Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis

Павлов, Виталий Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis"

На правах рукописи

Павлов Виталий Михайлович

МЕТОДОЛОГИЯ И РЕЗУЛЬТАТЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ ВАКЦИННОГО ШТАММА ЛШС18ЕИА ТЬЧ.АПГЛШ

03.02.03- микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

0боленск-2011

1 / г.:;,? 2зп

4840683

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор медицинских наук, профессор Дятлов Иван Алексеевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: академик РАМН,

доктор биологических наук, профессор Зверев Виталий Васильевич доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Станислав Степанович доктор медицинских наук, профессор Дядищев Николай Романович

Ведущая организация - Научио-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится «2.6» 2011г. в « 13 » часов на заседании

диссертационного совета Д 208.078.01 при Государственном научном центре прикладной микробиологии и биотехнологии по адресу: 142279, Московская область, Серпуховской район, пос. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии

Автореферат разослан « ¿1 У » О 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Н. К. Фурсова

Актуальность проблемы

Разработка современных лекарственных препаратов для лечения инфекционных заболеваний и средств их профилактики основывается на детальных данных о молекулярных структурах факторов патогенности и механизмах их действия. В частности, для создания вакцин важно знать, какие антигены являются протективными, а какие компоненты бактерий подавляют защитную функцию иммунной системы организма. История изучения возбудителя туляремии насчитывает более ста лет, однако до настоящего времени нет исчерпывающих сведений о факторах патогенности бактерий Francisella tularensis, их молекулярных структурах и механизмах действия (Titball R. W. et al„ 2003; До-марадский И. В., 2004; Sjostedt А., 2006). Исследование генома туляремийного микроба является одним из магистральных направлений решения проблем, связанных с разработкой новых и совершенствованием уже имеющихся средств и методов борьбы с туляремией. Проведенные недавно работы по определению нуклеотидных последовательностей геномов аттснуированного вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica LVS [ННр://ЬЬф.11п1^оу/ЬЬф/Ь1т1/гшсгоЬе. html] и природного вирулентного штамма F. tularensis subsp. tularensis Schu4 (Larsson P. et al, 2005) открыли широкие перспективы для изучения факторов патогенности и поиска протективных антигенов туляремийного микроба.

До недавнего времени адаптация общепринятых генетических методов для исследования генома F. tularensis представляла собой достаточно сложную проблему, что существенно препятствовало эффективному применению всего современного методического потенциала микробиологии для решения задач по выявлению факторов патогенности и иммуногенности туляремийного микроба.

Детальное исследование молекулярной структуры криптической плазми-ды из бактерий К novicida like F6168 (Родионова И. В. и др. 1991) позволит получить новые данные о влиянии данной плазмиды на биологические свойства бактерий рода Francisella и получить информацию, необходимую для конструирования плазмидных векторов. Важным этапом в исследованиях геномов микроорганизмов является перенос генетических структур в бактериальные клетки изучаемых микроорганизмов. Отсутствие информации о плазмидах,

способных реплицироваться в F. tularensis, до последнего времени сдерживало адаптацию переноса ДНК в клетки туляремийного микроба методами трансформации. Оптимизация методов криотрансформации и конъюгации для F. tularensis позволит переносить в бактерии генетические конструкции для ал-лельного обмена и создавать модельные штаммы для изучения метаболизма туляремийного микроба.

Показано, что бактерии штамма F. tularensis LVS модулируют белковый синтез во время роста в макрофагах. Среди белков, индуцируемых при размножении бактерий F. tularensis внутри макрофагов, выделяется белок с молекулярной массой 23 кДа (Golovliov I. et al., 1997). Однако, функциональная роль этого белка в патогенезе F. tularensis до последнего времени выяснена не была. Одним из путей решения этой проблемы могло бы стать создание метода ал-лельного обмена генов в хромосоме F. tularensis, позволяющего конструировать изогенные штаммы, отличающиеся только по изучаемому гену.

Первичным защитным барьером прокариотических и эукариотических клеток являются белки семейства суперокиддисмутаз (СОД), которые превращают токсичный радикал 02~ в молекулярный кислород (02) и перекись водорода (Н2Од) (Miller R. A. et al., 1997). У туляремийного микроба также выявлена СОД (Шимоняк Н. И. и др., 1992), тем не менее, роль этого фермента в патогенезе туляремии и в бактериальном метаболизме до последнего времени не была выяснена. Попытки инактивации СОД в других патогенных микроорганизмах приводили к потере жизнеспособности бактерий. Поскольку метод аллельного обмена позволяет не только инактивировать гены, но и модулировать их синтез, этот подход может быть использован для изучения СОД туляремийного микроба.

Живая туляремийная вакцина на основе штамма F. tularensis 15/10 была создана в СССР в 40-50 годах двадцатого столетия (Олсуфьев Н. Г., 1975). На основе этого же штамма в США был получен штамм F. tularensis LVS и создана экспериментальная живая вакцина (Eigelsbach Н. Т. el al, 1961).

Поскольку обе вакцины обладают определенной реактогенностью, обусловленной не охарактеризованными пока факторами патогенности (Олсуфь-

евН. Г., 1975), то проводимый в настоящее время сравнительный анализ нук-леотидных последовательностей геномов вакцинного штамма LVS и природных штаммов, несомненно, облегчит задачу создания генетически охарактеризованного современного вакцинного штамма без остаточных факторов реакто-гсниости. Очевидно, что без эффективных методов целенаправленного аллсль-ного замещения невозможно достижение существенных успехов в понимании молекулярных основ действия факторов как реактогенности, так и иммуноген-ности туляремийного микроба.

В качестве бактериальных векторов для получения рекомбинантных вакцин используют целый ряд микроорганизмов, среди которых: аттенуированные штаммы М. tuberculosis (Ellner J.J., 1998; Senaratne R.H,etal, 2007; Henao-Tamayo M. et a!., 2007), близкородственные микобактерии (Abou-Zeid С. et al., 1997),а также сальмонеллы (Mollenkopf H.J. etal., 2001) и некоторые другие (Miki К. et al., 2004). Известно, что туляремийная вакцина, обладая умеренной рсактогснностью, вызывает формирование длительного напряженного иммунитета (Tarnvik А., 1989). Кроме специфического иммунитета вакцинные штаммы F. tularensis индуцируют краткосрочную неспецифическую защиту против других внутриклеточных патогенов (Legionella, Listeria и др.) (Belyi Y. F. et al., 1996). До последнего времени изучение иммуномодулирующих свойств штамма F. tularensis 15/10 сдерживалось из-за отсутствия генетических методов по переносу дополнительных генов, кодирующих протективные антигены, в клетки вакцинного штамма туляремийного микроба. Изучение иммунобиологических свойств вакцинного штамма туляремийного микроба с гетерологичными протективными антигенами (в частности, наиболее иммупогенными антигенами М. tuberculosis Ag85B и ESAT-6) позволит оценить потенциал вакцинного туляремийного штамма в качестве нового бактериального вектора.

Все вышеизложенное обосновывает актуальность разработки молекулярных инструментов для всестороннего исследования туляремийного микроба. Полученные модифицированные штаммы туляремийного микроба смогут открыть новые перспективы для изучения иммунобиологических свойств туляремийно-

го микроба и получить детальную информацию о факторах патогенности и им-муногенности F. tularensis.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является разработка методологии молекулярно-генетического изучения F. tularensis и оценка с ее помощью роли отдельных генетических структур в иммунопатогенезе туляремийной инфекции.

Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Адаптировать и оптимизировать условия переноса плазмидных ДНК в клетки F. tularensis методами трансформации, конъюгации и мобилизации.

2. Определить и проанализировать нуклеотидную последовательность криптической плазмиды из бактерий F. novicida like F6168, а также исследовать функциональную активность выявленных плазмидных генов.

3. Создать ряд плазмидных векторов для клонирования промоторов и экспрессии гетерологичных генов протективных антигенов в F. tularensis и изучить их свойства.

4. Создать варианты вакцинного штамма F. tularensis 15/10, синтезирующие протективные антигены возбудителя туберкулеза, и изучить иммунобиологические свойства полученных штаммов.

5. Разработать систему аллельного замещения генов в хромосоме ту-ляремийного микроба и способ получения вариантов вакцинного штамма F. tularensis с модифицированными генами iglC и sodB.

6. Изучить иммунобиологические свойства полученных вариантов F. tularensis 15/10 и штамма LVS, дефектных по генам iglC и sodB.

Новизна исследования

Впервые разработана система для аллельного замещения генов в хромосоме F. tularensis. Созданы плазмидные векторы для конструирования плазмид, необходимых для осуществления аллельного обмена в хромосоме F. tularensis. Предложенный метод позволяет: а) удалять определенные участки генома

F. tularensis, б) модифицировать регуляторные и другие области опсронов; в) получать генетически маркированные вакцинные штаммы F. tularensis.

Впервые в геноме F. tularensis выявлены две копии гена iglC, кодирующего белок с молекулярной массой 23 кДа, и показана необходимость продукта гена iglC для внутримакрофагального размножения вакцинного штамма F. tularensis. Вариант вакцинного штамма без генов iglC не защищал вакцинированных мышей от гибели при заражении штаммом F. tularensis 503.

Показано снижение экспрессии гена sodß в F. tularensis в результате замены последовательности нуклеотидов инициирующего кодона ATG на GTG в гене sodB. Вакцинный штамм со сниженным уровнем синтеза белка СОД В обладает меньшей вирулентностью для мышей, чем немодифицированный вакцинный штамм.

Впервые показана возможность введения плазмид в вакцинный штамм туляремийного микроба методом криотрансформации. Оптимизированы условия криотраисформации F. tularensis.

Впервые показана возможность мобилизации плазмид из клеток Escherichia coli в клетки F. tularensis и оптимизированы условия межвидового скрещивания. Созданы мобилизуемые плазмидные векторы, позволяющие переносить фрагменты ДНК из Е. coli в F. tularensis.

Впервые получен вариант конъюгативной плазмиды pSa, способный с высокой эффективностью переноситься из Е. coli в F, tularensis и, наоборот, из F. tularensis в Е. coli.

Проведено структурно-функциональное исследование критической плазмиды из рода Francisella - плазмиды pFNLIO. Выявлена способность плазмиды pFNLIO стабильно реплицироваться в клетках вакцинного штамма туляремийного микроба. Показано, что вклад в стабильность наследования плазмиды pFNLIO бактериями F. tularensis вносят продукты плазмидных генов, кодирующих белки, гомологичные белкам Phd-Doc системы фага Р 1.

Впервые созданы стабильные плазмидные векторы для вакцинного штамма F. tularensis, позволившие приступить к изучению возможности ис-

пользования туляремийного вакцинного штамма в качестве реципиента при создании современных рекомбинантных вакцинных штаммов.

Впервые на основе F. tularensis 15/10 созданы штаммы, синтезирующие протективные антигены возбудителя туберкулеза. Показан повышенный синтез клетками F. tularensis гибридных белков, состоящих из лидерной части предшественника основного белка внешней мембраны F. tularensis Fop А и белкового антигена М. tuberculosis.

Впервые показано формирование специфического иммунного ответа на туберкулезные антигены у мышей, вакцинированных штаммами F. tularensis, синтезирующими протективные антигены возбудителя туберкулеза. Вакцинированные мыши обладали повышенной устойчивостью к аэрозольному заражению возбудителем туберкулеза.

Показана принципиальная возможность использования туляремийного вакцинного штамма в качестве реципиента при создании прототипов рекомбинантных вакцинных штаммов.

Практическая значимость

Разработана простая и надежная методология направленного конструирования неревертирующих мутантов F. tularensis, сочетающая локализованный мутагенез in vitro и гомологичную рекомбинацию in vivo, а также позволяющая получать достоверные данные о роли выбранных генов в проявлении патогенных и иммуногенных свойств возбудителя туляремии.

Оптимизированы способы стабилизации наследования и экспрессии генетической информации в клетках F. tularensis и подобраны векторы, обеспечивающие стабильную продукцию туберкулезных антигенов в клетках вакцинного штамма F. tularensis.

Сконструированы штаммы F. tularensis RVpl7 и RVplS, способные к синтезу основных протективных антигенов возбудителя туберкулеза, которые могут служить основой для разработки новой рекомбинантной живой туберкулезной вакцины.

В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) депонированы 11 авторских штаммов, необходимые

для изучения генетических детерминант факторов иммуногснности и патогенное™ возбудителя туляремии, а также сайт-направленного мутагенеза туляре-мийного микроба.

Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при составлении ниже перечисленных документов: Методические указания МУ 3.3.1.2161-07 «Основные требования к вакцинным штаммам тулярс-мийного микроба» (Федеральный уровень внедрения, 2007 г.), Методические рекомендации «Сайт-направленный мутагенез генома туляремийного микроба» (Учрежденческий уровень внедрения, 2003 г.) и Методические рекомендации «Сайт-направленный мутагенез генома туляремийного микроба» (Учрежденческий уровень внедрения, 2009 г.)

Положения, выносимые на защиту:

1. Комплекс методических приемов, позволяющих переносить плазмиды в бактерии F. lularensis 15/10 методами криотрансформации и мобилизации. Вариант конъюгативной плазмиды pSa, при скрещивании который способен переходить из клеток Е. coli в бактерии F. tularensis 15/10 и обратно. Методология переноса плазмид в клетки F. tularensis позволяет создавать генетически маркированные штаммы, необходимые для всестороннего изучения факторов иммуногенности и патогенности туляремийного микроба.

2. Плазмида pFNLIO, выделенная из штамма F. novicida like F6168, способна реплицироваться в F. tularensis и содержит все элементы для репликации по тета-механизму. Наличие в плазмиде pFNLIO генов, кодирующих белки, гомологичные белкам Phd-Doc системы, обуславливает высокую стабильность наследования данной плазмиды бактериями F. tularensis. Плазмида pFNLIO является основой для создания плазмидных векторов для F. tularensis.

3. Плазмидные векторы для F. tularensis, позволяющие клонировать промоторы и экспрессировать гетерологичные гены протективных антигенов в вакцинном штамме туляремийного микроба. Высокоэффективный способ

экспрессии протективных антигенов М. tuberculosis в вакцинном штамме F. tularensis 15/10.

4. Штаммы F. tularensis, экспрессирующие микобактериальные антигены Ag85B и ESAT-6, которые индуцируют противотуберкулезный Т-клеточный иммунный ответ у вакцинированных мышей и создают специфическую защиту мышей на модели легочной формы туберкулеза.

5. Способ целенаправленного создания вариантов вакцинного штамма F. tularensis с модифицированными генами и делециями в хромосоме, основанный на методе аллельного обмена.

6. Ген iglC в хромосоме F. tularensis находится в двух копиях. Направленное "выключение" синтеза 23 кДа белка кодируемого геном iglC, в штаммах F. tularensis 15/10 и LVS приводит к подавлению способности клеток F. tularensis к внутримакрофагальному размножению.

7. Продукт гена sodB F. tularensis необходим для жизнеспособности туляре-мийного микроба. Замена инициирующего кодона ATG на GTG в гене sodB приводит к снижению уровня экспрессии гена sodB в клетках F. tularensis. Штамм F tularensis FtsodB , несущий модифицированный ген sodB, обладает сниженной вирулентностью для мышей по сравнению с исходным штаммом F. tularensis LVS.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены и представлены на 35 международных и 7 российских научных конференциях: Всесоюзной научной конференции «Актуальные проблемы профилактики туляремии» (Симферополь, 1991); XIV научно-практической конференции ГосНИИ ПМ "Новые технологии и биосистемы. Достижения и перспективы" (Оболенск, 1991); Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград, 1992); Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, 1993); Международной конференции "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000); Юбилейной научной конференции, посвящен-

ной 75-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 2003); 3-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Оболснск, 2006); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммуно-биологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); First International Conference on Tularemia (Umea, Sweden, 1995); Second International Conference on Tularemia (Hra-dec Kralove, Czech Republic, 1997); 3rd International Conference on Anthrax (University of Plymouth, UK, 1998); International Conference 'Problems of Medical and Ecological Bioteclwology (Obolensk, 1999); 4th International Conference on Tularemia (City of Bath, UK, 2003); First International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology "BioMicroWorId-2005" (Badajoz, Spain, March, 2005); NIAID Research Conference (Opatia, Croatia, 2006); 5th International Conference on Tularemia Marine Biological Labs (Woods Hole, MA, USA, 2006).

Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторной научном семинаре ГНЦ ПМБ 30 июня 2010 г. протокол № 15.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 40 научных работ, в том числе 12 статей, представленных в научных журналах, рекомендованных ВАК; один патент и одна заявка на патент.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Работа состоит из введения; обзора литературы; собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть; заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 240 страницах, содержит 23 таблицы и 56 рисунков. Список литературы включает 215 работ.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Глава 1. Обзор литературы

В первых разделах главы обобщены данные о возбудителе туляремийной инфекции. Приведена современная классификация бактерий рода Francisella,

основанная на анализе нуклеотидных последовательностей туляремийных геномов. Изложены этапы истории создания живой туляремийной вакцины и попытки конструирования эффективных препаратов корпускулярных и химических туляремийных вакцин. Проанализирована литература об особенностях противотуляремийного иммунитета на основании данных, полученных, главным образом, на мышиной модели туляремии. Основная часть обзора посвящена работам по генетическому обмену у F. tularensis. Особое внимание уделено вопросам переноса плазмид и генов в клетки F. tularensis, влияния на этот процесс видовой и подвидовой принадлежности реципиента, а также системы рестрикции-модификации. Другим важным вопросом, освещенным в обзоре, является гомологичная рекомбинация в клетках F. tularensis. Важной частью обзора литературы является раздел о плазмидах, способных реплицироваться и экспрессироваться в туляремийном микробе. Рассмотрены подходы использования таких плазмид в качестве основы для создания молекулярных инструментов изучения F. tularensis.

Заключительная часть обзора посвящена работам по исследованию факторов патогенности и иммуногенности F. tularensis, проведенным в последние годы с использованием молекулярно-генетических методов.

Глава 2. Материалы и методы

В работе были использованы 2 штамма F. tularensis, 20 штаммов Е. coli, 3 штамма М. tuberculosis и штамм М. bovis BCG. Бактериальные штаммы были получены из ГКПМ-Оболенск. Штамм F. tularensis LVS был любезно предоставлен Карен Элкинс (Национальный институт здоровья, США).

Бактерии Е. coli выращивали в L-бульоне или L-arape (Маниатис Т. С. и др., 1984), при необходимости добавляли антибиотики: ампициллин (Ар), хлорамфеникол (Cm) или тетрациклин (Тс) в концентрациях 50, 10 и 20 мг/л, соответственно.

Клетки F. tularensis выращивали на плотной питательной среде ТА следующего состава: эритрит-агар, 1 % высушенной крови крупного рогатого скота, 1 % глюкозы, 0,05 % цистеина, 0,0025 % тиамина хлорида, pH 7,2, либо на

FT-агаре (ФГУН ГНЦ ПМБ, Оболенск), при необходимости в среду добавляли антибиотики: сульфат полимиксина В (Рт) (100 мкг/мл), Cm (3-10 мг/л), Тс (3-10 мг/л). При выращивании бактерий F. tularensis в жидкой питательной среде использовали питательную среду ТВ (Лапин А. А. и др., 2010) или питательную среду Чемберлена (Chamberlain Medium) (Chamberlain R.E., 1965).

Штамм M. tuberculosis H37Rv культивировали на жидкой питательной среде Middlebrook 7Н9 или на твердой агаризованной среде Middlebrook 7Н11 (Himedia Laboratories Pvt.Limited, Индия). Штаммы M. bovis BCG и M. tuberculosis H37Ra культивировали на глицерин-альбуминовой среде (конечная концентрация БСА - 0,1 %) без добавления Tween-20 при температуре 37 °С в течение 20 сут в атмосфере 0,5 % С02.

В работе использовали беспородных белых мышей массой (19 ± 2) г, мышей линии Balb/C, кроликов породы шиншилла из вивария ГНЦ ПМБ. В ряде экспериментов использовали мышей линии C57BL/6 (возраст 8-16 недель), свободных от патогенов (specific pathogen free - SPF), полученных из питомника лабораторных животных "Пущино" ( г. Пущино, Московская область).

После заражения наблюдение за мышами проводили в течение 21 сут. Величину ЛД50 определяли по методу Кербера (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962). Мышей эвтаназировали ингаляцией СО2.

Диссеминацию штаммов F. tularensis в органах мышей (по 12 мышей линии C57BL/6 в группе, возраст 6-8 недель) определяли после подкожного введения 20 КОЕ/мышь. На 3, 5, 7 и 10 сут из каждой группы по 3 мыши была проведена некропсия печени и селезенки.

Мышей заражали бактериальной суспензией М. tuberculosis (1 • 106 КОЕ/мл в ЗФР с добавлением 0,05 % Tween-80) с использованием ингаляционной установки Glas-Col Inhalation Exposure System 099C (Terre Haute, США, модель 4224). Органы мышей гомогенизировали в размельчителе тканей Seward stomacher 80 (Tekmar, США).

Все манипуляции с ДНК (выделение плазмидной ДНК из Е. coli, рестрикция, дефосфорилирование, лигирование, электрофорез в агарозном геле, ДГПС-ДНК гибридизация и трансформация плазмид в Е. coli и др.) проводили соглас-

но руководству (Маниатис Т. С. и др., 1984) и рекомендациям изготовителя (Fermentas, Латвия). Для определения размеров фрагментов в агарозном геле использовали маркеры молекулярных весов ДНК (Gibco-BRL, Grand Island, NY,и MBI Fermentas). Нуклеотидные последовательности определяли по методу Сэнджера (Sanger F. et al., 1977) на AB1373 ДНК-секвенаторе (Perkin-Elmer, Urayasu, Япония) и на секвенаторе ALF express II (Amersham Pharmacia Biotech, США).

Биоинформатический анализ последовательностей ДНК проводили с помощью программ FASTA и BLAST и баз данных GenBank и SWISSProt.

Плазмидную ДНК из штаммов рода Francisella выделяли щелочным методом (Маниатис Т. С.и др., 1984, Pavlov et al., 1994), в случае необходимости препараты ДНК очищали с помощью центрифугирования в градиенте хлористого цезия (CsCl) в присутствии бромистого этидия (EtBr) (Маниатис Т. С и др., 1984), Определение положения первых нуклеотидов матричных РНК проводили по (Pomerantsev АР. et ai,2001). Перенос плазмидных ДНК в F. tularensis проводили методом электростимуляции на электропораторе Gene Pulser II Eîectroporation System, (Bio-Rad, Hercules, CA,США (Baron G. S., et al., 1995) и криотрансформации (Мокриевич A. Н.и др., 1994). Скрещивание бактерий Е. coli и F. tularensis проводили на плотной питательной среде.

ГЩР проводили с использованием термоциклера Gene Amp PCR System 2700 (Applied Biosystems,США).

Плазмиды:

pHV33mob - создана в результате встраивания BamHI-фрагмента ДНК плазмиды pDM4(25) (1,7 т.п.н.) с mob областью плазмиды RP4 в Bam HI сайт плазмиды рНУЗЗ. Селективный маркер - Ар;

pPV - получена в результате объединения фрагментов: BamHI фрагмента с опТ из плазмиды pDM4 (1,6 т.п.н.), Pstl фрагмента плазмиды pDM4 с геном sacB Bacillus subtilis (2,6 т.п.н.) и HindIII-фрагмента плазмиды pSa с геном cat в плазмиде pUC19;

pVP5 - создана в результате встраивания BamHf-Snal фрагмента ДНК плазмиды pML2.1 (Машко С. В. и др., 1985) с геном cat в BamHl-Smalсайты плазмидыриС18;

вектор pPMCl был получен в результате объединения четырех фрагментов ДНК: KcpA-Sphl-Nhel (2361 п.н.), сгЛ-Nhel-Xhol (1013 п.н.), groES-A7ioI-&зс1 (367 п.н.) и RepB-S£/¡I-SacI (552 п.н.). Селективный маркер -Ст.

Ампликон cat-Mel -Xhol, фланкированный сайтами NheI и Xhol, был получен с использованием пары праймеров Cm-Nhel/Cm-Xhol и плазмидной ДНК рС194 в качестве матрицы. Ампликон groES--Y/¡oI-5'acI, фланкированный сайтами Xhol и Sad, был получен с использованием пары праймеров groES-Xho/groES-Sac и ДНК F. tularensis 15/10 в качестве матрицы.

Фрагмент RepB-SpM-SacI плазмиды pUC57-RepB был вырезан из плазмиды pUC57-RepB рсстриктазами Sphl и Sacl. Плазмида pUC57-RepB была получена в результате встраивания ампликона RtpH-Pstl-Sphl (537 п.н.) мевду сайтами Pstl и Sphl плазмиды pUC57. Ампликон RepB-Fj/I-iS^/jI (537 п.н.) был синтезирован с помощью пары праймеров RepB-Pst/RepB-Sph и плазмидной ДНК pFNLIO в качестве матрицы.

Препарат ДНК, несущей последовательность гена Sod А, получен методом ПЦР с использованием ДНК штамма М. tuberculosis H37Rv в качестве матрицы и пары специфических праймеров: 5'GAATGGATCCAGCCGAATACACCTTGCCAGAC3' и 5'GCGGGAATTCCCGAATATCAACCCCTTGGT3'. Амплифицированный фрагмент ДНК был встроен между BamHI и EcoRl сайтами в плазмиду pET23b(+)(Novagen, USA). Штамм К coli BL21 (pET23b(+)SodA) был использован для синтеза и последующего выделения рекомбинантного белка SOD А согласно инструкции производителя плазмиды pET23b(+) (Novagen, США).

Препарат ДНК, несущей последовательность модифицированного гена fipB, кодирующего зрелый белок Ag85B получен методом ПЦР с использованием ДНК штамма М. tuberculosis H37Rv в качестве матрицы и пары праймеров 5'GATCATATGTTCTCCCGTCCGGGTCTG3' и 5'GGTGGATCCTGACAGCCT GCGCC3'. Ампликон встроен меаду сайтами NdeI и BamHI в плазмиду

pET23b(+)(Novagen, USA). Штамм Е. coli BL21(pET23-85B) был использован для синтеза и последующего выделения рекомбинантного белка Ag85B-(His)6, согласно инструкции производителя плазмиды pET23b(+) (Novagen. США).

Препарат ДНК, несущей последовательность модифицированного гена esat-6, кодирующего белок ESAT-6, получен методом ПЦР с использованием ДНК штамма М. tuberculosis H37Rv в качестве матрицы и пары праймеров: 5'GGACATATGACAGACCAGCAGTGGAAT3' и 5'TTTCTCGAGTCCGAA CATCCCAGTCAC3'. Ампликон встроен между сайтами NdeI и Xhol в плазмиду pET24b(+) (Novagen, USA). Штамм Е coli BL21(pET24-ES) использован для синтеза и последующего выделения рекомбинантного белка ESAT-6-(His)6 согласно инструкции производителя плазмиды pET24b(+) (Novagen, США). Очистку рекомбинантных белков проводили аффинной хроматографией на Ni2+~NTAHisBind® SuperfIow™(Pharmacia Biotech, Швеция) по модифицированному протоколу, прилагаемому фирмой-производителем.

Антисыворотку к рекомбинантному белку SOD А получали с помощью подкожной иммунизации кроликов. Антисыворотки к рекомбинантным белкам Ag85B-(His)6 и ESAT6-(His)6 получали подкожной иммунизацией беспородных белых мышей. Иммунные сыворотки собрали через 7 дней после второй иммунизации. Титры специфических антител в сыворотках животных определяли с помощью твердофазного ИФА

При определении уровня синтеза IFN-y спленоцитами мышей в качестве актиген-презентирующих клеток (АПК) использовали костно-мозговые макрофаги (КММ) мышей линии C57BL6 категории SPF, которые получали по методу (Bcsio С.М. et al., 2001). Концентрацию IFN-y в клеточных супернатантах проводили с помощью набора Interferon gamma [(mINFy], Mouse ELISA Bio-trakTM System по методу фирмы-производителя (Amersham Biosciences, Великобритания).

Внутриклеточную выживаемость и способность к внутриклеточному размножению исходных и рекомбинантных штаммов F. tularensis определяли с использованием макрофагоподобной клеточной линии мышиных моноцитов

J774A.1, полученных из Российской коллекции культур клеток позвоночных Института цитологии РАН (РККК ИЦ РАН, С.-Петербург, Россия).

Оценку пролиферативной активности лимфоцитов проводили в реакции бласгтрансформации лимфоцитов но методу (Mishell В. В. et al., 1980). Определение фагоцитарной активности перитонеальнмх макрофагов проводили по общепринятой методике (Учитель И. Я., 1978.)

Оценку протсктивности штаммов F. tularensis проводили с помощью иммунизации подкожно мышей линии C57BL/6 категории SPF (20 ЬСОЕ/мышь). Двум контрольным группам вводили подкожно ЗФР и клетки М. bovis BCG в дозе 105 КОЕ/мышь, соответственно. На 28 сут после иммунизации проводили аэрозольное заражение животных Через 28 сут после экспозиции животных эв-таназировали ингаляцией С02 Учет результатов высевов из легких и селезенок проводили на 21 сут.

Электрофорез в 12,5 % ПААГ с/без добавлением ДДС-Na проводили в буферной системе Леммли. Белковые зоны либо окрашивали Кумасси R250 или без окрашивания использовали для оценки ферментативной активности или постановки иммуноблота.

Оценку ферментативной активности белка СОД А проводили по методу (Beauchamp С. eta!., 1971). Определение количества белка проводили по Лоури с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Определение устойчивости к параквату проводили на чашках с плотной питательной средой, инкубируемых при 37 °С п течение 48-72 ч, по величине зоны подавления роста.

Иммуноблотингом проводили по методу (Towbin Н. et al., 1979). Титры антител к антигенам в антисыворотках определяли методом твердофазного ИФА по общепринятой схеме.

Достоверность отличий численных значений результатов экспериментов определяли по г-критерию Стьюдента (Р<0,05) с помощью статистических программ, встроенных в программу Windows Excel.

Глава 3 . Криотрансформация, мобилизация и конъюгация плазмид в клетки вакцинного штамма F. tularensis 15/10

Криотрансформация туляремийного микроба. Для оптимизации условий передачи плазмид в клетки F. tularensis 15/10 методом криотрансформации выбрана плазмида рС194, способная реплицироваться в клетках F. tularensis и экспрессировать ген cat (Померанцев А. П. и др., 1991). Выявлено, что особенностью переноса плазмид в клетки F. tularensis при замораживании-оттаивании является необходимость присутствия в буфере для криотрансформации ионов магния. Показано, что оптимальным значением pH среды для трансформации является 7,5, оптимальное время инкубации перед замораживанием составляет 10 мин при температуре 22 °С. Показано, что для замораживания смеси клеток F. tularensis и ДНК может быть использован как сухой лёд-этанол, так и жидкий азот, но последний дает наилучший результат по выходу трансформантов. Метод применим также и для других штаммов туляремийного микроба.

Плазмидную ДНК рС194 переносили в клетки F. tularensis 15/10 не только в изолированном виде, ко и в составе рекомбинантных плазмид, например, бирепликонной плазмиды pHV33. Плазмидные ДНК pHV33, выделенные из клеток К coli HB101(pHV33) и F. tularensis 15 (pHV33), трансформировали клетки F. tularensis 15/10 практически с одинаковой эффективностью, что свидетельствовало об отсутствии системы рестрикции, по крайней мере, в штамме F. tularensis 15/10.

Показано, что в клетках F. tularensis обнаруживается только один фено-типический признак плазмиды pHV33- устойчивость к Cm из трех признаков проявляемых данной плазмидой в клетках Е. coli - устойчивость к Cm, Ар и Тс. Однако, при селекции на среде с Тс (10 мг/л) были отобраны клоны, в которых плазмида pHVT33 отличалась от исходной плазмиды наличием делеции размером 1,5 т.п.н. Таким образом, подтвержден факт возможности внутримолекулярных перестроек в плазмиде pHV33 в бактериях F. tularensis.

Мобилизация плазмид из клеток Е. coli в клетки F. tularensis. С целью выяснения возможности мобилизации плазмид из клеток Е coli в клетки F. tularensis и последующей оптимизации условий эффективного переноса

плазмид между данными микроорганизмами создана плазмида pHV33mob, несущая mob область плазмиды RP4. Примечательно, что при селекции трансформантов на среде с Cm получены клоны, содержащие делеционный вариант плазмиды pHVmob, лишенный участка плазмиды рС194, прилегающего к области начала репликации. Показано, что полученный делеционный вариант pHV'mob содержал гибридный ген cat под промотором гена rep плазмиды рС194.

Функциональная активность области mob в плазмидах pHVmob и pHV'mob была оценена при скрещивании между клетками штаммов Е. coli S17(pHV mob) и Е coli JM83 (pBR322), а также между клетками штаммов Е. coli S17(pIIV' mob) и Е. coli JM83 (pBR322). В результате были получены клопы, способные расти на средах с Cm и Тс. Частота появления таких клонов составила 10"' на донорную клетку при скрещивании в течение 3 ч. При скрещивании клеток Е. coli S17(pHV mob) (-1 • 10s КОЕ) и F. tularensis 15/10 (~ 1 ■ l(f КОЕ) на L-агаре в течение 20 ч при температуре 37 "С, с последующей селекцией на агаровой среде ТА (100 мг/л Рт и 3 мг/л Cm) получены клоны (~104), содержащие плазмиду, совпадающую по размерам с плазмидой pHV33 mob. Результаты данного эксперимента позволили сделать вывод о возможности мобилизации плазмид из клеток Е. coli в клетки F. tularensis и о способности «молекулярной машины» Е coli S17, кодируемой генами ira (из плазмиды RP4), переносить плазмиды из клеток Е. coli в клетки F. tularensis.

Клоны туляремийного микроба, полученные в результате мобилизации плазмиды pHV'mob, росли медленнее, чем клоны, несущие плазмиду pHVmob. Особенностью медленнорастущих клонов заключалась в том, что электрофоре-тически плазмидная ДНК в бактериях не выявлялась. Трансформирующая активность плазмиды pHV'mob клеток F. tularensis методами электропорации и криотрансформации не отличалась от таковой плазмиды pHVmob, при этом отмечалось также формирование на селективной среде медленнорастущих колоний. Экспериментально подтверждена низкая копийность плазмиды pHV'mob в клетках F. tularensis.

Изучение влияния условий скрещивания (состава среды, температура и время скрещивания, а также концентрация клеток донора и реципиента) позволило выбрать оптимальные параметры, обеспечивающие эффективный перенос плазмиды pHV33mob в клетки F. tularensis 15/10.

С использованием выбранных условий мобилизации проведено конъюга-ционное скрещивание между клетками Е. coli C600(pSa) и F. tularensis 15/10. Частота появления туляремийных клонов, устойчивых к Cm, составила ~ МО"7 на бактерию реципиента. Плазмидный анализ клонов показал наличие в бактериальных клетках высокомолекулярных плазмидных ДНК (рис.1).

Рисунок 1. - Плазмидные профили

клонов Р. Мотетки, полученных в

результате скрещивания.

1,17 - маркеры молекулярных весов ДНК Шш<ИИ, 2-16 - плазмидные ДНК.

Электрофоретическая подвижность плазмидных ДНК, выделенных из разных клонов, различалась, что может быть объяснено либо различиями в размерах плазмид, либо разным количеством супервитков в ковалентно-замкнутых кольцевых плазмидах, что, очевидно, связано с нестабильностью самой плазмиды (pSa) (ireland С. R., 1983). Для выяснения наличия изменений в составе плазмиды pSa изучали плазмиду pSa', выделенную из отдельного клона F. tularensis 15 (pSa'). Показано, что плазмида pSa' способна к обратному конъ-югационному переносу из клеток F. tularensis lS^pSaO в клетки Е. coli С600 с частотой ~ МО"4 на бактерию реципиента. Конъюгационный перенос плазмиды pSa' из клеток Е. coli С600 (pSa1) в клетки F. tularensis 15/10 происходил с частотой 5 • 10"4 на реципиентную клетку, что на три порядка выше, чем частота конъюгационного переноса плазмиды pSa из клеток К coli С600 (pSa) в клетки F. tularensis 15/10. Электрофореграмма (рис. 2) демонстрирует гетерогенность препаратов плазмидных ДНК из Е. coli C600(pSa'), что отражает нестабильность плазмиды pSa' в клетках Е. coli C60Q.

При изучении возможности внутривидового коньюгационного переноса плазмиды pSa' в результате скрещивания клеток F. tularensis 15(pSa') и F. tularensis 15(рКК202) получены единичные бигшазмидные клоны с частотой ~ 410"'°, что существенно меньше частоты появления коныогационных клонов при скрещивании клеток F. tularensis 15(pSa') и £. coli С600.

Различия в эффективности конъюгации могут быть объяснены наличием капсул как у донорных клеток, так и у реципиентных, что, вероятно, затрудняет процесс межклеточного переноса плазмидной ДНК. Полученные данные указывают на возможность конъюгационного переноса плазмиды pSa' между штаммами F. tularensis, хотя и с очень низкой частотой.

Рисунок 2. - Электрофореграмма препаратов ДНК, выделенных из клонов Е. coli C600(pSa').

1-8,10 - ДНК трансконъюгантов Е. coli C600(pSa'), 9 - маркеры молекулярных весов ДНК XHindlll.

Возрастание частоты переноса плазмиды pSa' в клетки F. tularensis по сравнению с исходной плазмидой pSa позволяет заключить, что плазмида pSa' отличается от плазмиды pSa в области, ответственной за репликацию плазмиды. Показано, что трансформация клеток F. tularensis 15/10 возможна только при использовании ДНК плазмиды pSa', но не плазмиды pSa.

Таким образом, результаты межвидового скрещивания показали, что плазмида pSa имеет нестабильную структуру. Кроме того, показано, что при коньгационном переносе плазмиды pSa в клетки туляремийного микроба возникает вариант плазмиды pSa', способный реплицироваться как в клетках Е. coli, так и в клетках F. tularensis. Установлено, что плазмида pSa' способна переходить из клеток Е. coli в клетки F. tularensis без дополнительных (плунжерных) плазмид (Померанцев А. П. и др., 1991). Анализ приведенных выше данных позволяет заключиь, что сконструированные нами плазмиды pHVT33, pHV'mob и pSa' могут быть использованы в качестве векторов (pHVT33) или в

1 234 5 6789 10

качестве основы для создания плазмидных векторов (pGM5 и др.) для изучения генома туляремийного микроба.

Следует отметить, в порядке обсуждения, что описанный нами факт эффективного межвидового переноса плазмид из клеток £ coli в клетки F. tularensis, осуществляемый на простых питательных средах при температуре окружающей среды, позволяет предполагать возможность таких процессов в природных условиях и говорить об их вкладе в дальнейшую эволюцию вида F. tularensis.

Глава 4. Структурно-функциональная организация криптической плазмиды pFNLIO.

При поиске плазмид, способных к репликации в клетках F. tularensis, было обнаружено, что такими свойствами обладает критическая плазмида pFNLIO, выделенная из штамма F. novicida like F6168 (Родионова И. В. и др., 1991). Изучене структурно-функциональной организации данной показало, что плазмида pFNLIO состоит из 3990 п. н., а содержание А+Т-пар в ДНК плазмиды равно 68 %. Данные о нуклеотидной последовательности pFNLIO размещены в базе данных GenBank под номером AFI21418.

По данным анализа нуклеотидной последовательности, в плазмиде pFNLIO находится 6 протяженных открытых рамок трансляции (ОРТ), занимающих около 75 % последовательности ДНК (рис. 3).

Две ОРТ (ОРТ1 и ОРТ2) расположены на "- "-цепи плазмиды, остальные - на "+"-цепи. Участок ДНК размером 250 п. н. со свойствами домена начала репликации локализован между ОРТ1 и ОРТ5. В этом районе находятся три копии повтора, состоящего из 23 нуклеотидов: gatocaaaaagtagttttaaatt. разделенные двумя повторами, состоящими из 8 нуклеотидов: caaaaagt и двумя перекрывающимися повторами, состоящими из 17 нуклеотидов gata/ataaagagaata. Наличие подобных прямых повторов характерно для доменов начала репликации плазмид, реплицирующихся по механизму тета-типа (del Solar G. et al., 1998).

Показано, что в ОРТ1 закодирована аминокислотная последовательность, состоящая из 339 аминокислотных остатков (а.о.), подобная аминокислотной последовательности белков инициации репликации RepA плазмид, реплици-

рующихся по тста-механизму. Стартовый нуклеотид аденин матричной РНК, синтезируемой с промотора перед ОРТ1, находится в положении 1647 нуклео-тида "-"-цепи рШНО.

у////'л

ВШ ОРТМ ош

ОРТ4

ОРТ1

ОРТ2

Рисунок 3 - Структурно-функциональная организация плазмиды рРИЫО.

Терминатор транскрипции обозначен треугольником; область начала репликации выделена заштрихованным прямоугольником. Участки гидролиза для рест-риктаз обозначены: В-ВатШ; Bg-Bg/ll; С-С/а1; Е-£соЯУ; Н-НтсйП; Б-ЗаЛ; X-ХЬа\.

Для ОРТ2 стартовый нуклеотид матричной РНК вблизи начала ОРТ не был обнаружен, что позволило предположить, что ОРТ1 и 2 входят в один опе-рон. В ОРТ2 кодирована аминокислотная последовательность из 140 а. о., подобная последовательности белка АТФ-зависимой РНК-хеликазы из Sulfolobus solfataricus (GenBank № АЕ006810). Оперон, включающий ОРТ1 - ОРТ2, кодирует белки, отвечающие за репликацию, копийность и обеспечение мономерности плазмиды.

Стартовый нуклеотид тимин матричной РНК, синтезируемой с промотора, локализованного перед ОРТЗ, находится в положении 3060 нуклеотида "-"цепи плазмиды. В ОРТЗ кодирована аминокислотная последовательность, состоящая из 298 а. о., подобная аминокислотной последовательности белка инте-гразы Salmonella enterica и рекомбиназы плазмиды pAOl из Bacillus pallidus.

Стартовый нуклеотид аденин матричной РНК, синтезируемой с промотора перед ОРТ 5, находится в положении 1968 нуклеотида "+"цепи плазмиды. ОРТ4, вероятно, не имеет собственного промотора и образует единый оперон с ОРТ5, так как последний нуклеотид терминирующего кодона ОРТ5 является

первым нуклеотидом второго кодона ОРТ4: OPT5-5'att gaa gaa <g¿rtact 3'-OPT4. OPT5 кодирует пептид размером 86 а. о., который подобен в функционально-активной обласги Phd-белку фага PI (Lehnherr Ii. et al., 1993). OPT4 кодирует пептид размером 68 а. о. Этот пептид подобен белкам Е. coli., Sr. coelicolor, М. tuberculosis и S. aureus (по данным базы данных NCBI), кодируемых генами Phd-Doe системы этих микроорганизмов, но существенно отличается от белка Doc фага PI.

BglII-EcoRV фрагмент ДНК плазмиды pFNLIO, несущий оперон ОРТ5-ОРТ4, при встраивании в плазмиду рНУЗЗ существенно снижает вероятность утраты плазмиды клетками штамма F. tulaiensis\5l\0 (pHV33-phd-doc). При выращивании в жидкой питательной среде без антибиотиков за 10 генераций 99 % бактериальных клеток сохраняли устойчивость к Cm, тогда как популяция штамма F. íularensis 15/10 (pHV33) содержала только 60 % клеток, устойчивых к Ст.

ОРТы кодирует пептид размером 56 а. о. Гомология аминокислотной последовательности этого белка с другими белками не найдена.

Структура, находящаяся за ОРТ2, подобна прскариотическим терминаторам. Данная последовательность нуклеотидов содержит инвертированный повтор:

1 acatagtaga tcgactcttc ttagggattt tatatttttt gataaatcat ctattttgct 61 agttaaatca tcaaatttat catcttgttg tttgactaaa tctaagaatc tattctcttt 121 tttaaaatcg ttcatgcaaa ccgcctatag ctttcttctt tttctgaaal tattigtctt 181 cacaccataa ttaaattccc atttttataa gtaaagtctt ttaaaagctt gtcagtctct

Функциональная активность этого терминатора в F. íularensis была подтверждена экспериментально.

Таким образом, проведенные нами исследования критической плазмиды pFNLIO позволили выявить генетические структуры, необходимые для репликации в клетках туляремийкого микроба по тета-механизму. Поскольку данная плазмида содержит оперон, кодирующий Phd-Doc-подобную систему, необходимую для ее стабильное наследование в F. íularensis, то, очевидно, что плаз-

мида pFNLIO может послужить основой для создания стабильных плазмидных векторов для изучения иммунобиологических свойств F. lularensis.

Глава 5. Экспрессия генов гетерологичных протектнвных антигенов в клетках вакцинного штамма F. tularensis 15/10.

Возможность экспрессии гетерологичных протективных антигенов в клетках штамма F. tularensis 15/10 изучена на примере экспрессии F!-антигена чумного микроба. Рекомбинантная плазмида pCFlO, несущая гены оперона fra Y. pestis создана на основе плазмидного вектора pHVT33. Фрагмент ДНК, содержащий гены оперона fra встроен в сайт Sal I плазмиды pHVT33. Полученная плазмида pCFlO (8,8 т. п. н.) введена в клетки F. tularensis 15/Í0 методом кри-отрансформации. Среди Тс-чувствительных клонов F. tularensis были обнаружены клоны, которые, по данным РПГА с анти-Fl моноклональными антителами, синтезировали Fl-антиген. Таким образом, показана возможность получения вакцинного штамма F. tularensis 15/10 с синтезирующего Fl-антиген чумного микроба, а также продемонстрированы векторные свойства плазмиды рНУТЗЗ.

Показана также возможность использования бациллярной плазмидь: pTV24 в качестве плазмидного вектора для клонирования фрагментов ДНК, несущих гены протективных антигенов возбудителя сибирской язвы, в клетках F. tularensis. Рекомбинантная плазмида pTVpag получена в результате встраивания фрагмента ДНК, несущего ген pag плазмиды pXOl Bacillus, anthracis в сайт Barn HI плазмиды pTV24. При трансформации F. tularensis 15/10 плазмид-ной ДНК pTVpag был получен штамм F. tularensis 15/10 (pTVpag), синтезирующий протективный антиген В. anthracis.

Интересно отметить, что штаммы F. tularensis 15/10, несущие векторные плазмиды рНУТЗЗ и pTV24 , а также с рекомбинантные плазмиды, полученные на их основе, часто утрачивали плазмиды при культивировании на жидких питательных средах и при пассировании в организме экспериментальных животных. Эта особенность затрудняла изучение иммунобиологических свойств ту-ляремийного вакцинного штамма, несущего дополнительные протективные антигены других бактерий. В дальнейшем данная трудность была преодолена в

результате создания илазмидного вектора pPMCl, стабильно наследуемого бактериями штамма F. tularensis 15/10, на основе плазмиды pFNL 10. Плазмида pPMCl (4259 н. п.) несет ген cat из плазмиды рС194, а также промотор и участок инициации трансляции оперона groES F. tularensis (рис. 4).

Потенциальные возможности плазмиды pPMCl в качестве плазмидного вектора были проверены на примере клонирования модифицированного гена sodA М. tuberculosis в клетках F. tularensis 15/10. Для повышения уровня экспрессии гетерологичного белка проведена замена в гене sodA редких для генома F. tularensis кодонов. В результате сконструированы три плазмиды, кодирующие три различных варианта гена sod4: плазмида pSFC21c неизмененным геном, плазмида pSFC22 с заменой редких кодонов в части гена, кодирующей С-концевую область белка, и плазмида pFSC24 с заменой редких кодонов по всей протяженности гена (рис. 5). Показано, что замены редких кодонов практически не повлияли на уровень экспрессии полученных вариантов гена sodA в клетках вакцинного туляремийного штамма (рис.б).Присоединение к структурной части гена sodA нуклсотидной последовательности, кодирующей лидерный пептид белка внешней мембраны F. tularensis РорА(плазмида pFS51) привело к

герА

terminator

герВ

SpM (1910)

Рисунок 4 - Генетическая карта плазмиды pPMCl.

существенному повышению экспрессии рекомбинантного гена в туляре-мийном микробе (рис 6).

Рисунок 5 -Генетическая карта плазмиды рР8С24.

1 2 3 4 5 6 7 8

'«рть <

Рисунок 6. - Иммуноблот рекомбинантного белка СОД с кроличьей антисывороткой.

1 - лизат клеток К ш1агети 15/10, 2 -лизат клеток Р. Магет\ь х 5/10{рЙ.РС21); 3 - клеточный лизат Р. Магегкгя 15/10 (р8РС22); 4-6 - клеточный лизат р. 1и1агетЬ 15/10 (р8РС24); 7 - клеточный лизат Р. Ыаггп.их 15/10 (рЗРС51); 8 - рекомбинантный белок СОД.

рБРС24

4869 н.п.

ВдП (2875)

герБ

На основе рРМС 1 созданы также плазмиды, кодирующие синтез реком-бинантных белков, состоящих из лидерного пептида белка внешней мембраны F. tularensis FopA и антигена 85В М. tuberculosis (плазмида pPMC-FL-85B) и лидерного пептида белка внешней мембраны /-'. tularensis FopA и белкаЕБАТ-б М. tuberculosis (плазмида pPMC-FL-85B-ESAT-6).

В результате переноса названных выше плазмид в клетки вакцинного штамма F. tularensis 15/10 получено два штамма F. tularemis RVpl7 и RVpl8, синтезирующих протективные антигены 85В М. tuberculosis и гибридный белок, состоящий из антигенов 85В и ESAT-6 М. tuberculosis, соответственно. Плазмиды pPMC-FL-85B и pPMC-FL-85B-ESAT-6 использованы также для получения штаммов F. tularensis LVS (F. tularensis LVS17 и LVS18, соответственно), синтезирующих протективные антигены М. tuberculosis. Показано, что штаммы F. tularensis RVpl7 и RVpl8, атакже F. tularensis LVS17 и LVS18, стабильно наследуют рекомбинантные плазмиды и сохраняют уровень экспрессии клонированных микобактериальных белков при пассировании через организм экспериментальных животных.

Бактерии штамма F. tularensis RVpl7 синтезировали две формы белка, содержащие антигенные детерминанты Ag85B, но отличавшиеся по размерам: белок с молекулярной массой -33 кДа, подобный белку FL-Ag85B, и белок с молекулярной массой ~30,6 кДа, подобный микобактериальному белку Ag85B (рис.7, А). В бактериальных клетках F. tularensis RVpl7 большая часть синтезируемого белка FL-Ag85B переходила в белок, подобный зрелому микобактериальному белку Ag85B.

Бактерии штамма F. tularensis RVp 18 синтезировали белок, содержащий антигенные детерминанты Ag85B и ESAT-6. (рис.7, Б). Данный белок имел молекулярную массу 40±3 кДа, соответствующую молекулярной массе рекомби-нантного белка FL-85B-ESAT-6 (405 а.о.). Белок FL-Ag85B-ESAT-6 находился в клетках, по-видимому, в непроцессированной форме.

Рисунок 7. - Иммуноблоггинг лизатов штаммов F. tularensis RVpl7 и RVpl8 с антисывороткой к белку Ag85B-(His)6.

А: 1- концентрированная культуральная среда М. bovis üCG; 2 - штамм F. tularensis R.Vp 17, белок Ag85B-(His)6; Б:1 - шгамм F. tularensis RVplS; 2 - штамм F. tularensis 15/!0(рРМСП; 3 - белок Ag85B~ (H¡s)6.

Таким образом, проведенные исследования показали возможность экспрессии генов гетерологичных протективных антигенов Y. pestis, В. anthracis и М. tuberculosis в клетках вакцинного штамма F. tularensis. Показано, что использование сконструированного нами плазмидного вектора pPMCi позволяет получать стабильные вакцинные штаммы, синтезирующие протективные антигены, которые будут далее изучены в аспекте использования вакцинного штамма F. tularensis в качестве бактериального вектора для создания рекомби-нантных вакцин.

Глава 6. Аллсльное замещение з хромосоме туляремийного микроба

Конструирование плазмидного вектора для аллельного обмена генов в хромосоме F. tularensis. В качестве репликона векторной ллазмиды для аллельного обмена в хромосоме F. tularensis выбрана плазмида pUC19, не способная реплицироваться в клетках туляремийном микроба. Ген cat плазмиды pSa встроен в плазмиду pUC19 в качестве селективного маркера, так как наличие одной копии этого гена в хромосоме F. tularensis позволяет бактериям расти на плотных средах, содержащих Cm в концентрации до 5 мг/л, тогда как для штамма F. tularensis 15/10 минимальная ингибирующая концентрация (МИК) Cm составляет менее 1 мг/л. В качестве селективного маркера для отбора бактерий, утративших плазмидный вектор, выбран ген sacB, подавляющий рост бактерий , несущих этот ген. Для проверки функциональной активности гена sacB Pst I фрагмент плазмиды pDM4 (2,8 т.п.н.), несущий ген sacB встроен в сайт Pst I плазмиды pHV33. В результате получена плазмида pHV-sacB в штам-

1 2 3 А 1 2 3 Б

ме F. tularensis 15/10 (pHV-sacB). Показано, что бактерии штамма F. tularensis 15/10 (pHV-sacB) не способны к росту на среде с 5 %-ой сахарозой, что указывает на экспрессию гена sacB в клетках туляремийного микроба. Для повышения эффективности переноса рекомбинантных плазмид в клетки туляремийного микроба в создаваемый плазмидный вектор для аллелыюго обмена была встроена тоЬ-область плазмиды RP4. Данная структура позволяла мобилизовать плазмидный вектор из клеток Е. coli S17 в клетки F. tularensis 15/10. В результате получен плазмидный вектор pPV для осуществления аллелыюго обмена в хромосоме F.tularensis, имеющий два сайта для встраивания целевых фрагментов ДНК - Sali и Xbal (рис. 8).

Рисунок 8 - Генетическая карта плазмиды рРУ , используемой для аллельного обмена в хромосоме Р. /м/яге/и«

Создание плазмиды для удаления гена iglC из хромосомы К /и/агагш. Для получения штамма .Г. /ы/аге/лш , лишенного гена iglC методом аллельного обмена, создана нлазмида, несущая модифицированный фрагмент ДНК из облас-

Silll XlMl

.BiirnHI

ти гена iglC. Для синтеза данного фрагмента ДНК без гена iglC использованы следующие праймеры:

23SalL15 5'ACGCGTCGACTACAATGCTAGAAACCTr3' 23Bam 5TCGGGATCCTATACATGCAGTAGGA3' 23Pst 5'AAACTGCAGCTGCATAGTAAGATCGGA3' 23SaiR15 5'GCGTGTCGACTTAGCCGTGCCAATTACCA3'

В результате встраивания полученного фрагмента ДНК в сайт Sail плаз-миды pPV была получена плазмида pPVA23. В качестве репипиентного штамма для отбора трансформантов, несущих плазмиду pPVA23, использовали штамм

E. coli DH5ct; затем плазмиду pPVA23 переносили в штамм К coli SI7.

Конструирование штаммов F. tularensis, несугцих делецию по гену iglC. Для удаления гена iglC из хромосомы вакцинного штамма F. tularensis 15/10 плазмида pPVA23 в результате скрещивания была перенесена мобилизацией из штамма Е. coli S17(pPVA23) в штамм F. tularensis 15/10. Полученные в результате такого скрещивания резистентные к Cm клоны F. tularensis не содержали плазмид, т е. генетическая конструкция, несущая ген cat, была интегрирована в хромосому туляремийного микроба. ПЦР анализ ДНК, выделенной из клеток клонов показал, что в половине проанализированных трансконъюгантов рекомбинация между плазмидой pPVA23 и хромосомой туляремийного микроба прошла по левому плечу, в другой половине - па правому плечу.

Спонтанная элиминация векторной части интегрированной структуры в результате повторной рекомбинации позволила получить на селективной среде, содержащей 5% сахарозу Cm-чувствительные клоны F. tularensis. ПЦР анализ показал, что у половины проверенных клонов амплнконы, полученные с помощью праймеров 23SalL15 и 23SalR15, имеют размеры, характерные для

F. tularensis 15/10, другая половина клонов (F. tularensis 15/10-Д23) дает два вида ампликонов, появление которых возможно только при наличии двух копий гена iglC в хромосоме (рис. 9).

Вывод о наличии в геноме туляремийного микроба двух копий гена iglC. был подтвержден методом ДНК-гибридизации по Саузерну , мевду фрагментами ДНК F. tularensis 15/10, полученными в результате гидролиза рестрикта-

зами, и ДНК-зондом, содержащим последовательность гена ig¡C. Для инактивации второй копии гена проведено скрещивание клеток Е. соН 817(рРУА23) и Р. 1и1агепя1$ 15/10-Д23. В результате селекции клонов и ПЦР анализа их геномов получен штамм туляремийного микроба без двух копий гена -Р. ?м/ягетш'.г15/10-А23-Л23. Аналогично получены варианты штамма Р. ПйагетЬ ЬУЭ без одной и двух копий гена iglC.

. 41 "

^ ш** «м — а* —» - „

Рисунок 9 - Электрофореграммы ПЦР продуктов, полученных на матрице ДНК штаммов К Ш1агет1.$ с помощью праймеров, комплементарных (А) - левому плечу гена р23, (Б) - правому плечу гена р23

Создание плазмиды для модификации гена бос1В в хромосоме Р. 1и\агеп$1$. Для снижения уровня экспресии гена $о<1В в клетках Р. Ыагет'ш синтезирован фрагмент хромосомы Р. 1и\агет1$, в котором инициирующий кодон АТС гена яос1В заменен на кодон вТв. Для синтеза левого плеча фрагмента использованы следующие праймеры:

ХЬа-эосШ 5 'САСТСТАОАТТАТССА'ПТООТАТТОАСОЗ' Рэ^осШ 5' АТССгеСАОТАСТСТССГТАААТТСОТСЗ'

РБ1Р-8ОС1В 5'ОАСС"ГОСАОТОАААТТТОААТТАССААААСЗ" За^БоёВ 5 'ТАТОТССтАСААССТААТСАОСОААТТОСЗ'

При конструировании модифицированного гена sodB перед инициирующим кодоном GTG создан участок узнавания для рестриктазы Pstl. Наличие этого сайта позволило отобрать с помощью рестрикционного анализа амплико-ны, амплифицированные с ДНК клонов, несущих модифицированный ген sodB. В результате встраивания фрагмента ДНК, несущего модифицированный ген sodB между сайтами ХЬа\ и Sa/1 плазмиды pPV, получена плазмида pPV-sodB. В качестве реципиентного штамма для отбора трансформантов, несущих плазми-ду pPV-sodB, использовали штамм £ coli DH5a, затем данная плазмида была перенесена в штамм Е. coli S17.

Конструирование шталша F. tularensis I.VS со сниженным уровнем экспрессии гена sodB. Попытки делении гена sodB из хромосомы штаммов F. tularensis 15/10 и LVS методом аллельного обмена оказались безуспешными, поскольку, вероятно, продукт гена sodB жизненно необходим для туляремийно-го микроба. Для выяснения влияния продукта гена sodB на иммунобиологические свойства туляремийного микроба создан штамм F. tularensis LVS со сниженной экспрессией гена sodB. Данный штамм F. tularensis FtsodB получен в результате алелльного обмена природного гена sodB, локализованного в хромосоме, на модифицированный ген sodB, содержащий инициирующий кодон GTG и локализованный на плазмиде pPV-sodB. Плазмида pPV-sodB перенесена из клеток £ coli S17-1 в клетки штамма F. tularensis LVS методом мобилизации. В результате селекции клонов, с последующим ПЦР- и рестрикционным анализом получен штамм F. tularensis FtsodB, содержащий ген scdß, кодирующий матричную РНК, начало синтеза белка с которой затруднено из-за присутствия редкого стартового кодона GTG.

Глава 7. Изучение иммуно-биологических свойств штаммов, сконструированных на основе штаммов F. tularensis 15/10 и LVS

Штаммы F. tularensis, модифицированные по гену iglC. Изучение влияния гена iglC на иммуно-иологические свойства туляремийного микроба проводили с помощью: (i) методов оценки уровня устойчивости к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки (НКС); (ii) способности к внутри-макрофагапьному размножению бактерий в эукариотических макрофагоподоб-

ных клетках линии 1774 А.1; (Ш) способности полученных штаммов индуцировать клеточное звено иммунного ответа методом бласттрансформации, а также (¡у) оценки протективности штаммов на мышиной модели эсперименталыюй туляремийной инфекции.

Показано, что устойчивость к бактерицидному действию ИКС у бактерий штаммов К Ш1агет1з 15/10-Д23 и К ш!агегюк 15/10-Д23-Д23 не изменилась по сравнению с таковой штамма Е /и/аге/мй 15/10. Это свидетельствует об отсутствии влияния продукта гена iglC на клеточные структуры штамма Е пйагепш 15/10, определяющие устойчивость бактерий к ИКС. Хотя полученные варианты вакцинных штаммов ш1агет¡з 15/10 и ЬУ8 одинаково хорошо росли в жидких питательных средах, тем не менее, в отличие от исходных штаммов, они снизили и даже потеряли способность к размножению в клетках Л 774 А.1 (Табл. 2).

Таблица 2 - Размножение бактерий Е Ыагетя в клетках .1774 А.1

Штаммы Е. ш1агет1Я Индекс размножения

15/10 540

15/10-Д23 30

15/10-Д23-Д23 1

ЬУБ 4000

ЬУБ -Д23 1000

ЬУ8 -Д23-Д23 4

Вакцинация мышей линии Ва1Ь/С клетками штамма Е. ш1агеп5к 15/10-Д23 приводила к формированию у животных протективного клеточного имму нитета, уровень которого был сходен с иммунитетом, формируемым у мышей при вакцинации штаммом Е Ш1агепз15 15/10. Вакцинация мышей линии Ва1Ь/С клетками штамма Е. шки-емк 15/10-Д23-Д23 не индуцировала иммунного ответа у мышей. Реакция бласттрансформации спленоцитов при стимуляции суммарным антигеном Е. Ыагежи была отрицательной, т.е. не отличалась от индекса стимуляции спленоцитов, полученных от неимунизиро-ванных мышей. Следовательно, продукт гена щ1С необходим для внутримак-рофагального размножения туляремийного микроба. Полученные данные под-

твердили рабочую гипотезу о том, что стадия внутримакрофагального размножения клетками вакцинного штамма Р. ш1агеп$'и необходима для формирования протективного иммунного ответа живой туляремийной вакциной.

Штамм ги/ягаии, модифицированный по гену ¡¡ойВ. Изучение культу-ральных свойств показало, что рост бактерий штамма Р. шЬгети Р1$о<1В замедлен по сравнению с бактериями штамма Р. Шагепзгз ЬУБ. Так, при аэробном культивировании в жидкой питательной среде Мюллер-Хинтона (МНВ) штамм Р. ш1аге№!$ Р1$ойВ имел более длительную лаг-фазу. Ферментативная активность железо-зависимая супероксиддисмутаза (РеСОД) в бактериях штамма К 1и1аге>мй Р1,<;ос1В оказалась существенно снижена по сравнению с таковой в бактериях штамма Р. Ги/агепн'х На рост культуры штамма Р. Магепт Р1яос]В в МНВ при аэробных условиях существенно влияло присутствие перекиси водорода (Н2О2). Повышенная чувствительность штамма Р. 1и1агеп51з Р1зос1В к Н202, несмотря на нормальную активность каталазы, позволило предположить, что часть повреждений клеток Р. Ыагет'и была вызвана радикалами ОН- , которые образуются в присутствии избытка Н2О2 и 02~ (НаШ*е11 В. е! с!.. 1984).

Клетки штамма Р. ш!агепт Р1чос1В также оказались весьма чувствителе-ными к действию препарата Паракват (Ы,К-диметил-4,4'-бипиридина дихло-рид), который широко используется в биологии для моделирования с-ксидатив-ного стресса. Зона подавления роста агаровой культуры штамма К ш1агет1$ р1зос!В составляла - (47,3 ± 3,5) мм по сравнению с зоной штамма Р. ш1агетг$ ЬУЗ - (35,3 ± 2,8 ) мм. Поскольку известно, что в присутствии Параквата увеличивается внутриклеточная концентрация радикала 02~, то дефицит РеСОД, вызванный модификацией гена восШ, вероятно, привел к подавлению роста культуры штамма Р 1и!аггп51з Р1яос1В. Таким образом, показано, что ген ьойВ кодирует РеСОД, которая нейтрализует' негативное действие оксидативного стресса.

Показано также, что штамм К ЫагетЫ Р^ос!В менее вирулентен для мышей линий С57ВЬ/6 и Ва1Ь/С по сравнению с исходным штаммом Р. ш1агет15 ЬУ.?. Органы мышей линии С57ВЬ/6, инфицированных штаммом

/*". ¿и/да-егай Игос/Д были менее обсеменены бактериями К ЫагетЬ и элиминация бактерий из органов происходила быстрее по сравнению с органами животных, инфицированными штаммом Р. Ш1агет1я ЬУЭ. Полученные данные еще раз подтвердили гипотезу о том, что железо-зависимая супероксиддисму-таза, кодируемая геном яоАВ, необходима для выживания и размножения бактерий в организме инфицированных животных.

Штаммы Р. ш1аге>ть, синтезирующие протективные туберкулезные антигены. Показано, что введение в клетки штаммов Р. ги1агет1з 15/10 и ЬУв векторной плазмиды рРМС1и рекомбинантных плазмид, созданных на ее основе, не влияет на ростовые свойства полученных плазмидосодержащих бактерий. В частности, скорость размножения бактерий штаммов Р. шШгепя'м ЯУр17 и ЯУр18 в мышиных клетках 1774. А1. практически не отличалась от скорости размножения вакцинного штамма Р. Ш1агеп$13 15/10. Динамика размножения клеток штаммов Р. 1и1агеп.ш 15/10 рРМС1, ЯУр17 и ЯУр18 в селезенке инфицированных мышей была подобна динамике размножения бактерий штамма Р. Ш1агеп$1515/10. Сходные данные, полученные для штаммов Р. /и/агелшЬУ817 и ЬУ818, синтезирующих А§85В и гибридный антиген А§85В-Е8АТ-б, приведены в таблице 3. Введение плазмид рРМС1, рРМС-РЬ-85В и рРМС-РЬ-85В-Е8АТ-6 в клетки Р. Магетгз 15/10 не влияло на вирулентность полученных штаммов: ЬЭзо была равна 30 100 КОЕ/мышь. Индексы стимуляции спленоцитов суммарным антигеном /•". ш1агет'т во всех группах мышей линии С57В176, вакцинированных штаммами Р. Магет'к рРМС1,

Таблица 3. Динамика изменения обсемененности органов мышей линии С57ВЬ, инфицированных штаммами Р. Ш1агепш ЬУЭП и ЬУ818.

Обсемененность органов, Log КОЕ

Дни 3 6 14 21

Органы Селезенка (С) Печень (П) С П С п С П

Штаммы К 1и1агепч13

ЬУБ 5.4 5.2 5.0 5.2 <3 <3 <2 <2

У(рРМС1) 5.2 4.9 4.9 4.1 <3 <3 <2 <2

ЬУв 17 4.1 3.9 4.5 4.7 <3 <3 <2 <2

ЬУв 1 8 6.3 5.7 6.4 6.3 <3 <3 <2 <2

RVpl7, RVpl8 и 15/10, были высокими и находились в пределах - (11,3 ± 1,35) (для штамма F. tularensis 15/10) и (8,2 ± 0,9) (для штамма F. tularensis RVpl8). У животных, иммунизированных штаммами F. tularensis RVpl7 и RVpl8, отмечался выраженный специфический иммунный ответ на антиген Ag85B-(His)6. Индексы стимуляции составили - (3,6 ±1,24) и (4,2 ±0,95), соответственно, достоверно (Р < 0,05) отличаясь от величин индекса стимуляции для интактных мышей - (1,2 ±0,28) и для мышей, вакцинированных штаммом F. tularensis 15/10 - (1,8 ±0,56). Уровень стимуляции спленоцитов антигеном ESAT-6-(His)6 в группе мышей, вакцинированных клетками

F. tularensis RVpl8, был незначителен и составлял - (1,9 ±0,18), достоверно (Р<0,05) отличаясь от величин индекса стимуляуии для интактных мышей -(0,8 ± 0,42) и слабо отличаясь от индекса стимуляции для мышей, вакцинированных клетками F. tularensis pPMCl - (1,2 ± 0,68).

Показано, что спленоциты иммунных мышей в ответ на туляремийные и микобактериальные антигены секретируют IFN-y в культуральную среду. Данные о концентрациях IFN-y в супернатанте спленоцитов в ответ на стимуляцию антигенами in vitro представлены в таблице 4.

Уровень секреции IFN-y спленоцитами, полученными от мышей, иммунизированных бактериями F. tularensis RVpl7, при стимуляции антигеном Таблица 4. Уровни синтеза IFN-y спленоцитами иммунных и не иммунных мышей C57BL

Штаммы F. tularensis IFN-y, нг/мл

Туляремийный антиген Ag85B-(His)ä 2 мкг/мл ECAT-6-(His)6 2 мкг/мл

15/10 75,8±5,3 10,2±0,7 н/о

pPMCl 83,8±3,8 15,0±1,0 0,8±0,3

RVpl7 82,5±1,2 31,9±0,7 н/о

RVpl8 73,7±8,1 20,3±0,7 4,8±0,2

контроль 6,5±0,8 0,2±0,3 н/о

Примечание: н/о -не определяли.

А§85В-(НЬ)6 превышал почти в 1,5 раза аналогичный уровень, определенный для мышей, иммунизированных бактериями Р. Ы1аге№1$ RVpl8. Вакцинация мышей штаммом Р. Ш1агеп$1з RVpl8 также индуцировала образование

спленоцитов, специфичных к ESAT-6. Таким образом, однократная иммунизация мышей рекомбинантными штаммами F. tularensis RVpl7 и RVplS активирует специфический Т-клеточный иммунитет. Выраженный иммунный ответ формировался также и на антигены туляремийного микроба, что позволило сделать вывод о том, что вакцинные свойства штаммов F. tularensis RVpl7 и RVpl8 в отношении защиты животных от туляремийной инфекции не изменились.

Оценка выраженности гумор&чьного звена иммунитета животных показала, что в сыворотках мышей, вакцинированных бактериями штаммов F. tularensis RVpl7 и RVplS, значимые титры антител к микобактериальным антигенам Ag85B и ESAT-6 отсутствуют, тогда как титры антител к суммарному туляремийному антигену, индуцируемые бактериями F. tularensis 15/10, F. tularensis RVpl7 и F. tularensis RVpl8, находились в диапазоне значений -(1 :170-1 : 2620).

Протектизность полученных рекомбинантных штаммов F. tularensis оценивали на мышиной модели легочной формы экспериментального туберкулеза, вызванной штаммами М. tuberculosis H37Rv и Erdman. Полученные данные по обсеменности легких и селезенки мышей, иммунизированных контрольными штаммами М. bovis BCG, F. tularensis LVS, F. tularensis LVS (pPMCl) и рекомбинантными штаммами F. tularensis LVS 17 и LVS 18, через 28 сут после заражения групп мышей бактериями вирулентного штамма М. tuberculosis Erdman, приведены на рис. 10. Уровень обсемененности микобактериями легких и

7 6,5 6 5,5 : т 6,5 5,5 4,5 А щ J_ Iii 4- ÍÉ

Lg КОЕ Контр LVS pPMCl 17 18 BCG Контр. LVS рРМС1 17 18 BCG

легкие селезенка

Рисунок 10 - Обсемененность органов иммунных мышей после аэрозольного заражения М. tuberculosis Erdman.

селезенки мышей, вакцинированных штаммами F. tularensisLVSll и LVSI8, был существенно ниже, чем таковой у групп отрицательного контроля.

Протективность рекомбинантных штаммов, полученных на основе штаммов F. tularensis 15/10 и LVS, не превышала таковую туберкулезного вакцинного штамма М. bovis BCG, Протективность рекомбинантных штаммов была подтверждена гистолочески. Гистограммы срезов легких иммунных мышей C57BL, вакцинированных рекомбинантными бактериями штаммов F. tularensis LVS !7, LVS 18, F. tularensis LVS и M. bovis BCG, после аэрозольного заражения штаммом М tuberculosis Erdman приведены на рис. 11.

Рисунок 11 - Гистологические срезы ткани легких мышей на 28 сутки после инфицирования бактериями М tuberculosis Erdman.

Таким образом, целенаправленная модификация вакцинных штаммов F. tularensis позволяет получать информацию о влиянии изучаемого гена на иммуногенность к вирулентность туляремяйного микроба. Полученные данные о протективных свойствах созданных стабильных рекомбинантных штаммов указывают на перспективность применения вакцинного штамма F. tularensis 15/10 в качестве бактериального вектора для создания комбинированных вакцин нового поколения.

Созданные молекулярные инструменты для модификации генома вакцинного штамма F. tularensis 15/10 открыли широкие перспективы для изучения молекулярно-генетических механизмах патогенности и иммуногенности F. tularensis с целью создания туляремийных вакцин нового поколения.

выводы

1. Адаптирован способ переноса плазмидных ДНК в клетки F. lularensis методом криотрансформации. Наличие ионов магния является необходимым условием переноса плазмид в клетки F. tularensis при использовании метода замораживания-оттаивания бактерий.

2. Впервые показана возможность мобилизации плазмидных ДНК из клеток

E. coli в клетки F. tularensis в результате скрещивания. Оптимизированы условия конъюгации и мобилизации плазмидных ДНК из клеток Е. coli в клетки

F. tularensis

3. Показано, что при конъюгативном переносе плазмиды pSa из клеток Е. coli в клетки F. tularensis в результате спонтанной мутации появляется плазмида pSa', способная к высокоэффективному «челночному» переходу между клетками Е. coli и F. tularensis, не требующему наличия «плунжерных» плазмид.

4. Впервые охарактеризована структурно-функциональная организация крип-тической плазмиды pFNLIO из штамма F. novicida like F6168. Плазмида pFNLIO, имеющая 3990 п. н. и содержание Г+Ц-пар, равное 32%, способна к репликации в бактериях F. tularensis. Плазмида pFNLIO содержит все генетические элементы, необходимые для репликации по механизму тета-типа, а также оперон Phd-Doc системы.

5. Созданы рекомбинантные плазмиды на основе репликонов плазмид рС194 и pTV24, позволяющие экспрессировать в клетках туляремийного микроба антигены У. pestis и В. anthracis с целью создания поливалентных вакцинных препаратов.

6. Сконструирован стабильный плазмидный вектор pPMCl на основе реплико-иа плазмиды pFNLIO для экспрессии гетерологичных антигенов в вакцинном штамме туляремийного микроба.

7. Показана возможность повышения уровня экспрессии гибридных генов, кодирующих гетерологичные белки, в клетках F. tularensis в результате присоединения к структурной части гена лидерной части предшественника основного белка внешней мембраны FopA F. tularensis.

8. Созданы стабильные штаммы F. tularensis RVpl7 и RVpl8, экспресснрующие микобактериальные антигены Ag85B и ESAT-6 и индуцируюшие специфический протек гивный противотуберкулезный Т-клеточный иммунный ответ у вакцинированных мышей. Показана принципиальная возможность использования туляремийного вакцинного штамма в качестве бактериального вектора при создании прототипов рекомбинантных вакцинных штаммов.

9. Показана возможность гомологичной рекомбинации в геноме F. tularensis. Разработаны плазмидные векторы и метод аллельного обмена в хромосоме F. tularensis, позволяющий удалять участки генома, модифицировать регуля-торные и другие области оперонов и получать генетически маркированные штаммы, что позволяет проводить детальный анализ влияния выбранных генов на вирулентность и иммуногенность туляремийного микроба.

10. Геном F. tularensis содержит две копии гена iglC, кодирующего 23 кДа белок. Вариант вакцинного штамма, лишенный двух копий гена iglC, не размножается в мышиных макрофагоподобных клетках и не защищает мышей от гибели при экспериментальной туляремийной инфекции,

11. Показано, что супероксиддисмутаза F. tularensis, кодируемая геном sodB, необходима для жизнедеятельности туляремийного микроба. Бактерии F. tularensis с пониженным содержанием БеСОД менее вирулентны для мышей, чем исходный штамм F. tularensis LVS.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ А) в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Павлов В.М., Мокриевич А.Н. Создание векторной плазмиды для Francisella tularensis II Проблемы особо опасных инфекций,- Саратов, 1994,-Вып.4-№74. .-С. 191-194.

2. Мокриевич А.Н., Фурсов В.В., Павлов В.М. Криотрансформация туляремийного микроба плазмидной ДНК // Проблемы особо опасных инфекций,- Саратов, 1994.. - Вып. 4 - № 74. - С. 186-190

3. Павлов В.М., Родионова И.В., Мокриевич А.Н., Мещерякова И.С. Выделение и молекулярно-генетическая характеристика криптической плазми-

ды из Francisella исл'/сгг/а-подобного штамма F6168. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1994. -№ 3. - С. 39^40.

4. Pavlov V.M., Mokrievich A.N. and Volkovoy К. Cryptic plasmid pFNLlO from Francisella novicida-Wkt F6168: the base of plasmid vectors for Francisella tularensis. IIFEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1996. - V. 13. P. 253256.

5. Павлов B.M., Мокриевич A.H., Носков A.H. и Ураков Н.Н. Туляремий-ный вакцинный штамм-потенциальный бактериальный вектор. // Вестн. Мед. Акад. Наук. - 1997. - № 3. - С. 15-17

6. Алимов А.П., Павлов В.М. Патент РФ на изобретение № 2110575 - ре-комбинантная плазмидная ДНК pro PF5, определяющая синтез капсуль-ного антигена F1 возбудителя чумы и протективного антигена возбудителя сибирской язвы, и способ конструирования рекомбинантной плазмид-ной ДНК pro PF5 // Бюллетень № 13 от 10.05.1998.

7. Померанцев А.П., Павлов В.М. // Плазмида pCSE4 для клонирования промотор-содержащих фрагментов ДНК в туляремийном микробе // Вест. РАМН. - 1999. - № 12. - С. 29-32.

8. Pomerantsev А.Р., Golovliov I.R., Ohara Y., Mokrievich A.N., Obuchi M., Norqvist A., Kuoppa K., Pavlov V.M. Genetic organization of the Francisella plasmid pFNLlO // Plasmid. - 2001. - V. 46 -N. 3. - P. 210-22.

9. Golovliov I., Sjostedt A., Mokrievich A., Pavlov V. A method for allelic replacement in Francisella tularensis II FEMS Microbiol Lett. - 2003. - V. 222-N.2.-P. 273-80.

10.Bakshi C.S., Malik M., Regan K., Melendez J.A., Metzger D.W., Pavlov V.M., and Sellati T.J. Superoxide dismutase В gene (iotttîl-deficient mutants of Francisella tularensis demonstrate hypersensitivity to oxidative stress and attenuated virulence // J Bacteriol.. - 2006. - V.188. - P. 6443-6448.

Н.Кравченко Т.Б., Платонов M.E., Вахрамеева Г.М., Баннов В.А., Кудрявцева Т.Ю., Мокриевич А.Н., Павлов В.М. Клонирование и экспрессия про-тективных антигенов Mycobacterium tuberculosis Ag85 и ESAT-6 в клет-

ках FranciseUa tularensis 15/10 // Биохимия - 2007. - T.72. - № 7. - С. 905914.

12.Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Домотенко Л.В., Храмов М.В. Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований FranciseUa tularensis И Пробл. особо опасных инфекций,-Саратов, 2009. - № 102. - С. 66 - 67

13.Мокриевич А.Н., Кондакова А.Н., Валаде Э., Платонов М.Е., Вахрамеева Г.М., Шайхутдинова Р.З., Миронова Р.И., Блаха Д., Бахтеева И.В., Тита-рева Г.М., Кравченко Т.Б., Комбарова Т.Н., Видаль Д., Павлов В.М., Линднер Б., Дятлов И.А., Книрель Ю.А. Биологические свойства и строение липополисахарида вакцинного штамма FranciseUa tularensis, полученного при инактивации гена системы «чувства кворума» qseC* // Биохимия,- 2010. - Т. 75. -Х« 4. - С. 539 - 548.

Б) в прочих изданиях:

14.Павлов В.М., Мокриевич А.Н. Клонирование гена Francisella tularensis, кодирующего синтез RecA-подобного белка, з Escherichia coli И Актуальные проблемы профилактики туляремии: Тезисы докладов Всесоюзной конференции. - Симферополь, 1991. - С.142.

15.Никитин А.Н.; Еремин С.А.; Павлов В.М., Дроздов И.Г. Генетическая трансформация туляремийного микроба плазмиднои ДНК // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций: Тезисы докладов Всесоюзной конференции. - Волгоград, 1992. - С. 45

16.Родионова И.В., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Мещерякова И.С. Выделение и молекулярно-генетическая характеристика плазмидной ДНК pFNLlO из штамма FranciseUa novicida-\ikc F 6168 // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций: Материалы Российской научной конференции.- Саратов, 1993. - С. 302

17.Pomerantsev, А.Р., Pavlov V.M., Urakov N.N. FranciseUa tularensis-. behaviour of heterologous plasmids // First International Conference on Tularemia (Aug.23-25,1995). Umea, Sweden: Abstracts.- 1995.- P. 13

lS.Norqvist A., Kuoppa K., Pavlov V.M., Sandstrom G. Construction and characterization of a cloning vector for use in Francisella tularensis // First International Conference on Tularemia (Aug.23-25, 1995). Umea, Sweden : Abstracts- 1995.- P. 28.

19.Tedikov V.M., Mokrievich A.N., and Pavlov V.M. Cloning of ori pXOl and pag gene of B. anthracis in Francisella tularensis II Salisbury Med. Bull.- Special Suplement no. 87,- 1996.-P. 98.

20.Pavlov V.M., Mokrievich A.N. and Pomerantsev A.P. Plasmid vectors for vaccine strain Francisella tularensis // Medizinische B-Schutz-Tagung des BWVg 22 und 23 oct. 1997.- 1997.- P. 10.

21.Pavlov V.M. Methodical approaches to designing recombinant live vaccine Francisella tularensis straines // Second International Conference on Tularemia (9-11 oct. 1997, Hradec Kralove, Czech Republic): Vojenske Zdravotnicke Listy.-Suplementum.-1997.- Rocnik LXI. - P. 4-5.

22.Mokrievich A.N., Pavlov V.M., Rodionova I.V., Meshcheryakova I.S. Restriction map of pFNLlO plasmid // Second International Conference on Tularemia (9-11 oct. 1997, Hradec Kralove, Czech Republic): Vojenske Zdravotnicke Listy - Suplementum.- 1997.- Rocnik LXVI. - P. 13-14

23.Pavlov V.M., Mokrievich A.N., Staritsyn N.A., Shishkova N.A. Rec-A like Francisella tularensis strain: Isolation and properties // Second International Conference on Tularemia (9-11 oct. 1997, Hradec Kralove, Czech Republic): Vojenske Zdravotnicke Listy - Suplementum.- 1997,- Rocnik LXVI. - P. 1415

24.Pomerantsev A.P., Pavlov V.M. Molecular tools for study of transcriptional regulation in Francisella tularensis II Second International Conference on Tularemia (9-11 oct. 1997, Hradec Kralove, Czech Republic): Vojenske Zdravotnicke Listy - Suplementum.- 1997.- Rocnik LXVI. - P. 10

25.Kravchenko T.B., Mokrievich A.N and Pavlov V.M. Immunobiological properties of recombinant vaccine strain of Francisella tularensis producing protective antigen of Bacillus anthracis II 3rd International Conference on Anthrax (University of Plymouth, 7-10 th September 1998): Abstract Book.- 1998,- P. 35.

26.Bannov V.A., Kudriavtseva T.Yu., Mokrievich A.N., Eruslanov B.V., Shishkova N.A., Verevkin V.V., Pomerantsev A.P., Pavlov V.M. Study of OmpS Legionella pneumophyla gene expression in the tularemia microbe vaccine strain // Problems of Medical and Ecological Biotechnology. The International Conference (December 14 -15). Obolensk, Russia. - 1999.- P. 13.

27.Kravchenko T.B., Titareva O.M., Bakhteeva I.V., Shishkova N.A., Pavlov V.M., Urakov N.N. Study of immune properties of the strain Francisella tularensis synthesizing Omps protein Legionella pneumophyla I I Problems of Medical and Ecological Biotechnology. The International Conference (December 14 -15). Obolensk, Russia. -1999 - P. 81.

28.Kudriavtseva T.Yu., Pavlov V.M., Urakov N.N., Eraslar.ov B.V. Isolation of Legionella pneumophyla outer membrane protein and analysis of this protein expression by recombinant strains // Problems of Medical and Ecological Biotechnology. The International Conference (December 14 - 15). Obolensk, Russia.-1999.- P. 87.

29.Pomerantsev A.P., Mokrievich A.N., Golovlev LP., Pavlov V.M. Nucleotide sequence, structural organization and functional activity of the piasmid pFNLlO specific for bacteria of Francisella species // Problems of Medical and Ecological Biotechnology. The International Conference (December 14 - 15). Obolensk, Russia. - 1999.-P. 126

30.Pavlov V.M. Genetics of tularemia microbe. // Problems of Medical and Ecological Biotechnology. The International Conference (December 14 -15). Obolensk, Russia. - 1999.- P. 289.

31.Платонов M.E., Мокриевич А Н. и Павлов В.М. Conjugative transfer of piasmid DNA from Escherichia coli into Francisella tularensis // Международная конференция Проблемы биологической и экологической безопасности (22-24 мая). Государственный научный ценр прикладной микробиологии, Оболенск, Россия. - 2000,- С. 76-78.

32.P!atonov М., Titareva G., Kravchenko Т. and Pavlov V.M. Immunobiological properties of Francisella tularensis with inactivated gene (iglC) encoding 23-kD protein // Fourth International Conference On Tularemia (September 1519). City of Bath, Great Bretain. - 2003. - P. 48.

33.Mokrievich A.N., Pavlov V.M. 2003. Conjugal transfer pSa piasmid from Escherichia coli in Francisella tularensis. // Fourth International Conference On Tularemia (September 15-19). City of Bath, Great Bretain. - 2003. - P. 49.

34. Piatonov M., Mokrievich A., Kravchenko Т., Shishkova N., and Pavlov V.M. 2003. Cloning of iron-dependent superoxide dismutase (SodA) oiMycobacterium tuberculosis in Francisella tularensis 15/10 // Fourth International Conference On Tularemia (September 15-19). City of Bath, Great Bretain. - 2003. -P. 50.

35.Мокриевич A.H, Павлов В.М. Francisella tularensis и межвидовой обмен генетической информации. //Юбилейной научной конференции, посвященной 75-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 2003); - 2003. - С. 147.

36.Kravchenko Т.В., Mokrievich A.N., Piatonov М.Е., Vahrameeva G.M., and Pavlov V.M. Development of recombinant Francisella tularensis vaccine strains carrying additional protective antigens. In the book of abstracts of the 1-

st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology. Badajoz, Spain, 2005, p.861

37.Platonov M.E., Mokrievich A.N., and Pavlov V.M. Piasmid conjugation and mobilization from Escherichia coli into Frcmcisella tularensis // 1-st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (March 15-18). Badajoz, Spain. - 2005. - P. 861

38.Платонов M. E., Мокриевич A. H., Кравченко Т. Б., Вахрамеева Г. М., Шишкова Н. А., Павлов В. М. Экспрессия генов протективных антигенов туберкулезного микроба в вакцинном штамме Francisella tularensis 15/10 // 3-ий Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (14-18 марта). Москва, Россия. — 2005. - С. 85.

39.Pavlov V.M., Mokrievich A., Platonov М., Kravchenko Т. Vachrameeva G., Titareva G., Bakhteeva I., Mironova R., Parra M., Elkins K.L., Brennan M.J. New bacterial vector for Mycobacterium tuberculosis protective antigens // The 2006 NIAID Research Conference (June 24-30). Opatija, Croatia. - 2006,- P. 43

40.Кравченко Т.Е., Мокриевич A.H., Платонов M.E., Вахрамеева Г.М., Кудрявцева Т.Ю., Баннов В.А., Миронова Р.И., Комбарова Т.И., Потапов

B.Д., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Галина Е.А, Павлов В.М. Вакцинный штамм Francisella tularensis - новый бактериальный вектор для протективных антигенов Mycobacterium tuberculosis // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств/ VII-я Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ (3-5 октября). Оболенск, Россия. - 2006. -

C. 147-148.

41.Павлов В.М., Кравченко Т. Б., Мокриевич А. Н., Платонов М. Е., Вахрамеева Г. М., Кудрявцева Т. Ю., Баннов В. А., Миронова Р. И., Комбарова Т. И., Потапов В. Д., Бахтеева И. В., Титарева Г. М., Ганина Е. А. Противотуберкулезная протективная активность туляремийного вакцинного штамма с антигенами Mycobacterium tuberculosis 85В И ESAT-6 // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней» (11-12 ноября). Москва, Россия. - 2008. - С. 95.

Подписано в печать:

21.02.2011

Заказ № 5007 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Павлов, Виталий Михайлович

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛС

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Туляремийная инфекция - общие сведения

1.2. Таксономия рода РгапшэеИа

1.3. Геном К Ш1агет1$

1.4. Рли1агеп51Б и плазмиды

1.5. Факторы патогенно сти Р. ШШгепягя

1.6. Генетические и генно-инженерные методы исследования 37 бактерий Т7. ш1агет1Б

1.6.1. Клонирование генов

1.6. 2. Мутагенез Р. Ы1агет

1.7. Туляремийные вакцины

1.7.1. Вакцины, приготовленные из убитых клеток

1.7.2. Химические вакцины

1.7.3. Живая туляремийная вакцина

1.8. Рекомбинантные вакцины

1.9. Характеристика белков - протективных антигенов возбудите- 52 ля туберкулеза

Введение Диссертация по биологии, на тему "Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis"

Актуальность проблемы

Разработка современных лекарственных препаратов для лечения- инфекционных заболеваний и средств их профилактики основывается, на детальных данных о молекулярных структурах факторов, патогенности и механизмах их действия. В частности, для. создания вакцин важно знать, какие антигены являются протективными, а какие компоненты бактерий подавляют защитную функцию иммунной системы организма. История изучения возбудителя туляремии насчитывает более ста лет, однако до настоящего времени нет исчерпывающих сведений .о факторах патогенности бактерий Francisella tularensis, их молекулярных структурах и механизмах действия (Titball R. W. et al., 2003; Домарадский И. В., 2005; Sjostedt А., 2006). Исследование генома туляремийного микроба является' одним из магистральных направлений решения проблем, связанных с разработкой новых и совершенствованием уже имеющихся средств и методов борьбы с туляремией. Проведенные недавно работы по определению нуклеотидных последовательностей геномов аттенуированного вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarc-tica LVS [http://bbrp.llnl;gov/bbrp/html/microbe. html] и природного штамма F. tularensis subsp. tularensis Schu4 (Larsson P. et al., 2005) открыли широкие перспективы для изучения факторов патогенности и поиска протективных антигенов •туляремийного микроба.

До недавнего времени адаптация общепринятых генетических методов для исследования генома F. tularensis представляла собой достаточно сложную проблему, что существенно препятствовало эффективному применению всего современного методического потенциала микробиологии для решения задач по выявлению факторов-патогенности и иммуногенности туляремийного микроба.

•Детальное исследование молекулярной структуры криптической плаз-миды из бактерий F. novicida like F6168 (Родионова И. В. и др. 1991) позволит получить новые данные о влиянии данной плазмиды на биологические свойства бактерий рода Francisella и получить информацию, необходимую для конструирования плазмидных векторов.

Важным этапом в исследованиях геномов микроорганизмов является перенос генетических структур в бактериальные клетки изучаемых микроорганизмов. Отсутствие информации о плазмидах, способных реплицироваться в F. tularensis, до последнего времени сдерживало адаптацию переноса ДНК в клетки туляремийного микроба методами трансформации. Оптимизация методов криотрансформации и конъюгации для F. tularensis позволит переносить в бактерии генетические конструкции для аллельного обмена и создавать модельные штаммы для изучения метаболизма туляремийного микроба.

Показано, что бактерии штамма F. tularensis LVS модулируют белковый синтез, во время роста в макрофагах. Среди белков, индуцируемых при размножении бактерий F. tularensis внутри макрофагов, выделяется' белок с молекулярной массой 23 кДа (Golovliovl. etal., 1997), однако функциональная роль этого белка в патогенезе F. tularensis до последнего времени выяснена не была. Одним из путей решения этой проблемы может стать разработка метода аллельного обмена генов в хромосоме F. tularensis, позволяющего конструировать изогенные штаммы, отличающиеся только по изучаемому гену.

Первичным защитным барьером прокариотических и эукариотических клеток являются белки семейства суперокиддисмутаз (СОД), которые превращают токсичный радикал 02 в молекулярный кислород Ог и перекись водорода (Н202) (Miller R. A. et al., 1997). У туляремийного микроба также выявлена СОД (Шимоняк Н. И. и др., 1992), тем не менее, роль этого фермента в патогенезе туляремии и в бактериальном метаболизме до последнего времени не была выяснена. Попытки инактивации СОД в других патогенных микроорганизмах приводили к потере жизнеспособности бактерий. Поскольку метод аллельного обмена позволяет не только инактивировать гены, но и модулировать их синтез, этот подход может быть использован для изучения СОД туляремийного микроба.

Поскольку обе вакцины обладают определенной реактогенностью, обусловленной не охарактеризованными пока факторами патогенности (Олсуфьев Н. Г., 1975), то проводимый в настоящее время сравнительный анализ нук-леотидных последовательностей геномов вакцинного штамма LVS и природных штаммов, несомненно, облегчит задачу создания генетически охарактеризованного современного вакцинного штамма без остаточных факторов ре-актогенности. Очевидно, что без эффективных методов целенаправленного аллельного замещения невозможно достижение существенных успехов в понимании молекулярных основ действия факторов как реактогенности, так и иммуногенности туляремийного микроба.

В качестве бактериальных векторов для получения рекомбинантных вакцин используют целый ряд микроорганизмов, среди которых: аттенуиро-ванные штаммы М. tuberculosis (Ellner J. J., 1998; SenaratneR. H, et al., 2007; Henao-Tamayo M. et al., 2007), близкородственные микобактерии (Abou-Zeid C. et al., 1997), а также сальмонеллы (Mollenkopf H. J. et al., 2001) и некоторые другие (Miki К. et al., 2004). Известно, что туляремийная вакцина, обладая умеренной реактогенностью, вызывает формирование длительного напряженного иммунитета (Tarnvik А., 1989). Кроме специфического иммунитета вакцинные штаммы F. tularensis индуцируют краткосрочную неспецифическую защиту против других внутриклеточных патогенов - Legionella, Listeria и др. (Belyi Y. F. et al., 1996). До последнего времени изучение имму-номодулирующих свойств штамма F. tularensis 15/10 сдерживалось из-за отсутствия генетических методов по переносу дополнительных генов, кодирующих протективные антигены, в клетки вакцинного штамма туляремийного микроба. Изучение иммунобиологических свойств вакцинного штамма туляремийного микроба с гетерологичными протективными антигенами, в частности, с наиболее иммуногенными антигенами Ag85B и ESAT-6 М. tuberculosis, позволит оценить потенциал использования вакцинного ту-ляремийного штамма в качестве нового бактериального вектора.

Все вышеизложенное обосновывает актуальность разработки* молекулярных инструментов для- всестороннего исследования туляремийного микроба. Полученные модифицированные штаммы туляремийного микроба* смогут открыть новые перспективы для изучения иммунобиологических свойств туляремийного микроба и получить детальную информацию о факторах па-тогенности и иммуногенности F. tularensis.

Цель и задачи исследования

Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи:

2. Определить и проанализировать нуклеотидную последовательность критической плазмиды из. бактерий F. novicidaAike F6168, а также исследовать функциональную активность выявленных плазмидных генов.

3. Создать ряд плазмидных векторов для' клонирования промоторов и экспрессии гетерологичных генов протективных антигенов в клетках F. tularensis и изучить их свойства.

5. Разработать систему аллельного замещения генов в хромосоме туляремийного микроба и способ получения вариантов вакцинного штамма F. tularensis с модифицированными генами iglC и sodB.

Новизна исследования

Впервые разработана система для аллельного замещения генов в хромосоме F. tularensis. Созданы плазмидные векторы для конструирования плазмид, необходимые для осуществления аллельного обмена в хромосоме F. tularensis. Предложенный метод позволяет: а) удалять определенные участки генома F. tularensis, б) модифицировать регуляторные и другие области оперонов; в) получать генетически маркированные вакцинные штаммы F. tularensis.

Показано снижение экспрессии гена sodB в F. tularensis в результате замены последовательности нуклеотидов инициирующего кодона ATG на GTG в гене sodB. Вакцинный штамм со сниженным уровнем синтеза белка СОД В обладает меньшей вирулентностью для мышей, чем немодифициро-ванный вакцинный штамм.

Впервые показана возможность введения> плазмид в вакцинный штамм туляремийного микроба методом криотрансформации. Оптимизированы условия криотрансформации F. tularensis^

Впервые получен вариант конъюгативной плазмиды pSa, способный с высокой эффективностью переноситься из клеток Е. coli в клетки F. tularensis и, наоборот, из F. tularensis в Е. coli.

Проведено структурно-функциональное исследование криптической. плазмиды из рода Francisella — плазмиды pFNLlO. Выявлена способность плазмиды pFNLlO стабильно-реплицироваться в клетках вакцинного штамма, туляремийного > микроба. Показано, что вклад в, стабильность наследования плазмиды pFNLlO бактериями,Е. tularensis вносят продукты-плазмидных генов, кодирующих белки, гомологичные белкам Phd-Doc системыфага Р 1.

Впервые' созданы стабильные плазмидные векторы для> вакцинного штамма F. tularensis, позволившие приступить к изучению возможности использования туляремийного вакцинного штамма в качестве реципиента при создании современных рекомбинантных вакцинных штаммов.

Впервые на основе вакцины F. tularensis 15/10 созданы штаммы, синтезирующие протективные. антигены возбудителя туберкулеза. Показан, повышенный синтез клетками F. tularensis гибридных белков,, состоящих из ди-дерной части предшественника основного белка внешней, мембраны F. tularensis Fop А и белкового антигена М tuberculosis.

Впервые показано формирование специфического иммунного ответа на туберкулезные антигены у мышей, вакцинированных штаммами.F. tularensis, синтезирующими протективные антигены возбудителя туберкулеза. Вакцинированные мыши обладали повышенной устойчивостью к аэрозольному заражению возбудителем туберкулеза.

Практическая значимость

Сконструированы, штаммы F. tularensis RVp 17 и RVpl8, способные к синтезу основных протективных антигенов- возбудителя туберкулеза, которые могут служить основой для разработки новой рекомбинантной живой туберкулезной вакцины.

В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ГКПМ-Оболенск) депонированы 11 авторских штаммов, необходимые для изучения генетических детерминант факторов иммуногенности и патогенности возбудителя туляремии, а также сайт-направленного мутагенеза туляремийного микроба.

Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при составлении ниже перечисленных документов: Методические указания МУ 3.3.1.2161-07 «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба»1 (Федеральный уровень внедрения, 2007 г.), Методические рекомендации «Сайт-направленный мутагенез генома туляремийного микроба» (Учрежденческий уровень внедрения, 2003 г.) и Методические рекомендации «Сайт-направленный мутагенез генома туляремийного микроба» (Учрежденческий уровень внедрения, 2009 г.)

Положения, выносимые на защиту:

1. Комплекс методических приемов, позволяющих переносить плазмиды в бактерии F. tularensis 15/10 методами криотрансформации и мобилизации. Вариант конъюгативной плазмиды pSa, при скрещивании который способен переходить из клеток Е. coli в бактерии F. tularensis 15/10 и обратно. Методология1 переноса плазмид в клетки F. tularensis позволяет создавать генетически маркированные штаммы, необходимые для всестороннего изучения факторов иммуногенности и патогенности ту-ляремийного микроба.

2. Плазмида pFNLlO, выделенная из штамма F. novicida like F6168, способна реплицироваться в F. tularensis и содержит все элементы для репликации по тета-механизму. Наличие в плазмиде pFNL 10-генов, кодирующих белки, гомологичные белкам Phd-Doc системы, обуславливает высокую стабильность наследования данной плазмиды бактериями F. tularensis. Плазмида pFNLlO является основой для создания, плаз-мидных векторов для F. tularensis.

6. Ген iglC в хромосоме F. tularensis находится в двух копиях. Направленное "выключение" синтеза 23 кДа белка, кодируемого геном iglC, в штаммах F. tularensis 15/10 и LVS приводит к подавлению способности клеток F. tularensis к внутримакрофагальному размножению.

7. Продукт гена sodB F. tularensis необходим для жизнеспособности туляремийного микроба. Замена инициирующего кодона ATG на GTG в гене sodB приводит к снижению уровня экспрессии гена sodB в клетках F. tularensis. Штамм F. tularensis FtsodB, несущий модифицированный ген sodB, обладает сниженной вирулентностью для мышей по сравнению с исходным штаммом F. tularensis LVS.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ'

Материалы диссертации доложены и» представлены на 10 международных и 7 российских научных конференциях: Всесоюзной' научной конференции «Актуальные проблемы профилактики туляремии» (Симферополь, 1991); XIV научно-практической конференции ГосНИИПМ "Новые технологии и биосистемы. Достижения и перспективы" (Оболенск, 1991); Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград, 1992); Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, 1993); Международной конференции "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000); Юбилейной научной конференции, посвященной 75-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 2003); 3-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); VII-й Межгосударственной научно-практической- конференции государств-участников СНГ (Оболенск, 2006); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); First International Conference on Tularemia (Umea, Sweden, 1995); Second International Conference on Tularemia (Hradec Kralove, Czech Republic, 1997); 3rd International Conference on Anthrax University of Plymouth, (UK, 1998); International Conference 'Probth lems of Medical and Ecological Biotechnology (Obolensk, 1999); 4 International Conference on Tularemia (City of Bath, UK, 2003); First International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology "BioMicroWorld-2005" (Badajoz, Spain, March, 2005); NIAID Research Conference (Opatia, Croatia, 2006); 5th International Conference on Tularemia Marine Biological Labs Woods Hole, MA, (USA, 2006).

Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторной научном семинаре ГНЦ ПМБ 30 июня 2010 г. протокол № 15.

ПУБЛИКАЦИИ

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Работа состоит из введения; обзора литературы; собственных исследований, включающих описание материалов, методы исследований и экспериментальную часть; заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 252 страницах, содержит 31 таблицу и 69 рисунков. Список литературы включает 278 работы (из них 62 отечественных и 216 зарубежных).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Павлов, Виталий Михайлович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанные и адаптированные1 нами методы переноса плазмид в клетки туляремийного микроба с помощью, криотрансформации, электропо-рации-и'конъюгации позволяют не только детально изучать механизмы) переноса, плазмид в бактерии F. tularensis, но и исследовать влияние плазмид, на иммунобиологические свойства туляремийного микроба. Кроме того, такие работы тесно связаны с проблемой изучения эволюции туляремийного микроба.

Обнаружение того факта, что ряд плазмид из бацилл и стафилококков способны реплицироваться и экспрессировать свои гены антибиотикоустой-чивости в туляремийном микробе, позволило нам показать, что метод криотрансформации позволяет с высокой эффективностью передавать плазмид-ные ДНК в клетки F. tularensis . Метод электропорации, адаптированный нами для штамма F. tularensis 15/10, также может быть применим для введения плазмидных ДНК в другие штаммы туляремийного микроба.

Проведенный детальный анализ единственной обнаруженной до^ недавнего времени плазмиды pFNLlO у бактерий рода Francisella позволил нам и ряду других исследователей создать серию векторных плазмид, необходимых для изучения возбудителя туляремии. Несмотря на целый ряд полученных, интересных результатов, остается не выясненным вопрос о биологической роли данной плазмиды в метаболизме бактерий рода Francisella.

Создание эффективных методов переноса плазмид в бактерии F. tularensis позволило приступить к разработке системы аллельного обмена в туляремийном микробе. Важность данной разработки определялась тем, что в последнем десятилетии накоплен большой объем информации о нук-леотидных последовательостях геномов различных подвидов F. tularensis, позволяющий проводить внутривидовой сравнительный анализ генетических структур туляремийного микроба, но и осуществлять поиск гомологий с геномами других видов бактерий. Выявленные особенности позволяют углубить наши знания молекулярно-генетических механизмов изучаемых генов в метаболизме возбудителя туляремии.

Созданная нами плазмида рНУЗЗ'шоЬ с уникальными свойствами репликации,в туляремийного микробе с меньшей.скоростью, чем деление клеток К ¿и/ягеляи', явилась основой для создания нового вектора для аллельного обмена, позволяющего использовать не только метод' мобилизации, но и метод трансформации для< переноса созданных генетических конструкций в клетки туляремийного микроба

Поскольку теоретические выводы нуждаются в экспериментальной проверке, то метод аллельного обмена и является адекватным инструментом для решения задач подобного рода. Нами показано, что данный подход может быть использован не только для инактивации целевых генов; но и для модуляции уровня трансляции матричных РНК генов-мишеней. Не вызывает сомнений, что спектр использования разработанного метода аллельного обмена может быть расширен.

Выбранный нами ген щ1С для-демонстрации эффективности метода аллельного обмена позволил нам не только получить штаммы с делегированным геном но и показать, что в геноме туляремийного микроба находится две копии этого гена. Анализ нуклеотидной последовательностей, проведенных другими исследователями позднее, подтвердил наш вывод. Оказалось, что ген iglC находится на острове патогенности и в геноме К Ш/ш'етшя имеются две копии этого острова патогенности. Изучение свойств вариантов вакцинного штамма с делетированной одной и двумя копиями гена iglC позволило углубить наши знания об иммунопатогенезе туляремийного микроба.

Метод аллельного обмена является ключевым при создании современной живой туляремийной вакцины, поскольку такая работа должна основываться на максимально полной картине иммуннопатогенеза туляремийного микроба.

Нами были проведены исследования по возможности создания поливалентных вакцинных штаммов на основе Р. ШШгеттэ 15/10, формирующего иммунитет к нескольким возбудителям инфекционных заболеваний, таким, как туберкулез, чума и сибирская язва. Поскольку используемый вакцинный штамм Р. Ы1агегт8 15/10 обладает определенными недостатками, то в настоящее время нами ведутся исследования по снижению реактогенности и изучению возможности создания вакцинного штамма, отвечающего всем современным требованиям вакцинологии.

Созданный стабильный плазмидный вектор рРМС1 позволил нам впервые показана возможность экспрессии генов микобактериальных антигенов в клетках вакцинного штамма Р. ы1агепБ18 15/10 и Г. ¿м/штум1 ЬУ8. Для эффективной экспрессии микобактериальных антигенов в клетках туля-ремийного микроба нами были сконструированы гибридные гены, состоящие из лидерной части РорЬ мембранного белка БорА Р. ййагепзгз и структурных частей зрелых белков Ag85B и слитного белка Ag85B-ESAT6.

Полученные экспериментальные данные позволяют с уверенностью утверждать, что данное направление работы является перспективным. Однако, следует отметить, что плазмидная локализация гибридных генов протектив-ных антигенов нежелательна согласно требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам, в частности, требованию по исключению генов, кодирующих устойчивость бактерий к антибиотикам. Метод аллельного обмена позволяет решить эту проблему в результате встраивания дополнительных конструкций в несущественные для метаболизма области хромосомы вакцинного штамма туляремийного микроба.

Принципиальная новизна полученных результатов заключается в том, что впервые созданы молекулярные инструменты, позволившие приступить к целенаправленному созданию живой туляремийной вакцины нового поколения. Разработанная методология позволила получить новые сведения о моле-кулярно-генетических механизмах патоиммуногенеза Р. (ЫагепБгя.

Анализ публикаций в области молекулярно-генетических исследований бактерий рода РгапшеИа позволяет констатировать, что данные, полученные в ходе выполнения данной диссертационной работы, широко цитируются в научной литературе, что говорит о их современности и актуальности.

Анализ результатов диссертационной работы позволяет сделать вывод о том, что все поставленные задачи решены, а полученные результаты явились базой для решения прикладных задач по созданию новых средств профилактики, лечения и диагностики заболевания туляремией.

Информация о работе

Павлов, Виталий Михайлович
доктора биологических наук
Оболенск, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы