Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4, потенциального компонента генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4, потенциального компонента генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины"

На правах рукописи

Лящук Александр Михайлович

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ТОЪ4, ПОТЕНЦИАЛЬНОГО КОМПОНЕНТА ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЙ СУБЪЕДИНИЧНОЙ ПРОТИВОТУЛЯРЕМИЙНОЙ ВАКЦИНЫ

03.00.07 - микробиология 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук.

Научные руководители: доктор биологических наук

И.С. Мещерякова кандидат биологических наук В.Г. Лунин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.М. Бондаренко кандидат биологических наук В.Е. Алаторцев

Ведущая организация - Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ.

Защита диссертации состоится «июня 2005 г. в 11 час, на заседании специализированного совета при ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН по адресу: 123098 г. Москва, ул. Гамалеи 18.

Автореферат разослан

« $3» мая

2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Туляремия является актуальной проблемой для здравоохранения в связи с широким распространением природных очагов в странах умеренного климатического пояса, а также возможной ролью возбудителя в качестве потенциального агента биотерроризма [Мещерякова И.С., 1994,1998; Morner Т. 1992].

Для специфической профилактики туляремии в Российской Федерации применяется живая вакцина (на основе штамма Frcmcisella tularensis 15 НИИЭГ), использование которой позволило снизить заболеваемость этой инфекцией до спорадических случаев или небольших вспышек [Мещерякова И.С., 1998; Khatenever L.M. et al., 1943; Sandstrom G. 1994].

Данная вакцина не лишена определенных недостатков, важнейшим из которых является значительно сходство геномов вакцинного и дикого штаммов F tularensis. Поэтому применение живой вакцины для вакцинации людей не желательно, особенно в условиях нарастающей тенденции снижения уровня естественного иммунитета у населения.

Одним из перспективных направлений в области совершенствования и разработки эффективных способов защиты от туляремии является создание иммунопрофилактических препаратов нового поколения на основе протективных компонентов бактериальной клетки F. tularensis. Такими препаратами, например, могут быть субъединичные вакцины [Arnon R. Et al., 2003; Dertzbaugh M.T., 1998; Liljeqvist S. et al., 1999]. Данные вакцины имеют ряд преимуществ, важнейшими из которых являются исключение возможности возникновения манифестной инфекции, слабая реактогенность и возможность получения стандартного препарата антигена. Вместе с тем, сложности в создании субъединичных вакцин связаны с недостаточными сведениями о протективных антигенах F. tularensis и иммунных механизмах ответа организма человека.

Возбудитель туляремии является внутриклеточным паразитом, и основная роль в формировании невосприимчивости к туляремии отводится Т-клеточному иммунитету. Основными известными Т-зависимыми антигенами туляремии являются компоненты внешней мембраны, среди которых лучше всего изучен белок TUL4 и липополисахарид [Khlebnikov V.S. et al., 1996; Sjostedt A. et al., 1992,1990].

На основе этих антигенов в последние годы были получены перспективные вакцинные препараты - это рекомбинантный или очищенный белок TUL4, инкапсулированный в иммуностимулирующие комплексы (ISCOMs) [Sjostedt A. et al., 1992; Golovliov I. et al., 1995], липополисахарид-белковый комплекс наружных мембран F. tularensis [Khlebnikov V.S. et al., 1996], препарат ОМ-«С», представляющий собой комплекс

наружных мембран, выделенный из вакцинного штамма F.tularensis 15 [Жемчугов В.Е. и др., 2004].

В настоящее время спектр основных иммуногенных антигенов Г. Ш1агет^ окончательно не определен, а вышеупомянутые препараты представляют собой сложную и, как следствие, заведомо трудно стандартизуемую смесь белков, липополисахаридов, жирных кислот и других компонентов клетки Г. Ш1агет^. Поэтому использование таких препаратов для вакцинации людей менее предпочтительно по сравнению с препаратами индивидуальных белков, липополисахаридов, или их смеси. Следует также отметить, что получение комплексных препаратов связано с необходимостью культивирования патогенных штаммов туляремии.

Получение стандартных белковых препаратов из клеточных экстрактов Г. Ш1агвпш трудоемко, а многочисленные очистки приводят к снижению протективной активности.

Таким образом, для создания эффективных профилактических препаратов против туляремии необходим принципиально новый подход, направленный на получение стандартных рекомбинантных белков, обладающих высокой протективной активностью, в том числе, за счет использования соответствующих адъювантов или иммуносорбентов.

Цель работы. Получение и характеристика рекомбинантного белка ТиЬ4 на основе технологии целлюлозосвязывающих доменов для генно-инженерных субъединичных противотуляремийных вакцинных препаратов.

В соответствии с целью в процессе диссертационной работы предстояло решить следующие основные задачи:

1. Клонирование гена белка ТИЬ4, а также отдельных участков гена белка ТИЬ4 в составе гибридных генов (белков);

2. Создание бактериальных продуцентов белка ТИЬ4 и рекомбинантных белков ТИЬ4^р-СБЭ и СБЭ^р-ТОЬ4;

3. Изучение локализации белков ТИЬ4^р-СБЭ и СБЭ^р-ТИЬ4 в лизатах клеток штамма-продуцента;

4. Разработка технологии очистки и получения препарата белка, пригодного для иммунизации;

5. Исследование антигенных свойств препарата белка ТИЬ4.

• Научная новизна. Впервые получен в препаративных количествах высокоочишенный рекомбинантный белок ТИЬ4^р-СБЭ, потенциальный компонент генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины.

Впервые для обеспечения синтеза белка TUL4 в клетках Escherichia coli были сконструированы гибридные плазмиды, контролирующие синтез химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4. Данные химерные белки состоят из нуклеотидной последовательности зрелого белка TUL4, Gly-Ser спейсера и целлюлозосвязываюшего домена из Anaerocellum thermophilum. Белки TUL4-sp-CBD и pCBD-sp-TUL4 отличаются N и С-концевым расположением последовательности белка TUL4.

Впервые были получены эффективные бактериальные продуценты белка TUL4 в составе химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 в клетках Е. coli штамма Ml5 (pREP4) и DH5a. Уровень экспрессии химерных белков составляет 30 % от тотального.

На основе использования свойств целлюлозосвязывающего домена, входящего в состав химерных белков, была разработана эффективная схема очистки рекомбинантных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 на целлюлозе. Степень чистоты препаратов составляла более 95 %.

Препарат белка, содержащий комплекс TUL4-sp-CBD и целлюлозу индуцировал выработку антител к исследуемому белку у лабораторных животных. Специфичность антител подтверждена с помощью метода иммуноблоттинга.

Практическое значение работы. Технология получения химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4, а также способ очистки и иммобилизации белков на целлюлозном сорбенте могут найти применение при создании профилактических препаратов против туляремии. Препарат, содержащий комплекс ТUL4-зр-СВО-целлюлоза, может быть использован для диагностических целей или для изучения свойств белка TUL4.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной конференции «Молекулярная медицина и безопасность» 26-28 октября, 2004 г., г. Москва; на международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» 8-10 сентября, 2004 г., г. Новосибирск; на V молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» 30 марта, 2005 г., г. Москва; на всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» 19-22 мая, 2005 г., г. Суздаль. Апробация диссертации состоялась 24 апреля 2005 года на научной конференции отдела генетики и молекулярной биологии бактерий в ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Публикации. Основные результаты диссертации отражены в шести печатных работах.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения и выводов. Объем работы составляет 104 страницы. Работа

иллюстрирована 6 таблицами, 15 рисунками и 10 схемами Список литературы включает 165 наименований (27 отечественных и 148 зарубежных)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время мало известно об основных антигенных детерминантах возбудителя туляремии, однако, пользуясь немногочисленными литературными данными, можно выделить основные группы иммунологически значимых антигенных детерминант. Это компоненты капсулы, липополисахарид и антигены белковой природы, локализованные на внешней мембране бактериальной клетки. Отдельное использование одной из антигенных детерминант в качестве вакцинного препарата мало эффективно. Вакцинный препарат против туляремии должен содержать комплекс антигенных компонентов, которые были бы способны сформировать стойкую невосприимчивость к туляремии. С другой стороны, эти антигенные компоненты должны быть получены в больших количествах, в чистом виде и с сохраненными антигенными и иммуногенными свойствами природного возбудителя туляремии.

Традиционный способ получения антигенных компонентов туляремии основан на фракционировании бактериальных клеток Г. tularensis с помощью различных физико-химических методов. Такие препараты содержат различные примеси, а многочисленные очистки приводят к снижению протективности антигенного компонента.

Чтобы избежать вышеперечисленных недостатков нами был применен методический подход, заключающийся в создании бактериального продуцента белка TUL4 с высокой степенью продукции целевого белка. Использованный подход предусматривает возможность разработки высокоэффективной схемы очистки белка TUL4, иммобилизированного на микрочастицах целлюлозы. Такой препарат за счет эффективной презентации белкового антигена иммунной системе должен обладать повышенной антигенной активностью, а при использовании в качестве компонента комбинированных субъединочных вакцин способствовать повышению их иммуногенности.

1. Создание бактериальных продуцентов белка ТиЬ4. Наиболее изученным и охарактеризованным антигенным компонентом возбудителя туляремии является белок TUL4, кодируемый геном TUL4 и представляющий собой основной белок наружной мембраны Г. tularensis. До настоящего момента не удавалось получить высокоочищенные концентрированные препараты белка. Тем не менее, по имеющимся в литературе данным белок TUL4 обладает протективной активностью. Нуклеотидная последовательность гена белка TUL4 консервативна у различных штаммов Г. tularensis. Определены Т-клеточные детерминанты белка.

Первым этапом нашей работы являлось создание эффективного штамма-продуцента белка TUL4 в клетках Е. соН штамма Ml5 (pREP4). Для этого аутентичный ген белка TUL4

был клонирован в бактериальный вектор pQE6 и были получены следующие генно-инженерные конструкции:

, Известно, что ген белка TUL4 кодирует последовательность сигнального пептида и зрелый белок (Рис. 1).

10 20 30 40 50 60 70 MKKIIKLSLLSLSIAG1ASCSTLGLGGSDDAKASAKDTAAAQTATTEQAAAVSKPTAKVSLNKLGQDKIKATVYTAY Сигнальная область Область зрелого ........................................

80 90 100 110 120 130 140 NNNPQGSVRLQKQAPEGSKCHDTSFPITKYAEKNDKTWATVTVKQGNNFCSGKWTANVVyDKEVIASDSINI ...................................................................белка

Рис. 1. Аминокислотная последовательность белка TUL4.

Гетерологичная экспрессия генов белков в Е. coli может приводить как к цитоплазматической локализации продуцируемых белков, так и к периплазматической локализации в том случае, если белок содержит N-концевой сигнальный пептид. Эффективность той или иной экспрессии может быть проверена только экспериментально. Для получения белка TUL4 с периплазматической локализацией была создана конструкция pQE-TULO, pQE-SigTUL и pQE-Asn-TUL, с периплазматической - конструкция pQE-TULM. Конструкции pQE-SigTUL и pQE-Asn-TUL отличаются от pQE-TULO тем, что они содержат высокоэффективные регуляторные элементы вектора pQE6 (промотор фага Т5 под

контролем Lad penpeccopa), a pQE-Asn-TUL содержит сигнальную последовательность гена аспарагиназы из Е. coli. Такие конструкции создавались для возможно более эффективной гетерологичной экспрессии белка TUL4. Плазмида pQE-TULM содержит область зрелого белка TUL4, окруженную высокоэффективными регуляторными элементами вектора pQE6.

Фрагменты гена белка TUL4 для клонирования были получены с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). В работе использовались олигонуклеотиды, синтезированные ЗАО «Синтол»:

1. Tull 5' -gcg agc gga tcc act cta ggg tta ggt ggc tct gat gat g- 3'

2. Tul2 5' -ata ttt ccg gaa att aag atc ttc ttg aat cag aag cga tta ctt ctt tgt c- 3'

3. Tul3 5' -taa tga gaa ttc taa tgt tag ctg tat cat cat tta ata aac tgc- 3'

4. Tul4 5' -gtt ggt ccg gat ggc taa gta caa cta аса tcg aga ata tc- 3'

5. Tul5 5' - ata ttt ccg gaa att aaa tat tta ttg aat cag aag cga tta ctt ctt tgt с - 3'

6. Tul-sig 5'- сас аса gaa 11с att ааа gag gag ааа tta асс atg ааа ааа ata att aag ctt agt с - 3'

Для получения pQE-TULO использовали олигонуклеотиды Ти13 и Ти14 для pQE-SigTUL - Tul-sig и Tul5, а для pQE-TULM - Tull и Tul2 (Схема 1).

10 20 30 40 50 60 70

Tul3

taatgagaat tctaatgtta gctgtatcat catttaataa actgc

taatgatgtt cttaatgtta gctgtatcat catttaataa actgctgttt attttatttt aattaatgtt

80 90 100 110 120 130 140

Tul-sig

cacaca ggatccatta aagaggagaa attaaccatg aaaaaaataa ttaagcttag

ataatcgatt tgagtatatg tgaatattta aaaataggag tatctatatg aaaaaaataa ttaagcttag

область промотора SD Start

150 160 170 180 190 200 210

Tull

tc ge gagoggatcc actctagggt taggtggcte tgatgatg

tcttttatct ttatcaatcg caggtttagc gagctgttct actctagggt taggtggctc tgatgatgca

220 230 240 250 260 270 280

aaagcttcag ctaaagatac tgctgctgct cagacagcta ctactgagca agctgctgct gtatctaagc

290 300 310 320 330 340 350

caactgcaaa agtaagttta aataaacttg gtcaggataa aataaaagca actgtatata cagcatacaa

360 370 380 390 400 410 420

taataaccca caaggaagtg taagattaca atggcaggct ccagaaggtt ctaagtgcca tgatacaagc

430 440 450 4 60 470 480 490

ttcccaatta ctaagtatgc tgagaagaac gataaaactt gggcaactgt aacagttaag caaggtaata

acttctgtag cggtaagtgg acagctaatg tagtttatga caaagaagta atcgcttctg attcaataaa

tatttaattt cttcaaatat ttataatttt ctagtttttg cttttctcaa aaaaaaataa cggtgtgatt

aattttgctt agctagatta gttgtacttt taacttttta ctaaaaagat ttgctataat tgcttaaata taacaaataa aaaagtaata gtttaatgaa aaacattatc ttgttattaa tgatattctc gatgttagtt

Схема 1. Нуклеотидная последовательность геномной ДНК F. tularensis и расположение праймеров Tull, Tul2, TuB, Tul4, Tul5 и Tul-sig в области гена белка TUL4. Tull, Tul3 и Tul-sig соответствуют прямой цепи - расположены над последовательностью геномной ДНК. Tul2, TuW и Tul5 соответствуют обратной цепи - расположены над и под последовательностью геномной ДНК соответственно.

В качестве матрицы для проведения ПЦР использовали геномную ДНК F. tularensis штамма 15/10.

Идентичность клонированного фрагмента участку гена белка TUL4 была подтверждена рестрикционным картированием и секвенированием.

Плазмиды pQE-TULO, pQE-SigTUL, pQE-Asn-TUL и pQE-TULM были трансформированы в штамм Е. coli Ml5 (pREP4). Анализ экспрессии белка TUL4 с помощью электрофореза по Лэмлли не обнаружил видимых продуктов экспрессии. Можно предположить, что уровень экспрессии составляет менее 1 % от тотального.

В результате проделанной работы не удалось получить эффективный уровень продукции белка TUL4 с конструкциями, содержащими аутентичную последовательность гена белка TUL4 как в цитоплазме, так и в периплазме клеток штамма-продуцента.

Известно, что процесс гетерологической экспрессии и секреции рекомбинантных белков в клетках Е. coli является сложным, а порой и невозможным. Помимо протеолиза на рекомбинантный белок действует множество других факторов.

В настоящее время существует ряд подходов, позволяющих решить данные проблемы. Одним из возможных подходов является fusion-технология - технология слитных

(химерных) белков. В основе этой технологии лежит подход, основанный на соединении в одной рамке трансляции двух генов (гена белка-носителя и гена исследуемого продукта), приводящий к синтезу в бактериальной системе химерного белка, устойчивого к протеолизу.

Предполагаемый нами подход основан на использовании технологии получения химерных белков, включающих целлюлозосвязывающий домен (ЦСД). Данный домен с одной стороны защищает белок от протеолиза, а с другой, за счет аффинности к целлюлозе, обеспечивает возможность высокоэффективной одностадийной очистки и иммобилизации целевого антигена на целлюлозном сорбенте. В свою очередь целлюлоза является дешевым и очень удобным субстратом, способным образовывать высокомолекулярные агрегаты (антиген-целлюлоза), имеющие более высокую иммуногенность по сравнению с иммуногенностью субъединичного белкового препарата.

В работе был использован ЦСД из термофильного микроорганизма ЛпаегосеИыш ЛегторНИит.

2. Создание бактериальных продуцентов белка TUL4-sp-CBD и CBD-SP-TUL4. На основе вектора pQE6 нами были созданы экспрессионные векторы pTUL4-sp-CBD и pCBD-sp-TUL4, содержащие гены химерных белков, состоящих из нуклеотидной последовательности белка TUL4 из F. tularensis, Gly-Seг спейсера (5 повторов Gly-Seг) и ЦСД из Лпаегосе11ит ШегторИйит (ЦСД расположен либо на N либо на С-концевой части химерной конструкции):

Последовательность ЦСД представлена на схеме 2. Идентичность клонированного фрагмента участку гена белка TUL4 и ЦСД была подтверждена рестрикционным картированием и частичным секвенированием.

start

9 18 27 36 45 54 63

ATG AGA GGA ТСС AAT GCA CCT TTA GGC GAA AAA GTC TTA CCA TCC ACG TTT GAA GAT GAC ACT

MRGSNAPLGEKVLPSTFEDDT

72 81 90 99 108 117 126

CGT CAG GGC TGG GAT TGG GAT GGA CCA TCT GGT GTG AAA GGT CCT ATT ACT АТС GAA ACT GCG

RQGWDWDGPSGVKGPITIESA

135 144 153 162 171 180 189

AAT GGT TCA AAA GCG СТА TCT TTT AAT GTT GAG TAT CCA GAG AAA AAA CCA CAA GAT GGC TGG

NGSKALSFNVEYPEKKPQDGW

198 207 216 225 234 243 252

GCA ACA GCT GCA AGG CTT ATA CTT AAA GAC ATA AAT GTA GAA AGG GGA AAT AAT AAA TAT TTG

ATAARLILKDINVERGNMKYL

261 270 279 288 297 306 315

GCT TTT GAT TTT TAT TTG AAA CCA GAT AGG GCT TCA AAA GGT ATG ATT CAG ATG TTT TTA GCT

AFDFYLKPDRASKGMIQMFLA

324 333 342 351 360 369 378

TTT TCA CCA TCC TTA GGT TAC TGG GCT CAG GTA CAA GAC AGT TTT AAT ATT GAC CCT CTT GGC

FSPPSLGYWAQVQDSFNIDLG

387 396 405 414 423 432 441

AAA ACT GTC AAG TGC AAA AAA GAT AGA AGA АСА GAA GTT TAT AAG TTC AAT GTA TTT TTT GAC

KTV KCKKDRRTEVYKFNVFFD

450 459 468 477 486 495 504

TTA GAC AAG ATA CAA GAT AAT AAA GTA CTG AGT CCA GAC АСА CTC TTG AGA GAT ATA ATA GTA

LDKIQDNKVLSPDTLLRDIIV

513 522 531 540 549 558 567

GTC ATA GCA GAT GGC AAT AGC GAT TTT AAG GGG AAA ATG TAT ATA GAT AAT GTT AGA TCC CCG

VIADGNSDFKGKMYIDNVRSP

576 TAA

stop

Схема 2. Нуклеотидная и аминокислотная последовательность ЦСД из Anaerocellum thermophilum.

В результате трансформации плазмид pTUL4-sp-CBD и pCBD-sp-TUL4 в штаммы Е. coli М15 (pREP4) и DH5a были созданы эффективные бактериальные продуценты белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4. Уровень экспрессии составлял 5-10 % от тотального (рис. 2).

12 345 67 89 10 11

j¿|flü «n А^щД^

Рис. 2. Анализ экспрессии белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD в клетках Е coli Ml 5 (pREP4) (электрофорез в 12 % ПААГ по Леммли).

1 - pCBD-sp-TUL4 до индукции; 2 - pCBD-sp-TUL4, индукция 2 ч.- 36,4 кДа, 3 - pCBD-sp-TUL4, индукция 2 ч. вместе с pACYC-RIL (Stratagene, USA, плазмида, кодирующая t-PHK редко встречающихся в E.coli кодонов AGA, AGG, АТА и СТА); 4 - pCBD-sp-TUL4, индукция 3 ч. вместе с pACYC-R.IL; 5 - pTUL4-sp-CBD до индукции; 6 - pTUL4-sp-CBD, индукция 2 ч. - 36 кДа; 7 - pTUL4-sp-CBD, индукция 3 ч. вместе с pACYC-RIL; 8 - pTUL4-sp-CBD индукция 2 ч. вместе с pACYC-RIL; 9 - М15 (pREP4) до индукции; 10 - М15 (pREP4), индукция 2 ч.; 11 - контроль молекулярной массы 37 кДа.

Таким образом, при использовании fusion технологии с ЦСД впервые была осуществлена эффективная экспрессия рекомбинантного белка TUL4 в цитоплазме клеток Е coli По всей вероятности, именно применение целлюлозосвязывающего домена сыграло решающую роль в увеличении экспрессии белка TUL4. Подобные данные, при использовании того же ЦСД были получены А.В. Васекиной с соавторами [А.В. Васекиной и др. 2005], которые получили эффективную экспрессию химерного белка HvNHX2 (вакуолярный Na+/H+ антипортер из ячменя) - ЦСД.

По данным литературы известно, что хромосомная ДНК клеток F. tularensis является AT богатой, а количество GC составляет примерно 30 %. Для клеток Е. coli характерным является наличие примерно 60 % GC. Таким образом, многие кодоны ДНК F. tularensis не оптимальны для Е coli и поэтому трансляция м-РНК генов из F tularensis в клетках Е. coli, возможно, может быть мало эффективной.

Следующим этапом нашей работы была попытка увеличения экспрессии гена рекомбинантного белка TUL4 с помощью плазмиды pACYC-RIL (Stratagene, USA), кодирующей t-PHK редко встречающихся в Ecoli кодонов AGA, AGG, АТА и СТА.

последовательность гена белка CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD содержит 20 кодонов AGA, AGG, АТА и СТА. Трансформация штаммов Ml5 (pREP4) [pCBD-sp-TUL4], M15 (pREP4) [pTUL4-sp-CBD], DH5 a [pCBD-sp-TUL4] и DH5 а [pTUL4-sp-CBD], плазмидой pACYC-RIL позволила увеличить уровень экспрессии белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD в 2-3 раза (Рис 2иРис. 3).

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 3. Анализ экспрессии генов белков CBD-sp-TUL4 (36,4 кДа) и TUL4-sp-CBD (36 кДа) в клетках Е. coli DH5a вместе с pACYC-RIL (электрофорез в 12% ПААГ по Леммли). 1 -pTUL4-sp-CBD до индукции; 2 - pTUL4-sp-CBD, индукция 2 ч.; 3 • pCBD-sp-TUL4 до индукции; 4 - pCBD-sp-TUL4, индукция 2 ч.; 5 - контроль молекулярной массы 36 кДА; 6 -штамм DH5a до индукции; 7 - штамм DH5a индукция.

Таким образом, были впервые получены эффективные бактериальные продуценты белка TUL4 в составе химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 в клетках Е. сок штамма Ml 5 (pREP4) и DH5 а. Уровень экспрессии химерных белков составляет 30 % от тотального.

Была проведена работа по исследованию локализации химерных белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD в лизатах штамма Е. coli DH5 а и Ml5 (pREP4). Показано, что белки CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD находятся в лизатах клеток штамма DH5a в растворимой форме (Рис. 4).

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 4. Анализ состояния химерных белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD в лизатах клеток Е. coli DH5ct. Электрофорез по Лэммли растворимых (супернатант) и нерастворимых (осадок) клеточных белков клонов, экспрессирующих химерный белок. 1,2- штамм Е coli DH5a - супернатант, осадок; 3,4 - штамм Е coli DH5a [pTUL4-sp-CBD] -супернатант, осадок; 5, 6 - штамм Е. coli DH5a [pCBD-sp-TUL4] - супернатант, осадок; 7-контроль молекулярной массы 37 кДа.

Дальнейшим этапом нашей работы являлось использование способности ЦСД в составе рекомбинантных конструкций к аффинному взаимодействию с целлюлозой и связыванию с этим сорбентом для очистки и выделения рекомбинантных белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD.

Используемый в данной работе ЦСД из термофильного микроорганизма Anaerocellum thermophilum характеризуется высокой константой связывания целлюлозы и обеспечивает стабильное взаимодействие с целлюлозной матрицей в широком диапазоне ионной силы (10 мМ - 4 М), рН (4-11), температуры (0-75°С). Это позволяет проводить в одну стадию процедуру растворения, связывания, очистки и ренатурации исследуемого химерного белка на твердой фазе с большим выходом, чем в растворе (в 3 раза).

Растворимая форма белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD позволяет очистить их с помощью целлюлозного сорбента без дополнительных и достаточно трудоемких методик, а именно без применения хаотропных агентов (в случае нерастворимости белка).

3. Выделение и очистка белков CBD-SD-TUL4 и TUL4-SP-CBD. Одной из задач получения стандартного белкового вакцинного или диагностического препарата является его эффективная очистка от белковых и небелковых компонентов штамма-продуцента, среди которых наиболее важными являются ДНК и липополисахариды. Для вакцинных препаратов степень очистки должна составлять 95 % и выше.

Использование в составе химерных белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD ЦСД позволяет эффективно выделить и очистить белок от примесей штамма-продуцента.

Нами была разработана методика очистки белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD (Схема. 3).

Разработанная нами методика получения препарата ТиЬ4-Бр-СВО-целлюлоза представляет собой простой и стандартизированный процесс, который осуществляется практически в одну стадию. Целлюлоза является дешевым сорбентом, поэтому препарат ТиЬ4-Бр-СВВ-целлюлоза является экономически выгодным препаратом. С помощью ЦСД удается высокоэффективно очистить белок TUL4. Ожидается, что препарат с таким уровнем частоты (95 %) не должен вызывать побочных эффектов у вакцинируемого, что особенно актуально в настоящее время, при наблюдающейся тенденции к снижению уровня иммунитета у населения.

Разрушение клеток Е coli, экспрессирующих химерный белок.

1

Центрифугирование полученного лизата

_1_

/-\

Нанесение супернатанта, содержащего химерный белок, на хроматографическую колонку с целлюлозой

ч_/

I

Схема 3. Очистка химерных белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD.

На рисунке 5 показан результат очистки химерных белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD с помощью разработанной методики. Уровень чистоты белкового препарата составляет более 95 %.

Рис 5 Выделение химерных белков СВЭ-зр-ТиЬ4 и ТиЬ4-зр-СВЭ Электрофорез по Лэммли 1 - штамм Е ЭИ5а [рТиЬ4^р-СВЭ], индукция, 2 - рТИЬ4^р-СВЭ после

иммобилизации на целлюлозе, 3 - штамм Е coh ЭИ5а [рСВЭ^р-ТИЬ4] индукция, 4 - рСВЭ-sp-TUL4 после иммобилизации на целлюлозе

В процессе очистки белок CBD-sp-TUL4 подвергается протеолизу, поэтому в дальнейших исследованиях мы использовали белок TUL4-sp-CBD

В работе было изучено взаимодействие белка TUL4-sp-CBD с различными целлюлозами (Рис 6) Белок TUL4-sp-CBD практически одинаково связывается с целлюлозами

Рис 6 Изучение емкости целлюлозных сорбентов 1 - лизат клеток Е coh DH5 a [pTUL4-sp-CBD], 2 - целлюлоза DEAE - (Sigma, USA), 3 - целлюлоза CM - (Whatman, England), 4 -целлюлоза микрогранулированная - (Sigma, USA), 5 - целлюлоза аморфная (по методу А Е Гурвича), 6 - целлюлоза сферическая - (The collaborative group celluflow c-25, USA), 7 -целлюлоза Волокнистая - (Whatman, England), 8 - целлюлоза Микрокристаллическая -(Sigma, USA)

Для очистки и получения препарата, содержащего комплекс химерный белок-целлюлоза мы использовали сферическую цеглютозу (The collaborative group celluflow c-25, USA) размером 5-10 мкм и аморфную целлкпозу Аморфная целлюлоза была получена по

методике АЕ. Гурвича с соавторами [А.Е. Гурвич и др 1961, 1981]. Использование обоих видов целлюлоз позволяет получить препарат, пригодный для иммунизации (который может свободно проходить через инъекционную иглу).

Были получены два препарата содержащих комплекс ТиЬ4-8р-СЕШ-целлюлоза (табл. 1)

Табл. 1. Характеристика препаратов, содержащих химерный белок ТИЬ4^р-СВЭ.

Наименование препарата Целлюлоза Концентрация белка мг/мл

• ТОЬ4^р-СВЭ сферическая 3,0

ТОЬ4^р-СВЭ аморфная 4,0

В результате проведенных исследований были получены препараты белка ТИЬ4^р-СВЭ-целлюлоза с концентрацией 3-4 мг белка на 1 мл суспензии, степень чистоты составляет 95 %.

4. Определение антигенных свойств белка ТЧП,4-м)-(1Ш. В рамках данной работы были исследованы антигенные свойства комплекса ТиЬ4-5р-СВВ-целлюлоза.

Для определения антигенных свойств химерного белка ТИЬ4^р-СВЭ были получены кроличьи антисыворотки к комплексу ТиЬ4-5р-СВЭ-целлюлоза. Получение гипериммунной кроличьей сыворотки к комплексу ТиЬ4-8р-СВБ-целлюлоза проводили по специальной схеме: 5-кратные подкожные инъекции препарата в объеме 0,5 мл с интервалами 3-5 недель. Первая и вторая инъекции сопровождались дополнительным введением 0,5 мл полного и неполного адъюванта Фрейнда соответственно. Последующие 3 инъекции проводили без использования адъювантов.

Кролики переносили иммунизацию со следующими клиническими проявлениями:

1. отмечена потеря аппетита в первые 2-3 дня после каждой инъекции, сопровождающаяся незначительной потерей массы тела (особенно выражено после первых двух инъекций);

2. на протяжении всего курса иммунизации сохранялись медленно рассасывающиеся уплотнения в местах подкожного введения препарата (менее значительные при использовании аморфной целлюлозы);

3. животные остались живыми на протяжении всего курса иммунизации.

С помощью метода иммуноблоттинга была показана способность химерного белка ТиЬ4^р-СВЭ индуцировать выработку специфических антител к белку ТИЬ4 (Рис. 7).

А

Б

тиы

17 кДа

110 84

47

33

24 16

ТиЬ4 17 кДа

12 3 4

кДа 1 2 3 4

Рис. 7. Иммуноблоттинг лизатов клеток вакцинного штамма Г Ш1агепш 15/10 и его вариантов 15 рЛСУСРМЫи14 (вариант с повышенной экспрессией белка ТИЬ4). А -иммуноблотинг с конъюгатом козьих антикроличьих ^О с пероксидазой хрена и кроличьей сывороткой к штамму Г. tularensis 15/10. Б - иммуноблотинг с тем же конъюгатом и кроличьей сывороткой к белку ТИЬ4 (разведение 1:50). 1 - лизат клеток Г. Ш1агет^ 15/10; лизат клеток Г Ш1агет^ 15 рЛСУСРМЫи14, клон 1; лизат клеток Г tularensis 15 рЛСУСРМЫд^, клон 2; лизат клеток Г. Ш1агет^ 15 рЛСУСРМЫд^, клон 3. Молекулярные массы маркерных белков указаны по вертикали.

Исследования антигенных свойств белкового компонента вакцинного препарата является ключевым моментом для дальнейшего изучения и возможного применения данного компонента для создания профилактических препаратов.

Показано, что комплекс ТШЛ-Бр-СВО-целлюлоза оказался способен индуцировать выработку специфических антител к белку ТИЬ4. Можно предположить, что ЦСД не является токсичным для организма животных и не мешает выработке специфических антител к белку ТИЬ4.

Таким образом, полученный препарат ПЛЛ-эр-СВО-целлюлоза сохраняет антигенные свойства белка ТИЬ4 и может быть использован в дальнейших исследованиях.

выводы

1. Сконструированы экспрессионные плазмиды, кодирующие аутентичные последовательности гена белка TUL4 Уровень экспрессии аутентичных генов белка TUL4 составляет менее 1 % от общего белка Е coli

2. Созданы экспрессионные плазмиды, кодирующие химерные белки TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4, состоящие из нуклеотидной последовательности целлюлозосвязывающего домена из Anaerocellum thermophilum, Gly-Ser спейсера и последовательности зрелого белка TUL4 Подобраны условия индукции синтеза химерных белков Уровень экспрессии белков составляет 30 % от общего белка Е colt

3 Изучено состояние химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 в цитоплазме клеток Е coh штамма DH5a Оба химерных белка экспрессируются в клетках штамма-продуцента в растворимой форме (растворимость составляет 90 %).

4 На основе технологии получения химерных белков, включающих целлюлозосвязывающий домен, был разработан высокоэффективный метод очистки и иммобилизации химерного белка TUL4-sp-CBD на целлюлозном сорбенте Получены препараты, содержащие комплекс ТШЛ-Бр-СВВ-целлюлоза с концентрацией 3-4 мг белка на 1 мл сорбента

5. Получены кроличьи антисыворотки к комплексу ТиЬ4-зр-СВО-целлюлоза. Антигенные свойства химерного белка TUL4 показаны с помощью метода иммуноблоттинга.

6 Технология получения химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4, а также способ очистки и иммобилизации белков на целлюлозном сорбенте могут найти применение при создании профилактических препаратов против туляремии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Кормилицына М.И., Шмаров М.М., Родионова И.В., Мещерякова И.С., Народицкий Б.С., Лящук A.M., Гинцбург А.Л. Характеристика рекомбинантных вакцинных штаммов Francisella tularensis с повышенной экспрессией белка TUL4. В сб. тезисов: I Межд. конф. «Молекулярная медицина и безопасность» Межд. Конф., М, Россия, 2628 окт. 2004, С. 99-100.

2. Лунин В.Г., Карягина-Жулина А.С., Лящук A.M., Сергиенко О.В., Лаврова Н. В., Родионова Э.В., Кормилицина М.И., Мещерякова И.С., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез рекомбинантного белка TUL4spCBD, штамм Escherichia coli Ml5 [pREP4, pTUMspCBD] - продуцент рекомбинантного белка TUL4spCBD, рекомбинантный белок TUL4spCBD и способ его получения, способ получения специфических антител к белку TUL4spCBD. Патент РФ. Дата поступления 08.12.2004, Входящий № 038987, Регистрационный № 2004135849.

3. Лящук A.M., Лунин В.Г., Родионова И.В., Карягина А.С.,.Рязанова Е.М, Лаврова Н.В., Кормилицина М.И.,.Мещерякова И.С, Народицкий Б.С.,.Гинцбург А.Л. Клонирование и экспрессия в Escherichia coli гена основного белка наружной мембраны Francisella tularensis TU14 - компонента для разработки субъединичной вакцины для профилактики туляремии. В сб. тезисов: Межд. конф. «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» Межд. Конф., Новосибирская обл., Россия, 8-10 сен. 2004, С. 259.

4. Лящук A.M. Разработка компонентов для генно-инженерных субъединичных противотуляремийных вакцинных препаратов, основанных на технологии целлюлозосвязывающих доменов. В сб. тезисов: V молодежной конференции. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». М., Россия, 30 марта 2005, С. 19-21.

5. Лящук A.M. Разработка компонентов для генно-инженерных субъединичных противотуляремийных вакцинных препаратов, основанных на технологии целлюлозосвязывающих доменов. В сб. тезисов: Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», г. Суздаль, Россия, 19-22 мая, 2005, С. 528.

6. Шмаров М.М., Кормилицина М.И.,.Родионова И.В, Лунин В.Г., Карягина А.С, Лящук A.M., Сергиенко О.В., Мещерякова И.С, Народицкий Б.С, Гинцбург А.Л. Конструирование штамма Francisella tularensis с повышенной экспрессией белка TUL4. В сб. тезисов: Межд. конф. «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» Межд. Конф., Новосибирская обл., Россия, 8-10 сен. 2004 С 271.

Сдано в печать 20 мая 2005г. Объем печати 1,0 п.л. Заказ № 950/130. Тираж 100 экз. Отпечатано: ООО «Спринт-Принт» г. Москва, ул. Краснобогатырская, 92 тел.: 963-41-11,964-31-39

09 ИЮ1Р005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лящук, Александр Михайлович

Список принятых сокращении.

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1. Краткая характеристика F. tularensis.

1.1. Распространение и эпидемиология.

1.2. Биологические свойства.

1.2.1. Классификация рода Francisella.

1.2.2. Морфология и культуральные свойства.

1.2.3. Биохимические свойства.

1.2.4. Основные факторы патогенности.

1.2.5. Основные антигенные детерминанты F. tularensis.

2. Профилактика туляремии.

2.1. Живые вакцины.

2.2. Инактивированные вакцины.

2.3. Рекомбинантные живые вакцины.

2.4. ДНК вакцины.

2.5. Субъединичные генно-инженерные вакцины.

3. Использование технологии химерных белков для создания субъединичных генно-инженерных вакцин.

3.1. Целлюлозосвязывающий домен.

3.2. Применение целлюлозы как иммуносорбента.

Глава II. Материалы и методы.

1. Материалы.

1.1. Бактериальные штаммы.

1.2. Плазмидные векторы.

1.3. Олигонуклеотиды.

1.4. Ферменты и другие реактивы.

1.5. Лабораторные животные.

2. Методы.

2.1. Выделение хромосомной ДНК.

2.2. Выделение и очистка аналитических количеств плазмидной

2.3. Выделение и очистка препаративных количеств плазмидной

2.4. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами.

2.5. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.6. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля.

2.7. Лигирование фрагментов ДНК.

2.8. Трансформация клеток Е. coli.

2.8.1. Подготовка компетентных клеток.

2.8.2. Электропорация.

2.9. Полимеразная цепная реакция.

2.10. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.11. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН (PAGE - SDS)

2.12. Выращивание штамма-продуцента и индукция синтеза 45 рекомбинантных белков.

2.13. Определение локализации белков в лизатах штамма-продуцента.

2.14. Иммобилизация и выделение белков, содержащих целлюлозосвязывающий домен.

2.15. Иммунизация лабороторных животных.

2.16. Иммуноблоттинг.

Глава III. Результаты и обсуждение.

1. Создание бактериальных штаммов-продуцентов белка

TUL4 из F. tularensis.

1.1. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию и секрецию белка TUL4 в периплазму клеток Е. coli.

1.1.1. Клонирование гена белка TUL4.

1.1.1.1. Получение ПЦР фрагментов гена белка TUL4.

1.1.1.2. Клонирование гена белка TUL4 в векторе pGEM-T.

1.1.1.3. Секвенирование нуклеотидных последовательностей гена белка TUL4.

1.1.2. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка TUL4.

1.1.3. Создание бактериальных продуцентов белка TUL4.

1.2. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию белка TUL4 в цитоплазме клеток Е. coli.

1.2.1. Создание экспрессионного вектора, содержащего ген зрелого белка TUL4.

1.2.2. Создание бактериального продуцента гена зрелого белка TUL4.

1.3. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию химерного белка TUL4-CBD в цитоплазме клеток Е. coli.

1.3.1. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка TUL4 в составе химерной конструкции с целлюлозосвязывающим доменом.

1.3.2. Создание бактериальных продуцентов генов белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD.

2. Оптимизация экспрессии химерных белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD.

2.1. Оптимизация времени индукции.

2.2. Оптимизация индукции с помощью плазмиды pACYC-RIL.

2.3. Индукция белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD в различных штаммах Е. coli.

3. Изучение локализации химерных белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD в лизатах штамма Е. coli DH5a.

4. Выделение и очистка белков CBD-sp-TUL4 и

TUL4-sp-CBD.

4.1. Изучение связывания химерных белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD с различными видами целлюлозы.

4.2. Выделение и очистка химерных белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD.

5. Определение антигенных свойств белка TUL4-sp-CBD.

5.1. Получение кроличьих антисывороток к комплексу тиЬ4-эр-СВО-целлюлоза.

5.2. Исследование антигенных свойств.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4, потенциального компонента генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины"

Актуальность проблемы. Туляремия является актуальной проблемой для здравоохранения в связи с широким распространением природных очагов в странах умеренного климатического пояса, а также возможной ролью возбудителя в качестве потенциального агента биотерроризма [16, 17, 110]. Для специфической профилактики туляремии в Российской

Федерации применяется живая вакцина (на основе Francisella tularensis 15 НИИЭГ) , использование которой позволило снизить заболеваемость этой инфекцией до спорадических случаев или небольших вспышек [92, 125, 17].

Данная вакцина, как всякая живая вакцина, не лишена определенных недостатков, важнейшими из которых являются введение человеку чужеродной генетической информации и длительное персистирование вакцинного штамма в организме вакцинированых. В настоящее время выявлено значительное сходство геномов вакцинного и дикого штаммов F. tularensis [96] . Поэтому применение живой вакцины для вакцинации людей не желательно, особенно в условиях нарастающей тенденции снижения уровня естественного иммунитета у населения.

Одним из перспективных направлений в области совершенствования и разработки эффективных способов защиты от туляремии является создание иммунопрофилактических препаратов нового поколения на основе протективных компонентов F. tularensis. Такими препаратами, например, могут быть субъединичные вакцины [31, 44, 28, 104]. Данные вакцины имеют ряд преимуществ, важнейшими из которых являются исключение возможности возникновения манифестной инфекции, слабая реактогенность и возможность получения стандартного препарата антигена. Вместе с тем, сложности в создании субъединичных вакцин связаны с недостаточными сведеньями о протективных антигенах F. tularensis и иммунных механизмах ответа макроорганизма.

Возбудитель туляремии является внутриклеточным патогеном и основная роль в формировании невосприимчивости к туляремии отводится Т-клеточному иммунитету. Основными Т-зависимыми антигенами туляремии являются компоненты внешней мембраны, среди которых наиболее изученным является белок TUL4[20, 138, 139] .

На основе данных антигенных компонентов в последние годы были получены перспективные вакцинные препараты - это рекомбинантный или очищенный белок TUL4, инкапсулированный в иммуностимулирующие комплексы (ISCOMs) [140, 68], липополисахарид-белковый комплекс наружных мембран

F. tularensis [93], препарат ОМ-«С», представляющий собой комплекс наружных мембран, выделенный из вакцинного штамма F. tularensis 15 [9].

В настоящее время спектр основных иммуногенов F. tularensis окончательно не определен, а вышеупомянутые препараты представляют собой сложную и, как следствие, заведомо трудно стандартизуемую смесь белков, липополисахаридов, жирных кислот и других компонентов клетки F. tularensis. Поэтому использование таких препаратов для вакцинации людей менее предпочтительно, по сравнению с препаратами индивидуальных белков, липополисахаридов или их смеси. Следует также отметить, что получение этих препаратов связано с необходимостью культивирования патогенных штаммов туляремии.

Получение стандартных белковых препаратов трудоемко, а многочисленные очистки приводят к снижению протективной активности.

Становится ясно, что для создания эффективных профилактических препаратов против туляремии необходим принципиально новый подход, направленный на получение стандартных рекомбинантных белков, обладающих высокой протективностью, в том числе, за счет использования соответствующих адъювантов или иммуносорбентов.

Цель работы. Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4 на основе технологии целлюлозосвязывающих доменов для генно-инженерных субъединичных противотуляремийных вакцинных препаратов.

В соответствии с поставленной целью в процессе выполнения диссертационной работы предстояло решить следующие основные задачи:

1. Клонирование гена белка TUL4, а также отдельных участков гена белка TUL4 в составе гибридных генов (белков);

2. Создание бактериальных продуцентов белка TUL4 и рекомбинантных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4;

3. Изучение локализации белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 в лизатах клеток штамма-продуцента;

4. Разработка технологии очистки и получения препарата белка, пригодного для иммунизации;

5. Исследование антигенных свойств препарата белка TUL4.

Научная новизна. Впервые получен в препаративных количествах высокоочищенный рекомбинантный белок TUL4-sp-CBD, потенциальный компонент генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины.

Впервые для обеспечения синтеза белка TLJL4 в клетках Escherichia coli были сконструированы гибридные плазмиды, контролирующие синтез химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4. Данные химерные белки состоят из нуклеотидной последовательности зрелого белка TUL4, Gly-Ser спейсера и целлюлозосвязывающего домена из Anaerocellum thermophilum. Белки TUL4-sp-CBD и pCBD-sp-TUL4 отличаются N- и С-концевым расположением последовательности белка TUL4.

Впервые были получены эффективные бактериальные продуценты белка TUL4 в составе химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 в клетках Е. coli штамма М15 (pREP4) и DH5a. Уровень экспрессии химерных белков составляет 30% от тотального.

На основе использования свойств целлюлозосвязывающего домена, входящего в состав химерных белков, была разработана эффективная схема очистки рекомбинантных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 на целлюлозе. Степень чистоты препаратов составляла более 95%.

Препарат белка, содержащий комплекс TUL4-sp-CBD и целлюлозу индуцировал выработку антител к исследуемому белку у лабораторных животных. Специфичность антител подтверждена с помощью метода иммуноблоттинга.

Практическое значение работы. Технология получения химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4, а также способ очистки и иммобилизации белков на целлюлозном сорбенте могут найти применение при создании профилактических препаратов против туляремии. Препарат, содержащий комплекс TUL4-sp-CBD-целлюлоза, может быть использован для диагностических целей или для изучения свойств белка TUL4.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной конференции «Молекулярная медицина и безопасность» 26-28 октября, 2004 г., г. Москва; на международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» 810 сентября, 2004 г., г. Новосибирск; на V молодежной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» 30 марта, 2005 г., г. Москва; на всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» 19-22 мая, 2005 г., г. Суздаль.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Лящук, Александр Михайлович

Выводы.

1. Сконструированы экспрессионные плазмиды, кодирующие аутентичные последовательности гена белка TUL4. Уровень экспрессии аутентичных генов белка TUL4 составляет менее 1% от общего белка Е. coli.

2. Созданы экспрессионные плазмиды, кодирующие химерные белки TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4, состоящие из нуклеотидной последовательности целлюлозосвязывающего домена из Anaerocellum thermophilum, Gly-Ser спейсера и последовательности зрелого белка TUL4. Подобраны условия индукции синтеза химерных белков. Уровень экспрессии белков составляет 30% от общего белка Е. coli.

3. Изучено состояние химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4 в цитоплазме клеток Е. coli штамма DH5a. Оба химерных белка экспрессируются в клетках штамма-продуцента в растворимой форме (растворимость составляет 90%).

4. На основе технологии получения химерных белков, включающих целлюлозосвязывающий домен, был разработан высокоэффективный метод очистки и иммобилизации химерного белка TUL4—sp-CBD на целлюлозном сорбенте. Получены препараты, содержащие комплекс тиь4-эр-СВВ-целлюлоза с концентрацией 3-4 мг белка на 1 мл сорбента.

5. Получены кроличьи антисыворотки к комплексу TUL4-sp-CBD-целлюлоза. Антигенные свойства химерного белка TUL4 показаны с помощью метода иммуноблоттинга.

6. Технология получения химерных белков TUL4-sp-CBD и CBD-sp-TUL4, а также способ очистки и иммобилизации белков на целлюлозном сорбенте могут найти применение при создании профилактических препаратов против туляремии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лящук, Александр Михайлович, Москва

1. Батюк JI.JI., Бурый B.JI. Применение ПЦР как экспресс-метода индикации возбудителя туляремии. Здоровье населения и среда обитания. Инф. Бюлл. ФЦ ГСЭН МЗ РФ, 2003, №6, 123, с.22-25.

2. Васекина А.В., Ершов П.В., Решетова О.С., Тихонова Т.В., Лунин В.Г., Трофимова М.С., Бабаков А.В. Вакуолярный Ка+/Н+антипортер ячменя: идентификация и реакция на солевой стресс. 2005, Биохимия, 2005, том 70, вып. 1, с. 123 132.

3. Волков И.Ю., Лунина Н.А., Великодворская Г. А. Перспективы практического применения субстратсвязывающих модулей гликозолгидролаз (обзор). Прикладн. Биох. и мик. 2004, 40, №5, с. 499-504.

4. Воробьев А.А., Васильев Н.Н. Адьюванты (неспецифические стимуляторы иммуногенеза). М., 1969.

5. Гурвич А.Е. Количественное определение содержания антител при помощи белковых антигенов, фиксированных на бумаге. Биохимия 1957, Т. 22, вып. 6, с.1028.

6. Гурвич А.Е., Капнер Р.Б., Незлин Р. С. Выделение чистых антител при помощи фиксированных на целлюлозе антигенов и изучение их свойств. Биохимия, 1959, Т. 24, с.142.

7. Гурвич А.Е., Корукова А.А., Эльгорт Д. А. Усиление иммуногенности белков путем их присоединения к целлюлозной матрице, сб. Иммуномодуляторы, 1987, с.67-76.

8. Гуревич А.Е., Кузовлева О.Б., Туманова А.Е. Получение белково-целлюлозных комплексов (иммуносорбентов) в виде суспензий, способных присоединять большие количества антител. Биохимия Т. 26, вып. 5, 1961, с. 934-942.

9. Жемчугов В.Е, Дятлов И.А., Кутырев В.В., Волох О.А. Способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии. Патент РФ, № заявки 2003102089/15, № публ. 2221591, 2004.

10. Ивашенцева Л.Н., Яшечкин Ю.И., Куличенко А.Н., Разработка ПЦР-тест системы для выявления возбудителя туляремии. Генодиагностика инфекционных заболеваний. М., 2002, с.275-277.

11. Кормилицина М.И., Барановский П. М., Ананова Е.В., Мещерякова И.С., Константинова Н.Д. Ассоциации франциселл синфузориями в эксперименте. В сб. Патогенные бактерии в сообществах, РАМН, Москва, 1994, с. 65-70.

12. Лехтцинд Е.В., Гурвич А.Е. Синтез высокоемкого иммуносорбента на основе суспензии целлюлозы. Бюл. экспер. биол. и мед., 1981, Т. 92, вып.7, с.68-70.

13. Лященко В.А., Воробьев А.А. Молекулярные основы иммуногенности. М., 1982.

14. Мазепа А. В. и др. Применение полимеразной цепной реакции при обследовании природного очага туляремии. Актуальные аспкты природноочаговых болезней. Омск, 2001, с. 162-263.

15. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Дж. Молекулярное клонирование. М., 1984.

16. Мещерякова И.С. Туляремия. Иммунология бактериальных инфекций: руководство для врачей. 1994. М.; Бишкек, РАН-АН Киргизии. Т. 1., С. 232.

17. Мещерякова И.С., Родионова И.В., Кормилицина М.И. Патогенные микроорганизмы рода Francisella. Матер. Научн. практ. Конф., посвящ. 100-летию образования противочум. службы России. Саратов, 1998, Т. 2, С. 84-85.

18. Мещерякова И.С. Современное состояние заболеваемости и профилактики туляремии в РФ. Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. Сб. научн. тр. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1998, вып 3, с. 209-212.

19. Мещерякова И.С. Таксономия, идентификация и иммунологическая диагностика возбудителя туляремии: Автрореф. дис. д-ра биол. Наук. М., 1990. 47с.

20. Оноприенко Н.Н. Сравнительная характеристика липополисахаридов бактерий рода Francisella. Диссертация. Ростов-на-Дону 2001, 141с.

21. Павлович Н.В., Цимболистова М.В., Маслова Н.Н. Быстрый метод оценки вирулентности Francisella tularensis in vitro. ЖМЭиИ, 2000, №2, С 17-20.

22. Поздеев O.K. Медицинская микробиология. М. : Геотар-мед. 2001, с.765.

23. Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.Л. Эволюция инфекционных процессов в России в XX веке. Руководство для врачей, Медицина, 2003.

24. Родионова И.В., Мещерякова И.С., Кормилицина М.И., Сравнительный анализ белковых антигенов Francisella. Мол. генетика, микробиолог, и вирусол., 1997, №3, С.11-15.

25. Рабинович M.JI. Кинетические аспекты действия карбогидраз (лизоцим и целлюлолитические ферменты). Дисс. канд. хим. наук. М.: Химический ф-т МГУ, 1977, 160с.

26. Рабинович M.J1., Мельник М.С. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы. Успехи биологической химии, т. 40, 2000, с. 205-266.

27. Романова JI.B., Мишанькин Б.Н., Праймеры для родоспецифического обнаружения Francisella tularensis в полимеразной рекции. Ж. микробиология. 1995, №5, с.77-80.

28. Ada G. Overview of vaccines. Mol Biotechnol. 1997 Oct;8(2):123-34. Review.

29. Anonymous. Tularemia, Kosovo. Wkly. Epidemiol. Rec. 2000.75:133-134.

30. Anthony, L. S. D., R. D. Burke, and F. E. Nano. Growth of Francisella spp. in rodent macrophages. Infect. Immun. 1991.59:3291-3296.

31. Arnon R, Ben-Yedidia T Old and new vaccine approaches. Int Immunopharmacol. 2003 Aug; 3(8):1195-204. Review.

32. Berdal, В.P., R. Mehl, N.K. Meidell, A.-M. Lorentzen-Styr, and 0. Scheel. Field investigations of tularemia in Norway. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:191-195.

33. Boyce, J. M. Recent trends in the epidemiology of tularemia in the United States. J. Infect. Dis. 1975. 131:197199.

34. Burnette, W.N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radiodinated protein A.Anal. Biochem. 1981. 112:195-203.

35. Burke, D.S. Immunization against tularemia: analysis of the effectiveness of live Francisella tularensis vaccine in prevention of laboratoryacquired tularemia. J. Infect. Dis. 1977. 135:55-60.

36. Clayton M.A., Clayton J.M., Brown D.R., and Middlebrook, J. L. Protective vaccination with a recombinant fragment of Clostridium botulinum neuro-toxin serotype A expressed from a synthetic gene in Escherichia coli. Infect. Immun. 1995. 63, 2738-2742.

37. Coriell, L.L., E.O. King, and M.G. Smith. Studies on tularemia IV. Observations on tularemia in control and vaccinated monkeys. J. Immunol. 1948. 58:183-202.

38. Cowley SC, Gray CJ, Nano FE. Isolation and characterization of Francisella novicida mutants defective in lipopolysaccharide biosynthesis. FEMS Microbiol Lett. 2000 Jan 1;182(1):63-7.

39. Dertzbaugh MT. Genetically engineered vaccines: an overview. Plasmid. 1998; 39(2):100-13. Review.

40. Donnelly JJ, Friedman A, Martinez D, Montgomery DL, Shiver JW, Motzel SL, et al. Preclinical efficacy of a prototype DNA vaccine: enhanced protection against antigenic drift in influenza virus see comments. Nat Med 1995;1(6):583- 7.

41. Donnelly, J.J., Ulmer, J.В., Shiver, J.W., and Liu, M.A. DNA vaccines. Annu. Rev. Immunol. 2000. 15, 617- 648.

42. Dorofe'ev, K.A. Classification of the causative agent of tularemia. Symp. Res. Works Inst. Epidemiol. Mikrobiol. Chita. 1947. 1:170-180.

43. Dreisbach VC, Cowley S, Elkin KL. Purified lipopolysaccharide from Francisella tularensis live vaccine strain (LVS) induses protective immunity against LVS infection that requires В cells and gamma interferin. Infect Immun 2000, 68:1988-1996.

44. Eigelsbach, H.T., and C.M. Downs. Prophylactic effectiveness of live and killed tularemia vaccines. I. Production of vaccine and evaluation in the white mouse and guinea pig. J. Immunol. 1961. 87:415-425.

45. Eigelsbach, H.T., and V.G. McGann. Genus Francisella Dorofe'ev 1947, 176AL. In N. R. Krieg and J. G. Holt (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 1. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md 1984. p. 394-399.

46. Einhauer A, Schuster M, Wasserbauer E, Jungbauer A Expression and purification of homogenous proteins in Saccharomyces cerevisiae based on ubiquitin-FLAG fusion. Protein Expr Purif. 2002. 24:497-504.

47. Ellis Jill, Petra C.F. Oyston, Michael Green, and Richard W. Titball Tularemia CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Oct. 2002, Vol. 15, No. 4, p. 631-646.

48. Evan GI, Lewis GK, Ramsay G, Bishop JM. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product. Mol Cell Biol. 1985. 5:3610-3616.

49. Fairweather, N.F., Chatfield, S.N., Makoff, A.J., Strugnell, R.A., Bester, J., Maskell, D.J., Dougan, G., Oral vaccination of mice against tetanus by use of a live attenuated Salmonella carrier. Infect. Immun. 1990. 58, 13231326.

50. Forsman, M., E.W. Henningson, E. Larsson, T. Johansson, and G. Sandstrom. Francisella tularensis does not manifest virulence in viable but nonculturable state. FEMS Microbiol. Ecol. 2000. 31:217-224.

51. Foshay, L. A comparative study of the treatment of tularemia with immune serum, hyperimmune serum and streptomycin. Am. J. Med. 1946. 1:190-188.

52. Foshay, L. Tularemia. Annu. Rev. Microbiol. 1950. 4:313330.

53. Foshay, L. , W.H. Hesselbrock, H.J. Wittenberg, and A. H. Rodenberg. Vaccine prophylaxis against tularemia in man. Am. J. Public Health 1942. 32:1131-1145.

54. Francis, E. Microscopic changes of tularemia in the tick Dermacentor andersoni and the bedbug Cimex lectularius. Public Health Rep. 1927. 42:2763-2772.

55. Freudl, R. , Maclntyre, S., Degen, M. , Henning, U. , Cell surface exposure of the outer membrane protein OmpA of Escherichia coli K-12. J. Mol. Biol. 1986. 188, 491-494.

56. Fridhandler L, Berk JE, Wong D. Affinity characteristics of amylase-binding substance(s) prepared from macroamylase complexes. Clin Chem. 1974;20(1):22-5.

57. Fulop, M., P. Mastroeni, M. Green, and R. W. Titball. Role of antibody to lipopolysaccharide in protection against low-and high-virulence strains of F. tularensis. Vaccine. 2001.19:4465-447250.

58. Germanier, R., Furer, E., Isolation and characterization of GalE mutant Ty21a of Salmonella typhi: a candidate strain for a live, oral typhoid vaccine. J. Infect. Dis. 1975. 131, 553-558.

59. Gilligan, P. H. Pseudomonas and Burkholderia, In P. R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C. 1995. p. 509-519.

60. Golovliov I., Ericsson M. , Akerblom L., Sandstrom G. , Tarnvik A., Sjostedt A. Adjuvanticity of ISCOMs incorporating a T cell-reactive lipoprotein of the facultative intracellular pathogen Francisella tularensis. Vaccine, 1995, V. 13 (3), P. 261-267.

61. Gurycova, D. Analysis of the incidence and routes of transmission of tularemia in Slovakia. Epidemiol. Mikrobiol. Immunol. 1997. 46:67-72.

62. Gurycova, D. First isolation of Francisella tularensis subsp. Tularensis in Europe. Eur. J. Epidemiol. 1998. 14:797802.

63. Gurvich A.E., Drizlikh G.I. Use of Antibodies on an Insoluble Support for Specific Detection of Radioactive Antigens. Nature. 1964. Aug. 8. V. 203 P. 648-649.

64. Helvaci, S., Gedikoglu S., Akalin H., and Oral H.B. Tularemia in Bursa, Turkey: 205 cases in ten years. Eur. J. Epidemiol. 2000. 16:271-276.

65. Hermanowska-Szpakowicz, Т., and S. A. Pancewicz. The presence of antibodies against Francisella tularensis among inhabitants of North-Eastern Poland. Przegl. Epidemiol. 1996. 50:55-59.

66. Holm S.E., A. Tarnvik, and G. Sandstrom. Antigenic composition of a vaccine strain of Francisella tularensis. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1980. 61:136-144.

67. Hood AM: Virulence factors of Francisella tularensis. J Hyg (London) 1977, 79:47-60.

68. Hornick R.B., and H.T. Eigelsbach. Aerogenic immunization of man with live tularemia vaccine. Bacteriol. Rev. 1966. 30:532-538.

69. Hubalek, Z., W. Sixl, and J. Halouzka. Francisella tularensis in Dermacentor reticulatus ticks from the Czech Republic and Austria. Wien. Klin.Wochenschr. 1998. 110:909910.

70. Ilan L. , Oded S. Cellulose-binding domains Biotechnological applications. Biotechnology Advances. 2002.20:191-213.

71. Johansson A, Forsman M, Sjostedt A. The development of tools for diagnosis of tularemia and typing of Francisella tularensis. APMIS. 2004. Nov-Dec;112(11-12):898-907.

72. Johnson K., Charles, I., Dougan, G., Pickard, D., O'Gaora, P., Costa, G., Ali, Т., Miller, I., Hormaeche, C., The role of a stress-response protein in Salmonella typhimurium virulence. Mol. Microbiol. 1991. 5, 401-407.

73. Jungbauer A, Hahn R. Engineering protein A affinity * chromatography. Curr Opin Drug Discov Devel. 2004.1. Mar;7(2):248-56.

74. Junhui, Z., Y. Ruifu, L. Jianchun, Z. Songle, C. Meiling, C. Fengxiang, and C. Hong. Detection of Francisella tularensis by the polymerase chain reaction. J. Med. Microbiol. 1996. 45:477-482.

75. Kadull P.J., Reames H.R., Coriell L.L., and Foshay L. Studies on tularemia. V. Immunization of man. J. Immunol. 1950. 65:425-435.

76. Kadzhaev K.V. Kormilitsina M.I. Demidova T.N. et al. Detection of Francisella tularensis in the samples of different origin by polymerase chain reaction. Ibid. 2000. P. 23.

77. Karpeisky MY, Senchenko VN, Dianova MV, Kanevsky V. Formation and properties of S-protein complex with S-peptidecontaining fusion protein. FEBS Lett. 1994. 339:209212.

78. Keefe AD, Wilson DS, Seelig B, Szostak JW One-step purification of recombinant proteins using a nanomolar-affinity streptavidin-binding peptide, the SBP-Tag. Protein Expr Purif. 2001. 23:440-446.

79. Khatenever, L. M. The allergic diagnosis, specificprophylaxis and vaccine therapy of tularemia. In E. B. 4 Balsky, I. Kochergin G., and Porin V. V. (ed.), Microbiologyand epidemiology. Medical Publications Ltd,, London, United Kingdom. 1943. p. 62-79.

80. Khlebnikov V.S., Golovliov I.R., Kulevatsky D.P., Tokhtamysheva N.V, Averin S.F., Zhemchugov V.E., lipopolysaccharide-protein complex (LPS-17 kDa protein) as chemical tularemia vaccines. FEMS Immunol Med Microbiol. 1996. Mar;13(3):227-233.

81. Kumar S, Epstein JE, Richie TL, Nkrumah FK, Soisson L, Carucci DJ, et al. A multiple effort to develop DNA vaccines against falciparum malaria. Trends Parasitol 2002;18(3 ) :129-35.

82. Kuwajima, G. , Asaka, J.-I., Fujiwara, Т., Nakano, K., Kondoh, E., Presentation of an antigenic determinant from hen egg-white lysozyme on the flagellar filament of Escherichia coli. Bio:Technology. 1988.6, 1080-1083.

83. Larsson P., Chain P., Forsman M. , Lindler LE, Andersson SGE, et all. The Francisella Tularensis SCHU S4 genom project. Abstract. Fourth international conference on tularemia. 15-18 September 2003. City of Bath.United Kingdom.

84. Lauriano CM, Barker JR, Nano FE, Arulanandam BP, Klose KE. Allelic exchange in Francisella tularensis using PCR products. FEMS Microbiol Lett. 2003 Dec 12; 229(2):195-202.

85. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.i,

86. Leslie DL, Cox J, Lee M, Titball RW. Analysis of a-cloned Francisella tularensis outer membrane protein gene and expression in attenuated Salmonella typhimurium. Microbiol Lett. 1993 Aug 1;111(2-3)s 331-5.

87. Liljeqvist S, Stahl S. Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines. J Biotechnol. 1999 Jul 30;73(1):1-33. Review.

88. Marmur J. Electrophoresis DNA on a agarose gel // J. Molec. Biol. 1961. №3. P.208-218.

89. Melcher U. The purification of beta-galactosidase-specific polysomes by affinity chromatography. Anal Biochem. 1975 Apr;64(2):461-5.

90. McCoy, G. W. , and Chapin C. W. . Further observations on a plaguelike disease of rodents with a preliminary note on the causative agent, Bacterium tularense. J. Infect. Dis. 1912. 0:61-72.

91. McCormick M, Berg J. Purification and S-Tag detection of CBD fusion proteins. In Novations. 1997. 7:12-15.

92. Morrison, D. C., and J. L. Ryan. Bacterial endotoxins andhost immune responses. Adv. Immunol. 1979. 28:293-450. ' 110) Morner, T. The ecology of tularemia. Rev. Sci. Tech. Off.1.t. Epiz. 1992. 11:1123-1130.

93. Nano F.E. Identification of a heat-modifiable protein of Francisella tularensis and molecular cloning of the encoding gene. Microb Pathog. 1988 Aug;5(2):109-19.

94. Olsufjev, N. G., and I. S. Meshcheryakova. Subspecific taxonomy of Francisella tularensis McCoy and Chapin 1912. Int. J. Syst. Bacteriol. 1983. 33: 872-874.

95. Ohara, Y., T. Sato, H. Fujita, T. Ueno, and M. Homma. Clinical manifestations of tularemia in Japan — analysis of 1355 cases observed between 1924 and 1987. Infection. 1991.19:14-17.

96. Owen, C. R. Genus Francisella, . In R. EBuchanan and N. E. Gibbons (ed.), Bergey's manual of determinative bacteriology. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md. 1974. p. 283-285

97. Pallesen, L., Poulsen, L.K., Christiansen, G., Klemm, P., Chimeric FimH adhesin of type 1 fimbriae: a bacterial surface display system for heterologous sequences. Microbiology 141, 1995. 2839-2848.

98. Pavlov, V. M., A. N. Mokrievich, and K. Volkovoy. Cryptic plasmid pFNLlO from Francisella novicida-like F6168: the base of plasmid vectors for Francisella tularensis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:253-256.

99. Pavlovich, N. V., N. I. Shimaniuk, and B. N. Mishan'kin. Neuraminidase activity in representatives of the genus Francisella. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1992. 910:8-10.

100. Pollitzer, R. History and incidence of tularemia in the Soviet Union. A review. The Institute of Contemporary Russian Studies, Fordham University, New York, N.Y. 1967.

101. Prior, R. G., L. Klasson, P. Larsson, K. Williams, L. Lindler, A. Sjostedt, T. Svensson, I. Tamas, B. W. Wren, P. C.

102. F. Oyston, S. G. E. Andersson, and R. W. Titball. Preliminaryanalysis and annotation of the partial genome sequence of ' Francisella tularensis strain Schu 4. J. Appl. Microbiol.2001. 91:1-7.

103. Rabinovich M.L. // Materials of Soviet-Finland Seminar on Bioconversion of Plant Raw Materials byMicroorganisms. Institute of Biochemistry and Physiology of. Microorganisms. Pushchino. 1984. P.31-48.

104. Robinson HL. DNA vaccines: basic mechanism and immune responses. Int J Mol Med 1999;4(5):549- 55.

105. Rufissmann, H., Shams, H., Poblete, F. , Fu, Y., Gala^n, J.E., Donis, R.O., Delivery of epitopes by the Salmonella type III secretion system for vaccine development. Science 281, 1998. 565-568.

106. Sandstrom, G. The tularemia vaccine. J. Chem. Tech. Biotech. 1994. 59: 315-320.

107. Sandstrom, G., and A. Tarnvik. Immunospecif ic T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis. J. Clin. Microbiol. 1987. 25:641-644.

108. Saslaw, S., H. T. Eigelsbach, J. A. Prior, H. E. Wilson, and S. Carhart. Tularemia vaccine study. II. Respiratory challenge. Arch. Intern. Med. 1961. 107:702-714.

109. Saslaw, S., H. T. Eigelsbach, H. E. Wilson, J. A. Prior, and S. Carhart. Tularemia vaccine study. I. Intracutaneous challenge. Arch. Intern. Med. 1961. 107:689-701.

110. Sassenfeld HM, Brewer SJ. A polypeptide fusion designed for purification of recombinant proteins. Bio/Technology. 1984. 2:76-81.

111. Scheich C, Sievert V, Bussow K. An automated method for high-throughput protein purification applied to a comparisonof His-tag and GST-tag affinity chromatography. BMC Biotechnol. 2003 Jul 28;3(1):12.

112. Schmidt TGM, Koepke J, Frank R, Skerra A. Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, Streptavidin. J Mol Biol. 1996. 255:753-766.

113. Schmidt TGM, Skerra A. The random peptide libraryassisted engineering of a C-terminal affinity peptide, useful for the detection and purification of a functional Ig Fv fragment. Protein Eng. 1993. 6:109-122.

114. Sjostedt, A., A. Tarnvik, and G. Sandstrom. Francisella tularensis: host-parasite interaction. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:181-184.

115. Sjostedt, A., Sandstrom G., and Tfirnvik A. Several membrane polypeptides of the live vaccine strain Francisella tularensis LVS stimulate T cells from naturally infected individuals. J. Clin. Microbiol. 1990.28:43-48.

116. Sjostedt A., Kuoppa K., Johansson Т., Sandstrom G. The 17 kDa lipoprotein and encoding gene of F. tularensis LVS are conserved in strains of F. tularensis. Microb Pathog., 1992, V. 13(3), P. 243-249.

117. Sjostedt A., Sandstrom G. , Tarnvik A., Jaurin B. Nucleotide sequence and T cell epitopes of a membrane protein of Francisella tularensis. J Immunol., 1990, V. 145(1), P. 311-317.

118. Sjostedt A., Sandstrom G. , Tarnvik A. Humoral and cell-mediated immunity in mice to a 17-kilodalton lipoprotein of Francisella tularensis expressed by Salmonella typhimurium. Infect. Immun., 1992, V. 60(7), P. 2855-2862.

119. Sjostedt A., Sandstrom G. , Tarnvik A., Jaurin B. Molecular cloning and expression of a T-cell stimulating membrane protein of Francisella tularensis. Microb. Pathog., 1989, V. 6 (6), P. 403-414.

120. Sorokin, V. M. , N. V. Pavlovich, and L. A. Prozorova. Francisella tularensis resistance to bactericidal action of normal human serum. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:249-252.

121. Stewart, S. J. Tularemia: association with hunting and farming. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:197-199.

122. Stofko-Hahn RE, Carr DW, Scott JD. A single step purification for recombinant proteins. FEBS Lett. 1992.302:274-278.

123. Studier, F. W. , Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W., Fuerst, T. R. , Niles, E. G. , and Moss, B. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of genes. Methods: Enzymol. Companion Methods 185, 1990. p.60-89.

124. Tarnvik, A. Nature of protective immunity to Francisella tularensis. Rev. Infect. Dis. 1989. 11:440-451.

125. Tarnvik, A., M. Ericsson, I. Golovliov, G. Sandstrom, and A. Sjostedt. Orchestration of the protective immune response to intracellular bacteria: Francisella tularensis as a model organism. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:221-225.

126. Tarnvik, A., G. Sandstrom, and A. Sjostedt. Epidemiological analysis of tularemia in Sweden, 1931-1993. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. 13:201-204.

127. Terpe К. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. Review. 2003. 60:523-533.

128. Tigertt, W. D. Soviet viable Pasteurella tularensis vaccines: a review of selected articles. Bacteriol. Rev. 1962. 26:354-373.

129. Tomme P, Boraston A, McLean B, Kormos J, Creagh AL, Sturch K, Gilkes NR, Haynes CA, Warren RA, Kilburn DG. Characterization and affinity applications of cellulose-binding domains. J Chromatogr B. 1998. 715:283-296.

130. Tough, D. F., S. Sun, and J. Sprent. T cell stimulation in vivo by lipopolysaccharide (LPS). J. Exp. Med. 1997. 185:2089-2094.

131. Van Die I., Wauben M., Van Megen I., Bergmans H., Riegman N. , Hoekstra W., Pouwels P., Enger-Valk В., Genetic manipulation of major P-fimbrial subunits and consequences for formation of fimbriae. J. Bacteriol. 1988. 170, 5870-5876.

132. Watanabe T, Ito Y, Yamada T, Hashimoto M, Sekine S, Tanaka H. The role of the C-terminal domain and type III domains of chitinase Al from bacillus circulans WL-12 in chitin degradation. J Bacteriol. 1994. 176:4465-4472.

133. Wilson, G. S., and A. A. Miles. Brucella tularensis, In Topley and Wilson's principles of bacteriology and immunity. The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Md. 1964. p. 10131014

134. Wenger, J. D. , D. G. Hollis, R. E. Weaver, C. N. Baker, G. R. Brown, D. J. Brenner, and С. V. Broome. Infection caused by Francisella philomiragia (formerly Yersinia philomiragia).

135. A newly recognised human pathogen.Ann. Intern. Med. 1989. 110:888-892.

136. Westphal 0, Luderitz O, Keiderling W. Effects of bacterial toxins; biochemical analysis of inflammation. Zentralbl bakteriol parasitenkd infektionskr' hyg. 1952 jun;158(3-5):152-60.

137. Wu, J.Y., Newton, S., Judd, A., Stocker, В., Robinson, W.S., Expression of immunogenic epitopes of hepatitis В surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989. p.4726-4730.

138. Xu Z, Bae W, Mulchandani A, Mehra RK, Chen W Heavy metal removal by novel CBD-EC20 sorbents immobilized on cellulose. Biomacromolecules. 2002. 3:462-465.

139. Zheng C-F, Simcox T, Xu L, Vaillancourt P. A new expression vector for high level protein production, one step purification and direct isotopic labeling of calmodulin-binding peptide fusion proteins. Gene 1997.186:55-60

140. Автор выражает огромную благодарность за неоценимую помощь в выполнении работы своим научным руководителям: Ирине Сергеевне Мещеряковой и Владимиру Глебовичу Лунину.

141. Отдельное спасибо: Кормилициной М.И., Родионовой И.В., Шмарову М.М., Народицкому Б.С., Карягиной-Жулиной А. С., Лавровой Н.В., Галушкиной З.М., Сергиенко О.В.,

142. Рязановой Е.М., Ворониной О.Л, Тихоновой Т.В., Ванюшевой О.В., Шилову И.А. и коллективам лаборатории генетической регуляции биохимических процессов, лаборатории молекулярной биотехнологии и лаборатории туляремии.

143. Также автор сердечно благодарит своих друзей и родных за оказанную поддержку и помощь.