Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба и конструирование на их основе диагностических препаратов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба и конструирование на их основе диагностических препаратов"

004612609 На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА Екатерина Михайловна

Структурная и функциональная характеристика антигенного С-комплекса туляремнйного микроба разных подвидов

03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 НОЯ 7010

Саратов-2010

004612009

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Волох Оксана Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Щербаков Анатолий Анисимович

доктор медицинских наук, профессор

Швиденко Инна Григорьевна

Ведущая организация:

ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт»

совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан «/^ ъШпЗ^ЬЯ. 2010 г.

Защита состоится «

ЛВ »НОзИрЯ 2010 г.

часов на заседании диссертационного

Ученый секретарь диссертационноп доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А.А.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Francisella tularensis - грамотрицательная факультативно внутриклеточная неподвижная мелкая плеоморфная бактерия, вызывающая заболевание у людей и животных, ареал распространения которой охватывает в основном зону умеренного климатического пояса Северного полушария. Различают 4 подвида F. tularensis: subsp. nearctica (встречается только в Северной Америке), subsp. holarctica (Северное полушарие), subsp. mediasiatica (только в Средней Азии) и subsp. novicida (Северная Америка и тропическая Австралия) [Олсуфьев Н.Г., 1975; Oyston P.C.F. et al., 2003; Whipp M. J, 2003; Splettstoesser W.D. et al., 2005], для которых характерна относительная генетическая однородность (до 90%) [Домарадский И.В., 2005]. Несмотря на достигнутые успехи в исследовании особенностей строения и биологии туляремийного микроба, факторы патогенности этого возбудителя, состав капсулы и протективные антигены окончательно не установлены [Havlasova J. et al., 2002; Sjostedt A., 2003; Eyles J.E., 2007; Oyston P.C.F., 2008; Santic M., 2010]. Эндемичные очаги туляремии характеризуются стабильностью проявления и широко распространены, в том числе на территории России и соседних стран [Tarnvik A. et al., 2004; Топорков В.П. и др., 2007, Безсмертный В.Е. и др., 2008]. Кроме того, возбудитель туляремии включен в высшую категорию А как потенциальный агент биотерроризма [Dennis D. et al., 2001; Gallagher-Smith M. et al., 2004].

Лабораторная диагностика туляремии в настоящее время основывается на иммунологических (сероаллергологическая диагностика) и бактериологических методах [Лаб. диагност. ООИ, 2009]. В области разработки новых способов детекции туляремийного микроба ведутся активные исследования [Splettstoesser W. D. et al., 2005; Hotta A. et al., 2007]. Тест-системы на основе молекулярно-генетических методов интенсивно разрабатываются и в настоящее время включены в схему лабораторной диагностики туляремии [Лаб. диагност. ООИ, 2009]. У возбудителя туляремии ли-пополисахарид (ЛПС) и белки внешней мембраны (ВМ) влияют на специфичность иммунного ответа макроорганизма, обладают уникальной полиэпитопной антигенной структурой и рассматриваются как перспективные антигены для создания профилактических и диагностических препаратов [Родионова И.В., Захаренко В.И., 1990; Хлебников B.C. и др., 1992, 1993; Ellis J. et al., 2002; Conlan J.W. 2004; Oyston P.C.F., 2008]. Оценка эффективности тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА) показала, что диагностикумы на основе препаратов ЛПС F. tularensis или от-

дельных белков ВМ (43 и 17 кДа) обладают более низкой чувствительностью (96,599,0%) и специфичностью (96-97%), чем на основе комплекса белков ВМ - 100% специфичность и чувствительность [Bevanger L. et al., 1988, 1989; Schmitt P. et al., 2005; Splettstoesser W. D. et al., 2005].

К антигенным структурам сложной химической природы относится поверхностный С-комплекс, обладающий выраженными иммуномодулирующими свойствами [Родионова И.В., 1989; Юров C.B. и др., 1991; Хлебников B.C. и др., 1994; Жемчугов В.Е., 2004]. В составе данного антигена, полученного из клеток вакцинного штамма F. tularensis 15 линии НИИЭГ (С-15), были определены белки, липиды и углеводы, установлена его протективная активность для белых мышей при экспериментальной туляремии, а также отсутствие токсичности и повреждающего действия на иммунокомпетентные клетки [Шепелёв И.А., 2005; Волох O.A. и др., 2007]. В то же время недостаточно изучены особенности строения и состава С-комплекса туля-ремийного микроба разных подвидов и его антигенные, биохимические и иммунобиологические свойства. Полученные данные позволят оценить возможность применения С-комплекса для разработки новых экспериментальных иммунодиагности-ческих препаратов.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - определение особенностей структуры и свойств антигенного С-комплекса туляремийного микроба разных подвидов, оценка возможности использования в иммунодиагностике туляремии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Получить препараты антигенного С-комплекса туляремийного микроба разных подвидов, провести их сравнительный анализ.

2. Разработать методические подходы для выделения и очистки компонентов С-комплекса туляремийного микроба.

3. Определить оптимальную схему иммунизации животных-продуцентов для получения туляремийных поликлональных антител.

4. Разработать методические подходы для выявления и количественного определения С-комплекса туляремийного микроба и его компонентов с применением различных вариантов иммуноанализа.

5. Разработать на основе антигенного С-комплекса туляремийного микроба экспериментальные иммунодиагностические препараты для детекции возбудителя туляремии и противотуляремийных антител.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. На основе сравнительного анализа структуры и свойств полученных препаратов С-комплекса из штаммов туляремийного микроба подвидов Ъо1агсйса, пеагсИса, тесИаь'шйса установлено, что их молекулярная масса в натив-ных условиях составляет около 280 кДа, все препараты сходны по химическому (содержат белки 62±5%, липиды 27±6% и углеводы 15±3%) и субъединичному составам (содержат иммунохимически активные субъединицы: 81-85, 57-60, 43, 23-27 и 14-17 кДа). В составе препарата С-15 с помощью протеомного анализа подтверждено наличие указанных выше субъединиц, среди которых впервые идентифицированы биологически активные молекулы - белки-шапероны (СгоЕБ и вгоЕЬ), три фермента, три белка ВМ и регуляторный белок (фактор элонгации ЕИ-Ти).

Препараты С-комплекса основных подвидов обладают протективными свойствами для лабораторных животных при экспериментальной инфекции, вызванной вирулентными штаммами голарктического, неарктического и среднеазиатского подвидов и индуцируют в организме лабораторных животных образование антител в ранние сроки. С-комплекс из К пйагепш зиЬэр. потс'к!а отличается от аналогичных антигенов других подвидов большим содержанием углеводной части (26,5±1,2%), наличием субъединиц с молекулярной массой более 110 кДа и отсутствием иммуно-реактивных белков в области 57-85 кДа. Установлено снижение иммунохимической (в 5 раз) и протективной активностей этого препарата.

Усовершенствованы отдельные этапы получения компонентов С-комплекса туляремийного микроба, разработаны иммунохимические методы (ИФА, иммунодот -ДИА, иммуноблоттинг) их выявления и количественного определения. Установлено, что компоненты С-комплекса с молекулярными массами более 23 кДа имеют белковую природу, а субъединицы 14-17 кДа - липопротеидную. Впервые было показано, что С-комплекс регистрируется у туляремийного микроба независимо от формы ЛПС и наличия капсулы.

Чувствительность экспериментальных препаратов на основе антител к С-комплексу туляремийного микроба для детекции возбудителя туляремии разных подвидов иммунодиагностическими методами (ИФА, ДИА) составляет 104-105 м.к./мл. Иммуносуспензионный метод на основе реакции латекс агглютинации позволяет выявлять как Сар+, так и Сар" штаммы туляремийного микроба, в отличие от коммерческого диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА). Использование С-15 в качестве маркерного антигена в иммуноблотгинге и ИФА

(ДИА) позволяет определять туляремийные антитела у лабораторных животных (вакцинированных и экспериментально зараженных).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработаны методы выделения компонентов С-комплекса туляремийного микроба с помощью ферментативного и химического гидролиза с последующей хроматографической очисткой, позволяющие с наименьшими затратами получать эти препараты в лабораторных условиях. Полученные препараты С-комплекса разных подвидов используются при выполнении научно-экспериментальных работ в лабораториях вакцинологии и иммунопрофилактики, иммунодиагностики и молекулярной диагностики РосНИПЧИ «Микроб». Полученные в результате работы научные данные об особенностях антигенного строения туляремийного микроба используются на курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования по специальности «бактериология» в институте «Микроб» при чтении лекций цикла «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии».

По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Применение антител к С-комплексу туляремийного микроба для детекции возбудителя туляремии методами иммуноанализа», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 17.04.2008 г.) и утвержденные директором института.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. С-комплекс является общим антигеном для туляремийного микроба основных подвидов (эиЬБр. Ио1агсИса, пеагсИса, тесИазгаНса), обладает сходной структурой и свойствами.

2. Особенности биохимического и иммунохимического строения С-комплекса из 1и\агет\$ зиЬэр. потййа обусловливают снижение его иммуногенности и про-тективности для белых мышей в отношении экспериментальной туляремийной инфекции по сравнению с аналогичными антигенами, выделенными из штаммов других подвидов.

3. Препарат С-комплекса, выделенный как из вакцинных, так и вирулентных штаммов, обладает иммуномодулирующими свойствами и защищает белых мышей при заражении вирулентными штаммами возбудителя туляремии голарктического, среднеазиатского и неарктического подвидов.

4. Разработанный комплекс методов выделения компонентов антигенного С-комплекса, основанный на комбинировании способов химического и ферментативного гидролиза препаратов с последующей хроматографической очисткой, позволяет получать иммунохимически активные компоненты.

5. Разработанная схема иммунизации животных продуцентов позволяет получать гипериммунные туляремийные сыворотки, отличающиеся высокой активностью и стабильностью.

6. Экспериментальные антительные препараты позволяют выявлять С-комплекс туляремийного микроба и его компоненты в различных вариантах иммуноанализа (ДИА, ИФА, иммуноблотгинг) в концентрации до 0,5-1,0 нг/мл, клетки туляремийного микроба разных подвидов в количестве до 104-105 м.к./мл. Экспериментальные препараты на основе антигенного С-комплекса выявляют специфические противо-туляремийные антитела у животных (вакцинированных, инфицированных и переболевших) в ранние сроки и до б мес.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях», Волгоград; Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины», Санкт-Петербург, 2006; VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ», Оболенск; IX Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва; научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России», Ставрополь, 2007 г.; IX Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», Волгоград; научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире», Оболенск, 2009; Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение противоэпидемической

защиты населения», Нижний Новгород, 2009; ежегодных итоговых научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2005-2010 гг.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК России.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников. Объем диссертации 141 страница машинописного текста. Список литературы содержит 129 отечественных и 137 иностранных источников. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 18 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы

Работа выполнена с использованием вакцинных (F. íularensis 15 НИИЭГ и LVS cap") и 65 вирулентных штаммов F. íularensis разных подвидов и биоваров (holarc-tica: eryR, eryS, japónica; nearctica, mediasiatica, novicidd), а также 30 гетерологич-ных микроорганизмов, все штаммы получены из ГКПБ «Микроб». Культивирование туляремийного микроба проводили при 37°С на плотных и жидких питательных средах FT, Т и LB.

Препараты С-комплекса разных подвидов получали из инактивированной фенолом биомассы поэтапным осаждением в изоэлектрической точке с предварительным гидродинамическим смывом [Шепелёв И.А., 2005].

Концентрацию белка определяли общепринятыми методами. Углеводы регистрировали по реакции с тимоловым реактивом [Сборник инструкций по общим методам контроля..., 1983], количество липидов - бихроматным методом [Amenta J., 1964], нуклеиновых кислот - по Спирину [ФС 42-3874-99,2000].

Для получения сывороток к С-комплексу туляремийного микроба использовали взрослых (2 кг) кроликов породы «Шиншилла». Иммуноглобулиновые фракции (Ig «С») выделяли по L. Rane, L. Newhauser [1954]. Для постановки метода флуоресцирующих антител (МФА) использовали препарат Ig «С» и ero F(ab')2-фрагменты, меченые флуоресцеинизотиоционатом по методу J. Marshall et al. [1958]. Иммунопероксидазный конъюгат получали с помощью периодатного метода [Фри-мель Г., 1987]. Для прямого ДИА использовали антитела, конъюгированные с кол-

лоидными металлами (серебром - проведено Н.А. Шараповой в РосНИПЧИ "Микроб", золотом - в ИБФРМ д.б.н. JI.A. Дыкманом).

Для очистки препаратов антигенов и иммуноглобулинов, разделения их компонентов использовали колоночную хроматографию с использованием различных носителей на хроматографе низкого давления Biologic LP фирмы «Bio-RAD» (США). Электрофорез в полиамилакридном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) проводили по U. Laemmli [1970] в 4% концентрирующем и 10% разделяющем гелях. Для обнаружения белков использовали окрашивание Кумасси ярко синим R-250, для детекции ЛПС-содержащих компонентов гели окрашивали азотнокислым серебром.

Для определения иммунохимической идентичности разных серий антигенных и антительных препаратов применяли следующие методы: реакцию диффузионной преципитации по Оухтерлони (РДП) и иммуноблоттинг по методу Н. Towbin [1979]. В работе использовали РНГА с иммуноглобулиновым и антигенным диагностику-мами (г. Киров), ИФА и ДИА в различных модификациях.

Для изучения иммуногенности полученных препаратов использовали беспородных белых мышей (18 г) и морских свинок (250 г). Протективную активность препаратов определяли при экспериментальном заражении лабораторных животных вирулентными штаммами F.tularensis, рассчитывая ED50 и LD50 по методу Кербера. Работу с животными проводили по стандартным методикам [СП 1.3.1285-03; МУ 3.3.1.2161-07].

При обработке полученных результатов применяли общепринятые статистические методы, вычисляя среднеарифметические величины, степень достоверности различий по t-критерию Стьюдента, исходя из уровня значимости (Р) <0,05 (95%) [Ашмарин И. П., Воробьев А. А., 1962; Рокицкий П.Ф., 1973].

2. Результаты исследований и их обсуждение

На первом этапе работы для оценки возможности получения С-комплекса из штаммов-продуцентов разных подвидов туляремийного микроба был проведен электрофоретический анализ суммарных клеточных белков 65 штаммов F. tularensis и препарата С-15. Было доказано наличие белковых фракций поверхностного антигенного С-комплекса туляремийного микроба в составе протеинограмм всех исследуемых штаммов и выявлена высокая однородность внутри и между подвидами F. tularensis. Получены препараты С-комплекса из следующих вирулентных штаммов-

продуцентов: F. tularensis subsp. holarctica eryR 503/840 (C-503), holarctica eryS B-300 (C-B 300), holarctica japónica Miura (C-Miura), nearctica B399 A'Cole (C-A'Cole), mediasiatica A-179 (C-A 179), mediasiatica A-61 (117) KM 4 (C-A 61), novicida Utah 112 (C-Utah 112); и из вакцинных штаммов F. tularensis 15 НИИЭГ и LVS cap" (С- LVS). Все штаммы по проведенным биохимическим тестам внутривидового ти-пирования соответствовали своему подвиду. В результате сравнительного анализа физико-химических, антигенных и биохимических особенностей препаратов С-комплекса F. tularensis разных подвидов было установлено, что все препараты полученные из вирулентных штаммов, кроме C-Utah 112, сходны по содержанию углеводов, белков и липидов с препаратом С-15 (таблица 1). Активность С-комплекса F. tularensis разных подвидов в ДИА с поликлональными антительными препаратами к С-15 составляла около 17 нг/мл, в РДП - 31-15,6 мкг/мл, а в ИФА - 0,7 нг/мл.

Таблица 1. Состав и иммунохимические свойства препаратов С-комплекса F. tularensis разных подвидов (M±mt).

№ Препарат Химический состав, % Активность, нг/мл

п/п С-комплекса Белки Углеводы Липиды ДИА ИФА

1. С-15 63,1±3,9 10,9±1,6 23,0±2,4 20,0±6,9 0,6±0,4

2. С-503 52,4±3,7 17,5±3,3 32,4±3,4 19,2±6,4 0,7±0,5

3. С-В 300 68,7±2,2 11,7±2,0 18,7±1,9 15,4±6,0 0,1±0,02

4. C-Miura 62,5±3,4 19,0±1,3 21,3±1,6 20,0±5,7 1,2±1,0

5. C-A'Cole 67,2±1,6 14,4±0,8 19,5±1,8 24,3±6,2 1,6±0,8

6. C-A 179 51,6±1,9 19,3±1,3 30,9±2,0 15,6±7,0 0,3±0,2

7. C-A 61 67,0±2,5 12,0±1,2 19,4±3,4 10,5±3,3 0,8±0,6

8. C-Utah 112 45,5±4,1 26,5±1,2 24,5±3,1 99,3±8,3 2,0±0,9

Электрофоретический белковый профиль С-комплекса из клеток вирулентных штаммов (503, В 300, Мшга, А'Со1е, А-179, А-61) не отличался от препарата, полученного из клеток вакцинного штамма. Окрашивание электрофореграммы азотнокислым серебром показало наличие во всех препаратах С-комплекса, независимо от подвида штамма-продуцента, компонентов липополисахаридной природы, которые представлены липидом А с коровым олигосахаридом и боковыми цепями. Кроме того, иммуноблотганг с антителами к С-комплексу туляремийного микроба позволил

установить иммунодоминантные полипептиды с молекулярной массой 81-85, 57-60, 43, 23-27 и 14-17 кДа входящие в состав всех исследованных препаратов (рисунок1). А Б

250957255-

95— 72 —

55 —

36- 36 —

28- 2817- 17_

Ш ..

М 1 2 3 4 5 6 7 8 М 1 2 3 4 5 6 7

М - маркеры молекулярной массы 11-250 кДа («Fermentas», США). А - белковый профиль (окраска Кумасси синим): 1 - С-15; 2 - С-В 300; 3 - С-503;

4 - C-Miura; 5 - С- А 179; 6 - С-А'Cole; 7 - C-Utah 112; 8 - клеточный лизат F. tu-larensis 15 НИИЭГ.

Б - иммуноблоттинг с Ig «С»: 1-С-15; 2-С-503; 3 - С-В 300; 4 - C-Miura;

5 - С-А~Со1е; 6 - С-А 179; 7 - C-Utah 112.

Рисунок 1. SDS-PAG электрофорез и иммуноблоттинг препаратов С-комплекса туляремийного микроба разных подвидов.

С помощью гель-хроматографии были определены профили препаратов С-15, С-503, С-В 300, С-А 179, С-А 61 и C-A'Cole, которые были представлены одним мажорным пиком с молекулярной массой около 280 кДа. Профиль C-Utah 112 имел два пика с молекулярными массами около 280 и 160 кДа. Состав пиков отличался: в первом были белки более 43 кДа, а во втором - менее 23 кДа. В результате определения идентичности между антигенным комплексом, выделенным из novicida Utah 112, и препаратами остальных подвидов в РДП были отмечены частично перекрещивающиеся линии преципитации («шпора»), что свидетельствует о наличии раз-

личных антигенных детерминант. Электрофоретический профиль препарата C-Utah 112 также отличался наличием дополнительных белков с молекулярной массой более 110 кДа и отсутствием иммунореактивных белков в диапазоне 57-85 кДа (рисунок 1).

Субъединичный состав С-комплекса F. tidarensis был подтвержден протеомным анализом на модели препарата С-15. Протеомный анализ проводили в ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА России (г. Москва). При компьютерном анализе протеома с помощью программы Mascot в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) в составе С-комплекса были идентифицированы 9 биологически активных молекул, специфических для F. tularensis, и один белок гомологичный фракции А О-аланил-Б-аланин карбоксипептидазы Yersinia pseudotuberculosis (рисунок 2).

■

Идентифицированные белки: 105 - 50S рибосомальный белок L7/L12 (RplL); 106 1 - белок-шаперон GroES; 107-108 - гипотетический белок FTL_0617; 111 - АС-

белок; 113 - белок ВМ; 114 - фракция А О-аланил-О-аланин карбоксипептидазы; 115-116 - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа; 117-118 - фактор элонгации Tu (EF-Tu); 119 - белок-шаперон GroEL; 120 - пероксидаза/каталаза (KatG). Рисунок 2. Двумерный РAG-электрофорез препарата С-15.

I ' • .

i

M\V

(kDj)

120 119

■ТТТ^

112 113

Ш ,ч0 ,8

114

108 sigäa i

106

116,250 97,400

31.000,«

21,500 14,400 6,500

Присутствие в составе С-комплекса белков-шаперонов, рецепторных белков ЕЕ-Ти и Яр1Ь, бактериальных ферментов обусловливают высокую иммунобиологическую активность данного антигена. Показано, что все препараты С-комплекса, независимо от подвидовой принадлежности штамма-продуцента, защищают лабораторных животных от гибели при экспериментальной туляремии, вызванной вирулентными штаммами голарктического, неарктического и среднеазиатского подвидов, а также большими дозами вакцинного штамма К 15 НИИЭГ (таблица 2).

Показатели индекса иммунитета для белых мышей, иммунизированных препаратом С-15, против голарктического подвида составили 1468, а против неарктического подвида — 10, индекс защиты (ИЗ) в обоих случаях был более 50%. Для препарата С-ШаЬ 112 ИЗ для белых мышей был значительно ниже (37,5%) по сравнению с другими исследованными образцами, что может быть связано с особенностями строения С-комплекса из подвида поугШа, в частности с большим содержанием углеводного компонента, а также отсутствием ряда иммунореактивных белков.

Таблица 2. Иммуногенность препаратов С-комплекса для белых мышей при экс-

периментальной туляремийной инфекции.

Препарат ШЕОв Заражающий штамм

К пЛагею 'и /\ пйагет'ш ш1агетх$ Р. ш1агегк1$

Бф. ЬоктОса 503/840 эзр. шгсйса В399 А'Со1е тес&тжкя А-179 щ>.!ю1ахаса 15 НИИЭГ

ИЗ, % 95,6 42 100 87

С-15 ЕО50, 3,1 95,5 2,24 1,4

мкг 2,4-11,3 55,9+169 1,8+8,3 0,6+2,9

ИЗ, % 50 56,5 100 92

С-503

ЕО50, 112,2 66,1 2,24 5,64

мкг 48,9-257 25,1+204 1,8+8,3 4,5+12,4

С-А'Со1е ИЗ, % 45,8 21,7 100 98

ЕО50, 131,8 562,3 2,24 4,41

мкг 50,1+407,4 251,2+818 1,8+8,3 2,5+10,1

ИЗ, % 58,3 69,5 100 100

С-А 179 ЕЭзо, 33,11 16,21 2,24 2,34

мкг 27,2-108 9,2+25,1 1,8+8,3 1,9+8,8

Контроль ИЗ, % 0 0 0 0

п/Ы 0/6 0/6 0/6 0/6

Примечание: п /Ы - отношение числа выживших белых мышей к общему числу

животных в группе; ЕО50: средняя иммунизирующая доза, диапазон штатах.

При сравнительном анализе влияния иммунизации С-комплексом Е. Магетгз разных подвидов на показатели клеточного звена иммунитета было показано отсутствие выраженного повреждающего действия всех препаратов на тимоциты и спле-ноциты белых мышей, а также положительная реакция лейкоцитолиза на 14-21 сутки иммуногенеза. Введение препаратов С-комплекса лабораторным животным вызывало формирование выраженного антительного ответа, независимо от подвида штамма-продуцента, вида животного (мыши, свинки, кролики) и способа иммунизации. Максимальной иммуномодулирующей активностью обладал С-комплекс, полученный из вакцинного штамма Шагет'к 15 НИИЭГ. В частности, при изучении динамики антителообразования у белых мышей в процессе развития гуморального иммунитета к С-15 отмечено формирование антительного ответа в ранние сроки (на 3-7 сутки). При использовании в качестве биомодели морских свинок антительный ответ, несмотря на регистрацию в ранние сроки, стабилизировался на высоком уровне только к 42 суткам и сохранялся до 4,5 мес., через 6 мес. уровень антител приблизился к исходному.

Поскольку бактерии Р. ш1агет1ь при попадании в неблагоприятные условия экспрессируют ряд стрессовых белков, два из которых ОгоЕБ и СгоЕЬ были идентифицированы в составе С-комплекса, мы определяли влияние температуры выращивания (28°С, 37°С, 42°С) на изменение белкового состава Р. Магепзгэ 15 НИИЭГ. Было установлено, что состав суммарных клеточных белков не менялся, но с повышением температуры до 42°С увеличивалось количество белков, секретируемых в культуральную жидкость. Субъединичный состав С-комплекса не зависел от температуры культивирования.

Учитывая поверхностное расположение С-комплекса, был проведен эксперимент по определению участия данного антигена в формировании капсулоподобного вещества 1и1агепт. Для этих целей нами с помощью обработки клеток акридиновым оранжевым из культуры Р. Магемг? 15 НИИЭГ были получены Сар" штамм и субкультура в Я-форме. Сар'-мутант К шЬгеп-ч'и 15 НИИЭГ обладал чувствительностью к действию НКС и не вступал в специфическое взаимодействие с антительным диагностикумом в РНГА [Заг^гот С., 1988; Павлович Н.В. и др., 1993]. Колонии в Я-форме обладали сниженной активностью в РНГА 108 м.к./мл (по сравнению с исходным штаммом - 5*105 м.к./мл) и плохо суспендировались в 0,85 % растворе ИаС1 рН 7,2, но обладали устойчивостью к бактерицидному действию нор-

нормальной сыворотки. Полученные штаммы взаимодействовали с «С» в ИФА, ;ИА (2,5-1х10б м.к./мл) и иммуноблоттинге. При анализе состава С- ЬУБ было ус-ановлено, что по основным физико-химическим и иммунохимическим свойствам он сходен с аналогичными препаратами, выделенными из вакцинного и вирулентных штаммов Р. ийагепж. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что присутствие С-комплекса на поверхности клетки не зависит от формы ЛПС и в его состав не входят антигенные компоненты капсулоподобного вещества туляремий-ного микроба.

Выделение компонентов С-комплекса туляремийного микроба осуществляли при помощи химического (действие кислот, щелочей, высокой температуры, рас-воров детергентов, фенола) и ферментативного гидролиза (проназы Е, пепсина, протеиназы К). При этом было установлено, что С-15 термостабилен, устойчив к действию кислот и щелочей в диапазоне рН от 1,0 до 13,0. Применение детергентов привело к изменению электрофоретического белкового профиля антигена и позволило установить белковую природу компонентов С-комплекса с молекулярными массами от 23 до 57 кДа, тогда как остальные белковые фракции обладали устойчивостью к их действию. Фенольная экстракция позволила разделить препарат С-15 на три фракции: фенольную, на 70% состоящую из углеводных и липидных компонентов, водно-фенольную и водную, содержащие в своем составе мажорные белки С-15 (78-80% белка). Присутствие во всех полученных фракциях двух иммунореактив-ных компонентов с молекулярными массами в диапазоне 14-17 кДа свидетельствовало о липопротеидной природе этих субъединиц.

Установлена высокая чувствительность С-комплекса к действию пепсина, вызывающего полный его гидролиз, и протеиназы К, приводящей к гидролизу его белковой части и позволяющей получить компонент ЛПС природы, который имеет структуру, типичную для Б-формы грамотрицательных бактерий. Разработанный нами метод ферментативного гидролиза С-15 проназой Е позволил получить модифицированный препарат С-15 (С-15 М) с молекулярной массой 56 кДа по данным гель-хроматографии и содержащий в своем составе мембранный белок 41-43 кДа (рисунок 3), обладающий высокой антигенной и протективной активностью.

Полученные к С-15 М мышиные поликлональные антитела взаимодействовали в ДИА с франциселлами всех подвидов в концентрации 10б м.к./мл (рабочее разведение 1/10), причем в иммуноблоттинге выявлялись только специфические для туля-

ремийного микроба белки (43 и 17 кДа). Более низкая активность мышиных сывороток может быть связана с природой антигена (отсутствие ЛПС-компонента и ряда белков исходного С-комплекса).

»Яг--------

95—, 72 — 55 —

36-

17— 4 , , . ' / V. __ !

ю\.....' ...... —

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 Ч---5---«—-—»—п—

•Цш» (т(пи(м)

А - Иммуноблоттинг препарата С-15 на этапах ферментативного гидролиза: М - маркеры молекулярной массы; 1 - С-15 до гидролиза; время инкубации: 2-0 часов; 3-4 - один час; 5-6 - два часа; 7-8 - три часа; 9-10 - 4 часа; 11-12-5 часов; 13-14-6 часов.

Б - Гель-хроматография препарата С-15 М на БерЬасгу! Б-300: по оси абсцисс -время элюции, мин. По левой оси ординат - оптическая плотность элюента при 280 нм (А.и.), по правой оси ординат — электропроводность элюента т8/ст.

Рисунок 3. Результаты иммуноблотгинга и гель-хроматографии модифицированного препарата С-комплекса.

Были получены специфичные поликлональные сыворотки к С-комплексу туля-ремийного микроба, содержащие антитела против основных мажорных белков всех антигенов независимо от штамма-продуцента. Использование на первых этапах иммунизации кроликов инактивированных цельноклеточных экстрактов штаммов трех основных подвидов туляремийного микроба с последующим внутривенным введением очищенного препарата С-комплекса, позволило увеличить специфичность сывороток без снижения чувствительности. Сыворотки к С-15 выявляли в ИФА, ДИА и иммуноблотгинге вирулентные штаммы Р. Ш1агет1з разных подвидов, обладаю-

щие более богатым антигенным спектром. Была проведена адсорбция полученных сывороток для освобождения от неспецифического взаимодействия с клетками чумного и псевдотуберкулезного микробов. Анализ чувствительности и специфичности «С»-сыворотки в ДИА показал, что она превосходит КТС. Чувствительность КТС при разведении 1/100 для штаммов F. tularensis составляет 107 м.к./мл, тогда как кроличья сыворотка к С-комплексу, при тех же разведениях, выявляла 106 м.к./мл возбудителя. «С»-сыворотка обладала 100 % специфичностью для концентрации ге-терологичных штаммов 108 м.к./мл, тогда как при использовании КТС были отмечены перекрестные реакции с клетками Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Е. coli и S. paratyphi в концентрации до 107м.к./мл. Активность полученных Ig «С» была проверена на расширенной панели F. tularensis разных подвидов (65 штаммов) и в среднем (M±mt) составила в ИФА 752(±0,39)х105 м.к./мл, в ДИА - 8(±0,47)*105 м.кУмл. При определении влияния способа обработки (инактивации) бактериальных клеток на чувствительность ИФА и ДИА было установлено, что экспериментальные тест-системы чувствительнее при исследовании культур F. tularensis, инактивированных фенолом и глутаральдегидом без нагревания.

На основе антител к С-комплексу туляремийного микроба был получен экспериментальный латексный диагностикум, позволяющий выявлять Сар+ и Сар" штаммы F. tularensis в РСА на стекле и PJ1A микрометодом. Чувствительность PJIA для Сар+ штаммов составляла 5* 106 м.к./мл, для Сар' -107 м.к./мл.

Разработан способ ферментативного гидролиза Ig «С» пепсином с последующей хроматографической очисткой для получения Р(аЬ')2-фрагментов молекулы иммуноглобулина, которые обладали большей специфичностью по сравнению с исходным препаратом. Отработана экспериментальная технология изготовления на основе Ig «С» и его Р(аЬ')2-фрагментов видоспецифических конъюгатов: иммуноперок-сидазных и с коллоидными металлами, позволившими повысить чувствительность ИФА и ДИА для клеток F. tularensis до 104 м.к./мл и упростить методику постановки анализа, используя прямой вариант. При постановке МФА с использованием экспериментальных ФИТЦ-конъюгатов Ig «С» и Р(аЬ')2-фрагментов и коммерческого диагностикума (ИДТИ) было отмечено специфическое свечение возбудителя в мазках-отпечатках органов зараженных вакцинным и вирулентными штаммами F. tularensis разных подвидов белых мышей на 3 креста. При бактериологическом анализе этих же отпечатков органов был отмечен рост туляремийного микроба, патолого-

анатомическая картина у павших животных была характерной для туляремийной инфекции. При бактериоскопическом исследовании мазков-отпечатков, окрашенных по Романовскому-Гимзе, возбудитель туляремии обнаруживали только в некоторых пробах, что согласуется с литературными данными [Олсуфьев Н.Г., 1975; Сомова Н.М. и др., 1964].

Были проведены лабораторные исследования возможности применения разработанных методов ИФА и ДИА на основе ^«С» для обнаружения возбудителя туляремии в материале от лабораторных животных и для анализа природного материала. Исследование материала от 41 лабораторно зараженной белой мыши показало, что антигены возбудителя туляремии обнаружены ИФА в 34 пробах (83%), ДИА в 29 пробах (71%), бактериологическим методом в 15 пробах (36,6%) (таблица 3). Была отмечена 100% корреляция между результатами бактериологического анализа и экспериментальных иммунодиагностических тест-систем в период от 1-10 суток после заражения.

Таблица 3. Результаты обнаружения антигенов туляремийного микроба в суспензии печени и селезенки экспериментально зараженных белых мышей.

№ Заражающий Срок жизни животного Количество исследованных проб Количество положительных результатов

п/п штамм Бактериологический метод ИФА ДИА

1. Г. шЫгети 7 сут. 8 сут. 21 сут 3 1 6 3 1 0 3 1 6 3 1 3

В399 А Со1е

2. Р. 1и1агет1$ 503/840 7 сут. 8 сут. 21 сут. 3 2 6 3 2 0 3 2 4 3 2 4

5 сут. 4 4 4 4

7 сут. 2 2 2 2

3. К Ы1агегш1$ 14 сут. 2 0 2 2

15 НИИЭГ 21 сут. 6 0 2 -

1 месяц 3 0 2 2

2 месяца 3 0 3 3

При эпизоотологическом обследовании зеленой зоны Саратова на обнаружение антигенов туляремийного микроба было проанализировано 106 проб от фоновых

авотных данного региона. Положительные результаты получены ИФА и ДИА в 17 6%) и 15 (14%) случаях соответственно. При этом было отмечено, что положи-льные пробы встречались в трех из 15 исследованных природных эпитопов.

Разработанные иммунодиагностические тест-системы на основе С-комплекса из геток вакцинного штамма К tularensis 15 НИИЭГ позволяют выявлять противоту-фемийные антитела как в экспериментальных и коммерческих противотуляре-ийных сыворотках, так и у экспериментально зараженных и иммунизированных абораторных животных. Сэндвич вариант ДИА был использован для детекции зовня противотуляремийных антител, как одного из показателей напряженности ротивотуляремийного иммунитета у вакцинированных людей. Показана возмож-ость использования С-15 в иммуноблотгинге для регистрации туляремийной ин-екции у лабораторных животных.

Полученные в работе данные представляют научный и практический интерес, оскольку впервые было показано, что С-комплекс является общим антигеном для уляремийного микроба, независимо от подвида возбудителя. Впервые получены репараты С-комплекса из штаммов туляремийного микроба разных подвидов ho-irctica, nearctica, mediasiatica и novicída, проведен сравнительный анализ их струк-уры, антигенных, биохимических и иммунологических свойств. Разработанные пособы выявления и получения С-комплекса, его компонентов и специфических нтител могут служить основой для создания новых средств диагностики и профи-[актики туляремии.

ВЫВОДЫ

1. Получены препараты С-комплекса из вирулентных штаммов F. tularensis четырех подвидов и основных биоваров: holarctica eryR, holarctica eryS, holarctica japónica, nearctica, mediasiatica, novicida; и вакцинных штаммов. Выявлена высокая иммунохимическая активность и антигенная идентичность образцов С-комплекса, выделенных из всех подвидов, кроме subsp. novicida.

2. Препараты С-комплекса F. tularensis разных подвидов, кроме subsp. novicida, имеют молекулярную массу 280 кДа и содержат следующие иммунодоминантные полипептиды: 81-85, 57-60, 43, 23-27 и 14-17 кДа. С-комплекс регистрируется у туляремийного микроба независимо от формы ЛПС и наличия капсулы.

3. Антигенный С-комплекс разных подвидов туляремийного микроба индуцирует в организме лабораторных животных образование антител в ранние сроки и

влияет на формирование клеточного иммунитета, обладает протективной активностью - защищает лабораторных животных от гибели при экспериментальной инфекции, вызванной вирулентными штаммами голарктического, неарктического и среднеазиатского подвидов.

4. Особенности препарата С-1ЛаЬ 112 (преобладание углеводной и липидной частей над белковой, присутствие двух компонентов с молекулярными массами около 280 и 160 кДа (при гель-хроматографии на БерЬасгу1 Б-ЗОО), наличие дополнительных иммунохимически инертных высокомолекулярных субъединиц более 110 кДа, и отсутствие иммунодоминантных полипептидов 57-85 кДа) приводят к снижению его иммуногенности и протективности по сравнению с аналогичными антигенами из штаммов других подвидов.

5. Оптимизированы схемы гипериммунизации животных-продуцентов С-комплексом туляремийного микроба, позволяющие получать высокоактивные по-ликлональные сыворотки (чувствительность - 106 м.к./мл при 100% специфичности для концентрации гетерологичных штаммов 108 м.к./мл). Для детекции Е. ш1агет1$ в различных вариантах иммуноанализа, включая непрямой и прямой ИФА, сэндвич ИФА, непрямой ДИА, реакция слайд-агглютинации на стекле, реакция латекс-агллютинации микрометодом, МФА, прямым ДИА с золотой меткой, предлагается использовать антитела к С-комплексу и Р(аЬ')2-фрагменты ^«С». Минимально выявляется до 0,5-1,0 нг/мл антигена, чувствительность для клеток туляремийного микроба разных подвидов - 105-104м.к./мл.

6. Проведена оценка эффективности применения ИФА и ДИА на основе антител к С-комплексу туляремийного микроба для детекции К /м/агегаю в органах экспериментально зараженных животных и у ряда фоновых для Саратовской области видов животных при эпизоотологическом обследовании данного региона. Была отмечена 100% корреляция полученных результатов с данными бактериологического анализа и ИФА в период от 1 до 10 суток после заражения.

7. Применение С-комплекса туляремийного микроба в качестве маркерного антигена в ИФА (ДИА) и иммуноблоттинге позволяет определять специфические про-тивотуляремийные антитела в экспериментальных и коммерческих туляремийных сыворотках, при изучении динамики образования антител у иммунизированных, вакцинированных и экспериментально зараженных лабораторных животных в процессе развития гуморального иммунитета против Р. Магет'гз.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Волох O.A., Шепелев И.А., Храмкова Е.М., Ерёмин С.А., Дятлов И.А. Раз-аботка иммуноферментного анализа на основе С-комплекса туляремийного микро-а // Санит. охрана террит. государств участников СНГ: пробл. биол. безоп. и про-яводействия биотерроризму в совр. условиях: Матер. VI Межгосуд. науч.-практ. онф. - Волгоград, 2005. - С. 217-219.

2. Волох O.A., Ерёмин С.А., Шепелёв И.А., Храмкова Е.М., Авдеева Н.Г., Дятлов И. А. Разработка комплексного профилактического препарата против чумы и /ляремии // Инф. болезни: пробл. здравоохр. и военной медицины: Матер. Рос. на-ч.-практ. конф. - СПб, 2006. - С. 70.

3. Храмкова Е.М., Волох O.A., Шепелёв И.А., Ерёмин С.А. Использование репарата С-комплекса Francisella tularensis для определения противотуляремий-ых антител // Чрезвыч. ситуации междунар. значения в общественном здравоохр. и знит. охрана террит. государств-участников СНГ: Матер. VII Межгосуд. науч.-ракт. конф. - Оболенск, 2006. - С. 254-255.

4. Храмкова Е.М., Волох O.A., Шепелёв И.А., Ерёмин С.А., Дятлов И.А. Ис-ользование С-комплекса туляремийного микроба для создания диагностических гст-систем // Биотехнология. - 2007. - №2. - С. 72-77.

5. Храмкова Е.М., Волох O.A., Шепелёв И.А., Ерёмин С.А., Авдеева Н.Г. Ис-ользование антител к С-комплексу Francisella tularensis для выявления возбудите-я туляремии // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. об-ва эпидемиологов, микро-иологов и паразитологов. - Москва, 2007. - С. 91.

6. Храмкова Е.М., Шепелёв И.А., Волох O.A., Кузнецов О.С., Алёшина Ю.А., рёмин С.А. Изучение ответных реакций макроорганизма на введение С-комплекса уляремийного микроба // Совр. аспекты эпид. надзора за особо опасными инф. за-олеваниями на Юге России: Матер, науч.-практ. конф. - Ставрополь, 2007. - С. 52-154.

7. Волох O.A., Шепелёв И.А., Фирстова В.В., Храмкова Е.М., Авдеева Н.Г., амохвалова Ю.И., Ерёмин С.А., Дятлов И.А. Оценка иммунобиологической актив-ости препаратов С-комплекса возбудителя туляремии как перспективного компо-ента химических вакцин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2007. -ЬЗ.-С. 16-21.

8. Храмкова Е.М., Уткин Д.В., Шепелев И.А., Авдеева Н.Г., Волох O.A. Оценка чувствительности и специфичности антительных препаратов к С-комплексу туляремийного микроба // Совр. технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инф. бол. на террит. государств-участников СНГ: Матер. IX Межгосуд. на-уч.-практ. конф. - Волгоград, 2008. - С. 143-144.

9. Храмкова Е.М., Волох О. А., Шепелёв И.А., Авдеева Н.Г., Еремин С.А., Подборонова H.A. Применение антител к С-комплексу туляремийного микроба для детекции возбудителя туляремии методами иммуноанализа // Метод, докум. и отчеты по сан.-эпид. охране террит. Российской Федерации: Реферат, сб. - Саратов, 2009.-С.17-18.

10. Кузнецова Е.М., Волох O.A., Шепелёв И.А., Авдеева Н.Г. Разработка препарата для иммунодиагностики возбудителя туляремии // Биол. безоп. в совр. мире: Матер, науч.-пракг. конф. молодых ученых и специалистов науч.-исслед. уч-режд. Роспотребнадзора. - Оболенск, 2009. - С. 129-131.

11. Кузнецова Е.М., Волох O.A., Шепелёв И.А. Актуальные вопросы дифференциации подвидов Francisella tularensis II Научное обеспечение противоэпид. защиты населения: Мат. юбил. Всерос. науч.-практ. конф., поев. 90-летию ННИИ-ЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилакт. и борьбе со СПИД. - Н. Новгород, 2009. - С. 143-146.

12. Волох O.A., Кузнецова Е.М., Ерёмин С.А., Гусева Н.П., Шепелёв И.А., Авдеева Н.Г. Перспективы создания химической туляремийной вакцины // Научное обеспечение противоэпид. защиты населения: Мат. юбил. Всерос. науч.-практ. конф., поев. 90-летию ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилакт. и борьбе со СПИД. - Н. Новгород. - 2009. - С. 329-331.

13. Кузнецова Е.М., Шепелёв И.А., Волох O.A. Структурно-функциональная характеристика основных антигенов Francisella tularensis Н Проблемы особо опасных инфекций - 2009. - Вып. 2 (100). - С. 44-49.

Подписано к печати 10.09.2010 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать лазерная. Гарнитура «Тайме». Усл.-печ. л. 1. Тираж 100.

Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузнецова, Екатерина Михайловна, Саратов

61 12-3/965

ФЕДЕРАЛЬНОЕ КАЗЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ «МИКРОБ» ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи

Кузнецова Екатерина Михайловна

ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА И КОНСТРУИРОВАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, О.А. Волох

Саратов -2012

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВМ - внешняя мембрана

ДИА - дот-иммуноанализ

ИДТЛ - иммуноглобулины диагностические туляремийные

люминесцирующие

ИФА - иммуноферментный анализ

КОЕ - колониеобразующая единица

ЛПБК - липополисахаридо-белковый комплекс

ЛПС - липополисахарид

м.к. - микробная клетка

МкАт - моноклональные антитела

МФА - метод флуоресцирующих антител

НАФ - неполный адьювант Фрейнда

НКС - нормальная кроличья сыворотка

НЛС - нормальная лошадиная сыворотка

ООИ - особо опасные инфекции

п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

РДП - реакция диффузионной преципитации в агаровом слое

РЛА - реакция латекс агглютинации

РНАт - реакция нейтрализации антител

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

DCL - абсолютная летальная доза

ED50 - средняя иммунизирующая доза

LD50 - доза летальная для 50 % животных

NTS - блокирующий буферный раствор

PBS - фосфатно-солевой буферный раствор

SDS - додецилсульфат натрия

SDS- PAGE -электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 6 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Дифференциация подвидов РгапсьчеНа шЬгетгя 13

1.2. Структурно-функциональная характеристика основных 19 антигенов туляремийного микроба

1.3. Способы детекции и идентификации возбудителя туляремии 32 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41

2.1. Бактериальные штаммы 41

2.2. Питательные среды и условия культивирования штаммов 42

2.3. Реактивы и лабораторные животные 43

2.4. Получение антигенов и их комплексов 44

2.5. Получение кроличьих иммунных сывороток и антительных препаратов 44

2.6. Биохимические и иммунохимические методы исследования 45

2.7. Иммунологические методы исследования 48

2.8. Статистическая обработка 48 ГЛАВА 3. ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННЫХ

КОМПЛЕКСОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА И

ХАРАКТЕРИСТИКА ИХ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА 49

3.1. Идентификация компонентного состава протективного антигенного комплекса туляремийного микроба 49

3.2. Оптимизация способов получения антигенных компонентов протективного антигенного комплекса туляремийного микроба и их характеристика 52

3.2.1. Химический гидролиз протективного антигенного комплекса 53

3.2.2. Ферментативный гидролиза протективного антигенного комплекса 56

3.3. Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба 63

ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРЕПАРАТОВ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕННОГО КОМПЛЕКСА ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ РАЗНЫХ ПОДВИДОВ 68

4.1. Структурная и функциональная характеристика протективного антигенного комплекса, продуцируемого штаммами разных подвидов 68

4.2. Иммунобиологические свойства препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из штаммов-продуцентов туляремийного микроба разных подвидов 76

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ И СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ 84

5.1. Получение поликлональных антител к протективному антигенному комплексу туляремийного микроба 84

5.2. Разработка экспериментальных препаратов для детекции возбудителя туляремии 89

5.3. Разработка экспериментальных препаратов для детекции туляремийных антител 100

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107

ВЫВОДЫ 117

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119

ВВЕДЕНИЕ

Туляремия - зоонозная природно-очаговая инфекция, возбудитель которой, Francisella tularensis, может вызвать вспышки заболевания среди широкого круга хозяев, включая человека, что представляет серьезную проблему для практического здравоохранения. Эндемичные очаги туляремии характеризуются стабильностью проявления и широко распространены, в том числе на территории Российской Федерации и соседних стран [Tärnvik A. et al., 2004; Топорков В. П. и др., 2007; Мещерякова И. С. и др., 2007; Окунев JI. П., Мазепа A.B., 2011; Wang Y. et al., 2011]. Специалистами Роспотребнадзора отмечается, что ослабление внимания к туляремии может привести к серьезным эпидемическим осложнениям, подтверждением чему служит резкий подъем заболеваемости в 2005 г. [Онищенко Г. Г., 2006; Безсмертный В. Е. и др., 2008; Кологоров А. И. и др., 2010]. Кроме того, возбудитель туляремии включен в высшую категорию А как потенциальный агент биотерроризма [Dennis D. et al., 2001; Gallagher-Smith M. et al., 2004]. Несмотря на достигнутые успехи в исследовании особенностей строения и биологии туляремийного микроба, факторы патогенности этого возбудителя, состав капсулы и протективные антигены окончательно не изучены [Havlasova J. etal., 2002; Sjöstedt А., 2003; Eyles J.E., 2007; OystonP.C.F., 2008; Santic M., 2010; Broms J. E. etal., 2011].

Лабораторная диагностика туляремии основывается на иммунологических (се-роаллергологическая диагностика) и бактериологических методах, в настоящее время дополнена молекулярно-генетическими методами [Лаб. диагност. ООИ, 2009]. Из иммунодиагностических методов в отечественной практике наиболее распространены реакция агглютинации и реакция непрямой гемагглютинации, недостатками которых являются возможность перекрестного реагирования с возбудителем бруцеллеза и невысокая чувствительность [Олсуфьев Н. Г., 1975; Мишанькин Б. Н. и др., 1998; Сырова Н. А., 2008]. Экспресс-методом специфической индикации возбудителя туляремии является широко применяемый метод флуоресцирующих антител, который эффективен для детекции F. tularensis в различных субстратах [МУ 3.1.2007-05]. В области разработки новых способов детекции туляремийного микроба ведутся активные исследования [Splettstoesser W. D. et al., 2005; Осина H. А. и др., 2007; Романова Л. В., 2008; Johansson A. et al., 2010; Ветчинин С. С. и др., 2011; Larson M. F. et al., 2011].

У возбудителя туляремии ЛПС и белки ВМ влияют на специфичность иммунного ответа макроорганизма, обладают уникальной полиэпитопной антигенной структурой и рассматриваются как перспективные антигены для создания профилактических и диагностических препаратов [Родионова И.В., Захаренко В.И., 1990; Хлебников B.C. и др., 1992, 1993; Аронова Н. В., Павлович Н. В. 2000; Ellis J. et al., 2002; Conlan J. W. 2004; OystonP. C. F., 2008; Beasley A. S. et al., 2011; Zarella Т. M. et al., 2011]. Большое внимание уделяется исследованию комплексных антигенов F. tularensis [Tärnvik A., Berglund L., 2003; Splettstoesser W. D. et al., 2005; Pierson T. et

al., 2011]. В частности, оценка эффективности разработанных иммуиодиагностических_

тест-систем показала, что ИФА на основе препаратов ЛПС F. tularensis или отдельных белков ВМ (43 и 17 кДа) обладают более низкой чувствительностью (96,5-99,0 %) и специфичностью (96-97 %), чем на основе комплекса белков ВМ - 100 % специфичность и чувствительность [Carlsson Н. Е. et al., 1979; Koskela Р., Salminen A., 1985; Bevanger L. et al., 1988, 1989; Schmitt P. et al., 2005; Splettstoesser W. D. et al., 2005].

Получаемые по классическому методу A. Boivin (1933) липополисахари-до-белковые комплексы возбудителя туляремии содержат до 10 % белка и характеризуются высокой серологической активностью [Родионова И. В., Шипицина Г. К., 1967]. В зависимости от способа получения ЛПБК имеют различный состав, молекулярную массу и свойства. В частности, установлена высокая иммунобиологическая активность ЛПБК ВМ F. tularensis, полученного с помощью обработки бактериальных клеток ультразвуком с последующим ультрацентрифугированием, с содержанием 12-22 % белка (25 белковых фракций) и 40 % липидов [Хлебников В. С. и др., 1991]. При обработке ВМ растворами детергентов с последующей гель-фильтрацией был получен высокоактивный ЛПБК (IV фракция, 15-35 кДа) с соотношением ЛПС:белок 1:1 [Хлебников В. С. и др., 1992, Кулевацкий Д. П., 1994]. Показано, что в составе препаратов ЛПБК присутствуют иммунодоминантные белки с молекулярными массами 17 и 43 кДа [Аверин С. Ф. и др., 1992; Кулевацкий Д. П., 1994] и белок-шаперон 63 кДа (GroEL) [Коровина О. В., 1993]. Комплекс ЛПС-17 кДа белок рассматривается в качестве прототипа химической туляремийной вакцины [Khlebnikov V. S .et al., 1996], также как и один из препаратов ЛПБК ВМ F. tularensis - С-комплекс [Жемчугов В. Е., 2004; Патенты РФ 2147234,2221591]. При оптимизации схемы выделения С-комплекса туляремийного микроба в условиях масштабированного культивирования штам-

ма-продуцента Ш1агет1х 15 НИИЭГ был разработан метод его изоэлектрической преципитации [Шепелев И. А., 2005]. С использованием этого подхода нами был получен препарат ЛПБК туляремийного микроба, отличающийся от остальных ранее описанных в литературе комплексных антигенов молекулярной массой, увеличением белкового компонента (более 60 %) и высокой протективной активностью при экспериментальной туляремии. Этот препарат ЛПБК получил авторское название протек-тивный антигенный комплекс - ПАК [Кузнецова Е. М. и др., 2011].

Несмотря на достигнутые успехи в исследовании антигенных комплексов ВМ К ш1агет18 важными условиями при разработке современных эффективных медицинских иммунобиологических препаратов, остаются совершенствование приемов выделения антигенов в иммунологически активной форме. Изучение особенностей состава и свойств комплексных антигенов туляремийного микроба разных подвидов позволит провести их детальную характеристику.

Цель исследования. Получить диагностически значимые антигенные комплексы Р. ш1агет1з и сконструировать на их основе экспериментальные иммунодиагности-ческие препараты.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать способы получения иммунохимически активных антигенных комплексов туляремийного микроба.

2. Провести сравнительный анализ полученных препаратов антигенных комплексов туляремийного микроба разных подвидов.

3. Получить высокоактивные поликлональные иммунные сыворотки к про-тективному антигенному комплексу туляремийного микроба и сконструировать на их основе экспериментальные иммунодиагностикумы для детекции возбудителя туляремии.

4. Разработать на основе антигенных комплексов туляремийного микроба экспериментальные препараты для детекции специфических антител.

Научная новизна исследования. Оптимизированы способы получения биомассы Р. tula.ren.sis для последующего выделения биологически активных антигенов. Приоритетность работы в данном направлении подтверждена оформлением заявки № 2010131275 на изобретение «Способ получения биомассы туляремийного микроба» (приоритет от 26.07.10 г). Для получения иммунохимически активных антигенных

комплексов туляремийного микроба были усовершенствованы способы их выделения и количественного определения. Выделен и охарактеризован гликозилированный белковый комплекс туляремийного микроба, обладающий выраженной иммуноген-ностью и высокой специфичностью, хроматографически гомогенный, с молекулярной массой (57±1) кДа, состоящий из двух белковых субъединиц (43 и 14-17 кДа). Выделен протективный антигенный комплекс, установлен его компонентный состав: субъединицы с молекулярными массами более 23 кДа имеют белковую природу, 14-17 кДа -липопротеидную. С помощью протеомного анализа в составе протективного антигенного комплекса впервые показано наличие следующих идентифицированных белков: белков-шаперонов (GroES и GroEL), ферментов (GAPDH, KatG, АсрР), белков ВМ (OmpH, FTL 0617) и регуляторных белков (EF-Tu, RplL). Установлено, что протективный антигенный комплекс является видоспецифичным антигеном, регистрируется у F. tularensis независимо от подвидовой принадлежности штамма, формы ЛПС бактериальной клетки и наличия капсулы.

Впервые на основе сравнительного анализа структуры и свойств препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из штаммов F. tularensis subsp. holarctica биоваров eryR, eryS, japónica, subsp. nearctica, subsp. mediaasiatica, установлено, что все препараты обладают иммуногенностью, сходны по химическому составу и содержат иммунохимически активные субъединицы (10-85 кДа). Антигенный комплекс из F. tularensis subsp. novicida отличается от ПАК других подвидов более низкой (в 5 раз) иммунохимической активностью, увеличением содержания углеводной части на (70±3) %, наличием субъединиц с молекулярной массой более 110 кДа и отсутствием иммунореактивных белков в области 57-85 кДа.

Сконструированы экспериментальные антительные и антигенные туляремий-ные диагностику мы. Использование ПАК и гликозилированного белкового комплекса в качестве маркерных антигенов в иммуноблоттинге, ИФА и ДИА позволяет определять туляремийные антитела в крови вакцинированных и экспериментально зараженных лабораторных животных. Чувствительность экспериментальных антительных диагностикумов для детекции возбудителя туляремии разных подвидов иммунодиаг-ностическими методами (ИФА, ДИА) составляет 104-105 м.к./мл. Сконструированный иммуносуспензионный диагностикум в РЛА позволяет выявлять содержащие капсулу (Сар+) и бескапсульные (Сар") штаммы F. tularensis в отличии от коммерческого ди-

агностикума для РНГА, выявляющего только Сар+-штаммы.

Практическая значимость. По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Применение антител к С-комплексу туля-ремийного микроба для детекции возбудителя туляремии методами иммуноанализа» и «Получение гликозилированного белкового комплекса внешних мембран клеток ту-ляремийного микроба», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 17.04.2008 г. и протокол № 5 от 22.09. 2011 г., соответственно) и утвержденные директором института.

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирован бескапсульный штамм К Ы^гетгэ ¡го1агсйса КМ 9, производный вакцинного штамма Т7. Ш1агет1я 15 линии НИИЭГ, который может быть использован при создании диагностических туляремийных тест-систем для детекции Сар" штаммов.

Выделенные препараты ПАК разных подвидов используются при выполнении научно-экспериментальных работ в лабораториях вакцинологии и иммунопрофилактики, иммунодиагностики и молекулярной диагностики РосНИПЧИ «Микроб». Научные данные об особенностях антигенного строения туляремийного микроба, полученные в результате работы, включены в теоретический материал при чтении лекций цикла «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии» на курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования по специальности «бактериология» в институте «Микроб».

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях», Волгоград, 2005, на Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины», Санкт-Петербург, 2006, на VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ», п. Оболенск, 2006, на IX Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2007, на научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора

за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России», Ставрополь, 2007, на IX Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», Волгоград, 2008, на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире», п. Оболенск, 2009, на Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения», Нижний Новгород, 2009, на X Межгосударственной научно-практической конференции «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитар-но-эпидемического благополучия населения государств-участников СНГ», Ставрополь, 2010, на научно-практической конференции молодых ученых Роспотребнадзора «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения», Н. Новгород, 2011, на III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора, п. Оболенск, 2011, на ежегодных научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2005-2011 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, из них 5 статей в изд