Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и их технологическое использование при изготовлении чумных иммунобиологических препаратов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Синтез композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и их технологическое использование при изготовлении чумных иммунобиологических препаратов"

На правахрукописи

ГРЯДСКИХДИАНААНАТОЛЬЕВНА

СИНТЕЗ КОМПОЗИЦИОННЫХ АФФИННЫХ СОРБЕНТОВ С МАГНИТНЫМИ СВОЙСТВАМИ И ИХ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ ЧУМНЫХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь - 2004

Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Тюменцева Ирина Степановна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук

Кузякова Людмила Михайловна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Чижова Людмила Николаевна

Ведущая организация: Северо-Кавказский государственный

технический университет

Защита состоится 7 июля 2004 года в 1200 на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.04 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корпус 2, ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета по адресу: 355009, г.Ставрополь, ул. Пушкина, д.1, корпус 1.

Автореферат разослан « у » июня 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Т.И. Джандарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На современном этапе развития биотехнологии весьма актуальными являются исследования, направленные на решение проблемы разработки высокоэффективных методов экспресс-диагностики особо опасных инфекций и индикации их возбудителей. Для достижения цели широко используют методы твердофазного иммунохимического анализа, основанные на применении магноиммуносорбентов.

Перспективно практическое использование магнитоуправляе-мых адсорбционных материалов для иммобилизации микроорганизмов в качестве инокулята при глубинном аппаратном культивировании. Разработка данной технологии обеспечивает получение биологически активных компонентов, которые необходимы на последующих этапах при конструировании диагностических тест-систем применяемых в иммуноанализе микроорганизмов.

Научно-практический интерес в данном направлении связан с повышением чувствительности, специфичности и достоверности иммунохимической диагностики особо опасных инфекций, что во многом определяется качественными показателями магносор-бентов. В настоящее время существуют проблемы с оптимизацией компонентного состава органокремнеземных композиционных сорбентов, а также весьма интересен аспект количественного регулирования магнитных свойств данных сорбционных материалов. Решение указанных проблем открывает возможности создания новых высокоэффективных диагностических тест-систем, применяемых в медицине и ветеринарии.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось системное решение научных проблем получения композиционных аффинных сорбентов и их технологическое использование при изготовлении чумных иммунобиологических препаратов.

При выполнении работы предстояло решить следующие задачи:

1. Разработать технологию хитозанкремнеземных сорбентов, исследовать их состав и физико-химические свойства;

2. Получить элементоксидные кремнеземные сорбенты с заданным составом и строением;

3. Исследовать и установить наиболее эффективные методы иммобилизации белковых лигандов на поверхности композиционных магносорбентов;

ЮС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

4. Исследовать иммобилизацию на композиционных магносор-бентах живых бактериальных клеток вакцинного штамма чумного микроба и разработать технологические этапы глубинного культивирования микроорганизмов штамма ^ pestis EV;

5. Разработать технологические аспекты конструирования твердофазных тест-систем для диагностики чумы и индикации ее возбудителя методом иммуноферментного анализа.

Научная новизна работы. Впервые разработана технология получения магноиммуносорбентов методом формирования пористой структуры кремнеземной матрицы в присутствии хитозана, аэросила А-380 и оксалата железа. Установлено, что в процессе синтеза сорбента образование магнетита осуществляется при разложении оксалата железа, и активирующее воздействие данного процесса приводит к увеличению объема пор сорбентов до величины 1,55-1,63 см3/г.

Впервые количественно исследованы магнитные свойства композиционных магносорбентов, получаемых методом формирования пористой кремнеземной матрицы в присутствии аэросила А-380, хитозана и магнетита, и определено, что величина удельной намагниченности насыщения возрастает с увеличением содержания магнетита в составе сорбентов.

Иммобилизацией на поверхности композиционных хитозан-кремнеземных магносорбентов чумных иммуноглобулинов получены магноиммуносорбенты и установлено, что показатели их чувствительности, специфичности определяются стандартностью структурных характеристик сорбентов, ковалентным способом связывания лигандов.

На основе разработанных композиционных магноиммуносорбентов (КМИС) сконструированы диагностические тест-системы для экспресс-диагностики чумы и индикации ее возбудителя, которые в иммуноферментном анализе характеризуются чувствительностью 1 • 102 м.к./мл по корпускулярным антигенам. Магноимму-носорбенты по чувствительности в иммуноферментном анализе (ИФА) по сравнению с применением полистироловых планшет превосходят известный метод более чем в 1000 раз, и при этом время постановки ИФА сокращается в 6-7 раз.Тест-системы сохраняют стабильность без потери активности в течение 1 года (срок наблюдения).

Проведены исследования по иммобилизации на разработанных композиционных магносорбентах живых бактериальных клеток'

вакцинного штамма чумного микроба, изучены технологические возможности использования иммобилизованной формы инокуля-та для глубинного аппаратного выращивания биомассы вакцинного штамма ^ pestis EV.

Практическое значение работы. На основе разработанных композиционных хитозанкремнеземных сорбционных материалов с магнитными свойствами сконструированы твердофазные тест-системы для экспресс-диагностики чумы и индикации ее возбудителя в иммуноферментном анализе, которые успешно апробированы в лабораторных и полевых условиях.

Методические приемы аппаратного культивирования ^ pestis EV с применением МИС-инокулята изложены в одобренных ученым советом (протокол № 3 от 29.03.04 г.) и утвержденных директором Ставропольского научно-исследовательского противочумного института методических рекомендациях «Глубинное культивирование вакцинного штамма чумного микроба с использованием магнито-управляемых иммобилизованных систем».

Технология получения композиционных хитозанкремнеземных магносорбентов прошла промышленную апробацию в производственных условиях в специализированном ЗАО НПФ «Люминофор», что подтверждено соответствующим актом.

Практическая значимость и приоритетность выполненных исследований подтверждена выдачей дипломов 1 степени за разработку диагностической тест-системы, присужденных на выставках: Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология 2003» в г. Сочи, а также на Всероссийской конференции «Новейшие технологические решения и оборудование» в г. Кисловодске в 2004 году.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Разработка технологии получения композиционных хитозан-кремнеземных магносорбентов методом формирования пористой структуры кремнеземной матрицы с образованием в процессе синтеза магнитного компонента из оксалата железа. Получение и исследование элементсодержащих сорбционных материалов.

2. Результаты количественных характеристик магнитных свойств магносорбентов с установлением закономерности возрастания удельной намагниченности насыщения, с увеличением содержания магнетита в составе сорбентов.

3. Разработанные условия иммобилизации на композиционных сорбентах живых бактериальных клеток вакцинного штамма чумного микроба и технологических этапов глубинного культивирования.

4. Разработка методами иммобилизации чумных иммуноглобулинов и антигенов магноиммуносорбентов и конструирование на их основе высокочувствительных тест-систем для диагностики чумы и индикации ее возбудителя методом ИФА.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научно-практических конференциях: в Ставропольском НИПЧИ, 2002, 2003 гг.; Международной конференции «Повестка дня на XXI век: программа действий — экологическая безопасность и устойчивое развитие» (Ставрополь, 2002 г.).; Всероссийской конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2002 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2002 г.); Всероссийской конференции «Биотехнология 2003» (Сочи, 2003 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 20 рисунков, приложения. Состоит из введения, обзора литературы, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 218 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При выполнении работы были использованы 14 штаммов микроорганизмов I, Ш и IV групп патогенности видов Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli.

Для синтеза композиционных кремнеземных сорбентов использовали аэросил А-380 (ГОСТ 14922-77 х.ч.) с содержанием основного вещества SiO2 — 99%; в качестве модификатора — хитозан Mw = 200000, степенью дезацетилирования 0,8 и степенью кристалличности 75% (завод им. Войкова, Москва); в качестве магнитного компонента применяли магнетит (Fe3O4).

В опытах использовали 50 белых мышей и 10 кроликов породы «Шиншилла».

Контроль общей и специфической стерильности проводили бактериологическим и биологическим методами согласно СП 1.2.011-94.

Фракцию 1 (Ф1) чумного микроба из бакмассы получали по Е.Е. Baker et al. (1952); Ф1 из культуральной жидкости изолировали методом изоэлектрической преципитации (Титенко М.М., Вейн-блат В.И., Веренков М.С., Васенин А.С., 1983).

Водорастворимый белковый антигенный комплекс чумного микроба изолировали по схеме Е.Н. Афанасьева (2000).

Иммунизацию кроликов проводили по схеме, разработанной И.С. Тюменцевой (1996).

Постановку иммунодиффузии в агаровом геле проводили по методике О. Ouchterlony (1949).

Иммуноглобулины из гипериммунных чумных кроличьих сывороток выделяли фракционированием каприловой кислотой по методу (Steibuch G., Andran P., 1969).

Непрямой метод окраски чумного микроба флуоресцирующими иммуноглобулинами осуществляли по методу Т.Н. Weller, А.Н. Coous (1954).

Иммунопероксидазные чумные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по методике Р.К. Nakane, A..Kawaoi (1974) с использованием иммуноглобулинов G (Ig), выделенных из чумной гипериммунной кроличьей сыворотки крови. '

Количество белка в биопрепаратах определяли спектрофотомет-рически на СФ-46 (Warburg О., Christian W., 1941).

Удельную поверхность сорбентов определяли по низкотемпературной адсорбции азота, используя методику А.А. Клячко-Гурвича (1961). Объем пор и их распределения по размерам — методом ртутной порометрии (Плаченов Т.Г., 1965).

Микроструктуру сорбентов исследовали на сканирующем электронном микроскопе IMZ—T3000 при увеличении в 10000 раз (Фрайфельдер Я., 1980).

Спектроскопию сорбентов в УФ-области проводили в отраженном диффузно-рассеянном свете в диапазоне 290—700 нм на приборе AQV-50 «Shimadzu» (Япония) (РусинГ.Г., 1990). ИК-спектры сорбентов исследованы на спектрофотометре Specord-75IR (Германия) в диапазоне волновых чисел 500-4000 см-1. Идентификацию поверхностных функциональных групп сорбентов проводили используя корреляционную диаграмму отнесения полос поглощения основных групп и связей (Киселев А.В., 1972).

При анализе элементоксидных слоев сорбентов проводили определение титана, алюминия, циркония (Нечипоренко А.П., Шевченко Г.К., Кольцов СИ., 1981), гидроксильных групп сорбентов (Кольцов СИ., Кузнецова Г.Н., Алесковский В.Б., 1967).

С целью подтверждения достоверности и воспроизводимости результатов, полученных при экспериментальных исследованиях, применяли математические методы (Зайцев Т.Н., 1991).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез композиционных магноиммуносорбентов и исследование их свойств

Целью начального этапа исследований явилось получение ферромагнитных сорбентов, обладающих заданным составом, адсорбционными и магнитными свойствами, для использования их при проведении иммуноанализа микроорганизмов на основе ИФА. Другой задачей было исследование возможности использования маг-нитоуправляемых сорбционных материалов для глубинного культивирования вакцинного штамма чумного микроба.

Синтез магносорбентов с высокой сорбционной активностью осуществлен методом формирования пористой структуры носителя в присутствии полисахарида хитозана. Синтезы элементсодержа-щих сорбентов проведены методами молекулярного наслаивания и деструкционно-эпитаксиального осаждения.

Непористый кремнезем-аэросил использован в качестве основного структурного компонента, формирующего остов композиционного сорбционного материала, имеющего развитую пористую структуру.

В качестве органического компонента синтеза применяли 3% раствор хитозана в 3% уксусной кислоте. Хитозан представляет собой полимер с цепью р—1—4—соединенных— 2—ацетамид—2—дезокси—2— глюкозных остатков. Благодаря своей химической природе, хитозан способен к образованию 4 основных типов связей: ионных, водородных, гидрофобных, связей по типу комплексообразования. В качестве магнитной составляющей при синтезе применялся магнетит (Fe3O4, кроме этого разработан способ получения магносорбентов путем введения на стадии получения гидрогеля оксалата железа (II).

Схема получения магноиммуносорбентов включает 8 стадий и представлена на рисунке 1.

Стадии 1—3 характеризуют процесс синтеза магносорбента на основе формирования пористой структуры органокремнеземной матрицы в присутствии компонентов синтеза.

На стадии 1 за счет протекающих процессов конденсации с участием силанольных групп кремнезема — аэросила образуется гидрогель. На стадии 2 при созревании и синерезисе гидрогеля протекают дегидратационные процессы, что приводит к уменьшению объема гидрогеля, его уплотнению.

На стадии 3 при термообработке гидрогель превращается в ксе-рогель, при этом объем его уменьшается в 8-15 раз, благодаря дей-

ствию капиллярных сил. На стадиях 4—8 завершается процесс синтеза композиционных магносорбентов, обеспечивающий выделение высокодисперсной фракции, получение стерильного сорбци-онного материала, а также его активирование функциональными группами с последующей иммобилизацией лигандов.

Стадия 1

Стадия 2

Стадия 3 Стадия 4 Стадия 5 Стадия 6

Стадия 7

Стадия 8

Рисунок 1. Схема получения магноиммуносорбентов

Структура композиционных сорбентов представлена корпускулярной системой, которая состоит из частиц кремнезема, покрытых полимером — хитозаном. Размер корпускул определяет величину удельной поверхности, а плотность их упаковки — объем и радиус пор. Механизм образования пористых хитозанкремне-земных магносорбентов можно представить как сложный процесс, сопровождающийся формированием корпускулярной структуры кремнеземного остова из непористых частиц аэросила А-380 и включением в него органического полимера хитозана и магнетита.

Проведены исследования структурных характеристик магносорбентов. Методом, основанным на низкотемпературной сорбции азота, была определена удельная поверхность сорбционных материалов. Суммарный объем пор и диаметр пор определены методом ртутной порометрии на приборе AYTO PORE 9200.

В таблице 1 представлены структурные характеристики сорбентов, полученных методом формирования пористой структуры кремнеземной матрицы в присутствии органического полимера хитоза-на и использовании магнетита.

Таблица 1. Характеристики магносорбентов в зависимости от количества магнетита, используемого в синтезе

Наименование образца Массовое соотношение компонентов синтеза Время гелеобра-зования, ч Удельная поверхность, м2/г Объем пор, см5/г Диаметр пор, нм

SiCb Fe304 Хитозан

МХКС2.5 5 2,5 1,5 4 68 1,5 35

МХКС,,5 5 1,5 1,5 4 74 1,4 32

МХКСо.5 5 0,5 1,5 4 82 U 26

Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что при увеличении количества магнетита, вводимого в компонентный состав сорбента, наблюдается некоторое снижение величины удельной поверхности сорбентов и увеличение объема пор.

В таблице 2 представлены структурные характеристики хитозан-кремнеземных магносорбентов, полученных методом формирования пористой структуры кремнеземной матрицы в присутствии полимера хитозана и оксалата железа.

Таблица 2. Характеристики магносорбентов в зависимости от количества оксалата железа, используемого в синтезе

Наименование образца Массовое соотношение компонентов синтеза Время преобразования, ч Удельная поверхность, м2/г Объем пор, см3/г Диаметр пор,нм

^Ог Хитозан Оксалат железа

МХКСз 5 1.5 3 4 70 1,63 37

МХКС2.5 5 и 2,5 4 73 1,55 34

МХКСг 5 1,5 2 4 78 1,35 .30

При сравнительном анализе данных таблиц 1 и 2 следует отметить, что с использованием в качестве компонента для синтеза сорбентов оксалата железа получаемые магносорбенты имеют несколько меньшую удельную поверхность и большее значение объема пор. Это объясняется, по-видимому, разрыхляющим и активирующим влиянием газообразных продуктов, выделяющихся при разложении оксалата железа, с образованием БеО, далее Ре203 и магнетита.

В последующем проведены исследования по количественной оценке магнитных свойств разработанных композиционных магносорбентов. При этом использовали вибрационный метод. Для определения магнитных свойств сорбент закреплялся на конце тонкого стержня из немагнитного материала, который с помощью цангового зажима соединялся с вибрационной системой, приводящей образец в колебательное движение. Образец магносорбента располагался между четырьмя измерительными катушками, которые неподвижно закреплялись на полюсах электромагнита. Магнитный момент сорбента определяли по магнитному моменту эталона — пластинки из никеля.

Результаты исследований, представленные в таблице 3, свидетельствуют, что величина удельной намагниченности насыщения возрастает с увеличением содержания магнетита в составе композиционных хитозан крем неземных сорбентов.

Таблица 3. Магнитные свойства хитозанкремнеземных магносорбентов

Наименование образца Массовое соотношение компонентов синтеза Удельная поверхность, м2/г Удельная намагниченность насыщения, МН, Л х м2/кг

5Ю2 Хитозан Ье,04

МХКС25 5 1,5 2,5 68 17,4

МХКС,.5 5 1,5 1,5 74 10,2

МХКСо.; 5 1,5 0.5 82 4,3

На сканирующем электронном микроскопе 1М7-Т3000 проведены исследования микроструктуры полученных композиционных магносорбентов по сравнению с известными кремнеземными материалами, такими как макропористое стекло МПС 200 ВГХ, си-лохром С-120 и гидротермальный силохром.

Для силохрома С-120 характерна однородная глобулярная структура с размером сросшихся корпускулярных частиц оксида кремния около 20 нм. В отличие от силохрома, топография поверхности макропористого стекла представлена губчатой структурой. Измененную глобулярную структуру имеет композиционный хитозанкремнеземный сорбент. Особенностью его структуры является сочетание обширных участков аморфных образований с губчатой структурой.

Разработана технология получения элементсодержащих кремнеземных сорбентов на основе аэросила А-380 методом деструкцион-но-эпитаксиального осаждения (ДЭО), с использованием аэросила А-380 и растворов солей: сульфатов железа, кобальта, магния, меди.

Количественный химический анализ полученных сорбентов подтвердил образование поликремневых солей химических элементов, таких как медь, магний, марганец, кобальт.

По данным спектров диффузного отражения, выполненных на приборе ЛрУ-50 «БЫша^и», наиболее активное влияние химического модифицирования кремнеземного сорбента проявилось в спектральной области 250—400 нм. Спектр диффузного отражения кремнеземов, имеющих в составе кальций и магний, близки к спектру аэросила А-380. Хромофорные металлы, содержащиеся в элементсодержащих кремнеземах, приводят к резкому увеличению поглощения в спектральной области 250—400 нм, причем кобальт и марганец дают широкую полосу поглощения, а медь способствует сдвигу полосы поглощения в коротковолновую область. Полученные результаты по спектрам диффузного отражения, на наш взгляд, можно использовать для оптимизации условий синтеза элементсодер-жащих сорбентов, их идентификации.

Проведены исследования кислотных свойств поверхности композиционных сорбентов, полученных методом формирования пористой структуры кремнеземной матрицы в присутствии полимера хитозана, а также элементсодержащих сорбентов, синтезированных методом деструкционно-эпитаксиального осаждения.

В таблице 4 представлены данные по кислотным свойствам элемент-кремнеземных сорбентов, полученных методом деструкци-онно-эпитаксиального осаждения содержащих, медь-, кобальт-,

жслезооксидныс слои. Синтез элементсодержащих кремнеземных сорбентов методом деструкционно-эпитаксиального осаждения, в отличие от общеизвестных методов синтеза твердых веществ, протекает не путем хаотичного междуатомного и межмолекулярного взаимодействия, а путем переноса и закрепления на заранее подготовленной поверхности каждый раз только одних, избранных структурных единиц. Данным методом по оригинальному синтезу получены магносорбенты, обладающие магнитными свойствами.

Таблица 4. Расчет концентрации Бренстедовских кислотных центров и констант равновесия ионного обмена для сорбентов

№ п/п Наименование сорбента В0х 10'3 мг-экв/м2 Кср. х 10"5

1 Аэросил А-380 1,1 1,02

2 Аэросилогель Со 0,74 0,63

3 Аэросилогель Ие 0,78 0,71

4 Аэросилогель А1 1,2 1,12

5 Аэросилогель Си 0,64 0,7

6 ♦ФХКС и 0,84

*ФХКС — фсррохитозанокремнезсмный сорбент.

Таким образом, в результате проведенных исследований получен набор композиционных сорбентов с оптимизированным составом и структурными характеристиками, изучены их спектральные характеристики, микроструктура поверхности, кислотные свойства, что позволяет целенаправленно использовать сорбционные материалы для последующего получения на их основе специфичных иммуносорбентов.

С целью дальнейшего активирования композиционных сорбентов функциональными группами нами разработаны три варианта модифицирования носителей: бензохиноновый, окислением перхлоратом натрия, глутаровым альдегидом.

Для получения магноиммуносорбентов проведены исследования по иммобилизации чумных иммуноглобулинов на поверхности носителей, активированных указанными методами.

Иммобилизацию чумных иммуноглобулинов на поверхности магносорбентов проводили следующим образом: к 0,2 мл 10% взвеси магносорбента приливали 1 мл ^ G, варьируя количество белка от 0,5 до 10 мг/мл, ковалентное связывание проводили в течение 1—24 часов, при температуре 5°С; 22°С и 38°С.

Проведены исследования по установлению значений констант иммобилизации чумных иммуноглобулинов на магносорбентс, активированном методом окисления и содержащим альдегидные группы. Значение константы иммобилизации равно 0,93х10"3 мин1.

Для оптимизации условий получения магноиммуносорбентов проведены исследования влияния таких факторов, как температура, значение рН раствора иммуноглобулинов на свойства маг-ноиммуносорбентов, специфическую активность и чувствительность.

Результаты, представленные в таблице 5, свидетельствуют, что максимальная адсорбционная емкость композиционных магно-сорбентов наблюдается при температуре 5°С и 22°С. Повышение температуры до 55°С в процессе иммобилизации иммуноглобулинов приводит к снижению уровня специфической активности и чувствительности композиционных сорбентов, применяемых в ИФА.

Таким образом, в соответствии с экспериментальными данными, оптимальными факторами, которые обеспечивают получение иммуносорбентов, обладающих высоким уровнем специфической активности и чувствительности, являются следующие: время иммобилизации специфических иммуноглобулинов 1,5 часа при значении рН раствора белка 7 и температуры от 5° до 22°С.

На основе хитозанкремнеземных сорбентов, активированных бензохиноном и окислением с помощью перхлората натрия, разработаны эффективные композиционные магноиммуносорбенты, имеющие преимущества по уровню чувствительности и специфичности, технологичности получения перед глутаральдегидным методом получения активированных сорбционных материалов.

Таблица 5. Зависимость чувствительности хитозанкремнеземных композиционных магноиммуносорбентов от количества

иммобилизованного белка и температуры при иммобилизации лиганда

Наименование иммуноглобулинов Температура иммобил. белка, °С Количество иммобилизованного белка, % Бремя иммобилизации, ч. Чувствительность М.К./МЛ

5 68 1,5 102

22 65 1,5 102

Чумные 37 65 1,5 102

55 26 1,5 103

Таблица 6. Чувствительность композиционных чумных магноиммуносорбентов

Значение рН иммуноглобулинов Метод синтеза КМИС Чувствительность м.к./мл

9,0 БХА ГХА АХА 10* 103 102

7,0 БХА ГХА АХА 102 104 102 .

5,5 БХА ГХА АХА и? 103 10г

7,0 FeKC 10»

БХА — бензохинонхитозаноаэросилогель;

ГХА—глутара1ьхитозаноаэросилогель;

АХА — альдегидохитозаноаэросилогель

БеКС — железокремнезсмный элементсодержащий сорбент

Разработанные магноиммуносорбенты сохраняли стабильность свойств при хранении (4°С) в течение 1 года (срок наблюдения).

Вышеизложенные научные разработки легли в основу заявки на изобретение № 2003136322/15 «Способ получения иммуносорбента» (положительное решение формальной экспертизы ФИПС от 13.01.04г).

Таким образом, разработана технология получения магноиммуносорбентов иммобилизацией на поверхности хитозанкремнеземных материалов чумных иммуноглобулинов и установлено, что показатели их чувствительности, специфичности определяются стандартностью структурных характеристик сорбентов, методом иммобилизации лиганда.

Использование магнитоуправляемых иммобилизованных систем для глубинного культивирования вакцинного штамма чумного микроба

Одним из современных направлений научных исследований в области биотехнологии является использование иммобилизованных клеток. Иммобилизация биообъекта способствует увеличению продуктивности и производительности биотехнологического процесса, стабилизации свойств продуцента, возможности использования и быстрого удаления микробиологической системы из зоны

культивирования (Егоров Н.С., Олескин А.В., Самуилов В.Д., 1987; Синицын А.П.,Райкина Е.И., Лозинский В.Н. и др., 1994;

Владимцева И.В., 2002; КаШи I., 1987). Магнитное манипулирование микроорганизмами — продуцентами, фиксированными на магнитных носителях, весьма перспективно, однако до настоящего времени разработке этих технологий уделялось мало внимания. Это и определило характер следующего направления наших исследований: изучение возможности и эффективности использования хитозанкремнеземного магноиммуносорбента для глубинного культивирования вакцинного штамма У. ре8Й8 ЕУ. Лигандом для получения МИС служили иммуноглобулины О, выделенные из гипериммунной кроличьей сыворотки крови, полученной при иммунизации животных водорастворимыми антигенами, изолированными из биомассы У. ре8Й8 ЕУ, выращенной при 28°С. Для получения иммобилизованных на магнитном носителе бактериальных клеток использовали производственную культуру вакцинного штамма У. ре8Й8 ЕУ. После контакта микробных клеток с магнитным носителем происходила прочная иммобилизация чумного микроба на поверхности магнитоуправляемого хитозан-кремнеземного иммуносорбента на основе реакции «антиген-антитело».

Магноиммуносорбент с фиксированными микробными клетками вносили в лабораторный ферментер (ЬКБ, Швеция) и использовали в качестве инокулята, который удерживали на соленоиде путем создания электромагнитного поля. Для выращивания микробной взвеси в ферментере в качестве питательной среды использовали бульон Хоттингера рН 7,2, инкубирование проводили при температуре 28°С с дискретным добавлением глюкозы согласно регламенту производства РП №702-97.

Контролем служило глубинное культивирование У.ре8Й8 ЕУ по методике периодического выращивания в ферментере без иммобилизованного сорбента.

Анализируя динамику накопления биомассы производственного штамма У.ре8Й8 ЕУ в процессе глубинного культивирования с использованием магнитоуправляемых иммобилизованных систем, можно отметить, что при первом выращивании 1а§-фаза в среднем длилась 8-9 часов, после чего наступала экспоненциальная фаза, во время которой отмечались интенсивный рост и размножение клеток. Через 18-20 часов наступала стационарная фаза роста, в начале которой производили слив культуральной жидкости, оставляя со-

леноид в рабочем состоянии. В сосуд заливали свежую порцию бульона Хоттингера и проводили повторное выращивание биомассы, не внося дополнительное количество инокулята.

Анализ динамики роста повторных выращиваний иммобилизованных клеток вакцинного штамма чумного микроба показал, что 1а§-фаза практически отсутствовала, а стационарная фаза роста наступала через 15 часов. При этом «урожай» биомассы при первом и повторных глубинных культивированиях был фактически одинаковым и составил в среднем 7х1010 м.к./мл среды. По сравнению с контролем (без иммобилизованного инокулята) количество биомассы увеличивалось на 40±5%. Описанные эксперименты были проведены на пяти сериях ферментативного бульона Хоттингера (рисунок 2).

е..

м.кУмл

Рисунок 2. Кривые роста популяции У.ревИв ЕУ при глубинном культивировании

1. Выращивание без МИС- инокулята (контроль)

2. Первичное выращивание с МИС-инокулятом

3. Повторное выращивание с МИС-инокулятом

Изучение свойств вакцинного штамма У.ре^ ЕУ, выращенного в условиях глубинного аппаратного культивирования при использовании иммобилизованного на магнитном сорбенте инокулята, проводили в соответствии с фармакопейной статьей

ФС 42-3877-99. Морфологические, тинкториальные, биохимические свойства, иммуногенность, термостабильность вакцины соответствовали нормативной документации (НД). Результаты изучения жизнеспособности (опытных и контрольных образцов) свидетельствуют, что при глубинном культивировании в электромагнитном поле с использованием иммобилизованного инокулята на магнитном носителе процент живых микробных клеток достигает не менее (55,4+5,8)%, в то время, как в контрольных образцах этот показатель — не более (30±5)% (таблица 7).

Таблица 7. Характеристика чумной вакцины БУ, выращенной при глубинном культивировании

Серия Количество живых микробных клеток,% Потеря в массе при высушивании, % Термостабильность, сутки

Первичное выращивание с МИС-инокулятом 54,0 ±4,4 2,3 10,0

Повторное выращивание с МИС-инокулятом 57,3 ± 3,9 2,1 10,5

Контрольное выращивание без МИС-инокулята 28,9 ± 2,6 1,9 9,4

Вышеизложенное дает основание высказаться в пользу перспективности использования этого способа глубинного культивирования при производстве живой чумной вакцины.

Кроме того, при глубинном культивировании чумного микроба появляется возможность использовать как микробную биомассу, так и культуральную жидкость для получения его кап-сульного антигена (Ф1), что значительно увеличивает выход целевого продукта высокого качества, который является основой при конструировании различных чумных иммунобиологических препаратов.

Методы твердофазного ИФА основаны на использовании серологически активных компонентов, иммобилизованных на нерастворимых носителях, что обеспечивает их быстрое и эффективное разделение. Чувствительность и специфичность ИФА обусловлена не только степенью чистоты и активности используемых ингредиентов, но и свойствами твердой фазы, которая должна сохранять иммунологические свойства и стабильность в иммобилизованном

состоянии, обладать минимальной активностью к неспецифическому связыванию компонентов анализируемой системы.

Проведенные эксперименты показали, что хитозанкремнсземный магносорбент полностью отвечает перечисленным требованиям.

Иммуноферментные тест-системы для диагностики чумы и индикации ее возбудителя

Синтезированный нами композиционный магносорбент, активированный перхлоратом натрия, был использован в качестве матрицы при конструировании антительной и антигенной чумной диагностических тест-систем для иммуноферментного анализа. При этом лигандами служили иммуноглобулины G, выделенные из гипериммунной чумной кроличьей сыворотки, и Ф1 чумного микроба, изолированной из культуральной жидкости изоэлектричес-кой преципитацией. .

Для получения чумных иммуноферментных конъюгатов и маг-ноиммуносорбента были использованы иммуноглобулины из антифракционной гипериммунной сыворотки.

В исследованиях использованы иммунопероксидазные чумные конъюгаты с рабочим титром 1: 200 — 1: 400. Все серии конъюгатов давали отрицательные результаты с водорастворимыми антигенами из гетерологичных штаммов Y. enterocolitica, E. coli, Y. pseudotuberculosis, что свидетельствовало об их специфичности.

Все манипуляции с магноиммуносорбентом в наших экспериментах производились с применением ряда технических устройств, разработанных сотрудниками Ставропольского и Волгоградского научно-исследовательских противочумных институтов. Данные технические средства обеспечивают фиксацию магносорбентов, их сепарацию, перенос, эффективное перемешивание в заданном режиме. Устройства размещены в компактной укладке, транспортируемой ручным способом и позволяющей осуществлять работу с ней как в лабораторных, так и в полевых условиях. В состав укладки входят магнитные ловушки различных конструкций для забора проб из объектов внешней среды, контейнеры для транспортировки магнитных сорбентов с фиксированными на их поверхности микроорганизмами, их антигенами, устройство для переноса магно-сорбентов с магнитной поверхности ловушки, устройство для отделения магносорбентов от жидкой фазы. Исследования проводили с обеззараженными клетками вакцинного штамма Y. pestis EV, а также с использованием вирулентных штаммов чумного микроба и

в модельных опытах на почве, контаминированной исследуемым возбудителем. После пропускания проб через техническое устройство, в результате которого осуществлялось селективное концентрирование патогена на магноиммуносорбенте, проводили имму-ноферментный анализ.

Чувствительность чумного антительного магноиммуносорбент-ного диагностикума, оцененная в ИФА, всех изготовленных серий была не менее 1х102 м.к. в пробе. Специфичность препаратов позволяла проводить анализы без перекрестных реакций с исследованными гетерологичными микроорганизмами.

Кроме антительного иммуносорбентного хитозанкремнеземного сорбента, был изготовлен антигенный КМИС, лигандом для получения которого служила Ф1 чумного микроба. Данный КМИС применялся для обнаружения специфических антител в экспериментальных сыворотках от лабораторных животных, зараженных чумой.

Для учета результатов проведения ИФА производили измерения оптической плотности исследуемых проб на приборе «Мультискан» при длине волны 492 нм. Анализ считали положительным при превышении оптической плотности опытного раствора над контрольным в 1,5 и более раза.

Таким образом, нами показана принципиальная возможность применения хитозанкремнеземных иммуносорбентов с магнитными свойствами для диагностики чумы и индикации ее возбудителя в экспрессном иммуноанализе (ИФА).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При получении магноиммуносорбентов на основе хитозана рекомендуем следующие параметры: соотношение компонентов синтеза 0,5:5:1,5, соответственно магнетит, аэросил А-380, хитозан; время гелеобразования 4 часа, значение рН гелеобразования 7,0; время иммобилизации с лигандом 1,5 часа при значении рН раствора белка 7 и температуры от 5° до 22° С. Для прочной иммобилизации лиганда рекомендуем использовать перхлоратное окисление и бензохиноновый метод.

ВЫВОДЫ

1. Проведены исследования по синтезу композиционных магно-сорбентов методом формирования пористой структуры кремнезе-

ма в присутствии полимера хитозана, имеющих стандартные структурные характеристики - удельную поверхность в пределах 68-82 м3/г, объем пор 1,2-1,5 м3/г. При этом достигнут результат количественного регулирования магнитных свойств сорбентов с изменением величины удельной намагниченности насыщения от 4,3 до 17,4 МН, А х м2/кг, достигаемые увеличением содержания магнитной составляющей в составе магносорбентов.

2. Впервые разработана технология получения пористых магно-сорбентов из кремнеземного материала аэросила — А-380, хитозана и оксалата железа. Изучены их структурные характеристики, химический состав в сопоставлении с данными ИК-спектроскопии и спектроскопии диффузного отражения: Синтезированы элементо-содержащие кремнеземные сорбенты методом молекулярного наслаивания и деструкционно-эпитаксиального осаждения для координационной иммобилизации белковых лигандов.

3. Разработана технология получения магноиммуносорбентов иммобилизацией на поверхности композиционных хитозанкремнезем-ных носителей чумных иммуноглобулинов и капсульного антигена чумного микроба (Ф1) методами окисления и бензохиноновым.

4. Использование хитозан крем неземного композиционного имму-носорбента с магнитными свойствами с иммобилизованными на нем живыми микробными клетками У. ре^ ЕУ в качестве иноку-лята при глубинном культивировании позволило существенно сократить время выращивания биомассы вакцинного штамма (до 15 часов) при значительном увеличении ее выхода на (40+5%) и повышении жизнеспособности микробных клеток (с 30% до 55%), при этом инокулят можно использовать многократно. Выращенная таким методом чумная вакцина соответствует всем требованиям нормативной документации.

5. Выращивание У. ре^ ЕУ при глубинном культивировании с использованием магноиммуносорбентного инокулята существенно повышает выход капсульного антигена Ф1 за счет возможности его извлечения как из биомассы, так и из культуральной жидкости.

6. На основе хитозанкремнеземного магносорбента сконструированы высокочувствительные специфичные диагностические чумные тест-системы (антительная и антигенная) для иммунофермен-тного анализа. Установлено, что основным фактором повышения их чувствительности являются иммунохимические свойства магно-иммуносорбента, определяемые качеством носителя, способом иммобилизации белкового лиганда.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Градских ДА Композиционные сорбенты для иммобилизации микроор-ганизмов//Современные достижения биотехнологии: Материалы II международной конференции. — Ставрополь, 2002. — С. 68-69.

2. Градских ДА, Тюменцева И.С. Синтез сорбентов для иммобилизации биологически активных соединений и микроорганизмов // Химия твердого тела и современные микро- и нанотехнологии: Международная научная конференция: тезисы докладов 13-18 октября. — Кисловодск, 2002. — С. 135-136.

3. Тюменцева И.С, Грядских Д. А.. Синтез и исследование биосовместимых композиционных сорбентов для иммобилизации микроорганизмов // Повестка дня на 21 век: программа действий — экологическая безопасность и устойчивое развитие: Материалы международной научной конференции. — Ставрополь: СтГАУ, 2002. - С. 191.

4. Градских Д.А Хитозанкремнеземные сорбенты для конструирования диагностических тест-систем // Биотехнология — 2003: Материалы. Всероссийской научной конференции. — Сочи, 2003. — С. 80.

5. Градских Д.А., Тюменцева И.С, Афанасьев Е.Н. Применение магноим-муносорбента для глубинного культивирования чумного микроба //Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения качества и здоровья сельскохозяйственных животных. Материалы II международной научно-практической конференции: Тезисы докладов 22-24 октября. - Ставрополь: СтГАУ, 2003. - С. 302-303.

6. Брыкалов А.В., Градских Д.А, Тюменцева И.С, Афанасьев Е.Н. Синтез и исследование магнитосорбционных органокремнеземных материалов для конструирования твердофазных диагностических тест-систем // Химия твердого тела и современные микро- и нанотехнологии: Международная научная конференция: Тезисы докладов 14-19 сентября. — Кисловодск, 2003. — 98 с.

7. Градских ДА, Тюменцева И.С, Афанасьев Е.Н. Магноиммуносорбенты для глубинного культивирования чумного микроба // Биотехнология — 2003: Материалы Всероссийской научной конференции. — Сочи, 2003. — С 79-80.

8. Градских Д.А., Тюменцева И.С, Афанасьев Е.Н. Технологическое использование магноиммуносорбентов для глубинного культивирования чумного микроба // Современные достижения в химии, биологии, и экономике: Сборник научных трудов. — Ставрополь: СгГАУ, 2004. — С 52.

9. Градских Д.А., Тюменцева И.С, Афанасьев Е.Н. Синтез хитозанкрем-неземных сорбентов для твердофазных диагностических систем в ИФА // Современные достижения в химии, биологии, и экономике: Сборник научных трудов. - Ставрополь: СтГАУ, 2004. - С 53.

10. Градских Д.А., Тюменцева И.С, Афанасьев Е.Н. Получение биотехнологических сорбционных материалов и их использование для конструирования тест-систем и глубинного культивирования микроорганизмов // Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: «Университетская наука — региону»: Материалы научной конференции. — Ставрополь: СГУ, 2004. — С 60-61.

Подписано в печать 3.06.2004. Формат 60x84 У16. Усл. печ. л. 1,3. Гарнитура «Таймс». Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ 348.

Отпечатано в типографии издательско-полиграфического комплекса СтГАУ «АГРУО, г. Ставрополь, ул. Мира, 302

NM 2 4 5 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грядских, Диана Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Получение и исследование композиционных сорбентов и их применение в твердофазном иммуноанализе (обзор литературы).

1.1. Синтез и исследование магнитосорбционных органокремнеземных материалов с иммобилизованными биологически активными лиганда

1.2. Строение и свойства хитозана, как перспективного компо-нента для синтеза композиционных сорбентов, и медико-биологические аспекты его применения.

1.3. Культивирование микроорганизмов с применением • методов их иммобилизации на сорбентах.

1.4. Применение магнитных иммуносорбентов для диагностики особо опасных инфекционных заболеваний и индикации их возбудителей

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

2.1. Характеристики используемых штаммов микроорганизмов.

2.2. Характеристика лабораторных животных.

2.3. Способы получения антигенов чумы, выделения специфических иммуноглобулинов, получения иммунопероксидазных коньюгатов и их контроль.

2.4. Материалы для синтеза композиционных кремнеземных сорбентов и физико-химические методы их исследования.

2.4.1. Химический анализ элементоксидных слоев сорбентов.

2.4.2. Физико-химические методы исследования.

2.5. Сублимация биопрепаратов.

2.6. Статистическая обработка результатов исследования.

ГЛАВА 3. Синтез композиционных магноиммуносорбентов и исследование их свойств.

3.1. Синтез хитозанкремнеземных и элементосодержащих композиционных магносорбентов.

3.2. Химическое модифицирование поверхности композиционных магносорбентов функциональными группами.

3.3. Получение магноиммуносорбентов и иммобилизация специфических иммуноглобулинов на поверхности сорбента.;.

ГЛАВА 4. Использование магнитоуправляемых иммобилизованных систем для глубинного культивирования вакцинного штамма чумного микроба.

4.1. Глубинное культивирование чумного микроба, иммобилизованного на магнитных носителях.

4.2. Изучение свойств чумного вакцинного штамма, выращенного с помощью иммобилизованного инокулята.

4.3. Получение капсульного антигена (Ф1) чумного микроба.

ГЛАВА 5. Иммуноферментные тест-системы для диагностики чумы и индикации ее возбудителя.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтез композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и их технологическое использование при изготовлении чумных иммунобиологических препаратов"

На современном этапе развития биотехнологии весьма актуальными являются исследования, направленные на решение проблемы разработки высокоэффективных методов экспресс-диагностики особо опасных инфекций и индикации их возбудителей. Для достижения цели широко используют методы твердофазного иммунохимического анализа, основанные на применении магноиммуносорбентов.

Перспективно практическое использование магнитоуправляемых адсорбционных материалов для иммобилизации микроорганизмов в качестве инокулянта при глубинном аппаратном культивировании. Разработка данной технологии обеспечивает получение биологически активных компонентов, которые необходимы на последующих этапах при конструировании диагностических тест-систем, применяемых в иммуноанализе микроорганизмов.

Научно-практический интерес в данном направлении связан с повышением чувствительности, специфичности и достоверности иммунохимиче-ской диагностики особо опасных инфекций, что во многом определяется качественными показателями магносорбентов. В настоящее время существуют проблемы с оптимизацией компонентного состава органокремнеземных композиционных сорбентов, а также весьма интересен аспект количественного регулирования магнитных свойств данных сорбционных материалов. Решение указанных проблем открывает возможности создания новых высокоэффективных диагностических тест-систем, применяемых в медицине и ветеринарии.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось системное решение научных проблем получения композиционных аффинных сорбентов и их технологическое использование при изготовлении чумных иммунобиологических препаратов.

При выполнении работы предстояло решить следующие задачи: разработать технологию хитозанкремнеземных сорбентов, исследовать их состав и физико-химические свойства; получить элементоксидные кремнеземные сорбенты с заданным составом и строением; исследовать и установить наиболее эффективные методы иммобилизации белковых лигандов на поверхности композиционных магносор-бентов; исследовать иммобилизацию на композиционных магносорбен-тах живых бактериальных клеток вакцинного штамма чумного микроба и разработать технологические этапы глубинного культивирования микроорганизмов штамма Y.pestis EV; разработать технологические аспекты конструирования твердофазных тест-систем для диагностики чумы и индикации ее возбудителя методом иммуноферментного анализа.

Научная новизна работы

Впервые разработана технология получения магноиммуносорбентов методом формирования пористой структуры кремнеземной матрицы в присутствии хитозана, аэросила А-380 и оксалата железа. Установлено, что в процессе синтеза сорбента образование магнетита осуществляется при разложении оксалата железа, активирующее воздействие данного процесса приводит к увеличению объема пор сорбентов до величины 1,55—1,63 см3/г.

Впервые количественно исследованы магнитные свойства композиционных магносорбентов, получаемых методом формирования пористой кремнеземной матрицы в присутствии аэросила А-380, хитозана и магнетита, и определено, что величина удельной намагниченности насыщения возрастает с увеличением содержания магнетита в составе сорбентов.

Иммобилизацией на поверхности композиционных хитозанкремнеземных магносорбентов чумных иммуноглобулинов получены магноиммуносорбенты и установлено, что показатели их чувствительности, специфичности определяются стандартностью структурных характеристик сорбентов, ковалентным способом связывания лигандов.

На основе разработанных КМИС сконструированы диагностические тест-системы для экспресс-диагностики чумы и индикации ее возбудителя, которые в иммуноферментном анализе характеризуются чувствительностью 1 * 10 м.к./мл по корпускулярным антигенам. Магноиммуносорбенты по чувствительности в ИФА по сравнению с применением'полистироловых планшет превосходят известный метод более чем в 1 ООО раз, и при этом время постановки ИФА сокращается в 6-7 раз. Тест-системы сохраняют стабильность без потери активности в течение 1 года (срок наблюдения).

Проведены исследования по иммобилизации на разработанных композиционных магносорбентах живых бактериальных клеток вакцинного штамма чумного микроба, изучены технологические возможности использования иммобилизованной формы инокулята для глубинного аппаратного выращивания биомассы вакцинного штамма Y. pestis EV.

Практическая ценность работы

На основе разработанных композиционных хитозанкремнеземных сорбционных материалов с магнитными свойствами сконструированы твердофазные тест-системы для экспресс-диагностики чумы и индикации ее возбудителя в иммуноферментном анализе, которые успешно апробированы в лабораторных и полевых условиях.

Методические приемы аппаратного культивирования Y. pestis EV с применением МИС-инокулята изложены в одобренных ученым советом института (протокол № 3 от 29.03.04 г.) и утвержденных директором Став-НИПЧИ методических рекомендациях «Глубинное культивирование вакцинного штамма чумного микроба с использованием магнитоуправляемых иммобилизованных систем».

Технология получения композиционных хитозанкремнеземных магносорбентов прошла промышленную апробацию в производственных условиях в специализированном ЗАО НПФ «Люминофор», что подтверждено соответствующим актом.

Практическая значимость и приоритетность выполненных исследований подтверждена выдачей дипломов 1 степени за разработку диагностической тест-системы, присужденных на выставках: Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология 2003» в г. Сочи, а также на Всероссийской конференции «Новейшие технологические решения и оборудование» в г. Кисловодске в 2004 году.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработка технологии получения композиционных хитозанкремнеземных магносорбентов методом формирования пористой структуры кремнеземной матрицы с образованием в процессе синтеза магнитного компонента из оксалата железа. Получение и исследование элементсодержащих сорбци-онных материалов.

2. Результаты количественных характеристик магнитных свойств магносорбентов с установлением закономерности возрастания удельной намагниченности насыщения с увеличением содержания магнетита в составе сорбентов.

3. Разработанные условия иммобилизации на композиционных сорбентах живых бактериальных клеток вакцинного штамма чумного микроба и технологических этапов глубинного культивирования.

4. Иммобилизация чумных иммуноглобулинов и антигенов на магно-иммуносорбентах и конструирование на их основе высокочувствительных тест-систем для диагностики чумы и индикации ее возбудителя методом ИФА.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на научно-практических конференциях (Ставропольский НИПЧИ, 2002, 2003), Международной конференции «Повестка дня на XXI век: программа действий — экологическая безопасность и устойчивое развитие», Ставрополь 2002г.; Всероссийской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2002; Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения биотехнологии», Ставрополь, 2002; Всероссийской конференции «Биотехнология 2003», Сочи, 2003.

Исследования по диссертационной работе входили составной частью в план НИР Ставропольского противочумного научно-исследовательского института по теме «Разработка методов получения чумных и холерных имму-нодиагностических тест-систем на основе твердофазных магнитных сорбентов и липосом с иммобилизованными ферментными и флуоресцирующими маркерами» Госрегистрационый № 01200216021.

По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 20 рисунков, приложения. Состоит из введения, обзора литературы,- 4 глав, заключения, практических рекомендаций, выводов, списка литературы, включающего 218 источников.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Грядских, Диана Анатольевна

Выводы

1. Проведены исследования по синтезу композиционных магносорбентов методом формирования пористой структуры кремнезема в присутствии полимера хитозана, имеющих стандартные структурные характеристики - удельную поверхность в пределах 68-82 м2 /г, объем пор 1,2-1,5м3/г. При этом достигнут результат количественного регулирования магнитных свойств сорбентов с изменением величины удельной намагниченности насыщения от 4,3 до 17,4 МН, А х м2/кг, достигаемые увеличением содержания магнитной составляющей в составе магносорбентов.

2. Впервые разработана технология получения пористых магносорбентов из кремнеземного материала аэросила - А-380, хитозана и оксалата железа. Изучены их структурные характеристики, химический состав в сопоставлении с данными ИК-спектроскопии и спектроскопии диффузного отражения. Синтезированы элементосодержащие кремнеземные сорбенты методом молекулярного наслаивания и деструкционно-эпитаксиального осаждения для координационной иммобилизации белковых лигандов.

3. Разработана технология получения магноиммуносорбентов иммобилизацией на поверхности композиционных хитозанкремнеземных носителей чумных иммуноглобулинов и капсульного антигена чумного микроба (Ф1) методами окисления и бензохиноновым.

4. Использование хитозанкремнеземного композиционного имму-носорбента с магнитными свойствами с иммобилизованными на нем живыми микробными клетками Y. pestis EV в качестве инокулята при глубинном культивировании позволило существенно сократить время выращивания биомассы вакцинного штамма (до 15 часов) при значительном увеличении ее выхода (на 40±5%) и повышении жизнеспособности микробных клеток (с 30% до 55%), при этом инокулят можно использовать многократно. Выращенная таким методом чумная вакцина соответствует всем требованиям нормативной документации.

5. Выращивание Y. pestis EV при глубинном культивировании с использованием магноиммуносорбентного инокулята существенно повышает выход капсульного антигена Ф1 за счет возможности его извлечения как из биомассы, так и из культуральной жидкости.

6. На основе хитозанкремнеземного магносорбента сконструированы высокочувствительные специфичные диагностические чумные тест-системы (антительная и антигенная) для иммуноферментного анализа. Установлено, что основным фактором повышения их чувствительности являются иммунохимические свойства магноиммуносорбента, определяемые качеством носителя, способом иммобилизации белкового лиганда.

Практические рекомендации

При получении магноиммуносорбентов на основе хитозана рекомендуем следующие параметры: соотношение компонентов синтеза 0,5:5:1,5, соответственно магнетит, аэросил А-380, хитозан; время геЛеобразования 4 часа, значение рН гелеобразования 7,0; время иммобилизации с лигандом 1,5 часа при значении рН раствора белка 7 и температуры от 5° до 22°С. Для прочной иммобилизации лиганда рекомендуем использовать перхлоратное окисление и бензохиноновый метод.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грядских, Диана Анатольевна, Ставрополь

1. Айлер, Ю.П. Планирование эксперимента при поиске оптимальных условий / Ю.П. Айлер, Е.В. Макарова. М.: 1976.-146 с.

2. Айлер, Р. Химия кремнезема / Р. Айлер. М.: Мир, 1982.-127 с.

3. А.С. №1425910 А61К 39/02. Способ получения туляремийного антигена / Н.Ф. Василенко, И.В. Кронгауз, О.Н. Лопатин, Т.И. Башлова, И.В. Жарникова-1988.

4. Алесковский, В.Б. Стехиометрия и синтез твердых соединений / В.Б. Алесковский Л: Высшая школа, 1976.-2 18 с.

5. Алесковский, В. Б. Химия твердых веществ / В.Б. Алесковский. М.: Высшая школа, 1978.-350 с.

6. Алесковский, В.Б. Модифицирование поверхности неорганическими соединениями / В.Б. Алесковский, А.Я. Юффа // Журн. Всес. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева. -1989-№3. С.317-324.

7. Алесковский, В.Б. Химия высокоорганизованных веществ // Химия высокоорганизованных веществ и научные основы биотехнологии: Автореф. Докл. III Междунар. Конф. /СПбГУ.-Санкт-Петербург, 2001, С.7-13

8. Анапова, Е.В. Обнаружение возбудителя туляремии у больных с помощью реакции иммунофлуоресценции / Е.В. Анапова, Л.С. Каменова, И.С. Мещерякова //ЖМЭИ.-1989-№4.-С.46-49.

9. Апарин, Г.П. Микробиология чумы / Г.П. Апарин, Е.П. Голубин-ский // Руководство.- Иркутск.- 1989.- 90 с.

10. Афанасьев, Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез,сибирская язва) // Автореф. Дис. докт. мед. наук / Е.Н. Афанасьев Ставрополь 2000,-с. 450.

11. Бактериологический метод определения концентрирующей способности магнитных иммуносорбентов / С.Д. Гавенский, В.И. Ефременко, И.М. Климова, В.Г. Пушкарь, В.Ю. Перов // Сб. науч.работ- Волгоград, 1989. — Выш.4, С. 23-27.

12. Бебрис, Н.К. Получение чистого макропористого кремнезема аэросила - адсорбента для газовой хроматографии / Н.К. Бебрис, А.В. Киселев, Ю.С. Никитин // Коллоид. журн.-1967.-Т.29, №3. - С. 326-332.

13. Н.Бельская, Н.А. Микрометод фракционирования и индентификации белков бактерий / Н.А. Бельская, B.C. Митина, В.И. Вейнблат // Материалы Северо-Кавказской биохим. конф.- Махачкала, 1970.- С. 270-271.

14. Бельская, Н.А. Микрометод фракционирования и индентификации белков бактерий / Н.А. Бельская, B.C. Митина, В.И. Вейнблат // Лаб. дело.-1972.-№10.-С. 514-516.

15. Березкин, В.Г. Твердые носители в газовой хроматографии / В.Г. Березкин, В.Г. Пахомов, К.И. Сакодинский. М.: Химия, 1975. - 210 с.

16. Богатский, А.В. Иммобилизация протеиназы Е и П на поверхности аминорганокремнезема / А.В. Богатский, Т.И. Давиденко, А.В. Чуенко // Укр. биохим. журн.-1979.-Т. 51., №4.-С. 315-318.

17. Богданов, В.Д. Структурообразователи в технологии рыбных продуктов / В.Д. Богданов.-М:. ВНИЭРХ, 2001.- сер.З.-высш.З.- С. 11-20.

18. Бойцова, Т.М. Обоснование и разработка ресурсосберегающих технологий рыбнофарма и пищевых продуктов на его основе // Автореферат дис. . д-ра техн. наук / Т.М. Бойцова .- Владивосток, 2002.-24 с.

19. Брей, В.В. Теоретическая и экспериментальная химия / В.В. Брей. -М:. 1982. -Т. 18, №1.-С. 122-125.

20. Брык, М.Т. Полимеризация на твердой поверхности неорганических веществ / М.Т. Брык Киев: Наукова Думка. - 1981. - 271 с.

21. Брыкалов, А.В. Новые композиционные носители для иммобилизации ферментов / А.В. Брыкалов, О.В. Воробьева // Современные достижения биотехнологии: Материалы Всерос. конф. Ставрополь. 1996.- С. 279.

22. Брыкалов, А.В. Разработка твердофазной тест-системы для диагностики хеликобактер пилори / А.В. Брыкалов, О.В. Воробьева, В.Д. Пасечников // Современные достижения биотехнологии: Материалы Всерос. конф.- Ставрополь, 1996.-С. 274.

23. Брыкалов, А.В. Метод получения магнитоиммуносорбентов для диагностических тест-систем / А.В. Брыкалов, И.В. Жарникова, И.С. Тюменцева// Сб. стр. 58 науч.- метод, конф. СГМИ. Ставрополь, 1995.- С. 19-20.

24. Брыкалов, А.В. Получение биопрепаратов на основе методов аффинной сорбции и иммобилизации // Дис. д-ра хим. наук / А.В. Брыкалов. -1993,СПб. -330 с.

25. Брыкалов, А.В. Сорбенты, на основе кремнеземов и активированных углей в биотехнологии и медицине / А.В. Брыкалов // Мат. конф. химиков Сев. Кавказа.-Нальчик, 1991.-С. 185-186.

26. Быков, И.П. Состояние и перспективы развития производства хитина, хитозана и продуктов на их основе из панциря ракообразных / И.П. Быков.- М., 1999.- С. 15-18.

27. Владимцева, И.В. Использование магнитных сорбентов в медицине и биотехнологии / И.В. Владимцева, А.А. Степин // Молекулярная биология и медицина: Тез.докл.научн.конф.-Ленинград, 1990.-С.32.

28. Варламов, В.П. Место российской науки в мировом хитозановом буме / В.П. Варламов.- М., 1999.- С. 7-8

29. Вейнблат, В.И. Иммуноэлектрофорез антигенов чумного микроба / В.И. Вейнблат, В.В. Каминский, Л.С. Орлова // Проблемы особо опасных инфекций.- Саратов, 1972.- Вып.4(26).- С. 196-200.

30. Вейнблат,В.И. Антигены Y.pestis (биохимические и иммунологические аспекты) // Дис. д-ра мед. наук /В.И. Вейнблат .- Саратов, 1974.-324 с.

31. Вейнблат В.И. Методы получения и очистки капсульного антигена и эндотоксина возбудителя чумы / В.И. Вейнблат, С.М. Дальвадянц, М.С.Веренков//Набор, дело, 1983. №12.-С. 37-39

32. Вершилова, П.А., Эпидемиология бруцеллеза / П.А. Вершилова, А.А. Голубева // Бруцеллез.-М.: Медицина, 1972.-С. 319-347.

33. Веселова, И.А. Использование хитозана и его производных для иммобилизации ферментов / И.А. Веселова, Т.Н. Шеховцова, Г.А. Бадун // Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана: Материалы Пятой конференции М.: 1999.-с. 265-267.

34. Владимцева, И.В. Научно-методические аспекты приготовления и использования магнитоуправляемых иммобилизованных микробиологических систем // Дис. д-ра биол. наук / И.В. Владимцева. Ставрополь, 2002.-304 с.

35. Воронков, М.Г. Кремний и жизнь / М.Г. Воронков, Р.И. Зельчан, Э.Я. Луковец Рига: Зинотне, 1978.-587 с.

36. Вудворд, Д. Иммобилизованные клетки и ферменты / Д. Вудворд М.: Мир, 1988.- 161 с.

37. Голубинский, Е.П. Обнаружение фракции 1 чумного микроба ферментным иммунологическим методом / Е.П. Голубинский, B.C. Рудник, М.П. Рудник // Проблемы изучения механизмов эпизоотии чумы: Тез. Докл. Всес. конф.-Саратов, 1980 С .9.

38. Горовой , Л.Ф. Хитозансодержащие материалы, получаемые из грибной биомассы / Л.Ф. Горовой // Материалы пятой конференции перспективы в исследовании хитина и хитозана».- М.: Издат, 1999.- С. 130-133.

39. Грядских, Д.А. Композиционные сорбенты для иммобилизации микроорганизмов / Д.А. Грядских //Современные достижения биотехнологии: Мат.Всерос.конф. Ставрополь, 2002, -с. 68-69.

40. Грядских, Д.А. Магноиммуносорбенты для глубинного культивирования чумного микроба / ДА. Грядских, И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев // Биотехнология 2003: Мат.Всерос. конф. Сочи, 2003. - С. 79.

41. Девдариани, З.Л. Научно-методические основы конструирования моноклональных иммуноглобулиновых реагентов с использованием гибри-домной технологии // Дис. . д-ра мед. наук / З.Л. Девдариани.- Саратов, 1993.-52 с.

42. Домарадский, И.В. Чума: современное состояние, гипотезы, проблемы / И.В. Домарадский.- Саратов, 1993.- 129 с.

43. Дрантиев, Б.Б. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа / Б.Б. Дрантиев, A.M. Егоров // Жур-нал.Всес.химич. об-во им.Д.И.Менделеева. 1982. - т.27, №4. - С. 82-89.

44. Егоров, Н.С. Биотехнология /Н.С. Егоров, А.В. Олескин, В.Д. Самуилов // Проблемы и перспективы биотехнологии.- М:. Высшая школа,-1987.- 115 с.

45. Ефременко, В.И. Магнитосорбенты в микробиологических исследованиях. Применение магнитных сорбентов в иммуноферментном и радиоиммунном анализах (обзор литературы) / В.И.Ефременко, И.С. Тюменцева // Деп. в ВИНИТИ 26.12.95, №344-В95.

46. Ефременко, В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях / В.И. Ефременко. Ставрополь, 1996. - 130 с.

47. Жакот, Р.А. Иммобилизация ферментов на силикатных носителях / Р.А. Жакот, А.С. Корсакевич // Успехи биолог, химии.- 1977.-Т. 18. -С.140-161.

48. Жоголев, К.Д. Препараты на основе хитина и хитозана в медицине и рациональном питании / К.Д.Жоголев, В.Ю.Никитин, В.Н.Цыган. -МПб,2000 32 с.

49. Журавлев, В.И. Опыт применения реакции энзиммеченных антител в практике эпизоотологического обследования природных очагов чумы / В.И. Журавлев, А.Т. Яковлев, B.C. Рыбкин // ЖМЭИ, 1983, № 11.- С. 116-117.

50. Зайцев, Т.Н. Математический анализ биологических данных /Г.Н.Зайцев. М.: Наука, 1991 -184 с.

51. Закревский, В.И. Иммуносорбенты их применение в иммунологии микроорганизмов / В.И. Закревский //ЖМЭИ. 1980. - №4. -С. 9-15.

52. Звягинцев, Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями / Д.Г. Звягинцев М: Изд.МГУ, 1973—1976 с.

53. Зыкин, Л.Ф. Иммуноферментный анализ в лабораторной диагностике некоторых опасных инфекций. ИФА при чуме / Л.Ф. Зыкин, А.Т. Яковлев // Очерки по лабораторной диагностике особо опасных инфекций.- Саратов: Сарат. ун-та.- 1993.- С. 10-15.

54. Зыкин, Л.Ф. Очерки по лабораторной диагностике опасных инфекций / Л.Ф. Зыкин, А.Т. Яковлев. Саратов, 1993. - 109 с.

55. Изучение сорбционной способности полистирольных планшетов, используемых в иммуноферментном анализе / Л.И. Ванеева, И.Ю. Гридина, О.Н. Пантелеева и др., // ЖМЭИ.- №9.- 1989.- С. 86-89.

56. Ильин, А.В. Ацетилирование низкомолекулярного водорастворимого хитозана /А.В.Ильин, В.П.Варламов//Новые достижения в исследовании хитина и хитозана: Материалы Международной конференции.- Москва,2001. -С. 280-283.

57. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райкина, В.И Лозинский, С.Д. Спасов // М:. Изд-во МГУ, 1994.- 228 с.

58. Использование инфракрасной спектроскопии для изучения химического состава чумного и псевдотуберкулезного микробов / Т.М. Тараненко, С.М. Дальвадянц, Т.П. Боровикова, И.Ф. Ковалев, B.C. Дернова // Пробл. особо опасн. инф., 1972.- Вып.1(23).- С. 37-41.

59. Иммуноферментный анализ / Под ред. Г.Т Нго, Г.М. Ленхофор — М:. 1988.-С. 25-167.

60. Использование магнитоуправляемых иммобилизованных систем для глубинного культивирования / И.В. Владимцева, М.В. Самыгин, А.А. Степин, О.В. Колотова // Биотехнология, -2001, №4. с. 74-78.

61. Исследование структуры гидроксильного покрова пирогенного кремнезема методами РЖ-спектроскопии и масс-спектрометрии /В.В.Брей, Н.И.Горлов, Э.Н.Король, В.В.Стрелко // Теорет. и эксперим. химия. -1982, №1.-С. 122-125.

62. Исследование кислотных свойств силохрома с-120, модифицированного элемент оксидными слоями методом молекулярного наслаивания / А.В.Брыкалов, С.И.Кольцов, В.И.Ковальков и др. // Журн.физ.химии, 1986. т.60.-№4.-С. 950-952.

63. Калинина, О.А. ИФА в серодиагностике сифилиса / О.А. Калинина, И.В. Емельянова, М.Ф. Лактионова // Современные вопросы дерматовенерологии: Сб. юбил. науч. тр. посвящ., 70-летию обл. кож.-вен.дисп. г. Курска.-Курск.- 1997.-С. 65-67.

64. Карнаухов, А.П. Глобулярная модель пористых тел корпускулярного строения / А.П. Карнаухов // Кинетика и катализ.- 1971. т. 12, №4.-с. 1025-1033.

65. Карпенко, В.В. Обезболивание животных в эксперименте /В.В. Карпенко, В.И. Сачков // Метод, рек.- М., 1985.- 53 с.

66. Картель, Н.Т. Новые критерии оценки свойств сорбентов медицинского назначения / Н.Т. Картель, Е.Д. Молюк, М.Е. Чудновский // тезЛУ рес-публ. конф. по сорбентам мед. назначения-Донецк, 1988.-С.14-15.

67. Касторная, М.Н. Бруцеллез / М.Н. Касторная, Е.Н. Афанасьев, И.С. Тюменцева // Лабораторная диагностика.-Дет.в ВИНИТИ 21.08.00.№148— 151.

68. Касторная, М.Н. Конструирование диагностических препаратов для экспрессных методов лабораторной диагностики бруцеллеза и детекция его возбудителей // Дис. канд.биол.наук / М.Н. Касторная.- Ставрополь, 2003.-180 с.

69. Киселев, А.В. Инфракрасные спектры поверхностных соединений. /А.В.Киселев, В.И.Лыгин.-М.: Наука, 1972.^59 с.

70. Киселев, А.В. Влияние температуры гидротермальной обработки на изменение пор и скелета промышленного силикагеля / А.В. Киселев, В.М. Лукьянович, Ю.С. Никитин. // Коллоид. журн.-1969.-Т.31, №3. С. 388-393.

71. Климова, И.М. Способ получения МИС: Патент №5040754 РФ, А в/к 39/385 с.12. № 11/00 //01, заявл.29.04.92. опубл.7.06.95.

72. Климова, В.А. Основные методы анализа органических соединений /В.А. Климова.-М:. Химия, 1971.-С. 159-161.

73. Климова, И.М. Магнитный иммунофермент анализ антигенов Yersinia pestis / И.М. Климова, В.И. Ефременко, В.Г. Пушкарь // ЖМЭИ 1989. -№7.-С. 62-65.

74. Клячко-Гурвич, А.А. Методы определения удельной поверхности / А.А. Клячко-Гурвич. М:. 1961,-№10. - с. 1885.

75. Ковальков, В.И. Синтез протонодонорных групп на поверхности высокодисперсного углерода / В.И. Ковальков, Е.П. Смирнов, С.И. Кольцов //Журн. общ. Химия, 1976, Т. №9. - С. 2 151.

76. Коликов, В.М. Хроматография биополимеров на макропористых кремнеземах / В.М. Коликов, Б.В. Мчедлишвили. JL: Наука, 1988.- С. 189.

77. Кольцов, С.И. Силикагель, его строение и физико-химические свойства / С.И. Кольцов, В.Б. Алесковский. JL: Госхимиздат, 1953.- С. 9498.

78. Кольцов, С.И. Изучение взаимодействия трихлорсилана с силикаге-лем / С.И. Кольцов // Журн. прикл. химии., 1965.- Т.38, №6.- С. 1384-1389.

79. Кольцов, С.И. Изучение стехиометрии продуктов реакции трихлорсилана с функциональными группами поликремнекислоты / С.И. Кольцов, Г.Н. Кузнецова, В.Б. Алесковский // Журн. прикл. химии. 1967. - Т.47.№1. -С. 70-72.

80. Кольцов, С.И. Изучение влияния носителей на свойства катализаторов / С.И. Кольцов, В.М. Смирнов, В.Б. Алесковский // Кинетика и катализ.-1970.-T.il, №4.-С. 1013-1021.

81. Кольцов, С.И. Изучение влияния носителя на свойства катализатора / С.И. Кольцов, В.М. Смирнов, В.Б. Алесковский // Кинетика и катализ. -1973.- Т. 14, №5. С. 1300-1303.

82. Красавцев, В.Е. Криль как сырьевая основа хитинового производства /В.Е. Красавцев // Материалы исследования хитина «хитозана».-М.,1999.-С. 35-37.

83. Кудрявцев, Г.В. Структура привитого слоя модифицированных кремнеземов / Г.В. Кудрявцев, С.М. Староверов // Журн. Всес. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева. 1989, №3- С. 308-316.

84. Куфлина, С.А. Эвтаназия экспериментальных животных / С.А. Куфлина, Т.Н. Павлова // Метод, рек.по выведению животных из экспериментов.-М., 1985.-9 с.

85. Лабинская, А.С. Практикум по микробиологическим методам исследования / А.С. Лабинская. М.: Медизд. 1963. — С .425-446.

86. Лившиц, B.C. Полимерные покрытия на раны и ожоги / B.C. Лившиц //Химикофармацетический журнал.- 1988, №7. С. 790-798.

87. Лисичкин, Г.Д. Достижения и перспективы химического модифицирования поверхности минеральных веществ / Г.Д. Лисичкин // Журн. Всес. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева.-1989. Т.34, №3. - с. 291-297.

88. Лисичкин, Г.Д. Достижения и перспективы химического модифицирования поверхности минеральных веществ / Г.Д. Лисичкин // Журн. Всес. хим. об-ва им. Д.И. Менднлеева.-1989.-Т. 34, №3.- С. 219-297.

89. Малыгин, А.А. О химическом составе продуктов взаимодействия хромсодержащего кремнезема с оксихлоридом ванадия / А.А. Малыгин // Журн. общ. химия.-1979.-№8 С. 1686-1690.

90. Малыгин, А.А. Химическая сборка материалов с заданными свойствами / А.А. Малыгин. Л.: Наука, 1986.- 49 с.

91. Манолов, А.Д. Радиоиммунологический анализ при изучении пер-систенции чумного антигена в организме грызунов и у эктопаразитов природных очагов Сибири / А.Д. Манолов, Л.Ф. Зыкин, Е.П. Голубинский // ЖМЭИ.-1991 .-№3.- С. 44-47.

92. Мельник, И.В. Применение хитозана и его производных для концентрирования баксуспензий / И.В. Мельник, Н.Д. Скичко, Е.А. Шубина.-М., 1999.-С. 170-171.

93. Методы практической биохимии / Под ред. В.Уильямсона. М.: Мир, 1978.-268 с.

94. Мещерякова, И.С. Использование иммуноферментного метода Slisa выявлению возбудителей туляремии / И.С. Мещерякова, И.С. Умнова, К.А. Шаханина // Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций Ставрополь, 1986. - 4.1 - С. 216-218.

95. Мирясова, Л.В. Метод культивирования коклюшных бактерий / Л.В. Мирясова // Лаб.дело. 1999, №10. С. 31-34.

96. Неймарк, Н.Е. Синтетические минеральные адсорбенты и носители катализаторов / Н.Е. Неймарк. Киев: Наукова Думка, 1982. - 210 с.

97. Немцев, С.В. Промышленное производство хитозана из панциря карапакса охотоморских крабов / С.В. Немцев, B.C. Божко // Материалы исследования хитина «хитозана»,-М., 1999.-С. 51-52.

98. Нечипоренко, А.П. Микроскептрофическое исследование титано-оксидных слоев, синтезированных методом молекулярного наслаивания / А.П.Ненчипоренко, Г.К.Шевченко, С.И.Кольцов. //Журн.прил.химии.-1981.-т.54.-№1.-С. 1260-1264.

99. Обнаружение антигенов бруцелл с помощью частиц коллоидных металлов в качестве маркеров специфических антител / Т.Ю. Загоскина, Е.Ю. Марков, А.И. Калиновский, Е.П.Голубинский // ЖМЭИ. 2001 — №3. -С. 65-69.

100. Оккерс, К. Пористый кремнезем / К. Оккерс // Строение и свойства адсорбентов и катализаторов. М.: Мир, 1973. - С. 233-284."

101. Опыт производства комбикормов с хитозаном на Днепропетровском заводе рыбных кормов /Е.А. Гамызин, Т.И. Сазонова, Е.Д. Близнюк. И.В. Сушков // Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана: Материалы V конференции.- М, 1999. С. 124-125.

102. Павлов, В.В. Химические перегруппировки в поверхностном слое дисперсных кремнеземов / В.В. Павлов, В.А. Тертых, А.А. Чуйко. 1976. -№4.-С. 62-69. .

103. Пак, В.Н. Природа кислотных центров поверхности титансодер-жащих кремнеземов / В.Н. Пак, С.И. Кольцов, В.Б. Алесковский // Теор. и эксперим. Химия. -1976. №6. - С. 839-843.

104. Парфит, Т, Адсорбция малых молекул / Т. Парфит, К. Рочестер -М.: Мир, 1986.-С. 14-63.

105. Патент РФ №21652553. Способ лечения онкозаболеваний К.А. Трескунов, Б.А. Комаров. Приоритет от 20.01.98.

106. Патент РФ о заявке 97105499/25. Флокуляционный агент радионуклидов для дезактивации жидких радиоактивных отходов. //Бюл. 1998, №26.

107. Перспективы клинического применения иммуномодулирующих. препаратов на основе хитозана / А.Д. Жоголев, К.Д.Жоголев, В.Ю.Никитин, В.Н.Цыган, // Медицинская иммунология 2001.-3- №2. - С. 316-317.

108. Плаченов, Т.Г. Разработка конструкции поромеров для изучения структуры пористых тел методом вдавливания ртути. / Т.Г. Плаченов // Журн. прил. химии.- 1965.- Т.28. №3. - С. 245-253.

109. Плиско, Е.А. Хитин и его химические превращения / Е.А.Плиско, Л.А.Нудьга, С.Н.Данилов //Успехи химии.- 1977. т. 46. - Вып.8. - С. 19701987.

110. Покровский, В.И. Иммуноферментиый анализ: современное состояние и тенденции развития / В.И. Покровский // Медицинская генетика и иммунология.- М:. 1986,- С. 4-5.

111. Поляченко, В.М. Обнаружение антигенов Francisella tularensis ИФА / В.М. Поляченко, С.П. Меринов, Е.П. Голубинский // ЖМЭИ. 1983— №11.-С. 114-115.

112. Постнов, В.Н. Синтез неорганических матриц на основе силикаге-ля методом химической сборки / В.Н. Постнов // Сб. науч. тр. ЛГУ. 1983.-С. 98-99.

113. Постнова, A.M. Исследование протонной кислотности титансо-держащих силикагелей, полученных методом молекулярного наслаивания / A.M. Постнова, В.Н. Пак, С.И. Кольцов // Журн. физ. химии. -1981.-Т.35, №8.-С. 2140-2141.

114. Практический курс химической и ферментативной кинетики: Учеб. пособие для химических специальностей ун-тов /И.В.Березин, А.А.Клесов.-М.: Из-во Моск.ун-та, 1976. — 320 с.

115. Препаративный метод выделения и очистки капсульного антигена чумного микроба при помощи изоэлектрической преципитации / М.М. Титенко, В.И. Вейнблат, М.С. Веренков, А.С. Васенин // Диагн. и профил. особо опасн. инфекий-.Саратов,- 1983.- С. 34-39.

116. Приказ №1179 от 10 октября 1983 г. Об утверждении нормативных затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения.-Москва, 1983.

117. Рабинович, М.И. Применение хитозана фармакорректора содержания тяжелых металлов в организме животных на Южном Урале / М.И. Рабинович, А.Р. Таирова // Матералы V конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана».- М, 1999.- С. 186-188.

118. Рогожин, С.В. Получение модифицированных кремнеземов для присоединения биологически активных соединений / С.В. Рогожин, В.Ю, Варламов, Д.Г. Вальковский // Изв. АН СССР / сер. хим. 1975. - №8. -С. 1718-1721.

119. Роуз, Э. Химическая микробиология / Э. Роуз. М.: 1971. -С. 45-60.

120. Рубин, А.Б. Биофизика 1. Теоретическая биофизика / А.Б. Рубин. — М.: Высш.школа, 1987.-319с.

121. Русин, Г.Г. Физико-химические методы анализа в агрохимии / Г.Г. Русин. М.: Агропромиздат, 1990. - С. 142-148.

122. Самойлова, Н.А. Хитозансодержащий гиполипидемический энте-росорбент /Н.А. Самойлова, В.Е. Рыженков, И .Я. Ямчков // Материалы V конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана».-М, 1999.-С. 191-193.

123. Самошин, Н.М. Исследование свойств иммобилизационной кислой протеазы / Н.М. Самошин, JI.T. Мотина, Л.И. Ерещенко // Прикл.биохим. и микробиология. 1978, №4. - С.554-557.

124. Санитарные правила СП 1.2.2011.-94. Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности Госкомсанэпиднадзор России. М.: 1994. - С. 74-78.

125. Сафронов, Т.М. Хитозан как флокулянт нативного рыбного белка /Т.М. Сафронов, Т.М. Бойцова.- М., 1999. С. 251 -252.

126. Свидетельство на полезную модель 8608 РФ, №98107798. Раневое покрытие «Хитоксин» /Б.А. Никонов, С.Ф. Антонов, А.И. Кобальтов и др. //Бюл.1998. №12.

127. Сенюк, О.Ф. Использование хитинового препарата «Микотон» в качестве радиопротектора / О.Ф. Сенюк, Л.Ф. Горовой, И.А. Трутнева // Материалы V конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана».- М, 1999. С. 193-197.

128. Симонова, JI.B. Хитин и хитозан. / J1.B. Симонова, J1.K. Пашук // Косметика и медицина .- М,1998, №1. С. 15-19.

129. Синицин, А.П. Зависимость стабильности иммобилизованной глюкоамилазы от способа иммобилизации / А.П. Синицин, А.И. Клибанов // Прикл. биохим. и микробиология.- 1978. №2. - С. 236-242.

130. Сорбенты на основе силикагеля в радиохимии / Б.Н.Ласкорин, В.В.Стрелко, Д.Н.Стражеско, В.Н.Денисов. -М.: Атомиздат,' 1977. 304 с.

131. Способ получения фракции 1 чумного микроба и анализ эффективности отдельных этапов ее приготовления /Д.А. Будыка, А.И.Тинккер, Е.Л. Ракитина, Т.Н.Фунтикова, М.Н. Гончарова.- Ставрополь, 1988,- 13 с.-Деп.о ВИНИТИ 12.08.88. №6548-888.

132. Сравнительное изучение методов подготовки проб материала, содержащего бруцеллы, к проведению ПЦР-анализа /И.А Соколова, Г.И. Лям-каин, Я.Ф. Брюханов //Сборник науч. тр.- Саратов.-2000.- Вып. 80. С. 148151.

133. Стрелко, В.В. Классификация реакций с участием поверхности дисперсных кремнеземов и исследование процессов, замещения водорода, связанного с поверхностными атомами кремния / В.В. Стрелко, В.А. Кани-болицкий /Коллоид. журн.-1971.-Т.ЗЗЮ, 5.- С. 750-756.

134. Сухоруков, A.M. Изучение сорбционных свойств полистироловых планшетов, используемых в иммуноферментном анализе / A.M. Сухоруков, А.М.Пономарева // ЖМЭИ.- 1987.- №9.- С. 18-22.

135. Терещенко, В.Г. Применение фитохитодеза в кардиологической реанимации /В .Г. Терещенко // Материалы научной конференции «Фитотерапия и лазеротерапия в XXI веке».- Черноголовка, 1999.- С. 86-88.

136. Тертых, В.А. Исследование взаимодействия у амиинопропил и Р - циа-нэтилтриэтоксисиланов с поверхностью аэросилов методом ИК - спектроскопии / В.А. Тертых, А.А. Чуйко, И.Е. Неймарк // Теор. и эксперим. химия.- 1965. -№3.- С. 400-405.

137. Тертых, В.А. Основные закономерности взаимодействия сила-нольных групп кремнезема с алкилхлорсиланами ряда С1п81(СНз)4.п(0-4) / В.А. Тертых, В.В. Павлов, К.И. Ткаченко Н Теор. и экперим. химия. 1975. — Т.11,№2.-С. 174-181.

138. Тертых, В.А. Синтез и исследование поверхности аминоорганок-ремнеземов / В.А. Тертых, А.А. Агзамходжаев, А.А. Чуйко // Изв. АН СССР сер. химия. 1968. №8. - С. 1739-1743.

139. Тертых, В.А. О размещении структурных гидроксильных групп на поверхности аэросила / В.А. Тертых, В.В. Павлов, К.И. Тканенко // Теор. и эксперим. химия.-1975.-Т. 11, №3.- С. 415-420.

140. Тривен, М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. М.\ Мир, 1983. -с. 23.

141. Тюменцева, И.С. К вопросу диагностики возбудителя бруцеллеза / И.С. Тюменцева, Е.Н.Афанасьев, М.Н. Касторная // Эрдем шиншилл бутэлл.-Уланбатор, 1999.- №7 .- С. 229-231.

142. Тюпенко, Г.М. Электрофорез хитозана при лечении заболеваний пародонта /Г.М.Тюпенко, Е.Е.Скорикова, А.Б.Зезин // Новые достижения в исследовании хитина и хитозана: Матер. В Междунар.конференции.- Москва, 2001.-С. 241-247.

143. Тютерев, C.JI. Научные основы использования химических активаторов болезнеустойчивости в защите растений от патогенов // Дис. . д-ра биол. наук /СЛ. Тютерев.- Пушкин, 2000. С-Пб. - 394 с.

144. Фрайфельдер, Я. Физическая химия. / Я.Фрайфельдер.-М.: Мир, 1980.-418 с.

145. Характеристика препаратов капсульного антигена, выделенных из бульонной культуры штамма Y. pestis EV / В.И. Вейнблат, М.М. Титенко, М.С. Веренков и др., // ЖМЭИ.- 1985.- №4,- С. 19-24.

146. Хитозан peros от пищевой добавки — к лекарственному средству / Под ред. Р. Муцарелли.- Нижний Новгород: Олигофарм, 2001.- 370 с.

147. Ходж, Ф. Органические реакции с использованием реагентов или субстратов, ковалентно закрепленных на функционализированных неорганических носителях / Ф. Ходж // Журн. Всес. об-ва им. Д.И.Менделеева. 1989.-Т.34,№3.-С. 331-339.

148. Чуйко, А.А. Аминокремнеземы как химически активные сорбенты и наполнители полимерных материалов / А.А. Чуйко, В.А. Тертых, Г.Е. Павлик//Коллоид, журн. 1965. - Т.27, №6. - С. 903-907.

149. Шаханина, К.Л. Выбор критериев пригодности твердофазных носителей на основе полистирола для проведения иммуноферментного анализа / К.Л. Шаханина, А.А. Соколенко, И.П. Павлова // ЖМЭИ.- №9. 1987. -С. 8-11.

150. Янишпольский, В.В. Иммобилизация ферментов на активированных аминокремнеземах / В.В. Янишпольский, В.А. Тертых, А.А. Чуйко // Тез. 12 Укр. конф. по физ. химии.-Киев, 1977. С.203.

151. Anaokar,.S.Solid-phase enzyme immunoassay for. serum ferreting / S. Anaokar, P.J. Sony, J.C. Standefer // Clin. Chem.-1979.-V.25.-P.l426-1431.

152. Aphanasev, E.N. Tne problems of brucellosis /E.N.Aphanasev, I.S. Tyumenzeva, M.N. Kastornaya // ЭРДЭМ Шинжилгээний БУТЭЭЛ, 1999.- №7. РЮ229Ю.

153. Austin , P.R. Chitin: New Facts of Research / P.R. Austin, C.I.Brine, I.E. Castle, I.P.Zikakis // Science.-1981.-212.- P. 719.

154. Bascom, W.D. Hudrolisis of triethulethocsilans at the silica carbon tetrachloride interface / W.D. Bascom, R.V. Timols // I. Phus. chem. 1972.- V.76.-P. 320

155. Boorsma D.M., Strefkert J.G. Peroxides on qlutaraldehyde for prospering peroxides conjugates / D. M. Boorma, J. G. Strefkert // J. immuonol. Methods.- 1979.- №30.- P. 245-255.

156. Brine, C.G. Utilization of chitin a cellulose derivative from crab and shrimp waste / C.G. Brine, P.R. Austin // Delaware university project Report,1974.-№19.-P. 12.

157. Burwell R.L. Modified silica gels adsorbents and cater list //Chem. Techkol.-1974.-V. 15, №1.-P. 370-377.

158. Carlsson, E. Enzyme linked immunosorbent assay for immunological diagnosis of human tularemia / E. Carlsson, A. Lindberg // J. Clin. Microbiol. -1979.-v.10, №5.-P. 615-621.

159. Cavanaught, D.C. Fortier M.K., Robinson D.M. Application of the ELISA technique to problem in the serologic diagnosis plaque / D.C. Cavanaught, M.K. Fortier, D.M. Robinson // Bull. Penam. Health. Org., 1979.-v.13, №4.- P. 399-402.

160. Chomel, B.V. Chanqibq trends in the epidemiology of human brucellosis in California from 1973 to 1992: a shift toward food borne transmission B.V. Chomel, E.E. De Bess, D.M Mabqiameie // J.Infect. Dis.-1994. V.170 (5).-P. 1216-1223.

161. Clark M.F. Characteristics of the micro plate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus / M. F. Clark, A.N. Adams //J.Qen. Virol. 1977/-V.36, №3.- P. 475-483.

162. Comparison of an enzyme linked immunosorben assay ELISA with a radioimmunoassay (RIA) for the measurement of ratiusulin / H. Webster, L.Bone Adrian, A. Katherine Webster, J.Terence Wilkin // J. Jmmunal. Method.- 1990.-v.134,1.-P. 25-100.

163. Dion, Le Doan. Research on Using Chitosan for Storage of Oranges in Vietnam / Le Doan Dien, Tran Quang Binh //Second Asia Pacific Chitin Symposium.-Bangkok, 1996.-P. 200-203.

164. Domard, A. Some Physicochemical and Structure Basis for Applicability of chitin and chitosan /А. Domard // Second Aside Pacific chitin Symposium.-Bangkok, 1966.-P. 1-12.

165. Ernst, E. Chitosan as treatment for body weight reduction. A metaanalysis / E. Ernst, M.H. Pittler // Perfusion.- 1998, №11.- 3.- P. 461-465.

166. Felit, O. Chitosan: A unique Polysaccharide for Drug Delivery / O. Felit, P. Buri, R. Gumy // Drug Development and Industrial pharmacy.- 1998, №24.-P. 979-993.

167. Filar, Y. Bulk and Solution Properties of chitin Specific enzyme-linked immunosorbent / Y. Filar, M.C. Winick, A. Freeman // I.Biotechnol. Bi-unq.-1981, V.23.-P. 31-33.

168. Herd, W. Mechanism of Gaseous Silo sane Reaction willies / W-Hertl // I.Rhus.Chem. 1968. - V. 72. - P. 3993-3997.л

169. Jirgensons, B. Organic Coloids / B. Jirgensons.- Austin: University of Texas. Princeton: Elsevier publishing company, 1958, 422 p.

170. Kato К., Hamguchi Y., Fukui H. Enzyme linked immunoassay, 1. Novel method for synthesis of the insulin-D-glycosidase conjugate and its applicability for insulin assay//J.Biochem.-1975.-V.78.-P. 235-237.

171. Konig H.J., Vob H. Vertahren zur Herstelling con mechanisch stobilen enzymhaltigen Immobilisation. Pat. 282923. GDR, MKU 540.-P.12.-N 11/04 /Tschistowkaya/. Martin Luther-Univer-sitet Halle - Wittenbery. - N3281731. -1990.

172. Kumar, G. Enzymatic Grafting of a Natural Product to chitosan to confer water solubility under basis conditions / G. Kumar, P. Smith, G.F. Payne//Biotechnology and Bioengineering, 1999.- v.63, №2.-P. 154-164.

173. Lim, L.Y. Effects of dry heft and saturated steam on the phased properties chitosan / L.Y. Lim, Khor, C.E. Ling // Journal Biomedical Materialists Research, 1999.- v. 48. №2.- P. 111-116.

174. Methods in enzymology / P.Z. Masson, C.Z. Cambiaso, D. Collet-Cassat,C.G. Magmisson et al //Academix Press Ing.New-York., USA.-1981.-V.74.-P. 106-139.

175. Mayer, S.P. Chitosan as Prolog in the waste water treatment / S.P. Mayer // Agriculture, Food, Chemistry.- 1989, №5.

176. Monson, P. Optimization of glutaraedehude activation of a support for enzyme immobilization / P. Monson // I.Mol. Catal. 1978.-V.3, №5. - P. 371384.

177. Naitu, J. Industrial applications of immobilized microbial cells / J. Naitu // World Biotech. Rept.,Proc. Conf.-London, New -York, 1987.-v.l,Pt.3. P. 93-101.

178. Oqawa К. X-Rjy diffraction study of sulfuric, nitric and halogen and salts of chitosan /K.Oqawa, 8. Ibukai // Carbohyar. Res.-1987.-V.160.- P. 425-433.

179. Patent 4241176 (USA)-23/12. Avrameas S.M., Gutsdon J.L. Magnetic del suitable to immunoenzimatic determination / S.M Avrameas., J.L Gutsdon //In.CL. С 1201/66, C07 G7/00 1980

180. Patent E.P. №460774. Manufacture of wound dressings from micro-fungal fibers / B. Sagan, P. Mamlyn, D. Wales.-1991.

181. Poison, A. The fractionation of protein mixtures hay linear polymers of bight molecular weight /А. Poison, O.M. Potgieter, I.E. Largier //Biochem. Biopsies. Acta.-1984.-V.82.

182. Qold, P. Demonstration of tumor-specific antigens in human colonic carcinoma by immunological / P. Qold, S.O. Freedmmam // I.Exp.Ved.-1965.V.121.- P. 439.

183. Rees D.A., Morris E.A. In: The Polysaccharides. / D.A. Rees, E.A. Morris Academies Press, New- York and London, 1982,-v. 1.-221 p.

184. Robinson, P.I. Porous glass a solid support for immobilization of finite chromatography of inhumes, Biochim, et biochips / P.I. Robinson, P. Dunmill, M.D. Lillu // Acta. 1971. - V. 242. - P. 659-661.

185. Soto-Peralta, N.V. Effects of Treatments on the clarity and colon of Apple Juice / N.V. Soto-Peralta // Journal of Food Science, 1989.- v. 54, №2.- 3.-P. 495-496.

186. Stahe, S.P. Diagnosis of human brucellosis with ELISA / S.P. Stahe, A. Marmonior, M.I. Micoud //Lancet.-1982.V.l 1, N8299.- P. 669.

187. Stavitsky,A.B. Haemagglutination and haemagglutination inhibition reactions with tannic acid and vis-diazotired benzidin-hroteiconjugated erythrocytes // IN: Immunological methods.- ED.Acrord J.F.- Oxford.- 1964.

188. Sting R., Ortmann G. Erfahrungen mitt einfachen ELISA Test-systemes fur die Brucellose - Serologie bei Rind, Schaf und Ziege //Berlin. Und munch. Wochenschr.-2000.-Vol.113.-Nl. - P. 22-28.

189. Studies on immunization against plague. The isolation and characterization of the Soluble antigen of Pasteur Ella pestis / E.E.Baker, Y. Sommer, L.E. Foster., et al //I.Immunl.- 1952.- v.68, №2 .- P. 131-145.

190. Tabatabai, L.B. Specific enzyme-linked immunosorbent assay for detection of bovine antibody to Brucella abortus / L.B .Tabatabai, B.L. Deyoe //J.Clin. Microbiol.-1984.-V.20, №2. P. 209-213.

191. Wand H.Y. Hettwer D.I. Methods in enzymoloqu. / H.Y. Wand, D.I.Hettwer //.Biotehnol. Bioenq,1982.- V.24.— P .45-48.

192. Warburg, O. Isolierung and Krystallization des Garugsterments Enlase. / O. Warburg, W.I. Christian // Biochem. J. 1941.- v.310.- P.-1120-1122.

193. Weller, Т.Н. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster propagated in vitro / Т.Н. Weller, A.H. Coons // Proc. Soc. Exp. Biol.-1954.-. v.86. — P. 789-794.

194. Werblin, T.P. Studies on the control of antibody synthesis III. Changes is heterogeneity of antibody affinity during the congress of the immune response / T.P. Werblin, Tai Kim Young, G.W. Siskind//I.Immunoboqy.-1973.-v.24.-P. 477.

195. Yackman, R. Light-scattering and infrared spectropha.tometric studies of chitin and chitin derivatives / R. Yackman, M. Goldberg // Carbohyd. Res.-, №38.-1974.-P. 35-45.

196. Yamamoto A. Conformational behavior of chitosan in the acetate salt: A varies study /A.Yomamoto. I.Kawada, T. Yui K. Oqawa // Biopisies. Biotech. Biochem-1997. V.61. P. 1230-1232.