Усовершенствование методов индикации Francisella tularensis и leptospira interrogans с применением иммобилизованных систем

Жарникова, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Усовершенствование методов индикации Francisella tularensis и leptospira interrogans с применением иммобилизованных систем
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование методов индикации Francisella tularensis и leptospira interrogans с применением иммобилизованных систем"

OU347958

На правах рукописи

ЖАРНИКОВА Татьяна Владимировна

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИНДИКАЦИИ FRANCISELLA TULARENSIS И LEPTOSPIRA INTERROGANS С ПРИМЕНЕНИЕМ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ

СИСТЕМ

03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

,1 5 О KT 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь - 2009

003479581

Работа выполнена в ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Ефременко Виталий Иванович;

доктор медицинских наук Антоненко Анатолий Дмитриевич.

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор Дмитриев Анатолий Федорович;

доктор биологических наук Селионова Марина Ивановна.

Ведущая организация: ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский

противочумный институт» Роспотребнадзора.

Защита состоится « 2009 г. в часов на засе-

дании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1, корп. 2, аудитория 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан « 2.$ г.

Ученый секретарь р

диссертационного совета " ^' ^^ Ржепаковскии И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эпидемиологическая обстановка по туляремии и лептоспирозу продолжает оставаться неблагополучной, что обусловлено наличием во многих субъектах Российской Федерации природных очагов данных иифекций (МУ 3.1.1128—02, МУ 3.1.2007-05), а также формированием новых. Сохранение природных очагов туляремии, циркуляция возбудителя среди домашних животных, а также вероятность применения Francisella tularensis при биотеррористических актах предопределяют актуальность исследований, посвященных совершенствованию диагностики данного заболевания. Сохраняющаяся активность очагов лептоспирозов в ряде регионов России, включая Ставропольский край, требует постоянного внимания со стороны санитарно-эпидемиологических служб и лечебно-профилактических учреждений (Ковалев HP. с соавт, 2006). В связи с этим, возникает необходимость применения современных информационных, диагностических, профилактических, производственных технологий, обеспечивающих профилактику заболеваний (Онищенко ГГ., 2007).

Существуют разнообразные методы индикации возбудителей указанных инфекций (бактериологические, биологические, иммунологические и т.д.), имеющие свои достоинства и недостатки. Перспективным направлением является разработка иммунодиагностических тестов, характеризующихся экспрессно-стыо, простотой технического исполнения и учета результатов в сочетании с высокой специфичностью и чувствительностью (Сырова H.A., Девдариани ЗЛ., Голова А.Б., 2007). Среди способов индикации возбудителей инфекционных заболеваний особое место занимают иммуносорбционные, в основе которых лежит принцип аффинности, базирующийся на специфическом связывании антигенов с комплементарными антителами. Новым этапом усовершенствования общепринятых методов диагностики является разработка, освоение производства диагностических препаратов на основе магноиммуносорбентов (Саяпина ЛВ. с соавт., 2007).

Среди лептоспирозной и туляремийной инфекций имеются общие пути заражения людей и источники инфицирования объектов внешней среды. В связи с этим, особое значение приобретает индикация возбудителей лептос-пироза и туляремии в сочетанных очагах. Одним из общих путей передачи инфекции является водный. «Купальные» вспышки возникают в результате нарушений санитарно - гигиенических правил при размещении животноводческих ферм и летних лагерей вблизи различных водоисточников, водопоя из открытых водоемов сельскохозяйственных животных, выделяющих патогены, заражением воды трупами грызунов, инфицированных возбудителями туляремии и лептоспироза. Традиционными методами выявить данных возбудителей сложно, так как их концентрация в водоеме ниже порога чувствительности известных методов диагностики. В связи с этим, необходим постоянный мониторинг за наличием данных патогенов в объектах внешней среды с использованием современных экспрессных методов индикации, обладающих высокой чувствительностью.

Цель работы - совершенствование методов индикации возбудителей туляремии и лептоспироза путем создания иммобилизованных бифункциональных и бивалентных диагностических препаратов, а также моно - и бивалентных магно-иммуносорбентов для селективного концентрирования патогенов при проведении микробиологического мониторинга объектов Внешней среда.

Основные задачи исследования: ' ' '

1) усовершенствовать Индикацию F. tulareftsis' v('L: interrogans путем постановки экспресс - анализа-с использованием высокоспецифйчных иммуноглобулинов флуоресцирующих;' Полученных одновременной хроматографиЧеской очисткой конъюгатаотнесвязавшегося красителя и гетерологичных антител;

2) отработать методику выявления F. tularertsis й L. interrogans в реакции суспензионной агглютинации (РСА) с использованием иммуносорбентов на основе кремнезёмно-флуоресцентной матрицы с антителами против эпидемически значимых штаммов возбудителей туляремии и лептоспироза;

3) - усовф&'ёнствовать и стандартизировать диагностическую тест-систему для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием иммобилизованных препаратов;

4) отработать'методы одномоментного селективного концентрирования возбудителей туляремии,5'' лептоспироза на бивалентных магноиммуносорбентах (МИС) с последующей постановкой ИФА при микробиологическом мониторинге возбудителей в объектах внесшей среды (в6да)"с низкой Концентрацией патогенов.

Научнаяновизна работы. Впервые для индикации F. iularensis и L. interrogans научно обоснованы новыесгсособы получствг иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих в результате одномоментной хроматографической их очистки от несвязавшегося флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) и гетерологичных антител на иммуносорбентах, обладающих экологической чистотой, доступностью, экономичностью и обеспечивающих высокую степень очистки препаратов. Пористая структура матрицы оптимальна для сорбции ФИТЦ и образования иммунохимического комплекса «антиген-антитело», исключает внутри-диффузионное торможение при аффинной хроматографии. Полученные иммунобиологические препараты обладают высокой специфической активностью при снижении материальных и трудовых затрат.

Впервые осуществлена научная разработка и скомпонована тест - система диагностическая на основе кремнезёмнсьфлуоресцентной матрицы с антителами против эпидемически значимых штаммов возбудителей лептоспироза'и туляремии для выявления F. tulctrensis и L. interrogans в РСА, обладающая высокой чувствительностью, специфичностью и увеличением срока годности. Преимущество применения разработанного препарата заключается в простоте постановки, быстроте получения результатов в РСА, увеличении срока годности до 3 лет (срок наблюдения) за счёт образования иммобилизованной системы, отработанных эффективных параметров получения препарата.

скршшнг - теста для микробиологического мониторинга объектов внешней среда,!. Предлагаемое сочетание МИС с экспресс-анализами позволяет ускорить детекцию возбудителей туляремии и лептоспироза в исследуемых пробах и повысить чувствительность анализов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Определены научные аспекты получения высокоспецифических туляремийных, лептоспирозных антигенов и антител, диагностических препаратов за счет исследования эпидемической значимости штаммов туляремийного и лептоспирозного микробов, выявления перекрестных реакций с гетерологичными штаммами, физико-химических свойств матриц, способов и параметров конъюгации лигандов, фиксации красителей на матрице, разработки моно - и бифункциональных иммобилизованных компонентов, отработки микробиологических тест-систем, проведение лабораторных испытаний и оценки их чувствительности на полевом материале.

Научно-методические разработки сочеганных методов использования им-муносорбционных компонентов в экспресс-анализах дополняют новыми научными данными сведения о возможности применения иммобилизованных систем, способствующих увеличению стабильности, чувствительности методов и проведению одновременной эффективной детекции возбудителей туляремии и лептоспироза в объектах внешней среды и биологическом материале.

При получении иммуноглобулинов флуоресцирующих для выявления возбудителей туляремии, лептоспироза разработаны методологические подходы по ковалентной фиксации гетерологичных антигенов на поверхности исследованных матриц, что позволяет получить бифункциональные аффинные сорбенты, применение которых приводит к сокращению материальных и трудовых затрат с сохранением первоначальной активности препарата.

Усовершенствованная РСА с применением полученных иммуносорбентов кремнезёмно-флуоресцентных туляремийных и лептоспирозных позволяет повысить стабильность, экспрессносгь (РСА длится 1- 3 мин., а РИГА (макрометод) — 24 ч.) и в три раза увеличить срок годности диагностической системы (срок наблюдения) без потери активности. Успешно проведены межлабораторные испытания совместно с сотрудниками лаборатории биологического и технологического контроля (ЛБЖ) Ставропольского научно-исследовательскою противочумного института (СтавНИПЧИ) (акт от 09.02.09 г.).

Предлагаемое сочетание разработанных бивалентных МИС с экспресс-анализами позволяет ускорить индикацию возбудителей туляремии и лептоспироза в исследуемых пробах и повысить чувствительность иммуноферментного анализа на 2-3 порядка за счет селективного концентрирования, исключения предварительных этапов очистки проб, увеличить срок годности иммобилизованных иммуноглобулинов в 4 раза (срок наблюдения) по сравнению с традиционным ИФА. Проведены межлабораторные испытания туляремийных МИС совместно с ЛБТК (акт от 24.12.08 г.), утверждена на данный препарат нормативная документация - ТУ 9388-006-01897080-2008.

Материалы научных разработок легли в основу трех методических документов, утвержденных на учрежденческом уровне внедрения: «Лабораторная

диагностика возбудителя лептоспироза» (протокол Учёного совета СтавНИПЧИ № 11 от 30.11.06 г.); «Индикация и идентификация возбудителя туляремии» (протокол Учёного совета СтавНИПЧИ № 5 от 07.06.08 г.) и «Критерии контроля качества экспериментальных серий тест-системы диагностической магаоимму-носорбентной для выявления возбудителя туляремии иммуноферментным методом» (протокол Учёного совета СтавНИПЧИ № 5 от 07.06.08 г.). Материалы методических рекомендации по лабораторной индикации возбудителя лептоспироза вошли в методические документы по сшштарно-эпидсмиологической охране территории Российской Федерации (Саратов, 2007).

Утверждена нормативная документация (пусковой регламент, инструкция по применению) на диагностикум суспензионный лептоспирозный иммуноглобули-новый (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 1 от 30.01.07 г.) и технические условия (ТУ), лабораторный регламент, инструкция по применению на тест-систему диагностическую магноиммуносорбентную для выявления возбудителя туляремии в ИФА (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 4 от 16.04.09 г.). Материалы диссертации используются на курсах первичной специализации и усовершенствования врачей по особо опасным инфекциям, в лекциях и практических занятиях по экспресс-индикации и применению иммуносорбентных препаратов в мониторинге возбудителей туляремийной и лептоспирозной инфекций в ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) выявление F. tularensis и L. interrogans в реакции иммунофлуорес-ценции (РИФ) эффективно с использованием разработанных высокоспецифичных иммуноглобулинов флуоресцирующих, полученных с применением бифункциональных иммуносорбентных препаратов с иммобилизованными гетерологичными антигенами для одновременной очистки препарата от несвязавшегося ФИТЦ и гетерологичных антител;

2) метод РСА с иммуносорбентом суспензионно-флуоресцентным позволяет выявлять F. tularensis и L. interrogans в концентрации 5x10s- 1х106м.кУмл при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами. Стабильность и срок годности препарата увеличены в 3 раза (срок наблюдения) по сравнению с традиционными суспензионными препаратами за счет эффективной иммобилизации лигандов на поверхности матрицы;

3) селективное концентрирование возбудителей туляремии, лептоспироза на разработанных моно - и бивалентных магноиммуносорбентах позволяет использовать их в ходе эффективного микробиологического мониторинга объектов внешней среды с целью индикации и изучения циркуляции указанных бактерий в очагах инфекций, в том числе и в сочетанных.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены: на Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 14 - 17 марта 2006 г.); IV съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчиникова (Пущино, 6-7 декабря 2006 г.); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России»

(Ставрополь, 21-22 марта 2007 г.); IX съезде научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26 - 27 апреля 2007 г.); IX Международной научной конференции и II Международной научной онкологической конференции (Пермь. Нидерланды - Германия - Франция, 26 апреля - 2 мая 2007 г.); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах - участниках СНГ» (Саратов, ■ 2007 г.); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009 г.).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках поисковой НИР «Подбор новых лабораторных методов и препаратов для использования в мониторинге лептоспирозов в Ставропольском крае» (2006-2008 гг.), НИР «Разработка производственной технологии композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и внедрение в практику магноиммуносор-бентных тест-систем на их основе для иммуноферментного анализа возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза» (№ Госрегистрации 01200952157) и научной школы НШ-2486.2008.7 при поддержке гранта Президента РФ в рамках темы «Создание твердофазных магнитоуправляемых тест-систем, обеспечивающих эффективный мониторинг за возбудителями бактериальных и вирусных заболеваний», отражено в 21 опубликованной научной работе, в том числе 3 работы - в изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК РФ и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой научной степени.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, приложения. Работа изложена на 163 страницах компьютерного текста, содержит 23 таблицы и 13 рисунков. Список использованной литературы включает 173 отечественных и 62 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

В работе использованы 36 штаммов микроорганизмов II-III групп пато-генности из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» Став-НИПЧИ: гомологичные - Francisella tularensis, Leptospira interrogans и ге-терологичные - Leptospira biflexa, Yersinia enterocolitoca, Yersinia pseudotu-berculesis, Escherichia coli, Brucella melitertsis, Brucella abortus, Brucella suis, Listeria monocytogenes. Для выращивания туляремийного микроба использовали желточную среду Мак-Коя, для инактивирования применяли хлороформ по методике, предложенной Н.Ф. Василенко с соавт. (1988). Для получения полноценных антигенных комплексов лептоспир выбраны штаммы

6 серогрупп, входящие в типовой диагностический набор штаммов для реакции микроагглютинации (РМА) и имеющие наибольшее эпидемиологическое и эпизоотологическое значение. Биомассы патогенных лептоспир выращивали на среде Ферворта-Вольфа, обеззараживали фенолом. Биомассу бруцелл выращивали в пробирках со скошенным агаром Альбими, для инактивирования использовали охлажденный до минус 40° С ацетон. Штаммы листериозного микроба засевали на глюкозо-глицериновый агар. Штаммы Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculesis, Е. coli выращивали на агаре Хоттингера. Контроль стерильности проводили биологическим и бактериологическим методами, изложенными в МУ 4.1/4.2. 588-96. Водорастворимые антигены изолировали комплексным методом: водно-солевой экстракцией и дезинтеграцией микроорганизмов (Василенко Н.Ф. с соавт., 1988).

В опытах были использованы: 16 кроликов породы «Шиншилла»; 30 беспородных белых мышей; 10 морских свинок, массой 250-300 г. Животных получали из питомника СтавНИПЧИ и после карантинизации использовали в опытах. Иммунные сыворотки-туляремийные и лептоспирозные получены иммунизацией кроликов по схеме, разработанной И.С. Тюменцевой (1994) и ЕЛ. Афанасьевым (2000). Контроль'специфической активности сывороток осуществляли в реакции радиальной иммунодиффузии по О. Оухтерлони (1949) в 1 % агаровом геле (Difco, USA) и в непрямой реакции иммунофлуоресценции (НРИФ) по Т.Н. Weller, А.Н. Coons (1954). При сорбции иммунных сывороток использовали аффинные сорбенты путем иммобилизации на магнитной алюмоси-ликатной матрице водорастворимых антигенов, выделенных из гетерогенных штаммов микроорганизмов (В. abortus 544, В. abortus 19-ВА, В. abortus 345; L. biflexa серогруппы Semarartga, серовар Patoc I.). При выделении иммуноглобулинов использовали методы фракционирования: каприловой кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969) и полиэтиленгликолем (ПЭГ-6000) «Мерк», Германия по A. Poison и др. (1964). Конъюгацию иммуноглобулинов с ФИТЦ .(C21H11NO5S) фирмы «Sigma» проводили по X. Шторц (Stortz, 1987). Прямой метод окраски препаратов осуществляли по А.Н. Coons, М.Н. Kaplan (1950). Контроль очистки конъюгатов от непрореагировавшего флуорохро-ма проводили методом восходящей хроматографии на бумаге (Носков Ф.С., 1985). Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по Р.К. Nakane, A. Kawaoi (1974) в модификации Е.А. Ткаченко с соавт. (1982). Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике М. Clark и A. Adams (1977) в "сэндвич"- варианте ИФА. Количественное определение белка проводили сравнением спектра поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ - 46 (Практическая химия белка, 1989). Очистку иммунопероксидазных конъюгатов от несвязавшихся иммуноглобулинов и фермента осуществляли на хромато-графической колонке фирмы LKB, используя сефадекс G-100. Лиофилиза-цию препаратов проводили в камере LZ-9c (Чехия) при вакууме' 10 Па, конечной температуре высушивания 30° С в течение (18 ± 2) ч. При "разработке иммобилизованных препаратов применяли алюмосиликат (ТУ 6-09-01-356-76);

полифепан - сорбент на основе древесного лигнина (Р.80/1211/3, производства ООО «Экосфера», г. Великий Новгород), окись железа (И) (ГОСТ 4173-77 ч.д.а.). Модификаторами сорбентов являлись: декстран (полиглюкин) - полисахарид, с молекулярной массой 0,5x1 (комбинат медпрепаратов "Красноярск"); натрия перхлорат - ТУ 6-09-3582-74. Микроструктуру поверхности сорбентов определяли по методу, описанному Д. Фрайфелдером (1980), Удельная поверхность сорбентов определялась по методу АА. Клячко-Гурвича (1961).

При выполнении работы исследовали полевой материал: воду из открытых водоемов Ставропольского края и внутренние органы животных из природных очагов туляремийной и лептоспирозной инфекций. Для подтверждения воспроизводимости и достоверности полученных результатов применяли статистические методы (Тамбовцев EJI., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий НЛ., 1969; Скуч Д., Уэсг Д., 1979). Математическую обработку результатов экспериментов проводили на компьютере (программа MS Office Excel ХР). Расчет значения средней квадратичной ошибки отдельного измерения (S), выборочной дисперсии (S2), вероятного квадратичного отклонения среднеарифметического (Е ^), проводили по Д. Скуч, Д. Уэсг (1979).

Результаты собственных исследований

Выявление возбудителей туляремии и лептоспироза с использованием иммуноглобулинов флуоресцирующих, изготовленных с помощью бифункциональных сорбентов

Качественная индикация возбудителей инфекционных заболеваний в РИФ возможна с применением выоокоактивных, специфичных иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих. Получение данных препаратов достаточно сложная задача. Во-первых, необходимо освободиться от несвязавшегося красителя, так как при его избытке наблюдается ложноположителыюе свечение. Во-вторых, надо очистить иммуноглобулины флуоресцирующие от гетерологичных антител, так как следствием невыполнения данной операции является неспецифическое свечение. Известны различные методы истощения сывороток от гетерологичных антител: использование в качестве адсорбентов микробных клеток, твердофазных полиакриламидных сорбентов. В первом случае существенно понижаются специфические титры антител. Во втором - титры антител снижаются незначительно, но технология приготовления полиакриламидных сорбентов является трудоемкой и включает использование высокотоксичных дорогостоящих импортных реактивов. Известны различные методы очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося флуорохрома, одним из которых является использование активированного угля. Однако при этом потери белка достигают 40 % (Скоупс Р., 1985). Чаще всего конъюгаты освобождают от несвязавшегося флуорохрома гельфильт-рацией на колонках с сефадексом G-50. При указанных условиях потеря белка незначительная, но для осуществления процесса необходимо применение колоночной хроматографии с сефадексом, имеющей ряд недостатков.

В связи с этим, мы приступили к разработке способа получения иммуносор-бента. Важным моментом являлся выбор эффективной матрицы, соответствующей ряду требований: матрица должна иметь открытую и пористую структуру,

частицы должны бьггь биологически и химически инертными, но в то же время легко образовывать производные, обеспечивающие иммобилизацию лигапдов, быть стабильными в течение определенного времени ц не приводить к разрушению ни носителя, ни лиганда. В качестве матриц, исследовано несколько вариантов: алюмосиликат; полифепан; алюмосиликат^ полифепан, активированные по-лиглюкином; алюмосиликат, полифепан с оксидом железа, активированные гю-лиглюкином. Выбор в качестве активатора матриц политлюкина, обусловлен тем, что матрицы приобретают положительные свойства, благодаря стабилизирующему эффекту действия этого органического соединения.

Для придания сорбентам биоспецифических свойств, на их поверхность иммобилизовали водорастворимые антигены, полученные из биомасс гете-рологичных штаммов микроорганизмов, дающих перекрестные реакции (для туляремийных - В. abortus 19-ВА, В. abortus 544, В. abortus 345; леп-тоспирозных - L. biflexa patoc I). Для активирования сорбентов с целью образования прочной связи лиганда .9, матрицей использовали метод окисления с помощью перхлората натрия. В дальнейшем полученные аффинные сорбенты применяли для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител.

Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие получали по Н, Storz (1987). В качестве лигапдов использовали иммуноглобулины лептоспи-розные, выделенные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных антигенами, полученными из 6 эпидемически значимых штаммов лептоспирозного микроба: L. Sejroe, L. Pomona ротопа, L. Canicola, L. Tarassovi, L. Grippotyphosa, L. Icterohaemorragiae. При иммунизации кроликов для получения туляремийных препаратов использовали антигены, выделенные из биомасс 3 подвидов F. 1и-larensis. Для метки иммуноглобулинов использовали ФИТЦ при концентрации белка 20 мг/мл, pH - 9,5. Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие освобождали от несвязавшегося флуорохрома и гетерологичных антител с помощью разработанных иммуносорбентов. Оценку результатов специфической активности и специфичности препаратов определяли на фиксированных мазках чистых культур гомологичных F. tularensis (L. interrogans), гетерологичных штаммов и в модельных опытах прямым методом окраски препаратов.

В результате проведенных исследований установлено, что при использовании сорбента на основе алюмосиликата, активированного полиглюки-ном, отсутствовали потеря белка, наличие,свободного ФИТЦ, наблюдалось яркое свечение гомологичных и: отсутствие свечения гетерологичных штаммов. Для сравнения была проведена очистка иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных от несвязавшегося флуорохрома по традиционной методике с использованием колонки хроматографической с сефадек-сом G-50. Для удаления гетерологичных антител, применяли полиакрила-мидный сорбент с иммобилизованным комплексным бруцеллезным водорастворимым антигеном. В результате исследования иммунологических показателей иммуноглобулинов флуоресцирующих установлена сопоставимость свойств полученных препаратов при их хроматографической очистке

на колонке и предлагаемым способом. С учетом снижения временных, трудовых и материальных затрат установлено превосходство предложенного метода очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительная характеристика в РИФ активности и специфичности иммуноглобулинов диагностических тулярсмийных флуоресцирующих, полученных традиционным и модифицированным методами

Мазки с взвесями культур Аюивнсхлъ и специф. иммутглоб. до сорбц иии метки в РНИФ Время очистки ог несвязав-шегося красителя/ СТОИМОСТЬ Активностей специф. до сорбции в РИФ Время сорбции /стоимость Атив- ностьи специф. после сорбции вРИФ Копией трация белка во всем объеме, мг Нагрузка красиго- ляш белок (Мф/Мб)

Препарат, палучеапый по традиционной методике

F. tularensis Schu, F. tularensis 503/840 1:800 Приочист-ке5 мл 1:128 20 ч! ЗЮруб 1:64 71 7,8

F. tularensis Miura, F. tularensis S90Аз, F. tularensis 543/6, F. йЖтетв15НИИЭГ 1:400 флуорес-Шфутащеш препарата на хрома- 1:64 1:32

В. abortus 544, В. abortus 19-BA 1:100 тографической 1:16 -

B. abortus 345 1:50 колонке с 1:8 -

Y. enierocolitica 64, Y. enierocolitica 178, £ coli 0-10, £ сой 0-11 сефадексом G-50 -20ч'/ 320 руб

Итога на очистку и сорбцию необходимо 40 ч!630 руб.

Препарат, полученный по модифицированной методике

F. tularensis Schu, F. tularensis 503/840 1:800 Очистка и сорбция проходили од новременно. В поры сорбен- 1:64 73 8,0

F. tularensis Miura, F. tularensis 890Ai, F. tularensis 543/6, £ййтевв15НИИЭГ 1:400 та входил несвязавшийся ФИТЦ, а к имиексному бруиршкйному антагену, связанному с сорбентом, 1:32

B. abortus 544, B. abortus 19-BA 1:100 присоединялись гомологичные к нему шшпеза. При очипке я -

B. abortus 345 1:50 сорбции 5 мл флуоресцирую- -

Y. enterocoliticafA, Y. enierocolitica 178, £ coli 0-10,0-11 щего препарата на иммуносор-бегае-1ч/90р!уб.

*- время приготовления хроматографической колонки (взвешивание, заливка, подготовка и т.д.) и очистка через колонку препарата.

Таким образом, экспериментально доказано эффективное выявление К tu-larensis и L. interrogans с использованием иммуноглобулинов флуоресцирующих, полученных с применением бифункциональных иммуносорбентов.

Оптимизация способов выявления возбудителей туляремии и лептос-пироза в реакции суспензионной агглютинации (РСА) с использованием иммобилизованных иммуноглобулинов

Для выявления F. tularensis и L. interrogans в РСА при упрощении и сокращении времени приготовления препарата мы приступили к разработке суспензионно - флуоресцентного диагностикума (моно - и бивалентного).

В качестве матрицы выбран неорганический компонент - алюмосиликат. Для данного кремнезема характерна высокая реакционная способность поверхностных групп при взаимодействии со многими веществами. Введение в матрицу ФИТЦ придавало ей цветовой эффект, повышающий наглядность серологического теста (РСА), а его реакционноспособность позволяла формировать дополнительные стабильные ковалентные связи между красителем и иммобилизируемыми белковыми молекулами за счет аминогрупп лизина и концевых аминогрупп белковой молекулы.

Постановку РСА осуществляли на предметном стекле. В качестве положительного контроля использовали взвесь F. tularensis в концентрациях от 1х]04до 1х]08 м.к./мл. Отрицательным контролем служил 0,9 % раствор натрия хлорида. Специфичность реакции контролировали на гетерологич-ных штаммах микроорганизмов (рис. 1, табл. 2).

а - с »весы» !•'. wlaremis Mima

£> - с ¡вши F. tutaremn 890 Аз

в - с вдассыо 0. abortus 544

Рисунок 1. Реакция суспензионной агглютинации на стекле с туляремийным суспензионно - флуоресцентным диагностикумом.

Таблица 2

Результаты контроля чувствительности туляремийного суспензионно -

флуоресцентного диагностикума

Штаммы микроорганизмов Чувствительность РСА, м.к./мл

Серия-1 Серия-2 Серия-3

F. tularensis Miura, F. tularensis 503/840, F. tularensis 15 НИИЭГ, F. tularensis 319/38 1 х 10s 1 х 106 1 х 106

F. tularensis Schu, F. tularensis 543/6 1 х 10ь 1 х 105 1 х 105

B. abortus 19 BA, 544, 345; B. melitensis 16M, 565, RevA, B. suis 1330, 508,6; Y. enterocolitica 64,178; £ coliti-M), E. coli 0-11 Отр. Отр. Отр.

В связи с наличием ряда общих источников и путей передачи туляре-мийной, лептоспирозной инфекций был получен бивалентный диагности-кум для выявления данных возбудителей в РСА. В результате подбора параметров установлено, что для оптимальной иммобилизации иммуноглобулинов на матрицу в количестве 50 мг, достаточной является концентрация белка туля-ремийных иммуноглобулинов 2,0 мг и лептоспирозных - 6 мг. Это связано с тем, что активность иммуноглобулинов туляремийных выше, чем лептоспирозных. Диагностикум проверен в РСА на стекле с гомо - и гетерологичными штаммами. Он позволял обнаруживать в исследуемых пробах F. tularensis и L. interrogans в количестве 1x10 -1х106м.кУмл. При изучении специфичности на гетерологичных штаммах в РСА перекрёстных реакций не выявлено.

Для сравнения использован эршроцитарный туляремийный диагностикум в РИГА, приготовленный из тех же серий иммуноглобулинов. В результате испытаний разработанный препарат зарекомендовал себя как высокоактивный и специфичный, позволяющий провести экспресс-диагностику в РСА, по чувствительности не уступающий эритроцитарному диагностикуму, а по экономичности и простоте изготовления препарата, превосходящий последний (табл. 3). Разработанный препарат позволил создать бивалентную тест-систему диагностическую для РСА при обнаружении F. tularensis и L. interrogans.

Таблица 3

Сравнительная характеристика суспензионно - флуоресцентного туляремийного, лептоспирошого диагносгикума (бивалентного) в сравнении с коммерческим эритроцитарным туляремийным диагностикумом

Диагностикум Время анализов Чувствительность, М.К./МЛ Время пригот. препарата, ч. Срок года, препар., лет Стоимость препар. на 900 анал., руб.

РСА РЫТА РСА РИГА

Бивалентный 1-3 мин. - 1х106 - 2,5* 3 615

Эритроцитар-ный для микро-/макроагглютинации - 120мин./ 1440 мин. - 1х106 18,0* 1 960

*- без учета времени выделения иммуноглобулинов

Совершенствование методов выявления возбудителей туляремии и лептоспироза в объектах внешней среды с помощью бивалентных магнитоуправляемых твердофазных иммуносорбентов

В связи с проведением мероприятий по снижению риска заражения населения, особое значение приобретает микробиологический мониторинг. С этой целью были разработаны тест-системы магноиммуносорбентные (МИС) для ИФА. Оптимизированы методы экспресс - диагностики возбудителя туляремии в ИФА

путем применения разработанных магнитоуправляемых тест-систем диагностических (на основе сертифицированных реактивов) с чувствительностью 1х102 -lxlO3 м.кУмл (акт межпабораторных испытаний от 24.12.08).

Известно, что традиционными методами выявить F. tularensis и L interrogans в водных объектах сложно, в связи с тем, что их концентрация в водоеме ниже порога чувствительности известных методов индикации. Кроме моно - инфекций, известны случаи микс-инфекций: туляремия и лептоспироз (Демидова ТЛ. с соавт., 2006). Для эффективного выявления возбудителей разработаны бивалентные МИС. В качестве матрицы использовали алюмосиликат с оксидом железа, модифицированный полиглюкином. Лигандами служили иммуноглобулины, выделенные из гипериммунных сывороток. Так как активность иммуноглобулинов туляремийных выше (1:32), чем лептоспирозных (1:16), нами предпринята попытка подобрать эффективную концентрацию белка, необходимую для иммобилизации на твердой матрице. Изучена кинетика процесса иммобилизации и количественная оценка ковалентного связывания лиганда с сорбентом. Выявление фиксированных на МИС возбудителей туляремии и лептоспироза осуществляли в ИФА. В качестве иммунопероксидазного конъюгата применяли полученные нами моно- и бивалентные кокьюгаты с рабочим титром 1:200-1:400. Эксперименты проводили с чистыми культурами F. tularensis и L. interrogans и в модельных опытах на 3000 мл водопроводной воды, контамшшрованной различной концентрацией данных возбудителей. Получены положительные результаты в обоих опытах при наличии в объеме пробы lxlO2 - 1x103 м.к. и выше. Традиционными методами ИФА, РНГА, реакции агглютинации латекса (РАЛ) выявить F. tularensis и L. interrogans в модельных опытах, когда микробные взвеси вносили в пробы воды большого объема, не удалось.

Нами подобраны условия постановки ИФА с разработанными бивалентными МИС и на их основе скомпонованными диагностическими тест-системами. Результаты испытаний показали, что использование МИС позволяет ускорить детекцию возбудителей туляремии, лептоспироза в исследуемых пробах и повысить чувствительность анализов за счет селективного концентрирования и освобождения проб от различных компонентов, отрицательно влияющих на проведение реакций.

Проведена апробация предложенных диагностикумов при выявлении F. tularensis и L. interrogans в полевом материале (объекты внешней среды).

В 2005 г. в период обострения в Ставропольском крае эпидемиологической ситуации по лептоспирозу ИФА с МИС показал, что антиген лептос-пир имеется в 7 из 13 доставленных проб воды открытых водоемов Красногвардейского района, в 1 пробе из 3 обследованных водоемов Кировского района. Во время водной вспышки лептоспироза у людей в Ставропольском крае (июль 2006 г.) проводились исследования открытых водоемов с применением разработанных МИС для селективного концентрирования антигенов из проб воды большого объёма. Число положительных проб на лептоспироз в ИФА с МИС составило 60 %, на туляремию - 7 %.

В 2008 г. проводили апробацию препарата при исследовании внутренних органов 140 грызунов (объединенных в 40 проб по виду животного и их местонахождению), добытых в природном очаге туляремии Ставропольского края. Исследуемый материал проверяли в реакции нейтрализации антител (РНАт) с диагностикумом туляремийным антигенным (производство СтавНИПЧИ), традиционном ИФА «сэндвич-варианте» с конъюгатом им-мунопероксидазным иммуноглобулиновым (экспериментальные серии СтавНИПЧИ) и в разработанном ИФА с МИС (табл. 4).

Таблица 4

Результаты сравнительного исследования внутренних органов грызунов на наличие возбудителей туляремии и лептоспироза

Количество исследуемых проб (40 шт.) Выявление возбудителей

туляремии лептоспироза

РНАт ИФА ИФА с МИС ИФА ИФА с МИС

Отр. проб/ пол. проб 38/2 37/3 33/7 40/0 38/2

% выявления 5 7,5 17,5 0 5

Проведение ИФА с разработанными МИС обеспечивают экспрессность анализа выявления F. tularensis и L. interrogans с высокой чувствительностью, специфичностью и увеличением срока годности диагностической тест-системы при уменьшении финансовых затрат на изготоЕшение и использование диагностической системы.

Резюмируя вышеизложенное, следует отметить основные положения, представляющие теоретические и практические результаты исследований.

Определены научные аспекты совершенствования микробиологической индикации возбудителей туляремии, лептоспироза путем биотехнологической разработки препаратов и новых методов экспресс-анализа.

В процессе научно-методических исследований унифицированы иммуноглобулины флуоресцирующие туляремийные, лептоспирозные и созданы новые препараты: алюмосиликатно - флуоресцентные для РСА; МИС бивалентные для ИФА, направленные на выявление F. tularensis и L. interrogans. Лабораторные и полевые испытания препаратов свидетельствуют о их высокой надежности и чувствительности при использовании для микробиологического мониторинга.

ВЫВОДЫ

1. Эффективный микробиологический мониторинг объектов внешней среды и материала от животных на эпидемичной территории на наличие F. tularensis и L. interrogans в реакции иммунофлуоресценции возможен при использовании разработанных иммунофлуоресцирующих препаратов, полученных с применением аффинных иммуносорбентов для одномоментной хроматографической очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя и

гетерологичных антител, которые позволяют получить высокоактивные (1:321:128), специфические антитела за короткое время (1 ч.).

2. Экспресс-анализ F. tularensis и L. interrogans в реакциях суспензионной агглютинации с использованием в качестве твердой фазы иммуносор-бентов на основе кремнезёмно-флуоресцентной матрицы с антителами против эпидемически значимых штаммов возбудителей лептоспироза и туляремии увеличивает вероятность достоверной диагностики, экономит время (учет через 1-3 мин., против 2 ч. при постановке микрометода РИГА), расход дорогостоящих биопрепаратов и создаёт неоспоримые удобства при выполнении лабораторных исследований (возможность проведения и завершений анализов без выделения культуры).

3. Оптимизированы методы экспресс-диагностики возбудителя туляремии в 'ИФА путем применения разработанных тест-систем диагностических магноиммуносорбентных (на основе сертифицированных реактивов) с чувствительностью 100 - 1000 м.к./мл (акт межлабораторных испытаний от 24.12.08 г.).

4. Для одновременного выявления возбудителей туляремии и лептоспироза в пробах внешней среды получены диагностические тест-системы магноиммуносорбентные бивалентные (туляремийные, лептоспирозные) для ИФА, обладающие высокой чувствительностью (103 м.к7мл), специфичностью (отсутствие перекрестных реакций с гетерологичными штаммами) и непродолжительным сроком проведения анализа (1,0-1,5 ч.). Иммобилизация на разработанном сорбенте туляремийных и лептоспирозных иммуноглобулинов обеспечивает сохранение их исходной активности, увеличивает в 4 раза (срок наблюдения) стабильность и срок годности по сравнению с иммобилизированными полистироловыми планшетами.

5. При использовании бивалентных магаоиммуносорбентов в модельных опытах на воде (3000 мл), контаминированной F. tularensis и L interrogans, получены положительные результаты при наличии в объеме пробы 102 -103 м.к. и выше. Методами ИФА с использованием сенсибилизированных полисгироло- вых планшет, РИГА, РАЛ выявить возбудителей туляремии и лептоспироза в данном объекте не удалось из-за низкой концентрации патогенов (100 м.к. в 3000 мл воды).

6. Установлена высокая диагностическая ценность при исследовании полевого материала на наличие возбудителей туляремии и лептоспироза разработанных препаратов и методов. В ИФА с бивалентным магноиммунооорбентом положительные результаты по выявлению возбудителя туляремии (внутренние органы грызунов) получены в 17,5 % исследуемых пробах, что в 3,5 раза больше, чем в РИГА (5 %), в 2,3 раза больше, чем в традиционном ИФА (7,5 %). Из этих же проб получено 5 % положительных результатов на наличие возбудителя лептоспироза, который не обнаруживался другими методами.

фазы использованы сконструированные бивалентные МИС, значительно повышающие чувствительность анализа. Традиционными методами обнаружить возбудителей инфекций в таких объектах крайне сложно, поскольку концентрация патогенов в водоеме ниже порога чувствительности известных методов диагностики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.При проведении скрининговых исследований по выявлению возбудителей туляремии, лептоспироза следует проводить постановку РСА, что позволит получить качественную диагностику и сэкономить время.

2. При исследовании большого количества проб с низкой концентрацией возбудителя туляремии, лептоспироза, особенно в сочетанных очагах, необходимо использовать бивалентные магноиммуносорбенты для селективного концентрирования указанных возбудителей с последующей постановкой ИФА.

3.Для усовершенствования иммунофлуоресцентных методов выявления возбудителей туляремии и лептоспироза при получении флуоресцирующих иммуноглобулинов качественную и эффективную их очистку от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител можно осуществлять с помощью бифункциональных аффинных иммуносорбентов на основе алюмосиликата, активированного полиглюкином с фиксированными на их поверхности гетерологичными антигенами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Воробьёва, О.В. Сорбенты для диагностики особо опасных инфекций / О.В. Воробьёва, АЛ. Филь, Т.В. Жарникова, Т.В. Яворчук // Московская меж-дунар. конф. «Биотехнология и медицина» (Москва 14-17марта2006).-С. 152.

2. Бородина, Т.Н. Туляремийный диагностикум на основе иммуносорбентов для постановки реакции суспензионной агглютинации / Т.Н. Бородина, О.В. Воробьёва, A.A. Филь, Т.В. Жарникова, С.С. Аванесян // Материалы IV съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчиникова (Пущино, 6 -7 декабря, 2006). - М, 2006. - С. 32.

3. Воробьёва, О.В. Разработка магноиммуносорбентных препаратов для экспресс-диагностики туляремии методом ИФА / О.В. Воробьёва, A.A. Филь, Т.В. Жарникова С.С. Аванесян // Материалы IV съезда общества биотехнологов России им. ЮЛ. Овчиникова (Пущино, 6-7 декабря, 2006). - М., 2006. - С. 49-50.

4. Алиева, Е.В. Унификация и разработка тест-систем диагностических для мониторинга возбудителей бактериальной (кампилобактериоз, туляремия, лептоспироз) и вирусной (лихорадка Западного Нила) природы / Е.В. Алиева, A.B. Таран, Е.Е. Афанасьева, Т.В. Жарникова, С.А. Курчева, И.С. Тюменцева, И.В. Жарникова, И.В. Самарина // Вестник Ставропольского государственного университета. - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2006. - В. 47. - С. 292-298.

5. Жарникова, T.B. Применение сорбционных материалов при получении диагностических флуоресцирующих препаратов / Т.В. Жарникова, Д.В. Ефременко, ИЛ. Жарникова, И.В. Самарина, A.B. Таран // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Материалы науч.-практ. конф. - Ставрополь, 2007. - С. 139-141.

6. Самарина, И.В. Лептоспироз в Северо-Кавказском регионе / И.В. Самарина, В.М. Мезенцев, E.H. Чеботарева, В.П. Надеина, Т.В. Жарникова // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Материалы науч.-практ. конф. - Ставрополь, 2007. - С. 85-88.

7. Самарина, ИВ. Современные аспекты эпидемиологии лептоспироза в Карачаево-Черкесской республике /И.В.Самарина, ВА. Петрюк, СЛ. Степанова, В.М. Мезенцев, E.H. Чеботарева, В.П. Надеина, A.C. Кочарян, Т.В. Жарникова // Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Материалы науч.-практ. конф. - Ставрополь, 2007. - С. 88-89.

8. Таран, A.B. Экспресс-диагностика лептоспироза / A.B. Таран, Т.В. Жарникова, И.В. Самарина, Б.И. Левченко // Материалы IX съезда науч. - практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (26 - 27 апреля 2007 г., г. Москва, Санэпидмедиа). - С. 85-86.

9. Самарина, И.В. Практическое применение новых методов детекции лептоспир в условиях обострения эпидемиологической обстановки на Ставрополье / И.В. Самарина, И.В. Жарникова, Т.В. Жарникова, E.H. Чеботаре^ ва, В.П. Надеина, Л.В. Дегтярева, A.C. Кочарян, ИА. Волохова, О.Г. Кириллова // Материалы IX Междунар. науч. конф. и II Междунар. науч. онкологической конф. (26 апреля - 2 мая 2007 г. Пермь. Нидерланды - Германия-Франция). - С. 243-244.

10. Ефременко, В.И. Применение тест-систем магноиммуносорбентных для выявления возбудителей инфекционных заболеваний (обзор литературы) / В.И. Ефременко, A.A. Зуенко, О.И. Коготкова, Н.В. Чурикова, И.С. Тюменце-ва, И.В. Жарникова, Е.С. Шиянова, В .Д. Майская, Е.Е. Афанасьева, Т.В. Жарникова, CA. Курчева //Деп. В ВИНИТИ 18.07.07, № 741. - В 2007. - 28 с.

11. Жарникова, Т.В. Получение аффинного сорбента для очистки лептоспи-розной сыворотки от неспецифических антител / Т.В. Жарникова, Д.В. Ефременко, И.В. Самарина, A.B. Таран // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах- участниках СНГ: Материалы VIII Межгос. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 208-209.

12. Таран, AJÍ. Методические рекомендации по лабораторной диагностике возбудителя лептоспироза / A.B. Таран, Т.В. Жарникова, И.В. Самарина, И.С. Тю-менцева, И.В. Жарникова, ЕЛ. Афанасьев, ИЛ. Юркина, ЛЛ. Дегтярева Н Методам. документы к отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации: Реферативный сборник. - Саратов, 2007. - С. 20.

13. Самарина, И.В. Новые лабораторные методы и препараты в мониторинге лептоспироза / И.В. Самарина, И.В. Жарникова, E.H. Чеботарева, В.П. Надеина, О.В. Малецкая, И.В. Ковальчук, О.Г. Кириллова, М.В. Фомеко, И.А. Воло-хова, Т.В. Жарникова, A.C. Кочарян, Б.И.Левченко, И.Н. Заикина // Медицинский Вестник Северного Кавказа. - 1 (9). - 2008. - С.38-41.

14. Самарина, И.В. Совершенствование эпиднадзора за лептоспирозами в Ставропольском крае на основе разработки новых диагностических препаратов / И.В. Самарина, A.B. Таран, И.В. Жарникова, Н.Г. Ковалев, М.В. Фоменко, ИЛ. Волохова, Б.И. Левченко, И.Н. Заикина, E.H. Чеботарева, Т.В. Жарникова, В.П. Надеина // Вестник Российской военно - медицинской академии. - № 2 (22). - Приложение. - Часть 1. - 2008. - С. 214-215.

15. Жарникова, И.В. Разработка и применение иммобилизованных систем для экспресс- диагностики различных заболеваний / И.В. Жарникова, И.С. Тюмен-цева, E.H. Афанасьев, В.И. Ефременко, Е.В. Жданова, Т.В. Жарникова, Е.Е. Афанасьева, Т.Н. Орлова, Д.В. Ефременко, Н.Е. Афанасьев, М.П. Лавре-шин, Н.В. Левченко, A.A. Семирчева, С.А. Курчева, А.М. Бабий // Вестник Российской военно - медицинской академии. - № 2 (22). - Приложение. -Часть 1,-2008.-С.180-181.

16. Жарникова, И.В. Получение полифункционального диагностикума для выявления возбудителей инфекционных заболеваний / И.В. Жарникова, Т.В. Жарникова, Е.В. Белик, Д.А. Грядских, И.В. Самарина, A.C. Кочарян, A.B. Брыкалов, Е.М. Головкина // Труды Кубанского государственного аграрного университета.-№2(11).-2008.-С. 193- 196.

17. Жарникова, ИБ. Иммобилизованные лигадды и их применсни е в производстве диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов для выявления возбудителей инфекционных заболеваний / И.В. Жарникова, A.B. Брыкалов, Т.В. Жарникова, Е.В. Белик, Д.А. Грядских, Е.М. Головкина // Биотехнология. - №3. - 2008. - С. 90- 95.

18. Жарникова, Т.В. Анализ разработки иммобилизованных компонентов для конструирования иммунобиологических препаратов (обзор литературы) / Т.В. Жарникова // Деп. в ВИНИТИ № 588 - В 2008 от 08.07.2008. - 24 с.

19. Жарникова, Т.В. Диагностические препараты и скрининг инфекционных заболеваний (обзор литературы) / Т.В. Жарникова // Деп. в ВИНИТИ № 588 - В 2008 от 08.07. 2008. - 42 с.

20. Жарникова, Т.В. Конструирование тест-систем диагностических бивалентных магноиммуносорбентных для одновременного выявления возбудителей туляремии и лептоспироза в иммуноферментном анализе (ИФА) / Т.В. Жарникова, И.В. Жарникова, CA. Курчева, И.С.Тюменцева, A.C. Кочарян, ДА. Грядских, Д.В. Ефременко, И.В. Самарина, И.В. Кузнецова, A.B. Брыкалов, Е.В. Белик, // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - № 5 (14). - 2008.—С. 88-90.

21. Жарникова, Т.В. Совершенствование экспрессных методов индикации возбудителей туляремии и лептоспироза с применением разработанных иммобилизованных систем / Т.В. Жарникова, Д.В. Ефременко, A.C. Кочарян // Материалы науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов «Биологическая безопаст-ность в современном мире» (21-22 апреля 2009 г., Оболенск). - С. 122-124.

Подписано в печать 26.09.09 Формат 60x84 1/16 Усл.печ.л. 1,1 Уч.-изд.л. 1,22

Бумага офсетная Тираж 100 экз. Заказ 288

Отпечатано в Издательско-полиграфическом комплексе Ставропольского государственного университета. 355009, Ставрополь, ул.Пушкина, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жарникова, Татьяна Владимировна

Перечень сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Микробиологический мониторинг за возбудителями туляремии и лептоспироза, их индикация. Получение и исследование матриц для аффинной хроматографии и твердофазного иммуноана-лиза (обзор литературы)

1.1. Микробиологический мониторинг за возбудителями туляремии и леп- ^ тоспироза, их индикация

1.1.1. Микробиологический мониторинг за возбудителем туляремии и его индикация

1.1.2. Микробиологический мониторинг за возбудителем лептоспироза и 2\ его индикация

1.2. Получение и исследование матриц для аффинной хроматографии и твердофазного иммуноанализа

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1. Штаммы микроорганизмов, взятые в работу

2.2. Питательные среды, условия культивирования микроорганизмов ^g

2.3. Лабораторные животные, использованные в экспериментах ^д

2.4. Получение антигенных комплексов микроорганизмов

2.5. Получение иммунных сывороток крови животных

2.6. Методы контроля антигенов и иммунных сывороток

2.7. Получение аффинных сорбентов и сорбция иммунных сывороток

2.8. Выделение иммуноглобулинов ^ ^

2.9. Получение и контроль иммунофлуоресцирующих и иммунофер-ментных конъюгатов

2.10. Физико-химические методы

2.11. Лиофилизация биологического материала ^

2.12. Характеристика реагентов, используемых для получения иммобилизованных препаратов

2.13. Методы математической и статистической обработки материалов

ГЛАВА 3. Выявление возбудителей туляремии и лептоспироза с использованием иммуноглобулинов флуоресцирующих, изготовленных с помощью бифункциональных сорбентов

3.1. Использование гетерологичных антигенов микроорганизмов, иммобилизованных на различных матрицах, для повышения качества и специфичности лептоспирозных и туляремийных иммуноглобулинов флуоресцирующих

3.2. Приготовление высокоактивных, специфичных иммунофлуоресци-рующих препаратов для выявления возбудителей туляремии и лептоспироза и совершенствование способов их очистки от несвязавшегося флуорохрома и гетерологичных антител

ГЛАВА 4. Оптимизация способов выявления возбудителей туляремии и лептоспироза в реакции суспензионной агглютинации (РСА) с использованием иммобилизованных иммуноглобулинов

ГЛАВА 5. Совершенствование методов выявления возбудителей туляремии и лептоспироза в объектах внешней среды с помощью бивалентных магнитоуправляемых твердофазных иммуносорбентов

5.1. Выявление возбудителя туляремии с использованием магнитоуправляемых твердофазных носителей

5.2. Отработка методов одномоментного селективного концентрирования возбудителей туляремии и лептоспироза на магноиммуносорбентах с последующей постановкой ИФА

5.3. Изучение диагностической ценности разработанных тест-систем с использованием в качестве твердой фазы бивалентных МИС

Введение Диссертация по биологии, на тему "Усовершенствование методов индикации Francisella tularensis и leptospira interrogans с применением иммобилизованных систем"

Эпидемиологическая обстановка по туляремии и лептоспирозу продолжает оставаться неблагополучной, что обусловлено наличием во многих субъектах Российской Федерации природных очагов данных инфекций (МУ 3.1.1128—02, МУ 3.1.2007-05), а также формированием новых. Сохранение природных очагов туляремии, циркуляция возбудителя среди домашних животных, а также вероятность применения Francisella tularensis при биотеррористических актах предопределяют актуальность исследований, посвященных совершенствованию диагностики данного заболевания. Сохраняющаяся активность очагов лептоспирозов в ряде регионов России, включая Ставропольский край, требует постоянного внимания со стороны санитарно-эпидемиологических служб и лечебно-профилактических учреждений (Ковалев Н.Г. с соавт., 2006). В связи с этим, возникает необходимость применения современных информационных, диагностических, профилактических, производственных технологий, обеспечивающих профилактику заболеваний (Онищенко Г.Г., 2007).

Существуют разнообразные методы индикации возбудителей указанных инфекций (бактериологические, биологические, иммунологические и т.д.), имеющие свои достоинства и недостатки. Перспективным направлением является разработка иммунодиагностических тестов, характеризующихся экспрессностью, простотой технического исполнения и учета результатов в сочетании с высокой специфичностью и чувствительностью (Сырова Н.А., Девдариани З.Л., Голова А.Б., 2007). Среди способов индикации возбудителей инфекционных заболеваний особое место занимают иммуносорбцион-ные, в основе которых лежит принцип аффинности, базирующийся на специфическом связывании антигенов с комплементарными антителами. Новым этапом усовершенствования общепринятых методов диагностики является разработка, освоение производства диагностических препаратов на основе магноиммуносорбентов (Саяпина JI.B. с соавт., 2007).

Среди лептоспирозной и туляремийной инфекций имеются общие пути заражения людей и источники инфицирования объектов внешней среды. В связи с этим, особое значение приобретает индикация возбудителей лептоспироза и туляремии в сочетанных очагах. Одним из общих путей передачи инфекции является водный. «Купальные» вспышки возникают в результате нарушений санитарно-гигиенических правил при размещении животноводческих ферм и летних лагерей вблизи различных водоисточников, водопоя из открытых водоемов сельскохозяйственных животных, выделяющих патогены, заражением воды трупами грызунов, инфицированных возбудителями туляремии и лептоспироза. Традиционными методами выявить данных возбудителей сложно, так как их концентрация в водоеме ниже порога чувствительности известных методов диагностики. В связи с этим, необходим постоянный мониторинг за наличием данных патогенов в объектах внешней среды с использованием современных экспрессных методов индикации, обладающих высокой чувствительностью.

Цель работы — совершенствование методов индикации возбудителей туляремии и лептоспироза путем создания иммобилизованных бифункциональных и бивалентных диагностических препаратов, а также моно- и бивалентных магноиммуносорбентов для селективного концентрирования патогенов при проведении микробиологического мониторинга объектов внешней среды.

Основные задачи исследования:

1) усовершенствовать индикацию F. tularensis и L. interrogans путем постановки экспресс-анализа с использованием высокоспецифичных иммуноглобулинов флуоресцирующих, полученных одновременной хроматографической очисткой конъюгата от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител;

2) отработать методику выявления F. tularensis и L. interrogans в реакции суспензионной агглютинации (РСА) с использованием иммуносорбентов на основе кремнезёмно-флуоресцентной матрицы с антителами против эпидемически значимых штаммов возбудителей туляремии и лептоспироза;

3) усовершенствовать и стандартизировать диагностическую тест-систему для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием иммобилизованных препаратов;

4) отработать методы одномоментного селективного концентрирования возбудителей туляремии, лептоспироза на бивалентных магноиммуно-сорбентах (МИС) с последующей постановкой ИФА при микробиологическом мониторинге возбудителей в объектах внешней среды (вода) с низкой концентрацией патогенов. (

Научная новизна

Впервые для индикации F. tularensis и L. interrogans научно обоснованы новые способы получения иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих в результате одномоментной хроматографической их очистки от несвязавшегося флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) и гетерологичных антител на иммуносорбентах, обладающих экологической чистотой, доступностью, экономичностью и обеспечивающих высокую степень очистки препаратов. Пористая структура матрицы оптимальна для сорбции ФИТЦ и образования иммунохимического комплекса «антиген-антитело», исключает внутридиффузионное торможение при аффинной хроматографии. Полученные иммунобиологические препараты обладают высокой специфической активностью при снижении материальных и трудовых затрат.

Впервые осуществлена научная разработка и скомпонована тест-система диагностическая на основе кремнезёмно-флуоресцентной матрицы с антителами против эпидемически значимых штаммов возбудителей лептоспироза и туляремии для выявления F. tularensis и L. interrogans в РСА, обладающая высокой чувствительностью, специфичностью и увеличением срока годности. Преимущество применения разработанного препарата заключается в простоте постановки, быстроте получения результатов в РСА, увеличении срока годности до 3 лет (срок наблюдения) за счёт образования иммобилизованной системы, отработанных эффективных параметров получения препарата.

Впервые разработан метод селективного концентрирования возбудителей туляремии, лептоспироза при их низкой концентрации в исследуемых водных объектах, путем применения бивалентных магноиммуносорбентов в качестве скрининг-теста для микробиологического мониторинга объектов внешней среды. Предлагаемое сочетание МИС с экспресс-анализами позволяет ускорить детекцию возбудителей туляремии и лептоспироза в исследуемых пробах и повысить чувствительность анализов.

Теоретическая и практическая значимость работы Определены научные аспекты получения высокоспецифических туляре-мийных, лептоспирозных антигенов и антител, диагностических препаратов за счет исследования эпидемической значимости штаммов туляремийного и лептоспирозного микробов, выявления перекрестных реакций с гетерологич-ными штаммами, физико-химических свойств матриц, способов и параметров конъюгации лигандов, фиксации красителей на матрице, разработки моно- и бифункциональных иммобилизованных компонентов, отработки микробиологических тест-систем, проведение лабораторных испытаний и оценки их чувствительности на полевом материале.

Научно-методические разработки сочетанных методов использования иммуносорбционных компонентов в экспресс-анализах дополняют новыми научными данными сведения о возможности применения иммобилизованных систем, способствующих увеличению стабильности, чувствительности методов и проведению одновременной эффективной детекции возбудителей туляремии и лептоспироза в объектах внешней среды и биологическом материале.

При получении иммуноглобулинов флуоресцирующих для выявления -возбудителей туляремии, лептоспироза разработаны методологические подходы по ковалентной фиксации гетерологичных антигенов на поверхности исследованных матриц, что позволяет получить бифункциональные аффинные сорбенты, применение которых приводит к сокращению материальных и трудовых затрат с сохранением первоначальной активности препарата.

Усовершенствованная РСА с применением полученных иммуносор-бентов кремнезёмно-флуоресцентных туляремийных и лептоспирозных позволяет повысить стабильность, экспрессность (РСА длится 1-3 мин., а РИГА (макрометод) — 24 ч.) и в три раза увеличить срок годности диагностической системы (срок наблюдения) без потери активности. Успешно проведены межлабораторные испытания совместно с сотрудниками лаборатории биологического и технологического контроля (ЛБТК) Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (СтавНИПЧИ) (акт от 09.02.09 г.).

Предлагаемое сочетание разработанных бивалентных МИС с экспресс-анализами позволяет ускорить индикацию возбудителей туляремии и лептоспироза в исследуемых пробах и повысить чувствительность иммунофер-ментного анализа на 2-3 порядка за счет селективного концентрирования, исключения предварительных этапов очистки проб, увеличить срок, годности иммобилизованных иммуноглобулинов в 4 раза (срок наблюдения) по сравнению с традиционным ИФА. Проведены межлабораторные испытания туляремийных МИС совместно с ЛБТК (акт от 24.12.08 г.), утверждена на данный препарат нормативная документация - ТУ 9388-006-01897080-2008.

Материалы научных разработок легли в основу трех методических документов, утвержденных на учрежденческом уровне внедрения: «Лабораторная диагностика возбудителя лептоспироза» (протокол Учёного совета СтавНИПЧИ № 11 от 30.11.06 г.); «Индикация и идентификация возбудителя туляремии» (протокол Учёного совета СтавНИПЧИ № 5 от 07.06.08 г.) и «Критерии контроля качества экспериментальных серий тест-системы диагностической магноиммуносорбентной для выявления возбудителя туляремии им-муноферментным методом» (протокол Учёного совета СтавНИПЧИ № 5 от 07.06.08 г.). Материалы методических рекомендаций по лабораторной индикации возбудителя лептоспироза вошли в методические документы по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Саратов, 2007).

Утверждена нормативная документация (пусковой регламент, инструкция по применению) на диагностикум суспензионный лептоспирозный им-муноглобулиновый (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 1 от 30:01.07 г.) и технические условия (ТУ), лабораторный регламент, инструкция по применению на тест-систему диагностическую магноиммуносорбент-ную для выявления возбудителя туляремии в ИФА (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 4 от 16:04.09 г.). Материалы диссертации используются на курсах первичной специализации и усовершенствования врачей по особо опасным инфекциям, в лекциях и практических занятиях по экспресс-индикации и применению иммуносорбентных препаратов в мониторинге возбудителей туляремийной и лептоспирозной. инфекций в ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) выявлениеF. tularensis и L. interrogans в реакции иммунофлуорес-ценции (РИФ) эффективно с использованием разработанных высокоспецифичных иммуноглобулинов флуоресцирующих, полученных с применением бифункциональных иммуносорбентных препаратов с иммобилизованными гетерологичными антигенами; для одновременной! очистки препарата от не-связавшегося ФИТЦ и гетерологичных антител;

2) метод РСА с иммуносорбентом суспензионно-флуоресцентным позволяет выявлять F. tularensis и L. interrogans в концентрации 5x105- 1x106 м.к./мл при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами. Стабильность и срок годности препарата увеличены в 3 раза (срок наблюдения) по сравнению с традиционными суспензионными препаратами за: счет эффективной иммобилизации лигандов на поверхности матрицы;

3) селективное концентрирование возбудителей туляремии, лептоспироза на разработанных моно- и бивалентных магноиммуносорбентах позволяет использовать их в ходе эффективного микробиологического мониторинга объектов внешней среды с целью индикации и изучения циркуляции указанных бактерий в очагах инфекций, в том числе и в сочетанных.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены: на Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 14-17 марта 2006 г.); IV съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчиникова (Пущино, 6-7 декабря 2006 г.); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2122 марта 2007 г.); IX съезде научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26 - 27 апреля 2007 г.); IX Международной научной конференции и II Международной научной онкологической конференции (Пермь. Нидерланды — Германия - Франция, 26 апреля - 2 мая 2007 г.); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах - участниках СНГ» (Саратов, 2007 г.); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009 г.).

Публикации

Основное содержание диссертации, выполненной в рамках поисковой НИР «Подбор новых лабораторных методов и препаратов для использования в мониторинге лептоспирозов в Ставропольском крае» (2006-2008 гг.), НИР «Разработка производственной технологии композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и внедрение в практику магноиммуносор-бентных тест-систем на их основе для иммуноферментного анализа возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза» (№ Госрегистрации 01200952157) и научной школы НШ-2486.2008.7 при поддержке гранта Президента РФ в рамках темы «Создание твердофазных магнитоуправляемых тест-систем, обеспечивающих эффективный мониторинг за возбудителями бактериальных и вирусных заболеваний», отражено в 21 опубликованной научной работе, в том числе 3 работы - в изданиях из перечня ведущих рецензируемых научнаучных журналов, утвержденных ВАК РФ и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой научной степени.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, приложения. Работа изложена на 163 страницах компьютерного текста, содержит 23 таблицы и 13 рисунков. Список использованной литературы включает 173 отечественных и 62 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Жарникова, Татьяна Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Эффективный микробиологический мониторинг объектов внешней среды и материала от животных на эпи'демичной территории на наличие F. tularensis и L. interrogans в реакции иммунофлуоресценции возможен при использовании разработанных иммунофлуоресцирующих препаратов, полученных с применением аффинных иммуносорбентов для одномоментной хроматографической очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител, которые позволяют получить высокоактивные (1:32-1:128), специфические антитела за короткое время (1 ч.).

2. Экспресс-анализ F. tularensis и L. interrogans в реакциях суспензионной агглютинации с использованием в качестве твердой фазы иммуносорбентов на основе кремнезёмно-флуоресцентной матрицы с антителами против эпидемически значимых штаммов возбудителей лептоспироза и туляремии увеличивает вероятность достоверной диагностики, экономит время (учет через 1-3 мин., против 2 ч. при постановке микрометода РНГА), расход дорогостоящих биопрепаратов и создаёт неоспоримые удобства при выполнении лабораторных исследований (возможность проведения и завершения анализов без выделения культуры).

3. Оптимизированы методы экспресс-диагностики возбудителя туляремии в ИФА путем применения разработанных тест-систем диагностических магноиммуносорбентных (на основе сертифицированных реактивов) с чувствительностью 100 - 1000 м.к./мл (акт межлабораторных испытаний от 24.12.08 г.).

10 м.к./мл), специфичностью (отсутствие перекрестных реакций с гетерологичными штаммами) и непродолжительным сроком проведения анализа (1,0 - 1,5 ч.). Иммобилизация на разработанном сорбенте туляремийных и лептоспирозных иммуноглобулинов обеспечивает сохранение их исходной активности, увеличивает в 4 раза (срок наблюдения) стабильность и срок годности по сравнению с иммобилизированными полистироловыми планшетами.

5. При использовании бивалентных магноиммуносорбентов в модельных опытах на воде (3000 мл), контаминированной F. tularensis и L. interrogans, получены положительные результаты при наличии в объеме 3 пробы 10" - 10 м.к. и выше. Методами ИФА с использованием сенсибилизированных полистироловых планшет, РИГА, РАЛ выявить возбудителей туляремии и лептоспира в данном объекте не удалось из-за низкой концентрации патогенов (100 м.к. в 3000 мл воды).

6. Установлена высокая диагностическая ценность при исследовании полевого материала на наличие возбудителей туляремии и лептоспироза разработанных препаратов и методов. В ИФА с бивалентным магноиммуносорбентом положительные результаты по выявлению возбудителя туляремии (внутренние органы грызунов) получены в 17,5 % исследуемых пробах, что в 3,5 раза больше, чем в РНГА (5 %), в 2,3 раза больше, чем в традиционном ИФА (7,5 %). Из этих же проб получено 5 % положительных результатов на наличие возбудителя лептоспироза, который не обнаруживался другими методами.

7. При выявлении лептоспир в воде открытых водоемов в период водной вспышки лептоспироза у людей эффективным (60 % положительных проб на наличие лептоспир и 7 % положительных проб на присутствие возбудителя туляремии) является ИФА, где в качестве твердой фазы использованы сконструированные бивалентные МИС, значительно повышающие чувствительность анализа. Традиционными методами обнаружить возбудителей инфекций в таких объектах крайне сложно, поскольку концентрация патогенов в водоеме ниже порога чувствительности известных методов диагностики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При проведении скрининговых исследований по выявлению возбудителей туляремии, лептоспироза следует проводить постановку РСА, что позволит получить качественную диагностику и сэкономить время.

3. Для усовершенствования иммунофлуоресцентных методов выявления возбудителей туляремии и лептоспироза при получении флуоресцирующих иммуноглобулинов качественную и эффективную их очистку от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител можно осуществлять с помощью бифункциональных аффинных иммуносорбентов на основе алюмосиликата, активированного полиглюкином с фиксированными на их поверхности гетерологичными антигенами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жарникова, Татьяна Владимировна, Ставрополь

1. Абелян, В.А. Иммобилизация циклодекстрингликозилтрансферозы и характеристика полученного биокатализатора / В.А. Абелян, Э.Г. Африкян // Журн. прикладная биохимия и микробиол. 1992. - Т. 28, №2. - С. 205 -209.

2. Авдеева, М.Г. Факторы риска тяжелого течения лептоспироза и основные причины летальных исходов / М.Г. Авдеева, О.В. Стриханова // Инфекционные болезни: пробл. здравоохр. и воен. мед. — СПб, 2006 — С. 15 — 16.

3. Айлер, Р. Химия кремнезёма / Р. Айлер / Пер. с англ. / Под ред. В.П. Пряшникова. М.: Мир, 1982. - T.l, Т.2. - 1127 с.

4. Анализ геномного полиморфизма лептоспир в полимеразной цепной реакции с произвольными полимерами / М.Ю. Першина и др. // Молекуляр. генетика, микробиол. и вирусол. 1998. - № 1. - С. 29- 32.

5. Анализ заболеваемости туляремией на территории Российской Федерации в 2001-2004 гг. / Т.Н. Демидова и др. // Актуальные вопросы эпиде- 1 миологии инфекционных болезней: Сб. научных трудов — М., 2006. В.8.- С. 265-273.

6. Ананьин, В.В. Лептоспирозы // Общая и частная эпидемиология. М.: Медицина, 1973. - Т. 1. - С. 402-422.

7. Ананьина, Ю.В. Особенности эпидемического проявления очагов леп-тоспирозов в современных условиях / Ю.В. Ананьина // Актуальные аспекты природноочаговых болезней: Материалы межрегион, науч. — практ. конф.-Омск, 2001.-С. 178- 179.

8. А.с. Способ получения туляремийного антигена / Н.Ф. Василенко и др. // Авторское свидетельство № 1425910 от 22.05.1988.

9. А.с. Способ приготовления аэросилогелей / А.В. Киселев, Т.Л. Кустова.-№ 264369- 1976.

10. Аффинная хроматография. Методы / Под ред. П. Дин, У. Джонсон, Ф. Мидл. М.: Мир, 1988. - 278 с.

11. Безопасность работы с микроорганизмами I-1I групп патогенности (опасности): Санитарные правила СП 1.321285-03 // Бюллетень нормат. и метод, документов Госсанэпиднадзора. М., 2003. — Вып. 3(13). — С.61 -144.

12. Бендикене, В.Г. Хроматография сериновых протеаз на хитине и его производных / В.Г. Бендикене, И.Г. Песлякас, B.C. Веса // Прикладная биохимия и микробиол. 1981. -Т. 17, №3. - С. 441 - 447.

13. Березин, И.В. Введение в прикладную энзимологию / И.В. Березин, К.М. Мартынек. -М.:МГУ, 1982. С.26-100.

14. Басель, Б. Некоторые эпизоотические и эпидемические аспекты лептоспироза / Б. Басель, А.В. Святковкий, В.А. Кузьмин, П.И. и др. // Вестник Российской военно-медицинской академии. 1(15). - 2006. — С. 157-159.

15. Биологические мембраны. Методы / Под ред. Дж. Финдлея, У. Эванза. М.: Мир, 1990.- С. 423.

16. Биологическая химия / Под ред. Н.И. Ковалевской- М.: Изд. «ACADEMA», 2005. 255 с.

17. Биотехнология / Отв. ред. А.А. Баев. М.: Наука, 1984. - 309 с.I

18. Биотехнология: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева М.: Изд. центр «Академия», 2007. -256 с.

19. Брыкалов, А.В. Получение биопрепаратов на основе методов аффинной сорбции и иммобилизации: Дис. . докт. химич. наук / А.В. Брыкалов. -Санкт-Петербург, 1993. 330 с.

20. Брыкалов, А.В. Сорбенты на основе кремнеземов и активированных углей в биотехнологии и медицине /А.В. Брыкалов // Материалы конф. химиков Сев. Кавказа. Нальчик, 1991. - С. 185- 186.

21. Бусыгин, К.Ф. Люминесцентная диагностика инфекционных болезней животных. М.: Колос, 1975.- С. 123.

22. Васенин, А.С. О перекрестном иммунитете против чумы и туляремии / А.С. Васенин, В.И. Вейнблат, Л.В. Самойлова // ЖМЭИ. 1980. - № 2. -С. 49- 52.

23. Василенко, Н.Ф. Получение и некоторые свойства антигенов туляремийного микроба / Н.Ф. Василенко, И.О. Лопаткин, И.В. Кронгауз и др. //I

24. Особо опасные инфекции на Кавказе (тезисы докладов шестой краевой научной конференции), Ставрополь, 1987. С. 193- 194.

25. Вачаев, Б.Ф. Иммунохимические и биологические свойства мембран лептоспир / Б.Ф. Вачаев, Э.А. Яговкин // Журнал микробиол. 1992. - № 11-12.-С. 46-48.

26. Взаимодействие вирусов гриппа А и В с углеродсодержащим сорбентом / В.Т. Иванова и др. // Вопросы вирусологии. -2008. № 2. - С. 40 — 43.

27. Водопьянов, А.С. Генотипическое разнообразие Francisella tularensis: VNTR- анализ: Автореф. дис. . канд. мед. наук: (03.00.23; 03.00.07) / А.С. Водопьянов. Ставрополь, 2009. - 18 с.

28. Вспышка туляремии в Московской области в 2005 г. /А.Б. Предтечен-ский и др. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней: Сб. научных трудов. М., 2006. - В.8. - С. 279-284.

29. Вспышки лептоспироза на территории Алтайского края / И.П. Салдан и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. - № 2. - С. 41-45.

30. Высокочувствительная неизотопная система гибридизации ДНК с применением амплификации (ПЦР) для идентификации бруцелл / Ю.К. Кулаков и др. // Молекуляр. генетика, микробиол. и вирусол. 1992. - № 7 -8. - С. 23.

31. Волина, Е.Г. Применение реакции энзим-меченных антител для диагностики лептоспироза / Е.Г Волина, Б.Д. Быченко, Н.Г. Бочарова // Журнал микробиол. -1981. №10. - С. 45-48.

32. Герпетическая инфекция / Лебедев В.В., Никулин Л.А., Александрова и др. 2000. - URL:http://WWW.Infectology.ru/RUK/herpes/index.asp.

33. Гинзбург, А.Л. Генодиагностика инфекционных заболеваний / А.Л. Гинзбург // Журн. микробиол. 1998. - №3. - С.86- 95.

34. Гипериммунные сыворотки / С.П. Карпов и др. Томск, 1976. — 378 с.

35. Джанков, И. Лептоспироз животных / И. Джанков / Пер. с болг. -Минск: Ураджай, 1985.- 128 с.

36. Долгих, Т.И. Лабораторная диагностика основа информационного обеспечения диагностического процесса при оппортунистических инфекциях (обзор литературы) / Т.И. Долгих // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - № 1. - С. 49 - 51.

37. Ефременко, В.И. Магнитный иммуноферментный анализ антигенов чумного микроба / В.И. Ефременко, И.М. Климова, Е.Н. Трофимов // Журн. микробиол. 1989. - № 7. - С.62 - 66.

38. Ефременко, В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях

39. В.И. Ефременко. Ставрополь, 1996. - 131 с.

40. Ефременко Д.В. Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза: Автореф. дис. .канд. мед. наук: (03.00.23; 03.00.07) / Д.В. Ефременко. Ставрополь, 2005. - 20 с.

41. Жарникова, И.В. Носители биотической и абиотической природы для иммобилизации антител и конструирования диагностикумов / И.В. Жарникова // Биотехнология. 2005. - №1. - С. 27 - 33.

42. Журов, С.А. Эритроцитарные тест-препараты для стандартизации флуоресцирующих антител и серологической диагностики гриппа / С.А. Журов, Ю.И. Васерин // Журн. микробиол. 1985. - №1. - С. 81 -85.

43. Заболеваемость зооантропонозными и природноочаговыми инфекциями и меры по их профилактике / Г.Г. Онищенко и др. // Журн. микробиол. — 1999.-С. 14-18.

44. Идентификация подвидов туляремийного микроба методом мультиплексной полимеразной цепной реакции / Н.А. Осина и др. // Проблемы особо опасных инфекций. 2007. —№1(93). - С.92 - 93.

45. Иммобилизация трипсина на углеволокнистых носителях, различающихся структурой, пористостью и химией поверхности / А.А. Масько и др. // Прикладная биохимия и микробиология. — 1992. — Т 28, №2. — С. 211 — 216.

46. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т.Т. Нго, Г.М. Ленхоффа. М., 1988.-С. 25- 167.

47. Иммуноферментный метод обнаружения бруцеллезных антител и антигена в сыворотках крови животноводов из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств / М.П. Подоляко и др. // Журн. микробиол. 1995. - № 6. -С. 53-54.

48. Иммунохимические свойства различных типов магносорбентов / И.М. Климова и др. // Акту ал. вопр. иммунодиагностики ООИ: Тез. докл. Все-союз. науч.- практич. конф. (26-27 мая 1986 г.). Ставрополь, 1986. - 4.1. -С.150 — 152.

49. Карпенко, В.В. Обезболивание животных в эксперименте: Методические рекомендации / В.В. Карпенко, В.И. Сачков. — М., 1985. — 53 с.

50. Катаев, Г.Д. Участие мышевидных грызунов в циркуляции возбудителей туляремии и геморрагической лихорадки на Кольском полуострове / Г.Д. Катаев, Н.М. Кузовлева, JT.A. Беспятова // Журнал микробиол. — 2008. — № 5. — С.93-95

51. Кельцев, Н.В. Основы адсорбционной техники / Н.В. Кельцев. М: Химия, -1984.-280 с.

52. Климова, В.А. Основные микрометоды анализа органических соединений / В.А. Климова. М., 1975. - 223 с.

53. Клячко-Гурвич, А.А. Методы определения удельной поверхности / А.А. Клячко-Гурвич // Из-во АН СССР. 1964. - № 10. - С. 1885.

54. Ласкорин, Б.Н. Сорбенты на основе силикагеля в радиохимии. Химические свойства. Применение / Б.Н. Ласкорин. -М.: Атомиздат, 1977. 304 с.

55. Лептоспироз / Е.П. Бернасовская и др. К.: Здоровье, 1989. — 151 с.

56. Лептоспироз в Ярославской области: эпидемиологические и эпизоото-логические аспекты / Д.В. Нагорнов и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. - № 5. - С. 28-32.

57. Лептоспирозы в Ульяновской области / Н.М. Никишина и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. — № 1. — С. 48-52.

58. Лисичкин, Г.В. Достижения, проблемы и перспективы химического модифицирования поверхности минеральных веществ / Г.В. Лисичкин // Журн. Всесоюз. хим. общества им. Менделеева. 1989. - Т.34, № 3. - С. 291 -297.

59. Мавзютов, А.Р. Ингибиторы полимеразной цепной реакции / А.Р. Мав-зютов; В.М. Бондаренко, А.Т. Латкин // Журнал микробиол. — 2003. №3. -С.93-98.

60. Малахов, Ю.А. Лептоспироз животных / Ю.А. Малахов. М:: ВО Агро-промиздат, 1992. - 240 с.

61. Малахов, Ю.А. Лептоспироз животных / Ю.А. Малахов. Ярославль.: Из-во ДИА-Пресс, 2001. - 584 с.

62. Марданглы, С.Г. Иммуноферментные тест-системы ЗАО «ЭКОЛАБ» для диагностики простого герпеса / С.Г. Марданглы // Клиническая лабораторная диагностика. -2008. —№2. — С.35 -38.

63. Марчев, Н. Опыт получения специфической туляремийной флуоресцентной сыворотки с помощью авирулентного штамма / Н. Марчев, А. Ревашка // Ветеринарная наука. 1974. - Т. 11, №7. - С. 86 - 91-.

64. Марьяновская, Т. Случаи туляремии среди жителей Москвы / Т. Марья-новская, Л. Митрикова, О. Тимченко // Врач. 2007. - № 12. - С.79-80.

65. Методы ПЦР для паспортизации и классификации микроорганизмов / С.А. Самсонова и др. // Биотехнология состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Междунар. Конгресса (Москва, 14-18 октября 2002 г.).-ML, 2002.-С.176.

66. Модифицированный метод гнездовой полимеразной цепной реакции в одной пробирке для детекции энтеровирусов / Н.В. Поклонская и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2004 . - №4. - С.46 - 47.

67. Нативные и ренатурированные олигомерзависимые эпитопы внутриклеточного нуклеокапсидного белка вируса гриппа / Н.П. Семенова и др. // Вопросы вирусологии. 2008. -№1. - С. 21 - 24.

68. Нафеев, А. А. Лептоспироз в антропургических очагах в Ульяновской области / А.А. Нафеев //Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2001. -№2.-С. 35-39.

69. Нафеев, А.А. Значение иммунолабораторных исследований в диагностике природноочаговых инфекционных болезней / А.А. Нафеев // Клиническая лабораторная диагностика. 2006. - №1. - С 36-37.

70. Нафеев, А.А. Опыт взаимодействия ЦГСЭН МО РФ и ЦГСЭН субекта РФ в профилактике природно-очаговых инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни /А.А. Нафеев, Ю.К. Болтенков 2007. —№1. - С. 4243.

71. Неймарк, И.Е. Синтетические минеральные адсорбенты и носители катализаторов / И.Е. Неймарк. Киев: Наукова Думка, 1982. - С. 143 -145.

72. Новая технология ковалентной иммобилизации биомолекул на носителях И. Применение фосфиновых сорбентов для иммунодиагностики и индикации возбудителей инфекционных заболеваний / И.В. Владимцева и др. // Биотехнология. 2007. - № 5. - С. 88 - 95.

73. Новая технология ковалентной иммобилизации биомолекул на носителях I. Разработка способа получения сорбентов на основе трис (гидрокси-метил) фосфине / Л.И Греков и др. // Биотехнология. — 2007. — № 4. — С. 34 -40.,

74. Новый количественный иммунофлуоресцентный метод определения IgE с помощью специфического сефарозного иммуносорбента и люминесцентного микроскопа / К.Г. Стоев и др. // Иммунология. 1981. - №1. - С. 85 -88.

75. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности: Методические указания МУ 1.3.1794-03. М.: ФЦГиЭ Роспотребнадзора,1995. - 19 с.

76. Особенности лептоспироза в Краснодарском крае / И.А. Калашников и др. // Реф. журн. 2006. - Св. том, № 5. - С 5.

77. Особенности проявлений некоторых природно-очаговых инфекций в Ставропольском крае в современном периоде / Н.Г. Ковалёв и др. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней: Сб. научных трудов. М., 2006. - В.8. - С. 328-332.

78. Оценка возможности завоза возбудителей опасных инфекционных болезней на территорию России международными транспортными средствами / В.И. Прометной и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. -2003. -№ 1.-С. 37-41.

79. Основы биотехнологии: Учеб. пособие для высш. пед учеб. заведений / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. 3-е изд., стер. - М.: Изд. центр «Академия», 2006. - С. 28.

80. Парнас, Ю. Антигенные и иммунологические взаимоотношения между бруцеллами и F. tularensis / Ю. Парнас // Здравоохранение Белоруссии. -1967.-№7. -С. 56-57.

81. Парфит, Г. Адсорбция из растворов на поверхностях твердых тел / Г. Парфит, К. Рочестер / Пер. с англ. / Под ред. В.И. Лыгина. М.: Мир, 1986. -488 с.

82. Пат. № 1707539 РФ. Маркер для люминесцентного иммуноанализа / Осин Н.С., Румянцева В.Д., Прошина Е.Ю. и др. 1992. - Бюл. №3.

83. Покровский, В.И. Лептоспироз: Руководство по зоонозам / В.И. Покровский, Ю.Г. Чернуха, П.М. Барышев. М.: Медицина, 1983. - С. 168 — 179.

84. Полтавченко, А.Г. Многопрофильная иммунохимическая индикация возбудителя инфекционных заболеваний / А.Г. Полтавченко, A.M. Яков-ченко, Н.А. Кривенчук // Биотехнология. 2006. - № 5. — С. 39 - 42.

85. Полтавченко, А.Г. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 2. Иммобилизация антигенов на подложке белкового чипа / А.Г. Полтавченко, A.M. Яковченко, Н.А. Кривенчук // Биотехнология. — 2007. — №1. — С. 86-93.

86. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноа-нализа микроорганизмов / В.И. Ефременко и др. // Журн. микробиол. -1989.-№ 12.- С. 100-105.

87. Потапова, Л.В. Иммобилизация в магнитные носители микроорганизмов, осуществляющих очистку сточных вод: Дис. .канд. биол. наук: (03.00.23) /Л.В. Потапова. Волгоград, 2006. - 21 с.

88. Практическая химия белка. М.: Мир, 1989. - С. 300 - 301.

89. Раев, М.Б. Частицы коллоидного углерода в системах неинструментальной диагностики / М.Б. Раев // Клиническая лабораторная диагностика. -2008.-№2.-С. 45-48.

90. Разработка диагностической тест-системы для выявления антигена и антител к возбудителю лептоспироза в непрямой реакции иммунофлуорес-ценции / С.Л. Капитулец и др. // Р.Ж. 2001. - № 2. - С.12-13.

91. Разработка метода экспресс-выявления антител и антигена вируса Эбола / А.А. Чепурнов и др. // Вопросы вирусологии. — 2007. — № 3. С. 41 -43.

92. Разработка способа получения универсальной матрицы для энтеросор-бентов / С.М. Кунижев и др. // Биотехнология- состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Международного Конгресса. — М., 2002. — С. 75.

93. Разработка тест систем для выделения и типирования вируса гриппа А на основе полимеразной цепной реакции / Д.Е. Киреев и др. // Вопросы вирусологии. — 2007. - №4. - С. 17.

94. Разработка тест-системы для выявления Leptospira interrogans методом полимеразной цепной реакции / И.П. Самсонова и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1994. - № 1. — С. 15-19.

95. Рахматуллина, Е.Н. Микрометод для определения микроальбуминурии / Е.Н. Рахматуллина и др. // Биотехнология. 2005. - № 1. - С. 90 — 92.

96. Результаты изучения диагностической эффективности новой тест-системы линейного иммуноферментного анализа «INNO-LIA™ SYPHILIS SCORE» / Н.В Фриго и др. // Клиническая лабораторная диагностика. -2006.-№3.-С. 36-41.

97. Результаты применения твердофазного иммуноферментного анализа для диагностики лептоспирозов / А.А. Сергеев и др. // Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций: Тез. докл. Всесоюз. конф. -Ставрополь, 1986. 4.2. - С. 93-96.

98. Ротанов, С.В. Сравнительное изучение иммунохроматографических наборов для экспресс-диагностики сифилиса / С.В. Ротанов, Н.В. Фриго,

99. B.И. Клюева // Клиническая лабораторная диагностика. 2008. - №2.1. C.42-45.

100. Рудакова, С.А. Применение метода иммуноблоттинга в диагностике иксодовых клещевых боррелиозов / С.А. Рудакова, Т.И. Долгих // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и

101. Крайнего Севера: Тезисы докладов III Российской науч. конф. с междун. участием (Новосибирск, 27-29 сентября 2006) . — Новосибирск, 2006. С. 212-213.

102. Самедов, А.С. Методика приготовления лиофилизированного лептоспирозного антигена для реакции связывания комплемента /А.С. Самедов // Журнал, микробиол. — 1966. № 2. — С. 37-41.

103. Системы взятия крови и интерференция в иммуноанализе / Г.С. Власов и др. // Клиническая лабораторная диагностика. — 2007. №4. - С. 24 -29.

104. Скоупс, Р. Методы очистки белков: Пер. с англ. / Р. Скоупс. М.: Мир, 1985.-358 с.

105. Скуч, Д. Основы аналитической химии / Д. Скуч, Д. Уэст М: Мир, 1979. — Т.1. - С.71- 73.

106. Способ получения сорбента / Г.Д. Елистратов и др.// БИПМ. 2004. -№ 3. — С. 629.

107. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования /Под ред. Биргера М.О. -М., 1982. С. 49-280.

108. Смирнов, В.В. Научные основы производства диагностических препаратов (Сыворотки для идентификации энтеробактерий) / В.В.Смирнов, В.Я. Чаплинский, З.М. Андреева и др. Киев: Наукова Думка, 1980. - 195с.

109. Тамбовцев, Е.П. Методы статистической обработки результатов серологических реакций / Е.П. Тамбовцев, С.Г. Ахметкалиев, Н.П. Пятницкий // Журн. микробиол. -1969. -№10. -С.26-31.

110. Таран, А.В. Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспироза и детекции его возбудителя: Автореферат дис. . канд. мед. наук / А.В. Таран. Ставрополь, 2008. - 24 с.

111. Темишевская, Л.Я. Использование техники иммобилизации клеток для непрерывного культивирования токсинообразующих анаэробов / Л.Я. Те-мишевская // Журн. микробиол. 1995. - №6. - С. 21 - 22.

112. Тест-система для выявления РНК вируса Крымско-Конго геморагиче-ской лихорадки методом ОТ-ПЦР / Е.В. Найденова и др. // Проблемы особо опасных инфекций 2006. - Вып.2. — С. 34.

113. Тривен, М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. — М: Мир, 1983.-С. 23.

114. Тимошков, В.В. Результаты двадцатилетнего мониторинга природных и антропургических очагов лептоспирозов в Москве. / В.В. Тимошков, Г.М. Маненкова, Л.В. Родина, М.Г. Ляпина // Дезинфекц. Дело. 2004. №1 С. 39-43.

115. Тюрина, И.Н. ДНК-зонд для идентификации и дифференциации лептоспир / И.Н.Тюрина, В.И. Белоусов, Н.Н. Быков, С.А. Артюшин // Ветеринария. 1993. -№ 8. - С. 22-24.

116. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов. Биокаталитические свойства адсорбционной глюкоамилазы / Г.А. Коваленко и др. // Биотехнология. 2002. - №5. - С. 81-93.

117. Уменьшение количества адсорбента гидроксида алюминия и сохранение протективной активности дифтерийного и столбнячного анатоксинов при введении в АКбДС-вакцину полиоксидония / Н.С. Захарова и др.// Иммунология. 2006. - Т 27, №2. - С. 88 - 91.

118. Фрайфелдер, Д. Физическая биохимия / Д. Фрайфелдер. — М: Мир, 1980-С.73.

119. Хохлова, Т.Д. Адсорбция белков и ДНК на дегидроксилированных и алюминированных силохромах / Т.Д. Хохлова, Л.Г. Гаркавенко, Ю.С. Никитин // Прикладная биохимия и микробиология- М.: Наука, 1991. Т. 27, №5. - С. 720 -724.

120. Черкасов, А.Н. Мембраны и сорбенты в биотехнологии / А.Н. Черкасов, В.А. Пасечник. Л., 1991. - 239 с.

121. Честнова, Т.В. Два случая листериоза, диагностированных в Тульской области / Т.В. Честнова // Эпидемиология и инфекционные болезни. -2002.-№2.-С. 39-42.

122. Шамардин, В.А. Эффективность некоторых иммунологических методов в диагностике лептоспироза / В.А. Шамардин, Н.В. Рудь, Б.К. Ильясов // Журнал микробиол. 1995. - № 2. - С. 84-86.

123. Шаханина, К.Л. Приготовление сефарозных пневмококковых диагно-стикумов и их использование в клинике легочных заболеваний / К.Л. Шаханина, И.В. Походзей // Журн. микробиол. 1978. - № 3. - С.75 - 79.

124. Эпидемиологическая характеристика бруцеллёза в современных условиях / В.В. Баташев и др. // Журн. микробиол. 1998. - №3. — С. 23 - 26.

125. Эпидемиологический надзор за туляремией: Методические указания МУ 3.1.2007-05. -М.: ФЦГиЭ Роспотребнадзора, 2005. 36 с.

126. Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами: Методические указания МУ 3.1.1128-02. М.: ФЦГиЭ Роспотребнадзора, 2002. - 44 с.

127. Яковлев, А.Т. ИФА в лабораторной диагностике бактериальных особо опасных инфекций: Автореф. дис. . доктора мед. наук / А.Т. Яковлев. -Саратов, 1992. 43 с.

128. Шторц, X. Иммунофлуоресценция / X. Шторц // Иммунологические методы. -М.: Медицина, 1987. С.128-148.

129. A monoclonal antibody reating with a determinant on leptospiral lipopolysaccharide protects guinea pigs against leptospirosis / B.H. Jost et al. // J. Med. Microbiol. 1986. -Vol. 22. -N 3. - P.269-277.

130. Adler, B. Species-and genus-specific antigens in leptospira, revealed by monoclonal antibodes and enzyme immunoassay / B. Adler, S. Faine // Zbl. Bakt., I. Abt. Orig A. 1983.-Bd. 255.-N 2-3.-P. 317-322.

131. Adsorbenzien and ratalistager / F. Janowski et al. // Z. Cyem. — 1979. — Vol. 19.-N l.-P.l-11.

132. Ainswort, A.J. Monoclonal Antibodies to Leptospira-interrogans Serovar Pomona / A.J. Ainswort, T.L. Lester, G. Capley // Can. J. Cemp. Med. 1985. -Vol. 49. - P. 202-204.

133. Berdal, B.P. et.al. // Scand. J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 32, N 3. - P. 287 -291.

134. Bovine Ig M and Ig G response to Leptospira interrogans serovas hardjo as measured by enzyme immunoassay / B. Adler et al. // Vet. microbiol. — 1982. — Vol. 76.-P. 577-587.

135. Chang, A. Electron microscopic evidence for reactions of axial filaments of Leptospira with Ig M and Ig G antibodies / A. Chang, S. Fain // Bull. WHO. -1970. Vol. 43. - P. 571-577.

136. Chapman, A. Genus-specific antigens in leptospira revealed by immunoblotting / A. Chapman, B. Adler, S. Faine // Zbl. Bakt. I. Abt. Orig. A. -1987. -Bd. 264.-N3-4.- P. 279-293.

137. Characterization of monoclonal antibodes against etiological agants of Weil,s disease / Y. Kobayashi et al. // Microbiol. Immunol. -1984. -Vol. 28. -N3.-P. 359-370.

138. Chemiluminescence enzyme immunoassays using protein A-bacterial magnetite cjmplex / T. Matsunaga et al // J. Of Magnetism and magnetic Materials, 1999.-Vol.1 -3.-P. 126- 131.

139. Clark, M.F. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus / M.F. Clark, A.N. Adams // J. Gen. Virol. 1977. - Vol.36. -N3. -P.475-483.

140. Coons, A.H. Localisation of antigen in tissue cells / A.H. Coons, M.N. Kaplan //J. Exp. med. 1950.-Vol. 91. -N 1. - P. 81-89.

141. Delisi C., Hethcote H., W., in: Affinity Chromatography and Related Techniques / C. Delisi, H.W. Hethcote // Gribnau Т., Visser J., Nivard R. (eds), Elsevier Scientific Publishing Co., Amsterdam. 1982. - P. 63.

142. Determination of cyclosporin A in 20 % ethanol by a magnetic beads-based immunofluorescence assay / M.V. Kiselev et al. // Anal. Biochem. 1999. -Vol. 269.-N2.-P. 393.

143. Differentiation of Brucella species by random amplified polymorphic DNA analysis / E. Tcherneva et al // J. Appl. Microbiol. 2000. - Vol. 88. - N 1. -p: 69 - 80.

144. Evaluation of a commercial enzyme-linked immunosorbent assay for detection of immunoglobulin M antibody in diagnosis of human leptospiral infection / W.E. Winslow et al. // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. - N 8. -P. 1938-1942.

145. Fagiolo, U. La reazione di immunofluoreszenza diretta nella sistematica delle leptospire / U. Fagiolo, B. Babudieri // Ann. 1st. super Sanita. -1968. -Vol.4. -N3. P. 344-350.

146. Fairbroter, J.M. Serologic interrelationship of Leptospira serovar and genus-specific antigens by enzyme-linked immunosorbent assay / J.M. Fairbroter // J. Clin Microbiol. 1984. -Vol. 20. - N 6. - P. 1089-1093.

147. Fathalla, N. C. Detection of leptospiral antibodes in animals sera by means of fractionated antigenic extracts / N. C. Fathalla, J. D. Coghlan // j. Med. Microbial.-1980.-Vol. 13-N4.-P. 513-525.

148. Flow-baased microimmunoassay / M.A. Hayes et al. // Anal. Chem. 2001. -Vol. 73.-N24.-P. 902.

149. Gribnau T.C.J. Affinity chromatography and related techniques / T.C.J.

150. Gribnau, J. Visser, R.J.F. Nivard // Amsterdam.: Elsevier, 1982. P. 18 - 22.

151. Jaskoby W.B. Affinity techniques: Enzyme purification, part B'. // Methods in Enzimology. Academic Press, New York. - 1974. - Vol. 34. - P. 148.

152. Kmety, E. Uber ein Vi antigen bei leptospiren / E. Kmety // Zbl. Bakt. Hyg, J. Orig. 1972. - Vol. 221. - P. 343-351.

153. Kriz, K. Advancementstoward magneto immunoassays / K. Kriz, J. Gerhrke, D. Kriz // Biosens Biolectron. 1998. - Vol. 13. - N 7 - 8. - P.817 -823.

154. Le Febre, K.B. Genetic and antigenic differencies of serologically indistinguishable leptospires of serovar hardjo / К. B. Le Febre, A. B. Thiermann, J. Foley // J. Clin. Microbiol. 1987. - Vol. 25. - N 11. - P. 20942097.

155. Lowe, C.R. An introduction to affinity chromatography / C.R. Lowe // Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology (Work T.S. and Burdon R.H., eds.). -Vol. 7. P. 11, Elsevier/North-Holland, Amsterdam. -1979.-P. 113-121

156. Lowe, C.R. Affinity chromatography / C.R Lowe, P.D.G. Dean. -London: Wiley, 1974. P. 176.

157. Lu, Q. Study on double antigens sandwich enzyme immunoassay for detection of Brucella specific antibodies in human and animals / Q. Lu, W. Zhang, Z. Hao // Chung. Hua. Liu. Hsing. Ping. Hsueh. Tsa. Chih. - 1999. -Vol. 20. -N 2. -P.21 -118.

158. Lucore Liza, Cullison Marc A., Jaykus Lee Ann //Appl. Fnd Environ. Microbiol. - 2000. - Vol. 66. - N 5. - P. 1766 - 1769.

159. Marshall, K. The acidity of surface groups of silicf / K. Marshall, N Ridgewee, J. Simpson // Chem. And Ind. -1974. Vol. 19. - P. 775-776.,

160. Maruyama, S. Seroprevalence of Bartonella henselae and Toxoplasma gondii amond healthy individuals in Thailand / S. Maruyama, S. Boonmar, Y. Morita // J. Vet. Med. Ski. -2000. -Vol. 62. N 6. - P.635-637.

161. Molday, R.S. Application of magnetic microspheres in labelind and separation of cells / R.S. Molday, S.P.S. Jen, A. Rembaum // Nature. 1977. -Vol. 268. - P.437 - 438.

162. Molecular Characterization of Brucella Strains Isolated from Marine Mammals / В J. Bricker et al. // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - N 3. - P. 1258- 1262.

163. Nakane, P.K. Peroxidase-labelled antibody-a new method of conjugation / P.K. Nakane, A. Kawaoi // J. Histochem. Cytochem. 1974. - V. 22. - N 4. -P. 506-508; 1084-1091.

164. Ono, E. Isolation of an antigenic oligosaccharide fraction from Leptospira interrogans serovar canicola with a monoclonal antibody / E. Ono, M. Naiki, R. Yanagawa // J. Gen. Microbiol. 1984. -Vol.130. -№ 6. - P. 1429-1431.

165. Ouchterlony, O. Antigen-antibody reactions in gel / O. Ouchterlony // Arkiv for Kemi. Mineral. О Ged. 1949. - Vol.261. -N 14. -P.l-9.

166. Peruski A.H., Johnson L.H., Peruski L.F.// J. Immunol. Methods. 2002. -V. 263,Nl-2.-P. 35-41.

167. Ramadass, P. A rapid latex agglutination test for detection of leprospiral antibodies / P. Ramadass, B. Samuel, K. Nachimulhu // Vet.Microbiol. -1999. -Vol. 70.-N 1-2.-P.137-139.

168. Richardson, J. The use of coated paramagnetic particles as a physical labels for use in magetj-immunossays/ J. Richardson, P. Hawcins, R. Luxton // Biosens Bioelectron. 2001. - Vol. 16. - P. 989.

169. Sakamoto, N. Studies on leptospiral genus-specific antigen / N. Sakamoto // Jap. J. Vet. Res. 1984 -Vol. 32. -№ 2. - P. 115.

170. Scheme for solation and identification of Bacilus anthracis / E.I. Eremenko et al. // Proceds of the 1st European Conference on Dangerous Pathogeus. -Wiuchester (England), 1999. P. 43.

171. Schricken, R. L. Precipitating antigens of leptospires. J. Chemical properties and serological activity of soluble fractions of Leptospira Pomona / R.L. Schricken, L. E. Hanson // Amer. J. Vet. 1963. -Vol. 24. - P. 854-860.

172. Singh, S.V. Comparative evaluation of a field-based dot-ELISA kit with three other serological tests for the detection of Brucella antibodies in goats / S.V. Singh, V.K. Gupta, N. Singh // Trop. Anim. Health. Prod. 2000. - Vol. 32(3).-P. 63.

173. Sjostedt, А.В. // DJ. Brenner (ed), Bergey's manual of systematic bacteriology.-N.Y.: Springer Verlag, 2003. -P.200-210

174. Steibuch, G. The isolation of IgG from imanalion serra with the acid of caprilic / G. Steibuch, R. Andran // Arch. Of Biochem. Stray and Biophys. -1969. Vol.139. - P. 279-284.

175. Tan W, Xia N, Cong Y. // Zhonghun Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Zazhi. -1998. -V.12. N 2. - P.176 — 178.

176. Tanaka, T. Detection of HbA (Ic) by boronate affinity immunoassay using bacterial magnetic particles / T. Tanaka, T. Matsunaga // Biosens Bioelectron. -2001.-P. 1089.

177. Tepper F., Kaledin L. // Water Conditioning and Purification. 2002. -P.62-65.

178. Terpstra, W.I. Analysis of leptospiral antigens by crossed immunoelectrophoresis / W. I. Terpstra, G. I. Shoone // Scand J. Immunol. — 1983.-Vol. 18.-P. 113-121.

179. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of high molecular weight / A. Poison et al. // Biochim., Biophis. Acta. 1964. - Vol. 82. - P. 463475.

180. The use of a reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of viral nucleic acid in the diagnosis of Crimean — Congo hemorrhagic fever / FJ. Burt et al. // J. Virol. Methods. - 1998. - Vol.70. - N2. - P. 129 -137.

181. Turkova, J. Leakage of the coupled affinant / J. Turkova // J. Chromatogr. 1978.-Vol. 12.-P.189.

182. Ultrasensetive magnetic biosensor for gomogeneous immunoassay / Y.R. Chemla et al.//Proc. Nat. Acad Sci. USA, 2000.-Vol. 97.-N 26. - P. 72.

183. Using scrapings from formalin-fixed tissues to diagnose leptospirosis by fluorescent antibody technicues / J.E. Cook et al. // Stain Tech. 1971. - Vol. 46.-P. 271-274.

184. Weimer B.C., Walsh M.K., Beer C. et al. //Appl. And Environ. Microbiol. -2001. -N3.- P. 1300-1307.

185. Weller, Т.Н. Fluorescent antibodu studies with agents of varicella and herpes zoster propagated in vitro / Т.Н. Weller, A.H. Coons // Prac. Soc. Exp. Biol. 1954. -Vol. 86. - P. 789 - 794.

186. WHO Recommended Surveillance Standards. WHO, 1999. - p. 15.

187. Yanagawa, R. Morphological analysis of leptospiral structures / R. Yanagawa, S. Faine. Nature. - 1966. - Vol. 211. - P. 823-826.

188. Yeung, K.K. Effect of immobilization on stability and properties of N-asetyl-beta-D-hexosaminidase from Turbo comutus / K.K. Yeung, A.J. Owen, J.A. Dain // Carbohydr. Res. 1979. - Vol. 75. - P. 295 - 304.

189. Yu, H. Comparative studies of magnetic particle-based solid phase fluorogenic and electrochemiluminescent immunoassay / H. Yu // J. Immunol. Methods. 1998. - Vol. 218. - N 1 - 2. - P. 1 - 8.

Информация о работе

Жарникова, Татьяна Владимировна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Усовершенствование методов индикации Francisella tularensis и leptospira interrogans с применением иммобилизованных систем - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Усовершенствование методов индикации Francisella tularensis и leptospira interrogans с применением иммобилизованных систем - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы