Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические и иммунобиологические свойства антигенов туляремийного микроба

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические и иммунобиологические свойства антигенов туляремийного микроба"

НИКОЛАЕВ Валерий Борисович

На правах рукописи

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АНТИГЕНОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иркутск - 2005

Работа выполнена в ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Марков Евгений Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Павлович Наталья Владимировна

доктор биологических наук,

профессор Тараненко Татьяна Михайловна

Ведущая организация: ФГУЗ «Ростовский-на-Донунаучно-исследовательскийпротивочумный институт» Федеральной службыпо надзору всферезащитыправпо-требителей и благополучия человека

Защита диссертации состоится «17» мая 2005 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 при ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб»

Автореферат разослан «12» апреля 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологическихнаук, старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Существование на территории Российской Федерации многочисленных стойких природных очагов туляремии определяет напряженность эпидемиологической обстановки в ряде административных территорий страны, где ежегодно регистрируются заболевания этой инфекцией (Они-щенко Г.Г. и др., 1999). Кроме того, возбудитель туляремии обладает рядом особенностей, обеспечивающих высокую возможность использования его в качестве потенциального средства биотерроризма (Ellis J. et al., 2002; Grunow R., Finke E.J., 2002; Navas E., 2002). В связи со сказанным остаются актуальными исследования, направленные на усовершенствование методов диагностики туляремии, конструирование новых диагностических тест-систем, обеспечивающих специфичность, достаточно высокую чувствительность и в то же время технологичность изготовления, доступность ингредиентов, простоту постановки реакции, оперативность получения результатов и их информативность. Актуальным является и разработка новых эффективных и безопасных субъединичных вакцин, пригодных для специфической профилактики туляремии, поскольку используемая в настоящее время живая вакцина не лишена недостатков (ДзагуроваС.Г., Резепова Ф.Ф., 1975; Козловский В.Н., 1997; Салтыков Р. А, 1976; Tarnvik A., Berglund L., 2003). Это вызывает необходимость углубленного изучения иммунобиологических свойств антигенных структур и отдельных антигенов возбудителя туляремии Francisella tularensis.

Несмотря на большое внимание, уделяемое исследованиям механизмов патогенности и иммуногенности возбудителя туляремии, многие вопросы изучения антигенной структуры туляремийного микроба остаются до конца невыясненными. В частности предстоит еще решить, какие антигены, в каком виде и соотношении должны входить в состав эффективных молекулярных вакцин. Наибольший интерес в этом аспекте вызывают поверхностные структуры бактериальной клетки, которые выполняют важнейшие функции во взаимодействии с иммунной системой хозяина, определяя характер специфического и неспецифического иммунного ответа (Бондаренко В.М., 1999; Езепчук Ю.В., 1985; Наумов АВ. и др., 1995; Павлович Н.В., 1993; Brown R.W. et al., 1988). Поэтому не удивительно, что при поиске субстанций, перспективных для диагностики или создания химических вакцин против туляремии, искомыми зачастую оказываются биомолекулы поверхностных структур бактериальных клеток (Анисимов П.И. и др., 1999; Хлебников B.C. и др., 1991,1994; Fulop M. et al., 1996; Golovliov I.R. etal., 1991; KayhtyH., 1985; SjostedtA, 2003; SzostakM.P. etal., 1997).

Большие надежды возлагаются на использование изолированных липополисахаридов (ЛПС) и белков наружной мембраны (БНМ) как наиболее изученных поверхностных антигенов туляремийного микроба

для усовершенствования соответствующих профилактических (Хлебников B.C. и др., 1992) и диагностических препаратов (Мещерякова И.С, 1990; Vljanen M.K. et al., 1983). Важными моментами в этих исследованиях, безусловно, являются усовершенствование методов выделения, очистки, идентификации антигенов туляремийного микроба, позволяющих в максимальной степени сохранить их иммунохимическую специфичность и протективную активность. Особое внимание необходимо уделять подбору щадящих способов инактивации бактериальной массы с целью сохранения исходных свойств выделяемых антигенов, так как отмечено, что традиционные способы обеззараживания существенно влияют на их структуру и физико-химические свойства (Ефанова Е.А. и др., 1991; Nutter J.E., 1971; SandstromG. etal., 1984). Все вышеизложенное определило цель и основные задачи настоящего исследования.

Цель работы:

Выделение и очистка антигенов возбудителя туляремии, характеристика ихфизико-химических, иммунобиологическихсвойств и оценка пригодности для конструирования диагностическихи профилактических препаратов.

Основные задачи исследования

В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи диссертационной работы:

1. Получить экстракты антигенов, препараты клеточных стенок и ЛПС F. tularensis с использованием разных методов инактивации микробной массы.

2. Разработать новые способы выделения и очистки ЛПС туляре-мийного микроба, используя липофильные свойства антибиотика по-лимиксина В и детергентов Тритона Х-114 и Твина 80.

3. Изучить физико-химические, иммунохимические и биологические свойства полученных антигенов туляремийного микроба.

4. Оценить пригодность выделенных антигенов для конструирования диагностических тест-систем с целью обнаружения антигенов туляремийного микроба и антител к ним.

Научная новизна

Показана возможность инактивации и одновременной экстракции антигенов возбудителя туляремии с помощью растворов мочевины и катионного детергента цетавлона. Разработаны новые методы получения высокоочищенного препарата ЛПС туляремийного микроба с использованием иммобилизованного полимиксина В и неионных детергентов Твина 80 и Тритона Х-114. Новизна разработки подтверждена патентом РФ № 2051969.

Получены новые данные о наличии в составе туляремийного микроба гликопротеинов, углеводная часть которых обладает сродством к конканавалину А. С помощью аффинной хроматографии на Кон А-Сефарозе выделен препарат гликопротеинов туляремийного микроба, обладающий иммунохимической активностью с диагностической сывороткой. Дополнены новыми данными сведения о физико-химических свойствах ЛПС и белково-липополисахаридного комплекса туляремийного микроба: химическом составе, электрофоретических спектрах, метахроматическом эффекте, активности в тесте гелирования лизата амебоцитов Пшы1ш ро\уркетш (ЬДЬ-тест), антигенных свойствах, протективной активности и токсичности.

Разработан вариант дот-иммуноанализа для обнаружения антигенов туляремийного микроба и антител к ним с использованием в качестве метки иммунореагентов частиц коллоидного серебра (Пат. РФ № 2203496).

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты проведенных исследований дополняют новыми научными данными сведения о поверхностных структурах и антигенах туляремийного микроба, позволяют глубже понять их роль в формировании иммунитета и синтезе антител. Теоретический аспект исследований представлен анализом возможных причин снижения иммуногенности антигенных структур бактериальных клеток при их изоляции и обоснованием важности способов обеззараживания бактерий для сохранения их протективной активности. Наряду с теоретическим интересом изучение иммунобиологических свойств клеточных оболочек и ЛПС имеет важное значение для разработки вопросов иммунодиагностики и профилактики туляремии.

Разработан и внедрен в практику комплекс методических приемов выделения, очистки, количественного анализа бактериальных ЛПС, получения диагностических сывороток и иммунохимических тест-систем. На основе экспериментальных данных составлены и одобрены Ученым советом Иркутского НИПЧИ «Методические рекомендации по очистке бактериальных ЛПС с использованием детергента Тритона X-114» (утверждены зам. пред. Госкомсанэпиднадзора РФ 17.03.96 г.), «Методические рекомендации по определению бактериальных липополиса-харидов колориметрическим методом» (утверждены Первым зам. Министра здравоохранения РФ 3.02.97 г.), «Методические рекомендации по приготовлению туляремийного антигенного эритроцитарного диагнос-тикума» (утверждены директором Иркутского НИПЧИ 3.03.97 г.), «Методические рекомендации по комплексному сероаллергическому исследованию на туляремию сывороток крови человека и животных» (утверждены Первым зам. Министра здравоохранения РФ 17.03.97 г.), «Методические рекомендации по определению функциональной активности лимфоцитов цитофлуориметрическим методом с использованием акри-

динового оранжевого» (утверждены зам. директора по научной работе Иркутского НИПЧИ 22.03.99 г.), «Методические рекомендации по приготовлению тест-системы для обнаружения антигенов Francisella tularensis на основе специфических антител, меченных коллоидным серебром» (утверждены зам. директора по научной работе Иркутского НИПЧИ 14.03.03 г.), получено два патента на изобретения «Способ получения бактериальных липополисахаридов» (Пат. РФ № 2051969) и «Способ обнаружения антигенов туляремийного микроба» (Пат. РФ № 2203496).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Новые способы очистки туляремийного липополисахарида с использованием иммобилизованного полимиксина В и неионных детергентов Твина 80 и Тритона Х-114.

2. ЛПС туляремийного микроба при взаимодействии с карбоциа-ниновым красителем вызывает сдвиг максимума поглощения последнего в коротковолновую часть спектра (метахроматический эффект), что может быть использовано для количественного определения содержания ЛПС в различных антигенных препаратах.

3. Туляремийный микроб в своем составе содержит гликопротеи-новый комплекс, у которого углеводная составляющая его компонентов обладает сродством к конканавалину А.

4. Изготовление туляремийного антигенного эритроцитарного диагностикума с использованием неионного детергента Тритон Х-114 и разработка варианта дот-иммуноанализа для обнаружения антигенов туляремийного микроба с использованием в качестве метки иммуноглобулинов частиц коллоидного серебра.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены и представлены на Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы профилактики туляремии» (Симферополь, 1991); 2nd Conference of International Endotoxin Society (Vienna, Austria. 1992); научной конференции «Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней» (Омск, 1993); научно-практической конференции, посвященной 75-летию образования санитарной службы в Иркутской области (Иркутск, 1997); Международной научно-практической конференции «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы», посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкурганской противочумной станции (Талдыкурган, 2001 г.) и на научных конференциях Иркутского НИПЧИ (Иркутск, 1985-2004 гг.).

Материалы диссертации оформлены на основе двух научных отчетов по плановым темам НИР.

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 16 печатных работах и 2 патентах на изобретения.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Текст работы изложен на 169 страницах машинописного текста, иллюстрирован 13 таблицами, 17 рисунками. Список цитированной литературы содержит 145 отечественных и 152 иностранных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Для выделения антигенов в работе использовали вакцинный штамм F. tularensis № 15 НИИЭГ и классические вирулентные штаммы голарктического подвида F. tularensis И-377 и F. tularensis И-777, выращенные на среде Анциферова при 37 °С. Обеззараживание бактериальной массы осуществляли обработкой ацетоном, мочевиной, детергентами цетав-лоном и Твином 80 с последующим прогреванием при 90 °С, а также прогреванием в кипящей водяной бане. Последующая работа осуществлялась после проведения контроля специфической стерильности в соответствии с требованиями Санитарных правил СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности)». Кроме того, в работе использовали следующие штаммы: Brucellaabortus 19 ВА, Escherichiacoli K-12, Yersiniapestis EV, Y.pseudotuberculosis 233, Y.enterocolitica 134 (O:3) и 383 (0:9), полученные из музея живых культур Иркутского НИПЧИ. Для культивирования использовали агар Хоттингера (производства Иркутского НИПЧИ).

Клеточные оболочки (КО) получали дифференциальным центрифугированием ультразвукового дезинтеграта ацетонвысушенных клеток. Аффинную хроматографию на Кон А-сефарозе («Pharmacia», Швеция) проводили в соответствии с рекомендациями производителя и в модификации автора. Гель-хроматографию на Sephacryl S-300 (25 х 300 мм) («Pharmacia», Швеция) проводили в 0,01 М аммоний би-карбонатном буфере (рН 8,5), содержащем 0,05 М NaCl и 0,1% доде-цилсульфата натрия (ДСН), на Sephacryl S-200 (25 х 840 мм) («Pharmacia», Швеция) в 0,05 М Трис-HCl буфере (рН 8,6), содержащем 0,15 М NaCl и 0,03% цетавлона («Serva», Германия).

Выделение липополисахарида (ЛПС) из ацетонвысушенных клеток проводили водно-фенольной экстракцией (Адаме ГА, 1975) и предложенными нами способами очистки: аффинной хроматографией на иммобилизованном полимиксине В и обработкой Тритоном Х-114.

ЛПС также выделяли с использованием неионного детергента Твина 80, экстракцией мочевиной.

Содержание белка определяли по О.Н. Lowry с соавт. (1951), нуклеиновых кислот — по А.С. Спирину (1958) и по L. Wu с соавт. (1987), углеводов — по методу W. Dubois с соавт. (1956). Определение 2-кето-З-дезоксиоктоновой кислоты (КДО) проводили по методу Y.D. Karkhanis с соавт. (1978). Тонкослойную хроматографию (ТСХ) продуктов кислотного гидролиза туляремийного ЛПС проводили на силуфоловых пластинах («Kavalier», Чехословакия) в системе пропанол-2:вода (7:1) с визуализацией результатов методом L. Wareen (1960). Маркерами служили коммерческие препараты КДО («Sigma», США) и 2-дезоксири-бозы («Мегк», Германия), а также гидролизат ЛПС Е. coli K-12, полученный в условиях аналогичных гидролизату туляремийного ЛПС.

Электрофорез в гомогенных 10% (12,5%) и градиентных 7,5—15% (7,5—20 %) полиакриламидных гелях (ДСН-ПАГЭ) проводили по методу U.K. Laemmli и М. Favre (1973) с набором белковых маркеров № 4 и 5 («Serva», Германия). Гелевые блоки окрашивали кумасси ярко-синим R-250 («Serva», Германия) (Fairbanks G. et al., 1971) и ионами серебра (TsaiC.-M., FraschC.E., 1982). Иммуноблотинг проводили по методу Н. Towbin с соавт. (1979) на нитроцеллюлозных мембранах 0,45 мкм («BioRad», США). Дот-иммуноанализ (ДИА) осуществляли с использованием специфических антител, меченных пероксидазой хрена (Полунина Т.А., 1990), а также частицами коллоидного серебра.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) проводили в соответствии с методическими рекомендациями (Меринов СП. и др., 1983), реакцию иммунодиффузии (РИД) проводили по О. Ouchterlony (1953). В имму-нохимических тестах использовали коммерческую туляремийную агглютинирующую сыворотку (производство Иркутского НИПЧИ) и экспериментальные кроличьи гипериммунные сыворотки, полученные против антигенов и целых клеток туляремийного микроба. Иммуноглобулины выделяли обработкой сывороток крови сульфатом аммония в комбинации с ионообменной хроматографией (Жатон Ж.-К. и др., 1981) или с использованием капри-ловой кислоты (McKinny M.M., 1987). Конъюгирование иммуноглобулинов с пероксидазой хрена (Марка А, НПО «Биолар») проводили периодатным методом (Imagawa М. et al., 1982), а комплексирование коллоидного серебра с иммуноглобулинами — физической сорбцией (Полтавченко АГ. и др., 2002).

Реакцию бласттрансформации (РБТЛ) выполняли с сенсибилизированными спленоцитами мышей и лимфоцитами периферической крови человека (Новиков Д.К., Новикова В.И., 1979). О степени активации клеток судили по включению [3Н]-тимидина («Изотоп», СССР), учитывая результаты в импульсах в минуту, и величине индекса стимуляции (ИС). Положительным контролем служил фитогемагглютинин-II (ФГА) («Serva», Германия).

Токсичность ЛПС тестировали in vivo на белых беспородных и линейных мышах (С-57 Black, BALB/c, CBA), а также in vitro в тесте гели-рования лизата амебоцитов Limulus polyphemus (LAL-тест) с набором реактивов E-Toxate («Sigma», США). Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) учитывали по выраженности реакции на внутрикожное введение 0,1 мл исследуемого препарата в область спины вакцинированным против туляремии морским свинкам из разведений 2,5 мг/мл; 1,25мг/мл; З00мкг/мл; 200мкг/мл; 100мкг/мл и коммерческого туля-рина (5 млрд. м.к./мл), учет реакции проводили через 24—48—72 ч (Олсуфьев Н.Г., 1975). Реакцию лейкоцитолиза проводили согласно Н.А. Суханову с соавт. (1989). Протективную активность антигенных препаратов определяли в тесте активной защиты беспородных и мышей линии BALB.

Статистическую обработку проводили общепринятыми методами (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962). В ряде случаев определяли среднюю арифметическую из 3—5 определений и ее среднюю ошибку. Для титров антител в сыворотках вычисляли средний геометрический титр (СГТ) (Ашмарин И.П., ВоробьевА.А., 1962).

Результаты исследований и обсуждение

Для выделения антигенов, наиболее перспективных в плане диагностики и специфической профилактики туляремии, использовали комплекс методических приемов, включающий ультразвуковую дезинтеграцию, экстракцию клеток растворами мочевины, Твина 80 и цетавло-на, дифференциальное центрифугирование, осаждение органическими растворителями, гель-хроматографию, обработку растворов антигенов детергентом Тритоном Х-114, аффинную хроматографию. Для анализа антигенного состава препаратов применяли ДСН-ПАГЭ и иммунохими-ческую систему детекции на основе коммерческой диагностической и экспериментальных поликлональных сывороток.

Обработка живых клеток туляремийного микроба растворами мочевины и цетавлона с целью их обеззараживания дает возможность получать специфически стерильные лизаты, используемые в дальнейшем в качестве источника антигенов и субклеточных фракций. Это позволяет избежать денатурирующее воздействие на них традиционных способов инактивации бактериальной массы. Воздействия мочевины и цетавлона в течение двух суток оказалось достаточным для полного отмирания клеток франциселл. После контроля специфической стерильности лизаты клеток туляремийно-го микроба подвергали центрифугированию для освобождения от неразрушенных клеток и их фрагментов. После диализа мочевинный экстракт разделяли центрифугированием на осадок, выпадающий при диализе (препарат ПР), и водорастворимую часть (препарат МЭ). Далее ультрацентрифугированием из препарата МЭ получали гелеобразный осадок (препарат ГО) и су-пернатант (препарат СУ). Химический анализ показал, что препарат СУ со-

держал 6,3 ± 0,3 % углеводов, 42,5 ± 2,1 % белка, 6,7 ± 0,4 % нуклеиновых кислот, 6,4 ± 0,3 % Л ПС; ГО - 20,6 ± 2,1 % углеводов, 29,2 ± 1,5 % белка, 7,2 ± 0,4 % нуклеиновых кислот, 34,8 ± 1,7 % ЛПС; ПР - 13,8 + 0,7% углеводов, 43,1 ± 2,1 % бежа, 1,1 ± 0,2 % нуклеиновых кислот, 31,3 ± 1,5 % ЛПС.

Предварительно лиофилизированный бесклеточный цетавлоновый экстракт растворяли в небольшом объеме 0,5 М раствора КаС1 и смешивали с 10 объемами охлажденного этанола. Образовавшийся преципитат растворяли, диализовали и лиофильно высушивали (препарат ЦЭ). Остаток микробных клеток, после обработки цетавлоном, экстрагировали 4 М раствором хлористого кальция. Экстракт хлористого кальция смешивали с охлажденным этанолом как указано выше и образовавшийся преципитат собирали и промывали этанолом (препарат ЭХК). Химический анализ показал следующий состав: препарат ЭХК — 6,3 + 0,3 % углеводов, 27,1 ± 1,3 % белка, 10,4 ± 0,5 % нуклеиновых кислот, 30,3 ±1,5% ЛПС; препарат ЦЭ — 4,7 ± 0,2 % углеводов, 41,7 ± 2,1 % белка, 0,64 ± 0,3 % нуклеиновых кислот, 30,4 ± 2,1 % ЛПС.

Препарат клеточных оболочек (КО), выделенный из ацетонвысу-шенных клеток вирулентного штамма Г. Ш1агвт1$ И-377', содержал 41,4 ± 2,7 % белка, 34,05 ± 1,7 % углеводов, 0,042 ± 0,004 % нуклеиновых кислот. Анализ КО в ДСН-ПАГЭ выявил около 25 полипептидных полос в диапазоне мол. масс от 10 до 70 кБа.

Анализ препаратов ГО, СУ, ЦЭ, ЭХК в ДСН-ПАГЭ показал наличие от 11 до 23 отчетливо выраженных полипептидных полос с мол. массами от 13 до 143 кБа. Антигенные препараты в своем составе содержали полипептиды как с одинаковыми, так и с разными мол. массами. Посредством иммуноблотинга с использованием иммуноглобулинов против целых клеток туляремийного микроба показано наличие нескольких антигенных фракций в интервале мол. масс от 12,5 до 68 кБа. Независимо от метода выделения, все препараты были активны в РИД с диагностической туляремийной сывороткой. В их составе основным регистрируемым компонентом идентифицирован ЛПС. В непрямом варианте И ФА с применением 1§ О кроличьих гипериммунных сывороток против туляремийного ЛПС препараты мочевинной и цетавлоновой экстракции выявлялись в количестве от 2,25 нг до 156 нг (по сухому весу).

Для более детального изучения состава препаратов ГО, СУ и препарата МЭ проведено их фракционирование гель-хроматографией на БерИасгу1 Б-300 и Б-200 в присутствии детергентов ДСН (0,1 %) и це-тавлона (0,03 %), соответственно. Анализ полученных фракций показал присутствие в их составе полипептидов с электрофоретической подвижностью, соответствующей мол. массам белков наружной мембраны туляремийного микроба (БрйеЛ А. е1 а1., 1990).

Основываясь на способности молекул неионного детергента Тритона Х-114 агрегировать при определенной температуре и образовы-

вать в водных растворах отдельную фазу, из препаратов МЭ, ПР, ЦЭ, ЭХК были выделены ЛПС, концентрирующиеся в отличие от белков и нуклеиновых кислот в гидрофобной детергентной фазе (рис. 1А, Б).

123456789 10 123456789

Рис. 1. ДСН - ПАГЭ (7,5-22 %) водных и детергентных фаз после обработки препаратов МЭ, ЦЭ, ПР, ЭХК Тритоном Х-114 А - окраска Кумасси ярко-синим R-250 Б - окраска ионами серебра Препараты из детергентной фазы дЭХК (3), дПР (5), дЦЭ (7), дМЭ (9), препараты из водной фазы вЭХК(2), вПР (4), вЦЭ (6), вМЭ (8) Маркерные белки 92, 68,45, 29 (kDa) (1,10)

Из препарата МЭ посредством аффинной хроматографии на Кон А-Сефарозе выделен антигенный комплекс гликопротеиновой природы (ЛА). Анализ препарата ЛА в ДСН-ПАГЭ показал наличие в нем полипептидов с мол. массами 80,5; 73; 50; 42, 29,5; 24,5; 16 и 13 kDa (рис. 2Б). При аффинной хроматографии элюируемый антигенный материал частично разделялся на две фракции. По данным РИД с диагностической туляремийной сывороткой в препарате ЛА регистрировалось не менее двух иммунохимически активных компонентов. Один из них обнаруживался как в первой, так и во второй фракциях, другой же — элюировался с Кон А-Сефарозы во второй фракции (рис. 2А).

М I II

Рис. 2. РИД и ДСН-ПАГЭ препарата ЛА, полученного аффинной хроматографией на Кон А-Сефарозе А- РИД фракций I и II против диагностической лошадиной туляремийной сыворотки (Ас) Б - ДСН-ПАГЭ (12,5 %) препаратов фракций I и II Маркерные белки (kDa) - М, окраска Кумасси ярко-синим R-250

Оценка влияния антигенных препаратов на клеточное звено иммунитета в тесте бласттрансформации сенсибилизированных лимфоцитов (РБТЛ) показала, что препарат ЛПС туляремийного микроба в концентрациях от 10 нг/мл до 10 мкг/мл не обладал индуцирующей активностью. В тоже время при внутрикожной пробе у иммунизированных против туляремии морских свинок и в реакции лейкоцитолиза ЛПС туляремийного микроба, полученного с использованием Твина 80, в дозе 5-100 мкг обладал активностью, статистически значимо превышающей активность корпускулярного коммерческого тулярина (Р< 0,05). В реакции специфического лизиса лейкоцитов, полученных от сенсибилизированных морских свинок, препарат ЛПС имел резко положительный коэффициент цитолиза и статистически не отличался от показателя коммерческого аллергена (Р> 0,05).

В РБТЛ, используя сенсибилизированную культуру клеток селезенки мыши и периферической крови донора, показано, что протестированные антигенные препараты обладают как активирующим, так и супрессивным действием на функциональные свойства лимфоцитов. Так, антигенный материал, содержащийся в препарате ЦЭ, в концентрациях 25 и 50 мкг/мл проявил индекс стимуляции (ИС) — 3,37 и 3,03 соответственно. Гель-хро-матографическая фракция препарата МЭ, собранная в первом пике на культуре мышиных спленоцитов показала ИС 1,09 и 1,3 соответственно концентрациям 100 и 200 мкг/мл. Антигенный материал, содержащийся во второй хроматографической фракции, обладал ИС равным 1,3. Комбинированное действие на культуру сенсибилизированных лимфоцитов митоге-на ФГА и антигенных препаратов приводило к снижению способности лимфоцитов отвечать на стимулирующее действие митогена (табл. 1). Препарат ЦЭ в дозе 50 мкг/мл снижал ИС лимфоцитов под действием ФГА (50 мкг/мл) в 1,8 раза по сравнению с культурой, стимулированной только митогеном (Р< 0,05).

Таблица 1

Влияние препаратов цетавлоного экстракта (ЦЭ) и водной фазы тритоновой обработкой преципитата мочевинного экстракта (вПР) на активацию сенсибилизированных лимфоцитов человека

в ответ на митоген (ФГА)

Препарат Концентрация, мкг/мл ИС

ФГА 50 99,7

ФГА 6,25 21,20

ФГА+ЦЭ 50 +50 45,3

ФГА+ЦЭ 25 + 25 72

вПР 0,001 1,65

вПР 0,010 1,12

вПР 0,100 0,78

ФГА + вПР 6,25 + 0,05 46,90

Двукратное уменьшение количества антигена и митогена в культуре клеток не приводило к снижению, как следовало бы ожидать, общего уровня реакции. Напротив, отмечено повышение ИС в сравнении с активностью, полученной на стимуляцию смесью исходных концентраций митогена и антигена. Аналогичный результат отмечен у препарата вПР, полученного из водной фазы ПР обработкой последнего Тритоном Х-114. Препарат вПР в начальной концентрации стимулировал низкую активность, а при ее увеличении проявлял тенденцию к подавлению спонтанной пролиферации лимфоцитов (Р< 0,05). Комбинированное воздействие на культуру клеток этого препарата (50 нг/мл) и митогена (6,25 мкг/мл) вызвало усиление пролиферативного ответа более чем в 2 раза, в сравнении с ИС, получаемым в ответ только на ФГА, что указывает на костимулирующее действие антигенного препарата.

В тесте активной защиты белых мышей однократная подкожная иммунизация препаратами МЭ, ПР, ЦЭ, ЭХК, ЛА в дозе 100,500 и 1000 мкг (по сухому весу) защищала 25—100% животных от заражения 10DCL вирулентного штамма F. tularensis голарктического подвида. Минимальные дозы препаратов МЭ и ПР, полученных мочевинной экстракцией, были более активны в тесте защиты животных по сравнению с их наибольшими испытанными дозами, что можно оценить как наличие у препаратов тенденции к супрессивному воздействию на иммунную систему животных. Препараты, полученные с использованием цетавлона, и препарат ЛА в таком же количественном диапазоне не оказывали данного воздействия и в тесте защиты они были активнее в максимально испытанных дозах. При увеличении заражающей дозы до 100 DCL наибольшей протективной активностью обладал препарат КО туляремийного микроба, который при подкожном введении в дозе 200 мкг (по сухому весу) защищал более 80 % взятых в опыт животных, для остальных антигенов единичная защита отмечена в группе мышей, иммунизированных препаратом ПР.

С целью получения ЛПС — одного из основных иммунодоминант-ных антигенов туляремийного микроба — в максимально нативном виде нами были усовершенствованы стандартные методы выделения, а также апробирован новый прием экстракции и очистки этого антигена. Из водно-фенольного экстракта туляремийного микроба, полученного по методу О. Westphal с соавт. (1952) аффинной хроматографией на иммобилизованном полимиксине В (Межин А.П. и др., 1986) в нашей модификации был выделен и очищен от примеси нуклеиновых кислот препарат туляремийного ЛПС. Полученный ЛПС обратимо сорбировался на иммобилизованном полимиксине В. Очищенный аффинной хроматографией ЛПС практически не содержал нуклеиновых кислот (менее 1 %), сохранял серологическую активность в РИД, давал положительную реакцию на присутствие липидов, при электрофоретическом анализе показал характерную для S-ЛПС гетерогенность, обладая высокополиме-

ризованным О-полисахаридом. ДСН-ПАГЭ анализ показал, что полученный препарат отличался от ЛПС, очищенного ультрацентрифугированием, наличием на электрофореграмме участка, обогащенного ЛПС с менее полимеризованным О-полисахаридом (рис. 3, трек 2).

1 2

Рис. 3. ДСН-ПАГЭ (12,5 %) ЛПС туляремийного микроба, выделенного водно-феноль-ной экстракцией 1 - препарат ЛПС, очищенный методом ультрацентрифугирования, 2 - препарат ЛПС, очищенный с использованием иммобилизованного лолимиксина В Окраска на углеводы ионами серебра

На основании исследований распределения радиоактивно меченных in vivo препаратов [3Н]-нуклеиновых кислот и [14С]-ЛПС Е. сой К-12, использованных в качестве модели, был предложен метод экстракции и очистки ЛПС из водных растворов с помощью детергента Тритона Х-114. Метод показал свою особую пригодность при работе с разбавленными водными растворами ЛПС за счет свойства последних при разделении фаз концентрироваться в небольшом объеме детерген-тной фазы. Данный подход был использован для выделения и очистки ЛПС из мочевинного экстракта туляремийного микроба (рис. 4). В препаратах ЛПС обнаруживалось наличие примеси нескольких полипептидов в диапазоне мол. масс от 12 до 25 kDa. Выход препарата составил 2—3 % от сухого веса бактерий. Содержание белка в препарате составило 10,1 + 1,1 % и углеводов — 16,2 + 2,3 %. Полученный ЛПС обладал метахроматическим эффектом при взаимодействии с карбоцианино-вым красителем «Stains all» (KK), низкой токсичностью в LAL-тесте (не ниже 20 нг/мл), что совпадает с результатами изучения свойств ЛПС туляремийного микроба, выделенного и очищенного с использованием неионного детергента Твина 80.

Способность Твина 80 лизировать туляремийный микроб была положена в основу выделения его ЛПС (рис. 5). Полученный этим методом препарат ЛПС содержал 6,5 + 1,1% белка, 30,3 + 2,3% углеводов, 0,27 ± 0,02 % КДО. Этот препарат не был токсичен для белых мышей в максимально испытанной дозе 25 мг на животное. Полученный ЛПС регистрировался в ИФА в конечной концентрации 4,5 ± 2,6 нг. Следует от-

Рис. 4. ДСН-ПАГЭ в градиентном полиакриламидном геле (7,5-22 %) препарата ЛПС туляремийного микроба, выделенного с использованием раствора мочевины и Тритона Х-114 Окраска на углеводы ионами серебра Справа указаны положение и мол массы маркерных белков

1 2

Рис. 5. ДСН-ПАГЭ в градиентном полиакриламидном геле (7-20 %) препарата ЛПС туляремийного микроба Окраска на углеводы ионами серебра Нагрузка 25 мкг (1), нагрузка 10 мкг (2) Справа указаны положение и мол массы маркерных белков (kDa)

метить, что ЛПС, очищенные с использованием Тритона Х-114 и Твина 80, обладали более высокой антигенной активностью в ИФА по сравнению с препаратом, выделенным водно-фенольным методом. Таким образом, предложенные способы выделения и очистки ЛПС туляремийного микроба позволяют получать препараты, практически не содержащие примеси нуклеиновых кислот и сохраняющие антигенные свойства.

В процессе проводимых экспериментов был усовершенствован предложенный J. Janda и Е. Work (1971) колориметрический метод оценки содержания ЛПС в растворах, основанный на метахромазии карбоцианино-вого красителя (КК). Установлено, что ЛПС туляремийного микроба обла-

дает метахроматическим эффектом при взаимодействии с КК, что характерно для ЛПС бактерий семейства ЕШвгоЪас1впасвав. Максимум поглощения образующегося комплекса туляремийного ЛПС с КК отличается от максимума поглощения ассоциата КК с ЛПС чумного, холерного, бруцеллезного микробов (467 нм) и находится в области 472 нм. Для ЛПС возбудителя туляремии чувствительность теста составила 25,2 ±1,3 мкг/мл и была наименьшей в сравнении с ЛПС других бактерий, обладающих полноценными эндотоксическими свойствами. Это в очередной раз указывает на уникальность свойств этого биополимера туляремийного микроба.

Для получения гипериммунных кроличьих сывороток апробированы схемы иммунизации с использованием антигенов мочевинной экстракции вакцинного и вирулентного штаммов туляремийного микроба, искусственно созданных иммуногенов на основе туляремийного ЛПС, формалинизированных клеток вакцинного, а также живых клеток вакцинного и вирулентного штаммов В. шОтвтЫ.

В связи с тем, что очищенный ЛПС туляремийного микроба не способен индуцировать выработку высоких титров антител, для получения гипериммунных кроличьих сывороток использовали целые клетки, а также искусственно полученные иммуногенные комплексы. При подкожной иммунизации 20% суспензией свежевыделенных эритроцитов кролика, сенсибилизированных ЛПС, титр антител кроличьих сывороток составил в И ФА - 1:1000000-1:8000000 (средний геометрический титр (СП) -2971989 V- 1,87), в РПГА - 1:10240-1:40960 (23043 */ 1,65), в МРА -1:1600-1:3200 (1825 х/: 1,68) и РИД - 1:16-1:32 (23 */: 1,40). Комбинация подкожного и внутривенного пути иммунизации конъюгатом ЛПС с про-таминсульфатом позволила получить антисыворотки с титром антител в ИФА - 1:320000-1:1280000 (638968 х/. 1,92), в РПГА - 1:10240-1:20480 (16800 V: 1,20), в МРА- 1:1280-1:2560 (1800 */: 1,36), РИД - 1:32-1:64 (46 V: 1,36). При подкожном введении кроликам конъюгата использовался полный адъювант Фрейнда (ПАФ). Подкожное и внутривенное введение суспензии ЛПС в нормальной кроличьей сыворотке индуцировали титры сыворотки в ИФА - 1:320000-1:2860000 (932731х/- 1,9), МРА - 1:1601:320 (225 х/: 1,40), РИД - 1:16-1:32 (24 V: 1,1,27), активность в РПГА не регистрировалась. Последовательной иммунизацией живыми клетками вакцинного и вирулентного штаммов туляремийного микроба в ПАФ были получены сыворотки с титрами антител в ИФА — 1:160000—1:1280000 (477613 V- 2,46), РПГА- 1:10240-1:20480 (15150 х/.1,32), МРА - 1:1280— 1:2560 (1902 х/: 1,30), РИД - 1:16-1:32 (25 х/: 1,27).

При иммунизации животных-продуцентов препаратами МЭ вакцинного и вирулентного штаммов, водной фазы препарата МЭ вирулентного штамма, обработанного Тритоном Х-114, и формалинизиро-ванными клетками вакцинного штамма были получены сыворотки с титрами антител в РИД 1:32-1:128 (64 */: 1,44).

Антисыворотка против водной фазы препарата МЭ вирулентного штамма, в основном, содержала иммуноглобулины одной специфичности, присутствующие также и в коммерческой диагностической сыворотке (рис. 6).

Рис. 6. РИД водной фазы препарата МЭ вирулентного штамма, обработанного Тритоном Х-114.1, 2, 4, 5, 6 - препараты иммуноглобулинов из кроличьих гипериммунных сывороток, 3 - коммерческая лошадиная диагностическая сыворотка, 7 - препарат водной фазы МЭ вирулентного штамма.

Полученная антисыворотка, являющаяся фактически моновалентной, может представлять интерес для дальнейшего исследования антигенного состава туляремийного микроба. Препараты МЭ вакцинного и вирулентного штаммов, а также формалинизированные клетки вакцинного штамма по результатам иммуноблотинга и иммунодиффузии индуцировали формирование практически идентичного в качественном отношении спектра иммуноглобулинов против белков, входящих в состав экстрактов и инактивированных клеток (рис. 7).

Рис. 7. ДСН-ПАГЭ (7,5-15 %) и иммуноблотинг препарата МЭ вакцинного штамма туляремийного микроба. I-ДСН-ПАГЭ препарата МЭ. 1 -смесь маркеров №4 и 5 («Serva» Германия), 2 - препарат МЭ; 3 - иммуноблотинг с иммуноглобулинами против МЭ вакцинного штамма; 4 - иммуноблотинг с иммуноглобулинами против формалинизированных клеток вакцинного штамма; 5 - иммуноблотинг с иммуноглобулинами против препарата МЭ вирулентного штамма. II - профи-лограммы иммуноблотинга препарата МЭ вакцинного штамма с конъюгатами: 3 - против МЭ вакцинного штамма, 4 - против формалинизированных клеток вакцинного штамма; 5 - против препарата МЭ вирулентного штамма.

При этом выявлено отличие активности разных конъюгатов в отношении одних и тех же полипептидов (рис. 7, трек 3, 4), что отражает способность антигенных препаратов индуцировать синтез иммуноглобулинов одинаковой специфичности, но в различном количественном соотношении. На профилограммах иммуноблотинга кроме соответствующего полипептидного спектра (рис. 7.П 3Ь, 4Ь, 5Ь), отмечены участки высокомолекулярных зон (рис 7.Н За, 4а, 5а), не окрашивающиеся белковым красителем (рис. 7.1 трек 2). Это указывает на присутствие некоторого количества иммуноглобулинов против ЛПС туляремийного микроба (рис. 7.11).

ЛПС туляремийного микроба как наиболее иммунореактивный антиген, а также другие субклеточные фракции, содержащие его, были использованы для получения эритроцитарного антигенного диагностикума на основе формалинизированных бараньих эритроцитов. Проведен подбор условий сенсибилизации 2,5% эритроцитарной суспензии с антигенным материалом в концентрации от 0,25 до 400мкг/мл. Отмечена зависимость чувствительности получаемых диагностикумов в РПГА не только от удельного содержания ЛПС в используемых для сенсибилизации антигенных препаратах, но и от физического состояния ЛПС в процессе сенсибилизации носителя Так как в водных растворах ЛПС образуют мицеллы различной степени агрегации, при сенсибилизации эритроцитов в реакционную среду был введен детергент Тритон Х-114 (в конечной концентрации 0,005— 0,25 %). Это привело к резкому возрастанию чувствительности получаемых диагностических препаратов. Данный эффект можно объяснить увеличением удельной плотности антигенных эпитопов за счет более равномерного и экстенсивного распределения на поверхности эритроцитов гомогенизированной детергентом суспензии ЛПС. Однако чрезмерное увеличение удельной плотности антигенных эпитопов приводило к возникновению эффекта прозой при постановке РПГА в начальных разведениях туляре-мийной сыворотки и повышению титра перекрестной реакции с бруцеллезной диагностической сывороткой. Для снижения нежелательных явлений в РПГА при получении диагностикума в качестве сенситина был использован нефракционированный исходный препарат МЭ и уменьшено добавляемое в инкубационную среду количество детергента. Полученный указанным способом антигенный эритроцитарный диагностикум выявлял специфические антитела в коммерческой агглютинирующей сыворотке в разведении 1:327680 (296787 */. 1,10) и не взаимодействовал с гетерологич-ными сыворотками в разведении 1:20. Реакция в разведении 1:80 с бруцеллезной диагностической сывороткой не подтверждалась соответствующей реакцией торможения непрямой гемагглютинации. Чувствительность препарата в РНАт составила 1,5 х 105 м. к. вакцинного штамма туляремийного микроба. Полученный диагностикум сохранял рабочие свойства в течение месяца в виде суспензии при температуре хранении 4 °С.

В качестве экспрессного метода исследования растворимых и кор-. пускулярных антигенов туляремийного микроба и антител к ним разработана тест-система для дот-иммуноанализа на нитроцеллюлозных мембранах с использованием антигенов мочевинных экстрактов и антител против них. Маркерами иммунохимических реагентов служили частицы коллоидного серебра. В качестве физического проявителя при визуализации результатов реакции антиген-антитело использовали водный раствор лимонной кислоты (0,5 %), метола (0,2 %) и азотнокислого серебра (0,2 %). Визуализацию результатов реакции проводили погружением мембраны в раствор проявителя на 3—5 мин. Пробы, содержащие антигены франциселл или антитела против них, проявлялись в виде темно-серых пятен. В отрицательном контроле и при отсутствии антигенов возбудителя туляремии или антител к ним в испытуемом образце окрашивание не развивалось. Чувствительность данного варианта ДИА при определении водорастворимых антигенов туляремийного микроба составила > 10 нг/мл, корпускулярного антигена — > 3 х 104 м.к./мл. В сыворотках крови добровольцев специфичные антитела обнаруживались лишь у вакцинированных против туляремии лиц в титрах 1:400—1:3200, что превышало более чем в 10 раз титры антител в РПГА. При исследовании гете-рологичных сывороток перекрестные реакции регистрировались только с противобруцеллезной агглютинирующей сывороткой.

Подводя итог проведенным исследованиям, следует отметить, что полученные антигенные препараты туляремийного микроба, представляющие собой сложные по составу комплексы белков и Л ПС, в экспериментах проявляли активирующее, супрессирующее и костимулирующее действие на сенсибилизированные иммунокомпетентные клетки. Характер действия зависел от дозы антигенных препаратов. Наибольшей про-тективной активностью из изученных препаратов обладали клеточные оболочки туляремийного микроба. Особый интерес для изучения природы иммунитета при туляремии может представлять препарат ЛА, обладающий иммунохимической специфичностью и определенной протектив-ной активностью. Входящие в состав данного препарата гликопротеины, возможно, являются факторами вирулентности туляремийного микроба. В процессе работы модифицированы традиционные и предложены новые методы выделения и очистки ЛПС туляремийного микроба. Модифицирован колориметрический метод определения бактериальных ЛПС. ЛПС туляремийного микроба может быть рекомендован в качестве диагностического аллергена в реакции лейкоцитолиза и кожной пробе.

Предложены схемы гипериммунизации кроликов для получения сывороток пригодных для изучения антигенного состава туляремийного микроба и конструирования диагностических тест-систем, апробированных в лабораторных условиях. Разработан простой высокочувствительный вариант дот-иммуноанализа с использованием в качестве метки спе-

цифических реагентов частиц коллоидного серебра, не требующий дорогостоящего оборудования и реактивов. Разработана методика сенсибилизации формалинизированных эритроцитов, позволяющая получать высоко активные антигенные диагностикумы, не уступающие по своей чувствительности и специфичности отраслевому стандартному образцу.

ВЫВОДЫ

1. С использованием различных способов обеззараживания из клеток туляремийного микроба изолироЕано 17 антигенных препаратов, дана характеристика их химического состава, полипептидных и антигенных спектров, иммунобиологических и протективных свойств. Установлено, что наибольшей протективной активностью в опытах на лабораторных животных обладал препарат клеточных оболочек.

2. В экстрактах туляремийного микроба выявлены гликопротеи-ны, имеющие высокое сродство к КОР канавалину А.

3. Предложены новые методы выделения и очистки туляремийного липополисахарида с использованием неионных детергентов (Тритон Х-114, Твин80) и аффинной хроматографии на иммобилизованном полимиксине В.

4. Очищенные Л ПС туляремийнсго микроба не токсичны для белых мышей в дозе 25 мг, проявляют низкую активность в ЬЛЬ-тесте (20нг/мл), обладают метахроматическэй активностью, ярко выраженной молекулярной гетерогенностью и способностью взаимодействовать с липофильным антибиотиком полимиксином В.

5. На основе полученных данных усовершенствован колориметрический метод количественного определения содержания туляремий-ного ЛПС. Предлагаемая модификация наиболее приемлема для рутинной работы, позволяющая существенно сократить время, упростить процесс проведения количественного анализа ЛПС, повысить достоверность получаемых результатов. Чувствительность метода для ЛПС туляремийного микроба составляет 25,2 ±1,3 мкг/мл.

6. Разработаны схемы иммунизации кроликов с использованием живых клеток вакцинного и вирулентного штаммов, препаратов ЛПС и мочевинных экстрактов туляремийного микроба, позволяющие получать гипериммунные сыворотки, которые могут служить высококачественным сырьем, используемым в дальнейшем для изучения антигенного состава туляремийного микроба и получения различных диагностических препаратов.

7. На основе мочевинного экстракта получен антигенный эритро-цитарный диагностикум, который проявлял активность в РПГА с коммерческой туляремийной сывороткой до разведения 1:327680 (296787 х/. 1,10). В РНАт диагностикум позволяет определять до 1,5 х 105м.к./мл ту-ляремийного микроба.

8. Разработана тест-система для детекции в дот-иммуноанализе (ДИА) антигенов возбудителя туляремии и антител к ним с использованием в качестве метки специфических антител и антигенов частиц коллоидного серебра. ДИА пригоден для исследования на туляремию разнообразного экспериментального и клинического материала, ха-растеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, экспресс-ностью, простотой выполнения, демонстративностью результатов. При анализе водорастворимых антигенов чувствительность тест-системы составила > 10 нг/мл, корпускулярный антиген обнаруживали в концентрации > 3 х 104 м.к./мл. Чувствительность обнаружения специфических антител в сыворотках крови людей, вакцинированных против туляремии, превышала более чем в 10 раз титры антител в РПГА.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Использование иммобилизованного полимиксина В для очистки антигенов туляремийного микроба из водно-фенольного экстракта / Е.Ю. Марков, В.Б. Николаев, Л.П. Шишкина, Н.А Суханов // Иркут. науч.-исслед. противочумн. ин-т Сибири и ДВ МЗ СССР. - Иркутск, 1989. — 9 с. - Деп. в ВИНИТИ 28.07.89, № 4871 В-89.

2. Выделение и характеристика некоторых свойств липополисаха-ридного препарата туляремийного микроба / Е.Ю. Марков, Л.П. Шишкина, В.Б. Николаев, Н.А. Суханов // Актуал. пробл. профилакт. туляремии: Тез. докл. Всесоюз. конф. (15—17 окт. 1991, г. Симферополь). — М., 1991.-С. 199-200.

3. Способ очистки бактерийных липополисахаридов от примесей нуклеиновых кислот / Е.Ю. Марков, В.Б. Николаев, Т.Ю. Загоскина, А.Р. Рудых// Информ. бюл. Пробл. комиссии по эпидемиол. и микробиол. ООИ / Рос. НИПЧИ «Микроб». - Саратов, 1992. - С. 37.

4. Новый способ выделения и очистки липополисахарида из клеток туляремийного микроба / Е.Ю. Марков, В.Б. Николаев, Л.П. Шишкина, НА Суханов // Современные аспекты природн. очаговости, эпидемиол. и профилакт. особо опасн. инфекц. болезней: Тез. докл. науч. конф., Омск, октябрь, 1993 г. - Ставрополь, 1993. - С. 235-236.

5. Экспериментальное изучение иммуностимулирующих свойств наружных мембран холерного вибриона и белковолипополисахаридно-го комплекса туляремийного микроба при иммунизации животных антигенами возбудителя сибирской язвы / ГА Петров, Е.Ю. Марков, М.В. Безносов, Ю.И. Соркин, Л.Я. Урбанович, В.Б. Николаев // Современные аспекты природн. очаговости, эпидемиол. и профилакт. особо опасных инфекц. болезней: Тез. докл. науч. конф., Омск, октябрь, 1993 г. — Ставрополь, 1993. - С. 255-257.

6. Взаимодействие липополисахаридов возбудителей особо опасных инфекций с карбоцианиновым красителем / Е.Ю. Марков, А.Б. Че-

рнов, В. Б. Николаев и др. //Актуальные проблемы профилактики особо опасных и природно-очаговых инфекц. болезней: Тез. докл. научн. конф. - Иркутск, 1994. - С. 106-107.

7. Патент № 2051969 РФ, МКИ6 С 12 Р 19/04. Способ получения бактериальных липополисахаридов / Е.Ю. Марков, В.Б. Николаев; Ир-кут. науч.-исслед. противочумн. ин-т Сибири и ДВ РФ. - № 5057385/13; Заявл. 31.07.92; Опубл. 10.01.96, Бюл. № 1.

8. Разработка туляремийного эритроцитарного антигенного диаг-ностикума/ В.Б. Николаев, Е.Ю. Марков, Ю.В. Мирончук, Л.П. Шишкина // Природноочаг. болезни человека: Материалы юбил. науч.-практ. конф., посвящ. 75-летию НИИ природноочаговых инфекций. — Омск, 1996. — С.236-237.

9. Николаев В.Б. Особенности физико-химических и иммунобиологических свойств поверхностных антигенов ГганЫхеНа tularensis /В.Б. Николаев, Е.Ю. Марков, Ю.В. Мирончук // Сб. тез. докл., посвящ. 75-летию образования сан. службы в Иркутской обл. — Иркутск, 1997. — С. 137—138.

10. Приготовление туляремийного эритроцитарного диагностикума: Метод, рекомендации / В.Б. Николаев, Е.Ю. Марков, Ю.В. Мирончук, Л.П. Шишкина // Метод, документы и отчеты по сан.-эпид. охране РФ: Реферативный сборник. — Изд-во Саратовского ун-та, 1998. — 25 с.

11. Определение содержания Л ПС в различных антигенных препаратах холерного вибриона колориметрическим методом / Е.Ю. Марков, В.Б. Николаев, Л.Я. Урбанович и др. // Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов: Слово, 1999. - Вып. 79. - С. 89~95.

12. Использование специфических реагентов, меченых частицами коллоидного серебра, для обнаружения антигенов Francisella tularensis и антител к ним методом дот-иммуноанализа / В.Б. Николаев, Т.Ю. Загоскина, Е.Ю. Марков и др. // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане: Материалы междунар. науч.-практ. конф. «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы», посвящ. 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Таддыкурганской противочумной станции (Тадцыкурган, 1-2 августа 2001 г.). - Алматы, 2001. - Вып. 3. - С. 196-198.

13. Николаев В.Б. Выделение антигенов туляремийного микроба гли-копротеидной природы с использованием иммобилизованного конканава-лина А / В.Б. Николаев, Е.Ю. Марков // Сб. докл. юбил. науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию госсанэпид. службы России. — Улан-Удэ, 2002. — С. 93—95.

14. Николаев В.Б. Выделение гликопротеинов Francisella tularensis аффинной хроматографией на иммобилизованном конканавалине А / В.Б. Николаев, Е.Ю. Марков // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2002. -Т. 2, № 4. - С. 87-88.

15. Новые иммуноглобулиновые тест-системы для детекции возбудителей особо опасных инфекций / Т.Ю.Загоскина, Е.Ю.Марков, В.Б. Николаев, Е.П. Голубинский// Сб. науч. тр., посвящ. 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 2003 - С. 30-32.

16. Патент № 2203496 МПК7 G 01 N 33/53. Способ обнаружения антигенов туляремийного микроба / В.Б. Николаев, Т.Ю. Загоскина, Е.Ю. Марков и др. Иркутский науч.-исслед. противочумн. ин-т Сибири и ДВ МЗ РФ. - № 2001118472/14; Заявл. 4.07.01, Опубл. 27.04.03, Бюл. № 12.

17. Николаев В.Б. Характеристика иммунологических методов обнаружения антигенов Francisella tularensis и антител к ним / В.Б. Николаев // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2004. - Том 2, № 1. - С. 184-189.

18. Isolation and purification of bacterial lipopolysaccharides from cell free extracts by phase separation using Triton X-114 / E.Yu. Markov, V.B. Nikolaev, T.Yu. Zagoskina et al. //A Book ofAbstracts ofthe 2nd Conference of International Endotoxin Society, August 17-20,1992. - Vienna, Austria, 1992. - Abstr. Nr. 80001.

Подписано в печать08.04 2005. Бумага офсетная. Формат60x84^ Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0

_Тираж 100 экз Заказ № 064-05._

РИО НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon@rol ru)

19 MA:i 2CÍ5

к

Ч

i

л 1

2430

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Николаев, Валерий Борисович

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, Стр.

СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ, ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Молекулярно-иммунологические свойства поверхностных структур и антигенов Francisella tularensis.

1.2. Характеристика современных иммунологических методов обнаружения антигенов франциселл и антител к ним.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Микробиологические методы (штаммы, получение бактериальной массы).

2.2. Методы препаративной биохимии.

2.3. Иммунохимические и иммунологические методы.

2.3.1. Методы обнаружения антигенов в выделенных препаратах.

2.3.2. Получение экспериментальных гипериммунных кроличьих сывороток.

2.3.3. Твердофазный иммуноферментный метод (ИФА).

2.4. Иммунобиологические методы исследования.

2.4.1. Определение "острой" токсичности.

2.4.2. Определение аллергенных свойств.

2.4.3. Определение протективной активности.

2.5. Аналитические методы.

2.5.1. Электрофоретические методы.

2.5.2. Методы химического анализа.

2.6. Радиоизотопные методы.

2.6.1. Изучение перераспределения нуклеиновых кислот й ЛПС в двухфазной системе вода : детергент Тритон Х-114.

2.6.2. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

2.7. Статистическая обработка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА И ХАРАКТЕРИСТИКА ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.

ГЛАВА 4. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ОЧИСТКИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА ЛПС К ТтЛЛЕЖН.

4.1. Разработка новых способов выделения и очистки ЛПС.

4.2. Взаимодействие ЛПС туляремийного микроба с карбоцианиновым красителем и усовершенствование спектрофотометрического метода его определения.

ГЛАВА 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ.

5.1. Получение гипериммунных кроличьих сывороток против изолированных антигенов туляремийного микроба и оценка их пригодности для получения диагностических тест-систем.

5.2. Получение эритроцитарного туляремийного антигенного диагностикума.

5.3. Разработка дот-иммуноанализа с частицами коллоидного серебра для обнаружения антигенов ^ 1и1агет18 и антител к ним.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химические и иммунобиологические свойства антигенов туляремийного микроба"

Актуальность проблемы. Существование на территории Российской Федерации многочисленных стойких природных очагов туляремии определяет напряженность эпидемиологической обстановки в ряде административных территорий страны, где ежегодно регистрируются заболевания этой инфекцией [39]. Кроме того, возбудитель этой инфекции обладает рядом особенностей, обеспечивающих высокую возможность использования его в качестве потенциального средства биотерроризма [194, 237, 288]. В связи со сказанным остаются актуальными исследования, направленные на усовершенствование методов диагностики туляремии, конструирование новых диагностических тест-систем, обеспечивающих специфичность, достаточно высокую чувствительность и в то же время - технологичность изготовления, доступность ингредиентов, простоту постановки реакции, оперативность получения результатов и их информативность. Актуальным является и разработка новых эффективных и безопасных субъединичных вакцин, пригодных для специфической профилактики туляремии, поскольку живая вакцина не лишена недостатков [58, 114, 123, 280]. Это вызывает необходимость углубленного изучения иммунобиологических свойств антигенных структур и отдельных антигенов возбудителя туляремии Francisella tularensis.

Несмотря на большое внимание, уделяемое исследованиям механизмов патоген-ности и иммуногенности возбудителя туляремии, многие вопросы изучения антигенной структуры туляремийного микроба остаются до конца невыясненными. В частности предстоит еще решить, какие антигены, в каком виде и соотношении должны входить в состав эффективных молекулярных вакцин. Наибольший интерес в этом аспекте вызывают поверхностные структуры бактериальной клетки, которые выполняют важнейшие функции во взаимодействии с иммунной системой хозяина, определяя характер специфического и неспецифического иммунного ответа [10, 12, 37, 92, 168]. Поэтому не удивительно, что при поиске субстанций, перспективных для диагностики или создания химических вакцин против туляремии, искомыми зачастую оказываются биомолекулы поверхностных структур бактериальных клеток [3, 42, 46, 158, 190,212,257, 273].

Большие надежды возлагаются на использование изолированных липополисаха-ридов (ЛПС) и белков наружной мембраны (БНМ), как наиболее изученных поверхностных антигенов туляремии, для усовершенствования соответствующих профилактических [52] и диагностических препаратов [78, 290]. Важными моментами в этих исследованиях, безусловно, являются усовершенствование методов выделения, очистки, идентификации антигенов туляремийного микроба, позволяющих в максимальной степени сохранить их иммунохимическую специфичность и протективную активность. Особое внимание необходимо уделять подбору щадящих способов инактивации бактериальной массы с целью сохранения исходных свойств выделяемых антигенов, так как отмечено, что традиционные способы обеззараживания существенно влияют на их структуру и физико-химические свойства [22, 155, 242]. Все вышеизложенное определило цель и основные задачи настоящего исследования.

Цель работы - выделение и очистка антигенов возбудителя туляремии, характеристика их физико-химических, иммунобиологических свойств и оценка пригодности для конструирования диагностических и профилактических препаратов.

Основные задачи исследования. В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи диссертационной работы:

1. Получить экстракты антигенов, препараты клеточных стенок и ЛПС Р. ш1агет1з с использованием нетрадиционных методов инактивации микробной массы.

2. Разработать новые способы выделения и очистки ЛПС туляремийного микроба, используя липофильные свойства антибиотика полимиксина В и детергентов Тритона Х-114 и Твина 80.

3. Изучить физико-химические, иммунохимические и иммунобиологические свойства полученных антигенов туляремийного микроба.

4. Оценить пригодность выделенных антигенов для конструирования диагностических тест-систем на основе иммунных сывороток и конструирования антигенного эритроцитарного диагностикума.

Научная новизна. Показана возможность инактивации и одновременной экстракции антигенов возбудителя туляремии с помощью растворов мочевины и катион-ного детергента цетавлона. Разработаны новые методы получения высокоочищенного препарата ЛПС туляремийного микроба с использованием иммобилизованного поли-миксина В и неионных детергентов Твина 80 и Тритона Х-114. Новизна разработки подтверждена патентом (№ 2051969 РФ).

Получены новые данные о наличии в составе туляремийного микроба гликопро-теинов, углеводная часть которых обладает сродством к конканавалину А. С помощью аффинной хроматографии на Кон А-Сефарозе выделен препарат гликопротеинов туляремийного микроба, обладающий иммунохимической активностью с диагностической сывороткой. Дополнены новыми данными сведения о физико-химических свойствах ЛПС и белково-липополисахаридного комплекса туляремийного микроба: химическом составе, электрофоретических спектрах, метахроматическом эффекте, активности в тесте гелирования лизата амебоцитов Ыти1шро1уркетиз (ЬАЬ-тест), антигенных свойствах, протективной активности и токсичности. Разработан вариант дот-иммуноанализа для обнаружения антигенов туляремийного микроба и антител к ним с использованием в качестве метки иммунореагентов частиц коллоидного серебра (Пат. № 2203496 РФ).

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований позволяют глубже понять роль антигенов туляремийного микроба в формировании иммунитета и синтезе специфических антител. Теоретический аспект исследований представлен анализом возможных причин снижения иммуногенности антигенных структур бактериальных клеток при их изоляции и обоснованием важности способов обеззараживания бактерий в сохранении их протективной активности.

Наряду с теоретическим интересом изучение иммунохимических свойств клеточных стенок и ЛПС имеет важное практическое значение для разработки вопросов иммунодиагностики и профилактики туляремии.

Разработан и внедрен в практику комплекс методических приемов выделения, очистки, количественного анализа туляремийного ЛПС, получения диагностических сывороток и иммунохимических тест-систем. На основе экспериментальных данных составлены и одобрены решением Ученого совета Иркутского НИПЧИ "Методические рекомендации по очистке бактериальных ЛПС с использованием детергента Тритона Х-114" (утверждены Зам. пред. Госкомсанэпиднадзора РФ 17.03.96 г.), "Методические рекомендации по определению бактериальных липополисахаридов колориметрическим методом" (утверждены Первым зам. Министра здравоохранения РФ 3.02.97 г.), "Методические рекомендации по комплексному сероаллергическому исследованию на туляремию сыворотки крови человека и животных" (утверждены Первым зам. Министра здравоохранения РФ 17.03.97 г.), "Методические рекомендации по приготовлению туляремийного антигенного эритроцитарного диагностикума" (утверждены директором Иркутского НИПЧИ 8.03.97 г.), "Методические рекомендации по приготовлению тест-системы для обнаружения антигенов РгапсиеИа Ы1агет1$ на основе специфических антител, меченных коллоидным серебром" (утверждены зам. директора по научной работе Иркутского НИПЧИ 23.01.03 г.), получено два патента на изобретения "Способ получения бактериальных липополисахаридов" (Пат. №2051969 РФ) и "Способ обнаружения антигенов туляремийного микроба" (Пат. № 2203496 РФ).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Новые способы очистки туляремийного липополисахарида с использованием иммобилизованного полимиксина В, неионных детергентов Твина 80 и Тритона Х-114.

2. ЛПС туляремийного микроба при взаимодействии с карбоцианиновым красителем вызывает сдвиг максимума поглощения последнего в коротковолновую часть спектра (метахроматический эффект), что может быть использовано для количественного определения содержания ЛПС в различных антигенных препаратах.

3. Туляремийный микроб в своем составе содержит гликопротеиновый комплекс, у которого углеводная составляющая его компонентов обладает сродством к конкана-валину А.

4. Изготовление туляремийного антигенного эритроцитарного диагностикума с использованием неионного детергента Тритон Х-114 и вариант дот-иммуноанализа для обнаружения туляремийного микроба с использованием в качестве метки иммуноглобулинов частиц коллоидного серебра.

Апробация. Материалы диссертации были доложены и представлены на: Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы профилактики туляремии" (Симферополь, 1991); 2nd Conference of International Endotoxin Society (Vienna, Austria. 1992); научной конференции "Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней" (Омск, 1993); научно-практической конференции, посвященной 75-летию образования санитарной службы в Иркутской области (Иркутск, 1997), Международной научно-практической конференции "Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы", посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкурганской противочумной станции (Талдыкурган, 2001 г.) и на научных конференциях Иркутского НИИПЧИ (Иркутск, 1985-2003 гг.).

Материалы диссертации оформлены на основе 2 научных отчетов (1986-1996 гг.) по плановым темам НИР.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 16 печатных работах, 2 патентах на изобретения.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Текст работы изложен на 169 страницах машинописного текста, иллюстрирован 13 таблицами, 17 рисунками. Список цитированной литературы содержит 145 отечественных и 152 иностранных источника.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Николаев, Валерий Борисович

129 ВЫВОДЫ.

1. С использованием различных способов обеззараживания из клеток туляремийного микроба изолировано 17 антигенных препаратов, дана характеристика их химического состава, полипептидных и антигенных спектров, иммунобиологических и протективных свойств. Установлено, что наибольшей протективной активностью в опытах на лабораторных животных обладал препарат клеточных оболочек.

2. В экстрактах туляремийного микроба выявлены гликопротеины, имеющие высокое сродство к конканавалину А.

3. Предложены новые методы выделения и очистки туляремийного липополисаха-рида с использованием неионных детергентов (Тритон Х-114, Твин 80) и аффинной хроматографии на иммобилизованном полимиксине В.

4. Очищенные ЛПС туляремийного микроба не токсичны для белых мышей в дозе 25 мг, проявляют низкую активность в ЬАЬ-тесте (20 нг/мл), обладают метахромати-ческой активностью, ярко выраженной молекулярной гетерогенностью и способностью взаимодействовать с липофильным антибиотиком полимиксином В.

5. На основе полученных данных усовершенствован колориметрический метод количественного определения содержания туляремийного ЛПС. Предлагаемая модификация наиболее приемлема для рутинной работы, позволяющая существенно сократить время, упростить процесс проведения количественного анализа ЛПС, повысить достоверность получаемых результатов. Чувствительность метода для ЛПС туляремийного микроба составляет 25,2+1,3 мкг/мл.

6. Разработаны схемы иммунизации кроликов с использованием живых клеток вакцинного и вирулентного штаммов, препаратов ЛПС и мочевинных экстрактов туляремийного микроба, позволяющие получать гипериммунные сыворотки, которые могут служить высококачественным сырьем, используемым в дальнейшем для изучения антигенного состава туляремийного микроба и получения различных диагностических препаратов.

7. На основе мочевинного экстракта получен антигенный эритроцитарный диагно-стикум, который проявлял активность в РПГА с коммерческой туляремийной сывороткой вплоть до разведения 1:327680 (296787 7: 1,10). В РНАт диагностикум позволяет определять до 1,5-105 м. к./мл туляремийного микроба.

8. Разработана тест-система для детекции в дот-иммуноанализе (ДИА) антигенов возбудителя туляремии и антител к ним с использованием в качестве метки специфических антител и антигенов частиц коллоидного серебра. ДИА пригоден для исследования на туляремию разнообразного экспериментального и клинического материала, характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, экспрессностью, простотой выполнения, демонстративностью результатов. При анализе водорастворимых антигенов чувствительность тест-системы составила >10 нг/мл, корпускулярный антиген обнаруживали в концентрации >3-104 м.к./мл. Чувствительность обнаружения специфических антител в сыворотках крови людей, вакцинированных против туляремии, превышала более чем в 10 раз титры антител в РПГА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Свойства туляремийного микроба, обусловливающие его патогенность и имму-иогеиность, далеко не расшифрованы, однако, несомненно, они в той или иной мере связаны с особенностями их антигенной структуры и вытекающей отсюда способностью к воспроизводству факторов, обеспечивающих их специфическое взаимодействие с клетками и тканями макроорганизма. Особый интерес в этом плане вызывают поверхностные макромолекулы бактериальной клетки, характеризующиеся высокой индивидуальностью в следствии генетически закодированнной взаимосвязи их структуры и функции. В частности, ЛПС, являясь иммунодоминантным компонентом клеточной стенки туляремийного микроба [5, 162, 273], активен в различных серологических реакциях, благодаря чему он широко используется для конструирования диагностических тест-систем [4, 136, 137, 182, 290]. С клеточной поверхностью ассоциируются также протекгивные антигены, использование которых в качестве компонентов химической противотуляремийной вакцины [17, 24, 42, 60, 233, 264] может послужить альтернативой существующей в настоящее время вакцине из живых клеток.

В связи с важностью роли поверхностных и других субклеточных фракций туляремийного микроба в иммунологической перестройке макроорганизма, диагностике и профилактике туляремии очевидна необходимость дальнейшего углубленного изучения антигенного спектра франциселл, оптимизации методов получения и детектирования антигенов, всесторонней оценки возможности использования антигенных препаратов в различных иммунологических реакциях. Благодаря развитию методов микробиологии, препаративной биохимии, иммунологии и молекулярной биологии в настоящее время появилась возможность создания экспериментальных химических вакч цин для профилактики туляремии на основе очищенных протективных антигенов. За последние годы появилась серия работ по изучению свойств внешней мембраны туляремийного микроба и ее составляющих [17, 18, 24, 27, 42, 46, 52, 60, 62, 117], а также предложено конструирование химической вакцины против туляремии на основе ЛПС и белка наружной мембраны с мол. массой 17 Юа [42]. Однако прогресс в этом направлении сдерживается нерешенностью вопроса о природе протективных факторов возбудителя туляремии и о причинах снижения иммуногенных свойств убитых микробных клеток и изолированных протективных антигенов. Одной из причин недостаточной эффективности убитых цельноклеточных вакцин могут быть неадекватные условия культивирования и обеззараживания бактериальной массы, в результате чего изменяется качественный и количественный состав антигенов бактерий, изменяются их нативные свойства. Значительное влияние на сохранение иммуногенных свойств антигенов оказывают условия, способы экстракции и очистки. В большей степени это относится к мембранным антигенам, для извлечения которых используют детергенты, органические растворители, способные изменять нативную конфармацию антигенных детерминант биомолекул. Совсем не обязательно очищенные антигены, даже при условии сохранения иммуногенности, должны быть подобны по пространственной структуре биомолекулам, находящимся в живой бактериальной клетки. Кроме этого при экстракции и очистке антигенов происходит утрата иммуноадъю-вантных компонентов бактериальной клетки и, будучи очищенными, сами по себе они могут и не проявлять протекгивной активности. Примером может служить потеря протективных свойств ЛПС-белкового комплекса, когда иммунизация осуществлялась очищенными препаратами ЛПС и мембранным белком в отдельности [42].

Другая причина может заключаться в быстрой деградации и выведении из организма человека убитых микробных клеток и их отдельных антигенов или изменении их процессинга, тогда как живые микробные клетки способны персистировать в ИКК [174, 196, 266].

Несмотря на дискуссионность вопроса о природе протективных антигенов туляремийного микроба, к настоящему времени установлено, что существенная роль во взаимодействии микроорганизма с иммунной системой хозяина и формировании антибактериального иммунитета принадлежит поверхностным структурам и антигенам - компонентам клеточных стенок бактериальной клетки (ЛПС, белковолипополисаха-ридным комплексам, поверхностным белкам и белкам наружной мембраны). Поэтому работы по созданию новых и усовершенствованию существующих химических вакцин для профилактики особо опасных инфекционных заболеваний целесообразно начинать с замены целых убитых микробных клеток на их поверхностные структуры разной степени очистки (клеточные оболочки, клеточные стенки и наружные мембраны). Особое внимание при этом необходимо уделить подбору щадящих способов обеззараживания микробных клеток, наносящих минимальный урон иммуногенности их поверхностных структур и отдельных антигенов. Такие препараты могут оказаться в настоящее время более подходящими для внедрения в практику здравоохранения, нежели препараты молекулярных вакцин, учитывая сложность и дороговизну получения последних [69].

Цель настоящей работы заключалась в выделении и очистке антигенов возбудителя туляремии, характеристике их физико-химических, иммунобиологических свойств и оценке пригодности для конструирования диагностических и профилактических препаратов.

В процессе выполнения работы проведен поиск оптимальных методов выделения субклеточных фракций и отдельных антигенов, пригодных для конструирования диагностических и вакцинных препаратов. Разработана оригинальная методика выделения и очистки из бесклеточных экстрактов франциселл ЛПС методом фазового распределения с использованием неионного детергента Тритона Х-114. Метод отличается от традиционных способов простотой и экономичностью, позволяет работать с разбавленными растворами ЛПС за счет эффекта концентрирования последних в де-тергентной фазе. Усовершенствован спектрофотометрический метод определения бактериальных ЛПС с карбоцианиновым красителем "Stains all". Полученные результаты свидетельствуют о том, что ЛПС туляремийного микроба по аналогии с ЛПС многих других грамотрицательных бактерий вызывают спектральный сдвиг максимума поглощения карбоцианинового красителя в более коротковолновую часть спектра как в растворах очищенных ЛПС, так и в растворах ЛПС, содержащих примеси белка и нуклеиновых кислот (в умеренных количествах). Это позволяет рекомендовать указанную реакцию для количественного определения ЛПС на разных этапах их выделения и очистки при изготовлении диагностических или профилактических препаратов.

Проведена работа по оценке иммунологической активности полученных антигенных препаратов, выделенных из клеток возбудителей туляремии, в реакции бласт-ной трансформации сенсибилизированных лимфоцитов белых мышей и донора. Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что изолированные антигенные препараты кроме активирующего или супрессивного действия, обладают и костимулирующим эффектом воздействия на функциональную активность сенсибилизированных лимфоцитов. Это действие носит дозозависимый характер.

Проведено изучение физико-химических свойств и протективной активности полученных антигенов и субклеточных фракций франциселл в тестах защиты лабораторных животных. В целом, результаты проведенных работ свидетельствуют о высокой протективной активности клеточных оболочек туляремийного микроба и перспективности использования их для конструирования химической вакцины. Наиболее интересными антигенными фракциями в плане изучения природы протективных антигенов являются препарат ЛА и ПР, обладающие иммунохимической специфичностью и протективной активностью. Особенно интересна потенциальная роль глико-протеинов, входящих в состав препарата ЛА, в вирулентности туляремийного микроба и индукции протективного иммунитета, что может найти свое применение в разработке высокоиммуногенных препаратов для создания химической вакцины.

Изучена возможность получения кроличьей поливалентной антитуляремийной сыворотки с использованием как живых клеток, так и антигенных комплексов туляремийного микроба. Проведенные исследования показали, что наиболее перспективным в этом отношении является ЛПС, экстрагированный из туляремийного микроба неионным детергентом Твином 80 с последующей очисткой дифференциальным центрифугированием и гель-фильтрацией.

Для получения кроличьих гипериммунных сывороток предложены рациональные схемы иммунизации и способы повышения титра специфических иммуноглобулинов, изучена пригодность полученных антисывороток для получения иммуноглобулинов, пригодных для изучения антигенного состава туляремийного микроба и приготовления диагностических тест-систем.

Разработанные варианты дот-иммуноанализа, с использованием в качестве метки специфических реагентов частиц коллоидного серебра, несомненно, позволят улучшить качество лабораторной диагностики туляремии. Предложенные тест-системы обнаружения корпускулярных или растворимых антигенов туляремийного микроба и антител к ним просты, высокочувствительны и специфичны, экспрессны, не требуют дорогостоящего оборудования и реактивов.

Оценена пригодность полученных антигенов для изготовления эритроцитарного диагностикума, предложена схема сенсибилизации эритроцитов, позволяющая использовать для этих целей нефракционированные антигенные препараты, что снижает трудоемкость и расходы при получении диагностикума. По своим свойствам (активности, чувствительности, специфичности) диагностикум не уступает отраслевому стандартному образцу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Николаев, Валерий Борисович, Саратов

1. Адаме Г.А. Выделение липополисахаридов из грамотрицательных бактерий / Г.А. Адаме // Методы исследования углеводов: Пер. с англ. М.: Мир, 1975. - С. 126130.

2. Анализ белков наружной мембраны клеточных стенок Francisella / И.В. Родионова, В.И. Захаренко, И.С. Мещерякова // Актуал. пробл. профилактики туляремии: Тез. докл. Всесоюз. конф. (15-17 октября 1991 г., г. Симферополь). М., 1991. -С. 159-160.

3. Анисимов П.И. Молекулярные механизмы экологии Yersinia pestis / П.И. Ани-симов, Ю.А. Попов, A.M. Кокушкин // Журн. микробиол. 1999. - № 6. - С. 106-108.

4. Аронова Н.В. Использование препаратов липополисахарида Francisella tularensis в точечном твердофазном иммуноферментном анализе / Н.В. Аронова, Н.В. Павлович // Журн. микробиол. 2000. - № 5. - С. 75-78.

5. Аронова Н.В. Сравнительный анализ иммунного ответа кролика на антигены живых и убитых бактерий рода Francisella / Н.В. Аронова, Н.В. Павлович // Молекул, генетика. 2001. - № 2. - С. 26-30.

6. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев. Л.: Изд-во медицинской лит., 1962. - 180 с.

7. Белок A Staphylococcus aureus, меченный европием, как реагент для определения специфических антител / Т.В. Гузаева, A.M. Комаров, С.В. Юров и др. // Журн. микробиол. 1994. - № 4. - С. 59-63.

8. Биохимические аспекты патогенности возбудителя чумы / А.В. Наумов, И.А. Кузьмиченко, Т.М. Тараненко и др. // Мед. паразитол. и паразит, болезни. 1995. - № 4. - С. 17-22.

9. Бобкова Е.Д. Применение лимулюс амебоцитного лизата (JIAJI-тест) для обнаружения эндотоксина в субстратах от больных инфекционными болезнями / Е.Д. Бобкова, Н.Б. Шалыгина // Журн. микробиол. 1988. - № 10. - С. 84-90.

10. Бондаренко В. М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса / В. М. Бондаренко // Журн. микробиол. 1999. - № 5. - С. 3439.

11. Брикман Д.И. Быстрая идентификация туляремийных культур при помощи пробы с Твином-80 / Д.И. Брикман // Журн. микробиол. 1968. - № 7. - С. 118-121.

12. Брикман Д.И. Чувствительность различных рас туляремийного микроба к эритромицину, олеандомицину и полимиксину / Д.И. Брикман, О.Д. Захлебная // Антибиотики. 1976. - Т. 21, № 2. - С. 134-136.

13. Видо- и родоспецифические антигенные эпитопы липополисахаридов Francisella tularensis / Н.В. Павлович, Н.В. Аронова, Н.Н. Оноприенко и др. // Молекул. генетика. 2000. - № 3. - С. 7-12.

14. Влияние антигенных фракций внешней мембраны Francisella tularensis на некоторые показатели Т-клеточного звена иммунитета / Д.В. Скатов, В.Г. Галактионов, JI.H. Сеенкова, B.C. Хлебников // Журн. микробиол. 1994. - № 3. - С. 100-103.

15. Влияние антигенных фракций внешней мембраны Francisella tularensis на функциональную активность макрофагов / Д.В. Скатов, В.С Хлебников. Р.Н. Василенко и др. // Журн. микробиол. 1993. - № 4. - С. 87-91.

16. Влияние детергентов на иммуногенную активность антигенов Neisseria meningitidis серогруппы В / JI.B. Бугаев, Е.А. Шкурина, В.И. Карабак и др. // Журн. микробиол. 1993. - № 2. - С. 11-15.

17. Влияние рекомбинантного фактора некроза опухоли на антителогенез у мышей, иммунизированных препаратом внешних мембран Francisella tularensis / С.В. Юров, С.Ю. Пчелинцев, Л.А. Денисов и др. // Журн. микробиол. 1995. - № 2. - С. 6467.

18. Выделение и характеристика иммуноглобулинов, антител и их полипептидных цепей / Ж.-К. Жатон, Д.Ч. Брандт, П. Вассали // Методы исследований в иммунологии: Пер. с англ. / Под ред. И Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир, 1981. - С. 58-82.

19. Высокочувствительный, гомогенный метод определения антител и антигенов с помощью липосом, моноклональных антител и комплемента / С.Н. Скопинская, Я.А. Тамулевич, С.П. Ярков и др. // Журн. микробиол. 1993. - № 1. - С. 77-82.

20. Галактионов В.Г. Графические модели в иммунологии / В.Г. Галактионов. -М.: Медицина, 1986. 240 с.

21. Герасимов В.Н. Дополнительные данные о морфологии и тонкой структуре бактерий рода Francisella / В.Н. Герасимов, В.Ю. Долотов // Актуал. пробл. профилактики туляремии: Тез. докл. Всесоюз. конф. (15-17 октября 1991 г., г. Симферополь).-М., 1991.-С. 37.

22. Гонтарь И.П. Антигенная общность возбудителей чумы, холеры, псевдотуберкулеза, туляремии, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза / И.П. Гонтарь, В.И. Ефременко,

23. С.М. Фарбер // Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры: Тез. докл. Все-союз. конф. Саратов, 1980. - С. 27-28.

24. Дельвиг A.A. Возможности использования кальций-зависимых лектиновых рецепторов антиген-презентирующих клеток для создания иммунотерапевтических препаратов / A.A. Дельвиг, Б.Ф. Семенов // Журна. микробиол. 2004. - № 1. - С. 7984.

25. Дженсен У. Ботаническая гистохимия: Пер. с англ. / У. Дженсен. М.: Мир, 1965.- 377 с.

26. Дише 3. Цветные реакции углеводов / 3. Дише // Методы химии углеводов: Пер. с англ. / Под ред. Н.К. Кочеткова. М.: Мир, 1967. - С. 20-24.

27. Дыкман JI.A. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа / Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев // Биохимия. 1997. - Т.62, вып. 4. - С. 411-418.

28. Дыкман Л.А. Применение дот-иммуноанализа и иммунозолотых маркеров для экспресс-диагностики острых кишечных инфекций / Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев // Журн. микробиол. 1999. - № 4. - С. 93-94.

29. Дэвени Т. Аминокислоты, пептиды и белки: Пер. с анг. / Т. Дэвени, Я. Гер-гей. М.: Мир, 1976.-364 с.

30. Егорова Т.П. Применение колориметрического определения липополисаха-рида в иммунологических исследованиях / Т.П. Егорова, Е.П. Глебовская, В.И. Ле-венсон // Иммунология. 1988. - № 4. - С. 79-82.

31. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул / Ю.В. Езепчук. М.: Медицина, 1985. - 240 с.

32. Жарникова И.В. Разработка суспензионного диагностикума для выявления возбудителя туляремии / И.В. Жарникова // Журн. микробиол. 2004. - № 1. - С. 6769.

33. Заболеваемость зооантропонозными и природноочаговыми инфекциями и меры по их профилактике / Г.Г. Онищенко, A.A. Монисов, Л.П. Гульченко, Ю.М. Федоров // Журн. микробиол. 1999. - № 4. - С. 14-18.

34. Захарова И.Я. Методы изучения микробных полисахаридов / И.Я. Захарова, Л.В. Косенко. Киев: Наукова Думка, 1982. - 183 с.

35. Защитные свойства внешних мембран Francisella tularensis при экспериментальной инфекции морских свинок /B.C. Хлебников, И.Р. Головлев, A.M. Чугунов и др. // Журн. микробиол. 1994. - № 1. - С. 84-88.

36. Изучение биохимических, антигенных и протективных свойств внешней мембраны возбудителя туляремии / B.C. Хлебников, И.Р. Головлев, Д.П. Кулевацкий и др. // Молекул, генетика. 1991. - № 7. - С. 15-20.

37. Изучение процесса иммунизации при туляремии. 2. Ультраструктура Т -лимфоцитов после прививки живой туляремийной вакциной / Н. Кулеков, Н. Шейков, Р. Маркова и др. // Воен.-мед. дело. 1989. - Т. 43, № 2. - С. 40-45.

38. Иммунологическая эффективность внешних мембран Francisella tularensis для обезьян-гамадрил / B.C. Хлебников, И.Р. Головлев, В.Е. Жемчугов и др. // Журн. микробиол. 1994. - № 3. - С.61-63

39. Использование иммуноферментного метода ELISA для выявления возбудителя туляремии / И.С. Мещерякова, Н.С. Умнова, K.JI. Шаханина, И.П. Павлова // Журн. микробиол. 1988. - № 11. - С. 109-112.

40. Использование микроточечного иммуноферментного анализа с визуальной индикацией для определения туляремийных антител / С.В. Юров, С.Ю. Пчелинцев, С.С. Афанасьев и др. // Журн. микробиол. 1991. - № 3. - С. 61-64.

41. Использование твердофазного липосомального иммуноанализа для определения бактериального антигена липополисахаридной природы / С.И. Третьяков, С.П. Ярков, В.Н. Злобин, Ю.Т. Калинин // Журн. микробиол. 1992. - № 11-12. - С. 43-45.

42. Исследование ЛПС-белкового комплекса из внешней мембраны Francisella tularensis / B.C. Хлебников, Д.П. Кулевацкий, И.Р. Головлев и др. // Журн. микробиол. 1992. - № 3. - С. 13-17.

43. Канатов Ю.В. Серологическая диагностика особо опасных инфекционных заболеваний / Ю.В. Канатов // 70 лет Моисею Иосифовичу Леви: Науч. тр., посвящ. юбиляру / Под ред. В.П. Ипатова, Е.Н. Богдановой. М., 1997. - С. 56-63.

44. Каральник Б.В. Эритроцитарные реагенты в клинической иммунологии / Б.В. Каральник // Иммунология. 1995. - № 5. - С. 4-6.

45. Козловский В.Н. Живые туляремийная и бруцеллезная вакцины, как индукторы иммунопатологических реакций: Автореф. дис. . д-ра мед. наук: 03.00.07, 14.00.36 / В.Н. Козловский; Рос. науч.-исслед. противочум. ин-т "Микроб". Саратов, 1997. - 37 с.

46. Коллинз У.П. Новые методы иммуноанализа. Пер. с англ. М.: Мир, 1991. -279 с.

47. Кулевацкий Д.П. Липополисахаридобелковые комплексы внешней мембраны возбудителя туляремии: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.04 / Д.П. Кулевацкий; Рос. науч.-исслед. противочум. ин-т "Микроб". Саратов, 1994. - 20 с.

48. Ларионова Л.В. Поиск и выделение антифагоцитарного фактора РгапызеИа Ш1агепш / Л.В. Ларионова // Журн. микробиол. 1994. - № 3. - С. 26-28.

49. Ларионова Л.В. Поиск протективных антигенов возбудителя туляремии / Л.В. Ларионова, Е.П. Дорошенко, Л.А. Прозорова // Актуал. пробл. профилактики туляремии: Тез. докл. Всесоюз. конф. (15-17 октября 1991 г., г. Симферополь). М., 1991.-С. 102-103.

50. Ларионова Л.В. Поиск цитотоксинов среди белков туляремийного микроба / Л.В. Ларионова, ЕА. Дашевская, Е.П. Дорошенко // Бактериальные токсины: Тез. докл 2-ой Всесоюз. конф. (27-30 ноября 1989 г.) Юрмала, 1989. - С. 63.

51. Луппа X. Основы гистохимии / X. Луппа. М.: Мир, 1980. - 343 с.

52. Ляшенко В.А. Макрофаги в инфекционном процессе / В.А. Ляшенко // Иммунология. 1995. - № 4. - С. 48-52.

53. Марков Е.Ю. Поверхностные структуры и антигены холерного вибриона, бруцелл и туляремийного микроба: Автореф. дис. . д-ра биол. наук: 03.00.07 / Е.Ю. Марков; Рос. науч.-иссл. противоч. ин-т "Микроб". Иркутск, 2000. - 39 с.

54. Марков Е.Ю. Современные подходы к усилению иммунного ответа при конструировании химических вакцин / Е.Ю. Марков; Иркутский науч.-исслед. противо-чум. ин-т Сибири и Дальнего Востока МЗ РФ. Иркутск, 1999. - 43 с. - Деп. в ВИНИТИ 10.09.99; № 2827-В99.

55. Маслова H.H. Иммуномодулирующие и антитоксические свойства препаратов липополисахаридов представителей рода Francisella / H.H. Маслова, Н.В. Павлович // Журн. микробиол. 1999. - № 4. - С. 50 - 53.

56. Межин А.П. Очистка ЛПС холерного вибриона с помощью аффинной хроматографии на полимиксин В-сефарозе 4В / А.П. Межин, Е.Ю. Марков // Конференция молодых ученых ИГУ: Тез. докл. Иркутск, 1985. - С. 105.

57. Методические рекомендации по обнаружению туляремийного микроба им-муноферментным методом / С.П. Меринов, Т.Ю. Загоскина, Е.П. Голубинский, JI.B. Меринова; Иркутский науч.-исслед. противочум. ин-т Сибири и Дальнего Востока МЗ СССР. Иркутск, 1983. - 7 с.

58. Мещерякова И.С. Антигены туляремийного микроба и их применение в реакции пассивной гемагглютинации: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.07 / И.С. Мещерякова; Науч.-исслед. ин-т эпидемиол. и микробиол. им. Н.Ф. Гамалеи. М., 1968 - 27 с.

59. Мещерякова И.С. Таксономия, идентификация и иммунологическая диагностика возбудителя туляремии: Автореф. дис. . д-ра биол. наук: 03.00.07 / И.С. Мещерякова; Науч.-исслед. ин-т эпидемиол. и микробиол. им. Н.Ф. Гамалеи. М., 1990. -47 с.

60. Михеева М.Н. Применение карбоцианиновых красителей в анализе бактериальных липополисахаридов (эндотоксинов). II. Липополисахарид Salmonella typhi / М.Н. Михеева, Л.И. Брутко // Химия природн. соед. 1987. - № 6. - С. 790-792.

61. Морфология, ультраструктура и популяционные особенности бактерий рода Francisella / В.Н. Герасимов, В.Ю. Долотов, A.B. Степанов, H.H. Ураков // Вестник Российской Академии наук. 1997. - № 6. - С. 24-30.

62. Навашин С.М. Рациональная антибиотикотерапия (справочник) / С.М. На-вашин, И.П. Фомина. 4-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982. - 496 с.

63. Новиков Д.К. Клеточные методы иммунодиагностики / Д.К. Новиков, В.И. Новикова. Минск: Беларусь, 1979. - 224 с.

64. Об усилении мероприятий по профилактике туляремии: Приказ МЗ Российской Федерации № 125 от 14 апреля 1999 г.

65. Обнаружение возбудителя туляремии у больных с помощью реакции имму-нофлуоресценции / Е.В. Ананова, JI.C. Каменова, И.С. Мещерякова, P.A. Савельева // Журн. микробиол. 1989. - № 4. - С. 46-49.

66. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии / Н.Г. Олсуфьев. М.: Медицина, 1975. - 192 с.

67. Оноприенко H.H. Сравнительная характеристика липополисахаридов бактерий рода Francisella: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.07 / H.H. Оноприенко; Рост, науч.-исслед. противочум. ин-т. Ростов н/Д, 2001. - 23 с.

68. Определение антигенной детерминанты превентивных моноклональных антител, специфичных к липополисахариду Francisella tularensis / B.C. Хлебников, И.Р. Головлев, Н.В. Тохтамышева и др. // Журн. микробиол. 1993. - № 1. - С. 83-88.

69. Определение продолжительности поствакцинального иммунитета против туляремии / P.A. Савельева, Е.В. Ананова, A.B. Пронин и др. // Журн. микробиол. -1995.-№6.-С. 51-52.

70. Особенности антительного ответа у животных, иммунизированных компонентами поверхностных структур Francisella tularensis / C.B. Юров, С.Ю. Пчелинцев, С.С. Афанасьев и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1991. - № 8. -С. 54-58.

71. Остерман JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / JI.A. Остерман; Отв. ред. Г.П. Георгиев. М.: Наука, 1983. - 304 с.

72. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) / JI.A. Остерман. М.: Наука, 1981.-288 с.

73. Павлович Н.В. Биологические свойства и факторы патогенности F. tularensis: Автореф. дис. . д-ра мед. наук: 03.00.07 / Н.В. Павлович; Рос. науч.-исслед. противочум. ин-т "Микроб". Саратов, 1993. - 37 с.

74. Павлович Н.В. Устойчивость Francisella tularensis к бактерицидному действию нормальной сыворотки как критерий оценки вирулентности бактерий / Н.В. Павлович, В.М. Сорокин, Н.С. Благородова // Журн. микробиол. 1996. - № 1. - С. 7-10.

75. Парнас Ю. Антигенные и иммунологические взаимоотношения между бру-целлами и возбудителями туляремии / Ю. Парнас // Журн. микробиол. 1967. - № 5. -. С. 60-62.

76. Петров Р.В. Искусственные антигены и вакцины / Р.В. Петров, P.M. Хаитов. М.: Медицина, 1988. - 288 с.

77. Петровская В.Г. Общие принципы генетического контроля патогенности бактерий / В.Г. Петровская, В.М. Бондаренко // Журн. микробиол. 1994. - № 3. - С. 106-110.

78. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная: Пер. с англ. / Э. Пирс. М.: Изд-во иностр. лит., 1962. - 962 с.

79. Полтавченко А.Г. Перспективы использования коллоидного серебра как маркера в иммуноанализе / А.Г. Полтавченко, Д.А. Полтавченко, Т.Ю. Загоскина // Сибирь-Восток. 2002. - Вып. 3, № 51. - С. 10-12.

80. Полтавченко А.Г. Проявление золей серебра в микротитровальных планшетах / А.Г. Полтавченко, Д.А. Полтавченко, Т.Ю. Загоскина // Сибирь-Восток. 2002. -Вып. 9, № 57. - С. 7-9.

81. Полунина Т.А. Разработка дот-иммуноферментного анализа для обнаружения клеток возбудителя особо опасных инфекций: Автореф. канд. .мед. наук: 03.00.07 / Т.А. Полунина; Всесоюз. науч.-исслед. противочум. ин-т "Микроб". Саратов, 1990. - 19 с.

82. Получение серебряных золей маркеров для иммуноанализа / А.Г. Полтавченко, Ф.В. Тузиков, Д.А. Полтавченко, Т.Ю. Загоскина // Сибирь-Восток. - 2002. -Вып. 4, №52.-С. 18-20.

83. Превентивная активность моноклональных антител, специфичных к липо-полисахариду Francisella tularensis / B.C. Хлебников, С.С. Ветчинин, Г.К. Гречко и др. // Журн. микробиол. 1992. - № 9 - 10. - С. 67-70.

84. Применение реакции агглютинации латекса для выявления туляремийного микроба / М.П. Рудник, A.A. Вейде, Ю.В. Лукин и др. // Актуал. пробл. профилактики туляремии: Тез. докл. Всесоюз. конф. (15-17 октября 1991 г., г. Симферополь). М., 1991.-С. 163-164.

85. Работнова И.Л. Хемостатное культивирование и ингибирование микроорганизмов / И.Л. Работнова, И.Н. Позмогова. М.: Наука, 1979. - 208 с.

86. Реакция непрямого лейкоцитолиза при туляремии / H.A. Суханов, Л.В. Ме-ринова, Ю.В. Мирончук и др. // Журн. микробиол. 1989. - № 4. - С. 103-104.

87. Родионова И.В. Анализ спектров общих белков у Francisella / И.В. Родионова, Г.В. Бруханский // Журн. микробиол. 1990. - № 2. - С. 107-108.

88. Родионова И.В. Антигенный состав белков наружной мембраны туляремийного микроба / И.В. Родионова, В.И. Захаренко // Молекул, генетика. 1990. - № 11 - С. 16-18.

89. Родионова И.В. Наружные мембраны туляремийного микроба и их белковый состав /И.В. Родионова, Н.Д. Константинова, Г.В. Бруханский // Молекул, генетика. 1989. - С. 22-25.

90. Родионова И.В. Сравнительный анализ белковых антигенов Francisella / И.В. Родионова, И.С. Мещерякова, М.И. Кормилицына // Молекул, генетика. 1997. -№ 3. - С. 11-15.

91. Салтыков P.A. Стабилизация иммуногенных свойств вакцинных штаммов бактерий / P.A. Салтыков // Журн. микробиол. 1976. - № 8. - С. 3-9.

92. Сивкова О.В. Коагглютинирующий диагностикум для идентификации возбудителя туляремии / О.В. Сивкова // Лаб. дело. 1988. - № 10. - С. 64-65.

93. Солгобилизация и реконструкция мембранных белков / О.Т. Джонс, Ю.П. Эрнест, М. Дж. Мак-Нэми // Биологические мембраны. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж.Б. Финдлея, У.Г. Эванза. М.: Мир, 1990. - С. 196-250.

94. Спирин A.C. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот / A.C. Спирин // Биохимия. 1958. - Т. 23, вып. 5. - С. 656-662.

95. Способность авирулентных форм Francisella tularensis к диссеминации и пролиферации в организме хозяина / М.В. Цимбалистова, Н.В. Павлович, В.М. Сорокин, Н.К. Тынкевич // Журн. микробиол. 1996. - № 2. - С. 10-13.

96. Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов / Под ред. С.Г. Дзагурова, Ф.Ф. Резепова. М.: Медицина, 1975. - 223 с.

97. Сравнительная характеристика капсульного вещества и липополисахарида Francisella tularensis / В.М. Сорокин, Н.В. Павлович, М.В. Цимбалистова, Л.А. Прозорова // Журн. микробиол. 1996. - № 6. - С. 62-63.

98. Супотницкий М.В. Протективные свойства порообразующих белков патогенных бактерий / М.В. Супотницкий // Вестн. РАМН. 1996. - № 8. - С. 18-22.

99. Суханов H.A. Реакция лейкоцитолиза и тест повреждения нейтрофилов как методы выявления аллергии к туляремийному микробу / H.A. Суханов, И.И. Осипенко, Д.И. Брикман // Журн. микробиол. 1981. - № 5. - С. 110.

100. Сухарь В.В. Гликолипидный состав штаммов Francisella tularensis различной степени аттенуации / В.В. Сухарь // Микробиол. журн. 1993. - Т. 55, № 1. -С. 812.

101. Сухарь В.В. Гликолипиды возбудителя туляремии / В.В. Сухарь // Журн. микробиол. 1991. - № 10. - С. 14-16.

102. Сухарь В.В. С-антиген туляремийного микроба / В.В. Сухарь, B.C. Уралева // Микробиол. журн. 1992. - Т. 54, № 2. - С. 42-46.

103. Сухарь В.В. Химическая и биологическая характеристика антигенов туляремийного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук: 03.00.04 / В.В. Сухарь; Рост, мед. ин-т. Ростов н/Д, 1988. - 24 с.

104. Твердофазный иммуноанализ с использованием коллоидного золота в серо-типировании азоспирилл / В.А. Богатырев, Л.А Дыкман, Л.Ю. Матора, Б.И. Шварц-бурд // Микробиол. 1991. - Т. 60. - С. 524-529.

105. Туляремия / Б.Н. Мишанькин, Н.В. Павлович, Л.В. Романова и др. // Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Саратов, 1998.-Т. 1.-С. 111-143.

106. Умнова Н.С. Разработка иммуноферментных тест-систем для диагностики туляремии и бруцеллеза: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 14.00.36 / Н.С. Умнова; АМН СССР науч.-исслед. ин-т эпидемиол. и микробиол. им. Н. Ф. Гамалеи. М., 1988.-22 с.

107. Файбич М.М. Туляремийная сухая живая вакцина НИИЭГ Красной Армии / М.М. Файбич, Т.С. Тамарина // Журн. микробиол. 1946. - № 7. - С. 59-63.

108. Финдлей Дж.Б. Выделение и модификация мембранных белков и пептидов / Дж.Б. Финдлей // Биологические мембраны. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж.Б. Финдлея, У.Г. Эванза. М.: Мир, 1990. - С. 251-307.

109. Франек И. Использование флуоресцирующих антител для ускоренной диагностики инфекций вызываемых В. апЖгаЫз и Р. Ш1агет1з / И. Франек // Журн. гиг. эпидемиол. микробиол. и иммунология. 1965. - № 9. - С. 144.

110. Хансон Р. Химический состав бактериальной клетки / Р. Хансон, Дж. Фил-липс // Методы общей бактериологии: Пер. с англ. / Под ред. Ф. Герхардта и др. М.: Мир, 1984. - Т. 2. - С. 283-373.

111. Характеристика биологических свойств бескапсульных вариантов Francisella tularensis / Н.В. Павлович, Б. Н. Мишанышн, Н.Я. Шиманюк и др. // Журн. микробиол. 1993. - № 3. - С. 21-26.

112. Характеристика структуры и антигенной активности препаратов липополи-сахаридов различных представителей рода Francisella / Н.Н. Маслова, Н.В. Павлович, В.М. Сорокин, В.А. Зурабян // Молекул, генетика. 1998. - № 3. - С. 26-29.

113. Ярилин A.JI. Апоптоз и его место в иммунном процессе / A.JI. Ярилин // Иммунология. 1996. - № 4. - С. 10-23.

114. Яровая JI.M. Новые данные о химической структуре ЛПС и практические перспективы / Л.М. Яровая, В.А. Алешкин // Журн. микробиол. 1991. - № 3. - С. 7378.

115. A new and improved microassay to determine 2-keto-3-deoxyoctonate in lipo-polysaccharides of gram-negative bacteria / Y.D. Karkhanis, J.J. Zeltner, J.J. Jackson, D.J. Carlo // Anal. Biochem. 1978. - Vol. 85. - P. 595-601.

116. Activation of the innate immune system by CpG oligodeoxynucleotides: immu-noprotective activity and safety / D.M. Klinman, S. Kamstrup, D. Verthelyi et al. // Springer Semin. Immunopathol. 2000. - Vol. 22, No. 1-2. - P. 173-183.

117. Adjuvanticity of ISCOMs incorporating a T cell-reactive lipoprotein of the facultative intracellular pathogen Francisella tularensis / I. Golovliov, M. Ericsson, L. Aker-blom et al. // Vaccine. 1995. - Vol. 13, No. 3. - P. 261-267.

118. Affinity chromatography: principles and methods. Uppsala: Rahms i Lund, 1979. -71 p.

119. Agglutination and ELISA methods in the diagnosis of tularemia in different clinical forms and severities of the disease / H. Syrjala, P. Koskela, T. Ripatti et al. // J. Inf. Dis. 1986. - Vol. 153, No. 1. - P. 142-146.

120. Aida Y. Removal of endotoxin from protein solutions by phase separation using Triton X-l 14 / Y. Aida, M.J. Pabst // J. Immunol. Meth. 1990. - Vol. 132, No. 2. - P. 191192.

121. Alurkar V. Immunomodulatory properties of porins of some members of the family Enterobacteriaceae / V. Alurkar, R. Kamat // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65, No. 6. - P. 2382-2388.

122. Anderson R. Fatty acid distribution in the phospholipids of Francisella tularensis / R. Anderson, A.R. Bhatti // Lipids. 1986. - Vol. 21, No. 10. - P. 669-671.

123. Anthony L.S.D., Kongshavn P.A.L. Experimental murine tularemia caused by Francisella tularensis, live vaccine strain: a model of acquired cellular resistance / L.S.D. Anthony, P.A.L. Kongshavn // Microbial. Pathogen. 1987. - Vol. 2, No. 1. - P. 3-14.

124. Antigen from Francisella tularensis: nonidentity between determinants participating in cell-mediating and humoral reactions / G. Sandstrom, A. Tarnvik, H. Wolf-Watz, S. Lofgren // Infect. Immun. 1984. - Vol. 45, No. 1. - P. 101-106.

125. Bacterial cell wall components as immunomodulators. I. Lipopeptides as adjuvants for parenteral and oral immunization / W.G. Bessler, L. Heinevetter, K.H. Wiesmuller et al. // Int. J. Immunopharmacol. 1997. - Vol. 19. - P. 547-550.

126. Bacterial DNA containing CpG motifs stimulates lymphocyte-dependent protection of mice against lethal infection with intracellular bacteria / K.L. Elkins, T.R. Rhinehart-Jones, S. Stibitz et al. // J. Immunol. 1999. - Vol. 162, No. 4. - P. 2291-2298.

127. Bacterial ghosts as multifunctional vaccine particles / M.P. Szostak, H. Mader, M. Truppe et al. // Behring Inst. Mitt. 1997. - Vol. 98. - P. 191-196.

128. Bacterial ghosts: non-living candidate vaccines / M.P. Szostak, A. Hensel, F.O. Eko et al. // J. Biotechnol. 1996. - Vol. 44. - P. 161-170.

129. Benz R. Structure and function of porins from Gram-negative bacteria / R. Benz // Ann. Rev. Microbiol. 1988. - Vol. 42. - P. 359-393.

130. Bevanger L. Comparative analysis of antibodies to Francisella tularensis antigens during the acute phase of tularemia and eight years later / L. Bevanger, J.A. Maeland, A.I. Kvan // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1994. - Vol. 1, No. 2. - P. 238-240.

131. Beveridge TJ. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles / T.J. Beveridge // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 161, No. 16. - P. 4725-4733.

132. Bhatnagar N.B. Heat stress alters the of a rifampin-resistant of Francisella tularensis LVS / N.B. Bhatnagar, K.L. Elkins, A.H. Fortier // Infect. Immun. 1995. -Vol. 63, No. l.-P. 154-159.

133. Bordier C. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-l 14 solution / C. Bordier // J. Biol. Chem. 1981. - Vol. 256, No. 4. - P. 1604-1607.

134. Brade H. Structure-activity relationships of bacterial lipopolysaccharides (endotoxins). Current and future aspects / H. Brade, L. Brade, E.Th. Rietschel // Zbl. Bakt. Hyg. A. 1988.-Vol. 268.-P. 151-179.

135. Brown R.W. Surface antigens in vivo: a mirror for vaccine development / R.W. Brown, H. Anwar, J.W. Costerton // Can. J. Microbiol. 1988. - Vol. 34. - P. 494-496.

136. Characteristics and evaluation of antibody-horseradish peroxidase conjugates prepared by using a maleimide compound glutaraldehyde andperiodate / M. Imagawa, S. Joshiake, J. Hamaguchi et al. // J. Appl. Biochem. 1982. - Vol. 4. - P. 41-57.

137. Colorimetric method for determination of sugars and related substances / W. Dubois, K.A. Gilles, J.K. Hamilton et al. // Anal. Chem. 1956. - Vol. 28, No. 3. - P. 350-356.

138. Conlan W. Vaccines against Francisella tularensis past, present and future / W. Conlan // Expert Rev. Vaccines. - 2004. - Vol. 3, No. 3. - P. 307-314.

139. Cowley S. Phase variation in Francisella tularensis affecting intracellular growth, lipopolysaccharide antigenicity and nitric oxide production. / S. Cowley, S.V. Mylt-seva, F.E. Nano // Mol. Microbiol. 1996. -Vol. 20, No. 4. - P. 867-874.

140. Crowle A.J. Immunodiffusion / A.J. Crowle. 2-nd ed. - New York, 1973. -545 p.

141. Du sympathicotropisme de l'endotoxine du Bacterium tularensis / V. De Laver-gne, J.R. Helluy, J. Beurey, et Pierson Sommelet // C. R. Soc. Biol. -1951. T. CXLV, No. 11-12.-P. 1348-1349.

142. Edstrom R.D. A colorimetric method for the determination of mucopolysaccharides and other acidic polymers / R.D. Edstrom // Anal. Biochem. 1969. - Vol. 29, No. 3. -P. 421-432.

143. Elkins K.L. Nonspecific early protective immunity in Francisella and Listeria infections can be dependent on lymphocytes / K.L. Elkins, A.T. Maclntyre, T.R. Rhinehart-Jones // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66, No. 7. - P. 3467-3469.

144. Enzyme linked immunosorbent assay for immunological diagnosis of human tularemia / H.E. Carlsson, A.A. Lindberg, G. Lindberg et al. // J. Clin. Microbiol. - 1979. -Vol. 10,No. 5.-P. 615-621.

145. Evaluation of Salmonella porins as a broad spectrum vaccine candidate / B. Tabaraie, B.K. Sharma, P.R. Sharma et al. // Microbiol. Immunol. 1994. - Vol. 38, No. 7. -P. 553-559.

146. Fairbanks G. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane / G. Fairbanks, T.L. Steck, D.F.H. Wallach // Biochem. 1971. -Vol. 10, No. 13.-P. 2606-2617.

147. Field detection of Francisella tularensis / B.P. Berdal, R. Mehl, H. Haaheim et al. // Scand. J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 32, No. 3. - P. 287-291.

148. Fulop M. Activation of the complement system by Francisella tularensis lipo-polysaccharide. / M. Fulop, T. Webber, R. Manchee // New Microbiol. 1993. - Vol. 16, No. 2.-P. 141-147.

149. Fulop M. Role of lipopolysaccharide and a major outer membrane protein from Francisella tularensis in the induction of immunity against tularemia / M. Fulop, R. Man-chee, R. Titball // Vaccine. 1995. - Vol. 13, No. 13. - P. 1220-1225.

150. Fulop M. Role of two outer membrane antigens in the induction of protective immunity against F. tularensis strains of different virulence / M. Fulop, R. Manchee, R. Titball // FEMS Immunol. 1996. - Vol. 13, No. 3. - P. 245-247.

151. Fulop M. Use of a zwitterionic detergent for the restoration of the antibody binding capacity of immunoblotted Francisella tularensis lipopolysaccharide / M. Fulop, T. Webber, R. Manchee // Anal. Biochem. 1992. - Vol. 203, No. 1. - P. 141-145.

152. Gil H. Presence of pili on the surface of Francisella tularensis / H. Gil, J.L. Benach, D.G. Thanassi // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72, No. 5. - P. 3042-3047.

153. Hood A.M. Virulence factors of Francisella tularensis / A.M. Hood // J. Hyg. -1977.-Vol. 79, No. 1.-P. 47-60.

154. Identification of proteins of Francisella tularensis induced during growth in macrophages and cloning of the gene encoding a prominently induced 23-kilodalton protein.

155. Golovliov, M. Ericsson, G. Sandström et al. // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65, No. 6. -P. 2183-2189.

156. Immunogenicity and toxicity of lipopolysaccharide from Francisella tularensis LVS. / G. Sandström, A. Sjöstedt, Т. Johansson et al. // FEMS Microbiol. Immunol. 1992. -Vol. 5, No. 4.-P. 201-210.

157. Immunogenicity of a new lot of Francisella tularensis live vaccine strain in human volunteers / D.M. Waag, G. Sandström, MJ. England, J.C. Williams // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 13, No. 3. - P. 205-209.

158. Inability of the Francisella tularensis lipopolysaccharide to mimic or to antagonize the induction of cell activation by endotoxins / P. Ancuta, T. Pedron, R. Girard et al. // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, No. 6. - P. 2041-2046.

159. Increased synthesis of DnaK, GroEL, and GroES homologies by Francisella tularensis LVS in response to heat and hydrogen peroxide. / M. Ericsson, A. Tärnvik, К. Kuoppa et al. // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62, No. 1. - P. 178 - 183.

160. Influence of the lipopolisaccharide from Francisella tularensis on the stability of liver lysosomes and peroxisomes / Ch.S. Popov, D.G. Tsonchev, M.D. Mironova et al. // Докл. Бол. АН. 1983. - Т. 36, No. 7. - С. 945-948.

161. Issekutz A.C. Removal of gram-negative endotoxin from solutions by affinity chromatography / A.C. Issekutz // J. Immunol. Meth. 1983. - Vol. 61. - P. 275-282.

162. Janda J. A colorimetric estimation of LPS / J. Janda, E. Work // FEBS Lett. -1971.-Vol. 16.-P. 343-345.

163. Jantzen E. Cellular fatty acid composition of Francisella tularensis / E. Jantzen, B.P. Berdal, T. Omland // J. Clin. Microbiol. 1979. - Vol. 10, No. 6. - P. 928-930.

164. Jap B.K. Structure and functional mechanism of porins / B.K. Jap, P.J. Walian // Physiol. Rev. 1996. - Vol. 76. - P. 1073-1088.

165. Kathleen Bhan A. Reduction of Brucella species and Francisella tularensis cross reacting agglutinins by dithiothreitol / A. Kathleen Bhan, C. George Klein // J. Clin. Microbiol. - 1982. - Vol. 16, No. 4. - P. 756-757.

166. Kay R.E. Spectral changes in a cationic dye due to interaction with macromolecules. II. Effects of environment and macromolecule structure / R.E. Kay, R. Walwick, C.K. Gifford // J. Phys. Chem. 1964. - Vol. 68, No. 7. - P. 1906.

167. Keler T. Metachromatic assay for the quantitative determination of bacterial endotoxins / T. Keler, A. Nowotny // Anal. Biochem. 1986. - Vol. 156, No. 1. - P. 189-193.

168. Klinman D.M. Repeated administration of synthetic oligodeoxynucleotides expressing CpG motifs provides long-term protection against bacterial infection / D.M. Klinman, J. Conover, C. Coban // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, No. 11. - P. 5658-5663.

169. Kluger M.J. Polymyxin B use does not ensure endotoxin-free solution / M.J. Kluger, R. Singer, S.M. Eiger // J. Immunol. Meth. 1985. - Vol. 83. - P. 201-207.

170. Knothe H. Ein Beiträge zur Serologie der Tularämie (Hämagglutination, Agglutination, Panagglutination und Agglutinin Adsorbion.) / H. Knothe, G. Havemeister // Zbl. Bact. Orig. 1961. - Bd. 181. - S. 80-102.

171. Kohn J. A colorimetric method for monitoring activation of Sepharose by cyanogen bromide / J. Kohn, M. Wilchek // Biochem. Biophis. Res. Commun. 1978. - Vol. 84. -P. 7-14.

172. Koskela P. Cell-mediated and humoral immunity induced by a live Francisella tularensis vaccine / P. Koskela, E. Herva // Infect. Immun. 1982. - Vol. 36, No. 3. -P. 983-989.

173. Koskela P. Cell-mediated immunity against Francisella tularensis after natural infection / P. Koskela, E. Herva // Scand. J. Infect. Dis. 1980. - Vol. 12, No. 4. - P. 281287.

174. Koskela P. Humoral immunity against Francisella tularensis after natural infection / P. Koskela, A. Salminen // J. Clin. Microbiol. 1985. - Vol. 22, No. 6. - P. 973-979.

175. Kostiala A.A.I. Tularemia in rat. I. The cellular basis of the host resistance to infection / A.A.I. Kostiala, D.D. McGregor, P.S. Logie // Immunology. 1975. - Vol. 28, No. 5. - P. 855-869.

176. Kuwae T. Rapid purification of extracted bacterial lipopolysaccharides by continuous free-flow electrophoresis / T. Kuwae, M. Kurata // Microbiol. Immunity. 1984. -Vol. 28.-P. 169-180.

177. Laemmli U.K. Maturation of the head of bacteriophage T4. I. DNA packaging events / U.K. Laemmli, M. Favre // J. Mol. Biol. 1973. - Vol. 80. - P. 575-599.

178. Lilliehook B. Production of murine monoclonal antibodies against Francisella tularensis antigens and characterization of antibody-reactive epitopes / B. Lilliehook, G. Sandstrom // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1989. - Vol. 90, No. 1. - P. 71-77.

179. Long-lasting cell-mediated immunity induced by a live Francisella tularensis vaccine / A. Tarnvik, M.-L. Lofgren, S. Lofgren et al. // J. Clin. Microbiol. 1985. - Vol. 22, No. 4. - P. 527-530.

180. Lovgren K. The ISCOM: an antigen delivery system with built-in adjuvant / K. Lovgren, B. Morein // Molec. Immun. 1991. - Vol. 28. - P. 285-286.

181. Lugtenberg B. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other gram-negative bacteria / B. Lugtenberg, L. van Alphen // Bio-chem. Biophys. Acta. 1983. - Vol. 737. - P. 51-115.

182. Mayer H. Analysis of lipopolysaccharides of gram-negative bacteria / H. Mayer, R.N. Tharanathan, J. Weckesser // Meth. Microbiol. London e. a., 1985. - Vol. 18. - P. 157-207.

183. McCartney A.C. The Limulus amebocyte lysate assay for bacterial endotoxins / A.C. McCartney //Alta. 1986. - Vol. 13. - P. 180-192.

184. McKinny M.M. A simple, non chromatographic procedur to purity immunoglobulins from serum and ascites / M.M. McKinny, A. Parcinson // J. Immunol. Methods. 1987. Vol. 96, No. 2. - P. 271-278.

185. Membrane proteins of Francisella tularensis LVS differ in ability to induce proliferation of lymphocytes from tularemia vaccinated individuals / H.-M. Surcel, M. Sorvas, I.M. Heiander, E. Herva // Microb. Pathog. 1989. - Vol. 7, No. 6. - P. 411-419.

186. Membrane-disorganizing property of polymyxin B nonapeptide / C. Lam, J. Hildebrandt, A.F. Schütze, A.F. Wenzel // J. Antimicrobial. Chemother. 1986. - Vol. 18. - P. 9-16.

187. Molecular cloning and expression of a T cell stimulating protein of Francisella tularensis / A. Sjöstedt, G. Sandström, A. Tärnvik, B. Jaurin // Microbial Pathogenesis. - 1989. - Vol. 6, No. 6. - P. 403-414.

188. Morrison D.C. Binding of polymyxin B to the lipid A portion of bacterial lipo-polysaccharides / D.C. Morrison, D.M. Jacobs // Immunochem. 1976. - Vol. 13. - P. 813818.

189. Nano F.E. Identification of a heat-modifiable protein of Francisella tularensis and molecular cloning of the encoding gene / F.E. Nano // Microbial Pathogenesis. 1988. -Vol. 5,No. 2.-P. 109-120.

190. Navas E. Problems associated with potential massive use of antimicrobial agents as prophylaxis or therapy of a bioterrorist attack / E. Navas // Clin. Microbiol. Infect. -2002. Vol. 8, No. 8. - P. 534-539.

191. Nine-analyte detection using an array-based biosensor / C. R. Taitt, G. P. Anderson, B. M. Lingerfelt et al. // Anal. Chem. 2002 . - Vol. 74, No. 23. - P. 6114-6120.

192. Niwa M. Inactivation and immobilization of endotoxin. A novel endotoxin binding substance, polymyxin-Sepharose / M. Niwa, M. Umeda, K. Ohashi // Jpn. J. Med. Sei. Biol. 1982.-Vol. 35.-P. 114-115.

193. Nowotny A. Basic exercises in immunochemistry / A. Nowotny. 2nd ed. - New York, 1979. - 305 p.

194. Nucleotide sequence and T cell epitopes of a membrane protein of Francisella tularensis / A. Sjöstedt, G. Sandström, A. Tärnvik, B. Jaurin // J. Immunol. 1990 -Vol. 145, No. 1.-P. 311-317.

195. Nutter J.E. Antigens of Pasteurella tularensis: preparative procedures / J.E. Nutter// Appl. Microbiol. 1971. - Vol. 22. - P. 44-48.

196. Nutter J.E. In vitro interactions between rabbit alveolar macrophages and Pasteurella tularensis / J.E. Nutter, Q.N. Myrvik // J. Bacteriol. 1966. - Vol. 92, No. 3. - P. 645-651.

197. Obayashi T. A new endotoxin-specific assay / T. Obayashi // Endotoxin: Proc. Int. Symp. Endotoxins,Satell. Symp. 4th Int. Conf., Immunopharmacol., Tochigi-Ken, 11-13 May, 1988. New York; London, 1990. - P. 215-223.

198. Ogawa Y. Characterization of the pyrogenicity of two different lipopolysaccha-rides and their lipid A-bovine serum albunin complexes / Y. Ogawa, T. Murai, S. Kanoh // J. Pharmacobio-Dyn. 1986. - Vol. 9. - P. 722-728.

199. Ohara S. Serological studies on Francisella tularensis, Francisella novicida, Yersinia philomiragia and Brucella abortus / S. Ohara, T. Sato, M. Homma // Int. J. Syst. Bact. 1974. - Vol. 24, No. 2. - P. 191-196.

200. Orchestration of the protective immune response to intracellular bacteria: Francisella tularensis as a model organism / A. Tarnvik, M. Ericsson, I. Golovliov et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 13, No. 3. - P. 221-225.

201. Ormsbee R.A. Studies on Bacterium tularense antigens. II. Chemical and physical characteristics of protective antigen preparations / R.A. Ormsbee, C.L. Larson // J. Immunol. 1955. - Vol. 74. - P. 359-370.

202. Ouchterlony O. Antigen antibody Reactions in Gels. IV. Types of Reactions in Coordinated Systems of Diffusion / O. Ouchterlony // Acta path, microbiol. scand. - 1953. -Vol. 32.-P. 321.

203. Peptides bound to proteosomes via hydrophobic feet become highly immunogenic without adjuvants / G.H. Lowell, L.F. Smith, R.C. Seid, W.D. Zollinger // J. Exp. Med. 1988. - Vol. 167. - P. 658-663.

204. Peruski A.H. Rapid and sensitive detection of biological warfare agents using time-resolved fluorescence assays / A.H. Peruski, L.H. Johnson, L.F. Peruski Jr. // J. Immunol. Methods. 2002. - Vol. 263, No. 1-2. - P. 35-41.

205. Porins: the major outer membrane proteins of enteric bacteria as protective antigens / P.H. Makela, N. Kuusi, M. Nurminen, H. Saxen, M. Valtonen // Semin. Infect. Dis. -1982.-Vol. 4.-P. 360-365.

206. Predominant expansion of Vy9 V52 T cells in tularemia patient / T. Sumida, T. Maeda, H. Takahashi et al. // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60, No. 6. - P. 2554-2558.

207. Production and characterization of monoclonal antibodies directed against the lipopolysaccharide of Francisella tularensis / M. Fulop, T. Webber, R. Manchee, D.S. Kelly // Clin. Microbiol. 1991. - Vol. 29, No. 7. - P. 1407-1412.

208. Protective LPS-protein complex from outer membrane Francisella tularensis / I.R. Golovliov, D.P. Kulevatsky, S.F. Averin, V.S. Khlebnikov // 11th Meeting Europ. Federat. Immunol. Soc.: Abstracts. Finland, 1991. - P. 12-19.

209. Protein heterogeneity of Francisella tularensis detection of proteins with antigenic determinants / J. Stulik, J. Cerna, H. Kovarova, A. Macela // Folia Microbiol. (Praha). 1989. - Vol. 34, No. 4. - P. 316-323

210. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rose-brough, A.L. Farr, R.J. Randall // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193, No. 1. - P. 265-275.

211. Rapid generation of specific protective immunity to Francisella tularensis / K.L. Elkins, D.A. Leiby, R.K. Winegar et al. // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60, No. 11. - P. 4571-4577.

212. Role of antibody to lipopolysaccharide in protection against low- and high-virulence strains of Francisella tularensis / M. Fulop, P. Mastroeni, M. Green, R. W. Titball // Vaccine. 2001. - Vol. 19. - P. 4465-4472.

213. Roth R.I. A modified Limulus amebocyte lysate test with increased sensitivity for detection of bacterial endotoxin / R.I. Roth, J. Levin, S. Behr // J. Lab. Clin. Med. 1989. -Vol. 114.-P. 306-311.

214. Sandström G. Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis / G. Sandström, A. Tärnvik, H. Wolf-Watz // J. Clin. Microbiol. 1987. - Vol. 25, No. 4. - P. 641-644.

215. Sasaki J. Relationship between stainability and virulence of F. tularensis / J. Sasaki // J. Vinsen Med. Sei. 1966. - Vol. 11, No. 3. - P. 191-195.

216. Seitmann G. The outer membrane of Gram-negative bacteria with emphasis on its lipopolysaccharide and lipoprotein components / G. Seltmann, E.Th. Rietschel // Wiss. Beitr. M.-Luther-Univ., Halle Wittenberg. P. 1988. - No. 32. - P. 77-112.

217. Sjostedt A. Humoral and cell-mediated imunity in mice to a 17-kilodalton lipoprotein of Francisella tularensis expressed by Salmonella typhimurium / A. Sjostedt, G. Sandstrom, A. Tarnvik // Infect. Immunity. 1992. - Vol. 60, No. 7. - P. 2855-2862.

218. Sjostedt A. Several membrane polypeptides of the live vaccine strain Francisella tularensis LVS stimulate T-cell from naturally infected individuals / A. Sjostedt, G. Sandstrom, A. Tarnvik // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28, No. 1. - P. 43-48.

219. Sjostedt A. The T-cell-stimuIating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein / A. Sjostedt, A. Tarnvik, G. Sandstrom // Infect. Imuran. 1991. - Vol. 59, No. 9. - P. 3163-3168.

220. Sjostedt A. Virulence determinants and protective antigens of Francisella tularensis / A. Sjostedt // Curr. Opin. Microbiol. 2003. - Vol. 6, No. 1. - P. 6671.

221. Structure of the O-antigen of Francisella tularensis strain 15 / E.V. Vinogradov, A.S. Shashkov, Y.A. Knirel et al. // Carbohydr. Res. -1991. Vol. 214, No. 2. - P. 289-297.

222. Surcel H.-M. Diversity of Francisella tularensis antigens recognized by human T lymphocytes / H.-M. Surcel // Infect. Immun. 1990. - V.58, No. 8. - P. 2664-2668.

223. Tarnvik A. Nature of protective immunity to Francisella tularensis / A. Tarnvik // Rev. Infect. Dis. 1989. - Vol. 11, No. 3. - P. 440-451.

224. Tarnvik A. Stimulation of subpopulations of human lymphocytes by a vaccine strain of Francisella tularensis / A. Tarnvik, S.E. Holm // Infect. Immun. 1978. - Vol. 20, No. 3. - P. 698-704.

225. Tarnvik A. Time of lymphocyte response after onset of tularemia and after tularemia vaccination / A. Tarnvik, G. Sandstrom, S. Lofgren // J. Clin. Microbiol. 1979. -Vol. 10,No. 6.-P. 854-860.

226. Tarnvik A. Tularaemia / A. Tarnvik, L. Berglund // Eur. Respir J. 2003. - Vol. 21, No. 2.- P. 361-373.

227. T-cell-independent resistance to infection and generation of immunity to Francisella tularensis / K.L. Elkins, T. Rhinehart-Jones, C.A. Nacy et al. // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61, No. 3.-P. 823-829.

228. The 17 kDa lipoprotein and encoding gene of Francisella tularensis LVS are conserved in strains of Francisella tularensis / A. Sjostedt, K. Kuoppa, T. Johansson, G. Sandstrom // Microb. Pathog. 1992. - Vol. 13, No. 3. - P. 243-249.

229. The development of immunoassays to four biological threat agents in a bidiffrac-tive grating biosensor / T. O'Brien, L. H. Johnson, J. L. Aldrich et al. // Biosens. Bioelec-tron. 2000. - Vol. 14, No. 10-11.-P. 815-828.

230. Thorpe B.D. Phagocytosis and intracellular fate of Pasteurella tularensis. III. In vivo studies with passively transferred cells and sera / B.D. Thorpe, S. Marcus // J. Immunol. 1965. - Vol. 94. - P. 578-585.

231. Towards proteome database of Francisella tularensis / Hubalek M., Hernychova L., Havlasova J. et al. // J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2003. -Vol.787, No. 1. - P.149-177.

232. Towbin H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to ni-trocellulosesheets: procedure and some applications / H. Towbin, T. Stachelin, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76, No. 9. - P. 4350-4354.

233. Tsai C.-M. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels / C-M. Tsai, C.E. Frasch // Anal. Biochem. 1982. - Vol. 119, No. 1. - P. 115-119.

234. Tularemia / J. Ellis, P. C. Oyston, M. Green, R. W. Titball // Clin. Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 15, No. 4. - P. 631-646.

235. Various membrane proteins of Francisella tularensis induce interferon-gamma production in both CD4+ and CD8+ T cells of primed humans / A. Sjostedt, M. Eriksson, G. Sandstrom, A. Tarnvik // Immunology. 1992. - Vol. 76, No. 4. - P. 584-592.

236. Vinogradov E.V. Structural analysis of Francisella tularensis lipopolysaccharide / E.V. Vinogradov, M.B Perry, J.W. Conlan // Eur. J. Biochem. 2002. - Vol. 269, No. 24. -P. 6112-6118

237. Wagner H. Immunostimulatory DNA sequences help to eradicate intracellular pathogens / H. Wagner, H. Hacker, G.B. Lipford // Springer Semin. Immunopathol. 2000. -Vol. 22, No. 1-2.-P. 147-152.

238. Wareen L. Tiobarbituric acid spray reagent for doxy sugars and sialic acid / L. Wareen//Nature. 1960. - Vol. 186, No. 4720. - P. 237.

239. Westphal O. Über die Extraktion von Bakterien mit Phenol/Wasser / O. West-phal, O. Lüderitz, F. Bister // Z. Naturforsch. 1952. - Teil B 7. - S. 148-155.

240. Wilson M. A new assay for bacterial lipopolysaccharides / M. Wilson, W. Harvey // Current Microbiol. 1990. - Vol. 21, No. 2. - P. 91-94.

241. Wu L. A method for purification of bacterial R-type lipopolysaccharides (lipoo-ligosaccharides) / L. Wu, C. Tsai, C.E. Frasch // Anal. Biochem. 1987. - Vol. 160, No. 2. -P. 281-289.

242. Zhang G.-H. New microassay for quntitation of endotoxin using Limulus amebo-cyte lysate combined with enzyme-linked immunosorbent assay / G.-H. Zhang, L. Baek, C. Koch // J. Clin. Microbiol. 1988. - Vol. 26, No. 8. - P. 1464-1470.