Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций"

На правах рукописи

ТЮМЕНЦЕВА Ирина Степановна

НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ПРОИЗВОДСТВА

ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСОБО ОПАСНЫХ И ДРУГИХ ИНФЕКЦИЙ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Саратов -1996

Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте.

Научные консультанты.- доктор медицинских наук, профессор В.И. Ефреыенко, доктор медицинских наук, профессор Т.И.Акисныова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН Г.И.Шуб; доктор медицинских наук, старший научный сотрудник 3.Л.Девдаркани; доктор медицинских наук, старший научный сотрудник В.С.Ры&пш.

Ведущая организация - Ростовский-на-Дону научно-исследовательской противочумный институт.

Защита диссертации состоится "26" июня 1996 г. в . асов

на заседании специализированного совета Д.074.32.01 в Российском

научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071, г.Саратов, ул.Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан "22" мая 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук КОРНЕЕВ Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность пробле м.ы.

Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний - один из основных факторов, обеспечивающих эффективность комплекса лечебных и противоэпидемических мероприятий (Самойлова с соавт., 1990; Наркевич с соавт., 1991; Анисимов с соавт., 1992; Айкиыба-ев, 1992, 1994; Наумов, Самойлова, 1992; Беляев, Прохода, 1994 и ДР-).

Результат лабораторно-микробиологического исследования, в свою очередь, зависит от номенклатуры и качества диагностических препаратов, применяемых для идентификации микроорганизмов - возбудителей различных заболеваний человека и животных.

В настоящее время предприятиями страны осуществляется выпуск многих диагностических сывороток, отвечающих современным требованиям к подобного рода препаратам. Однако постоянно расширяющиеся сведения о систематике микроорганизмов, их антигенных свойствах, о их роли в патологии человека, с одной стороны, и о свойствах антител - с другой, интенсивный поиск новых природных и синтетических соединений, обладающих высокой иммуностимулирующей активностью, требуют постоянного совершенствования технологии изготовления и повышения качества диагностических препаратов. А . .

. Методы экспресс-анализов являются необходимыми для своевременного решения целого ряда эпидемиологических, зпизоотологичес-ких, микробиологических и других вопросов. В связи с этим остается актуальным совершенствование существующих и поиск новых высокочувствительных, специфичных, простых в выполнении, доступных широкому кругу исследователей экспрессных методов анализа. Среди них в настоящее время для избирательного концентрирования и обнаружения антигенного материала, в тем числе бактериальных клеток, широко применяют иммуносорбционные методы (Шаханина с соавт.,' 1969; Сербезов и др. 1973; Рыбкин, 1978; Закревский, 1980; Шимко, Леви, 1990 и др.). Дополнительные удобства и значительные преимущества перед общепринятыми методами появились с началом использования сорбентов с магнитными свойствами, которые используются в качестве твердой фазы для селективного концентрирования

на их поверхности различных антигенов и микроорганизмов (Эти^, 1977; Ьеа еЬ а1., 1985; Пушкарь, Ефременко, Климова и др., 1985 и др.). Широкий диапазон обьёмов исследуемых проб (от нескольких сот микролитров до многих кубических метров жидкостей), возможность исследования сильно загрязненных объектов позволяют проводить более качественную диагностику инфекционных заболеваний, а также значительно расширяют возможность "мониторинга внешней среды на наличие различных инфекционных агентов.

Магноиммуносорбентные диагностикумы (МИС) только начинают внедряться в практику отечественного здравоохранения, однако успешные экспериментальные разработки не завершились их промышленным изготовлением, что связано с существующими многочисленными сложностями приготовления этих препаратов, в том числе с использованием дорогостоящих импортных реактивов. В связи со сказанным, остается актуальным дальнейшее совершенствование технологии, основывающейся на отечественной базе химических реактивов. Это отразится не только на стабильности, но и на экономической эффективности производства ШС.

Конструирование различных. МИБП (люминесцирующих, агглютинирующих, магноиммуносорбентных, иммуноферментных и других) неразрывно связано с получением высокоактивных, специфичных гиперим-ыунных сывороток, многие этапы технологии приготовления которых нуждаются в доработке и глубоком детальном изучении.

Одним из актуальных вопросов в этом ряду является создание технологии получения полигрупповых диагностических препаратов для одномоментного выявления нескольких инфекционных агентов, что значительно ускоряет и удешевляет проведение иммунобиологических анализов.

Цель и основные задачи исследования.

Цель работы - совершенствование технологии получения высо-котитражных гипериммунных поли- и моновалентных сывороток и конструирование на их основе различных медицинских иммунобиологических диагностических препаратов (МИБП).

Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:

- оптимизировать и унифицировать условия выделения водорастворимых антигенных комплексов, используемых в производстве МИБП;

- изучить возможность замены (на этапе выделения антигенов) высоковирулентных производственных штаммов микроорганизмов на авирулентные или вакцинные;

- разработать высокоэффективную производственную схему иммунизации животных-продуцентов;

- изучить условия возникновения иммунологической ареактив-ности в процессе иммунизации животных-продуцентов;

- получить экспериментально-производственные серии поли- и моновалентных диагностических люминесцирущих иммуноглобулинов;

- разработать технологическую линию производства магноимму-носорбентных диагностикумов;

- сконструировать технические устройства и разработать методические приемы для работы с магноиммуносорбентными диагности-кумами;

- сконструировать диагностические магноиммуносорбентные тест-системы' для выявления и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.

- разработать условия стабилизации диагностикумов магноим-муносорбентных.

Научная новизна работы:

- разработаны научно-методические подходы к повышению эффективности получения гипериммунных сывороток", используемых для производства различных диагностических иммунобиологических препаратов;

- доказана возможность использования антигенных комплексов вакцинных и авирулентных штаммов (вместо высоковирулентных) в производстве различных диагностических препаратов;

- новыми являются данные о значительном стимулирующем эффекте феракрила при иммунизации животных-продуцентов;

- доказано, что специфическая иммунологическая реактивность может наступить при иммунизации животных-продуцентов любыми антигенами, что необходимо учитывать в производстве МИБП;

- разработаны научно-методические подходы к производству

иммуноглобулинов диагностических чумных, туляремийных, бруцеллезных, сапных, мелиоидозных, сибиреязвенных полигрупповых люми-несцирующих сухих;

- разработан оптимальный вариант технологии изготовления микрогранулированных полиакриламидных магноиммуносорбентов;

- впервые разработаны технические устройства для работы с диагностикумаш магноиммуносорбентными;'

- разработаны методические приемы для работы с диагностику-мами магноиммуносорбентными;

- впервые проведена научно-технологическая разработка диагностических магноиммуносорбентных препаратов нового поколения на основе композиционного органоминерального декстранокремнеземного носителя (КШС), технология производства которых полностью базируется на отечественных реактивах;

- впервые разработан способ стабилизации диагностикумов магноиммуносорбентных методом лиофильного высушивания.

Практическая ценность работы:

- разработан и внедрен в практику отечественного здравоохранения медицинский иммунобиологический препарат - иммуноглобулины диагностические чумные, сапные, мелиоидозные, туляремийные, бруцеллезные, сибиреязвенные (антиспоровые) полигрупповые люми-несцирующие сухие. Составлена и одобрена Учеными Советами Ставропольского и Волгоградского НИПЧИ нормативно-техническая документация (экспериментально-производственный регламент).

В соответствии с приказом Ш СССР N 314 с января 1988 г. в Ставропольском НЖШИ развернуто производство препарата. С 1988 года приготовлено 22 экспериментально-производственных серии ди-агностикума. Решением Госкомсанзпиднадзора РФ (информация за N01-12/833-25 от 30.11.94 г.) иммуноглобулины диагностические полигрупповые люминесцирующие включены в номенклатуру препаратов, по которой создаются запасы на случай возникновения эпидемических осложнений в Российской Федерации;

- разработана технология изготовления диагностикумов магно-сорбентных на основе микрогранулщюванных нолиакрилашщных сорбентов чумного, туляремийного, бруцеллезного, сибиреязвенного (антиспорового), холерного» сапного, мелиоидозного, гепатитного

А; утверждена Комитетом Госсанэпиднадзора РФ нормативно-техническая документация на диагностикумы магносорбентные чумной и туляремийный для ИФА и РИФ (регламенты производства, ВФС, инструкции по применению); Комитетом МИБП принято решение (протокол N7 от 24.11.94 г.) о внедрении этих диагностикумов в практику здравоохранения; утверждена "Инструкция по изготовлению и контролю тест-системы диагностической для выявления вируса гепатита А иммуноферментным методом" (протокол N 2 от 26.02.93 г. заседания Ученого Совета СтавНИПЧИ);

- оформлена технологическая документация на устройства для работы с МИС, изготовлены промышленные образцы этих устройств, выполненные в виде компактных укладок;

- приемы для работы с диагностикумами магносорбентными оформлены в виде методических рекомендаций "Использование магно-иммуносорбентов в иммунологических методах выявления корпускулярных и водорастворимых антигенов возбудителей инфекционных заболеваний (бактериологический, иммуноферментный, иммунофлуорес-центный)", утвержденных Комитетом Госсанэпиднадзора РФИапреля 1995 г.;

- созданы диагностические тест-системы на основе композиционных МИС для обнаружения и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний (чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы (антиспоровые), сапа, мелиоидоза, холеры, дизентерии) в иммуно-ферментном методе и методе количественной иммунофлуоресценции;

- составлена программа Госиспытаний тест-систем диагностических магносорбентных чумных, туляремийных, сибиреязвенных (антиспоровых), бруцеллезных, холерных (монопрепаратов) сухих для ИФА и РИФ, приготовленных по новой технологии. Нормативно-техническая .документация, утвержденная Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол N 7 от 16.06.1995 г.),представлена на рассмотрение в Федеральную комиссию по МИБП, дезинфецирующим и косметическим средствам МЗ РФ.

Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах по первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям (Ставрополь, 1995 г.) и семинарах для практических врачей и научных работников Госкомсанэпиднадзора по при-

менению магносорбентных препаратов в диагностике инфекционных заболеваний и мониторинге внешней среды на наличие инфекционных агентов (Ставрополь, 1991-1995 гг.)

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Научно-методические подходы к повышению эффективности получения гипериммунных сывороток, используемых для производства различных диагностических иммунобиологических препаратов (люми-несцирующих, агглютинирующих, магноиммуносорбентных).

2. Повышение технологичности производства иммуноглоблуинов диагностических чумных, сапных, ыелиоидозных, туляремийных, бруцеллезных, сибиреязвенных (антиспоровых) полигрупповых люминес-цирующих сухих.

3. Оптимизированный вариант технологии производства микро-гранулированных полиакриламидных магноиммуносорбентов (МИС).

4. Технология производства диагностикумов магноиммуносорбентных нового поколения на основе композиционного органомине-рального декстранокремнеземного носителя (КШС).

5. Технические устройства и методические приемы для работы с ыагноиымуносорбентами при выявлении возбудителей инфекционных заболеваний и их антигенов бактериологическим, иммуноферментным анализами и количественной иммунофлуоресценцией.

6. Диагностические магносорбентные тест-системы для ИФА и КИФА чумная, туляремийная, бруцеллезная, сибиреязвенная (антиспоровая), холерная, гепатитная А.

Апробация работы и публикации.

Основные результаты диссертационной работы были доложены и представлены на итоговой научной конференции (Ставрополь, 21-22 декабря 1989 г.); научной конференции (Омск, октябрь, 1993); межгосударственной научно-практической конференции "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний", посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (Ставрополь, 1994 ); научной конференции, посвященной 60-летию Иркутского противочумного института (Иркутск, октябрь, 1994 г); научной конференции Ставропольс!сого отделения Российского научного общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Ставрополь,

февраль, 1995 г.); конференции Ставропольской сельскохозяйственной Академии (Ставрополь, апрель, 1995); рабочем совещании представителей противочумных институтов России, занимающихся разработкой и производством ШБП (Ставрополь, 16-18 мая, 1995 г.); первой конференции по биотехнологии Северо-Кавказского региона "Современные достижения биотехнологии" (Ставрополь, 1995); Международной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек" (Москва, 4-7 декабря 1995 г.).

Основные результаты диссертации изложены в 47 научных публикациях, 3-х заключительных отчетах, а также в 12 нормативно-технических документах (инструкции, ЭПР, ВФС).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5-ти глав, заключения, выводов и списка литературы. Она изложена на 327 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и 33 рисунка. Список литературы включает 367 отечественных и 95 зарубежных литературных источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Характеристика водорастворимых анти.генных 'комплексов возбудителей особо опасных инфекций, используемых в производстве иммунобиологических диагностических препаратов

Известно, что выделение антигенов микроорганизмов в гомогенном виде для той или иной цели в подавляющем большинстве случаев осуществляется после перевода антигенов в растворимое состояние. При обилии методов нам было необходимо подобрать условия, обеспечивающие наиболее полное выделение специфических антигенов из микробных клеток. В производстве полигрупповых иммунных сывороток проводится комплексная иммунизация несколькими антигенами (в нашем случае пятью). Вследствие чего возникла необходимость в унификации способа получения антигенных комплексов.

При освоении производства иммуноглобулинов диагностических полигрупповых, люминесцирующих мы столкнулись с тем, что на этапе приготовления антигенов приходится манипулировать большими объемами биомасс из вирулентных -штаммов микроорганизмов (чумы, бру-

целлеза, туляремии, сапа, мелиоидоза), что значительно осложняет работу в силу того, что приходится прибегать к специальным мерам безопасности, и несмотря на это, не может быть абсолютной гарантии предотвращения лабораторного заражения персонала.

Вследствие этих обстоятельств правомерен вопрос о возможности замены (на этапе выделения антигенов) высоковирулентных производственных штаммов микроорганизмов на авирудентные или вакцинные в технологическом процессе производства диагностических препаратов.

1.1. Оптимизация условий выделения водорастворимых антигенных комплексов ООИ.

Для сравнительной оценки способов изолирования водорастворимых антигенных комплексов микроорганизмов мы (на модели бру-целл, как наиболее устойчивых к внешним воздействиям микробов) использовали солевую экстракцию (2,5 Z NaCl), механическую дезинтеграцию на аппарате Л.М.Евстюгова-Бабаева и М.М.Жванецкой, криолизис, экстракцию и ультразвуковую дезинтеграцию. 0 степени разрушения микробных клеток судии по оптической плотности, которую регистрировали фотоэлектрокалориметрически и по количеству белка в надосадочных субстратах.

Сравнительная оценка методов разрушения клеток бруцелл (а равно и методов выделения антигенных комплексов) показала преимущество ультразвукового действия. Разрушение микробных клеток при этом носило "взрывной" характер, особенно в первые 10 минут. После 15-20 мин..• воздействия УЗ-волн оставалось не разрушенным 15-5 Z микробных клеток. Далее происходило медленное разрушение оставшихся клеток, но, в основном, энергия ультразвуковых волн расходовалась на нагревание субстрата.

Проанализировав полученные данные, мы объединили два метода для более полного извлечения антигенных компонентов: водно-солевую экстракцию и ультразвуковую дезинтеграцию. Указанная схема получения водорастворимых антигенов представлена на рис. 1. Эта схема оказалась универсальной, и в дальнейшем она была использована для изоляции полноценных водорастворимых антигенов туляре-¡лийного, сапного, мелиоидозного, сибиреязвенного .микробов.

- и -

Рис.1. Схема получения водорастворимых антигенных комплексов микроорганизмов

Выращивание биомассы микроорганизмов на матрацах, смывание биомассы с матрацев, стерилизация биомассы, сушка ацетоном

Экстракция ацетонвысушен-ных микробных клеток 2,57. раствором ЫаС1 в течение 48 час

I

Центрифугирование при 4000 я 60 мин

Осадок клеток

Ультразвуковая дезинтеграция

п L

Центрифугирование при 20000 s 60 мин

Осадок клеток

Экстракция 2,5 Z раствором Nací 24 часа

Центрифугирование при

20000 г

60 мин

Осадок (удаляют)

Надосадочная -жидкость I

Нйдосадочная-жидкость И

Над осадочная-1

жидкость III

Диализ объединен--ных супернатантов (I+II+III) против дистиллированной воды 48 ч

Розлив в ампулы

Лиофильное высушивание. Запайка ампул. Этикети-ровка

1.2. С р авнительная характеристика водорастворимых антигенных комплексов. бруцелл в зависимости от вирулентности

Для получения высокоспецифичных диагностических сывороток (в частности бруцеллезных и туляремийных) ряд исследователей рекомендуют использовать для этой цели вирулентные штаммы микроорганизмов (Franek, Prohazka, 1965; Kubica, Blleckl, 1967; Чернышева и др., 1967; Левина, 1977 и др.).

В процессе освоения производства полигрупповой люминесциру-ющей сыворотки нами, основываясь на данных литературы, свидетельствующих о практической идентичности специфической активности антигенов чумного вирулентного и вакцинного (FI), сибиреязвенного вирулентного и авирулентного штаммов, мы успешно заменили регламентируемые вирулентный штамм чумного микроба Y.pestis 231 (708) на вакцинный штамм EV и сибиреязвенный B.anthracls 0C0-I на авирулентный B.anthracls 34 F2 Sterne. Учитывая полученные результаты, встал вопрос о возможности замены вирулентных штаммов бруцелл и туляремии, как наиболее опасных в процессе приготовления специфических антигенов микроорганизмов. Подобная замена позволила бы существенно упростить противоэпидемический режим работу, исключить необходимость проведения биологического контроля на специфическую стерильность (в случае бруцеллёза таковой контроль длится не менее 40 дней), снизить риск заражения производственного персонала.

С этой целью мы провели ряд исследований по сравнительному изучению антигенной структуры вирулентных и вакцинных штаммов бруцелл.

Методом зонального электрофореза в подиакриламидном геле исследованы водорастворимые антигенные комплексы всех шести видов бруцелл: B.melitensis, B.abortus, B.suis, B.canls, B.neoto-me, и вакцинных штаммов: B.melitensis Rev-I, B.abortus 19, B.suis 6.

У всех штаммов бруцелл (вирулентных и вакцинных) выявлено 9-14 белковых фракций. Все белковые фракции, обнаруживаемые в геле, по электрофоретической подвижности (Weber, Osborn, 1969,)

были разделены на 3 группы: 1 - медленно движущиеся белки (Rf от 0,0 до 0,45); 2 - белки со средней электрофоретической подвижностью (Rf от 0,45 до 0,65); 3 - быстродвижущиеся белки (Rf от 0,65 до 1,0). Протеинограммы бруцелл вирулентных и вакцинных штаммов одного вида были практически идентичны. Общими для всех изученных видов и штаммов бруцелл являются 11 фракций со следующими величинами Rf: 0,1; 0,11; 0,16; 0,25; 0,27; 0,31; 0,38; 0,44; 0,48; 0,65; 0,7. Большинство (восемь) из этих фракций по электрофоретической подвижности относятся к 1 группе медленно-движущихся белков. Вид В.suis (как вирулентный, так и вакцинный штаммы) имел 3 дополнительных фракции Rf 0,21; 0,55; 0,85. Для того, чтобы судить о степени сходства протеинограмм; различных видов, их сравнили по коэффициенту подобия (Блохина и соавт., 1979), Как видно из таблицы 1, белковые спектры бруцелл разных видов обладают значительной степенью подобия. Выделяются на общем фоне виды: B.melitensis, В.abortus и B.sius.

При изучении антигенного спектра в реакции двойной иммуно-диффузии в агаровом геле (РИД) (Ouchterlony, 1949) нами исполь-

.Таблица 1

Показатели подобия бруцелл разных видов (вирулентных штаммов)

Вид микроор- IB.meli-IB.abortuslB.suislB.canislB.ovislB.neoto-ганизмов Itensis l I l | imae

B.melitensis 100

В.abortus 100 100

В.suis 84-, 6 84,6 100

B.canis 83,4 83,4 92,2 100

B.ovis 72,8 72,8 75 81,2 100

B.neotomae 76,2 76,2 60,8 76,2 73,6

зованы водорастворимые антигенные комплексы бруцелл видов В.шё-litensis, В.abortus и В.suis вирулентных и вакцинных штаммов и гипериммунные кроличьи антисыворотки, полученные к вышеназванным антигенам. Антигенный спектр вирулентных культур бруцелл в гомо-

логичной и гетерологичной (межвидовой) системах постановки РИД имел следующий вид: сыворотка к B.melitensis 16-М выявляла у гомологичного штамма 7, а у штаммов В.abortus 544 и В.suis 1330 -4 антигенных компонентов. Антигенный спектр, выявляемый сывороткой В.abortus,характеризовался наличием 5 антигенов в гомологич- . ной системе, у B.melitensis и В.suis сыворотки к В.abortus выявляли 4 антигенных компонента. С гомологичным штаммом сыворотка к В.suis формировала 6 преципитационных линий, с антигеном B.melitensis - 5, В.abortus - 4. В перекрестных РИД (вирулентные -вакцинные штаммы) выявлены общие антигены: B.melitensis и В.suis - 4;. а В.abortus - 3.

Далее мы провели сравнительную спектроскопию водорастворимых белковых антигенных комплексов бруцелл этих трех видов, вирулентных и вакцинных штаммов. Было показано, что спектры поглощения практически идентичны..

Изучена токсичность для белых мышей изолированных водорастворимах компонентов бруцелл разных видов, патогенности и вирулентности. Водорастворимые компоненты бруцелл, выделенные из вакцинных штаммов, в значительной степени менее токсичны, чем таковые из вирулентных штаммов (в 1,7-3,5 раза).

1.3. Срав'нительная'характеристика водорастворимых антигенных комплексов туляремийного микроба в зависимости от вирулентности

Изучение методом диск-электрофореза в ПААГ белкового спеет ра вирулентных штаммов F.tularensis (543/6, 83 erys, 8Э0 Аз, Mi-ura, Schu), авирулентного 3'25/1765 к живой туляремийной ■ вакцины ЖТВ (штамм 15 НИИЭГ) показало, что при разделении образуется от 6 до 10 белковых зон.

При сравнительном изучении протеинограым туляремийнах антигенов штаммов разных подвидов отмечено, что характеризуются они как наличием обших белковых фракций с одинаковой электрофорети-ческой подвижностью, так и некоторыми индивидуальными белковыми компонентами. Общей для всех изученных подвидов туляремийного микроба является белковая фракция с Rf 0,65. Протеинограмма атамма НИИЭГ 15 (ЖТВ) состояла из 6 белковых фракций (Rf 0,11

-0,76). Общими с голарктическими и неарктическим штаммами были фракции с № 0,11; 0,65; 0,69 и 0,76. Авирулентный штамм 325/1765 голарктического подвида имел 9 белковых фракций с И1 от 0,02 до 0,78. У штамма присутствовала общая фракция со всеми исследованными вирулентными штаммами - К1 0,65. Кроме того выявлен еще ряд общих белковых фракций с различными штаммами туляремийного микроба: 1?Г 0,33 - Г.Ьи1агепз1з 83 егу3, 890 Аз, М1ига, ЗсЬи; И1 0,51 и 0,78 - Р.Ьи1агепз1з М1ига; И" 0,69 - Г. Шагеп-з1г и 15 НИИЭГ. Вычисленные коэффициенты подобия (табл.2) свидетельствуют, что степень подобия авирулентного штамма (325/1765) и вакцинного НИИЭГ 15 с другими (вирулентными) штаммами находилась в пределах остальных показателей.

Таблица 2

Показатели подобия штаммов туляремийного микроба

Штаммы микро-183 егу31543/6IMiura ISchu 1890 Аз 1325/1765ШИИЗГ организмов I II Ii I 115

F.tularensis;

83 егу3 . 100

F.tularensis

543/6 20

F.tularensis

Miura - 25

F.tularensis

Schu 25

F.tularensis

890 Аз 24

F.tularensis

325/1765 13,3

ЖТВ 23,1

100

23.5 100

17.6 22,2 100

15.7 22 21

13.3 19,4 17,6

27 17,6 20

100

23,5 100 18,7 20 100

При изучении антигенного спектра в РИД использовали водорастворимые антигены вирулентных, авирулентного и вакцинного штампов туляремийного микроба и гипериммунные кроличьи сыворотки, полученные к вышеуказанным антигенам . Антигены и антисыво-

ротки в гомологичной и гетерологиЧной системах постановки РИД формировали от 1 до 4 преципитационных линий. В перекрестных реакциях выявлено от 1 до 3 общих антигенов. В некоторых постановках определялись 1-2 индивидуальных антигена. Авирулентный и вакцинный штаммы имели 1-2 общих антигена с вирулентными штаммами туляремийного микроба.

Сравнительная спектроскопия водорастворимых белковых комплексов вирулентных, авирулентного и вакцинного штаммов туляремийного микроба показала практически совпадающие спектры поглощения.

Водорастворимые антигенные комплексы, полученные из вирулентных штаммов, значительно токсичнее для белых мышей по сравнению с таковыми из авирулентного и вакцинного штаммов туляремийного микроба (в 3-5 раз).

Таким образом, результаты исследований белкового спектра и антигенной структуры методами диск-электрофореза в ПААГ, РИД, , УФ-спектроскопии и тосичности водорастворимых комплексов, выделенных из вирулентных, авирулентных и вакцинных штаммов возбудителей бруцеллеза и туляремии, дают основание заменить высоковирулентные штаммы на непатогенные в процессе получения гипериммунных сывороток. Однако окончательное суждение по данному вопросу можно иметь только после сравнительного изучения их способности вызывать ответную иммунологическую реакцию у животных- продуцентов.

2. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ СХЕМЫ ИММУНИЗАЦИИ

Для разных целей требуются сыворотки с различными свойствами, поэтому нельзя разработать единый способ иммунизации животных, который бы гарантировал получение продукта, идеально удовлетворяющего всем требованиям. Тем не менее существуют определенные принципы получения антител, которые могут быть приняты за "основные правила", Наилучшие сыворотки получают в определенной степени методом проб и ошибок, поскольку каждый иммуноген отличается от других, и процесс образования антител у каждого животного имеет свои индивидуальные особенности. Необходимые свойства антисывороток - это высокий титр в сочетании с высокой авид-

ностью, а также специфичность. Первые (на которые оказывают влияние различные адъюванты) зависят от достижения баланса между неограниченной стимуляцией антигенчувствительных клеток в лимфо-идных тканях животных при условии персистирования иммуногена, с одной стороны, и от конкуренции между клетками за лимитированное количество антигена таким образом, чтобы отвечали лишь клетки с наибольшей аффинностью, - с другой. Специфичность же практически зависит от чистоты' иммуногена, поскольку даже небольшие посторонние примеси могут вызвать непропорционально сильное антитело-образование.

Исходя из перечисленных закономерностей, в каждом частном случае следует обосновать выбор отдельных звеньев процесса иммунизации, учитывая, что в динамике антителообразования ни один из перечисленных факторов (характер антигена, доза, кратность введения, метод аппликации) не действует изолированно.

2.1. Получение поли-и моновалентных гипериммунных сывороток

В Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте с 1988 г в соответствии с приказом МЗ СССР было начато освоение коммерческого выпуска полигрупповых люминесцирующих иммуноглобулинов, предназначенных для быстрого обнаружения прямым люминесцентно-серологическим методом одновременно шести возбудителей (чума, сап, мелиоидоз, туляремия, бруцеллез, сибирская язва) . Процесс производства показал, что целый ряд этапов изготовления данного препарата требует доработки и значительного усовершенствования с целью повышения технологичности. Так,/в ЭПР на этот препарат регламентирована схема иммунизации, включахшдо последовательные многоточечные внутрикожные введения смеси антигенов, указанных выше, с полным адыовантом Фрейнда (ПАЗ). Гипериммунизация включает четыре инъекции с интервалом в шесть дней, месячного перерыва и еще четырех инъекций с шестидневным интервалом. Иммунный ответ с производственными титрами сывороток (1:256 - 1:512), определяемыми в НРИФ, при такой схеме введения антигенов отмечался лишь у 25-30 Z иммунизируемых кроликов. Следовательно остальные животные уходили в отход по причине неравнозначного иммунного ответа-на отдельные антигенные компоненты.

Так, например, при высоких (производственных) титрах ка чумной и бруцеллёзный имыуногены выявлялись низкие титры на сапной, мели-оидозный и туляремийный антигены. Для увеличения выхода произ-йодственного сырья мы были вынуждены отбирать из отхода сыворотки с наилучшими показателями с их последующей коррекцией по тому или иному антигенному комплексу. Для этой цели получали моноспецифические сыворотки на все составляющие полигруппового антигена. Причем, процесс коррекции довольно сложен и трудоемок. Кроме того, у всех животных в результате использования ПАФ развивалась адъювантная болезнь, которая выражалась в возникновении множественных опухолевидных образований на месте введения с последующими изъязвлениями. У животных снижался аппетит, они теряли в весе.

Перед нами была поставлена задача получить высокоактивные, специфичные гиперимыунные сыворотки, разработав оптимальные схемы иммунизации, менее трудоемкие, не столь травматичные для животных, и сократить до минимума отход кроликов-продуцентов.

Для этого, не меняя вышеназванную схему иммунизации, вместо ПАФ были использованы следующие адъюванты: ланолин-вазелиновая смесь, адыовант на основе арлацеля, "опытный" адъювант, изготовленный в Ленинградском ВНИДОЧЕП, левамиэол и .липосомы с ' >т цетилфосфатом (ДЦФ) и без него.

Сравнительный анализ полученных результатов показал, что при применении в качестве адъЬвантов ланолин-вазелиновой смеси и липосом без ДЦФ титры гипериммунных сывороток, определяемые в НРИФ и РИД, были намного ниже производственных (1:64 - 1:128; 1:2 - 1:4 соответственно). Иммунный ответ при использовании адъ-юванта на основе арлацеля, "опытного", левамизола и липосом с ДЦФ был значительно выше. В отличие от других адъювантов. при введении липосом в месте инъекции не происходило образования гранулем и других нежелательных реакций. Таким образом, несмотря на некоторое повышение специфических титров у отдельных особей, процент выхода кроликов с производственными титрами не изменился.

В связи с вышеизложенным встал вопрос об изменении схемы иммунизации и поиске иных иммуноиодулирущих веществ.

Стимуляцию антителообразования, позволяющую получить значительное число животных-продуцентов с высокими титрами антител в крови, описали Е.Г.Кирдей с соавт. (1986). На одном из этапов гипериммунизации авторы использовали феракрил.

Мы, заменив ПАФ на феракрил в регламентируемой схеме гипериммунизации, добились увеличения выхода кроликов с производственными титрами до , (50+5) .7,. ^ В'зяв за основу предложенную Е.Г.Кирдеем с соавт. (1986)' схему иммунизации, для повышения специфической активности гипериммунных сывороток, кроме феракри-ла нами введен комплекс антиген-антитело, инъецируемый животным на определенном этапе; - _ *

Для получения гипериммунных .сывороток, ' Кроме антигенов из вирулентных штаммов возбудителей бруцеллёза (В.abortus ; 544/ B.melitensis 16-М, В.suis 1330) и туляремии (F.tularenSis о?Ю Аз., Schu, Miига, 83 erys, 543/6),*нами параллельно былй использованы водорастворимые антигены из вакцинных ■ штамме• бруйелл (В.abortus 19, B.melitensis Rev-i, В.suis 6) и авируле'нтрзго штамма F.tularensis 325/1745.

Способ гипериммунизации' заключается в , следующем: кроликам-продуцентам вводили по 0,6 мл 3 Z водно-спиртового раствора феракрила в подушечки задних лап. На 5-7 день антигены возбудителей чумы (0,2 мг), сапа (1 мг), мелиоидоза (1 Мг)', бруцеллеза (3 мг), туляремии (3 мг) смешивали с 1,2 мл 1 Z водно-спиртового раствора феракрила и по 0,6 мл вводили в подколенные лимфатические узлы. Через три дня такую же смесь* вводили внутримышечно трехкратно с промежутками в 4 дня. На 30 день от животных получали по 4 мл иммунной сыворотки, добавляли--половинные до^-ы антигенов в каждую.сыворотку. Полученный комплекс'антиген-антитело (Аг-Ат) вводили четырехкратно по 1 мл с промежутками в л-4 внутривенно тому животному, от которого получена иммунная см воротка. Специфическая активность полученных гипериммунных роток в НРИФ достигала 1:512 - 1:2048. а в ЫД 1:16 - 1:64. вне зависимости от использованисго "вирулентного" или "вакпинно го'' антигенов. Количество антителообразуюших кроликов-продуцентов с подобными титрами составляло 95 %. Кроме того, иммуностимулирующий эффект достигался при незначительном токсическом воз-

действии на животных, без возникновения адчювантной болезни. При этом феракрил способствовал значительному увеличению лимфоузлов, и это позволяло вводить антигены непосредственно в иммунокомпе-тентные органы.

Шестым комг. ом полигрупповых иммуноглобулинов являются сибиреязвенные (адсорбированные) иммуноглобулины. Необходимость отдельного получения сибиреязвенного компонента связана с тем, что ряд авторов указывали на значительное подавление антителооб-разования к другим антигенам при комплексной иммунизации животных (Буравцева и др. 1978; Пилипенко с соавт., 1980). В'связи с зим. в НТД на полигрупповые люминесцирующие иммуноглобулины для получения шестикомпонентного препарата иммунизацию животных -продуцентов осуществляли по схеме 5 + 1, т.е. чумной, сапной, мелиоидозный, бруцеллезный, туляреыийный антигены вводили одновременно (в одном шприце) одной группе животных, другую группу кроликов иммунизировали только сибиреязвенным антигеном. По схеме иммунизации сибиреязвенным антигеном, заложенной в НТД, выход кроликов-продуцентов с производственными титрами, определяемыми в НРКФ (1:3200 - 1:6400), составлял не более 25 7.. Применив разработанную нами схему иммунизации (с феракрилом), повышен выход кроликов - продуцентов до 80 X, при этом титры специфических антител в НРИФ превышали вышеназванные в 2-3 раза (от 1:12800 до 1:25600).

Используя вышеописанную схему иммунизации, мы также получили гипериммунные кроличьи ыоносыворотки - чумные, сапные, мели-оидозные, бруцеллёзные, туляремийные, специфические титры антител которых в НРИФ достигали 1:512 - 1:2048, а в РИД - 1:16 -1:64, что вполне удовлетворяло ' требованиям оценки сырья для дальнейшего получения диагностических препаратов.

2.2. Статистический анализ эффективности схем иммунизации

Статистический анализ проведен при ' помощи кошгаотера 1ВМ АТ-386 Дх по методике И.А. Ойвина (1960).

Проанализированы две схемы по.получению полигрупповых гипериммунных сывороток: схема, регламентированная НТД на иммуноглобулины диагностические дюминесцирующие полигрупповые (Схема!),

и разработанная нами схема (схема II). В обоих схемах мы использовали различные иммуномодулируювде вещества: ланолин-вазелиновая смесь, левамизол, адъютанты ФрейнДа, арлацелевый, ленинградский "опытный", липосомы, феракрил. Учет специфической, активности полученных полигрупповых сывороток оценивали в реакциях НРИФ и РИД по каждому из пяти антигенных компонентов. На рис. 2,3 представлены данные по бруцеллезному компоненту. Как видно из рисунка, полученные статистически достоверные результаты свидетельствуют о значительном преимуществе феракрила над остальными испытанными адиовантами вне зависимости от примененной схемы иммунизации (I или II).

2.3. Получение агглютинирующих диагностических сывороток

2.3.1. Получение диагностической туляремийной агглютинирующей с ы -в о р о т.к и

Разработанную схему иммунизации мы апробировали для получения агглютинирующих диагностических сывороток. Работа была выполнена совместно с сотрудниками Иркутского цаучно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока: к.б?н., доцентом Твменцевым С.Н., к.б.н. Андреевской Н.М., к.м.н., ст.н.с., Каретниковой Э.С., к.б.н., ст.н.с. Калиновскиы

A.И., к.б.н. Репиной'Л.П., к.м.н, Загоскиной Т.Ю., Михайловой

B. А.

Согласно регламента производства N 55-87, для получения агглютинирующей диагностической туляремийной сыворотки сухой для РА лошадям-продуцентам вводят кульгуру .туляремийного микроба, убитую кипячением.'Гипериммунизацию проводят циклами, состоящими из 5-6 внутривенных инъекций в возрастающих дозах с пятидневными интервалами. Таких инъекций проводят до 17 и более. Этот этап является наиболее длительным, ' трудоемким и сложным в процессе, производства агглютинирующей сыворотки с титром не ниже 1:3200. В среднем на подготовку к производственной эксплуатации одного продуцента требуется 45-47 месяцев. Вследствие этого товарная продукция дорогостоящая, поскольку для получения её нужного качества приходится годами содержать лошадей, использовать большое

схема 1

12 3 5 7

[Ж

схема 2

1 г Ъ 4 5

Рис,2.Специфическая активность в РИД бруцелезного компонента в полугрупповой гипериммунной сыворотке при использовании различных адьювантов и схем иммунизации.

схема 1

3 5?

Пгшу

1 2 3 4 5 6 ?

схема 2

Рис.3.Специфическая активность в НРИФ бруцеллезного компонента в полигрупповой гипериммунной сыворотке при использовании различных адъювантов и схем иммунизации.

Обозначения Ацьюванты:

• I 1 - ФРЕЙНДА 4 Е-И - ЛАНОЛИН-ВАЗЕЛИНОВЫЙ

2 Г" I - АРЛАЦЕЯЕВЫЙ 5 ЕЗ - ЛИПОСОМЫ

3 ЛЕНИНГРАДСКИЙ "ОПЫТНЫЙ" б ЩЦ --ЛЕ8АМИ30Л

7 ЕШЗ - ФЕРАКРИЛ

ПРИМЕЧАНИЕ: Цифровые обозначения по оси ординат даны в условных

единицах

количество антигена и проводить многократные иммунизации.

Обобщив собственный опыт работы по получению диагностических сывороток и сведения литературы, мы предложили принципиально новую схему иммунизации. Лошадям-продуцентам вводили подкожно в область нижней трети шеи по 2 мл 3 % водно-спиртового раствора феракрила. На 6-7 день инъецировали по 300 млрд м.к. инактивиро-ванной формалином культуры туляремийного микроба в предлопато-чные лимфатические узлы в смеси с 2 мл 1 % раствора феракрила. Через 2 дня такую же смесь вводили внутримышечно в увеличивающихся дозах (400 , 500 , 600 , 700 млрд.м.к.) с промежутками в 4 дня.На 7-8 день после последней инъекции антигена брали пробу крови, получали сыворотку и определяли титр антител. Если титр был ниже 1:3200, делали стимулирующее кровопускание в обьеме 2-3 литров. Получали иммунную сыворотку, отбирали 4 порции сыворотки по 100 мл и в каждую добавляли антиген-инактивированную культуру туляремийного микроба в вышеуказанных возрастающих дозах. Далее проводили второй цикл иммунизации из четырех внутривенных введений с 4-дневными интервалами комплекса антиген-антитело (Аг-Ат). На 7-8 день брали пробу крови, получали сыворотку и определяли титр антител. Обычно он был достаточным (1:3200) для производственного кровопускания. Разработанная нами схема иммунизации апробирована на трех лошадях. Применение новой схемы иммунизации лошадей значительно сокращает срок подготовки продуцентов ( с 45-47 месяцев до 4-7 месяцев). За счет этого снижаются затраты на содержание лошадей,подготовку антигенов и 'процесс иммунизации. Надежность этой схемы иммунизации подтверждается получением однотипных результатов при использовании трех продуцентов.

Качество диагностической туляремийной сыворотки, полученной по разработанной нами схеме, изучено в соответствии с ФС 42.112 ВС-88 и свидетельствует о полном соответствовании требованиям НТД.

2.3.2. Получение диагностической бруцеллёзной агглютинирующей сыворотки

Современные методы получения специфических бруцеллёзных диагностических сывороток основаны на использовании высокоиммуно-

генных, но, как правило, вирул'ентных или с высокой остаточной вирулентностью живых клеток бруцелл. Так, согласно регламента производства N 273-82 для получения диагностической агглютинирующей сыворотки иммунизируют кроликов-продуцентов живыми вирулентными клетками В.abortus 146 и B.melitensis 565 (lxlO9 м.к. в 1 мл) четырехкратно. Сыворотка диагностическая бруцеллёзная агглютинирующая имеет титр не ниже 1:1600. Недостатком вышеуказанного способа является постоянный повышенный риск инфицирования персонала.

Чтобы исключить возможность заражения на наиболее опасном этапе производства (работа с зараженными продуцентами), изучена возможность получения бруцеллёзной кроличьей агглютинирующей сыворотки с использованием вместо* живых клеток бруцелл их липопо-лисахаридного антигена (ЛПС), выделенного горячей водно-феноль-ной экстракцией из B.melitensis 16-М. При иммунизации животных использовали разработанную нами схему. Установлено, что в сыворотке крови кроликов вырабатываются специфические антитела к гомологичному штамму и другим представителям рода бруцелл в S-фор-ме в объемной реакции агглютинации до титра 1:2560 - 1:5120, в РИД - 1:32. Полученные диагностические бруцеллёзные сыворотки не уступали по активности и специфичности аналогичному коммерческому препарату. Качество диагностической бруцеллёзной сыворотки, полученной по разработанной нами схеме', изучено в соответствии с ФС 42-126 ВС-88 и соответствуют её требованиям.

2.4. Получение холерной иммунной сыворотки

В производстве холерных агглютинирующих сывороток для иммунизации продуцентов используют корпускулярный 0-антиген. В качестве оптимальной схемы иммунизации кроликов рекомендовано пятикратное введение О-антигена - 5-7-9-11-13 млрд микробных клеток. Максимум накопления антител наблюдается на 7-й день после последней инъекции антигена. Выработку же агглютининов и вибрио-цвдных антител, специфичных для холерных вибрионов, стимулирует не весь комплекс антигенов клеток вибриона, а его дипополисаха-ридный антиген (Петрова, 1964; Misra, Shrivastava, 1960), вследствие чего вполне обосновано применение его в производстве диаг-

ностических препаратов. Работа по использованию ЛПС в этих целях предпринималась ранее рядом авторов (Лавровская с соавт., 1964; Тюменцев с соавт., 1980, 1983; Яговкин, 1930; Андреевская с соавт. , 1984, 1987 и др.). Основываясь на вышеизложенном, нами были предприняты попытки по получению специфичных, высокоактивных гипериммунных холерных кроличьих сывороток на основе деградированного липополисахаридного 0-антигена, предложенного С.Н.Тюмен-цевым с соавт. (1983) для получения холерных агглютинирующих сывороток.

В работе использовали штаммы возбудителя холеры: V.cholerae eltor Rv-79 (Инаба); V.cholerae eltor 5695 (Огава); V.cholerae cholerae 569-B (Инаба);V.cholerae cholerae M 143 (Огава).

Холерные вибрионы сероваров Инаба и Огава в S-форме выращивали в течение 3-х часов в 1 % пептонной воде (pH 7,6), пересевали на пластинчатый агар Мартена или Хоттингера (pH 7,7-7,8) и инкубировали при 37° С в течение 18-20 часов. Далее культуры смывали с питательной среды и выделяли липогликопротеид методом водной экстракции по методике С.Н.Тюменцева с соавт. (1983).

Готовый препарат представляет собой комплексное соединение белка, полисахаридов, липидов с незначительным содержанием нуклеиновых кислот.

Учитывая малую эффективность отдаленной реиммунизации при получении холерных сывороток с использованием ЛПС (Дертева с соавт. ,1972; Яговкин, 1980; Адамов, 1981; Тюменцев с соавт., 1984, 1986; Андреевская, 1987), сочли нецелесообразным применение разработанной нами схемы, эффективной для других инфекций. При получении холерных иммунных сывороток мы применили другой вариант: кроликов иммунизировали четырехкратно, вводя антиген по 0,5 мг (в суммарной дозе 1 мг) в смеси с 1,2 % водно-спиртового раствора феракрила в задние лапки, подколенные лимфоузлы, передние лапки, задние лапки поочередно с интервалом в 4 дня. Тотальное кровопускание проводили на 7 день после заключительной инъекции -антигена. Специфическую активность сывороток оценивали в реакциях агглютинации, НРИФ и РИД. Титры специфических антител в вышеназванных •реакциях были следующими: 1:3200 - 1:7000 (РА); 1:512 - 1:2048 (НРИФ); 1:16-1:64 (РИД), что свидетельствует о пригод-

ности полученных иммунных сывороток для производства холерных диагностических препаратов на их основе.

2.5. Влияние схем иммунизации на иммунологическую реактивность животных-продуцентов

Для получения сыворотки каждого вида приходится разрабатывать индивидуальную оптимальную схему иммунизации'продуцентов. При этом часто не учитывается возможность проявления специфической иммунологической ареактивности. При иммунизации животных- продуцентов новым антигеном с использованием оптимальных, схем, к сожалению, приходится сталкиваться с возникновением своего рода специфической иммунологической ареактивностью, так как наступает такой период, когда дальнейшее введение антигена не сопровождается повышением титра антител. В одном случае специфическая иммунологическая ареактивность развивается быстро, в другом медленно. Например, при получении диагностической туляреыий-ной агглютинирующей сыворотки лошадей-продуцентов иммунизируют, согласно действующей нормативно-технической документации, цикда-ни, состоящими из '5-6 внутривенных инъекций в возрастающих дозах культурой туляремийного микроба, убитой кипячением, с интервалом 3-5 дней. Многолетние наблюдения за динамикой накопления агглютининов в крови лошадей-продуцентов туляремннной диагностической сыворотки показывают, что после 2-3 циклов иммунизации титр специфических антител устанавливается в пределах 1:400 - 1:800. Несмотря на продолжающуюся иммунизацию, активность сывороток увеличивается очень медленно, и лишь через несколько лет титры антител достигают показателей 1:3200 - 1:6400. С этого-момента начинают получать производственные серии сывороток. В среднем на подготовку одного продуцента требуется не менее 45 месяцев.(Тю-менцев с соавт., 1994).

Все вышеуказанное наводило на мысль о возможности проявления специфической иммунологической ареактивности за счет депрессивного действия антител на процесс антителообразования в период гипериммунизации продуцентов. Феномен депрессивного действия антител на антитеообразование является предметом изучения многих авторов (Прокопенко, Рябович-Щербо, 1974; М1зга,^Shгlvastava,

1960 и др.) и может считаться в настоящее время установленным фактом.

Исходя из этого, свои исследования мы начали с выявления влияния специфических антител на динамику иммунного ответа при введении кроликам липополисахарида холерных вибрионов. По ходу выполнения экспериментальной работы цифровые показатели подвергали статистической обработке.Для оценки антигенных свойств ЛПС и эффективности схем иммунизации использовали метод определения средней арифметической величины по В.Монцевичюте-Эрингене (1964).

В опыт I взяли 12 кроликов, разделив их на 4 группы. Животным первых двух групп вводили ЛПС холерного вибриона внутривенно с двухдневным интервалом в увеличивающихся дозах (0,05 - 0,10 -0,15 - 0,18 - 0,20 мг) - в дальнейшем использовалась оптимальная схема (Тюменцев с соавт., 1983; Тюменцев, Андреевская, Безносов, 1983). Для животных первой группы ЛПС растворяли в 1 мл физиологического раствора, для второй группы - в 1 мл кроличьей холерной агглютинирующей 0-сыворотки с титром агглютининов 1:3200. Кроликам третьей и четвертой групп ЛПС (по 0,5 мг) сначала вводили в подушечки задних, а через 7 дней - передних лап. Для животных третьей группы ЛПС растворяли в 0,4 мл физиологического раствора, четвертой группе - в 0,4 мл кроличьей холерной агглютинирующей 0-сыворотки.

Для ответа на вопрос: не возникает ли подобное явление in vivo, в опыте II 10 кроликов были разделены на 2 группы. Всем животным ЛПС вводили шесть раз с интервалами 7 дней. Пяти кроликам первой группы антиген инъецировали поочередно в подушечки задних и передних лап по 0,01-0,01-0,5-0,5-0,5 мг в 1 мл физиологического раствора. Кроликам второй группы антиген растворяли тагосе в 1 мл физиологического раствора и вводили внутривенно по О,001-0,001-0,001-0,05-0,05-0,5-0,5 мг. Пробное взятие крови делали каждые два дня, тотальное кровопускание производили на 7 день после последней инъекции антигена.

Для выяснения значения доз и интервалов вводимого ЛПС на возникновение иммунологической ареактивности у кроликов проведен опыт III на двух контрольных и шести опытных кроликах. Всех жи-

вогкых реиммунизировали лпс внутривенно. Контрольных животных иммунизировали по оптимальной схеме, указанной выше. Опытных животных иммунизировали ЛПС двукратно по 0,001 мг с семидневным интервалом. Затем первой паре животных опытной группы антиген вводили на 27 и 47 дни в дозе 0,05 мг, второй паре - в той же дозе на 47 день. На 67 день всех опытных животных иммунизировали по оптимальной схеме. Лробы крови у животных брали через каждые пять дней для наблюдения за изменением титров агглютининов. Животных обескровливали на 7 день после последней инъекции антигена.

Возможность пассивной передачи специфической иммунологической ареактивности к холерному ЛПС показана в опыте 1У. Опытным животным внутривенно вводили по ю мл кроличьей холерной агглютинирующей 0-сыворотки (титр 1:3200). Через четыре часа у них брали пробу крови и иммунизировали животных по оптимальной схеме. Опытным и контрольным животным ЛПС вводили внутривенно в следующих дозах: 0,05-0,1-0,15-0,18-0,2 мг с двухдневными интервалами.

Наблюдение за животными и динамикой накопления антител в их сыворотках показали следующее.

В опыте I выраженную общую реакцию, проявляющуюся повышением температуры тела, учащением пульса и дыхания, наблюдали у животных первой и третьей групп после первых инъекций антигена. У животных второй и четвертой групп подобных явлений не наблюдалось. У животных первой и третьей групп значения средней арифметической титра агглютининов в объемной реакции агглютинации достигали 1:5733+986 и 1:4833+723 соответственно, в то время как у животных второй и четвертой групп подобные титры не превышали 1:433+72 и 1:170+29. Это свидетельствует о том, что антитела, содержащиеся в холерной агглютинирующей 0-сыворотке, нейтрализуют пирогенные, токсичные, антигенные свойства ЛПС и оказывают депрессивный эффект на антигелообразование.

В опыте II у животных первой группы наличие антител в сыворотке крови зафиксировано на 5-й день после первой инъекции, в дальнейшем титр их нарастал до 14 дней и у отдельных животных к этому сроку достигал 1:1500 - 1:4028. В последующем четко прос-

леживалась тенденция ■ снижения количества антител, несмотря на увеличение вводимых доз ЛПС. К концу опыта титры антител у кроликов составляли 1:570; 1:625; 1:650; 1:2150 и 1:3400. Во второй группе животных, иммунизированных внутривенно, у двух кроликов количество антител возрастало до пятой инъекции - 1:6800 -1:8000. У двух других кроликов изменения количества антител пос-'ле второй инъекции антигена графически выглядело в виде ломанных линий с резким падением титра сразу же после инъекции антигена и последующим подъемом. Титр антител в этом случае после шестой инъекции ЛПС составлял 1:3200. У одного кролика из этой группы после трех первых инъекций наблюдался подъем титра (до 1:1200), последующие инъекции не вызывали заметного повышения титра. Полученные материалы свидетельствуют о возникновении специфической иммунологической ареактивности к ЛПС после двух инъекций у всех кроликов первой и одного кролика второй групп. У двух кроликов второй группы возникла частичная ареактивность, поскольку последующие инъекции антигена в оптимальных дозах вызывали заметное ослабление синтеза антител, а у остальных кроликов такого состояния не отмечено на протяжении всего цикла иммунизации.

В опыте III образование антител наблюдали у всех опытных животных на 5 день после первой инъекции антигена, и к 19 дню их количество достигало максимума - 1:1400+492 - 1:1500+342. В последующем' прослеживалось снижение количества антител до титра 1:200+20 - 1:300+36. Введение антигена на 27, 47 и 67 дни сопровождалось незначительным нарастанием количества антител. Животные, подучившие ЛПС на 27 и 47 дни, оказались ареактивными к последующей иммунизации. Максимальные титры антител в сыворотке крови этих животных не превышали 1:1325+202 - 1:1900+400, в то время как у контрольных животных они были в пределах 1:5200+425. У животных третьей пары,, иммунизированных на 67 день, титр агглютининов был на уровне соответствующих показателей у контроль-. ных животных. Однако обращает внимание более быстрое снижение у них титра антител, чем у контрольных животных. К концу опыта титр антител снизился до 1:1375+224.

Таким образом, динамика накопления антител в сыворотке опытных животных свидетельствует о том,- что двукратное с интер-

валом б 7 дней введение ЛПС в дозе 0,001 мг оказывает слабое антигенное раздражение, приводящее в последующем к иммунологической ареактивности.

В опыте 1У фоновые сыворотки всех животных не содержали специфических агглютининов к холерным вибрионам. Специфические агглютинины выявлены в пробах сывороток, взятых после введения холерной агглютинирующей 0-сыворотки, а также в пробах, взятых на 7 день после последней инъекции ЛПС. У животных поаге введения холерной агглютинирующей 0-сыворотки титр агглютининов составлял 1:350+150 - 1:250+125, а после заключительной иммунизации - 1:574+62 и 1:287+53. У контрольных животных, иммунизированных только ЛПС, значение средней арифметической титра составляло 1:4000+236 и 1:5600+284.

В ряде случаев на вводимые нами дозы ЛПС при отдаленной иммунизации животные не проявляли видимой реакции, а при первичной иммунизации такие дозы были бы для животных летальными. Это наводит на мысль, что следует различать возникшую ареактивность или устойчивость к токсическим свойствам ЛПС, и ареактивность, проявляющуюся слабым антителообразованием (Громова с соавт., 1990; Громова, 1994). Это дает основание заключить, что при иммунизации животных ЛПС индуцируется выработка не только специфических агглютининов и вибриоцидных антител, но и антител, нейтрализующих токсичность липида А.

При иммунизации кроликов ЛПС холерных вибрионов нам не удалось наблюдать иммунологического паралича, сопровождающегося полным исчезновением антител, как это наблюдал Л.Н.Фонталин а др.(1978). Даже при клиническом проявлении интоксикации,, вызываемой высокими дозами ЛПС, животные оставались способами к биосинтезу антител. При внутривенной инъекции малых (подпороговых) доз ЛПС наблюдался меньший толерогенный эффект, чем при введении в подушечки лап. Это обьясняется, по-видимому, тем, что при введении непосредственно в кровь антиген быстро разносится по всему организму, при этом какая-то его часть остается ^заблокированной специфическими антителами, и она вступает.в контакт с В-лимфоцитами, индуцируя антатедообразование. Ареактивность, возникшая у животных после двукратного введения небольших доз ЛПС,

сохраняется до 60 дней. Её можно продлить путем однократных инъекций ЛПС. Специфическая иммунологическая ареактивность может быть передана интактным кроликам путем внутривенного введения иммунной сыворотки.

При подготовке продуцентов туляремийной агглютинирующей сыворотки, возможно, также возникает специфическая иммунологическая ареактивность, в следствие чего организм животного длительное время не реагирует специфически на введение антигена. Косвенное возникновение специфической ареактивности подтверждается возможностью сокраш,ения срока подготовки продуцентов, изменением схемы иммунизации (доз, частоты введения антигена) и применением иммуностимулятора - феракрила ( см. раздел 8.3.1).

Таким образом, на основании приведенных результатов можно утверждать, что выбор оптимальной схемы иммунизации продуцентов антигенами, содержащими ЛПС, имеет решающее значение в производстве диагностических сывороток. Введение "подпороговых" доз ЛПС холерных вибрионов вызывает иммунологическую ареактивность у кроликов, сохраняющуюся до 60 дней. Однократное введение "подпо-роговой" дозы ЛПС продлевает её. Иммунологическая ареактивность к ЛПС холерных вибрионов может быть передана интактным кроликам пассивно.

Таким образом, нами разработана производственная схема иммунизации, применимая для получения гипериммунных как поли-, так к моновалентных сывороток, являющихся высококачественным сырьем, используемым в дальнейшем для получения различных диагностических препаратов. При этом нами доказана возможность замены высоковирулентных бруцеллезных и туляремийных штаммов на вакцинные бруцеллезные и авирулектный тулярешйнкй штаммы на этапе производства антигенов без какого-либо ущерба для конечного продукта - поли или моновалентных иммунных сывороток. Преимущества данной схемы заключаются в значительном повышении выхода животных-продуцентов с производственными титрами (с 25-30 % до 80-95 % ); в существенном повышении титров специфически антител у иммунизированных животных по сравнению с регламентируемой схемой, предложенный способ более экономичен, менее трудоемок, атравмагичен для животных.

Применив разработанную нами схему иммунизации для получения диагностических агглютинирующих сывороток (бруцеллезной и туля-ремийной), нам удалось получить сыворотки с высокими титрами агглютининов, которые не -уступали по активности и специфичности аналогичным коммерческим препаратам. Качество диагностических агглютинирующих бруцеллезной и туляремийной'сывороток соответствовали требованиям, соответствующим НТД. При этом для исключения возможности инфицирования на наиболее опасном этапе производства бруцеллезной сыворотки (работа с зараженными продуцентами) вместо живых клеток вирулентных культур бруцелл нами использован липополисахаридный антиген из В.теШепз1з 16-М. При производстве диагностической туляремийной агглютинирующей сыворотки применение новой схемы иммунизации лошадей-продуцентов позволило значительно сократить срок подготовки продуцентов ( с 45-47 месяцев до 4-7 месяцев). За счет этого,существенно снижаются затраты на содержание лошадей, подготовку антигенов и иммунизацию.

На разработанную схему иммунизации получен патент "Способ получения диагностической сыворотки" К 2010577 от 15.08.94 г.

При производстве холерной иммунной сыворотки, основываясь на данные литературы о неэффективности длительной и отдаленной реимыунизации с использованием холерного липополисахарида, мы применили иную, сокращенную схему иммунизации. Полученные иммунные сыворотки отвечали требованиям к сырью для получения диагностических препаратов.

При иммунизации животных-продуцентов любыми антигенами, но особенно липополисахаридной природы, необходимо иметь в виду возможность возникновения иммунологической реактивности,то есть наступление такого момента, тогда дальнейшее введение антигена продуценту не сопровождается повышением титра антител. Это обстоятельство необходимо учитывать при отработке оптимальной схемы иммунизации тем или иным антигеном.

3. ПОЛУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЖШНЕСЦИРУЩИХ ШШЮГЛОБУЛИНОВЫК ПРЕПАРАТОВ

С целью эффективной диагностики инфекционной патологии максимально достоверным является обнаружение факта присутствия ан^ тигенов возбудителя во внутренних биологических средах организма

хозяина, либо в объектах внешней среды при использовании тест-систем,основанных на применение аффинных реагентов, маркированных флуоресцентной, радиоактивной, ферментной и другими молекулярными метками. Особый интерес вызывают препараты, дающие возможность одновременного обнарунения сразу нескольких инфекционных агентов. Так™ препаратом являются иммуноглобулины диагностические полигрупповые лшинесцирующие,« предназначенные для быстрого обнаружения прямым люминесцентно-серологическим методом одномоментно шести возбудителей (чума, canj мелиоидоз, туляремия, бруцеллез, сибирская язва).

С целью совершенствования технологии нага изучены различные способы выделения иммуноглобулинов и условия их конъюгации с ФИТЦ для получения лгаинесцирувдих диагностических препаратов. Иммуноглобулины выделяли сульфатным (Kekwick, 1940), сульфат-ри-ваноловкм методами (Иаханина, 1968), преципитацией каприловой кислотой (Steibuch, Andran, 1969) и ПЭГ-6000 (Poison et al., 1964). Оптимальным явился каприловый метод в силу того, что в преципитате содержалось до 90 % фракции igG, незначительное количество остатков альбумина," и для конъюгации с ФИТЦ требовалось наименьшее количество флуорохрома, обеспечивающее оптимальное молярное отношение Мф/Мб. Это способствовало снижению вероятности неспецифических реакций.

Были изучены также различные. условия конъюгации белка с ФИТЦ: значение рН реакционной смеси, нагрузка красителя, время его контакта с белком, температурный режим конъюгации. Отмечено, что после добавления красителя в первые минуты происходит снижение ед рН на 0,3-0,5, при этом значительная часть красителя не вступает в реакцию с белком. В связи с этим необходимо проводить контроль показателей рН и их корректировку в первые минуты после добавления ФИТЦ и через 30 минут после начала метки. Наилучшие серии конъюгатов были получены в наших экспериментах при значении рН реакционной смеси 9,5, нагрузке ФИТЦ 20 мг на 1 г белка, температуре 20 °С и 2-х часовом контакте белка с красителем.

В настоящем исследовании обобщены результаты изучения физико-химических свойств, специфической активности, чувствительности и специфичности 24 экспериментально-производственных серий

полигрупповых люминесцирующих иммуноглобулинов; 7 серий чумных люминесцирующих иммуноглобулинов; туляремийных, бруцеллезных, сибиреязвенных (антиспоровых), сапных, мелиоидозных, холерных люминесцирующих иммуноглобулинов (по 10 серий).

Критериями оценки физико-химических свойств моно- и полигрупповых люминесцирующих иммуноглобулинов 'служили: внешний вид, растворимость, прозрачность, цветность, щелочность, остаточная влажность, концентрация белка, количественное соотношение ФИТЦ/белок. В таблице 3 представлены выборочно типичные серии изученных препаратов.

В работе использовали нативные свежеприготовленные взвеси культур микроорганизмов в концентрации 5x10® м.к./мл по 0С0 мутности ГИСК им.Л.А.Тарасевича. Активность люминесцирующих препаратов испытывалась на четырех-пяти гомологичных штаммах каждого вида возбудителя в пяти псвторностях.

Установлено, что специфическая активность моно- и полигрупповых препаратов Бсех приготовленных серий характеризуется красящим титром, равным разведению 1:32 - 1:128 при исследовании мазков гомологичных возбудителей, рабочее разведение препаратов - 1:16 - 1:64.

Для определения чувствительности люминесцирующих иммуноглобулинов использовали гомологичные штаммы в следующих концентрациях: 5хЮ6; 1x10е ; 5х105; 2,5х105; lxlO5; 5х104 микробных клеток в 1 мл. Показано, что рабочее разведение испытанных серий препаратов давало возможность обнаруживать микробы в мазках, приготовленных из 5х105 и более микробных тел в 1 мл. С помощью всех серий удалось выявить (не во всех полях зрения) единичные бактерии в мазках, приготовленных из взвесей, содержащих 2,5х105 м.к. в 1 мл.

Диагностическая ценность люминесцирующих антител определялась не только на чистых культурах, но и в имитированных пробах внешней среды (смывы с предметов обихода, фильтраты воздуха, пробы воды, почвы). Для проведения этого этапа работы использовали по пять нативных взвесей гомологичных штаммов в концентрациях, равных чувствительности препаратов (5х105 м.к./мл) и в -5 раз большей (2,5x10® м.к./мл). В результате проведенной работы

Таблица 3

Физико-химические свойства поли- и моновалентных ясминесцируюздос иммуноглобулинов (выборочно)

Критерии оценки Г Серии иммуноглобулинов '

I 10 ПГ I 15 Ш1 117(вакц.)ПГ1 1ч 15 т (вакц.)I 3 6 17б(вакц.)1 4х

Внешний вид Компактная пористая таблетка желто-оранжевого цвета

Растворимость В 0,5 мл дистиллированной соды в течение 1 мин. Прозрачность Раствоо прозрачен

Цветность ¡Нелтого цвета

щелочность, рН 9,0 9,0 8,7 8,8 9,0 9,0 8,9 8,9

Остаточная

влажность, % 2,0 2,1 2,0 2,0 2,0 2,3 2,5 2,3

Концентрация 1

белка, £ 1,08 1,0 1,1 0,99 1,09 0,98 1,08 1,09 со

Количественое 01

соотношение 1

ФИТЦ/белОК 5,6 6,7 6,4 5,4 3,8 4,1 7,0 7,0

Количество приготовленных серий 24 7 10 10 10 10 10

Обозначения: цифры 10, 15, 17, 4, 1 и т.д. - номера серий иммуноглобулинов (выборочно); ПГ - полигрупповые иммуноглобулины;

ч, т, б, х - чумные, туляремииные, бруцеллезные, холерные иммуноглобулины соответственно;

вакц. - иммуноглобулины на основе антигенов из -вакцинных штаммов

установлено, что в мазках, приготовленных из проб внешней среды, содержащих в 1 мл 5х105 м.к., имеются единичные клетки с интенсивным специфическим свечением.

Для изучения специфичности испытываемых серий люминесцирую-щих иммуноглобулиновых препаратов в опыт было взято 100 штаммов культур гетерологичных микроорганизмов (Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolitica, E.coll, S.typhimuriùm, S.typhiabdominalis, S.typhi, Sh.flexneri, Sh.sonnei, Sh.dysenteriae, Sh. boydii, B.abortus, B.melitensis, B.suis, V.cholerae cholerae, V.cholerae eltor, V.non 01, Y.pestis, F.tularensls, B.cereus, B.megaterium, B.subtilis, P.llaniefascens, P.mendocini, P.nonligfasciens). В результате константировано отсутствие специфической иммунофлуо-ресценции у всех гетерологичных микроорганизмов, взятых в опыт и окрашенных'рабочим разведением дюминесцирующих антител.

Таким образом нами изготовлены иммуноглобулиновые диагностические люминесцирующие препараты (полигрупповые,, чумные, бруцеллезные, холерные, сапные, мелиоидозные,. туляремийные, сибиреязвенные) на основе гипериммунных сывороток, полученных по разработанной нами производственной схеме иммунизации, отвечающие ШВТ, предъявляемым к люминесцирующим препаратам. Доказана возможность замены трех вирулентных штаммов бруцелл на вакцинные и пяти высоковирулентных туляремийных штаммов на один авирулентный на этапе изготовления антигенов, используемых для иммунизации животных-продуцентов.

. Согласно информации Госкомсанэпиднадзора РФ (N 01-12/833-25 от 30.11.94 г.), иммуноглобулины диагностические полигрупповые люминесцирующие включены в номенклатуру препаратов, по .которой создаются запасы на случай возникновения эпидемических осложнений в Российской Федерации.

4. МАГН0С0РБЕНТЫ: СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ В настоящее время для избирательного концентрирования и обнаружения антигенного материала, в том числе бактериальных клеток, нашли применение различные иммуносорбционные методы (Шаха-нина с соавт., 1969; Сербезов и др., 1973; Закревский, 1980; Григорьев, 1991; Масленникова с соавт., 1992 и др.). Среди них

известны способы селективного концентрирования микроорганизмов иммуносорбентами, которые представляют собой антитела, переведенные в нерастворимую форму, но сохраняющие, специфическую активность (Незлин, 1972). Дополнительные удобства и значительные преимущества перед общепринятыми методами появились с начатом использования сорбейтов с магнитными свойствами, которые применяются в качестве твердой фазы для селективного концентрирования на их поверхности различных антигенов и микроорганизмов.

Рядом исследователей (Пуикарь с соавт., 1985; Подзолкова с соавт., 1988; Ефременко с соазт., 1989; Владимцева с соавт., 1990 и др.) для диагностики ООН были предложены и использованы магнитные полиакриламвдные микрогранулированные сорбенты (МИС). Экспериментальные серии полиакриламидных магнитных сорбентов с .иммобилизованными лигандами различной природы нашли применение в бактериологическом методе, прямом и непрямом методах количественной инмунофлуорэсцэнции, при осуществлении прямого и непрямого вариантов имыупоферментного анализа. Особые преимущества использования МИС в этих методах проявляются при исследовании сильно загрязненных проб, а также при низкой концентрации в пробе исследуемого материала, который способен селективно концентрироваться на поверхности магнитных сорбентов. Анализ литературы показал, , что довольно успешные экспериментальные разработки по магноиммуносорбентам, по!сазавшие перспективность и необходимость этих препаратов, не1 завершились их промышленным освоением и внедрением в отечественную практику. Нам известен лишь один ком-, мерческий препарат на основе сор5ента с магнитными свойствами -"МадподеГ" (Франция). По всей вероятности, сложившееся положение связано с существующими многочисленными технологическими сложностями приготовления ШС, невсегда воспроизводимыми результатами по причине недоведеяия экспериментальной технологии до промышленного уровня и другими подобными обстоятельствами.

4.1. Получение полиакриламидных магноиммуносорбентов

В 1991 г от МЗ СССР и Главного эпидемиологического управления Ш СССР Ставропольский и Волгоградский научно-исследовательские противочумные институты^получили техническое задание на на-

учно-технологическую разработку набора магноиммуносорбентов диагностических для выявления возбудителей чумы, туляремии, бруцеллёза, сибирской язвы, сапа и мелиоидоза. Перед нами были поставлены следующие задачи: разработать технологию псшиакриламид-ных магносорбентов (МС); сконструировать на основе МС диагности-куш магносорбентные для тест-систем МФА и ■ РИФ с чувствительностью методов не выше 5х103 м.к./мл; составить научно-техническую документацию, выпустить экспериментально-производственные серии препаратов. Работа выполнялась совместно с сотрудниками Волгоградского НИПЧИ: академиком РЭА Тихоновым Н.Г., д.б.н., ст.н.с. Климовой И.М., к.б.н., ст.н.с. Пушкарем В.Г.

Наиболее важными моментами в технологии получения МС являются проблема стабилизации дисперсий, выбор оптимальных стабилизаторов и их концентрации, хорошее смачивание раствором мономеров частиц капсулируемого продукта и адгезия капель олигомера к их поверхности, а также скорость полимеризации мономеров.

Применив высокодисперсный магнитный материал на основе феррита, стало возможным получить сорбент с ярко выраженными магнитными свойствами. Составляющие частицы данного материала обладали хорошей смачиваемостью и химической инертностью в водных и буферных растворах. Использование феррита не влияло на скорость полимеризации используемых мономеров и позволяло получить ыик-рогранулы с равномерным включением магнитного материала.

С целью повышения уровня гидрофильных свойств магнитного порошка, для лучшего включения его в полиакриламидные гранулы нами разработана-методика, включающая предварительную обработку магнитного порошка путем промывки его ацетоном, дистиллированной водой с последующим фосфатированием. Фосфатное покрытие кроме повышения уровня гидрофильности порошка, достаточного для включения в полиакриламидный гель, дополнительно придает ему коррозийную стойкость.

Для приготовления микрогранулированного полиакриламидного магнитного сорбента использовали метод эмульгирования потоком газообразного азота (Пушкарь о соавт., 1984).

Таким образом, нами отработана технология получения полиак-риламидных магносорбентов, позволяющая получать микрогранулы с

равномерным включением магнитного материала, размером 20-100 мкм, с ярко-выраженными магнитными свойствами.

Для получения МИС использовали микрогранулированный полиак-рилачидный носитель с включенным в него магнитным материалом. Лигандом служили IgG, выделенные с помощью ПЭГ-6000 по A.Poison et al. (1964) из специфических, высокоактивных гипериммунных кроличьих сывороток против - антигенов "из вакцинных и вирулентных штаммов. Иммобилизацию IgG на МС проводили путем их кова-лентного присоединения с использованием глутарового альдегида. Принципиальная технологическая схема получения микрогранулиро-ванных полиакриламидных МИС представлена на рис 4. На основе результатов разработок оформлен патент "Способ получения магноим-муносорбентов"(заявка N 5040754-/13 (021070), решение ВНИИГПЭ РФ от 7.06.95 о выдаче патента).

4.2. Т е х н и ч е с к и е устройства и методические приемы для работы с ШС

Для работы с магноиммуносорбентами необходимы специальные технические устройства, обеспечивающие эффективное автоматическое перемешивание, сепарацию, перенос, фиксацию магнитных сорбентов в заданном режиме и т.д.Совместные разработки Ставропольского и Волгоградского научно-исследовательских противочумных институтов привели к созданию комплекта, технических устройств для работы с ШС, обеспечивающих выделение различных микроорганизмов из различных объектов внешней среды, а также их экспресс-анализ в иммунологических реакциях (ИФА и РИФ). Устройства размещены в компактной укладке, легко транспортируемой ручным способом, работа с которой возможна как в лабораторных, так и в полевых условиях. Проведены Государственные медицинские и технические испытания комплекта приборов и приспособлений для работы с ШС. Комитетом по новой медицинской технике РФ (от 28.08.95) дане разрешение на их серийный выпуск. Для обнаружения и выделения с помощью МИС микроорганизмов, находящихся в воздухе, сконструировано специальное барботирующее устройство. Оформлен патент "Устройство для аспирации воздуха" (заявка N 95122036/20 от 26.12.95 г., решение ВНИИГПЭ РФ от 21.03.96 г. о выдаче патента).

Рис.4. Принципиальная технологическая схема приготовления полиакриламидного магноиммуносорбента

1. Приготовление магиосорбекга.

2.Приготовление машоиммуносорбента.

МС» га/пршаЯимегм««. 1ЧС «0-800 ист/1 ил 1ИЬ)

От»»мни МИСот РммИС* мсоюмютоса ¿ала ампулы^чмйка №СБ,г-Э род по 14 т

Для выявления возбудителей инфекционных заболеваний бактериологическим методом, а также их корпускулярных и водорастворимых антигенов в иммунобиологических методах исследования (бактериологическом, иммунофлуоресцентном и иммуноферментном) с использованием ШС и технических устройств для работы с ними разработаны методические приемы. Схема проведения анализов представлена на рис.5.

Составлены методические рекомендации, утвержденные Комитетом Госсанэпиднадзора РФ 11 апреля 1995 г.

4.3. Характеристика диагностику-мов магноиммуносорбентных и их применение

Приготовлено по 7 серий препаратов для диагностики возбудителей чумы, туляремии, бруцеллёза, холеры, сибирской язвы (антиспора), сапа, мелиоидоза. Их оценку проводили по следующим критериям: форма и размер гранул, подвижность в магнитном поле, специфическая активность и специфичность в иммуноферментном анализе и методе количественной иммунофлуоресценции.

Все испытанные серии диагностикумов представляли собой гранулы сферической формы и имели размеры от 20 до 100 мкм. Время сорбции 10 мг сорбентов из объема жидкости 1 .мл под действием постоянного магнита была не более 3 секунд.

' Чувствительность диагностикумов испытывали на 3-5 типичных гомологичных штад/ах каждого'вида возбудителя в пяти повторное-тях при разведении микробных взвесей с 1х104 м.к./мл до 1х103м.к./мл (корпускулярные антигены). Установлено, что специфическая активность препаратов обеспечивает определение соответствующих микробных клеток обоими методами анализа (ИФА и КИ-ФА) в ¡концентрации 1х103 м.к./мл возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза, холеры, сибирской язвы, сапа и мелиоидоза, в том числе в пробах, имитирующих объекты внешней'среды.

Специфичность препаратов, оцененная на типичных гетерологичных штаммах в этих же методах, позволяет проводить анализ без перекрестных реакций с исследованными гетерологичными микроорганизмами. Оцененные таким образом специфическая активность и специфичность оказались равноценны у диагностикумов, полученных на

анализов о

роведенкя б&ктериологиче

скс:го

исполъ сованием диаз]

с

1 2 Суспензии исследуемого материала(от 3 до 30 мл).Экспозиция 1-2 часа.Т=22 ±4°С при постоянном перемешивании.

флуоресцентного, иммунсфермент-

м; 1Гноимму1

:осорбентных (МИС)

1 2 ' Собрать МИС магнитной палочкой в стеклянном чехле

!

1

2

Промыть в физ. растворе 5-7 раз.

Посев

МИС на плотные и жидкие селективные питательные среды.

Люм.микроскоп с фотометрической насадкой

Отмыть 5-7 раз физ.раствором.

Экспозиция 30-4(^мин ^ри

Электронный пульт для ИФА

основе антигенов из вирулентных и вакцинных штаммов.

В дальнейшем МИС были апробированы при поиске возбудителей инфекционных заболеваний в различных объектах внешней среды. Выявление возбудителя чумы в Центральном Кавказском очаге осуществляли с помощью полиакриламидных МИС. Объектами исследования служили экстракты из блох, .счесанные с сусликов, части трех гнезд сусликов и пробы нестерильной почвы, зараженной возбудителем чумы (1С3 м. к. на 1 г почвы). Высевы материала из экстрактов блох на агар Хоттингера (рН 7,2) с генцианвиолетом проводили параллельно, используя методику концентрирования живых клеток на поверхности магнитных иммуносорбентов и традиционный метод посева заразного материала на среды того же состава. В обоих случаях выделены вирулентные культуры чумного микроба. При анализе кон-таминированной почвы с использованием МИС положительные результаты получены в 80 X случаев ( в 12 из 15 опытов). В то же время ни в одном из опытов не обнаружено культур при прямом посеве материала на среды.

Таким образом,показана возможность использования магнитных полиакриламидных иммуносорбентов в эпиднадзоре за чумой и их преимущество перед традиционными методами анализов.

В 1990 г. во время вспышки холеры в Ставрополе были использованы диагностику}«) магносорбентные холерные, которыми "заряжали" ловушки. Последние устанавливали в различных точках забора материала (открытые водоемы, водопровод, канализационные стоки и т.п.). В итоге было выделено 2 культуры У.сЬо1егае еНог из воды родника "Корыта" и сточной воды "Северного коллектора" городской канализации. Следовательно, используя магноиммуносорбенты, можно организовать непрерывное наблюдение за наличием холерных вибрионов в воде открытых водоемов, водопроводов, канализационных систем. Такой мониторинг в руках эпидемиологов может быть мощным средством в эпиднадзоре за холерой.

По просьбе практического здравоохранения нами была разработана диагностическая тест-система для выявления вируса гепатита А в обьектах внешней среды и материале от больных в ИФА на основе магносорбентов. В результате исследования 381 пробы положительные анализы на вирус гепатита А составили 22,9-36,4 %

(канализационные стоки инфекционных больниц, сточные воды курортной зоны городов Кавминвод и других объектов). При заборе материала (фекалий) больных гепатитом А людей в ИФА тест-система выявляла специфический антиген в разведении исходной пробы до 1:320 - 1:640 и не давала перекрестных реакций при исследовании материала, полученного от больных другими инфекционными кишечными заболеваниями (сальмонеллёз, дизентерия, острый гастроэнтерит, а также от больных вирусным гепатитом В).

Вышеизложенное позволяет заключить, что нами разработана тест-система диагностическая, предназначенная для быстрого выявления вируса инфекционного гепатита А в объектах внешней среды и в материале от больных в ранние сроки заболевания иммунофермент-ным методом с использованием магноиммуносорбентов.

Таким'образом, нами разработан оптимальный вариант технологии изготовления микрогранулированных полиакриламидных магнитных сорбентов, на основе которых сконструированы диагностикумы маг-ноиммуносорбентные чумной, туляремийный, бруцеллезный, сапной, мелиоидозный, сибиреязвенный (антиспоровый), холерный, гепатитный А. Изготовлено несколько десятков опытных и производственных серий указанных диагностикумов. Лабораторные и полевые испытания показали их высокую чувствительность (1х103 м.к./мл) и специфичность. Проведены Государственные приемочные испытания диагностикумов магносорбентных чумных и туляремийных для ИФА и РИФ, составлена НТД (регламенты производства, ВФС, инструкции по применению), утвержденная ГИСК иы.Л.А.Тарасевича. Комитетом МИБП дано разрешение СтавКИПЧИ на их производство и внедрение в практику здравоохранения (протокол N7 от 24 ноября 1994 г.).

Опыт экспериментально-производственного освоения диагностикумов магносорбентных на основе полиакриламидных микрогранулированных сорбентов на базе лаборатории диагностических препаратов СтавНИПЧИ показав, что недостатками указанных диагностикумов является длительность и многостадийность их получения, использование дорогостоящих импортных реактивов. Поэтому дальнейшее совершенствование препаратов шло в направлении поиска дешевых, прочных и технологичных матриц, легко поддающихся модифицированию, с использованием отечественных, доступных реактивов.

Проанализировав научную литературу, мы остановили свой выбор на высокодисперсных кремнеземах, имеющих большую удельную поверхность с гидроксильным покровом, способную к замещению гид-роксильных групп функционально активными,г малые размеры частиц, высокие сорбционные свойства, устойчивость к воздействию физико-химических факторов'. На их основе наш были разработаны, так называемые, композиционные магнитные иммуносорбенты (КМИС). В качестве структурных единиц, формирующих остов кремнезема, использовали пирогенную- форму диоксида кремния (азросил А-380) и магнитный порошок. Аэросил представляет собой продукт высокотемпературного парафазного гидролиза БЮЦ в токе кислорода с последующей конденсацией в парах воды. Модифицирование матрицы проводили декстраном и 0,06 % раствором бензохинона с последующим ковалентным связыванием белкового лиганда. Модифицирование сорбента бензохиноном приводит к образованию на поверхности сорбента олигогидрохинонных групп, имеющих преимущества перед альдегидными, проявляющиеся в способности ковалентного связывания с остатками различных аминокислот белкового лиганда, что повышает специфическую емкость иммуносорбента (рис. 6). .

КМС КМС КМИС

Рис. 6. Схема синтеза композиционного органо-кремнеземного магноиммуносорбента

Полученные композиционные 'органокремнеземные магноиммуно-сорбенты представляют собой высокодисперсные кикрогранулы неправильной формы с ярковыраженными магнитными свойствами,' обладающие хорошей смачиваемостью и эффективным оседанием в растворе, отсутствием склонности к конгломерации. Сорбенты имеют размеры гранул от 70 до 100 мкм. Среднее значение -их удельной поверхности - 70 м2/г, суммарный обьем пор -1,2 см3/г и средний радиус пор - 35 нм.

Таким образом, нами разработана принципиально новая технология получения КМИС (рис.7), преимуществами которых являются: использование нетоксичных отечественных компонентов технологии, их дешевизна, проста изготовления, механическая, химическая прочность, значительное увеличение активной сорбционной поверхности. Работа по конструированию композиционных магносорбентов выполнена совместно с д.х.н., профессором Ставропольской сельскохозяйственной академии Брыкаховым A.B.

Изготовлено по 10 серий.препаратов для диагностики возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза, холеры, сибирской язвы (антиспоровые), сала, мелиокдоза, гепатита А. Чувствительность перечисленных выше диагностикумов, оцененная в экспресс-иммуноака-лизах (ИФА и КИФА), во всех проводимых опытах была не менее, чем 1Х102 м. к./мл. Специфичность препаратов позволяет проводить анализы без перекрестных реакций с исследованными гетерологичньаш микроорганизмами (100 штаммов). Для проведения иммуноферментого анализа, кроме методики постановки реакции в планшетах, вами отработан и апробирован вариант проведения ИФА с КМИС во флаконах (типа пенищшюиовых).

Одним из. очень существенных преимуществ композиционных МИС перед полиакриламилными явилась способность переносить жесткие условия лиофилизащш. Это позволило получить сухие препараты с длительным сохранением исходных свойств. Данная характеристика явилась основополагающей для внедрения их в широкую медицинскую практику, поскольку жидкие МИС имеют небольшой срок хранение г не могут выйти из рамок экспериментальных. Активность КМИС, оцененная в реакции количественной иммунофлуоресценции и иммунофер-ментноы анализе после лиофилизации и хранения в течение 8 меся-

?чс 7 Пркнщшиаяг.ная технологическая схема приготовления ' -композиционного магноиммуносорбента

__&№ *1>А». ¡¡Ь 1 „Л л ,1 ,1.11 ."3 ¡У« Л . г 1._

Расгаор беюохинона 0X5% а харбснат-бшсарбонатном буфере (КББ).

Магшгтный порошок. РиОз

Дзросил —Ргсгаор дгкирана 0.5%.

м

Инкубация при 24°С 1 час.

(йШя^;

н

I ^

(I Г

5-

;1

ТЕРМОСТАТ

■ а

Сушка при 100 -110°с 0,5 часа

Инхубадм при 24 С 1 час, постоянно перемеишзая.

Надосадо"шук> жказлстъ слетают с помощью постоянного магшгга.

Отшшаиае КМИС 0,15 М ЫаС1 3-5 раз

Розшш в ампул».

Инкубация при. 24 "С 1 час.

Отмывание КМС а КББ и дистиллированное воде 3-5 раз

(О. •>3

Лиофилизацая

ЗалгВха ампул. Готовка КМИС.

- 4е -

цев (срок наблюдения) при температуре 4 °С и (24+2) °С, свидетельствовала о их высоком качестве.

На основании научно-исследовательских разработок составлена следующая НТД: регламент производства, BSC, инструкция по применению тест-систем диагностических магносорбентных чумных, тудя-ремийных, бруцеллезных, сибиреязвенных (антиспоровых), холерных (монопрепаратов) сухих для ИФА и РИФ, утвержденная Ученым Советом СтавНИПЧИ (протокол N 7 от 16.06.1995 г.).

Разработанные нами композиционные магноиммуносорбенты успешно испытань} в лабораторных и полевых условиях.

В ионе 1^94 г. проводились учебно-тренировочные занятия в полевых условиях СПЭБа института с участием представителя Краевого штаба ГО. Штатные методы экспресс-анализа не дали положи-тельных-находок из наживного материала (три зашифрованные пробы - смывы из внешней среды). Использование же композиционных МИС для селективного концентрирования на их поверхности исследуемых микроорганизмов с последующим выявлением методом количественной иммунофлуоресценции позволило в течение 2-2,5 часов выявить в пробе N 2 возбудитель сибирской язвы, а в пробе N 3 индентифи-цировать возбудитель чумы. Дальнейший ход исследуемых проб после их подращивания на питательна средах с использованием традиционных методов диагностики подтвердил наличие в пробах этих возбудителей. Эффективность использования КМИС была испытана во время вспышки холеры в Республике Дагестан в 1994 году. В бактериологической лаборатории Центра Госсанэпиднадзора (г.Дербент) было исследовано.90 ловушек, заряженных КМИС, которые устанавливали в канализационные стоки, оросительные каналы, реки, артезианские колодцы и др. объекты Дербентского района Дагестана. Доставляемые пробы исследовали методом количественной иммунофлуоресценции и бактериологическим - путем посева сорбента на питательные среды. Контролем служили пробы воды, взятые в этих же точках, исследуемые по классической схеме. Количественной имму-нофлуоресценцией удалось получить 15 положительных на холеру результатов. Из канализационных стоков одного из поселков, кроме дважды подтвержденных положительных результатов в КИФА, была выделена культура холерного вибриона .при посеве КМИС на питатель-

ные среды. Общепринятым бактериологическим методом ни в одном ~ случае выделить культуру холерного вибриона не удалось.

В июне-августе 1995 г. в работе СПЭБ в Чеченской Республике были применены КМИС с целью мониторинга внешней среды на холеру. За указанный период в бактериологическую лабораторию СПЭБ было доставлено 193 ловушки,котфрые ставили в пруды.реки Сушка, Нефтянка, каналы, сточные арыки и ливневую«канализацию в пределах г.Грозного.Доставленные пробы исследовались методом количественной иммунофлуоресценции и бактериологическим методом путем посева КМИС с ловушек на питательные среды. Контролем служили пробы воды,взятые в местах установки ловушек,исследуемые общепринятым бактериологическим методом.В июне-июле опытные и контрольные пробы дали отрицательный результат. В августе из стока пруда и из пруда кирпичного завода у пос. Грозненского были выделены три культуры холерного вибриона эльтор путем посева КМИС на питательные среды (эти же пробы, исследованные в КЙФА, дали положительный результаты).

На основе композиционных магносорбентов нами был сконструирован дизентерийный полигрупповой магносорбентный диагностикум для ИФА и КИФА. Приготовлено 5 серий диагностшсума. Проведенные лабораторные испытания всех серий препарата показали их высокую чувствительность (1х102 м.к./мл) и специфичность.

■Тагам образом, нами разработана технология получения магно-ссрбентных диагностикумов на основе высокоспецифичных гипериммунных сывороток. Лабораторные испытания и апробация в очагах свидетельствуют о надежности и перспективности использования этих препаратов в зпиднадзоре за различными инфекциями и экспресс-диагностике инфекционных заболеваний. ВЫВОДЫ

1. Разработана оптимальная производственная схема иммунизации продуцентов для получения поли- (чумные, туляреыийные, бруцеллезные, сапные, мелиоидозные) и моноспецифических гипериммуных сывороток, используемых в качестве сырья для получения различных диагностических препаратов, обеспечивающая повышение специфической активности в 2-4 раза, их стандартность, увеличение процента кроликов-продуцентов с производственными титрами антител с 25-30%

до 95 %, удешевление конечного продукта (патент N 201057 от 15.08.1994 г.).

2. Предложена оригинальная схема иммунизации лошадей продуцентов для изготовления туляремийной диагностической агглютинирующей сыворотки, позволяющая сократить производственный цикл иммунизации с 45-47 до 4-7 месяцев, значительно снизить тем самым трудозатраты и себестоимость продукции. Полученные экспериментально-производственные серии диагностической туляремийной сыворотки для РА отвечают требованиям, соответствующим НТД. Разработана оптимальная схема иммунизации для получения бруцеллезной диагностической агглютинирующей сыворотки с заменой живых клеток вирулентных культур бруцелл на липополисахаридный антиген.

3. Доказана возможность замены высоковирулентных бруцеллезных штаммов на вакцинные, туляремийных вирулентных штаммов на авирулентный или вакцинный штаммы в технологическом процессе производства МИБП.

4. Унифицирована производственная схема, позволяющая выделять наиболее полные^ антигенные комплексы из штаммов различных микроорганизмов с сохранением их нативности.

5. На основе полученных гипериммунных сывороток по предложенной схеме изготовлены экспериментально-производственные серии иммуноглобулинов диагностических люминесцирующих полигрупповых бруцеллезных; туляремийных; холерных; сибиреязвенных (антиспоровых); сапных; мелиоидозных; дизентерийных, отвечающих ОМБТ, предъявляемым к люминесцирующим препаратам.

6. Специфическая иммунологическая ареактивность может наступить при иммунизации животных-продуцентов любыми антигенами, чаще это возникает при иммунизации антигенами липополисахаридной природы, что необходимо учитывать при обработке оптимальной схемы иммунизации тем шш иным антигеном.

7. Разрабртан оптимальный вариант технологии изготовления мик^^от^шо^нж^полиакриламидных магносорбентов (заявка N 5040754/13*7.06.95 г. о выдаче патента). На их основе сконструированы диагностикумы магносорбентные чумной, туляремийный, бруцеллезный, сибиреязвенный (антиспорсвой), сапной, мелиоидозный, холерный, гепатитный (А) для ЙФА и КйФА, имеющие высокую чувстви-

тельность и специфичность. Комитетом Госсанэпиднадзора РФ утьерж- " дены ВЗС 42/Д-014 ВС-95, ВФС 42/Д-15 ВС-95, регламенты производства NN 510-95, 511-95, инструкции по применения диагностикумов магносорбентных чумного и туляремийного для ИФА и КИФА. Комитетом МИБП принято решение о внедрении препаратов в практику здравоохранения (протокол N 7 от 24 ноября 1994 г.).

8. Впервые создана технология получения магносорбентов нового поколения - композиционных на основе пирогенной формы диоксида кремния, модифицированной декстраном и бензохиноном. На их основе сконструированы высокоспецифичные диагностикуш композиционные магнокммуносорбентные (КМИС) (чумной, туляремийный, бруцеллезный, сибиреязвенный (антиспоровой), холерный, сапной, мелиоидозный, дизентерийный, имеющие высокую чувствительность (1х102 м.кл.).

9. Разработаны специальные технические устройства и методические приемы по использовании их в иммунобиологических методах выявления корпускулярных и водорастворимых антигенов возбудителей инфекционных заболеваний, оформленные в виде методических рекомендаций, утвержденных Госкомсанэпиднадзором России.

10. Лабораторные испытания и апробация в очагах инфекционных заболеваний диагностикумов магносорбентннх свидетельствуют об информативности, высокой чувствительности, специфичности, надежности и перспективности использования этих препаратов в эпидемиологическом мониторинге окружающей среды и экспресс-диагностике различных микроорганизмов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЯ

1. Определение, токсигенности бруцелл разных видов (Е. Н. Афанасьев, 9. А. Чернова). - //Болезни с природной очаговостью на Кавказе (Тез. дохл, краевой научной конфер. , посвященной 60-лети» образования СССР). - Ставрополь, 1982. - С. 8-9.

2. Антигенная структура бруцелл. Сообщение I. Сравнительная оценка методов выделения водорастворимых антигенов бруцелл (В. Н. Афанасьев, Н. Ф. Таран). - //Деп. в ВИНИТИ 12.09.88 г., Н6635-В.

3. Антигенная структура бруцелл. Сообщение II. Сравнительное изучение растворимых белков бруцелл методом зонального электрофореза (В. Н. Афанасьев, Н. Ф. Таран). - //Деп. в ВИНИТИ

12. оа. ее г., невза-в.

• 4. Антигенная структура бруцелл. Сообщение XII. Иммунодиф-фузный анализ водорастворимых антигенов бруцелл (В. Н. Афанасьев, И. Ф. Таран ). - //Деп. в ВИНИТИ 12. 09. 86 г. , Н6837-В.

5. Антигенная структура бруцелл. Сообщение 1У. Иммунозлект-рофоретический анализ водорастворимых антигенов бруцелл (Е. Н. Афанасьев, И. Ф. Таран ). -//Деп. в ВИНИТИ 12.09.88 г., И8838-В.

6. Антигенная структура бруцелл. Сообщение У. Изучение антигенных взаимосвязей бруцелл методом непрямой реакции иммуноф-луоресценции (Е.Н.Афанасьев, И. Ф. Таран). - //Деп. в ВИНИТИ 12. пд. 88 г. , Н6638-В.

7. Опыт производственного осврения .полигрупповых люминесци-руюяих иммуноглобулинов (М. Н. Гончарова, А. И. Тинкер, В. Ф. Иванова и др. ). - //Актуальные вол р. , эпидемиол. , профилактики и диагностики особо опасных инфекций. Тез. докл. итоговой науч. конфер. (21-22 декабря 1989)). - Ч. 1, Ставрополь, 1989. - а 59-82.

8. Пути усовервенствования диагностических полигрупповых люминесцируюцих иммуноглобулинов (А. К. Тинкер). - //Актуальные вопр. , эпидемиол. , профилактики и диагностики особо опасных инфекций. Тез. докл. итоговой науч. конфер. (21-22 декабря 1989)).

- Ч. II, Ставрополь, 1989. - С. 83-86. . '

9. Стимулирование антителообразования различными адъюванта-ми при изготовлении диагностических лвминесцируюцих сывороток (Е. Н. Афанасьев,1 Б. П. Цыбин, К. К Прокопьев). - //Актуальные вопр. , эпидемиол. , профилактики и диагностики особо опасных инфекций. Тез. докл. итоговой науч. конфер. (21-22 декабря 1989)). '

- 4. II, Ставрополь, 1989. - а 98-98.

10. Схемы гипериммунизации при получении полигрупповой диагностической люминесцирувдей сыворотки (Е. Н. Афанасьев). - //Акту- альные вопр. , эпидемиол. , профилактики и диагностики особо опасных инфекций. Тез. докл. итоговой науч. конфер. (21-22 декабря 1989)). - 4. 1, Ставрополь, 1989. - а 95-98.

11. Влияние многократных заморахиваний-^ттаиваний на активность Ф1А чумного микроба (Д. А. Будыка, Г. Н. Галенко, Е. В. Жданова и др. ). - //Сб. Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конф. Саратов, 1993 - С. 73-74.

12.' Выявление вируса гепатита А в объектах вневней среды (Н. ф. Василенко, В. И. Кфременко, К. Н-Гнутов' и др. ). - //Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней. Тез. докл. науч. конф. (Омск, октябрь, 1993). - Ставрополь', 1993. - С. "24-28. !

13. Оптимизация режимов лиофилизации антигенов возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза, используемых для проиэводстваимму-

ноглобулиновых диагностических препаратов (А. И. Тинкер, В. В. Жданова, В. В. Бинатова и др. ) - //Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней. Тез. докл. научн. конф. (Омск, октябрь, 1993 г. ) - Ставрополь. - а 299-301.

14. Отработка режимов лиофилизации антигенов возбудителей особо опасных инфекций, применяемых для производства иммуногло-булиновых диагностических препаратов (А. И. Тинкер, В. В. Жданова,

B. В. Бинатова и др. >. - //Деп. в ВИНИТИ 27. 07. 83 г. . И2129-В93.

15. Эпидемиологический мониторинг вируса гепатита А с помощь» магнитных сорбентов (Н. Ф. Василенко, В. И. Вфременко, И. Н. Гнутов и др. ). - //Натер, докл. Всероссийской науч. -практич. кснф. - Пермь, 1993. - С. 32.

16. Влияние схемы иммунизации на иммунологическую реактивность продуцентов диагностических препаратов (С. Н. Тюменцев, Н. К. Андреевская, Э. С. Каретникова). - // Актуальные проблемы профилактики особо опасных инфекций и природно-очаговых инфекционных болезней. Тезисы докл. науч, конфер. , посвященной 60-летию Иркутского противочумного ин-та, октябрь 1994 г. Иркутск, 1994. - С. 160-161.

17. Влияние многократных замораяиваний-оттаиваний на активность Ф1А чумного микроба (В. А. Кантеева, Е. В. Хданова, А. Н. Тинкер и др. >. - //Актуальные вопросы профилактики чумы и других и инфекционных заболеваний. Материалы межгосударственной научно-практической конференции, актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы. Ставрополь, 1994. - С. 93-94.

18. Диагностическая тест-система для выявления вируса гепа-' тита А (Н. Ф. Василенко, В. И. Вфременко, И. Н. Гнутов). - //Деп. в ВИНИТИ 15. 07. 94 .г. , N 1799-094.

19. Индикация возбудителей 00И с псмоцьн композиционных магноиммуносорбентов (Е.Н.Афанасьев, И. В. Харникова, А. В. Брыка-лов). - //Актуальные вопросы профилактики чумы' и других и инфекционных заболеваний. Материалы межгосударственной научно-практической конференции; актуальные вопроси профилактики чумы и других инфекционных заболеваний, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы. Ставрополь, 1994. - С. 40-41.

20. Использование композиционных иммуноссрбентов в реакции иммунофлуоресценцин (РИФ) для экспресс-диагностики возбудителей ООН (И. В. Харникова, А. 3. Брыкалов). - //Актуальные вопросы профилактики чумы и других и инфекционных заболеваний. Материалы мед-государственной научно-практической конференции, актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы. Ставрополь, 1994.

C. 88-90.

21. Использование композиционных иммуносорбентов в иммуно-

ферментном анализе . (ИФА) для экспресс-диагностики возбудителей ООН (й. В. Жарникова, А. В. Брыкалов), - //Актуальные вопросы профилактики чумы и других и инфекционных заболеваний. Материалы межгосударственной научно-практической конференции, актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний, посвя-ценной 100-летию открытия возбудителя чумы. Ставрополь, 1994. С 41-42.

22. Е вопросу об усовериенствовании препарата для люминес-центно-серологической диагностики возбудителя ' дизентерии (Е.В.Алиева, Е.Н.Афанасьев, Е. В. Жданова). - //Актуальные вопросы профилактики чумы и других и инфекционных заболеваний. Материалы межгосударственной научно-практической конференции, актуальные вопросы профилактики чукы и других инфекционных заболеваний, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы. Ставрополь, 1894. - С. 237-238. ч

- 23. Разработка тест-системы для экспресс-диагностики ООН (получение диагностических люминесцируюдих иммуноглобулиновых препаратов (Е. В. Жданова, Е.Н.Афанасьев). - //Ren. в ВИНИТИ 04. 11. 94 г. , N 2S08-B94. '

24. Разработка тест системы для экспресс-диагностики ООН (Магносорбентные диагностикумы) (В. В. Жданова, В. Н. Афанасьев). -//Актуальные вопросы профилактики чумы и других и инфекционных заболеваний. Материалы межгосударственной научно-практической конференции, актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы. Ставрополь, 1994. - С. 90.

25. Разработка тест-системы - для экспресс-диагностики ООН (люминесцируюцие иммуноглобулиновые препараты) (В. В. Жданова, Е.Н.Афанасьев). - ///.¡стуальные вопросы профилактики чумы и других и инфекционных заболеваний. Материалы межгосударственной научно-практической конференции, актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний, посвященной 100-лети» открытия возбудителя чумы. Ставрополь, 1994. - а 91.

28. Современное состояние изученности и лабораторной- диагностики возбудителей дизентерии (Обзор литературы) (Е. В. Алиева, В. Н. Афанасьев, Е. В. Жданова). - //Деп. в ВИНИТИ 04. 11. 34, N 2506-В94.

2?. Способ получения диагностической сыворотки (С. Н. Тюмен-цев, Н. М. Андреевская, А. И. Калиновский и др. ). - //Описание изобретения к патенту Российской Федерации, N 2010577. Б юл. Н 6, от 15. 04. 94 г.

28. Сравнительное изучение способов замораживания антигенов возбудителей чумы, туляремии и бруцеллеза, используемых в производстве иммунобиологических препаратов (В. А. Хантеева, А. К. Тиккер, В. В. Жданова). - //Актуальные вопросы профилактики чумы и других и инфекционных заболеваний. Материалы межгосударственной

1аучно-практической конференции, актуальные вопросы профилактики 1укы и других инфекционных заболеваний, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы. Ставрополь, 1994. - С. 51-52.

29. Усовершенствование производственной схемы иммунизации еивотных моно- и поликомпонентными антигенами (Е. В. Жданова, I. Н. Афанасьев). - //Деп. в ВИНИТИ 04. 11. 94 г. , N2507-B94.

30. Усовериенствование производственной схемы иммунизации твотиых моно- и поликомпонентными антигенами (Н.В.Жданова, !. ¡5. Афанасьев). - //Актуальные вопросы профилактики чумы и других и инфекционных заболеваний. Материалы межгосударственной научно-практической конференции, актуальные вопросы профилактики *умы и других инфекционных заболеваний, посвященной 100-летию зткрытия возбудителя чумы. Ставрополь, 1994. - С, 92-93.

31. Влияние условий замораживания на активность антигенов (умы, бруцеллеза, и туляремии (Е. А. Кантеева, В. И. Ефременко,

К. Тинкер). - //Деп. в ВИНИТИ 10. 07.95 г. , N2073-B95. .

32. Индикация возбудителей особо опасных инфекций с помощью сомпозиционных магноиммуносорбентов (В. И. Ефременко, Е. Н. Афанась-sb, К. В. Жарникова и др. ). - //Проблемы особо опасных и др, инфекционных заболеваний (Материалы юбилейной яонфер. , посвящ. LOO-летию открытия возб. чумы 18-19 окт. , 1994. Ставрополь). Jen. в ВИНИТИ 25. 01. 95 г. , Н221-В95.

33. Метод получения магноиммуносорбентов для диагностичес-сих тест-систем (А. 3. Брыкалов, И. В. Харникова,.0. В. Воробьева). -'/Сборник трудов 58-й науч.-методич. конфер. ("Соэерленствованке учебного процесса и применение технических средств обучения"). -Ставрополь, 1995. - С. 19-20.

34. Особенности эпидемиологии дизентерии в Ставропольском грае (2. В. Алиева, В. И. Ефременко, Д,Г. Дворников и др.). - //Деп.

s ВИНИТИ 30. 01. 95 г. , N258-B95.

35. Применение композиционных магноиммуносорбентов для зкс-зресс-диагностики сибирской язвы методом твердофазной иммунофлу-»ресценции (О. В. Воробьева, А. В. Брыкалов). - //Современные достижения биотехнологии. Материалы Первой конференции Северо-Хав-:азского региона (Ставрополь, сентябрь, 1995). - Ставрополь, 1995. - С. 90.

36. Разработка твердофазной реакции иммунофлуоресценции РКФ) на основа композиционных кагноинмуносорбентов (И. В. Жарни-cosa, А. В. Брыкалов, В. И. Ефременко). - //Современные достиаения >иотехнологии. Материалы Первой конференции Северо-Хавказсхого зегиона (Ставрополь, сентябрь, 1S95). - Ставрополь, 1995.

:. 87-88.

37. Разработка композиционных магноимнуносорбентов нового ¡околения и их применение для иммуноферментного анализа сибирской язе« {с/я) (О.В.Воробьева, А. В. Брыкалов). - //Современные ;остнвекия . биотехнологии. Материалы Первой конференции Севе-

ро-Кавказского региона (Ставрополь, сентябрь, 1995). - Ставро поль, 1995. - С. 92.

38. Способ получения магноиммуносорбентов (В. И. Ефременко А. Г. Хорошенький, В. В. Бинатова и яр. ). - //Заявка N 5040754/1 (012070), решение ВНИИГПЭ РФ от 7. 06. S5 г. о выдаче патента.

39. Сравнительная характеристика иммуноглобулинов, выделен ных разными способами (И. В. Жарникова, Е. В. Жданова). - //Актуаль ные вопросы профилактики чумы и других и Инфекционных заболева ний. Материалы межгосударственной научно-практической конференции, актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционны: заболеваний, посвяаенной 100-летию открытия возбудителя чумы. Ставрополь, 1994. - С. 21-212.

40. Сравнительная характеристика результатов иммунофэрмент-ного анализа (ИФА) в зависимости от твердой фазы (И. В. Жарникова А. В. Брыкалов, В. И. Ефременко). - //Современные достижения биотехнологии. Материалы Первой конференции Северо-Кавказского регион* (Ставрополь, сентябрь, 1995). - Ставрополь, 1995. - С. 88-89.

41. Стабилизация композиционных магноиммуносорбентов (КМКС) методом лиофилизации (И. В. Жарникова, А. И. Мирошниченко, А. В. Брыкалов). - //Современные достижения биотехнологии. Материалы Первой конференции Северо-Кавказского региона (Ставрополь, сентябрь, 1995). - Ставрополь, 1995. - С. 89.

42. Повышение эффективности улавливания микроорганизмов и: воздуха (С. М. Калькой, В. И. Ефременко, Н,И. Швецова). - // Матер. научно-практической конференции "60 лет противочумной службь Кавказа". Актуальные вопросы профилактики особо опасных и другиз инфекционных заболеваний. - Ставрополь, 1995. - С. 16-20

43. Новые препараты для диагностики и ветеринарно-санитар-ного мониторинга (В. И. Ефременко, А. В. Брыкалов, И. В. Жарникова). -//Материалы международной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек" (4-6 декабря 1895 г. ). - Москва, 1995.

С. 206.

44. Иагносорёенты в микробиологических исследованиях. Исследование магнитных сорбентов для выделения микроорганизмов из объектов внешней среды (Обзор литературы) (В. И. Ефременко). //Деп. в ВИНИТИ 26. 12. 95, N 3443 - В95.

45. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. Применение магнитных сорбентов в иммунофлуоресцентном анализе (Обзор литературы) (В. И. Ефременко). - //Деп. в ВИНИТИ 26. 12. 95, N 3444 - В95.

48. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. Применение магнитных сорбентов в иммуноферментном и радиоиммунном анализах (Обзор литературы) (В. И. Ефременко). - //Деп. в ВИНИТИ 26. 12. 95, N 3444 - В95.

47. Устройство для аспирации воздуха (С. М. Кальной, В. И. Ефременко, Н. М. Ввецова и др. ). - Заявка » 95122036/20 от 23. 12. 95г.

ешение ВНИЙГПЭ РФ от 21. 03. 96 г. о выдаче патента. СПИСОК ДОКУМЕНТОВ ПО ВНЕДРЕНИЮ НАУЧНЫХ ДОСТИЖЕНИЙ В ПРАКТИКУ

1. Экспериментально- производственный регламент "Иммуногло-улины диагностические чумные, сапные, мелйоидозные, туляремий-ыо, бруцеллезные, сибиреязвенные (антиспорсвые) адсорбированные оли групповые люминесцируюцие сухие - 351 с.

2. Зременная фармакопейная статья 42/Д-015 ВС-95 диагности-ума магносорбентного чумного жидкого для ИФ/. и РИФ - 10 с.

3. Инструкция .по применению диагностикума магносорбентного умного для ИФА и РИФ -6 с.

4. Временная фармакопейная статья 42/Д-014 ВС-95 диагности-ума магносорбентного туляремийного жидкого для КФА и РИФ - 10с.

5. Инструкция по применению диагностикума магносорбентного уляремийного для ИФА и РИФ - 8 с.

6. Регламент производства N510-95 диагностикума магносор-¡ентного туляремийного жидкого для ИФА и РИФ. - 207 с.

7. Регламент производства N511-95 диагностикума магносорбентного чумного жидкого для ИФА и РИФ. - 20? с.

8. Временная фармакопейная статья тест-систем диагностичес-:их магчосорбентных чумных, туляремийных, бруцеллезных, сибире-сзвенных (споровых), холерных (монопрепаратов) сухих для ИФА и >ИФ. - 10 с.

9. Инструкция по применению тест-систем диагностических ¡агносорбентных чумных, туляремийных, бруцеллезных, сибиреяэвен-шх (споровых), холерных (монопрепаратов) сухих для ИФА и РКФ. -I с.

10. Регламент производства тест-систем диагностических маг-юсорбентных чумных, туляремийных,•бруцеллезных, сибиреязвенных [споровых) .холерных (монопрепаратов) сухих для ИФА и РИФ. - 327с.

11. Инструкция по изготовлению и контролю тест-системы диагностической для выявления вируса гепатита А иммуноферментным методом. - 72 с.

12. Инструкция по изготовлению и контролю дизентерийного юлигруппового магносорбентного диагностикума для ИФА и ХИФА. -35 с.