., Negoro S., Urabe I., Okada H. Amino acid alteration essential for increasing the catalytic activity of nylon-oligomer-degradation enzyme of Flavobacterium sp. II Eur. J. Biochem. 1991. V.200. P. 165-169

59. Okada H., Negoro S., Kumura H., Nakamura S. Evolutionary adaptation ofplasmid-encoded enzymes for degrading nylon oligomers // Nature. 1983.1. V.306. №10. P. 203-206

60. Kanagawa K., Oishi M., Negoro S.5 Urabe I., Okada H. Characterisation of the 6-aminohexanoate-dimer hydrolase from Pseudomonas sp. NK87 // J. Gen. Microbiol1. 1993 V. 139. P. 787-795

61. Fukumura T., Takeuchi M.5 Banno I. Stepwise loss of e-aminicaproic acid cyclic dimer in Alcaligenes species D-2 // European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology. 1982. V. 14. P. 120-124

62. Yasura K.5 Uedo Y., Takeo M.5 Kato D., Negoro S. Genetic organization of nylon-oligomer-degrading enzymes from alcalophilic bacterium,

63. Agromyces sp. KY5R // J. of bioscience and bioengineering. 2007. V.104. № 3. P.521-524.

64. Kinoshita S., Negoro S., Muramatsu M., Bisaria V.S., Sawada S., Okada H. 6-aminohexanoic acid cyclic dimmer hydrolase: A new cyclic amide hydrolase produced by Acromobacter gyttatus KI72 // Eur. J. Biochem. 1977. V. 80. P. 489-495

65. Kawai F. Sphingomonads involved in biodégradation of xenobiotic polymers // Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 1999. V. 23. P. 400-407

66. Kawai F. Microbial aspects of the degradation of water-soluble synthetic polymers//Macromol Symp. 1997.V. 123. V. 177-187

67. Гершкович А.А., Кибирев В.К. Синтез пептидов. Реагенты и методы. -Киев: Наукова думка. 1992. 360 с.

68. Dunn H.W., Gunsalus I.C. Transmissible plasmids coding early ensymes of naphthalene oxidation in Pseudomonas putida II J. Bacteriol. 1973.V.114. P. 974-979

69. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.W. The continuous cultivation of microorganisms: II. Construction of a chemostat // Methods Microbiol. 1970. V.2. P.277-327

70. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. — М.:Химия. 1984. 448 с.

71. Решети лов А.Н. Биосенсоры в России: монография / А.Н. Решетилов, В.А. Алферов, Т.А. Решетилова, О.Н. Понаморева. Тула: Изд-во ТулГУ. 2007. 111 с.

72. Спицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: Изд-во МГУ, 1994.-288 с.

73. Борисов И.А. Лобанов А.В., Решетилов А.Н., Курганов Б.И. Количественный анализ калибровочных зависимостей биосенсоров // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. №3. С. 256-262

74. Matsushita К., Hiroaki Ebisuya, M. Ameyama, O.Adachi. Change of the terminal oxidase from cytochrom al in shaking culture to cytochrom о in static culture of Acetobacter aceti II Journal of bacteriology. 1992. V.174. N.l.P. 122-129

75. Yasui Y., Suneya Y., Mori A. Behavour of acetic acid bacteria grown in surface culture toward oxygen // J. Ferment. Technol. 1978. V. 56. P. 266272

76. Пуста K.A., Решетилов A.H. Физиолого-биохимические особенности Gluconobacter oxydans и перспективы использования в биотехнологии и биосенсорных системах // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т. 34. N4. С. 339-353

77. Современная микробиология. Прокариоты. Под ред. Й.Ленгеля, Г. Древса и Г. Шлегеля. Т.1 М.: Мир. 2005

78. Биотехнология: Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов / Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. М.:Высш.шк. 1987 - 143 с.