Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение компонентов полиэпитопной вакцины против ВИЧ/СПИД

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Получение компонентов полиэпитопной вакцины против ВИЧ/СПИД"

ВОЛОСНИКОВА Екатерина Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ ПОЛИЭПИТОПНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИЧ/СПИД

03.01.06 -биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 ОЕВ 2072

005010366

ВОЛОСНИКОВА Екатерина Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ ПОЛИЭПИТОПНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИЧ/СПИД

03.01.06 -биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Лебедев Леонид Рудольфович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Белявская Валентина Александровна доктор биологических наук

Жуков Владимир Александрович

Ведущая организация:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск).

Защита состоится « 22 » февраля 2012 г. в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУНГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: 630559, р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, тел. 8(383)

336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Уровень заболеваемости СПИДом в мире неуклонно растет. По данным ВОЗ, общее количество заболевших превысило 40 млн. человек, более 22 млн. уже умерли от СПИДа. Согласно данным Федерального центра по профилактике и борьбе со СПИДом число ВИЧ-инфицированных в России на 2010 г. оценивалось в 589581 человек, в том числе 5 227 детей в возрасте до 15 лет. (офиц.сайт Федерального центра СПИД http://www.hivrussia.ru/stat/2010.shtml). Россия входит в "тройку лидеров" по скорости заражения ранее неинфицированных граждан.

Наиболее подвержены ВИЧ-инфекции дети и молодые люди до 25 лет, которые составляют примерно четвертую часть от общего числа людей, живущих со СПИДом. Поэтому разработка новых подходов для создания эффективной профилактической и терапевтической вакцины против ВИЧ является чрезвычайно актуальной задачей.

Создание эффективной и безопасной вакцины против ВИЧ/СПИД является одной из приоритетных задач современной вакцинологии, что связано с неуклонным ростом заболеваемости СПИД в разных странах мира и РФ. В России важность работ по созданию вакцины против ВИЧ/СПИД подчеркивается Постановлением правительства РФ от 25 декабря 2007 г. № 1905-Р.

К сожалению, многочисленные исследования в области создания высокоэффективной и безопасной вакцины против ВИЧ в мире до сих не увенчались успехом. Разработка анти-ВИЧ-1 вакцины -несомненно, лучший способ контроля за распространением эпидемии ВИЧ-инфекции путем формирования стойкого иммунитета у вакцинированного населения (Fauci A.S., 2008).

Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» А.М. Ерошкиным (Eroshkin A.M. et al, 1995) была предложена модель белка-антигена - кандидата для создания вакцины против ВИЧ. Белок ТВ1 содержит четыре Т-клеточных эпитопа и пять В-клеточных эпитопов из белков ВИЧ-1 Env и Gag. Позднее на его основе был создан оригинальный искусственный иммуноген в виде вирусоподобных частиц с дсРЫК в центре и белком на поверхности - кандидат в вакцины против HIV-I (Лебедев Л.Р. и др. 2000). Его конструкция являлась по сути субъединичной, сочетая в себе и иммуноген и стимулятор иммунного ответа (индуктор интерферонов - дсРНК). Она обладала хорошей

иммуногенностью, вызывала наработку высоких титров антител против ВИЧ с вирус-нейтрализующей активностью.

Дальнейшее совершенствование конструкции привело к идее об использовании в качестве второго компонента ДНК-вакцины (рекомбинантной плазмиды pcDNA-TCI для центрального ядра частиц вместо дсРНК), который бы обеспечивал формирование Т-клеточного иммунного ответа. Т-клеточный иммуноген был разработан С.И. Бажаном (Bazhan S.I., et al., 2004). Ген TCI кодирует искусственный поли-СТЬ-эпитопный Т-клеточный иммуноген (TCI, Т Cell Immunogen), содержащий более 80 Т-клеточных эпитопов из основных вирусных белков Eng, Gag, Pol, Nef.

Использование данного подхода позволило создать в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» кандидатную вакцину против ВИЧ/СПИД, названную КомбиВИЧвак. Она не имеет аналогов по структуре белкового и ДНК-иммуногенов, составу вакцинной конструкции. Доклинические исследования вакцины КомбиВИЧвак показали ее высокую специфическую активность и безвредность при испытании на животных, и в настоящее время завершена первая стадия клинических испытаний (Разрешение Росздравнадзора МЗиСР РФ на проведение первой фазы клинических испытаний вакцины «КомбиВИЧвак» №133 от 30 марта 2010г.).

Следует отметить, что как белок TBI, так и ДНК-TCI не имеют природных аналогов, являются результатом теоретических исследований и расчетов, проводимых с целью конструирования новых наиболее активных компонентов белковой и нуклеиновой природы, которые при попадании в организм могут сформировать специфический антиВИЧ иммунитет. Информация об их физикохимических свойствах практически отсутствует. Вместе с тем, изучение физико-химических свойств новых рекомбинантных веществ, используемых в вакцине, предоставляет необходимую информацию о молекулярной массе, спектральных характеристиках, об устойчивости активных в иммуногеном отношении компонентов к биодеградации, условиях хранения и т.д. Часть характеристик как для белка TBI, так и для ДНК-TCI были исследованы, но не в полном объеме. Получение новых данных о физико-химических свойствах компонетов (белка TBI и ДНК-TCI) является важной задачей для конструирования вакцины КомбиВИЧвак.

Важной составляющей всего комплекса работ по созданию вакцин на основе биотехнологических компонентов, является разработка

способов их получения, очистки, которые должны обеспечить воспроизводимость процесса и высокое качество этих субстанций. От этого зависят специфические иммуногенные свойства вакцины, ее пирогенность и токсичность. Все это, в равной степени, относится к разработке технологических приемов получения высококачественных компонентов: белка ТВ1 и ДНК-ТС1, соответствующих требованиям, предъявляемым к генно-инженерных препаратам. Разработанные технологические схемы и способы получения активных компонентов должны быть хорошо воспроизводимы и масштабируемы.

Цель и задачи исследования

Цель - усовершенствование и масштабирование технологий выделения и очистки компонентов полиэпитопной кандидатной вакцины против ВИЧ/СПИД. Исследование и оптимизация условий, обеспечивающих воспроизводимость биотехнологических процессов.

В связи с целью исследования необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить оптимальные условия выделения и очистки белка ТВ1 из клеток с целью увеличения выхода целевого белка и его чистоты от примесных компонентов.

2. Исследовать возможности масштабирования процесса получения рекомбинантного белка ТВ1.

3. Подтвердить воспроизводимость выбранных технологических процессов выделения и очистки белка ТВ1 и охарактеризовать серии белка.

4. Исследовать физико-химические свойства рекомбинантного белка ТВ1, его конъюгата и вакцинной конструкции.

5. Исследовать процесс конъюгирования. Эмпирически определить количественные соотношения и условия проведения процесса конъюгирования компонентов конструкции: декстрана, белка ТВ1 и положительно заряженных молекул спермидина.

6. Оптимизировать процесс очистки субстанции ДНК плазмиды pcDNA-TCI с целью увеличения ее выхода и чистоты.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые при помощи компьютерных программ была усовершенствована схема получения рекомбинантного белка ТВ1, что позволило сократить количество стадий очистки и себестоимость процесса, а также достичь высокой чистоты и повысить выход целевого белка.

При проведении масштабирования процесса по оптимизированной технологии очистки рекомбинантного белка ТВ1 показана полная идентичность получаемого продукта.

Впервые исследован процесс конъюгирования белка ТВ1 с полимерами и показана возможность получения конъюгатов полисахаридов с белками-антигенами с заранее заданными свойствами и соотношением компонентов.

Впервые проведены физико-химические исследования вакцины и ее отдельных компонетов: изучена температурная и ферментативная устойчивость, сняты спектральные характеристики, показана стабильность вакцинного препарата при хранении. Полученные данные показали неизменность свойств белка при оптимизации и масштабировании процесса выделения.

Полученные сведения о свойствах белка, технологических приемах, контрольных точках и методах контроля вошли в раздел Инструкции по изготовлению и контролю «КомбиВИЧвак». В соответствии с данной инструкцией были наработаны серии белка ТВ1 для изготовления 5 серий вакцины «КомбиВИЧвак», используемых для проведения доклинических и клинических испытаний.

Инструкция использовалась для получения серий белка ТВ1 и для проведения доклинических и клинических испытаний.

Также на основании полученных данных были оформлены СОП:

СОП СТИ № 2.1-055/01-2011 Разрушение биомассы ТВ1; СОП СТИ № 2.1-057/01-2011 Отмывки, растворение осадка тел включения и восстановление белка ТВ1;

СОП СТИ № 2.1-056/01-2011 Хроматографическая очистка белка ТВ1;

СОП СТИ № 2.1-054/01-2011 Ренатурация и получение готовой субстанции белка ТВ1.

Положения, выносимые на защиту

1. Усовершенствованная технология получения

рекомбинантного белка ТВ1 позволяет получать белок высокой чистоты (до 98%) с выходом белка (до 60% от его исходного содержания) и примесью эндотоксина менее 12,5 ЕЭ/дозу.

2. Масштабирование процесса получения рекомбинантного белка ТВ1 позволяет сохранять качество и выход получаемой субстанции белка на высоком уровне.

3. Предложенные параметры процесса конъюгирования позволяют получать конъюгаты полисахаридов с белком ТВ1 с заранее заданными соотношениями компонентов и зарядом.

4. Предложенная технология выделения и очистки субстанции рсОИА-ТС! позволяет увеличить выход (до 1 мг/1 г клеток) и чистоту (до 97%) получаемого плазмидного материала.

Апробация работы

Результаты исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: «Молекулярная медицина и биобезопасность». 6-я междунар.конф., 10-11 нояб. 2009 г., Москва» (Диплом 2 степени). «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 5-й Московский междунар. конгресс, Москва, 16-20 марта 2009 г.». (Диплом 3 степени), Науч.-практ. конф. молодых учёных и специалистов Роспотребнадзора, Оболенск, 21-22 апр. 2009 г.». «Биотехнология: состояние и перспективы развития: VI

Московский междунар. конгресс, 21-25 марта 2011 г.».

Работа выполнена во ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора в 2009-2011гг. в рамках научных тем организации и по грантам государственных научно-технических программ "Новейшие методы биоинженерии", "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел: «Защита от патогенов», по Федеральной Государственной программе “Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего”, постановление правительства РФ от 25 декабря 2007 г. № 1905-Р.

Публикации

По результатам, полученным в процессе работы, опубликовано 6 статей (из них 4 в реферируемых журналах) и 3 тезисов в сборниках конференций и конгрессов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 133 страницах, состоит из 7 разделов: «Общая характеристика работы», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Библиографический список» и «Приложения». Работа содержит 26 рисунков, 10 таблиц. Библиография представлена 236 источниками отечественных и зарубежных авторов.

Личный вклад автора

Лично соискателем были проведены теоретические расчеты (определение зарядов белка при различных значениях pH, расчет всех этапов процесса при масштабировании) и получена основная часть экспериментальных , результатов: выделение и очистка

рекомбинантного белка ТВ1, масштабирование процесса выделения белка, конъюгация белка ТВ1 с полимерами, получение связанных частиц конъюгата белка ТВ1 с дсРНК, выделение и очистка плазмидной ДНК ТС1, физико-химические исследования белка ТВ1, его конъюгата и вакцинной конструкции. Кроме того, соискатель принимал участие в изготовлении 5 серий вакцины КомбиВИЧвак для доклинических и первой фазы клинических испытаний.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Целью исследования являлось усовершенствование и масштабирование технологий выделения и очистки компонентов полиэпитопной кандидатной вакцины против ВИЧ/СПИД, а также исследование и оптимизация условий, обеспечивающих воспроизводимость биотехнологических процессов.

1 Оптимизация способа получения рекомбинантного белка ТВ1

Одним из рекомбинантных белков, созданных для использования в качестве антигена в составе вакцины от ВИЧ, является белок ТВ1. В обзоре литературы было указано, что он получается биосинтезом в рекомбинантных прокариотических клетках Е.соН с последующим выделением и хроматографической очисткой.

Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» была разработана схема очистки белка ТВ1. Для выделения и очистки белка клетки суспендировали в буферном растворе, разрушали при помощи ультразвука. Было отмечено, что белок ТВ1 при биосинтезе накапливается в клетках в основном в тельцах включения. Тельца включения осаждали центрифугированием и дважды промывали буфером.

В предварительных экспериментах по фракционированию полученного осадка растворами с возрастающими концентрациями мочевины было установлено, что белок ТВ1 растворяется практически полностью при концентрации мочевины в растворе 6 Моль/л.

Извлеченный из телец включения белок чистили хроматографиями на ДЕАЕ-целлюлозе, гель-фильтрацией на сефарозе CL-6B и рехроматографией на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой.

Разработанная ранее схема имела ряд недостатков (недостаточная чистота получаемого препарата, отсутствие стандартной методики и т.д.) и требовала оптимизации для получения воспроизводимого и легко масштабируемого процесса.

Для разработки технологии его очистки в первую очередь следовало исследовать его способность растворяться в водных растворах, в растворах с хаотропными агентами. В зависимости от концентрации последних, значений pH и т.д. Кроме того, было необходимо разработать воспроизводимый процесс получения и провести эксперименты по его масштабированию. Для этих целей необходимо было исследовать физико-химические свойства белка: его температурную и ферментативную устойчивость, способность к конъюгации, спектральные характеристики и стабильность при хранении.

С помощью программы PROTEIN CALCULATOR v3.3 ('http://www.scripps.edu/cgi-bin/cdputnam/protcalc3~) по аминокислотной последовательности были определены изоэлектрическая точка молекулы белка ее заряд при различных значениях pH. Для белка TBI теоретически рассчитанное значение р! = 5.67, а данные по зарядам представлены в табл. 1.

Таблица 1

Заряд молекулы TBI при различных значениях pH

pH 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00

Заряд +16,6 +10,2 +4,5 +1,4 -0,2 -1,4 -2,3 -3,0 -3,5 -4,1 -5,0 -6,9 -10,1

Для разрушения клеток их суспендировали в буфере (10 мМ Трис-НС1, pH 8,0) в отношении 1 : 4 по объему и подвергали обработке ультразвуком (УЗДН-2Т, Россия, 22 кГц при максимальной амплитуде) циклами: 1 мин и 5 мин охлаждения в ледяной бане, контролируя чтобы температура суспензии не превышала 8 °С.

Отмывку телец включения проводили трехкратно раствором 20 мМ Триса, pH 8,0 с добавлением Тритона Х-100 до конечной концентрации 0,1 %. Отмытые тельца включения отделяли

центрифугированием.

Ранее было отмечено, что белок ТВ1 практически полностью переходил в раствор мочевины при концентрации последней 6 Моль/л. Были проведены эксперименты по изучению распределения

суммарных клеточных белков после разрушения клеток в буфере с 6 М мочевиной при различных значениях pH. Из проведенных экспериментов был сделан вывод, что растворимость основной массы клеточных белков увеличивается при повышении значений pH выше 5,4 и при значении pH 9,5 материала в осадке практически не остается. Тогда как при значениях pH 4,2-5,4 растворе наблюдается в основном полоса белка ТВ1 (рис. 1).

Рис.1. Электрофореграмма клеточных белков, растворенных в буфере с 6М мочевиной при различных значениях pH (13%-ный ПААГ, денатурирующие условия)

Дорожки: 1-рН 4,2; 2- pH 4,8; 3- pH 5,4; 4- pH 6,0; 5- pH 6,6; 6- pH 7,8' 7-рН 8,4; 8- pH 9,5

К - 5 мкг белка ТВ1, Л - лизоцим (контроль 14400Д)

Из рис.1 видно, что основная масса клеточных белков переходит в раствор при значениях pH выше 5,4, тогда как при значениях pH ниже в растворе наблюдается в основном полоса белка ТВ1. В аналогичном эксперименте, при экстракции белка раствором мочевины при значении pH 4,8 из отмытых буферным раствором (ЮмМ Трис, pH 8,0) телец включения чистота его достигала 80% от суммы экстрагированных белков.

Основываясь на теоретически рассчитанных (табл.1) и экспериментальных данных, можно сделать заключение, что наиболее полно белок ГВ1 извлекается из телец включения при pH 4,5 - 4,6 при концентрации мочевины 6 Моль/л. Клеточный дебрис и нерастворившиеся белки отделяли центрифугированием. Практически весь белок ТВ1 при этом находился в растворе мочевины, минимально загрязненный примесными белками.

Надосадочная жидкость

осадки

КІ2345678 Л 12 3 4 5 6 7 8

Таким образом, белок ТВ1 извлекался из телец включения буфером с концентрацией мочевины 6 Моль/л при pH 4,5 - 4,6. Клеточный дебрис и нерастворившиеся белки отделяли центрифугированием. Практически весь белок ТВ1 при этом находился в растворе мочевины, минимально загрязненный примесными белками. Для освобождения от основной массы примесей нуклеиновых кислот и липополисахаридов (эндотоксина) проводили хроматографическую очистку экстракта из телец включения на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой ДЕ-52 в присутствии мочевины при значении pH ниже изоэлектрической точки белка. После нанесения раствора сорбент промывали тем же буфером, содержащим мочевину (6 Моль/л). Белок ТВ1, имея положительный заряд (табл.4) при этих значениях pH, не сорбировался и находился в промывочном растворе. При последующей промь.вке колонки раствором 0,5 М №С1, с нее элюируется материал, содержащий примеси нуклеиновых кислот и липополисахаридов. Проведение хроматографии при значении pH 5,2-5,4 позволяло получить конечный продукт с чистотой целевого белка до 90 %. Картины оптических профилей хроматографий при разных значения pH представлены на рис.2.

ТВ1 ТВ1 ...-........-...

И'

н

и промывка колонки 0,5 М №С1 Профиль хроматографии при pH 4,6

Нанесение Элюция

и промывка колонки 0,5 М №С1 Профиль хроматографии при pH 5,2

Рис. 2 Сравнение оптических профилей хроматографий (при 280 нм) экстракта телец включения при разных значения pH

Как видно из рисунка 2, проведение хроматографии при значении pH 5,2 позволяет отделить более разнообразный пул примесей (нуклеиновые кислоты, фосфолипиды и др.), заряженных отрицательно при этом значении pH. В тоже время, приближение значения pH к изоэлектрической точке белка (р!=5.67) грозит

выпадением белка на колонке в осадок. Поэтому для проведения первой хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе было выбрано значение pH 5,2.

Экстракт телец включения, полученный при значении pH 4,6 подтитровывали 1М раствором Трис до значения pH 5,2.

Для доочистки и концентрирования белка использовали также хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе, но выше изоэлектрической точки белка, при значении pH 8,0 в присутствии мочевины. При этом значении pH белок, имея отрицательный заряд молекулы (табл.1), сорбировался на ДЕАЕ-целлюлозе, и его элюция наблюдалась при концентрации 0,12 - 0,15 М NaCl (анализ фракций проводили при помощи ЭФ в ПААГ в денатурирующих условиях). Фракции, содержащие белок TBI, объединяли и проводили ренатурацию белка. Для этого раствор разбавляли в два раза раствором NaCl 0,15 Моль/л и перемешивали в течение Зч при температуре 4 °С. Далее раствор белка тщательно диализовали против физиологического раствора при температуре +4°С и стерилизовали фильтрацией (фильтр с диаметром пор 0,22 мкм).

Выход целевого продукта белка TBÍ в процессе очистки составлял около 60% от его исходного содержания, чистота белка - не менее 95%. Количественный анализ проводили с использованием компьютерной программы «Gel-pro analyzer, Ver. 3.1». В аналогичных экспериментах по хроматографической очистке белка с использованием катионообменного сорбента (КМ-сефароза) не удалось очистить белок TBI до чистоты выше 90%. Примеси эндотоксина, определенные по (ОФС 42-0062-07 Бактериальные эндотоксины, 2007) менее 25 ЭЕ/мг (менее 1,25 ЭЕ/дозу 50 мкг) (EU «endotoxin units”).

Анализ препаоата поедставлен на рис.З. м 1

.у|-л

66000

45000—

ЗЙООО—►

29000—►»-*-

20100—►

14400—► •

Рис.З Электрофореграмма препарата рекомбинантного белка TBI в 12%-ом ПААГ

М - белки-маркеры (14400 - 69000Д);

1 - готовый препарат ТВ1 (Юмкг)

Таким образом, в ходе оптимизации технологии получения рекомбинантного белка ТВ1 применялась комбинация из двух хроматографий на ДЕАЕ-целлюлозе при разных значениях pH, что позволило получить высокоочищенный препарат белка. При первой, проводимой при pH 5,2 — 5,4, ниже изоэлектрической точки белка, сорбируются и удаляются примесные нуклеиновые кислоты, липополисахариды и белки, при второй, проводимой при pH 8,0, сорбируется целевой белок и удаляются остальные примеси.

В результате использования для теоретических расчетов компьютерных программ была рассчитана изоэлектрическая точка белка ТВ1 р! (р1 = 5,67). На основании экспериментальных данных предложен ьэспроизводимый способ получения рекомбинантного белка ТВ!, с помощью которого получены серии высокоочищенного препарача (табл.6). Изучение физических характеристик белка позволило оптимизировать процессы его солюбилизации из телец включения и ренатурации при выделении и очистке. Полученные образцы белка ТВ1, характеризовались высокой чистотой (более 95%) и гомогенностью, и удовлетворяли требованиям по содержанию эндотоксина для рао.воров, предназначенных для парентерального введения (5 ЭЕ/кг/час) (Афиногенова Г.Н., 2007).

Сравнительные схемы получения белка ТВ1 по изначальной и оптимизированной технологиям представлены на рис.4.

Изначальная схема получения Оптимизированная схема получения

Рис.4 Сравнительная характеристика изначальной и оптимизированной технологий получения рекомбинантного белка ТЕМ

Оптимизированная схема получения рекомбинантного белка ТВ1 позволила сократить продолжительность процесса выделения (с 40 до 30 часов) и себестоимость процесса (за счет экономии сорбента Сефароза 6В).

При разработке оптимизированного процесса выделение белка 'ГВ1 велось из (1±0,5) г клеток. После отработки методики количество биомассы было увеличено до 20 г клеток. Данные по выделению и очистке белка из (20±3) г клеток представлены в таблице 2.

Таблица 2

Средние данные по процессу очистки 3-х серий белка ТВ1____________

Стадия очистки Объё м, мл Суммарный белок TBI Выход, %

мг/мл 1мг Содержание, % Количество, мг

Экстракт из телец включения 20±2 10,0±0,5 195±20 70±7 135±20 100

1 хроматография 50±5 2,2±0,5 110*20 90 100±20 75

2 хроматография 40±5 2,2±0,3 85±10 97±1 80±20 60

Содержание целевого белка в пробах определяли при помощи ЭФ в 12%-ном ПААГ (Laemmly W.H., 1970) с последующим

сканированием дорожек с использованием компьютерной программы «Gel-рго analyzer, Ver. 3».Результаты анализа 3 серий, полученных по оптимизированной технологии, представлены в табл. 3.

Таблица 3

Характеристики субстанции белка TBI___________________

Показатель Требования МУК 4.1/4.2.588-96 Серия 1 Серия 2 Серия 3

Чистота и гомогенность не менее 95% 96 96 96

Молекулярная масса, кД - 20 20 20

Концентрация по белку, мг/мл - 2,5 2,3 2,1

Выход белка, мг - 68 90 75

Примеси липопо-лисахаридов LAL-тест, норма <25, ЕЭ/дозу (50 мкг) <2,5 <5 <5

Пирогенность <1,4°С (норма согласно ГФХИ изд., чЛ) 0,5 0,8 0,5

2 Масштабирование процесса получения рекомбинантного белка ТВ1

В ходе разработки и внедрения оптимизированной технологии получения рекомбинантного белка ТВ1 была увеличена загрузка биомассы с (1 ±0,5) до 23 г. Для отработки процесса масштабирования загрузка биомассы была увеличена до 57 г. В результате проведенного масштабирования показано, что при увеличении объема используемой для выделения биомассы качество и выход получаемого белка сохраняются на высоком уровне.

В результате масштабирования технологического процесса (при загрузке 57 г) получены две серии белка ТВ1, удовлетворяющие предъявляемым требованиям по содержанию бактериальных эндотоксинов (ГФ XII изд., часть 1, с. 128).

С целью подтверждения идентичности образцов белка ТВ1, полученных после масштабирования, образцам, выделенным по исходной и оптимизированной технологии, была определена молекулярная масса, проведены спектральные исследования (рис. 5), исследована их устойчивость к температурным (рис. 6) и

Рис.5 Спектральные характеристики образцов белка ТВ1

Спектральные характеристики образцов белка ТВ1, полученных по:

______- оптимизированной

технологии

______- масштабированной

технологии

Мй.СО КО.СО ЭД06 230.09 ЗСО.ОС

ферментативным воздействиям.

Рис.6 Электрофореграмма белка ТВ1 в 12%-ном ПААГ после инкубации при 37 “С течение суток М-маркеры (14400-66000)

1 - ТВ1 контроль

Серии белка ТВ1, полученные в результате

2 - исходного процесса

3- оптимизированного процесса

4- масштабированного процесса

Полученные результаты позволили установить полное соответствие характеристик образцов белка ТВ1, полученных по технологиям с различной загрузкой биомассы.

Образцы субстанций были проанализированы согласно методам контроля для медицинских и иммунобиологических препаратов (МУК 4.1./4.2.588-96, 1996). Значения результатов, представленные в таблице 4, свидетельствуют о соответствии субстанций белка ТВ1 по чистоте, по содержанию примесей клеточных белков и липополисахаридов требованиям для медицинских и

иммунобиологических препаратов (МУК 4.1 ./4.2.588-96, 1996).

Данные по примесям липополисахаридов и белков штамма-продуцента были получены независимым отделом контроля качества по соответствующим методикам по соответствующим методикам приведенным в МУК 4.1./4.2.588-96 и ГФ XII изд., ч.1. Данные по пирогенности получены отделом биологических испытаний.

45000

36000

29000

20100

14400

Ир- -

Таблица 4

Характеристики образцов белка ТВІ, полученные по технологиям с ________________различной загрузкой биомассы.________________________

Показатель Требования МУК 4.1/4.2.588 -96 Изначальный тех. процесс (5 операций) Оптимизированный тсх.процесс (7 операций) Масштабированный тех.ироцесс (2 операции)

Биомасса, г - 24±3 ¡±0,2 23±3 57

Выход в % от исходного содержания целевого белка в клетках 40 60 60 60

Выход в пересчете н: дозы вакцины (1д: 50 мкг белка) 600±200 60±5 1500±300 5000±500

Чистота и гомогенность не менее 95% 92 96 96 96

Молекулярная масса, кД - 20 20 20 20

Иммуноблот-тинг Mab к р24 ВИЧ-1 ' + + +■ ■■ + -

Примеси белков штамма-продуцента не более 200 нг/мг препарата 100 20 . 20 20

Примеси липополисахари дов ЬАЬ-тест, норма <25, ЕЭ/дозу (50 мкг) >45 <25 <25 <25

Устойчивость к трипсину с активностью 26,8 е.а./г Скорость гидролиза и образующиеся фрагменты идентичны Скорость гидролиза и образующиеся фрагменты идентичны Скорость гидролиза и образующиеся фрагменты идентичны Скорость гидролиза и образующиеся фрагменты идентичны

Устойчивость к температуре 37"С идентично идентично идентично идентично

Пирогенность <1,4"С (ГФХП изд., 4.1) 1,4±0,3 0,8±0,3 0,8±0,3 0,5±0,3

Таким образом, была оптимизирована и масштабирована эффективная технология получения высокоочищенного препарата белка ТВ1. Отработанный процесс является воспроизводимым и гарантирует получение чистого препарата согласно методам контроля для медицинских и иммунобиологических препаратов (МУК 4.1./4.2.588-96, 1996). '

3 Исследование процессов получения конъюгатов с полисахаридной матрицей

В качестве полимерной матрицы был выбран биодеградируемый полимер - декстран с молекулярной массой 60000 Да (полиглюкин). Для придания молекуле конъюгата положительного заряда использовали спермидин (молекулярная масса 145 Да).

Для получения конъюгатов использовали реакцию Малапрада (М. Р-) (ЬНр.//ц,\ууу.х1т|'са1.сот/|’пГо.рЬр?|^=3292'). которую проводили при комнатной температуре (от 20°С до 25°С). Растворы декстрана и перйодата натрия смешивали в соотношении 1:25 (моль/моль). Через выбранные промежутки времени аликвоты раствора подвергали гель-фильтрации на сефадексе С-25 и к активированному декстрану добавляли спермидин либо антиген - белок ТВ1. О полноте прохождения реакции судили, интерпретируя результаты, полученные с помощью методов гель-фильтрации (на колонке с сефадексом в-150) и денситометрически с помощью электрофореза (в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях). Показатель полноты реакции (%) определяли как отношение количества спермидина/белка в составе конъюгата к исходному содержанию компонентов в реакционной смеси.

Было изучено действие основных факторов, оказывающих влияние на процесс образования конъюгатов:

- времени инкубации декстрана с окислителем

- соотношения концентраций декстрана и перйодата натрия

- длительности реакции конъюгирования

- количества спермидина, введенного в состав конъюгата

Показано, что для получения конъюгата с соотношением на одну молекулу декстрана - одна молекула белка ТВ1 и десять молекул спермидина:

1. оптимальное время активации полисахаридной матрицы (инкубации декстрана с окислителем) для последующего образования конъюгатов составляет 30-60 мин, оптимальное соотношение

концентраций компонентов - на 1 декстрана - 20-25 молекул перйодата натрия.

2. для образования вирусоподобных частиц с дсРНК соотношение спермидина в конъюгате должно быть не менее 10 молекул на 1 молекулу декстрана.

3. так как скорость реакции конъюгирования спермидина с декстраном выше, чем молекул белка был разработан порядок внесения компонентов в реакционную смесь (для получения конъюгатов заданного состава: на одну молекулу полиглюкина - одна молекула белка ТВІ и 10 молекул спермидина). Для этого необходимо первоначально к активированной матрице добавлять белок, после 120 мин инкубации вносить спермидин, продолжая инкубацию реакционной смеси еще 120 мин. Согласно выбранным параметрам процесс получения конъюгата белка ТВІ с полимерами может быть представлен в виде схемы (рис.7).

Рис. 7 Схема образования конъюгата белка ТВ1 с полимерами Полученные конъюгаты по уровню примесей ЛПС соответствуют требованиям для медицинских и иммунобиологических препаратов, вводимых людям (МУК 4.1./4.2.588-96, 1996).

4 Оптимизация метода получения плазмидной рс1)\ Д-ТС1

Для извлечения и очистки плазмидного материала отмытые клетки бактерий суспендировали в буфере (50 мМ глюкоза, 25мМ Трис-НС1 и ЮмМ ЭДТА) в течение 30 мин и добавляли раствор, содержащий 1,5%-ный 808 и 0,4 М КаОН. Все операции лизиса во избежание деградации ДНК плазмиды проводили при 0° С. Полученный раствор содержал значительное количество примесей, особенно РНК. Для деполимеризации последней проводили обработку РНКазой, свободной от ДНКазы.

Был выбран метод фракционирования ЫС1. Было исследовано влияние концентрации ЬлС1 на распределение ДНК и РНК. Для этого к аликвотам осветленного лизата клеток, полученного на предыдущей стадии, добавляли ЫС1 до различных концентраций, инкубировали и суспензии центрифугировали. Надосадочные жидкости и осадки (растворенные в воде) анализировали электрофорезом в 1%-ом геле агарозы. Результаты анализа представлены на рис 8.

Надосадочные фракции Осадки

0 1 2 3 4 1 2 3 4

Рис.8 Электрофореграмма в 1%-ном геле агарозы образцов препаратов ДНК при высаливании ЬіСІ, дорожки:

0 - исходный материал; 1 -препарат ДНК при 2М ЬіСІ; 2 - препарат ДНК при З М ЬіСІ; 3 - препарат ДНК при 4 М ЬіСІ; 4 - препарат ДНК при 5М ЬіСІ

Из рис. 8 видно, что ДНК плазмиды наблюдается во всех надосадочных фракциях. Тогда как в осадке она обнаруживается при концентрациях ЬіСІ 4 Моль/л и больше. В то же время пул низкомолекулярной РНК в надосадочной фракции при концентрации ЬіСІ 3 Моль/л значительно снижается. В дальнейшем, для фракционирования, использовали концентрацию соли 3 Моль/л. На этом этапе можно достичь содержания плазмидной ДНК в препарате до 15-20%.

Для тонкой очистки плазмидной ДНК использовали гель-фильтрацию на колонке с сефарозой СЬ-2В. Причем препарат наносили в солевом растворе ЬіСІ для предотвращения возможных «залипаний» положительно заряженных примесей на молекулы ДНК.

Типичный профиль представлен на рис.9.

хроматографии при длине волны 260 нм

'ЙШ

\ 1 1

1 { I

1 1 1

1 |

Рис.9 Оптический фильтрации препарата сефарозой СЬ-2В ! - пик,

высокоочищенной ДНК плазмиды

2 - пик, соответствующий комплексу примесных РНК, полисахаридов, белков.

профиль гель-на колонке с

соответству ющи й

В результате был разработан процесс очистки плазмидной ДНК со следующими стадиями:

- лизис клеток щелочью с одновременной депротеинизацией ДСН,

- низкоскоростное центрифугирование для удаления клеточных обломков и значительной части белков,

- концентрирование нуклеотидного материала 67%-ным раствором этанола,

- разрушение примесной РНК РНКазой, свободной от ДНКаз

- осаждение РНК ЗМ раствором 1лС1,

- очистка хроматографией на колонке с сефарозой СЬ-2В.

Процесс позволяет получать препарат высокоочищенной

плазмидной ДНК рсОИА-ТС1 с выходом 1-2 мг из г влажных клеток (в зависимости от исходного содержания плазмиды в клетках).

1 2 3 4 5 6

Рис. 10 Электрофореграмма в 1%-ном геле агарозы рестрикционного анализа очищенной плазмиды рсОМА-ТС1

Дорожки: 1 - исходная и 2 - полученный препарат плазмиды, гидролизованные рестриктазой Уэр!; 3 — исходная и 4 - полученный препарат плазмиды, гидролизованные рестриктазой Мэр I; 5 - маркер 1 кЬ («Сибэнзим»); 6- маркер 100 Ьр («Сибэнзим»)

Как видно на рис. 10 полученный препарат плазмидной ДНК по данным рестрикционного анализа идентичен исходной ДНК pcDNA-TCI.

В процессе экспериментов была разработана технология получения высокоочищенных препаратов плазмидной ДНК для фармацевтических целёй. Наработаны образцы препарата pcDNA-TCI, которые использовались для проведения экспериментальных моделей сборки вакцинной конструкции.

Образцы препарата pcDNA-TCI, полученные по данной технологии, для изготовления серий вакцины «КомбиВИЧвак» не использовались. Препараты pcDNA-TCI, использованные для получения серий вакцины «КомбиВИЧвак» для доклинических и клинических испытаний, получены по технологии, приведенной в заявке на изобр. № 2009112677, от 06.04.2009 г.

5 Получение вакцинной конструкции

Сбор вакцинной конструкции «КомбиВИЧвак» проводили в стерильном боксе. Объемы растворов конъюгата белка TBI и плазмидной ДНК TCI рассчитывали, исходя из значений на дозу препарата вакцины объемом 200 мкл: 50 мкг белка и 75 мкг ДНК Раствор конъюгата белка пропускали через стерильный-фильтр, затем через этот же фильтр пропускали половину раствора хлорида натрия

0,9 %. Далее фильтрующую насадку меняли и через новую насадку по каплям в полученный раствор вносили плазмидную ДНК TCI. Затем через этот же фильтр пропускали оставшуюся часть раствора хлорида натрия 0,9 %. Раствор при смешивании компонентов постоянно перемешивали и затем добавляли 50 % от общего конечного объема раствора 10 %-ный раствор реополиглюкина. Отбирали аликвоты для определения стерильности препарата вакцины и содержания в нем елка TBI. Раствор вакцинного препарата передавали на стадию стерильного розлива в ампулы.

В предыдущих работах предлагалось для получения вакцинной конструкции использовать гель-фильтрацию на колонке с 6В Сефарозой, но исследование процесса образования вакцинной конструкции плазмидной ДНК ТС1 с белком TBI, по расчету вносимых компонентов и их соотношений, показали, что можно отказаться от этой стадии без ущерба для качества получаемой конструкции вакцины. При этом происходит экономия реактивов

(сорбента 6В Сефарозы) и времени на проведение процесса сборки вакцины.

Полученные в ходе работы серии препаратов вакцины были использованы для доклинических испытаний. Все полученные серии удовлетворяли требованиям, предъявляемым к медицинским и иммунобиологическим препаратам (МУК 4.1./4.2.588-96, 1996).

6 Исследования физико-химических свойств рекомбинантного белка ТВ1 в виде монопрепарата, в составе конъюгата и вакцинной конструкции

Ранее в разделе 1 уже были рассмотрены основные физикохимические свойства белка ТВ1. При конъюгировании белка с полимерами и дальнейшей сборке вакцинной конструкции могли произойти изменения в структуре белка. Также необходимо было убедиться в том, что полученные препараты удовлетворяли требованиям НД.

Проведен ряд экспериментов по устойчивости к протеазам белка ТВ1, а также его конъюгата и вакцины. Показано, что при обработке образцов белка ТВ1, конъюгата и вакцины трипсином наблюдается идеинтичный трипсинолиз во всех образцах.

Проведены спектральные исследования:

• рекомбинантного белка ТВ1, а также его конъюгата и вакцины

• образцов вакцины КомбиВИЧвак, смеси препаратов белка и ДНК, белка, ДНК и реополиглкжина (РПГ) в эквивалентных количествах.

В ходе проведенных спектральных исследований было установлено, что спектры вакцинной конструкции значительно отличаются от спектров белка ТВ1 и его конъюгата, а также от спектров смеси белка и ДНК и реополиглкжина (РПГ), взятых в эквивалентных количествах. Это свидетельствует об образовании связей в вакцинной конструкции между компонентами.

По данным исследований структуры КомбиВИЧвак и ее компонентов методом КД-спектроскопии был сделан вывод о том, что спектры основных компонентов вакцины в ее составе остаются характерными для их свободного состояния, что свидетельствует о неизменности их структуры.

С целью подтверждения результатов полученных спектров образцы препаратов были исследованы в 1 %-ном геле агарозы (рис. 12). О подвижности вакцинной конструкции судили по

продвижению ДНК в 1 %-ном геле агарозы. На элетрофореграмме видно, что вакцинная конструкция имеет меньшую подвижность, чем рсО^-ТО в смеси компонентов, что свидетельствует об образовании частиц вакцинной конструкции и их большей молекулярной массе по сравнению с исходной рс01МА-ТС1.

Проведено исследование сохранности конструкции вакцины и плазмидной ДНК в ее составе после ее хранении в течение двух лет. Для эксперимента были взяты серии вакцины, которые использовались для проведения доклинических испытаний. Было показано, что вакцина КомбиВИЧвак после хранения в течение 2-х лет сохраняет свою структуру.

3

Рис. 12 Электрофореграмма в I%-ном геле агарозы образцов вакцины КомбиВИЧвак, смеси препаратов белка и ДНК, белка, ДНК и реополиглюкина (РПГ) в эквивалентных количествах

М-маркеры молекулярных масс (1000-10000 п.н.)

1 - плазмидная ДНК ТС1

2 - смесь белка ТВ1 с ДНК ТС1 в присутствии РПГ(10%-го реополиглюкина)

3-вакцина КомбиВИЧвак с. 100809

На электрофореграмме оыло видно, что дмк в вакциннои конструкции была гомогенной и сохраняла меньшую подвижность, чем ДНК плазмиды рсО^-ТС1. Это свидетельствует о сохранении структуры частиц вакцинной конструкции и их большей молекулярной массе по сравнению с исходной рсЭКА-ТС1.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован процесс очистки белка-антигена ТВ1. Представленный способ очистки представляет собой две последовательные хроматографии на одном сорбенте при значениях pH ниже и выше изоэлектрической точки молекул белка. В усовершенствованном технологическом процессе сокращено количество хроматографических стадий (с 3-х до 2-х) и их продолжительность. Оптимизированный процесс позволил достичь высокой чистоты (до 96%) и выхода белка (до 60% от его исходного содержания).

2. Проведенное масштабирование технологического процесса показало, что при увеличении объема используемой для выделения

биомассы, качество (чистота до 96%) и выход (до 60% от его исходного содержания) получаемой субстанции белка сохраняются на высоком уровне. Идентичность образцов белка TBI, полученных при масштабировании, образцам, полученным по исходной технологии, была подтверждена путем определения молекулярной массы, спектральных характеристик, устойчивости к температурным и ферментативным воздействиям.

3. При исследовании процесса образования трехкомпонентных конъюгатов впервые установлено, что, варьируя количеством образующихся активных групп при активации декстрана, последовательностью внесения компонентов (белка-антигена и спермидина), длительностью реакций конъюгирования, можно получать конъюгаты полисахаридов с белками-антигенами с заранее заданными свойствами по молярному соотношению и заряду.

4. Разработан процесс выделения и очистки субстанции pcDNA-TCI для центрального ядра молекулярной конструкции. В результате корректировки процесса удалось увеличить выход (до 1 мг/1 г клеток) и чистоту (до 97%) получаемого препарата pcDNA-TCI.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

По результатам, полученным в процессе работы, опубликовано 6 статей (из них 4 в реферируемых журналах) и 3 тезисов в сборниках конференций и конгрессов.

1. Е.А. Volosnikova, N.I. Akulova, Ya.S. Gogina, G.M. Levagina, Y.K. Mikhailova, L.R. Lebedev, V.F. Podgornyi, Yu.V. Telegina. Development of technology for purification of plasmid DNAs for pharmaceutical purposes // Applied Biochemistry and Microbiology. -

2010.-№9. - pp.59 - 64.

2. Волосникова E.A., Акулова Н.И., Гогина Я.С., Левагина Г.М., Михайлова В.К., Лебедев Л.Р., Подгорный В.Ф., Телегина 10.В. Разработка технологии очистки плазмидной ДНК для фармацевтических целей // Биотехнология,- 20Ю.-№2.- С.59-64.

3. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р., Акулова Н.И. Очистка рекомбинантного белка TBI - антигена ВИЧ// Биотехнология. - 2010. -№4. - С.65-68.

4. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р., Каплина О.Н., Карпенко Л.И., Акулова Н.И., Рослякова ЕЛО. Иммунологическая характеристика вакцины КомбиВИЧвак против ВИЧ/СПИД. Совершенствование

способов получения // Вест. Урал. мед. академ. науки. - 2010. - №2\1 (29). - С. 245. - (Тематич. вып. по аллергологии и иммунологии).

5. Волосникова Е.А. Исследование процесса образования конъюгатов для создания вакцинных конструкций// Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. -2011.-Т.31.-№6.-С.141-145.

6. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р., Акулова Н.И., Рослякова

Е.Ю. Очистка рекомбинантного белка TBI как компонента нановакцины против ВИЧ/СГ1ИД. [Электронный

ресурс]//Биотехнология и биомедицинская инженерия: Сб. тр. 3-й Всерос. науч.- практич. конф. с междунар. участием, посвящённой 75-летиго Курского мед. ун-та/под ред. проф. В.А. Лазаренко [и др.] -Курск, 2010,- С. 45-47.

7. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р. Усовершенствование процесса очистки рекомбинантного белка TBI - компонента вакцины против ВИЧ//Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока: Сб. тр. 1-й Всерос. науч.- практич. конф. -Улан-Удэ, 2010.-С. 170-172.

8. Волосникова Е.А., Карпенко Л.И., Бажан С.И., Лебедев Л.Р., Масычева В.И., Ильичев A.A., Нечаева Е.А., Дроздов И.Г., Онищенко Г .Г. Биотехнологические аспекты создания нановакцины против ВИЧ КомбиВИЧ вак.// Биотехнология: состояние и перспективы развития:

5-й Московский междунар. конгресс, Москва, 16-20 марта 2009 г.:Материалы конгресса.-М.,2009.-ч.1,- С.220-221,- На англ.яз.//Там же.- С.221.

9. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р., Акулова Н.И.

Биотехнологические подходы к очистке рекомбинантного белка TBI// «Молекулярная медицина и биобезопасность». 6-я междунар.конф., 10-11 нояб. 2009г., Москва: Сб. материалов, науч. программа, тез - М 2009.- С.57-59. '

10. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р., Масычева В.И. Характеристика препарата рекомбинантного белка TBI - компонента вакцины против ВИЧ, полученного разными способами //"Биотехнология: состояние и перспективы развития: VI Московский междунар. конгресс, 21 — 25 марта 2011г.: Материлы конгресса — М.,

2011. - 4.1. -С.437-438. - То же на англ. языке. - С. 438.

AT - антитела АГ - антиген

а. о. - аминокислотный остаток

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека первого типа

ВИО - вирус иммунодефицита обезьян

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дсРНК-двуспиральная рибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

НД - научная документация

ООН - организация объединенных наций

п. н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПААГ- полиакриламидный гель

СПИД-синдром приобретенного иммунодефицита

TBI - Т- и В-клеточный иммуноген

TCI - Т-клеточный иммуноген

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ФСП - фармакопейная статья предприятия

ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭФ - электрофорез

MVA - Modified Vaccinia virus Ankara

В работу вошли результаты совместных исследований с Акуловой Н.И., Даниленко Е.Д., Карпенко Л.П., Кашперовой Т.А., Лебедевым Л.Р., Левагиной Г.М., Масычевой В.И., Михайловой В.К., Орешковой С.Ф., Подгорным В.Ф., Росляковой Е.Ю., Телегиной Ю.В.

Автор выражает благодарность коллегам, принимавших участие в проведении данных исследований и внедрении их результатов.

ВОЛОСНИКОВА Екатерина Александровна «Получение компонентов полиэпитопной вакцины

01 пі ой к ПР°ТИВ ВИЧ/СПИД»

Uj.01.06 -биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Отпечатано и сброшюровано в типографии «Союз Т» Печать RIZO с готовых оригинал макетов Тираж 100 экз. Заказ №419 Адрес: 630090 Россия Новосибирская область г.Бердск, ул.Ленина, 89/15 оф. 705, т 2-96-91 ’

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волосникова, Екатерина Александровна, Кольцово

61 12-3/457

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ВИРУСОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ «ВЕКТОР»

На правах рукописи

ВОЛОСНИКОВА Екатерина Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ ПОЛИЭПИТОПНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИЧ/СПИД

03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

Доктор медицинских наук, Лебедев Леонид Рудольфович

Кольцово-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Часть I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 5

Актуальность проблемы 5

Цели и задачи исследования 8

Научная новизна и практическая значимость работы 8

Положения, выносимые на защиту 10

Апробация работы 10

Публикации 11

Объем и структура диссертации 12

Личный вклад автора 12

Часть II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14

2.1 Способы создания вакцинных препаратов, особенности 14

получения вакцин против ВИЧ/СПИД ^ ^

2.1.1 Способы создания вакцинных препаратов

17

2.1.2 Особенности получения вакцин против ВИЧ/СПИД

2.1.3 Способы создания молекулярных конструкций 27 нанобиочастиц для использования в медицинской практике

2.1.4 Способы создания молекулярных конструкций

29

нанобиочастиц для доставки ДНК-вакцин.

2.2 Получение рекомбинантных белков как компонентов для 34 создания субъединичных вакцинных препаратов, в том числе против ВИЧ/СПИД

39

2.3 Методы получения нуклеотидного материала для фармацевтических целей

2.4 Методы получения конъюгатов медицинских средств

Часть III

Часть IV

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Оптимизация способа получения рекомбинантного белка ТВ1

50 56 56

4.2 Масштабирование процесса получения рекомбинантного 66 белка ТВ1

4.3 Исследование процессов получения коньюгатов с

71

полисахариднои матрицей

4.4 Разработка метода получения плазмидной pcDNA-TCI 81

4.5 Получение вакцинной конструкции

4.6 Исследования физико-химических свойств рекомбинантного

86

белка ТВ1 в виде монопрепарата, в составе конъюгата и

вакцинной конструкции

Заключение 93

Часть V ВЫВОДЫ 96

Список опубликованных работ по теме диссертации 97

Часть VI Библиографический список 99

Часть V Приложения 129

Список использованных сокращений

а. о. - аминокислотный остаток АГ - антиген AT - антитела

ВИО - вирус иммунодефицита обезьян

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека первого типа

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дсРНК - двуспиральная рибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛПС - липополисахариды

МУК - методические указания

НД - научная документация

ООН - организация объединенных наций

п. н. - пар нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ФСП - фармакопейная статья предприятия

ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭФ - электрофорез

FDA - Food and Drug Administration

MVA - Modified Vaccinia virus Ankara

TBI - T- и B-клеточный иммуноген

TCI - Т-клеточный иммуноген

Часть I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Уровень заболеваемости СПИДом в мире неуклонно растет. По данным ВОЗ, общее количество заболевших превысило 40 млн. человек, более 22 млн. уже умерли от СПИДа. Наиболее подвержены ВИЧ-инфекции дети и молодые люди до 25 лет, которые составляют примерно четвертую часть от общего числа людей, живущих со СПИДом. Согласно данным Федерального центра по профилактике и борьбе со СПИДом число ВИЧ-инфицированных в России на 2010 оценивается в 589581 человек, в том числе 5 227 детей в возрасте до 15 лет [222]. Россия входит в "тройку лидеров" по скорости заражения ранее неинфицированных граждан.

Поэтому разработка новых подходов для создания эффективной профилактической и терапевтической вакцины против ВИЧ является чрезвычайно актуальной задачей.

Создание эффективной и безопасной вакцины против ВИЧ/СПИД является одной из приоритетных задач современной вакцинологии, что связано с неуклонным ростом заболеваемости СПИД в разных странах мира и РФ. В России важность работ по созданию вакцины против ВИЧ/СПИД подчеркивается Постановлением правительства РФ от 25 декабря 2007г. № 1905-Р.

К сожалению, многочисленные исследования в области создания высокоэффективносй и бензопасной вакцины против ВИЧ в мире до сих не увенчались успехом. Разработка безопасной и эффективной анти-ВИЧ-1 вакцины - несомненно, лучший способ контроля за распространением эпидемии ВИЧ-инфекции путем формирования стойкого иммунитета у вакцинированного населения [117].

Среди многих направлений по созданию антиВИЧ-вакцин можно выделить подходы, связанные с использованием молекулярных конструкций, включающих В- и Т- клеточные иммуногены. Одним из перспективных

современных направлений конструирования вакцин является объединение В-и Т- клеточных иммуногенов ВИЧ в одной молекулярной конструкции.

Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» A.M. Ерошкиным и сотр. [115] была предложена модель белка-антигена - кандидата для создания вакцины против ВИЧ. Белок TBI содержит четыре Т-клеточных эпитопа и пять В-клеточных эпитопов из белков ВИЧ-1 Env и Gag. Позднее на его основе был создан оригинальный искусственный иммуноген - кандидат в вакцины против HIV-I [33, 39]. Его конструкция являлась по сути субъединичной, сочетая в себе и иммуноген и стимулятор иммунного ответа (индуктор интерферонов - дсРНК). Конструкция обладала хорошей иммуногенностью и вызывала наработку высоких титров антител против ВИЧ и проявляла высокий титр вирус-нейтрализующих антител. [39].

Дальнейшее совершенствование конструкции привело к идее об использовании второго иммуногенного компонента - pcDNA-TCI, который бы обеспечивал формирование Т-клеточного иммунного ответа. Т-клеточный иммуноген был разработан С.И. Бажаном [84]. Плазмида pcDNA-TCI (ДНК-вакцина) кодирует искусственный поли-СТЬ-эпитопный Т-клеточный иммуноген (TCI, Т Cell Immunogen), содержащий более 80 Т-клеточных эпитопов из основных вирусных белков Eng, Gag, Pol, Nef.

Использование данного подхода позволило создать в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» кандидатную вакцину против ВИЧ\СПИД, названную КомбиВИЧвак. Она не имеет аналогов по структуре белкового и ДНК-иммуногенов, составу вакцинной конструции. Доклинические исследования вакцины КомбиВИЧвак показали ее высокую специфическую активность и безвредность при испытании на животных, в настоящее время она находится на первой стадии клинических испытаний (Разрешение Росздрванадзора МЗиСР РФ на проведение первой фазы клинических испытаний вакцины «КомбиВИЧвак» №133 от 30 марта 2010г.).

Следует отметить, что как белок TBI, так и ДНК-TCI не имеют природных аналогов, являются результатом теоретических исследований и

расчетов, проводимых с целью конструирования новых наиболее активных компонентов белковой и нуклеиновой природы, которые при попадании в организм могут сформировать специфический антиВИЧ иммунитет. Информация об их физико-химических свойствах практически отсутствует. Вместе с тем, изучение физико-химических свойств рекомбинантных веществ, используемых в вакцине, предоставляет необходимую информацию о молекулярной массе, спектральных характеристиках, об устойчивости активных в иммуногеном отношении компонентов к биодеградации и выборе веществ для защиты от ферментов, условиях хранения, и т.д. Аналогичные характеристики как белка TBI, так и ДНК-TCI исследованы не в полном объеме, но являются существенной информацией для конструирования вакцины КомбиВИЧвак.

С другой стороны, очевидно, что важной составляющей всего комплекса работ по созданию вакцин на основе биотехнологических компонентов, является разработка способов их получения, очистки, которые должны обеспечить воспроизводимость процесса и высокое качество этих субстанций. От этого зависят специфические иммуногенные свойства вакцины и ее токсичность. Все это в равной степени относитя к разработке технологичесикх приемов получения высококачественных компонентов белка TBI и ДНК-TCI, соответствующих требованиям, предъявляемым к генно-инженерных препаратам. В этом плане выбранные технологические схемы и способы получения активных компонентов должны быть хорошо масштабируемы и воспроизводимы.

Цель и задачи исследования

Цель - усовершенствование и масштабирование технологий выделения и очистки компонентов полиэпитопной кандидатной вакцины против ВИЧ/СПИД. Исследование и оптимизация условий, обеспечивающих воспроизводимость биотехнологических процессов.

В связи с целью исследования необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать оптимальные условия выделения и очистки белка TBI из клеток с минимальным содержанием примесных компонентов с целью увеличения выхода целевого белка и его чистоты.

2. Исследовать возможности масштабирования процесса получения рекомбинантного белка TBI

3. Подтвердить воспроизводимость выбранных технологических процессов выделения и очистки белка TBI и охарактеризовать серии белка.

4. Исследовать физико-химические свойства рекомбинантного белка TBI, его конъюгата и вакцинной конструкции.

5. Оптимизировать процесс конъюгирования. Эмпирически подобрать количественные соотношения и условия проведения процесса конъюгирования компонентов конструкции: декстрана, белка TBI и положительно заряженных молекул спермидина.

6. Оптимизировать процесс очистки субстанции ДНК плазмиды pcDNA-TCI с целью увеличения ее выхода и чистоты.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые при помощи компьютерных программ была усовершенствована схема получения рекомбинантного белка TBI, что позволило сократить количество стадий очистки и себестоимость процесса, а также достичь высокой чистоты (до 96%) и оптимального выхода целевого белка (60%).

При проведении масштабирования процесса по оптимизированной технологии очистки рекомбинантного белка TBI показана полная идентичность получаемого продукта.

Впервые исследован процесс конъюгирования белка TBI с полимерами и показана возможность получения конъюгатов полисахаридов с белками-антигенами с заранее заданными свойствами и соотношением компонентов.

Впервые проведены физико-химические исследования вакцины и ее отдельных компонентов: изучена температурная и ферментативная устойчивость, сняты спектральные характеристики, показана стабильность вакцинного препарата при хранении. Полученные данные показали неизменность свойств белка при оптимизации и масштабировании процесса выделения, что гарантирует сохранность его свойств.

Полученные сведения о свойствах белка, технологических приемах, контрольных точках и методах контроля вошли в раздел Инструкции по изготовлению и контролю вакцины «КомбиВИЧвак». В соответствии с данной инструкцией были наработаны серии белка TBI для изготовления 5 серий вакцины «КомбиВИЧвак», используемых для проведения доклинических и клинических испытаний.

Также на основании полученных данных были оформлены СОП:

СОП СТИ № 2.1-055/01-2011 Разрушение биомассы TBI; СОП СТИ № 2.1-057/01-2011 Отмывки, растворение осадка тел включения и восстановление белка TBI;

СОП СТИ № 2.1-056/01-2011 Хроматографическая очистка белка

TBI;

СОП СТИ № 2.1-054/01-2011 Ренатурация и получение готовой субстанции белка TBI.

Положения, выносимые на защиту

1. Усовершенствованная технология получения рекомбинантного белка TBI позволяет получать белок высокой чистоты (до 96%) с выходом белка (до 60% от его исходного содержания) и примесью эндотоксина менее 25 ЕЭ/дозу.

2. Масштабирование процесса получения рекомбинантного белка TBI позволяет сохранять качество и выход получаемой субстанции белка на высоком уровне.

3. Предложенные параметры процесса конъюгирования позволяют получать конъюгаты полисахаридов с белком TBI с заранее заданными соотношениями компонентов и зарядом.

4. Предложенная технология выделения и очистки субстанции pcDNA-TCI позволяет увеличить выход (до 1мг/1г клеток) и чистоту (до 97%) получаемого плазмидного материала.

Апробация работы

Материалы и результаты исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: «Молекулярная медицина и биобезопасность». 6-я междунар. конф., 10-11 нояб. 2009г., Москва» (Диплом 2 степени)

«Биотехнология: состояние и перспективы развития» 5-й Московский междунар. конгресс, Москва, 16-20 марта 2009 г.». (Диплом 3 степени)

Науч.-практ. конф. молодых учёных и специалистов Роспотребнадзора, Оболенск, 21-22 апр. 2009 г.». «Биотехнология: состояние и перспективы развития: VI Московский междунар. конгресс, 21-25 марта 2011г.».

Работа выполнена во ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора в 2009-2011гг. в рамках научных тем организации и по грантам государственных научно-технических программ "Новейшие методы

биоинженерии", "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел: «Защита от патогенов», по Федеральной Государственной программе "Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего", постановление правительства РФ от 25 декабря 2007г. № 1905-Р.

Публикации

По результатам, полученным в процессе работы, опубликовано 6 статей (из них 4 в реферируемых журналах) и 3 тезисов в сборниках конференций и конгрессов.

1. Volosnikova Е.А., Akulova N.I., Gogina Ya.S., Levagina G.M., Mikhailova Y.K., Lebedev L.R., Podgornyi V.F., Telegina Yu.V.. Development of technology for purification of plasmid DNAs for pharmaceutical purposes // Applied Biochemistry and Microbiology. - 2010.-№9. - pp.59 - 64.

2. Волосникова E.A., Акулова Н.И., Гогина Я.С., Левагина Г.М., Михайлова В.К., Лебедев Л.Р., Подгорный В.Ф., Телегина Ю.В. Разработка технологии очистки плазмидной ДНК для фармацевтических целей // Биотехнология,- 20Ю.-№2.- С.59-64.

3. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р., Акулова Н.И. Очистка рекомбинантного белка TBI - антигена ВИЧ// Биотехнология. - 2010. -№4. -С.65-68.

4. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р., Каплина О.Н., Карпенко Л.И., Акулова Н.И., Рослякова Е.Ю. Иммунологическая характеристика вакцины КомбиВИЧвак против ВИЧ/СПИД. Совершенствование способов получения // Вест. Урал. мед. академ. науки. - 2010. - №2\1 (29). - С. 245. - (Тематич. вып. по аллергологии и иммунологии).

5. Волосникова Е.А. Исследование процесса образования конъюгатов для создания вакцинных конструкций// Бюллетень Сибирского

отделения Российской академии медицинских наук. - 2011. - Т.31. - №6. -С.141-145.

6. Волосникова Е.А., Лебедев J1.P., Акулова Н.И., Рослякова Е.Ю. Очистка рекомбинантного белка TBI как компонента нановакцины против ВИЧ/СПИД. [Электронный ресурс]//Биотехнология и биомедицинская инженерия: Сб. тр. 3-й Всерос. науч.- практич. конф. с междунар. участием, посвященной 75- летию Курского мед. ун-та/под ред. проф. В.А. Лазаренко [и др.] - Курск, 2010.- С. 45-47.

7. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р. Усовершенствование процесса очистки рекомбинантного белка TBI - компонента вакцины против ВИЧ//Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока: Сб. тр. 1-й Всерос. науч.- практич. конф. - Улан-Удэ, 2010.- с. 170172.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 133 страницах, состоит из 7 разделов: «Общая характеристика работы», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Библиографический список» и «Приложения». Работа содержит 26 рисунков, 10 таблиц. Библиография представлена 236 источниками отечественных и зарубежных авторов.

Личный вклад автора

Лично соискателем были проведены теоретические расчеты и получена основная часть экспериментальных результатов: выделение и очистка рекомбинантного белка TBI, масштабирование процесса выделения белка, конъюгация белка TBI с полимерами, получение связанных частиц конъюгата белка TBI с дсРНК, выделение и очистка плазмидной ДНК TCI, физико-химические исследования белка TBI, его конъюгата и вакцинной

конструкции. Кроме того, соискатель принимал участие в изготовлении 5 серий вакцины КомбиВИЧвак для доклинических и первой фазы клинических испытаний.

Часть II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Способы создания вакцинных препаратов, особенности получения вакцин против ВИЧ/СПИД

Вирус иммунодефицита человека был открыт в 1983 году в результате исследования этиологии СПИД. Первыми официальными научными сообщениями о СПИД стали две статьи о необычных случаях развития пневмоцистной пневмонии и саркомы Капоши у мужчин - гомосексуалов, опубликованные в 1981 [95, 96]. Один из его первооткрывателей Р. Галло высказал предположение, что вакцина против ВИЧ-инфекции/СПИД будет создана уже в течение 2 последующих лет. Однако этот оптимистический прогноз не оправдался. Хотя первые клинические испытания кандидатных вакцин против СПИД были начаты в США уже в 1987 г. [13], эффективного вакцинного препарата не создано до сих пор. По оценке Объединённой программы ООН по ВИЧ/СПИД (ЮНЭЙДС) и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), с 1981 по 2006 от болезней, связанных с ВИЧ-инфекцией и СПИД умерли 25 миллионов человек. Таким образом, �