Изучение молекулярно-биологических свойств вариантов вакцинного штамма Francisella tularensis с делетированными генами системы рекомбинации recA и recD

Лапин, Александр Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение молекулярно-биологических свойств вариантов вакцинного штамма Francisella tularensis с делетированными генами системы рекомбинации recA и recD
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение молекулярно-биологических свойств вариантов вакцинного штамма Francisella tularensis с делетированными генами системы рекомбинации recA и recD"

На правах рукописи

Лапин

Александр Александрович

ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВАРИАНТОВ ВАКЦИННОГО ШТАММА РМКаБЕГХА ТиМЯМБН С ДЕЛЕТИРОВАННЫМИ ГЕНАМИ СИСТЕМЫ РЕКОМБИНАЦИИ НЕСЛ И ШСП

03.02.03 - микробиология 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-6 ОКТ 2011

Оболенск - 2011

4855177

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Кандидат физико-математических наук Павлов Виталий Михайлович Кандидат медицинских наук Мокриевич Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Гремякова Татьяна Андреевна Кандидат биологических наук Воложанцев Николай Валентинович

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

Защита состоится Рг^^^Ф 2011 г. на заседании диссертационного

совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «/(; »О? К Я1 2011 г. Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Н.К. Фурсова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Туляремия - зоонозная инфекция, имеющая природную очаговость. На территории Российской Федерации природные очаги туляремии распространенны повсеместно, поэтому наблюдаемый в настоящее время уровень заболеваемости (по данным ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора, в 2010 г. зарегистрировано 115 случаев туляремии, по сравнению с 2009 г. - 57 случаев) представляет несомненную проблему для Российского здравоохранения.

Возбудителем туляремии является микроорганизм Francisella tularensis. В современной классификации выделяют четыре подвида F. tularensis: subsp. tularensis, subsp. holarctica, subsp. mediaasiatica и subsp. novicida. Наиболее тяжелую форму заболевания вызывает F. tularensis subsp. tularensis, циркулирующий на территории Северной Америки (Ellis et al., 2002).

Для профилактики туляремии в РФ используется живая вакцина, которая формирует длительный напряженный иммунитет. Основным недостатком данной вакцины является ее некоторая реактогенность и нестабильность (Олсуфьев с соавт., 1960). Поэтому в настоящее время актуальной проблемой является создание нового поколения стабильных и менее реактогенных вакцинных туляремийных штаммов. Одним из способов стабилизации генома вакцинного туляремийного штамма представляется инактивирование элементов системы гомологичной рекомбинации.

Известно, что инактивирование гена гесА у вакцинного штамма Mycobacterium bovis BCG приводило к стабилизации генома данного микроорганизма и не влияло на его протективные свойства (Keller et al., 2008). Инактивация генов гесА и гесВС в клетках Salmonella приводила к снижению вирулентности для мышей и замедленному росту в макрофагах (менее выраженному в случае гесА мутантов) (Buchmeier et al., 1993). Наличие дефекта в гене recD у Salmonella, продуктом которого является белок RecD, обладающий АТФ-азной (Chen et al., 1997) и хеликазной (Taylor et al., 2003) активностями, также приводило к аттенуации бактерий Salmonella для мышей и снижению их пролиферации в макрофагах (Cano et al., 2002).

Ранее было показано наличие функционально-активного гесЛ-подобного гена в геноме вакцинного штамма F. tularensis (Павлов с соавт., 1991) и в геноме F. tularensis subsp. novicida (Berg et al., 1992). При сравнительном анализе нуклеотид-

ной последовательности геномов видов Francisella были обнаружены также recD-подобные гены (Larsson et al., 2005).

Учитывая вышеизложенные факты, изучение влияния recÄ- и recD-подобных генов F. tularensis на генетические и биологические свойства вакцинного штамма ту-ляремийного микроба является на настоящий момент актуальной задачей, решение которой необходимо для создания нового поколения вакцинного штамма, а также для изучения эволюции туляремийного микроба

Цель исследования: изучение влияния генов системы гомологичной рекомбинации гесА и recD на биологические и иммунологические свойства вакцинного штамма F. tularensis.

Задачи исследования

1. Биоинформационный анализ генов системы гомологичной рекомбинации гесА и recD у F. tularensis.

2. Получение вакцинного варианта штамма F. tularensis 15/10 с делетированным геном гесА.

3. Получение продуцента Е. coli B121(DE3), экспрессирующего рекомбинантный белок RecA F. tularensis, выделение и очистка белка RecA.

4. Получение антител к рекомбинантному белку RecA F. tularensis и анализ экспрессии белка RecA в клетках туляремийного микроба.

5. Получение вакцинного варианта штамма F. tularensis 15/10 с делетированным геном recD.

6. Изучение влияния генов гесА и recD на свойства вакцинного штамма F. tularensis 15/10.

7. Выбор последовательностей нуклеотидов в гене recD для ПЦР-диагностики с гибридизационно-флуоресцентной детекцией подвидов F. tularensis; конструирование праймера, содержащего Chi-сайт Е. coli, для дифференциации подвидов туляремийного микроба.

Научная новизна

Впервые получены варианты вакцинного штамма F. tularensis 15/10 с инактиви-рованными генами системы гомологичной рекомбинации гесА и recD. Показано, что при инактивации гена гесА в геноме штамма F. tularensis 15/10 снижается вирулентность данного штамма, сохраняется его способность к персистенции в макрофагах и не ухудшаются вакцинные свойства. Установлено, что инактивация гена recD в гено-

ме штамма F. tularensis 15/10 приводит к аттенуированию штамма, при сохранении его протективных свойств и значительном снижении способности к гомологичной рекомбинации. Впервые показано отсутствие индукции белка RecA в клетках штамма F. tularensis 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты.

Практическая ценность работы

Созданы плазмиды pPVArecA, рРVArecD для аллельного обмена. Разработан алгоритм, позволяющий стабилизировать и аттенуировать вакцинный туляремийный штамм путем инактивации генов системы рекомбинации гесА и recD. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ (ГКПМКК-Оболенск) депонированы авторские штаммы F. tularensis subsp. ho-larctica 15/10ДгесЛ (per. номер 6622.) с делецией гена гесА, и F. tularensis subsp. ho-larctica 15/10 hrecD (per. номер B-6823) с делецией гена recD (Федеральный уровень внедрения). Результаты исследований послужили основой для составления двух патентов на изобретение: «Способ стабилизации вакцинного туляремийного штамма» №2010141704 от 11.10.2010 (Оболенск, 2010, Федеральный уровень внедрения) и «Способ аттеннуации вакцинного туляремийного штамма» №2011131560 от 28.07.2011 (Оболенск, 2011, Федеральный уровень внедрения). Материалы диссертации используются в программе подготовки аспирантов ФБУН ГНЦ ПМБ (учрежденческий уровень внедрения).

Положения, выносимые на защиту

1. Делеция гена гесА в геноме вакцинного штамма К /н/огами 15/10 приводит к снижению способности данного штамма к гомологичной рекомбинации. Инактивация гена гесА сопровождается повышением чувствительности к ультрафиолетовому излучению. Полученный штамм К /м/агеи^и 15/ЮАгесА сохраняет свои ростовые свойства и способность к размножению в макрофагах и не меняет свою устойчивость к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки. Жизнеспособность лио-фильно высушенной культуры К ш1аге№15 15/ЮДгесЛ не меняется в процессе ее хранения.

2. Антитела к рекомбинантному белку ЯесА распознают нативный белок ЛесА штамма К 1и1агегик 15/10. Количество белка ЯесА в клетках штамма К Ы1агет1$ 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты не меняется.

3. Делеция гена гесй в геноме штамма К Ш1агепз1$ 15/10 приводит к подавлению гомологичной рекомбинации. Штамм К /ы/аге/и« 15/10Дгес£) не меняет свою устойчивость к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки, обладает пониженными ростовыми свойствами и замедленной способностью к размножению в макрофагах, по сравнению с исходным вакцинным туляремийным штаммом.

4. У штамма Р. Ш1агет1з 15/10 с инактивированным геном гесА на порядок снижена вирулентность для мышей, при сохранении его протективных свойств. Делеция гена гесй у вакцинного туляремийного штамма приводит к его аттенуированию и сохранению протективных свойств.

5. Созданная система праймеров и зондов на основе вариабельной последовательности гена гесй позволяет проводить дифференциацию подвидов туляремийного микроба методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Сконструированный праймер, содержащий СЫ-последовательность Е.соН, позволяет различать подвиды туляремийного микроба методом ПЦР.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии туляремии (ЛМТ) ФБУН ГНЦПМБ по Государственным контрактам № 118-Д от 11.06.2009 г. и № 124-Д от 11.06.2009 г. в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.)».

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и представлены на: научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г., 31 мая- 2 июня 2011 г.), III научно-практической школе-конференции «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 31 мая- 2 июня 2011 г.) и на третьем съезде военных врачей медико-профилактического профиля вооруженных сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 8-10 декабря 2010 г.) «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия вооруженных сил Российской Федерации». Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ 21 июня 2011 г.

Публикации

Основное содержание работы отражено в 9 научных публикациях, в том числе в 4 статьях журнала из списка изданий, рекомендованного ВАК, а также в двух принятых к рассмотрению заявках на патент Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 20 работ отечественных и 151 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 31 рисунками и 14 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

В первых главах приведены данные о возбудителе туляремии и лабораторной диагностики данной инфекции. Изложена история получения и использования туля-ремийного вакцинного штамма. Проанализированы литературные данные, касающиеся функционирования системы гомологичной рекомбинации у микроорганизмов. Приведена история исследования модели гомологичной рекомбинации. Основная часть обзора посвящена работам по исследованию функционирования основных ферментов системы гомологичной рекомбинации - белкам ЯесА и ЯесВСО. Приведены данные об организации генома Л Магеюи, Рассмотрены подходы генетического изучения туляремийного микроба. Заключительная часть литературного обзора посвящена вопросу применения генетической модификации системы рекомбинации у

вакцинных штаммов в том числе и F. tularensis, для стабилизации и аттенуации вакцинных штаммов.

Глава 2. Материалы и методы исследования

В работе использовали полученные из коллекции ГКПМКК-Оболенск бактериальные штаммы: - F. tularensis subsp. tularensis - 3 штамма, F. tularensis subsp. mediasiatica - 2 штамма, F. tularensis subsp. Novicida - 1 штамм, F. tularensis subsp. holarctica - 6 штаммов, из которых F. tularensis subsp. holarctica biovar japónica - 3 штамма и вакцинный штамм F. tularensis, subsp. holarctica 15/10, а также гетероло-гичные штаммы У. pestis EV76, Y. pseudotuberculosis 1779, В. anthracis СТИ-1 и Е. coli JM 83, Е. coli DH5a, Е. coli S17-1 и Е. coli B121(DE3).

Мышиные макрофагоподобные клетки линии J744.A1 были получены из Российской Коллекции клеточных культур, г. Санкт-Петербург, Россия.

В работе были использованы мыши линии BALBc (возраст 6-8 нед.) и беспородные белые мыши массой 18-20 г, полученные из вивария ФБУН ГНЦ ПМБ, соответствующие требованиям к качеству лабораторных грызунов (Лившиц, 1978).

Культивирование штаммов Е. coli проводили на жидких и плотных питательных средах Лурия-Бертани (LB) при температуре 37 °С (Miller, 1972) с добавлением при необходимости антибиотиков: хлорамфеникола (Cm) 10мг/л, ампициллина (Ар) 100 мг/л, канамицина (Km) 40 мг/л и 5% сахарозы (Suc). Культивирование штаммов F. tularensis проводили при температуре 37 °С на среде FT-arap (ФБУН ГНЦ ПМБ) и жидкой питательной среде (Лапин с соавт., 2009), при необходимости в питательные среды добавляли антибиотики: полимиксин (Рт) 100 мг/л, Km 10 мг/л, Cm 3 мг/л, стрептомицин (Str) 100 мг/л и 5% Suc.

Лиофильное высушивание подготовленных суспензий объемом 2 мл проводили с использованием сушилки Bench Top SLC "Virtis" 4 к (США) при автоматическом режиме подвода тепла (20+30 °С) в течение 24 ч (глубина вакуума - 200 мТорр).

Молекулярно-биологические работы выполняли в соответствии с руководством Маниатиса с соавт. (1984). Перенос рекомбинантных плазмид в клетки штаммов

E. coli осуществляли "кальциевым" методом трансформации, а в клетки

F. tularensisí5/l0 - методом конъюгации (Golovliov et al., 2003).

Олигонуклеотиды синтезировали в компании ЗАО «Синтол» (Москва, Россия).

ПЦР проводили с использованием термоциклера Gene Amp PCR System 2700 (Applied Biosystems,США).

ПЦР в реальном времени проводили на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc, США) с оптическим ПЦР-модулем.

Секвенироеание нуклеотидных последовательностей ДНК проводили с использованием метода Сэнгера на секвенаторе ALF express II (Amersham Pharmacia Biotech, США) в компании «Синтол» (Москва, Россия).

Конструирование штаммов с делетированными генами системы рекомбинации гесА и recD на основе штамма F. tularensis subsp. holarctica 15/10 проводили с помощью аллельного обмена по методике Golovliov et al (2003). Для синтеза модифицированных фрагментов генов гесА и recD использовали ампликоны, полученные с помощью праймеров FSA, RBA, FBA, RSA и FSD, RBD, FBD, RSD, соответственно. Дефектные аллели генов гесА и recD встраивали в Sail сайт суицидного вектора pPV. Для комплементации мутаций в генах гесА и recD, фрагменты хромосомной ДНК F. tularensis 15/10 с функционально активным геном гесА встраивали в Sail сайт вектора pHV33-mob, а фрагмент ДНК с геном recD - в Sail сайт векторов pHV33-mob и pUC19/pK194. Для получения плазмиды pET23(b+)/RecA-(His)6, экспрессирующей белок RecA F. tularensis в клетках Е. colt, ген гесА F. tularensis 15/10 встраивали между сайтами Ndel и Xhol в векторе рЕТ23(Ь+).

Очистку рекомбинантного белка RecA из цитоплазматической фракции штамма-продуцента Я coli В121 (pET23(b)+/RecA-(His)6) проводили металл-хелатирующей хроматографией в неденатурирующих условиях на носителе Ni2+NTAHisBind® Super-flow™(Pharmacia Biotech, Швеция).

Концентрацию белка определяли по методу Lowry et al. (1951), электрофорез белков проводили по методу Лэмли (Laeraly, 1970).

Иммуноблоттинг проводили по методу Товбина (Towbin et al., 1979). Имму-ноферментный анализ (ИФА) проводили согласно руководству (Ngo 1988).

Индукцию белка RecA F. tularensis 15/10 проводили с использованием налидик-совой кислоты при концентрации 40 мг/л (Weinstock et al., 1979) и с помощью УФ-облучения при длине волны 245 нм.

Чувствительность бактерий к перекиси водорода (H2Oi) определяли диско-диффузионным методом с помощью дисков диаметром 5 мм.

Определение чувствительности клеток туляремийного микроба к УФ-облучению проводили с помощью UV-облучателя при длине волны 245 нм (Cole Parmer, США).

Устойчивость микробов к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки (HKQ оценивали по выживаемости бактерий в суспензии плотностью 1х106 КОЕ/мл после инкубирования с сывороткой при температуре 37 °С в течение 24 ч.

Эффективность размножения клеток туляремийного микроба в макрофагах оценивали по разнице между десятичными логарифмами КОЕ, полученными при высевах лизатов макрофагов через 3 ч и 48 ч после инфицирования клетками штаммов F. tularensis.

Определение LDSo проводили согласно методу Кербера в модификации (Ашма-рин, 1962).

Для оценки протективности модифицированных туляремийных штаммов вакцинированных мышей заражали подкожно культурой F. tularensis 503 в дозе 1х102 КОЕ/мышь (DCL штамма F. tularensis 503 для мышей линии BALB/c составляет 1 КОЕ/мышь) через 28 суток после вакцинации. Достоверность отличий количественных значений экспериментов определяли по i-критерию Стьюдента (Р<0,05) с помощью статистических программ, встроенных в программу Windows Excel.

Глава З.Результаты исследований Получение штаммов F. tularensis, дефектных по генам системы рекомбинации гесА и recD

У бактерий F. tularensis, как у большинства микроорганизмов, ключевыми белками системы рекомбинации являются белок RecA и RecBCD-мультиферментный комплекс экзонуклеазы V.

Проведенный анализ нуклеотидных последовательностей гена гесА у разных вижов и подвидов франциселл показал, что сходство генов на уровне подвидов F. tularensis составляет 99 %, а на уровне видов F. tularensis и F. phylomiraghia - 81 %. Сравнение нуклеотидных последовательностей гена recD показало 90 %-ное сходство на уровне подвидов F. tularensis и 85 %-ное сходство - на уровне видов F. tularensis F. phylomiraghia.

Проведенное множественное выравнивание представленных в базе данных NCBI аминокислотных последовательностей белка RecA показало на уровне подвидов F. tularensis различие только по одной аминокислоте, а на видовом уровне различия между F. tularensis и F. phylomiraghia - в виде единичных аминокислотных замен и

делеций. Белок ЛесО обладал вариабельностью в аминокислотной последовательности как на уровне видов, так и на уровне подвидов, которая проявлялась в виде многочисленных аминокислотных замен и протяженных областей делеций.

При помощи плазмиды рРУДгесА нами был получен штамм Е. Ш1агет1$ 15/10 с делецией гена гесА. Наличие делеции в области данного гена было подтверждено в ПЦР и иммуноблоттингом (рис 1, 2).

М 12 3 4

Рисунок 1 - ПЦР-анализ клонов штамма F. tularensis 15/10ДrecA\ М - маркер XHind (23130, 9416, 6557, 4316, 2322,2027, 564, 125 т.п.о.); 1- исходный вариант F. tularensis 15/10 с натив-ной копией гена гесА (4009 п.о); 2 ,3, 4 - F. tularensis 15/10ДгеЫ с делегированным вариантом гена гесА (2949 п.о)

Анализ экспрессии гена гесА и синтеза белка RecA F. tularensis 15/10

Показано, что полученный нами штамм Е. coli BL21(pET23(b)+/RecA-(His)6) экспрессировал рекомбинантный белок RecA-(His)6 с молекулярной массой около 42 кДа, который при выделении из клеток Е. coli находился в цитоплазматической фракции в растворимой форме. Очищенный препарат рекомбинантного белка агрегировал при комнатной температуре, а при снижении температуры снова переходил в растворимую форму. Иммунизация мышей рекомбинантным белком RecA-(His)6 позволила получить специфическую сыворотку к белку RecA-(His)6 с титром антител, равным 1:3016. Полученная антисыворотка выявляла одну полосу с молекулярной массой 43 кДа в лизате клеток штамма F. tularensis 15/10 (рис. 2). Сыворотка к реком-бинантному белку RecA выявляла также единичные белковые полосы в лизатах клеток Е. coli и Y. pestis с молекулярной массой 38 кДа, что соответствует теоретическому значению молекулярных масс белка RecA у этих микроорганизмов. Общность иммунологических эпитопов белка RecA у различных микроорганизмов согласуется с

данными анализа аминокислотных последовательностей и свидетельствует о высокой степени его консервативности. Следует отметить, что молекулярная масса нативного белка RecA F. tularensis 15/10 (43 кДа) отличалась от теоретической (»39 кДа), что может быть обусловлено посттрансляционной модификацией белка RecA (Fischer et al., 2004).

■*- 118 ■*- 86

•<—26 ■*- 19

1 2 3 4 5 6

Рисунок 2 - Оценка специфичности антисыворотки к рекомбинантному белку RecA-(His)6 (12,5% ДСН-ПААГ): 1 -Y. pestis EVлинии НИИЭГ; 2 - F. tularensis 15/10; 3-F. tularensis 15/10Лгес4; 4-Е. coli BL21; 5 - рекомбинантный белок RecA-(His)6; 6 - окрашенные маркеры «Fermentas» (Литва)

Оценка индукции нативного белка RecA F. tularensis 15/10

С помощью метода иммуноблоттинга было показано, что после воздействия УФ-облучения на клетки штамма F. tularensis 15/10 уровень экспрессии белка RecA в клетках туляремийного микроба не менялся (рис. 3). Аналогичные данные были получены после индукции налидиксовой кислотой. Таким образом, показано, что регуляция синтеза белка RecA у F. tularensis 15/10 отличается от регуляции синтеза белка RecA у других микроорганизмов (рис. 4).

Ш й V-:!

М М $

■

12345 6 123456

А Б

Рисунок 3 - Индукция белка ЯесА под действием УФ-облучения (12,5% ДСН -ПААГ); А-облучение в течение 10 с: линия 1 - 0 с, 2 - 30 мин, 3-1 ч, 4-2 ч, 5-4ч культивирования, 6 - белок К.есА-(Из)б; Б-облучение в течение 80 с: линия 1 - 0 с, 2 - 30 мин, 3 - 1 ч, 4-2 ч, 5-4ч культивирования, 6 - белок 11есА-(Н15)б

1 2 3

Рисунок 4 - Индукция белка ЯесА после воздействия налидиксовой кислотой (12,5% ДСН-ПААГ); 1 и 2 - клетки Р. Ыагеп81$ 15/10 до и после воздействия налидиксовой кислоты, 3 - белок 11есА-(Н18)б

Последующую оценку уровня транскрипционной активности гена гесА Р. Ш1агеп515 15/10 проводили полуколичественным анализом при помощи обратно-транскриптазной ПЦР (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени. Проведенный анализ выявил одинаковое количество иРНК на разных фазах роста К /и/агегш'л 15/10 в течение О-бч культивирования в жидкой питательной среде, что косвенно свидетельствовало о конститутивном синтезе белка ЯесА К рис. 5).

a 800

1400 ■■■

1200 ■■•

1000

600 •-■

200

400 ■■■

Cycles

440

Рисунок 5 - Анализ транскрипционной активности гена гесА Ш1агеп51$ 15/10 при культивировании в течение 0-6 ч. Зеленым цветом обозначены кривые амплификации региона гена гесА, коричневым цветом выделены кривые амплификации региона гена с1паА

С использованием плазмиды рРУДгесЭ нами был получен штамм К Ги/агетш'я 15/10 с делецией гена гесй. Наличие делеции гена гесй было подтверждено в ПЦР (рис 6).

М 1 2 3 4

Рисунок 6. ПЦР-анализ полученных клонов штамма К Магелт 15/10ДгеЫ и F. Магетгз \Ы\Шесй\ М - маркер ШЫ (23130,9416, 6557, 4316,2322, 2027, 564, 125 т.п.о.); 1- исходный вариант Р. 1и1агеп$1$ 15/10 с нативной копией гена гесй (3498 п.о); 2 ,3, 4 -Р. 1и1агет1й 15/10Дга:/) с делегированный вариантом тенагесй (2895 п.о)

Для комплементации модифицированных генов гесА и гесЭ у штаммов Р. ш1агеп51$\5/\0АгесА, Г. ййагегкгв \5l\0krecA были сконструированы плазмиды рНУЗЗ-тоЬ¡гесА, рНУЗЗ-тоЬ/гес.О и риС19/рК194//-есД реплицирующиеся в клетках Р. (к/агепда 15/10 и содержащие функционально активные гены гесА и гесй. Полученные плазмиды переносили в штаммы F. Ш1агею1$ 15/1 ОД гесА и F. /к/агешта 15/10ДгесД соответственно.

Изучение биологических и иммунологических свойств мутантных штаммов

Оценка способности к гомологичной рекомбинации штаммов К Ш1агеп$1$ с делениями генов тесА и гесО. Для подтверждения роли генов г ее А и гесО в гомологичной рекомбинации в полученные штаммы переносили суицидную плазмиду с фрагментом хромосомной ДНК К /ы/агелш 15/10. Частота интеграции суицидной плазмиды в хромосомную ДНК штамма Р. Ги/да-еш/я 15/10 составляла 10"7, а для Р. ¡и1агеп515 15/10ДгеЫ и К 15/10АгесБ - менее 10"9. Таким образом, деле-

ция генов гесА и гесО приводила к снижению частоты рекомбинации более чем в 100 раз. Введение плазмиды рИС 19/рК 194/гесБ с функционально активным геном гесО в клетки К <м/агелш с инактивированным геном гесО восстанавливало способность штамма к интеграции суицидной плазмиды в хромосомную ДНК до исходного уровня

ю-7.

Оценка динамики роста штаммов F. tularensis с делениями генов гесА и recD in vitro

Показано, что в жидкой питательной среде штамм F. tularensisl5ilQArecA по ростовым свойствам сопоставим с исходным штаммом F. tularensis 15/10 (рис. 7).

Время, ч

Рисунок 7. Динамика роста вакцинных штаммов F. tularensis 15/10 и F. tularensis 15/10Дгес4

В отличие от него, штамм К Ш1агет\$ 15/10 с делецией гена геей растет значительнее медленнее родительского штамма (рис. 8). На плотной питательной среде

штамм К МагепяЬ 15/10Дгесй формировал колонии меньшего размера, по сравнению со штаммами К Ыагепя^з 15/10 и Т7.1и1агет1! 15/10ДгесА.

о,з

? 0,25

«л

£ °-2

I °'15

I 0,1 Й

0,05

0 -г-1-1-1-1-1-1-1

012345678 Время, ч

Рисунок 8. Динамика роста вакцинных штаммов Е Магепзи 15/10 и Е 1и1агепги 15/1 ОДгесО(рНУЗЗ-тоЬ), К ш1агею15 15/ЮЛ/-гсДрНУЗЗ-тоЬ/гесО), Е. Шкгепзгя 15/1 ОДгесО

Для подтверждения влияния гена гесО на рост культуры Е. Ы1агет1$ 15/10Дгес£> в мутантный штамм была введена плазмида рНУЗЗ-тоЬ/гесй с функционально активным геном гесО. Восстановление синтеза белка ЯесО в клетках штамма К /и/агелдо 15/10ДгесД рНУЗЗ-тоЬ/гесй приводило к реверсии его ростовых свойств до уровня родительского штамма как на жидкой (рис. 8), так и на плотной питательной среде.

Оценка выживаемости штаммов К Ш1атепъ1$ с делециями генов тесА и гесй после лиофильного высушивания

Сравнение жизнеспособности полученных вариантов вакцинного штамма Магегигз после лиофильного высушивания и хранения в течение месяца показало, что жизнеспособность лиофильно высушенных клеток штамма Е. Ш1агет1$ 15/1 ОДгесА не отличалась от исходного, а жизнеспособность клеток штамма К Магегигх 15/10Дгес£> снизилась (табл. 1).

Таблица 1 - Выживаемость лиофильно высушенных клеток штаммов Р. ш1агеп!1$ 15/10, Р. ш]агеп$\з 15/10ДгесВ и Р. Ыагегаи \5t\QhrecA при хранении

Выживаемость, %

Название штамма Исходная После лиофилизации Хранение в течение месяца при температуре +4°С +25"С

Р. Ш1агепт 100 93 88 80

15/10

Р. шЬгетгя 100 69 66 64

15/10Дгес£>

Р. Магеюгз 100 87 86 82

15/10 АгесА

Оценка частоты возникновения стрептомицин-резистентных мутантов штаммов К ШШгепь'м 15/10 с делениями генов гесА и гес!)

Частота появления стрептомицин-резистентных мутантов для штаммов Р. ¡и1агеп51.ч 15/10Дгей4, К <«/агега« \5IWArecD и Р. ш1агет1$ 15/10 равна 10"9, что подтверждает отсутствие влияния генов системы рекомбинации гесА и геей на спонтанный мутагенез.

Оценка устойчивости к ультрафиолетовому облучению штамма К /и!агеш1х 15/10 с делецией гена гесА

Показано, что клетки штамма К <г//агет« 15/1 ОДгесА обладали повышенной чувствительностью к УФ-облучению, по сравнению с исходным штаммом Р. /ы/агеи5(5 15/10. Введение плазмиды рНУЗЗ-шоЬ/геЫ с геном гесА в клетки Р. ш1аге№1з 15/10ДгесЛ полностью восстанавливало устойчивость бактерий к УФ-облучению (табл. 2).

Таблица 2 - Воздействие УФ облучения на штаммы Р. Ш1агет15 15/10 и Р. Ш1агет1з

15/1 ОДгесА

Время экспо- Р. Магеп$1$ Р. Магею^я Р. 1и1агепз1з К ш1аге /1515

зиции, сек 15/10 15/ЮДгесЛ 15/10ДгесЛ: 15/10ДгесА:

рНУЗЗ- рНУЗЗ-тоЬ

тоЫгесА

Концентрация живых клеток после УФ - облучения (1^ КОЕ/мл)

0 9,14 9,3 8,91 9,2

10 9,04 7 8,81 7,01

20 9,01 6,6 8,47 6,02

40 8,7 6,25 8,37 5,36

80 8,0 5 8,16 4,47

160 6,9 - 7,51 -

Оценка воздействия перекиси водорода на клетки штаммов F. tularensis 15/10 с делециями генов гесА и recD

Чувствительность клеток штаммов F. tularensis 15/1 ОДгесА и F. tularensis 15/10Дгес£> к бактерицидному действию перекиси водорода (Н202) была сравнима с таковой для клеток F .tularensis 15/10. При концентрации Н202 1 % зона подавления роста дефектных штаммов не отличалась от исходного штамма и составляла 0,9 см, что говорит о сохранении устойчивости к воздействию перекиси водорода.

Размножение клеток штаммов F. tularensis 15/10 с делениями генов гесА и recD в макрофагах

Сравнительный анализ роста клеток штаммов F. tularensis в макрофагоподобных клетках J774.1A. показал, что делеция гена гесА практически не влияет на размножение бактерий в макрофагах, а делеция гена recD приводит к замедлению их размножения в макрофагоподобных клетках.

Определение устойчивости клеток штаммов F. tularensis 15/10 с делениями генов гесА и recD к нормальной кроличьей сыворотке

Бактерицидная активность ИКС против клеток штаммов F. tularensis 15/10ДгесА, F. tularensis 15/10ДrecD и F. tularensis 15/10 была одинакова, и выживаемость бактериальных клеток всех исследуемых штаммов F. tularensis составляла 10-30 %.

Определение остаточной вирулентности штаммов F. tularensis 15/10 с делениями генов гесА и recD

Показано, что LD50 штамма F. tularensis 15/1 ОДгесА для мышей по сравнению с исходным штаммом F. tularensis 15/10 снизилась на порядок, а вирулентность штамма F. tularensis 15/10ArecD снизилась на шесть порядков.

Оценка протективности штаммов F. tularensis 15/10 с делениями генов гесА и recD на мышиной модели

Проверка иммуногенности дефектных штаммов F. tularensis 15/10ДгесА и F. tularensis 15/10ДrecD показала сохранение у них протективных свойств, характерных для исходного штамма (табл. 3.).

Таблица3 - Протективность штаммов F. tularensis 15/10, F. tularensis \5l\0hrecA и F. tularensis 15/1 ОДrecD для мышей линии BALB/c_

Доза иммунизации, КОЕ/мышь Доза зара- Выживших животных, %

жения F. tularensis 503 КОЕ/мышь Иммунизация F. tularensis Иммунизация F. tularensis Иммунизация F. tularensis

15/10 15/1 OA recA 15/10Д recD

lxlO2 100 100 100

lxlO3 100 100 100

lxlO4 lxlO2 100 100 100

lxlO5 нд нд 100

Контроль 0

Создание системы из одного праймера для дифференциации подвидов туля-ремийного микроба на основе специфических регионов хромосомы F. tularensis, фланкированных Chi- последовательностями подобными Е. coli Использование праймера Chi If 5'CTAGG-GCTGGTGG-G3\ содержащего Chi-сайт Е. coli, позволило дифференцировать подвиды F. tularensis методом ПЦР (рис. 9.). Данный праймер можно использовать не только для межвидовой и видовой, но и родовой дифференциации (рис. 10.).

i г з * з в 7 в з ю Ii

... i i ' — — —

ЩЗ : : .....I ¿Щ -Щ....... |§| SW 1 < .......

** • . * * «м» ""/ ..... <

■■г-.;""- ä

.. ,»„.»«••» V« k* jv, ••»

* ... * i* ът **** && '

1 2 3 * 5 6 7 В

Рисунок. 9. Электрофореграмма ам-пликонов, полученных в ПЦР с праймером Chi If и ДНК F. tularensis: 1-11 - GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder; 2 - subsp. holarctica 15; 3 - subsp. holarctica 503; 4 - subsp. holarctica bv. japónica Miura; 5 - subsp. holarctica bv. japónica Jasoe; 6 - subsp. tularensis 8859; 7 -subsp. tularensis Schu; 8 - subsp. mediasia-tica 120; 9 - subsp. mediasiatica 117; 10 -subsp. novicida Utah 112

Рисунок. 10. Электрофореграмма ампли-конов, полученных в ПЦР с праймером Chi If и ДНК различных видов микроорганизмов:

1-8 - GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder; 2 — F. tularensis subsp. holarctica 503; 3 - F. tularensis subsp. tularensis Schu; 4 - F. tularensis subsp. mediasiatica 120; 5 — S. enteritidis; 6 - Y. pestis EV76; 1-Е. coli JM83

Создание системы праймеров и зондов для ПЦР в реальном времени для индикации и идентификации подвидов F. tularensis на основе последовательности гена recD

Использование праймеров recDM5A/B F, recD845A/B R, /-ec£>886Non-pat F, recZ)886Non-patR и зондов recDM5A/B, recDMSA/B, recD886 Non-pat, созданных на основе анализа последовательностей гена recD в штаммах F. tularensis, позволяет дифференцировать подвиды туляремийного микроба в ПЦР-РВ (табл. 4). Чувствительность системы праймеров и зондов составляет -1 х 104 КОЕ/мл.

Таблица 4 - Результаты испытания мультиплексных тест-систем для выявления ДНК штаммов Р. Ш1агепз15 и гетерологичных микроорганизмов

№ Микроорганизмы, штаммы Наличие сигнала или детектируемого гена по каналу

recD 845 А recD 845 В

FAM HEX (R-6-G)

1 F. tularensis subsp. tularensis Schu + -

2 F. tularensis subsp. tularensis B399 A-Cole + -

3 F. tularensis subsp. tularensis 8859 + -

4 F. tularensis subsp. holarctica 9 - +

5 F. tularensis subsp. holarctica 21/400 - +

6 F. tularensis subsp. holarctica 15/10 - +

7 F. tularensis subsp. holarctica 503 - +

8 F. tularensis subsp. holarctica japónica Mi-ura +

9 F. tularensis subsp. holarctica japónica Jasoe + -

10 F. tularensis subsp. mediasiatica 117 + -

11 F. tularensis subsp. mediasiatica 120 + -

12 F. tularensis subsp. novicida 112 Nov -

13 Y. pestis ssp. pestis EV76 -

14 Y. pseudotuberculosis -

15 B.anthrctcis СТИ-1 -

16 E.coliJM 83 -

выводы

1. Показано, что гомология нуклеотидных последовательностей гена гесА подвидов F. tularensis составляет 99 %, а на уровне видов у F. tularensis и F. phylomiraghia снижается до 81 %. Гомология последовательностей гена recD для разных подвидов F. tularensis составляет около 90 %, а для видов F. tularensis и F. phylomiraghia -85 %. Белки RecA видов F. tularensis и F. phylomiraghia отличаются единичными аминокислотными заменами и делециями; в аминокислотных последовательностях белка RecD у разных видов и подвидов туляремийного микроба присутствуют протяженные области делеций и многочисленные аминокислотные замены.

2. Создан продуцент Е. coli, синтезирующий рекомбинантный белок RecA F. tularensis 15/10, состоящий из 359 а.о. продукта гена гесА и 6 остатков гистидина. Мышиная сыворотка к рекомбинатному белку RecA F. tularensis 15/10 выявляет белковую полосу с молекулярной массой 43 кДа в лизате клеток F. tularensis 15/10, а также белковые полосы с молекулярной массой 38 кДа в лизатах клеток Е. coli и Y. pestis.

3. Количество белка RecA в клетках F. tularensis 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты не меняется; транскрипционная активность гена гесА в течение логарифмической фазы роста клеток F. tularensis 15/10 в жидкой питательной среде, определенная методом ПЦР-РВ, не меняется, что косвенно указывает на конститутивный синтез данного белка в клетках туляремийного микроба.

4. Получен штамм F. tularensis 15/10AreсА, культурально-морфологические свойства которого при выращивании на плотных и жидких питательных средах, способность выживать в нормальной кроличьей сыворотке и размножаться в макрофаго-подобных клетках J774.A1, чувствительность к пероксиду водорода и частота возникновения стрептомицин-резистентных мутантов существенно не отличаются от таковых исходного вакцинного штамма. Однако, у штамма F. tularensis 15/ЮДгесЛ, по сравнению с исходным, подавлена способность к гомологичной рекомбинации и повышена чувствительность к УФ-облучению.

5. Получен штамм F. tularensis 15/10 ArecD, обладающий сниженной способностью к размножению в макрофагоподобных клетках J774.A1, подавленным ростом на плотных и жидких питательных средах, сниженной способностью к гомологичной рекомбинации, по сравнению с исходным вакцинным штаммом. При этом чувствительность данного штамма к пероксиду водорода и частота возникновения стрептомицин-резистентных мутантов не изменились.

6. Показано, что протективные свойства штаммов F. tularensis 15/10ДгеЫ и F. tularensis 15/ЮДгесО не изменились по сравнению с исходным вакцинным штаммом. Однако, остаточная вирулентность штамма F. tularensis 15/10ДгеЫ ниже на порядок, а штамма F. tularensis 15/10ArecD - на шесть порядков, по сравнению с таковой штамма F. tularensis 15/10.

7. Система праймеров и зондов, созданная для детекции гена recD методом ПЦР в реальном времени, обладает специфичностью, позволяющей дифференцировать подвиды туляремийного микроба.

8. Разработана ПЦР-система дифференциации подвидов F. tularensis с помощью праймераСЫ lf.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

а) в журналах, рекомендованных ВАК

1. Лапин A.A., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Домотенко Л.В., Храмов М.В. Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensisJI Проблемы особо опасных инфекций. - 2009. - №102. - С. 66-67.

2. Лапин A.A., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Комбарова Т.Н., Бахтеева И. В., Дятлов И.А., Павлов В.М. Иммунобиологические свойства вакцинного штамма Francisella tularensis 15/10 с делегированным геном recA. II Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. (Принята в печать).

3. Лапин А. А., Кравченко Т. Б., Мокриевич А. Н., Вахрамеева Г. М., Комбарова Т. И., Дятлов И. А., Павлов В. М. Влияние УФ-облучения и налидиксовой кислоты на индукцию RecA белка Francisella tularensis 15/10. II Проблемы особо опасных инфекций, - 2011. (Принята в печать).

4. Г.М.Вахрамеева, А.АЛапин. В.М.Павлов, А.Н.Мокриевич, Р.И.Миронова, И.А.Дятлов. ПЦР дифференциация подвидов Francisella tularensis с помощью одного праймера. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - №107. - С. 46-46.

б) заявки на патенты

7. Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Миронова Р. И., Комбарова Т.И., Лапин A.A. Заявка на получение патента на изобретение «Способ стабилизации туляремийного вакцинного штамма» под № 2010141704 от 11.10.2010.

8. Лапнн A.A.. Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Миронова Р. И., Комбарова Т.И., Игнашина E.H., Павлов В.М. Заявка на получение патента на изобретение «Способ аттенуации туляремийного вакцинного штамма» под №2011131560 от 28.07.2011.

в) тезисы конференций

5. Лапин A.A., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Комбарова Т.И., Бахтеева И.В., Павлов В.М. Получение дефектного по recD гену вакцинного варианта Francisella tularensis 15/10 и изучение его свойств // Материалы научно практической школы конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г.) Оболенск, 2010, С. 282-284.

6. Лапин A.A., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Павлов В.М. Получение штамма Francisella tularensis 15/10 с делегированным геном recA и изучение его биологических свойств // Материалы III научно практической школы конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 31 мая -2 июня 2011 г.) Оболенск, 2011, С. 322-324.

9. Лапин A.A.. Вахрамеева Г.М., Павлов В.М., Мокриевич А. Н., Миронова Р. И., Дятлов И.А. Универсальный праймер для ПЦР дифференциации подвидов возбудителя туляремии// Третий съезд военных врачей медико-профилактического профиля вооруженных сил Российской Федерации «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия вооруженных сил Российской Федерации» (Санкт-Петербург, 8-10 декабря 2010 г.).

Подписано в печать: 12.09.2011

Заказ № 5888 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лапин, Александр Александрович

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СТР СИМВОЛОВ,

ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика возбудителя туляремии

1.1.1. Лабораторная диагностика

1.1.2. Вакцинный туляремийный штамм

1.2. Система рекомбинации микрорганизмов

1.2.1. Модель процесса гомологичной рекомбинации

1.2.2. ЯесА белок - ключевой фермент гомологичной 24 рекомбинации

1.2.3. ЫесА белок - фермент, участвующий в 27 процессах репарации

1.2.4. Фермент КесВСБ (экзонуклеаза V)

1.2.5. Организация генома Г. Ш1агеп&1$>

1.2.6. Методы генетического исследования 34 Г. Шагет

1.2.7. Генетическая модификация генов 37 рекомбинации вакцинных штаммов - путь к их стабилизации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение молекулярно-биологических свойств вариантов вакцинного штамма Francisella tularensis с делетированными генами системы рекомбинации recA и recD"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ:

Туляремия - зоонозная инфекция, имеющая природную очаговость. Особенностью данной инфекции, является множество путей передачи и высокая восприимчивость к заражению у людей; По данным ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора на территории Российской Федерации природные очаги-туляремии распространенны , повсеместно,, поэтому наблюдаемый в настоящее время уровень заболеваемости (в 2010 году зарегистрировано 115 случаев туляремии, по сравнению с 2009 годом -57 случаев) представляет несомненную проблему для Российского здравоохранения.

Возбудителем туляремии является микроорганизм К шШгегтБ. В современной классификации« выделяют четыре подвида К ¿и/аге/шя: зиЬзЛЫагепБ'^, яиЬяр. Но1агсИса, БиЬзр. тесИааБ1айса и БиЬэр. пошсгйа. Наиболее тяжелую форму заболевания вызывает подвид ШЫгеутэ, циркулирующий на территории Северной Америки [58].

Р. tula.ve.mis и другие виды бактерий рода РгапЫ$е11а представляют немалый интерес для исследователей не только с точки зрения их дифференциации, но и изучения их генетической изменчивости. В, связи с этим актуальной является проблема изучения, эволюционных механизмов генетической изменчивости данного микроорганизма.

Для профилактики туляремии в Российской Федерации используется живая вакцина, основным недостатком * которой является' некоторая реактогенность и нестабильность [12]. Поэтому в настоящее время актуальной является проблема создания нового поколения стабильных и менее реактогенных вакцинных туляремийных штаммов. Одним из путей решения данной проблемы, является стабилизация генома вакцинного туляремийного штамма инактивированием одного из механизмов генетической изменчивости. Наиболее значимым видом генетической ч изменчивости является гомологичная рекомбинация.

В последнее время данный; процесс изучается у вакцинных штаммов; некоторых микроорганизмов. Так, туберкулезная вакцина на основе штамма; BacilleCalmette-Guerin (BCG), который былполучен из Mycobacterium bovis,-широко используется в настоящее, время: В разных странах живую/ туберкулезную вакцину готовят на основе.вариантов штамма BCG - (Pasteur, Frappier, Denmark, Russia) [27]. Среди этих вариантов» только у штамма. Russia, имеющего дефект в гене гесА, произошла стабилизация генома : и не изменились протективные свойства [92]. Инактивация генов гесА и recBG в клетках Salmonella: typhimurium привела^ к; снижению вирулентности для мышей и замедленному росту в макрофагах (менее выраженному в случае гесА мутантов); [34]. Дефект в гене reel) у S. typhimurium также привел к аттенуации для мышей и снижению пролиферации в макрофагах [36].

Таким образом; на примере штаммов М. bovis BCG и S. typhimurium показано; что мутации в генах системы рекомбинации создают препятствия к изменению- свойств: для; вакцинных штаммов, приводя к их стабильности, а также способствуют снижению их вирулентности для экспериментальных животных, которая; как известно, является одним, из интегральных показателей реактогенности штамма:

Шри сравнительном? анализе нуклеотидной последовательности геномов? видов и разных подвидов* Francisella были обнаружены г ее А- и recD-подобные гены [96]. Ранее было показано наличие функционально-активного; rec/t-подобного гена в- геномах F, tularensis subsp. holarctica [16] и F. tularensis subsp: novicida [28].

Учитывая вышеизложенные факты, изучение роли гесА- и recD -подобных генов F. tularensis в функционировании системы гомологичной рекомбинации является на настоящий момент актуальной* задачей, решение которой необходимо для понимания. эволюционных механизмов генетической изменчивости туляремийного микроба, биологических и иммунологических свойств и влияния на стабильность вакцинных штаммов F. tularensis.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: изучение влияния генов системы гомологичной рекомбинации гесА и гееИ на биологические и иммунологические свойства вакцинного штамма Р. Ш1агеп81з.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Биоинформационный анализ генов системы гомологичной

1 рекомбинации гесА и гееИ у Р. Ы1агет1$.

2. Получение вакцинного варианта штамма Р. ийагетгБ 15/10 с делетированным геном г ее А.

3. Получение продуцента Е. соЫ ВШфЕЗ), экспрессирующего рекомбинантный белок ЯесА Р. ШагепБгй, выделение и очистка белка ЯесА.

4. Получение антител к рекомбинантному белку КесА Р. Ш1агет18 и анализ экспрессии белка ЯесА в клетках туляремийного микроба.

5. Получение вакцинного варианта штамма Т7. ЫЫгетгз 15/10 с делетированным геном гесЭ.

6. Изучение влияния генов гесА и гесБ на свойства вакцинного штамма К Ы1агет1$ 15/10.

7. Выбор последовательностей нуклеотидов в гене гесИ для ПЦР-диагностики с гибридизационно-флуоресцентной детекцией подвидов Р. Ы1агеп$18\ конструирование праймера, содержащего СЫ-сайт Е. соИ, для дифференциации подвидов туляремийного микроба.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые получены варианты вакцинного штамма Р. шШгетгя 15/10 с инактивированными генами системы гомологичной рекомбинации гесА и г ее И. Показано, что при инактивации гена гесА в геноме штамма Т7. шШгетгя 15/10 снижается вирулентность данного штамма, сохраняется его способность к персистенции в макрофагах и не ухудшаются вакцинные свойства. Установлено, что инактивация гена гесО в геноме штамма Р. ийагатз 15/10 приводит к аттенуированию штамма при сохранении его протективных свойств и значительном снижении способности к гомологичной рекомбинации. Впервые показано отсутствие индукции белка RecA в клетках штамма F. tularensis 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ Созданы плазмиды pPVAгесА и pPVArecD для аллельного обмена. Разработан алгоритм, позволяющий стабилизировать и аттенуировать вакцинный туляремийный штамм путем инактивации генов системы рекомбинации гесА и recD. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ («ГКПМ-Оболенск») депонированы авторские штаммы F. tularensis subsp. holarctica 15/1 OA гесА (per. номер 6622.) с делецией гена г ее А, и F. tularensis subsp. holarctica 15/10 A recD (per. номер B-6823) с делецией гена recD (Федеральный уровень внедрения). Результаты исследований послужили основой для составления двух патентов на изобретение: «Способ стабилизации вакцинного туляремийного штамма» №2010141704 от 11.10.2010 (Оболенск, 2010, Федеральный уровень внедрения) и «Способ аттеннуации вакцинного туляремийного штамма» №2011131560 от 28.07.2011 (Оболенск, 2011, Федеральный уровень внедрения). Материалы диссертации используются в программе подготовки аспирантов ФБУН ГНЦ ПМБ (учрежденческий уровень внедрения). ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Делеция гена гесА в геноме вакцинного штамма F. tularensis 15/10 приводит к снижению способности данного штамма к гомологичной рекомбинации. Инактивация гена гесА сопровождается повышением чувствительности к ультрафиолетовому излучению. Полученный штамм F. tularensis 15/10isrecA сохраняет свои ростовые свойства и способность к размножению в макрофагах и не меняет свою устойчивость к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки. Жизнеспособность лиофильно высушенной культуры F. tularensis 15/10АгесА не меняется в процессе ее хранения.

2. Антитела к рекомбинантному белку RecA распознают нативный белок RecA штамма F. tularensis 15/10. Количество белка RecA в клетках штамма Е. Ш1агепБ1з 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты не меняется.

3. Делеция гена гесИ в геноме: штамма Е. Ш1агеп81в 15/10 приводит к подавлению; гомологичной ^рекомбинации; Штамм Е. Магет18 15/10АгесВ не меняет свою - устойчивость, к бактерицидному действию» нормальной кроличьей сыворотки, обладает пониженными? ростовыми« свойствами и; замедленной- способностью к размножению в макрофагах, по сравнению с исходным вакцинным туляремийным штаммом.

4. У штамма, Е. шШгетшБ 15/10* с. инактивированным геном гесА на? порядок снижена вирулентность для: мышей, при: сохранении его протективных свойств. Делеция; гена гесБ у вакцинного - туляремийного штамма приводит к его аттенуированию. и сохранению протективных: свойств.

5. Созданная система праймеров и зондов на основе-вариабельной последовательности гена1 гесВ позволяет; проводить дифференциацию подвидов туляремийного микроба методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Сконструированный праймер, содержащий СЫ-последовательность Е.соЫ, позволяет различать., подвиды туляремийного микроба методом ПЦР.

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА в лаборатории микробиологии туляремии? (ЛМТ) ШЦ ПМБ по Государственным контрактам № 118-Д от 115.06£0091г. и № 124-Д от 11.06.2009 г. в рамках Федеральной; целевой .программы «Национальная система химической^ и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)».

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы; диссертации; доложены и представлены; на: научно-практической школегконференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г., 31 мая- 2 июня 2011 г.), III научно-практической школе-конференции «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 31 мая- 2 июня 2011 г.) и на третьем съезде военных врачей медико-профилактического профиля вооруженных сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 8-10 декабря 2010 г.) «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия вооруженных сил Российской Федерации». Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ 21 июня 2011 г.

ПУБЛИКАЦИИ

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Лапин, Александр Александрович

ВЫВОДЫ

1. Показано, что гомология нуклеотидных последовательностей гена гесА подвидов Р. ййагет'^ составляет 99 %, а на уровне видов у Р. ШагепБгз и Р. phylomiraghia снижается до 81%. Гомология последовательностей гена гесВ" для разных подвидов Р. ш1агет1Б составляет около 90%, а для видов Р. ИйагегшБ и Р. phylomiraghia -85 %. Белки 11есА видов Р. 1и1агеп$1Б и Р. phylomiraghia отличаются единичными аминокислотными заменами и делециями; в аминокислотных последовательностях белка И-есО у разных видов и подвидов туляремийного микроба присутствуют протяженные области делеций и многочисленные аминокислотные замены.

2. Создан продуцент Е. coli, синтезирующий рекомбинантный белок RecA F. tularensis 15/10, состоящий -из 359 а.о. продукта гена гесА -и 6 остатков гистидина. Мышиная сыворотка к рекомбинатному белку RecA F. tularensis 15/10 выявляет белковую полосу с молекулярной массой 43 кДа в лизате клеток F. tularensis* 15/10; а также белковые полосы с молекулярной массой 38 кДа в лизатах клеток Е. coli и Y: pestis .

3. Количество- белка RecA в- клетках F. tularensis 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты, не меняется; транскрипционная активность гена гесА в течение логарифмической фазы роста клеток F. tularensis 15/10 в жидкой питательной среде, определенная методом ПЦР-РВ, не меняется, что косвенно-указывает на конститутивный синтез данного белка в-клетках туляремийного микроба.

4. Получен штамм F. tularensis 15/10 Ar ее А, культурально-морфологические свойства которого при выращивании на плотных и. жидких питательных средах, способность, выживать в нормальной кроличьей? сыворотке и размножаться- в макрофагоподобных клетках J774.A1, чувствительность к пероксиду водорода» и частота возникновения' стрептомицин-резистентных мутантов- существенно не* отличаются от таковых исходного вакцинного > штамма*. Однако, у штамма-F. tularensis 15/10 Ar ее А, по сравнению-с исходным, подавлена способность к гомологичной' рекомбинации и повышена чувствительность к УФ-облучению.

6. Показано, что протективные свойства штаммов F. tularensis 15/10 А гесА и F. tularensis 15/1 QAreeD не изменились по сравнению с исходным вакцинным штаммом. Однако, остаточная вирулентность штамма F. tularensis 15/10АгесА ниже на порядок, а штамма F. tularensis 15/10АrecD - на шесть порядков, по сравнению с таковой штамма F. tularensis 15/10.

8. Разработана ПЦР-система дифференциации подвидов F. tularensis с помощью праймера Chi lf.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенная-работа является новым этапом в изучении* влияния генов системы гомологичной рекомбинации гесА и recD на свойства вакцинного туляремийного штамма:

Для профилактики туляремии в РФ используется живая вакцина, созданная на основе штамма F. tularensis 15/10. Одним из недостатков этой вакцины является нестабильность, выражающаяся в R-S диссоциации, приводящей к снижению иммуногенности, поэтому проблема стабильности и изменчивости вакцинного туляремийного штамма остается актуальной-[58]. Одним из путей решения данной, проблемы является стабилизация генома вакцинного' туляремийного* штамма инактивацией одного из механизмов генетической изменчивости. Наиболее значимым видом генетической изменчивости является- гомологичная* рекомбинация, обеспечивающая воспроизводство» генетического разнообразия* и поддержание целостности-генома. Еще в 1965 году было1 выявлено; что мутации, вызывающие нарушение рекомбинации, приводят, впоследствии, к снижению способности давать рекомбинантное потомство при конъюгации и трансдукции [41].

Известно, что гены системы рекомбинации влияют не только на такие биологические процессы как репарация ДНК, SOS мутагенез, но и на i иммунологические свойства вакцинных штаммов. Ранее было показано, что инактивация генов гесА и гесВС в клетках S. typhimurium приводит к снижению вирулентности для мышей и замедленному росту в макрофагах [34; 36]. Мутации в генах системы рекомбинации в штаммах М. bovis BCG, урЫтипит также явились определяющими факторами снижения^ их остаточной? вирулентности: и препятствовали изменению их свойств. Эти-факты позволили? нам; предположить, что инактивация ключевых генов; рекомбинации, которыми? являются. КесА, и КесВСЕ) мультиферментный: комплекс экзонуклеазы V, может привести к стабилизации свойств штаммов -и может быть, полезна при? создании и улучшении свойств? существующих вакцинных; штаммов.

Компьютерный анализ; транслированных аминокислотных последовательностей; Р. 1и1агетшБ, представленных в- базе; данных; МШ1; показал консервативность строения^ Нес А белка: на; уровне; подвидов Е-.ЛиЫгепБ^ различия проявлялись только; по одной аминокислоте, а на видовом уровне различия^ между Е. ЬиХагетгз и F-.phylomiragh.ia'. - в виде единичных аминокислотных замен? и; делеций. При этом« ЛесВСВ мультиферментный- комплекс обладал большей; вариабельностью? в; аминокислотной последовательности субъединиц как на уровне видов, так и на: уровне подвидов в виде протяженных областей; делеции . и; многочисленных аминокислотных замен. Поэтому нам показалось; интересным изучение роли и влияния; продуктов: генов- гесА- и гесО на-биологические и иммунологическиесвойства/7. Ш/ягелшУ.

Для этого нами были получены штаммы Е. Ш1агет18 Т5/10с;делецией генов;. гесМ и гееВ с использованием рекомбинантных; плазмид. рРУД г ее А, рРУЛгёсД созданных на основе суицидного вектора рРУ [73].

Исследование биологических и иммунологиических свойств полученных штаммов выявило, что инактивация генов гесА- и; гесВ:

- не оказывает существенного влияния: на ростовые свойства при росте на агаризованных и жидких питательных средах (необходимо отметить, что для штамма Е. ш1агепБ18 \5/\0АгееВ присутствовали различия: в динамике роста на жидкой питательной среде и в размере колоний на агаризованной среде);

- не оказывает влияния на эффективность размножения штаммов в макрофагоподобных клетках (при этом для штамма F. tularensis 15/10АrecD было отмечено некоторое снижение этого показателя).

- по способности противостоять факторам неспецифического иммунного^ ответа, в» частности, к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки, дефектные штаммы не у ступали^ исходному;

- наблюдается» снижение остаточной вирулентности для мышей с сохранением при этом протективных свойств;

- значительно снижена способность к гомологичной рекомбинации, частота интеграции чужеродной ДНК составляет менее 10~9;

- делеция генов гесА и recD не влияет на действие таких повреждающих факторов, как перекись водорода и стрептомицин, а действие УФ -облучения оказывает более губительное воздействие на штамм F. tularensis 15/10 с делецией гена гесА, что подтверждает ключевую роль этого гена в процессах SOS - репарации.

Таким образом, мы подтвердили функциональную взаимосвязь между гомологичной рекомбинацией и репарацией поврежденной ДНК, и, как следствие, взаимосвязь между УФ-чувствительными мутантами и их рекомбинационной способностью [41;43; 82; 164].

Суммируя вышеизложенное, нам кажется перспективным, использование предложенного нами подхода генетической модификации механизма системы рекомбинации путем инактивации ее ключевых звеньев, что может явиться предпосылкой для создания улучшенного туляремийного вакцинного штамма со сниженной остаточной вирулентностью и стабильными вакцинными свойствами.

Для определения уровня экспрессии RecA и его зависимости от воздействия таких индуцирующих повреждения ДНК факторов, как УФ -облучения и налидиксовой кислоты, нами был создан экспрессирующий вектор pET23b(+)/RecA-(His)6 который позволил нам провести выделение секретируемого белка Р. 1и1агет18 15/10 из клеток Е. соН ВЬ21 с высокой степенью очистки и получить антисыворотку к этому белку. Полученная-антисыворотка содержала специфические антитела к этому белку, позволяющие детектировать нативный белок ЯесА Р. шШгепягя- 15/10:

Результаты, полученные с помощью иммуноблоттинга* и анализа активности гена гесА методом ПЦР-РВ совмещенной с обратной транскрипцией, показали, что синтез белка ЯесА в клетках Р. Ы\агет18 15/10, по-видимому, является конститутивным и не индуцируется под воздействием УФ-облучения и налидиксовой кислоты.

На основании проведенного нами, анализа последовательности гена гесВ выявлены вариабельные области, послужившие основой для-создания системы праймеров и зондов, направленных на детекцию и разделение возбудителей туляремии. Данная; система имеет хорошую.чувствительность и специфичность, подтвержденную при исследовании разных подвидов туляремийного микроба, что позволяет ее дальнейшее использование для созданиия тест-системы основанной на мультилокусной ПЦР* в режиме реального времени. На основе сравнительного анализа нуклеотидной последовательности геномов подвидов туляремийного микроба" нами был сконструирован- праймер СЫ Н позволяющий проводить внутривидовую* дифференциацию^. Ш/агетшя.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лапин, Александр Александрович, Оболенск

1. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. - С. 85-104.

2. Вахрамеева Г.М., Лапин A.A., Павлов В.М., Мокриевич A.Hi, Миронова Р.И., Дятлов И.А. ПЦР дифференциация подвидов Francisella tularensisc помощью одного праймера. // Проблемы особо опасных инфекций.- 2011. N. 107.-С. 46-48.

3. Гайский H.A. Инфекция и иммунитет у животных, залегающих в зимнюю спячку. // Журн. микробиол. — 1944. Т. 3. - С. 5-14.

4. Глазер В.М. Гомологичная генетическая рекомбинация. // Сорософский образовательный журнал. 1998. - N. 7. - С. 13-21.

5. Лапин A.A., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Домотенко Л.В., Храмов М.В. Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensis.il Проблемы особо опасных инфекций.-2009.-N. 102-С. 66-67.

6. Лившиц Ю.И. Требования- к качеству лабораторных грызунов и условия их содержания // Руководство по вакцинному и сывороточному делу.- М.: Медицина, 1978. С. 24-36.

7. Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987. 544 с.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Изд-во Мир, Москва. 1984. 480 с.

9. Мещерякова И.С. Таксономия, идентификация и иммунологическая диагностика возбудителя туляремии.- Автореф. дис.д-ра биол. наук. М.,1990. 47 с.

10. Мокриевич А.Н., Фурсов В.В., Павлов В.М. Криотрансформация плазмид. //Проблемы особо опасных инфекций. 1994. - N. 4. - С. 186-190.

11. Дунаева Т.Н., Емельянова О.С., Майский И.Н., Олсуфьев Н.Г., Руднева Г. П. Туляремия. М.: Медгиз, 1960. С. 459.

12. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М.: Медицина, 1975. С. 186.

13. Олсуфьев Н.Г. Мещерякова И.С. Внутривидовая таксономия возбудителя туляремии Francisella tularensis МкКой и Чепин. // Ж. гигиенны, эпидемиол.,микробиол. и иммунол.-1982-N. 26-С. 291-299.

14. Оноприенко Н.Н, Павлович Н.В. Роль липополисахарида в токсичности бактерий рода Francisella. // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. -2002. -№3.- С. 25- 28.

15. Павлов В.М., Мокриевич А.Н. Клонирование гена F. tularensis, кодирующего синтез RecA подобного белка в Е. coli. Актуальные проблемы профилактики туляремии: Тез. докл. Всесоюзн. научн. конф. Октябрь 1991 г., Симферополь. - М.: 1991.- С. 142.

16. Павлов В.М., Родионова И.В., Мокриевич А.Н., Мещярикова И.С. Изоляция и молекулярно-генетическая характеристика криптической плазмиды из Francisella novicida-подобного штамма F6168 // Мол. генет. микробиол. вирусол. -1994. N 3. - G. 39-40.

17. Под редакцией академика РАМН, профессора Онищенко Г.Г., профессора В.В. Кутырева чл.-корр. РАМН; Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство

18. Спирин А.С. Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот. Издательство: Высшая школа. 1990. -353.с.

19. Хесин, Р:Б.Непостоянство генома. Издательство-Р: М.-Р. Наука. -1985. 472.С.

20. Amundsen S.K., Taylor A.F., Chaudhury А. М., and Smith G. R. recD-P. the gene for an essential third subunit of exonuclease V. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - P. 5558-5562.

21. Ancuta P., Pedron Т., Girard R. et al. Inability of the Francisella tularensis« lipopolysaccharide to m imic or to antagonize the induction of cell activation by endotoxins // Infect Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 2041-2046:

22. Anthony L.S., Gu M.Z., Cowley S:C. et al. Transformation and allelic replacement in Francisella spp. // J. Gen. Microbiol.-1991. V. 137. - P. 26972703.

23. Bailone A., Sommer S., and Devoret R. Mini-F plasmidinduced

24. SOS signal in Escherichia coli is recBC dependent. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1985. V. 821-P. 5973-597.7. '

25. Bailone A., Sommer S., Knezevic J., Dutreix M., and Devoret R. A recA protein mutant deficient in its interaction with the umuDC complex. // Biochimie.-1991.-V. 73.-P: 479-484.

26. Bates H., and Bridges B.A. Mutagenic DNA repair in Eschenchia coli. XIX. On the roles of recA protein in ultraviolet light mutagenesis. //Biochimie.- 1991.-V. 73.-P. 485-489.

27. Behr M.A. BCG different strains, different vaccines? // Lancet Infect Dis. -2002.-2.-N. 2.-P. 86-92.

28. Berg J.M., Khisimuzi MDLULI E., Nano F. Molecular Cloning of the recA Gene and Construction of a recA Strain of Francisella novicida. //Infect, and immun.- 1992.- V. 60. (2).- P. 690-693.

29. Biek D.P., and Cohen S. N. Identification and characterizationof recD, a gene affecting plasmid maintenance and recombination in Escherichia coli.// J. Bacterid.-1986.-V. 167-P. 594-603.

30. Birge E.A., and Low K.B. Detection of transcribable recombination products following conjugation in rec+, recB- and recC- strains of Escherichia coli K-12.// J. Mol. Biol.-1974.-V. 83-P. 447-457.

31. Brcic-Kostic K., Salaj-Smic T., Marsic E., Kajie S., StojiUkovic I.,and Trgovcevic Z. Interaction of recB CD. enzyme with DNA damaged by gamma radiation.//Mol.-1991.-Gen. Genet.-V. 228.-P. -136-142.

32. Buchmeier N.A., Lipps C.J., So M.Y.H., and Heffron F. Recombination-deficient mutants of Salmonella typhimurium are avirulent and sensitive to the oxidative burst of macrophages.// Mol. Microbiol.-1993.-V. 7.-P. 933-936.

33. Burckhardt S. E., Woodgate R., Scheuermann R. H., and Echols H. UmuD mutagenesis protein of Escherichia coli-P: overproduction, purification, and cleavage by recA.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1988.-V. 85-P. 1811-1815.

34. Cano D., Pucciarelli M., Garcia-del Portillo F., Casadesus J>. Role of the RecBCD'recombination-pathway in Salmonella virulence.// J Bacteriol.- 2002.-V. 184(2)-P: 592-595

35. Chaudhury A. M., and Smith G. R. A new class of Escherichia coli recBC mutants-P. implications for the role of recBC enzyme in homologous recombination.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984.-V. 81- P: 7850-7854.

36. Chen H.-W., Ruan B., Yu, M., Wang J. and Julin D.A. The RecD subunit of the RecBCD enzyme from Escherichia coli is a single-stranded DNA-dependent ATPase. // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272: - P. 10072-10079.

37. Chow S. A., Chiu S. K., and Wong B; C. RecA proteinpromoted homologous pairing between duplex molecules-P. functional role of duplex regions of gapped duplex DNA.//Biochimie.-1991. V. 73-Pi 157-161.

38. Chow S.A., Chiu S.K., and Wong B.C. RecA proteinpromoted homologous pairing and strand exchange between intact and partially single-stranded duplex DNA.// J. Mol. Biol.- 19921-V. 223 -P: 79-93"

39. Clark A.J., and Margulies A. D. Isolation and characterizationof recombination-deficient mutants of E. coli K-12.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA-1965.-V. 53-P. 451-459.

40. Clark A.J. Recombination-deficient mutants of E. coli and other bacteria.// Annu. Rev. Genet 1973.-V. 7.-P. 67-86.

41. Clark, A.J., and M. R. Volkert. A new classification of pathways repairing pyrimidine dimer damage in DNA, In E. C. Friedberg, P. C. Hanawalt, and C. F. Fox (ed.), DNA repair mechanisms. Academic Press, Inc., New York. 1978. -P. 57-72.

42. Conley E.C., and West S.C. Homologous pairing and the formation of nascent synaptic intermediates between regions of duplex DNA by recA protein.// Cell -1989.-V. 56.-P. 987-995.

43. Conley E.C., and West S.C. Underwinding of DNA associated with duplex-duplex pairing by recA protein.// J. Biol. Chem.- 1990.- V. 265.-P. 10156-10163.

44. Cole R.S. Inactivation of Eschenchia coli, F' episomes at transfer, and bacteriophage lambda by psoralen plus 360-nm light-P. significance of deoxyribonucleic acid cross-links.//J. Bacteriol.- 1971.- V. 107.-P. 846-852.

45. Cole R.S. Properties of F' factor deoxyribonucleic acid transferred from ultraviolet-irradiated donors-P: photoreactivation in the recipient and the influence of recA, recB, recC, and uvr genes.// J*. Bacteriol.- 1971.-V. 106:-P: 143-149.

46. Cox M.M., and Lehman I. R. Directionality and polarity in recA proteinpromoted branch migration.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V. 78.-P. 6018-6022.

47. Cox M.M., and Lehman I.R. RecA protein of Eschenichia coli promotes branch migration, a kinetically distinct phase of DNA strand exchange.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981.-V. 78.-P. 3433-3437.

48. De la Puente-Redondo V.A., del Blanco N.G., Gutierrez-Martin C.B., Garcia-Pena F.J., Ferri E.F.R. Comparison of different Approaches for typing of Francisella tularensis strains. // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - N. 3. -P. 1016-22.

49. DasGupta, C., Shibata T., Cunningham R.P:, and Radding C.M. The topology of homologous pairing promotedby recA protein.// Cell. 1980. - V. 22. . p. 437-446.

50. DasGupta C., and Radding C.M. Polar branch migration promoted by recA protein-P. effect of mismatched base pairs.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1982.--V. 79. P. 762-766.

51. DiCapua E., Engel A., Stasiak A., and Koller T. Characterizationof complexes between recA protein and duplex DNA by electron microscopy.// J. Mol. Biol.- 1982.-V. 157.- P. 87-103.

52. DiCapua E., Schnarr M., Ruigrok R W., Lindner P., and Timmins P. A. Complexes of recA protein in solution. A study by small angle neutron scattering.// J. Mol. Biol.- 1990.- V. 214 -P . 557-570.

53. Editor by Ngo T.T. and Lenhoff H.M. Enzyme-mediated immunoassay.// Plenum Press, New York and London. 1988. - P 444.

54. Egelman E.H., and Stasialk A. Structure of helical recA-DNA complexes. Complexes formed in the presence of ATP--y-S or ATP.// J. Mol. Biol.- 1986.-V. 191.-P. 677-697.

55. El'bert B.I., Tinker I.S., Romanova V. P., Zavarzina K. V., and Puchkeva T. I. On the epidemiological effectiveness of cutaneous v accination with tularemia yolk vaccine against tularemia. // Rostov. 1947. - V. 6. - P. 62-70.

56. Ellis J., Oyston P.C.F., Green M., Titball R.W. Tularemia. // Clinical. Microbiol. Rev. 2002. - P. 631-646

57. Ehrlich, S.D. DNA cloning in Bacillus subtilis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 75. - P. 1433-1436.

58. Ennis D.G., Ossanna N., and D.W. Mount. Genetic separation of Eschenichia coli recA functions for SOS mutagenesis and repressor cleavage.// J. Bacteriol.- 1989.-V. 171.-P. 2533-2541.

59. Finch P.W., Storey A., Brown K., Hickson I.D., and Emmerson P.T. Complete nucleotide sequence of recD, the structural gene for the alpha subunit of exonuclease V of Escherichia coli. // Nucleic Acids Res. 1986. - V. 14. - P. 85838594.

60. Finch P.W., Storey A., Chapman K.E., Brown K., Hickson I.D., and Emmerson P.T. Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli recB'gene. // Nucleic Acids Res. 1986. - V. 14. - P. 8573-8582.

61. Finch, P.W., Wilson R E., Brown K., Hickson I. D., Tomkinson A. E., and Emmerson P.T. Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli recC gene and of the thyA-recC intergenic region. // Nucleic Acids Res. 1986. - V. 14.1. P. 4437-4451.

62. Fishel R. General genetic recombination, In U. N. Streips and R. E. Yasbin (ed.), Modern microbial genetics. Wiley-Liss, New York. 1991.-P. 91-121.

63. Fischer W., Haas R. The RecA Protein of Helicobacter pylori Requires a Posttranslational Modification for Full Activity.// J. Bacteriology.- 2004; V. 186(3). -P. 777-784

64. Frank DW, Zahrt TC. Genetics and genetic manipulation in Francisella tularensis. // Ann N Y Acad Sci. 2007. - V. 1105. - P. 67-97.

65. Franklin N. Illegitimate recombination, in The Bacteriophage lambda. // Gold Spring Harbor, New York.-1971. P. 175-194.

66. Ganesan S., and Smith G. R. Strand-specific binding to duplex DNA ends by the subunits of Escherichia coli recBCD enzyme. // J. Mol. Biol. 1993. - V. 229. -P.! 67-78.

67. Golovliov I., Sandstrom G., Ericsson M., Sjostedt A., and Tarnvik A. Cytokine expression in the liver during the early phase of murine tularemia. // Infect. Immun. 1995. - V. 63. - P. 534-538

68. Golovliov I., et al. An Attenuated Strain of the Facultative Intracellular Bacterium Francisella tularensis Can Escape the Phagosome of Monocytic Cells. // Infect.Immun. 2003. - V. 71. - P. 5940-5950.

69. Golovliov I, Sjostedt A, MokrievichA, Pavlov V. A method for allelic replacement in Francisella tularensis. // FEMS Microbiol Lett.- 2003-V. 222.-P. 273-280.

70. Gray C.G., Cowley S.C., Cheung K.K., Nano F.E. The identification of five genetic loci of Francisella novicida associated with intracellular growth. // FEMS Microbiol Lett. 2002.- V. 215.-P. 53-56.

71. Holliday R. A. Mechanism for gene conversion: in fungi. // Genet. Res. 1964;:-V. 5:- P: 282-304., , ' . : .

72. Horii: T., T. Ogawa, T. Nakatani, T. Hase, H. Matsubara, and: H. Ogawa. Regulation of the SOS functions-P. purification of E. coli LexA protein and determination of its specific site cleaved:by the;RecA protein;// Cell; 1981,- V. 27-P. 515-522.

73. Howard-Flanders P:,. and Boyce R.P. DNA repair and genetic recombination-P: studies on mutants of Escherichia coli defective: in these processes.//Radiat. Res.- 1966.- V. 6 P; 156-181.

74. Johansson A., Berglund L., Eriksson U., et. al. Comparative analysis of PGR versus culture for diagnosis of ulceroglandular tularemia // J. Clin. Microbiol. -2000. V. 38. N. 1. - P. 22 - 26.

75. Johansson A., Forsman M! and Sjostedt A. The development of tools for diagnosis of tularemia and typing of Francisella tularensis. II APMIS. 2004. -V. 112;-P. 898-907.

76. Kahn R., Cunningham R. P., DasGupta C., and Radding C. M. Polarity of heteroduplex formation promoted by Escherichia coli recA protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1981.-V. 78. P. 4786-4790.

77. Karlin S. and Brocchieri L. Evolutionary C onservation of RecA G enes in Relation to Protein Structure and Function. // J1 Bacteriol. 1996. - V. 178. - N. T. -P. 1881-1894.

78. Karoui El M., Ehrlich D., and Gruss A. Identification of the lactococcal exonucleaseyrecombinase and its modulation by the putative Chi sequence. // Proc. Natl. Acad: Sci. USA. 1998 - V. 95, P: 626-631.

79. Keller M., Boettger E.C., Sande P. Tuberculosis vaccine strain Mycobacterium bovis BCG Russia is a natural recA mutant. // Nature Precedings! 2008.

80. Kowalczykowski S. C. Mechanistic aspects of the DNA strand exchange activity of E. coli recA protein. // Trends Biochem. Sci. 1987.-V. 12.-P: 141-145.

81. Kowalczykowski S. C., Dixon D: A., Eggleston A. K., Lauder S. D., and Rehrauer W. M. Biochemistry of Homologous Recombination in Escherichia coli. // Microbiol. Rev. 1994. - V. 58. - N. 3. - P! 401-465.

82. Kugeler K. J., Gurfield N., Creek J. G. et al. Discrimination between-Francisella tularensis and Francisella-like endosymbionts when screening ticks by PCR // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 7. - N. 11. - P. 7594 - 7597.

83. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.//Nature(London). 1970. - V. 227.-P. 680-685.

84. Larsson P., et al. The complete genome sequence of Francisella tularensis, the causative agent of tularemia. // Nature Genetics. -2005. V. 37. - P. 153 7 159.

85. Lin P. F., and P. Howard-Flanders. Genetic exchanges caused by ultraviolet photoproducts in phage lambda DNA molecules-P. the role of DNA replication. // Mol. Gen. Genet. 1976. - V. 146. - P: 107-115.

86. Little J. W., Edmiston S. H., Pacelli L. Z., and Mount D: W. Cleavage of the Escherichia coli lexA protein by the recA protease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1980.-V. 77.- P. 3225-3229.

87. LoVullo E.D:, Sherrill L.A., Perez L.L. & Pavelka M.S., Jr. Genetic tools for highly pathogenic Francisella tularensis subsp. tularensis. II Microbiology. 2006. -V. 152.-P: 3425-3435.

88. Long G.W., Oprandy J J., Narayanan R.B., et. al. Detection of Francisella tularensis in blood by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1993. -V.31.N. l.-P. 152- 154.

89. Lovett SiT., DeLuca C. L., and Kolodner R. D. The genetic dependence of recombination in recD mutants of Escherichia coli. // Genetics. 1988. - V. 120. -P. 37-45.

90. Lowiy O.H., Rosenbrough N.R., Farr A.L. and Randall RJ. Protein measurement with the folin phenol.// J. Biol. Chem. 1951.- Y. 193. - P. 115-119.

91. Maier T.M., Havig A., Casey M., Nano F.E., Frank D:W., and Zahrt T.C. Construction and Characterization of a Highly Efficient Francisella Shuttle Plasmid. // Applied and Environmental Microbiology. 2004. - P. 7511-7519.

92. Markham B.E., Harper J.E., and Mount D.W. Physiology of the SOS response-P. kinetics of lexA and recA transcriptional activity following induction. // Mol. Gen. Genet.- 1985.-V. 198. P. 207-2121

93. McEntee K., Weinstock G.M., and Lehman I.R. Initiation of general recombination catalyzed in vitro by the recA protein of Escherichia coli.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76.- P. 2615-2619.

94. McEntee, K., Weinstock G.M., and Lehman I.R. RecA protein-catalyzed strand assimilation-P. stimulation by Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980.- V. 77. - P. 857-861.

95. McEntee K., Weinstock G.M., and Lehman I. R. Binding of the recA protein of Escherichia coli to single- and doublestranded DNA. // J. Biol. Chem. 1981. -V. 256. - P. 8835-8844.

96. McEntee K., Weinstock G.M., and Lehman I.R. DNA and nucleoside triphosphate binding properties of recA protein from Escherichia coli. // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1981. - V. 26: - Pi 265-279.

97. McPartland A., Green L., and Echols H. Control of recA gene RNA in E. coli regulatory and signal genes. // Cell.- 1980. V. 20. - P. 731-737.

98. Miller R.V., and Kokjohn T.A. General microbiology of recA-P. environmental and evolutionary significance. //Annu. Rev. Microbiol. 1990. -V. 44. - P. 365-394.

99. Muniyappa K., Shaner S. L., Tsang S. S., and Radding C. M. Mechanism of the concerted action of recA protein and helix destabilizing proteins in homologous recombination. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V. 81. - P. 2757-2761.

100. Nano F.E., Zhang N., Cowley S.C. et al. A Francisella tularensis pathogenicity island required for intramacrophage growth. // J. Bacteriol. 2004. -V. 186.-P. 6430-6436.

101. Niebylski M. L., Peacock M. G., Fischer E. R. et al. Characterization of an endosymbiont infecting wood ticks, Dermacentor andersoni, as a member of a genus Francisella // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 3933 - 3940.

102. Noda H., Munderloh U. G., Kurtti T. J. Endosymbionts of ticks and their relationship to Wolbachia spp. and tick-borne pathogens of humans and animals // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 3926 - 3932.

103. Norqvist, A., Kuoppa K. Sandstrom G. Construction of a shuttle vector for use in Francisella tularensis. FEMS.// Immunol Med Microbiol. 1996. - V. 13. -P. 257-60.

104. Ogawa T., Wabiko H., Tsurimoto T., Horii T., Masukata H., and Ogawa H. Characteristics of purified recA protein and the regulation of its synthesis in vivo. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1978. - V. 43. - P. 909-916.

105. Oliver D.B., and Goldberg E.B. Protection of parental T4 DNA from a restriction exonuclease by the product of gene 2. // J. Mol. Biol. 1977. - V. 116.-P. 877-881.

106. Oyston P.C.F. Francisella tularensis: unravelling the secrets of an intracellular pathogen. // Journal of Medical Microbiology. 2008. - V. 57. -P. 921-930.

107. Papavinasasundaram K.G., Anderson C., Brooks P.C., Thomas N.A. Movahedzadeh F., Jenner P.J., Colston M.J. and Davis E.O. Slow induction of RecA by DNA damage in Mycobacterium tuberculosis. II Microbiology. 2001. V. 147.-P. 3271-3279.

108. Pavlov V.M., et al. Isolation and molecular-genetic characteristic of a cryptic plasmid from the Francisella novicida like F6168 strain.// Mol Gen Mikrobiol Virusol. 1994. - P. 39-40.

109. Pavlov V.M., Mokrievich A. N., Volkovoy K. Cryptic plasmid pFNLlO from Francisella novicida-like F6168: the base of plasmid vectors for Francisella tularensis. IIFEMS Immunol Med Microbiol. 1996. - V. 13. - P. 253-56.

110. Porter, R. D., T. McLaughlin, and B. Low. Transduction vs. "conjuduction"-P. evidence for multiple roles for exoV in genetic recombination in E. coli.// Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1978. V. 43. - P: 1043-1046.

111. Register, J.C., III, and Griffith J. 10 nm recA protein filaments formed in the presence of magnesium and adenosine 5'-0-3-thiotriphosphate may contain RNA. // Mol. Gen. Genet. 1985. - V. 199.- P. 415-420.

112. Rinken R., Thomas B., and Wackernagel W. Evidence that recBC-dependent degradation of duplex DNA in Escherichia coli recD mutants involves DNA unwinding. // J. Bacteriol. 1992. - V. 174.- P. 5424-5429.

113. Roberts J. W., Roberts C.W., Craig N.L., and Phizicky E. M. Activity of the Escherichia coli recA gene product. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. -1978.-V. 43 P. 917-920.

114. Rould E., Muniyappa K., and Radding C.M. Unwinding of heterologous DNA by recA protein during the search for homologous sequences.// J. Mol. Biol. -1992.-V. 226.-P. 127-139.

115. Rupp W.D., and Howard-Flanders P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. // J. Mol. Biol. 1968. - V. 31. - P. 291- 304.

116. Rupp W.D., Wilde G.E., III, Reno D.L., and Howard-Flanders P. Exchanges between DNA strands in ultravioletirradiated Escherichia coli. //J. Mol. Biol. -1971 -V. 61.- P. 25-44.

117. Russell C.Bt, Thaler D.S., and Dahlquist F.W. Chromosomal transformation of Escherichia coli recD strains with linearized'plasmids. // J. Bacteriol. 1989. -V.171.-P: 2609-2613.

118. Sancar A., and Rupp W.D. Physical map of the recA gene.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1979. - V. 76*. - P. 3144-3148.

119. Sandstrom G. The tularemia vaccine. // J. Chem. Tech. Biotech. 1994. -V. 59.-P. 315-320

120. Sandri R.M., and Berger H. Bacteriophage PI-mediated generalized transduction in Escherichia coli-P. fate of transduced DNA in rec+ and recA -recipients.// Virology. 1980. - V. 106. - P. 14-29.

121. Scoles G. Phylogenetic analysis of the Francisella-like endosymbionts of Dermacentor ticks // J. Med. Enthomol. 2004.- V. 41. - P. 277 - 286.

122. Shibata T., DasGupta C., Cunningham R.P., and Radding C.M. Purified Escherichia coli recA protein catalyzes homologous pairing of superhelical DNA and single-stranded fragments.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1979: - V. 76.-P. 1638-1642.

123. Sjostedt A., Eriksson U., Berglund L., Tarnvik A. Detection of Francisella tularensis in ulcers of patients with tularemia by PCR. // J. Clin. Microbiol. 1997. -V. 35.-N. 5.-P. 1045-1048.

124. Sjostedt A., Family XVII. Francisellaceae, genus I. Francisella. // Brenner DJ. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology.-NY., 2003. - P. 201-210.

125. Simon R., Priefer U. and Puhler A. Abroad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram-negative bacteria. // Biotechnology.-1983. V. 1. - P. 784-791.

126. Simon R. High frequency mobilization of gram-negative bacterial replicons by the in vitro constructed Tn5-Mob transposon. // Mol-Gen-Genet. 1984. -V. 196.-P. 413-420.

127. Sladek F.M., MunnM.M., Rupp W.D;, and Howard- Flanders P. In vitro repair of psoralen-DNA cross-links byrecA, uvrABC, and the 5-exonuclease of DNA polymerasel. // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264 - P. 6755-6765.

128. Smith K.C., and Wang T.-C. V. recA-dependent DNA repair processes. // Bioessays. 1989. - V. 10. - P. 12-16.

129. Soltis D.A., and Lehman I.R. RecA protein-promoted DNA strand exchange-P. isolation of recA protein-DNA complexes in the presence of single-stranded DNA binding protein. // J. Biol. Chem. 1983. - V. 258. - P. 6073-6077.

130. Stahl F.W. Special sites in generalized recombination.// Annu. Rev. Genet. -1979.-.V. 13.-P. 7-24.

131. Stahl M .M., Kobayashi I., S tahl F .W., and Huntington S .K. A ctivation of Chi, a recombinator, by the action of an endonuclease at a distant site. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - V. 80. - P: 2310-2313.

132. Stasiak A., Stasiak A.Z., and Koller T. Visualization of recA-DNA complexes involved in consecutive stages of an in vitro strand* exchange reaction. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1984. - V. 49. - P: 561-570.

133. Sun L.V., Severin D.D.M., Ghu M.C., Petersen J.M. Development of a multitarget real-time TaqMan PGR' assay for enhanced detection« of Francisella tularensis in complex specimens // J. Clin. Microbiol. 2003: - V. 41. - P: 5492 -5499.

134. Taylor A.F. The recBCD enzyme of Escherichia coli, In R. Kucherlapati and G. R. Smith (ed.). // Genetic recombination. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1988. - P. 231-263.

135. Taylor A.F. and Smith G.R. RecBCD enzyme is a DNA helicase with fast and slow motors of opposite polarity. // Nature. 2003. - V. 423; - P. 889-893:

136. Titball R.W., Sjostedt, A., Pavelka, M.S., Nano F.E. Biosafety and selectable markers. // Ann N Y Acad.Sci. 2007. - V. 1105. - P. 405-417.

137. Towbin H., Staenelin, Gordon J. Electroforetic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets-P. procedure and some applications.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979.' - V. 76. - P. 4350-4354.

138. Tsang S.S., Ghow S.A., and Radding G.M'. Networks of DNA and recA protein are intermediates-in homologous pairing. // Biochemistry. 1985. - V. 24. -P. 3226-3232.

139. Tyeryar F.J., Lawton W.D. Transformation of Pasteurella novicida. II J.Bacteriol. 1969. - V. 100. - P. 1112-1113.

140. Wackernagel W., and Radding C.M. Formation in vitro of infective joint molecules of lambda DNA by T4 gene 32 protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1974.-V. 71.-P. 431-435.

141. Wang T.-C.V., and Smith K.C. Mechanisms for recFdependentand recB-dependent pathways of postreplication repair in UV-irradiated Escherichia coli uvrB. // J. Bacteriol. 1983. - V. 156. - P. 1093-1098.

142. Wang T.-C.V., and Smith K.C. Inviability of dam recA and dam recB cells of Escherichia coli is correlated with their inability to repair DNA double-strandbreaks produced b y mismatch repair.//J. Bacteriol. 1986. - V. 165. - P. 10231025!

143. Willetts N.S., Clark A.J., and Low B: Genetic location of certain mutations conferring recombination deficiency in Escherichia coli. // J. Bacteriol. 1969. -V. 97. - P. 244-249.

144. West S.C., Cassuto E., Mursalim J., and Howard-Flanders P. Recognition of duplex DNA containing single-stranded regions by recA protein. //Proc. Natl. Acad. Sci: USA. 1980s - V. 77. - P.' 2569-2573.

145. Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Миронова Р. И., Комбарова Т.Н., Лапин A.A. Заявка на получение патента на изобретение «Способ1 стабилизации туляремийного вакцинного штамма» под № 2010141704 от 11.10.2010.

146. Лапин A.A., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Миронова Р: И., Комбарова Т.И., Игнашина E.H., Павлов В.М. Заявка на получение патента на изобретение «Способ аттенуации туляремийного вакцинного штамма» под №2011131560 от 28:07.2011.в) тезисы ¿конференций

Информация о работе

Лапин, Александр Александрович
кандидата биологических наук
Оболенск, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Изучение молекулярно-биологических свойств вариантов вакцинного штамма Francisella tularensis с делетированными генами системы рекомбинации recA и recD - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы