Особенности иммунного ответа, индуцированного комбинированной ДНК-белковой вакциной КомбиВИЧвак

Ужаченко, Роман Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности иммунного ответа, индуцированного комбинированной ДНК-белковой вакциной КомбиВИЧвак
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Особенности иммунного ответа, индуцированного комбинированной ДНК-белковой вакциной КомбиВИЧвак"

На правах рукописи

М-

004694660

Ужаченко Роман Владимирович

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА, ИНДУЦИРОВАННОГО КОМБИНИРОВАННОЙ ДНК-БЕЛКОВОЙ ВАКЦИНОЙ КомбиВИЧвак

03.02.02 - «вирусология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Кольцово-2010

- з МЮН 2010

004604660

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель

доктор биологических наук Карпенко Лариса Ивановна Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Евстропов Александр Николаевич доктор биологических наук, профессор Гуляева Людмила Федоровна

Ведущая организация

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится « 4 » июня 2010 года в J часов на заседании диссертационного совета при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан апреля 2010 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

Л.И. Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Синдром приобретенного иммунодефицита человека (СПИД), вызываемый вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), впервые был зарегистрирован в 1981 г. [Gottlieb, 1981]. Высокая скорость и пандемическое распространение заболевания, а также взрывной характер манифестации ВИЧ-инфекции заставляют искать способы ее лечения и профилактики.

Современная высокоактивная антиретровирусная терапия, включающая комплекс противовирусных препаратов, позволяет увеличить продолжительность жизни ВИЧ-инфицированного, но не обеспечивает его полного выздоровления. В связи с этим, актуальным является создание эффективной вакцины, которая позволила бы ограничить циркуляцию и накопление ВИЧ-1 в популяции.

Одним из наиболее перспективных направлений при создании вакцины против ВИЧ-инфекции является дизайн искусственных полиэпитопных иммуногенов, которые включают иммунологически значимые консервативные эпитопы из разных вирусных белков [Eroshkin et al., 1995]. При этом исключение из списка эпитопов антигенных детерминант, обладающих иммунопатогенным действием, позволяет значительно увеличить безопасность полиэпитопных вакцин. В настоящее время разработаны иммуногены данного типа как для индуцирования антител [Cai et al., 2007; Eroshkin et al., 1995; Kumar et al., 1994], так и ответа цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) [Alexander et al., 2002; Bazhan et al., 2004; Gomez et al., 2004; Karpenko et al., 2004].

В ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" (р.п. Кольцово, Новосибирская обл.) были получены две полиэпитопные конструкции, направленные на формирование гуморального (TBI) и клеточного (TCI) иммунного ответа. Первый из них, TBI (Т and В cell immunogene), содержит пять В-клеточных и четыре Т-хелперных эпитопов из белков env и gag ВИЧ-1 [Eroshkin et al. 1995] и способен индуцировать у животных гуморальный ответ против антигенов ВИЧ-1 [Karpenko et al., 2003; Loktev et al., 1996]. Другой полиэпитопный белок, TCI (Т cell immunogene), был разработан Бажаном С.И. с соавт. в качестве поли-ЦТЛ-вакцины [Bazhan et al., 2004]. В структуру белка (длина 392 а.о.) были включены более 80 перекрывающихся CD8+ ЦТЛ- и CD4+- Т-хелперных эпитопов из Gag, Env, Pol и Nef [Bazhan et al., 2004]. При иммунизации ДНК-вакциной pcDNA-TCI наблюдалось появление у мышей клонов специфических Т-лимфоцитов, отвечающих продукцией ИФНгамма при их рестимуляции специфическими пептидами [Karpenko et al., 2004].

Для доставки TBI- и TCI-иммуногенов были предложены искусственные вирусоподобные частицы (ВПЧ), полученные Лебедевым Л.Р. с соавт. [Lebedev et al.,

2000]. Поверхность ВПЧ содержит поверхностный белок TBI, что обеспечивает его эффективную презентацию B-клеткам. Кроме того, полиглюкиновая оболочка ВПЧ способна защищать ДНК, включенные в состав частиц, от действия окружающих нуклеаз, в результате чего доставка ДНК-вакцин с ВПЧ к антиген-представляющим клеткам (АПК) является более эффективной [Lebedev et al., 2000; Karpenko et al., 2003].

Ранее на основе технологии искусственных ВПЧ нами была получена кандидатная полиэпитопная вакцина против ВИЧ-инфекции, содержащая рекомбинантный белок TBI и ДНК-вакцину pcDNA-TCI и названная комбинированной анти-ВИЧ-вакциной (КомбиВИЧвак) [Karpenko et al., 2007]. Было показано, что двукратная иммунизация КомбиВИЧвак вызывает образование нейтрализующих антител и ВИЧ-специфических Т-лимфоцитов у мышей [Karpenko et al., 2007].

Между тем, оставалось неизученным, способны ли два полиэпитопных иммуногена взаимно влиять друг на друга при индукции иммунного ответа. В настоящее время существует ряд примеров комбинированных вакцин - вакцина против столбняка, дифтерии и коклюша [Mawas et al., 2006], вакцина против краснухи, паротита, кори и ветряной оспы [Ovsyannikova et al., 2007] и ряд других. Взаимное влияние между антигенами при их комбинировании было показано для вакцин, полученных на основе как различных патогенов, так и одного и того же вирусного агента [Clemens et al., 1995; Zeng et al., 2009]. При этом заранее предсказать характер взаимодействия (синергизм, антагонизм, нейтральное взаимодействие) между отдельными компонентами в комбинированной вакцине практически невозможно. В этой связи, актуальной задачей является оценка взаимного влияния белка TBI и ДНК-вакцины pcDNA-TCI в составе вакцины КомбиВИЧвак, чтобы исключить ингибирующее действие компонентов вакцины на индуцируемый ими иммунный ответ.

Кроме того, до настоящего времени было неизвестно, на протяжении какого времени плазмидная ДНК, доставляемая вместе с КомбиВИЧвак, присутствует в органах иммунизированных животных. Ранее в ходе доклинических испытаний не было обнаружено долговременных биохимических, физиологических и морфологических изменений, что позволило сделать первичные выводы о безопасности КомбиВИЧвак [Karpenko et al., 2007]. Задача, касающаяся исследования времени элиминации плазмидной ДНК из организма, является актуальной, т.к. проблема безопасности генетической иммунизации остается одним из критических вопросов при переходе от доклинических к клиническим испытаниям.

Целью данной работы было изучение взаимного влияния полиэпитопных иммуногенов TBI и TCI на индукцию иммунного ответа в составе комбинированной

бивалентной ДНК-белковой вакцины КомбиВИЧвак, а также оценка распределения плазмиды pcDNA-TCI, компонента КомбиВИЧвак, в органах иммунизированных животных.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Изучить характер взаимного влияния (синергизм, антагонизм, нейтралитет) между компонентами комбинированной вакцины в отношении индукции гуморального и клеточного ответов.

• Разработать протокол для определения плазмиды pcDNA-TCI в органах иммунизированных животных.

• Исследовать кинетику распределения плазмиды pcDNA-TCI, компонента КомбиВИЧвак, в органах иммунизированных животных.

Научная новизна н практическая ценность работы. В данной работе впервые было показано, что иммунный ответ, вызываемый комбинированием двух полиэпитопных иммуногенов (рекомбинантным белком TBI и ДНК-вакциной TCI) обусловлен их взаимным влиянием, а именно: TCI вызывает увеличение TBI-индуцируемого гуморального ответа и усиливает дифференцировку ТЪ2-лимфоцитов.

Доставка ДНК-вакцины pcDNA-TCI с помощью КомбиВИЧвак сопровождается первоначальным накоплением плазмидной ДНК в большинстве исследованных нами органах (до 14 сут.), но далее наблюдается градиентное снижение концентрации pcDNA-TCI вплоть до уровня ниже достоверной детекции во всех изученных органах.

Разработан высокочувствительный метод для определения с помощью РТ-ПЦР ДНК-плазмиды pcDNA-TCI в органах мышей, иммунизированных вакциной КомбиВИЧвак. Протокол включен в состав научно-технической документации на вакцину КомбиВИЧвак.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. ДНК-вакцина pcDNA-TCI, компонент КомбиВИЧвак, усиливает гуморальный ответ, вызываемый рекомбинантным белком TBI, белковым компонентом КомбиВИЧвак.

2. ДНК-вакцина pcDNA-TCI в составе КомбиВИЧвак обладает иммуномодулирующим действием и вызывает пролиферацию Th2-лимфоцитов.

3. Содержание ДНК-вакцины pcDNA-TCI в тканях иммунизированных животных градиентно снижается после одно- и двукратной иммунизации КомбиВИЧвак вплоть до полной элиминации из тканей к 60 сут. после последнего введения. Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 6

статей. Материалы диссертации были представлены на четырех Международных

конференциях: "Биотехнология и медицина" (Москва, Россия, 2006), 8th John Humphrey advanced summer programme in immunology: Immunology and viral infections (Moscow, Russia, 2007), "Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития" (Алматы, Казахстан, 2008), 1st International FEBS Summer School on "Pathogen-Host Interplay" (Berlin-Potsdam, Germany, 2008); и двух российских конференциях: III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006), XI Всероссийский научный форум с международным участием им. В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, Россия, 2007).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, включая 17 рисунков и 1 таблицу, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (198 наименований).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В настоящей работе были изучены свойства КомбиВИЧвак, комбинированной вакцины против ВИЧ-инфекции, полученной на основе рекомбинантного белка . TBI и ДНК-вакцины pcDNA-TCI. Дизайн вакцины был проведен с применением технологии искусственных вирусоподобных частиц (ВПЧ) (рис. 1), предложенной сотрудником ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Лебедевым Л.Р. [Karpenko et al., 2007; Lebedev et al., 2000]. Ранее было показано, что КомбиВИЧвак вызывает секрецию ИЛ-2, ИФНгамма и ИЛ-4 спленоцитами иммунизированных мышей, а также образование антител, обладающих вируснейтрализующими свойствами [Karpenko et al., 2007]. В то же время, оставалось неизвестным, насколько оптимальным является включение двух иммуногенов в состав единой конструкции.

Взаимное влияние основных компонентов КомбиВИЧвак, рекомбинантного белка TBI и ДНК-вакцины pcTCI, было оценено с использованием ИФА и теста ELISpot. В отличие от КомбиВИЧвак, контрольные конструкции ВПЧ были созданы в трех вариантах: 1) конструкция, которая содержала белок TBI, но вместо плазмиды pcDNA-TCI векторную плазмиду pcDNA3.1 (БПЧ-TBI-pcDNA); 2) ВПЧ, которые содержали только плазмиду pcDNA-TCI без белка TBI (ВПЧ-pcDNA-TCI); 3) конструкция, содержащая только векторную плазмиду pcDNA3.1 (ВПЧ-pcDNA) (рис. 1).

Гуморальный ответ

Двукратная иммунизация мышей вакцинными конструкциями, содержащими специфические иммуногены TCI и TBI, сопровождалась образованием ВИЧ-специфичес-

■ Контроль

■ КомбиВИ'-Ьак

□ БГР+TBI-pcDNA

□ ВПЧ-pcDNA-TCI

□ ВГМ-pcDNA

(А)10000 8000 5 6000

£ 4000 а

ь 2000

о -

14 21 28 35 42 62

Дней после иммунизации

КомбиВИЧвак ВПЧ-pcDNA-TCI БПЧ-TBI-pcDNA ВПЧ-pcDNA

Рис. 1. Иммуногеные конструкции на основе технологии искусственных ВПЧ, которые были использованы для иммунизации. КомбиВИЧвак (ВПЧ-TBI-pcDNA-TCI) является бивалентной ДНК/белковой ВИЧ-1 вакциной, содержащей TCI- и ТВ1-иммуногены; ВПЧ-pcDNA-TCI - ДНК вакцина pcDNA-TCI, кодирующая иммуноген TCI (выделено красным цветом); БПЧ-TBI-pcDNA - вакцина, несущая иммуноген TBI и векторную плазмиду pcDNA3.1; ВПЧ-pcDNA - конструкция, содержащая только векторную плазмиду pcDNA3.1 (отрицательный контроль).

Рис. 2. Титр антител в плазме крови мышей ВАЬВ/с, иммунизированных

КомбиВИЧвак, BПЧ-pcDNA-TCI, ВПЧ-ТВ1-рсОЫА, BПЧ-pcDNA (контрольная группа) I или 0.9% КаС1 (неиммунизированная группа). Животные были иммунизированы на 0 и 28 сут. Кровь была отобрана на 14, 28, 35. 42, и 62 сутки после иммунизации. Сыворотка крови была изучена в ИФА с использованием рекомбинантного белка ТВ1 (А) и лизата ВИЧ-1 ЕУК (Б). Результаты представлены в виде среднего значения титра + среднестатистическое отклонение (п = 5).

ких IgG, однако величина гуморального ответа у мышей из разных групп различалась. Максимальный уровень IgG, регистрируемый при иммунизации кандидатной вакциной КомбиВИЧвак, значительно превышал соответствующие показатели при введении конструкций, содержащих только один из иммуногенов (БПЧ-TBI-pcDNA, либо ВПЧ-pcDNA-TCI). Данные были получены в ИФА при использовании в качестве антигена рекомбинантного белка TBI (рис. 2А) и лизата ВИЧ-1 (рис. 2Б). В группе мышей, иммунизированных ВПЧ-pcDNA (отрицательный контроль), величина гуморального ответа была на уровне фоновых значений неиммунизированных мышей, которым вводился физиологический раствор (рис. 2). Таким образом, специфические иммуногены, белок TBI и плазмида pcDNA-TCI, в составе комбинированной конструкции ВПЧ-ТВ1-pcDNA-TCI (КомбиВИЧвак) оказывали синергический эффект на продукцию антител, уровень которых значительно превышал ответы, наблюдаемые при иммунизации конструкциями, содержащими только один из иммуногенов.

Дополнительным изученным параметром было соотношение IgGl/IgG2a, характеризующее отклонение иммунного ответа в сторону пролиферации Thl, либо Th2. Определение IgGl- и ^02а-антител в сыворотке мышей, иммунизированных КомбиВИЧвак, проводилось методом ИФА с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка TBI (1 мкг/мл). Оказалось, что контрольная конструкция ВПЧ-TBI-pcDNA3.1 индуцирует IgGl и IgG2a приблизительно в одинаковых количествах, так что значение IgGl/IgG2a для ВИЧ-ТВI-pcDNA3.1 ненамного отклоняется от 1, как и в случае неиммунизированных животных (рис. 3). В то же время, иммунизация КомбиВИЧвак сопровождалась отклонением значения коэффициента IgGl/IgG2a в сторону преимущественного синтеза IgGl (в среднем, > 2) и достоверно превышало величину соответствующего параметра для БПЧ-TBI-pcDNA (рис. 3).

Таким образом, совместное включение двух полиэпитопных иммуногенов, рекомбинантного белка TBI и ДНК-вакцины pcDNA-TCI, сопровождается синергичным усилением гуморального ответа на антигены ВИЧ-1. Кроме того, pcDNA-TCI не только усиливает синтез ВИЧ-специфических антител, но и обладает модулирующим действием, вызывая преимущественное отклонение дифференцировки ThO в сторону Th2.

Клеточный ответ

Т-клеточный ответ был оценен в тесте ELISpot для конструкций, содержащих как оба антигена (КомбиВИЧвак, или ВПЧ-TBI-pcDNA-TCI), так и каждый иммуноген в отдельности (БПЧ-TBI-pcDNA и ВПЧ-pcDNA-TCI). В качестве антигенов для специфической стимуляции выброса цитокинов использовали пептиды N15 (DRVIEVVQGAYRAIR) и N16 (KQIINMWQEVGKAMYA). Данные пептиды могут

презентироваться различными аллелями молекул МНС I (H-2d,p,u,q/H-2a,b,f) [Shirai et al., 1996] и МНС II (H-2b,k/H-k,d,s) мышей [Ahlers et al., 2001] и представляться, таким образом, CD8+ ЦТЛ и CD4+ Т-хелперам.

Из данных, представленных на рис. 4, видно, что иммунизация мышей конструкциями, содержащими ген TCI (ЕШЧ-TBI-pcDNA-TCI и ВПЧ-pcDNA-TCI) индуцирует Т-клеточный ответ на 7 сут. после реиммунизации. В группах животных,

Рис. 3. Титр антител IgGl и IgG2a (А) и их соотношение (Б) в сыворотке крови мышей BALB/c, иммунизированных КомбиВИЧвак, БПЧ-TBI-pcDNA или 0.9% NaCl (контроль, неиммунизированная группа). Животные были иммунизированы на 0 и 28 сутки. Сыворотка крови была получена на 35 сутки после иммунизации и изучена в ИФА, где в качестве антигена для сорбции был использован рекомбинантный белок TBI (1 мкг/мл). Титр антител был определен как последнее разведение, достоверно отличающееся от контроля конъюгата в ряду 2-кратных разведений. Используемые антитела к IgGl и IgG2a были конъюгированы с щелочной фосфатазой (Sigma). Результаты представлены в виде среднего значения реципрокного титра + среднестатистическое отклонение (п = 5). Титр IgGl- и IgG2a-aHTHTen в контрольной группе (неиммунизированные животные) обладал низким значением и, в среднем, составлял 1/215±45.

иммунизированных БПЧ-TBI-pcDNA и ВПЧ-pcDNA, клеточный ответ был на уровне отрицательного контроля (группы неиммунизированных животных, которым вводился физиологический раствор). При этом в случае иммунизации вакцинными конструкциями ВПЧ-TBI-pcDNA-TCI и ВПЧ-pcDNA-TCI клеточный ответ (секреция ИФНгамма и ИЛ-2) практически не различался. Это означает, что в отличие от стимуляции гуморального иммунного ответа, в случае индукции Т-клеточного ответа компоненты TCI и TBI комбинированной вакцины БПЧ-TBI-pcDNA-TCI не вызывают синергического эффекта. Вероятно, это связано с тем, что основной вклад в индукцию Т-клеточного ответа вносит иммуноген TCI, поскольку он содержит более 80-ти клеточных эпитопов (как CD8+ ЦТЛ, так и CD4+ Th) [Bazhan et al., 2004]. Поэтому в случае индукции Т-клеточного иммунитета вакцинными конструкциями БПЧ-TBI-pcDNA-TCI и ВПЧ-pcDNA-TCI основной иммуногенный потенциал сосредоточен в белке TCI.

Между тем, выброс ИЛ-4 спленоцитами был достоверно более высоким в случае КомбиВИЧвак по сравнению с ВПЧ-pcDNA-TCI и БПЧ-TBI-pcDNA (рис. 4). Таким образом, иммуногены TBI и TCI оказывают синергичное действие на продукцию Т-лимфоцитами ИЛ-4, который является, наряду с ИЛ-13 [Romagnani, 2000], центральным цитокином, усиливающим продукцию антител. Возможным объяснением усиления секреции антител, ИЛ-4 и отклонения иммунного ответа в сторону ТЪ2-лимфоцитов при включении TBI- и TCI-иммуногенов в состав КомбиВИЧвак является присутствие Th-эпитопов в составе белка TCI [Bazhan et al., 2004]. Кроме того, на С-концевой последовательности TCI имеется специальный тетрапептидный мотив из С-терминальной последовательности белка LAMP, потенциально способный направлять деградацию искусственного белка по лизосомальному пути. Это, в свою очередь, будет способствовать высвобождению Th-эпитопов, увеличению их презентации молекулами МНС II и, как следствие, усилению гуморального ответа.

Изучение кинетики распределения ДНК-вакцииы pcDNA-TCI в органах мышей, иммунизированных КомбиВИЧвак

Изучение распространения плазмиды при ДНК-иммунизации является необходимым аспектом доклинических испытаний, поскольку позволяет оценить длительность присутствия чужеродной ДНК в тканях иммунизированных животных. Считается, что чем больше плазмидная ДНК присутствует в клетках, тем больше вероятность ее встраивания в геном реципиентов. В свою очередь, интеграция чужеродной ДНК в хромосомы человека может приводить к появлению мутаций в кодирующих и регуляторных последовательностях генома. Вместе с тем, эксперименты на

лабораторных животных свидетельствуют о том, что встраивание в хромосомы плазмидного материала при ДНК-вакцинации не происходит [Ramirez et al, 2008; Liu et al., 2007; Tuomela et al., 2005]. Оценка распределения плазмиды в органах животных входит в перечень обязательных тестов на этапе доклинических испытаний ДНК-вакцины [Medjitna et al., 2006; Ramirez et al., 2008; Robertson, Griffiths, 2006]. С целью изучить кинетику элиминации pcDNA-TCI в органах животных, иммунизированных КомбиВИЧвак, нами был использован метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР).

Данная часть исследования включала несколько этапов: 1) подбор оптимальных условий реакции РТ-ПЦР (праймеры, зонды, компоненты буфера, температурный профиль реакции) для детекции разных количеств плазмиды pcDNA-TCI; 2) нормирование количества геномной ДНК в образцах органов иммунизированных животных; 3) анализ распределения плазмиды в тотальной ДНК, выделенной из органов животных, которые были иммунизированы КомбиВИЧвак.

Для контроля персистенции плазмиды в органах иммунизированных животных нами был выбран ПЦР в реальном времени, поскольку этот метод позволяет количественно определить число копий экзогенной ДНК в тотальной ДНК клеток-хозяев [Coelho-Castelo et al., 2006; Leamy et al., 2006; Loots et al., 2006; Orsâg et al., 2008]. С этой целью нами были подобраны две пары праймеров, специфичные к последовательности гена TCI:

1 -й прямой 5-AGG GAG СТА GAA CGA TTC GC-3'

1-й обратный 5-TGT CCA GAA TGC TGG TAG GG -3'

2-й прямой 5'-СТТ GCT САА TGC САС AGA СА-3'

2-й обратный 5-TGC АТС АСС САС АТС GAGТА-3'

Дизайн оригинальных последовательностей олигонуклеотидов был проведен с использованием программы "Primer Express" (Applied Biosystems). Указанные пары праймеров были использованы совместно с интеркалирующим красителем SYBERGreen, величина флуоресцентного сигнала которого является пропорциональной количеству дуплексной ДНК и возрастает в ходе ПЦР. Вариант использования праймеров с интеркалирующим красителем SYBERGreen обладает рядом преимуществ и позволяет значительно сократить затраты на проведение ПЦР, т.к. не требует дополнительного синтеза олигонуклеотидных зондов и использования глушителя флуоресценции. Это является особенно важным, когда реакция ПЦР применяется для большого числа образцов геномной ДНК.

КомбиВИЧвак

БПЧ-TBI-pcDNA

ВПЧ-pcDNA-TCI

Неиммунизированные мыши

■ 15+16 в GST-TCIn Контроль

(Б)

И 1 «

КомбиВИЧвак

БПЧ-TBI-pcDNA

ВПЧ-pcDNA

ВПЧ-pcDNA-TCI

Неиммунизированные мыши

115+16 a GST-TCIn Контроль |

1 т

1 к

КомбиВИЧвак

ВПЧ-TBI-pcDNA

ВПЧ-pcDNA

ВПЧ-pcDNA-TCI Неиммунизированные

115+16 a GST-TCIn Контроль

Рис. 4. ИЛ-2-ELISPOT (А), ИЛ-4-ELISPOT (Б), ИФНу-ELISPOT (В) ответы спленоцитов мышей BALB/c, имунизированных препаратами КомбиВИЧвак, ВПЧ-pcDNA-TCI, ВПЧ-TBI-pcDNA, ВПЧ-pcDNA (контрольная группа) или 0.9% NaCl (группа неиммунизированных животных) на 7 сут. после второй иммунизации. Для всех животных спленоциты были раздельно рестимулированы in vitro смесью пептидов N15 и N16, рекомбинантным белком GST-TCI и полипептидом ЕНЕС в качестве отрицательного контроля. Результаты представлены в виде среднего числа цитокин-продуцирующих колоний на 5x105 спленоцитов + среднестатистическое отклонение.

В результате проведенных исследований было показано, что превышение сигнала, принятого за пороговый уровень флуоресценции (threshold level), наблюдалось нами уже на стадии 20-22 циклов как в случае первой, так и второй пары праймеров (рис. 5, А и Б). Таким образом, данные олигонуклеотиды неспецифично "отжигались" на геномной ДНК мыши.

Для того чтобы повысить специфичность реакции, нами был проведен дизайн новой пары праймеров с учетом того, что эти нуклеотиды будут использованы совместно с флуоресцентным зондом, меченым красителем Tamra. При дизайне оригинальных последовательностей третьей пары праймеров и зонда с использованием программы "Primer Express" (Applied Biosystems) были выбраны следующие последовательности олигонуклеотидов:

3-й прямой 5-AGG GCT ААТ ТСА СТС ССА АС-3'

3-й обратный 5-TGG ТСС TGG TGT GTA GTT С-3'

Зонд (5,6)-Tamra-5'-TCC TTG АТС TGT GGA ТСТ АСС АСА САС A-3'-BHQ2.

Как видно на рис. 6, при проведении ПЦР с данной парой праймеров не наблюдалось репортерной флуоресценции в образцах, содержащих ту же геномную ДНК, что и в предыдущих экспериментах. В связи с отсутствием "фоновой" флуоресценции третья пара праймеров была использована для определения ДНК-компонента вакцины КомбиВИЧвак, плазмиды pcDNA-TCI в органах иммунизированных животных.

Первоначальный протокол был модифицирован по нескольким параметрам: концентрация ионов магния, температура отжига праймеров и зонда, буфер, концентрация детергента NP-40. Влияние этих факторов было изучено на различных кратных разведениях плазмиднои ДНК pcDNA-TCI (Ю'-Ю1 копий плазмиды). В результате проведенных исследований было показано, что оптимизированный протокол для детекции различных количеств плазмиды pcDNA-TCI имеет следующий вид: КС1-буфер, 0,08% NP-40, 0,3 мМ MgCl2, 90 мкМ праймеров и 22 мкМ флуоресцентного зонда. Объем одной пробы составляет 25 мкл. Температурный профиль ПЦР-реакции состоит из повтора следующих циклов: 5 мин hot-старт (95°С) и 35-50 циклов, каждый из которых включает 25 сек, 95°С; 15 сек, 58°С; 15 сек, 65°С; 15 сек, 72°С.

При использовании данного протокола было показано, что порог чувствительности данной реакции (величина, определенная как разведение плазмиды, при котором кинетическая кривая накопления ампликонов не отличается от соответствующей кривой для следующего разведения) составляет юМо1 копий pcDNA-TCI (рис. 7).

Цикл амплификации

Рис. 5. Кинетические кривые накопления ампликонов, полученные для первой (А) и второй (Б) пар праймеров (структура - см. текст), специфичных к последовательности гена ТС1.

Результаты были получены для препаратов геномной ДНК (б) неиммунизированных мышей (в данном случае - геномная ДНК из мышечной ткани). В качестве контроля был использован раствор плазмидной ДНК (103 копий рсЭКА-ТСГ, что соответствует 7 нг плазмиды) (а). Результат для каждого образца был получен в дублях.

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Цикл амплификации

Рис. 6. Кривые накопления ампликонов, полученные для третьей пары праймеров (структура - см. текст).

Результаты были получены для препаратов геномной ДНК (а) неиммунизированных мышей (в данном случае - геномная ДНК из мышечной ткани). В качестве контроля был использован раствор плазмидной ДНК (103 копий рсОЫА-ТС[, что соответствует 7 нг плазмиды) (б). Результат для каждого образца был получен в дублях.

10 102 копий 0' К01 сопий ч ий ^ ".....- /

11 I5 кого й ч ^

10 1 копи \ ч ч А V ' / / у

12,54 / // /

'—'

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цикл амлификации

Рис. 7. Зависимость кинетики накопления ампликонов фрагмента плазмиды рсЭКЛ-ТО от концентрации вносимой в ПЦР-смесь матрицы. В эксперименте были использованы различные разведения плазмидной ДНК (10 -101 копий/пробу). Результат для каждого образца был получен в дублях.

Следующим этапом данной работы было определение количества геномной ДНК в каждом образце, полученном из органов иммунизированных и контрольных (неиммунизированных) животных. С этой целью нами был использован известный протокол для определения ампликонов гена домашнего хозяйства мыши Ро12: F 5'-ССТ ААС СТА ТСС ATT GAC CAA GTG-3', R 5'-AAG GGT GTG АСА АТС ТСТ GC-3' и олигонуклеотидная проба 5'-((5,6)-Tamra)-TGC ССС GCT CCA TTG CTG CCA-3'-BHQ2, меченная флуоресцентным красителем [Naumenko et al., 2008]. Условия реакции: 1 цикл (3 мин 95°), 36 циклов (10 сек, 95°, 30 сек, 59°, 15 сек, 72°). Концентрации реагентов в ПЦР-смеси: MgCh - ЗмМ, ДНК-зависимая ДНК-полимераза - 1,711/реакция, dNTP - 0,25 мМ, олигонуклеотидные праймеры - 0,6мкМ, олигонуклеотидная проба - 0,ЗмкМ, буфер с добавлением KCl - однократный.

Как видно на рис. 8, кинетика накопления ампликонов для эквивалетного количества геномной ДНК из каждого образца была одинаковой. Таким образом, данные препараты ДНК являются одинаковыми по своим свойствам и могут бьтть использованы для РТ-ПЦР плазмидной ДНК.

Цикл амплификации

Рис. 8. Амплификационные кривые для образцов геномной ДНК, выделенной из органов иммунизированных и неиммунизированных животных.

В качестве маркера для контроля количества геномной ДНК был использован ген Pol II мыши. В каждую ПЦР-смесь был добавлен 1 мкг препарата тотальной геномной ДНК. В качестве примера на данном графике представлены кривые, полученные для следующих органов мышей, иммунизированных КомбиВИЧвак: мышцы (а), печень (б), селезенка (в), семенники (г), кожа (е), а также контрольных (неиммунизированных) животных (мышцы, д). Результат для каждого образца был получен в дублях.

На заключительном этапе работы оптимизированный протокол РТ-ПЦР был использован для определения числа копий плазмиды рсБЫА-ТО в органах животных, иммунизированных одно- и двукратно КомбиВИЧвак. В каждую реакционную смесь добавлялся 1 мкг геномной ДНК, количество которой определялось спектрофотометрически и с помощью РТ-ПЦР. В качестве примера на рис. 9 представлены кинетические кривые изменения флуоресценции, полученные для препаратов геномной ДНК из мышечной ткани животных на разные сроки после иммунизации КомбиВИЧвак.

В результате проведенных исследований нами было показано, что при однократном введении КомбиВИЧвак во всех изученных органах количество плазмидной ДНК убывало в постиммунизационный период вплоть до ее полного исчезновения на 60 сут. после иммунизации (рис. 10). Динамика элиминации плазмиды роБКА-ТО в органах мышей при двукратном введении КомбиВИЧвак была аналогичной (рис. 11). Следует отметить, что наибольшее число копий плазмидной ДНК было зарегистрировано в мышечной ткани и коже (пиковые значения - 106-107 копий рсОКА-ТС1/1 мкг геномной ДНК) (рис. 11).

Цикл амплификации

Рис. 9. Примеры типичных кинетических кривых, полученных для образцов геномной ДНК из органов животных на различные сроки иммунизации КомбиВИЧвак: мышцы 7 (а), 14 (г), 49 (б), 56 (е) и 88 (ж) сут.; кожа (в) и селезенка (д) 7 сут. после 1-ого введения вакцины. При изучении геномной ДНК из препаратов органов неиммунизированных (контрольных) животных не было обнаружено "фонового" образования ампликонов (см. рис. 9 и разд. 3.2.1).

Это связано, прежде всего, с тем, что местом введения КомбиВИЧвак были мышцы. В то же время, часть введенной внутримышечно вакцины может попадать в кровоток, либо

транспортироваться вместе с антигенпредставляющими клетками в лимфатические узлы и селезенку. Это позволяет объяснить, почему рсОКА-ТС1 может быть детектирована в печени и селезенке, хотя и в гораздо более низком содержании (103-105 копий рсИКА-ТС1/1 мкг геномной ДНК) по сравнению с кожей и мышцами (рис. 11).

Таким образом, 2-кратная иммунизация лабораторных мышей КомбиВИЧвак сопровождается распределением ДНК-вакцины рсОЫА-ТС1, входящей в состав КомбиВИЧвак, в органах животных, но убывает со временем и исчезает совсем на 60 сут. после 2-ого введения вакцины. Кроме того, важно отметить, что ДНК-вакцина достаточно быстро элиминируется из семенников, что снижает возможность передачи через клетки герминативных тканей. Исходя из этого, вероятность интеграции плазмиды рсБЫА-ТС1 является минимальной, что говорит в пользу биологической (и, в частности, генетической) безопасности КомбиВИЧвак.

Рис. 10. Динамика распределения плазмиды рсОКА-ТО, компонента КомбиВИЧвак, в органах мышей, иммунизированных однократно КомбиВИЧвак.

Результаты представлены в виде среднего значения числа копий плазмиды рсОКА-ТС1/1 мкг геномной ДНК + среднестатистическое отклонение (п = 5). Плазмидная ДНК не детектировалась в органах неиммунизированных (контрольных) животных, в связи с чем данные по ее распределению в органах не отражены на рисунке. Ось абсцисс - сутки после иммунизации, ось ординат - ^10 количества копий плазмиды рсБКА-ТС!.

Селезенка

14 21 28 35 42 49 56 62 70 77

Сутки после иммунизации

14 21 20 35 42 4 9 56 62 70 77

Сутки после иммунизации

~ X

§ 1

5 ь-

О ^

* 2

я „

5 г!

а О

г н

2 <

ел 2;

° а

и 21 28 35 42 49 М 62 70 77

Сутки после иммунизации

Рис. 11. Динамика распределения плазмиды рсОЫА-ТСЛ, компонента КомбиВИЧвак, в органах мышей, иммунизированных двукратно КомбиВИЧвак.

Результаты представлены в виде среднего значения числа копий плазмиды рсОКА-ТСГ/1 мкг геномной ДНК + среднестатистическое отклонение (п = 5). Иммунизация мышей КомбиВИЧвак проводилась на 0 и 28 сут. Плазмидная ДНК не детектировалась в органах неиммунизированных (контрольных) животных, в связи с чем данные по ее распределению в органах не отражены на рисунке. Ось абсцисс - сутки после иммунизации, ось ординат - 1о§10 количества копий плазмиды рсБКА-ТС!.

выводы

1. В составе вакцины КомбиВИЧвак плазмида pcDNA-TCI вызывает синергическое усиление гуморального ответа, индуцированного белком TBI.

2. Объединение TCI- и TBI-иммуногенов в составе КомбиВИЧвак вызывает поляризацию ответа Т-лимфоцитов в сторону Т-хелперов 2-го типа.

3. Разработан протокол для определения плазмиды pcDNA-TCI с помощью РТ-ПЦР в органах мышей, иммунизированных вакциной КомбиВИЧвак, который включен в состав научно-технической документации на вакцину КомбиВИЧвак.

4. Показано, что плазмида pcDNA-TCI после иммунизации вакциной КомбиВИЧвак (1 доза=75 мкг, или 1х1013 копий) распределяется в органах и тканях неравномерно. В первые 14 суток после иммунизации максимальное количество ДНК-плазмиды выявлялось в месте инъекции (мышцах и прилежащих слоях дермы, 107/мкг геномной ДНК) и было на 2-4 порядка выше, чем в других органах.

5. Содержание плазмиды pcDNA-TCI во всех исследованных тканях иммунизированных животных градиентно снижалось после одно- и двукратной иммунизации КомбиВИЧвак до элиминации из тканей к 60 сут. после последнего введения (уровень чувствительности - 10-100 копий плазмиды/пробу).

Основные результаты опубликованы в следующих работах:

Публикации в отечественных и зарубежных журналах

1. Bazhan S.I., Karpenko L.I., Lebedev L.R., Uzhachenko R.V., Belavin P.A., Eroshkin

A.M., Ilyichev A.A. A synergistic effect of combined bivalent DNA-protein anti-HIV-1 vaccine containing multiple T- and B-cell epitopes of HIV-1 proteins. Molecular immunology. 2008. V.45. P.661-9.

2. Миронов Г.Г., Ужаченко P.B., Гвоздев B.A. Влияние полиэпитопного Т-клеточного ВИЧ-1 иммуногена на гуморальный ответ, вызываемый искусственным В-клеточным ВИЧ-1 антигеном. Сравнительный анализ различных путей иммунизации. Сборник научных трудов "Достижения современной биотехнологии". Новосибирск, 2008. - С.140-7.

3. Karpenko L.I., Ilyichev А.А., Eroshkin A.M., Lebedev L.R., Uzhachenko R.V., Nekrasova N.A., Plyasunova O.A., Belavin P.A., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Zaitsev

B.N., Danilenko E.D., Masicheva V.I., Bazhan S.I. Combined virus-like particle-based polyepitope DNA/protein HIV-1 vaccine. Design, immunogenicity and toxicity studies. Vaccine. 2007. V.25. P.4312-23.

4. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Ерошкин A.M., Лебедев Л.Р., Ужаченко Р.В., Некрасова Н.А., Плясунова О.А., Белавин П.А., Серегин С.В., Данилюк Н.К., Даниленко Е.Д., Зайцев Б.Н., Масычева В.И., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Вакцина "КомбиВИЧвак", содержащая В- и Т-клеточные иммуногены ВИЧ-1. Доклады Академии наук. 2007. №4(413). С.553-556.

5. Бажан С.И., Карпенко Л.И., Ужаченко Р.В., Ильичев А.А. Новые направления конструирования вакцин против ВИЧ-1. Биопрепараты. 2007. №1(25). С.29-31.

6. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Ужаченко Р.В., Некрасова Н.А., Лебедев Л.Р., Агафонов А.П., Веремейко Т.А., Левагина Г.М., Даниленко Е.Д., Масычева В.И., Богрянцева М.П., Плясунова О.А., Ильичев А.А. Различные формы кандидатных вакцин против ВИЧ-1, несущих полиэпитопные иммуногены. Биопрепараты. 2006. №4(24). С.8-10.

Публикации в материалах всероссийских и международных конференций

1. Uzhachenko R.V. Immune response induced by Combined DNA/protein vaccine against HIV-1 administered by different pathways. 1st International FEBS Summer School on "Pathogen-Host Interplay", Berlin-Potsdam, Germany, July 20-27, 2008, p.65.

2. Ужаченко P.B., Л.И. Карпенко, С.И. Бажан, Л.Р. Лебедев, В.А. Гвоздев, Г.Г. Миронов, Н.С. Козлова, А.А. Ильичев. Особенности гуморального ответа, индуцируемого комбинированной вакциной против ВИЧ-инфекции.

Международная научно-практическая конференция "Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития", Алматы, Казахстан, 19-21 мая 2008 г., с.474-475.

3. А.А. Ilyichev, L.I. Karpenko, R.V. Uzhachenko, L.R. Lebedev, O.A. Plyasunova, E.D. Danilenko, V.I. Masycheva, S.I. Bazhan. Combined HIV-1 vaccine on the basis of polyepitope protein and DNA vaccine. Designing and preclinical trials. Workshop HIV vaccines. St. Petersburg, June 1-2,2007.

4. Ужаченко P.B., Карпенко Л.И., Бажан С.И., Лебедев Л.Р., Ильичев А.А. Образование антител различной специфичности зависит от способа введения комбинированной вакцины против ВИЧ-1. XI Всероссийский научный форум с международным участием им. В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", 28-31 мая 2007 г., Санкт-Петербург, Россия, с. 167.

5. Ilyichev А.А., Karpenko L.I., Uzhachenko R.V., Lebedev L.R., Bazhan S.I. Designing and preclinical trials of combined HIV-1 vaccine on the basis of polyepitope protein and DNA vaccine. 4th IAS Conference on HIV-1 pathogenesis, treatment and prevention incorporating the 19th ASHM Conference. July 22-25, 2007, Sydney, Australia, p.CDA030.

6. Uzhachenko R.V., Karpenko L.I., Lebedev L.R., Ilyichev A.A., Bazhan S.I. Synergistic effect of combined bivalent DNA-protein anti-HIV-1 vaccine containing multiple T- and B-cell epitopes of main HIV-1 proteins. 4th IAS Conference on HIV-1 pathogenesis, treatment and prevention incorporating the 19th ASHM Conference. July 22-25, 2007, Sydney, Australia, p.CDC008.

7. Uzhachenko R., Karpenko L., Lebedev L., Ilychev A., Bazhan S. Formation of antibody response with different repertoire depends on the administration way of the Combined DNA/protein HIV-1 vaccine. 8th John Humphrey advanced summer programme in immunology: Immunology and viral infections. September 10-14, 2007, Moscow, Russia, p.60.

8. Ужаченко P.B., Карпенко Л.И. Исследование иммуногенных свойств комбинированной вакцины против ВИЧ-инфекции. Московская международная конференция "Биотехнология и медицина", 14-17 марта 2006 г., Москва, Россия, с. 146-7.

9. Ужаченко Р.В., Карпенко Л.И. Сравнительный анализ иммуногенной активности полиэпитопных вакцин против ВИЧ-инфекции. Международная школа-конференция молодых ученых "Биотехнология будущего", 5-9 июня 2006 г., С.Петербург, Россия, с.92-3.

10. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Некрасова Н.А., Лебедев Л.Р., Белавин П.А., Серегин С.В., Данилюк Н.К., Левагина Г.М., Терещенко Т.А., Ужаченко Р.В., Ильичев А.А. Кандидатные вакцины против ВИЧ-1 на основе полиэпитопных белков. Международная конференция "Физико-химическая биология", 30 июля-3 августа 2006 г., Новосибирск, Россия, с.40.

11.Karpenko L., R. Uzhachenko, N. Nekrasova, Lebedev L., Veremeiko Т., Ilyichev A., Bazhan S. Designing and preclinical trials of combined HIV-1 vaccine on the basis of polyepitope protein and DNA vaccine. XVI International AIDS Conference, 13-18 August 2006, Toronto, Canada, р.АЗЗ.

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного технического университета 630092, г. Новосибирск, пр. К. Маркса,20, тел./факс (383) 346-08-57, ngtu@ngs.ru формат 60 х 84/16, объем 1.5 п.л., тираж 100 экз., заказ № 260, подписано в печать 29.04.10г.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Ужаченко, Роман Владимирович

Список принятых сокращений

Введение

Научная новизна и практическая ценность работы

Основные положения, выносимые на защиту

Публикации и апробация работы

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Строение, геном, жизненный цикл

1.2. ВИЧ-специфический иммунный ответ

1.2.1. Гуморальный ответ

1.2.2. Цитотоксический ответ

1.3. Современные подходы к созданию кандидатных вакцин против

ВИЧ-инфекции

1.3.1. Вакцины против ВИЧ-инфекции, направленные на формирование гуморального ответа

1.3.2. Получение вакцин на основе ЦТЛ-эпитопов ВИЧ

1.3.3. Полиэпитопные вакцины

1.3.4. Кандидатные ДНК-вакцины 33 1.3.4.1. Персистенция ДНК-вакцин в организме иммунизированных животных

1.3.5. Новые способы доставки вакцин и стратегии усиления иммунного ответа на антигены ВИЧ

1.3.6. Комбинированные вакцины

1.3.7. Вакцины против ВИЧ-1, разрабатываемые в ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор"

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы

2.2. Протокол иммунизации и схема эксперимента

2.3. Иммуноферментный анализ

2.4. Определение количества специфических цитокинпродуцирующих клеток в тесте ELISpot

2.5. Изучение персистенции ДНК-компонента вакцины

2.5.1. Получение образцов тканей и органов

2.5.2. Выделение ДНК из тканей и органов иммунизированных животных

2.5.3. Определение количества геномной ДНК мыши в образцах органов

2.5.4. Определение количества ДНК-компонента вакцины в образцах органов 52 2.6. Статистическая обработка результатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Оценка взаимного влияния компонентов вакцины

3.1.1. Гуморальный ответ

3.1.2. Клеточный ответ

3.2. Изучение персистенции ДНК-вакцины pcDNA-TCI в органах мышей, иммунизированных КомбиВИЧвак

3.2.1. Подбор условий для определения количества ДНК-компонента вакцины в органах иммунизированных животных

3.2.2. Измерение количества геномной ДНК в образцах органов иммунизированных и контрольных животных

3.2.3. Определение числа копий плазмиды pcDNA-TCI в органах иммунизированных животных 78 Заключение 87 Выводы 90 Список публикаций 91 Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ADE — antibody-dependent enhancement (антитело-зависимое усиление) CD - cluster of differentiation (кластер дифференцировки)

ELISpot - enzyme-linked immunospot analysis (фермент-связанный анализ иммуноспотов) HLA - human leukocyte antigen (антигены лейкоцитов человека) IgG - иммуноглобулин класса G

LAMP - lysosome-associated membrane protein (мембранные белки, ассоциированные с лизосомами)

МНС - major histocompatibility complex (главный комплекс гистосовместимости)

SIV - simian immunodeficiency virus (вирус иммунодефицита обезьян)

TBI - Т- и В-клеточный иммуноген

TCI - Т-клеточный иммуноген

Th - Т-хелперы а.о. - аминокислотный остаток АГ - антиген

АЗКЦ — антителзависимая клеточная цитотоксичность АПК - антигенпрезентирующие клетки AT - антитела в/б - внутрибрюшинное (введение) в/м - внутримышечное (введение)

ВИЧ-1 — вирус иммунодефицита человека первого типа

ВПЧ - вирусоподобная частица

ИЛ - интерлейкин

ИС - иммунная система

ИФА - иммуноферментный анализ н.о. - нуклеотидные основания об/мин — оборотов в минуту п.н. — пар нуклеотидов п/к - подкожное (введение)

РТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция в реальном времени СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности иммунного ответа, индуцированного комбинированной ДНК-белковой вакциной КомбиВИЧвак"

Синдром приобретенного иммунодефицита человека (СПИД), вызываемый вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), впервые был зарегистрирован в 1981 г. [Gottlieb, 1981], однако, по мнению некоторых исследователей, его распространение началось с начала 70-ых г.г. Высокая скорость и пандемическое распространение заболевания, а также взрывной характер манифестации ВИЧ-инфекции заставляют искать способы ее лечения и профилактики.

Первые попытки создать вакцину против ВИЧ-инфекции были предприняты сразу после открытия в 1983 г. вируса ВИЧ-1 [Barre-Sinoussi et al, 1983]. Между тем, использование традиционных подходов (живые аттенуированные, инактивированные, субъединичные вакцины), которые достаточно долго и с большим успехом используются для профилактики вирусных инфекций (краснуха, грипп, корь, ветряная оспа), не привело к успеху. Так, в 2003 г. неудачей завершилась III фаза клинических испытаний рекомбинантной вакцины AIDS VAX (VaxGen) на основе гликопротеина ВИЧ-1 gpl20 [Pitisuttithum, 2005]. Считается, что создание ВИЧ-1-вакцины на основе поверхностных белков черезвычайно сложно по причине высокой изменчивости вируса.

Принципы иного подхода к созданию эффективной ВИЧ-вакцины были сформулированы в последние 10-15 лет. Он основан на способности ВИЧ-специфических цитогоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) контролировать процессы репликации ВИЧ-1 в инфицированных клетках [Bangham, 2009]. Однако неудачное завершение в 2007 г. клинических испытаний вакцины MRKAd5 (Merck), содержащей большой пул ЦТЛэпитопов ВИЧ-1 в составе полноразмерных белков Gag, Pol и Nef ВИЧ-1 и направленной исключительно на формирование клеточного ответа, показало, что делать ставку на стимуляцию только клеточного ответа недостаточно [Hanke, 2008].

Третьей и последней на данный момент крупной вехой в истории исследований анти-ВИЧ-вакцин считается дата 24 сентября 2009 г., когда было объявлено об успешном завершении в Тайланде 2 фазы клинических испытаний кандидтной вакцины против ВИЧ-инфекции. В качестве праймирующего антигена был использован рекомбинантный поксвирус канареек (ALVAC), в геном которого встроены три гена ВИЧ-1, кодирующие поверхностный (gpl20), внутренний и регуляторный белки (4-кратное введение), а при бустерной вакцинации - рекомбинантная вакцина AIDSVAX (VaxGen) на основе гликопротеина ВИЧ-1 gpl20 (2-кратное введение) [Rerks-Ngam et al., 2009]. Оказалось, что такой режим вакцинации обеспечивал формирование защитного иммунитета у 31.2% добровольцев, характеризующихся различным риском заражения ВИЧ-инфекцией и отсутствием ВИЧ-1 на момент начала испытаний [Rerks-Ngam et al., 2009].

Таким образом, последние данные клинических испытаний и иммунологии ВИЧ-инфекции указывают на важность создания комплексного иммуногена, который с одинаковой эффективностью индуцировал бы как гуморальный, так и клеточный ответ.

В 90-ых г.г. был разработан новый подход к дизайну вакцин, заключающийся в создании искусственных полиэпитопных иммуногенов, которые включают иммунологически значимые консервативные эпитопы из разных вирусных белков и при этом лишены патогенных антигенных детерминант [Thomson et al., 1995]. В настоящее время разработаны полиэпитопные иммуногены для индуцирования как гуморального [Cai et al., 2007; Eroshkin et al., 1995; Kumar et al., 1994; Loktev et al., 1996; Theisen et al., 2000; Wang et al., 2006], так и ЦТЛ-ответа [Alexander et al., 2002; Bazhan et al., 2004; Gomez et al., 2004; Karpenko et al., 2004; Livingston et al., 2002; Suhrbier, 2002; Thomson et al., 1998; Wilson et al., 2003].

В ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" были получены две полиэпитопные конструкции, направленные на формирование гуморального (TBI) и клеточного (TCI) иммунного ответа. Первый из них, TBI (Т and В cell immunogene), содержит 5 В-клеточных и 4 Т-хелперных эпитопов из белков env и gag ВИЧ-1 [Eroshkin ct al. 1995] и способен индуцировать у животных гуморальный ответ против антигенов ВИЧ-1 [Karpenko et al., 2003; Loktev et al., 1996].

Другой полиэпитопный белок, TCI (T cell immunogene), был разработан Бажаном С.И. с соавт. в качестве поли-ЦТЛ-вакцины [Bazhan et al., 2004]. В структуру белка (длина 392 а.о.) были включены более 80 перекрывающихся CD8+ ЦТЛ- и CD4+ Т-хелперных эпитопов из Gag, Env, Pol и Nef [Bazhan et al., 2004]. При иммунизации ДНК-вакциной pcDNA-TCI, кодирующей иммуноген TCI, наблюдалось появление у мышей клонов специфических Т-лимфоцитов, отвечающих продукцией ИФНгамма при их рестимуляции специфическими пептидами [Karpenko et al., 2004].

Для доставки TBI- и TCI-иммуногенов были предложены искусственные вирусоподобные частицы (ВПЧ), полученные Лебедевым Л.Р. с соавт. [Lebedev et al., 2000]. Белок TBI представлен в виде множества копий на поверхности ВПЧ, что обеспечивает его эффективную презентацию иммунной системе. В коровой части ВПЧ находится ДНК-вакцина, кодирующая TCI-иммуноген, которая покрыта полиглюкиновой оболочкой, защищающей ее от действия нуклеаз [Lebedev et al., 2000; Karpenko et al., 2003].

Между тем, оставалось неизученным, способны ли два полиэпитопных иммуногена взаимно влиять друг на друга, вызывая иммунный ответ. Действительно, известны различные пути взаимодействия между вакцинами в комбинированных препаратах [Clemens et al., 1995; Kawahara et al., 2006; Konishi et al., 2003; Zeng et al., 2009], и заранее предсказать характер такого взаимодействия практически невозможно. В этой связи, крайне актуальной задачей является оценка взаимного влияния белка TBI и ДНК-вакцины pcDNA-TCI в составе вакцины КомбиВИЧвак, чтобы исключить ингибирующее действие компонентов вакцины на индуцируемый ими иммунный ответ.

Кроме того, до настоящего времени было неизвестно, на протяжении какого времени персистирует плазмидная ДНК, доставляемая вместе с КомбиВИЧвак, в органах иммунизированных животных. Ранее в ходе доклинических испытаний не было обнаружено долговременных биохимических, физиологических и морфологических изменений, что позволило сделать первичные выводы о безопасности КомбиВИЧвак [Karpenko et al., 2007]. Задача, касающаяся исследования интегративного потенциала ДНК-вакцин и времени их персистенции, является актуальной, т.к. проблема безопасности генетической иммунизации остается одним из критических вопросов при переходе от доклинических к клиническим испытаниям.

Цель данной работы: изучение взаимного влияния полиэпитопных иммуногенов TBI и TCI на индукцию иммунного ответа в составе комбинированной бивалентной ДНК-белковой вакцины КомбиВИЧвак, а также оценка распределения плазмиды pcDNA-TCI, компонента КомбиВИЧвак, в органах иммунизированных животных.

Для решения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

• Разработать протокол для определения плазмиды pcDNA-TCI в органах иммунизированных животных.

Научная новизна и практическая ценность

В данной работе впервые было показано, что иммунный ответ, вызываемый комбинированием двух полиэпитопных иммуногенов, является не просто суммой ответов, вызываемых отдельными компонентами комплексной вакцины (рекомбинантным белком TBI и ДНК-вакциной TCI), а определяется взаимным влиянием между иммуногенами. Так, TCI вызывает увеличение TBI-индуцируемого гуморального ответа и усиливает дифференцировку Th2-лимфоцитов.

Доставка ДНК-вакцины pcDNA-TCI с помощью КомбиВИЧвак сопровождается первоначальным накоплением плазмидной ДНК в тканях, прилегающих к месту инъекции, но далее наблюдается градиентное снижение концентрации pcDNA-TCI вплоть до уровня ниже достоверной детекции. Важно, что плазмида достаточно быстро элиминируется из гонад (семенники), что снижает вероятность вертикальной передачи мутаций, связанных со встраиванием плазмидного материала в геномную ДНК.

Разработан протокол для определения методом РТ-ПЦР ДНК-плазмиды pcDNA-TCI в органах мышей, иммунизированных вакциной КомбиВИЧвак. Протокол включен в состав научно-технической документации на вакцину КомбиВИЧвак.

Основные положения, выносимые на защиту

1. ДНК-вакцина pcDNA-TCI усиливает гуморальный ответ, вызываемый рекомбинантным белком TBI, белковым компонентом КомбиВИЧвак.

2. ДНК-вакцина pcDNA-TCI в составе КомбиВИЧвак обладает иммуномодулирующим действием и вызывает пролиферацию ТЬ2-лимфоцитов.

3. Содержание ДНК-вакцины pcDNA-TCI в тканях иммунизированных животных градиентно снижалось после одно- и двукратной иммунизации КомбиВИЧвак вплоть до полной элиминации из тканей к 60 сут. после последнего введения.

Апробация работы и публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 статей в российских и зарубежных журналах. Материалы диссертации были представлены на 4 Международных конференциях: "Биотехнология и медицина" (Москва, Россия, 2006), 8th John Humphrey advanced summer programme in immunology: Immunology and viral infections (Moscow, Russia, 2007), "Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития" (Алматы, Казахстан, 2008), 1st International FEBS Summer School on "Pathogen-Host Interplay" (Berlin-Potsdam, Germany, 2008); и двух российских конференциях: III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006), XI Всероссийский научный форум с международным участием им. В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, Россия, 2007). Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, включая 17 рисунков и 1 таблицу, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы (198 наименований) и перечня опубликованных работ.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Ужаченко, Роман Владимирович

выводы

1. В составе вакцины КомбиВИЧвак плазмида pcDNA-TCI вызывает синергическое усиление гуморального ответа, вызываемого белком TBI.

2. Объединение TCI- и TBI-иммуногенов в составе КомбиВИЧвак вызывает поляризацию ответа Т-лимфоцитов в сторону Т-хелперов 2-ого типа.

3. Разработан протокол для определения плазмиды pcDNA-TCI с помощью РТ-ПЦР в органах мышей, иммунизированных вакциной КомбиВИЧвак. Результаты были включены в состав научно-технической документации на вакцину КомбиВИЧвак.

4. Показано, что плазмида pcDNA-TCI после иммунизации одной дозой вакцины

IЧ

КомбиВИЧвак (75 мкг, 1x10 копий) распределяется в органах и тканях неравномерно. В первые 14 суток после иммунизации максимальное количество ДНК-плазмиды фиксировалось в месте инъекции (мышцах и прилежащих слоях дермы, 107/мкг геномной ДНК) и было на 2-4 порядка выше, чем в других органах.

5. Содержание плазмиды pcDNA-TCI во всех исследумых тканях иммунизированных животных градиентно снижалось после одно- и двукратной иммунизации КомбиВИЧвак до элиминации из тканей к 60 сут. после последнего введения (уровень чувствительности — 10-100 копий плазмиды/пробу).

Список публикаций Публикации в отечественных и зарубежных журналах

1. Bazhan S.I., Karpenko L.I., Lebedev L.R., Uzhachenko R.V., Belavin P.A., Eroshkin

A.M., Ilyichev A. A. A synergistic effect of combined bivalent DNA-protein anti-HIV-1 vaccine containing multiple T- and B-cell epitopes of HIV-1 proteins. Molecular immunology. 2008. V.45. P.661-669.

2. Миронов Г.Г., Ужаченко Р.В., Гвоздев В.А. Влияние полиэпитопного Т-клеточного ВИЧ-1 иммуногена на гуморальный ответ, вызываемый искусственным В-клеточным ВИЧ-1 антигеном. Сравнительный анализ различных путей иммунизации. Сборник научных трудов "Достижения современной биотехнологии". Новосибирск, 2008. - С. 140-147.

3. Karpenko L.I., Ilyichev А.А., Eroshkin A.M., Lebedev L.R., Uzhachenko R.V., Nekrasova N.A., Plyasunova O.A., Belavin P.A., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Zaitsev

4. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Ерошкин A.M., Лебедев Л.P., Ужаченко Р.В., Некрасова Н.А., Плясунова О.А., Белавин П.А., Серегин С.В., Данилюк Н.К., Даниленко Е.Д., Зайцев Б.Н., Масычева В.И., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Вакцина "КомбиВИЧвак", содержащая В- и Т-клеточные иммуногены ВИЧ-1. Доклады Академии наук. 2007. №4(413). С.553-556.

Публикации в материалах всероссийских и международных конференций

3. А.А. Ilyichev, L.I. Karpenko, R.V. Uzhachenko, L.R. Lebedev, O.A. Plyasunova, E.D. Danilenko, Y.I. Masycheva, S.I. Bazhan. Combined HIV-1 vaccine on the basis of polyepitope protein and DNA vaccine. Designing and preclinical trials. Workshop HIV vaccines. St. Petersburg, June 1 -2, 2007.

4. Ужаченко P.В., Карпенко JI.И., Бажан С.И., Лебедев Л.Р., Ильичев А.А. Образование антител различной специфичности зависит от способа введения комбинированной вакцины против ВИЧ-1. XI Всероссийский научный форум с международным участием им. В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", 28-31 мая 2007 г., Санкт-Петербург, Россия, с. 167.

8. Ужаченко P.В., Карпенко Л.И. Исследование иммуногенных свойств комбинированной вакцины против ВИЧ-инфекции. Московская международная конференция "Биотехнология и медицина", 14-17 марта 2006 г., Москва, Россия, с.146-147.

11. Karpenko L., R. Uzhachenko, N. Nekrasova, Lebedev L., Veremeiko Т., Ilyichev A., Bazhan S. Designing and preclinical trials of combined HIV-1 vaccine on the basis of polyepitope protein and DNA vaccine. XVI International AIDS Conference, 13-18 August 2006, Toronto, Canada, р.АЗЗ.

Заключение

ВИЧ-инфекция является глобальной проблемой, что обусловлено быстрыми темпами ее распространения, высокой летальностью, а также отсутствием адекватных мер лечения и профилактики. В настоящее время насчитывается около 33 млн. человек, инфицированных ВИЧ-1. Кроме того, каждый день регистрируется более 7 тыс. новых случаев заболевания [Chan, 2009]. Несмотря на то, что вирус ВИЧ-1, вызывающий СПИД, был открыт в начале 80-ых г.г. прошлого столетия, первые результаты клинических испытаний вакцин были получены только в XXI веке. Первые два крупных клинических испытания анти-ВИЧ-вакцин на добровольцах, закончившиеся неудачей, показали, что стратегия использования вакцин, направленных на формирование только одного компонента иммунного ответа, гуморального (AIDSVAX, 2003 г.) [Pitisuttithum, 2005], либо клеточного (MRKAd5, 2007 г.) [Hanke, 2008], оказалась неэффективной. Вместе с тем, последние клинические испытания в Тайланде (2005-2009 г.г.) показали, что при комбинировании двух вакцин, одна из которых (AIDSVAX) предназначена для индукции В-клеточного иммунитета, а другая (ALVAC-HIV) — для индукции Т-клеточного иммунитета путем использования прайм-бустерной стратегии (ALVAC-HIV + AIDSVAX), риск ВИЧ-инфекции был снижен на 31% [Rerks-Ngam et al., 2009]. Несмотря на то что высокий защитный эффект комбинации двух ВИЧ вакцин, использованных в тайском испытании, был невысоким, он оказался статистически значимым. Это говорит в пользу того, что создание эффективной вакцины против ВИЧ-инфекции возможно, и что вакцина против ВИЧ-1 должна быть комбинированной, чтобы индуцировать оба звена иммунитета. Кроме того, важными являются социальные последствия данных исследований. Так, в России, по разным оценкам, число заболевших ВИЧ-инфекцией на данный момент составляет 300-500 тыс. человек. Вместе с тем, даже 30% защитный эффект при вакцинации позволит в перспективе уменьшить число заболеваний на 100-150 тыс. случаев.

Представленная диссертационная работа посвящена изучению такой, а именно комбинированной вакцины против ВИЧ-инфекции, которая в силу этого получила название КомбиВИЧвак. Данная вакцина включает два компонента TBI и TCI, направленных на формирование гуморального и кеточного ответов, и получена на основе оригинальной технологии сборки искусственных вирусоподобных частиц (ВПЧ), разработанной в ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Лебедевым JI.P. [Lebedev et al., 2000]. Технология ВПЧ позволяет включать в состав одной конструкции как белковые, так и ДНК компоненты вакцины.

В результате проведенных исследований было показано, что КомбиВИЧвак индуцирует образование антител, связывающихся с белками ВИЧ-1, а также вызывает формирование ВИЧ-специфических Т-лимфоцитов, продуцирующих различные цитокины (ИЛ-2, ИФНгамма, ИЛ-4, ИЛ-10) в ответ на стимуляцию антигенами ВИЧ-1.

В литературе имеется множество примеров взаимного влияния между компонентами комбинированной вакцины - от нейтральных [Nam et al., 2006] до взаимодействий, вызывающих либо адъювантный эффект [Zeng et al., 2009], либо, наоброт, ингибирование иммунного ответа [Mawas et al., 2004, 2006; Muthumani et al., 2002]. В нашей работе при изучении КомбиВИЧвак было показано, что включение в состав единой конструкции двух иммуногенов, рекомбинантного белка TBI и ДНК-вакцины pcDNrHA-TCI, вызывало синергическое усиление гуморального ответа на антигены ВИЧ-1 по сравнению с конструкциями, содержащими только белок TBI (рис. 5). Что касается клеточного ответа, то ответ CD8+ Т-лимфоцитов, вызываемый плазмидой pcDNA-TCI, оставался без изменений (рис. 5), тогда как ответа Т-лимфоцитов был сдвинут в сторону Thl Th2 (рис. 6).

На втором этапе представленной работы было изучено распределение ДНК-вакцины pcDNA-TCI, компонента КомбиВИЧвак, в органах иммунизированных животных. Изучение персистенции плазмидной ДНК является тестом, рекомендованным

ВОЗ для косвенной оценки возможности встраивания (интеграции) векторной ДНК в геном клеток-хозяев. Нами было показано, что доставка ДНК-вакцины pcDNA-TCI с помощью КомбиВИЧвак сопровождается первоначальным накоплением плазмидной ДНК в тканях, прилегающих к месту инъекции. Вместе с тем, далее наблюдалось градиентное снижение концентрации pcDNA-TCI вплоть до ее исчезновения к 60 суткам после последнего введения при одно- и двукратной иммунизации (рис. 16). Следует отметить, что уровень чувствительности предложенного теста составлял 10-100 копий плазмиды/пробу (рис. 13). Важно, что плазмида достаточно быстро элиминируется из герминативной ткани (семенники) (рис. 16), что снижает вероятность вертикальной передачи мутаций, связанных со встраиванием плазмидного материала в геномную ДНК.

Таким образом, КомбиВИЧвак эффективно индуцирует ВИЧ-специфический иммунный ответ, а ДНК-компонент вакцины, pcDNA-TCI, не задерживается в организме иммунизированных животных и элиминируется. Следует отметить, что к настоящему времени проведены необходимые доклинические испытания КомбиВИЧвак и получено разрешение на проведения первой фазы клинических испытаний вакцины.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Ужаченко, Роман Владимирович, Кольцово

1. Меньшиков И. В., Бедулева, Л. В. Идиотип-антиидиотипические взаимодействия в патогенезе СПИДА // Иммунология. 2006. - N 5. - С. 316-320.

2. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д. Полимеразная цепная реакция. М. -Изд-во: Бином. 2009. - 215 с.

3. Ahlers J.D., Belyakov I.M., Thomas Е.К., Berzofsky J.A. High-affinity T helper epitope induces complementary helper and APC polarization, increased CTL, and protection against viral infection // J. Clin. Invest. 2001. - N 108. - P. 1677-1685.

4. Alfano M., Crotti A., Vicenzi E., Poli G. New players in cytokine control of HIV infection. // Curr HIV/AIDS Rep. 2008. -N 5(1). - P.27-32.

5. Alkhatib G. The biology of CCR5 and CXCR4. // Curr Opin HIV AIDS. 2009. - N 4(2). - P.96-103.

6. Balla-Jhagjhoorsingh SS, Koopman G, Mooij P, Koornstra W, McCormack S, Weber J, Pantaleo G, Heeney JL. Long-term persistence of HIV-1 vaccine-induced CD4+CD45RA-CD62L-CCR7- memory T-helper cells. // AIDS. 2004. - N 18(6). -P.837-848.

7. Bangham CR. CTL quality and the control of human retroviral infections. // Eur. J. Immunol.-2009.-N39(7). P.1700-1712.

8. Blankson JN. Effector mechanisms in HIV-1 infected elite controllers: Highly active immune responses? // Antiviral Res. 2009. - Epub ahead of print.

9. Brass A.L., Dykxhoorn D.M., Benita Y., Yan N., Engelman A., Xavier R.J., Lieberman J., Elledge S.J. Identification of host proteins required for HIV infection through a functional genomic screen // Science. 2008. -N 319. - P. 921-926.

10. Bureau M.F., Naimi S., Torero Ibad R., Seguin J., Georger C., Arnould E., Maton L., Blanche F., Delaere P., Scherman D. Intramuscular plasmid DNA electrotransfer: biodistribution and degradation // Biochim Biophys Acta. 2004. - 1676(2). - P.138-148.

11. Cai Q., Peng G., Bu L., Lin Y., Zhang L., Lustigmen S., Wang H. Immunogenicity and in vitro protective efficacy of a polyepitope Plasmodium falciparum candidate vaccine constructed by epitope shuffling. // Vaccine. 2007. -N 25(28). - P.5155-5165.

12. Campbell E.M., Hope T.J. Live cell imaging of the HIV-1 life cycle. // Trends Microbiol. 2008. -N 16(12). - P.580-587.

13. Campbell G.R., Loret E.P. What does the structure-function relationship of the HIV-1 Tat protein teach us about developing an AIDS vaccine? // Retrovirology. 2009. - N 6. -P.50.

14. Cardozo Т., Swetnam J., Pinter A., Krachmarov C., Nadas A., Almond D., Zolla-Pazner S. Worldwide distribution of HIV type 1 epitopes recognized by human anti-V3 monoclonal antibodies. // AIDS Res Hum Retroviruses. 2009. - N 25(4). - P.441-450.

15. Camera E, Li W, Borderia AV, Moltedo B, Moran T, Garcfa-Sastre A. Optimization of human immunodeficiency virus gag expression by newcastle disease virus vectors for the induction of potent immune responses. // J Virol. 2009. - N 83(2). - P.584-597.

16. Carter C.A, Ehrlich L.S. Cell biology of HIV-1 infection of macrophages. // Annu Rev Microbiol. 2008. - N 62. - P.425-443.

17. Choudhry V., Zhang M.Y., Harris I., Sidorov I.A., Vu В., Dimitrov A.S, Fouts Т., Dimitrov D.S. Increased efficacy of HIV-1 neutralization by antibodies at low CCR5 surface concentration. // Biochem Biophys Res Commun. 2006. - N 348(3). P. 1107-15.

18. Chung AW, Rollman E, Center RJ, Kent SJ, Stratov I. Rapid degranulation of NK cells following activation by HIV-specific antibodies. // J. Immunol. 2009. - N 182(2). -P.1202-1210.

19. Coffin J.M. HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy // Science. 1995. -N 267. - P. 483-489.

20. Deliyannis G., Boyle J.S, Brady J.L., Brown L.E., Lew A.M. A fusion DNA vaccine that targets antigen-presenting cells increases protection from viral challenge // PNAS. 2000. -N 97(12).-P.76-80.

21. Donnelly J.J., Liu M.A., Ulmer J.B. Antigen presentation and DNA vaccines. // Am J Respir Crit Care Med. 2000 - N 2. - P. 190-193.

22. Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery //Nucleic Acids Res. 1997. -N 25. - P.3095-3101.

23. Dyrhol-Riise A.M., Stent G., R0sok B.I., Voltersvik P., Olofsson J., Asjo B. The Fas/FasL system and T cell apoptosis in HIV-1-infected lymphoid tissue during highly active antiretroviral therapy. // Clin Immunol. 2001. - N 101(2). - P. 169-179.

24. Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva I.P., Lomakin A.S., Lebedev L.R., Kamyinina T.P., Pereboev A.V., Ignat'ev G.M. Design of four-helical protein as a candidate for HIV vaccine. // Protein Eng. 1995. - N 8. - P.167-173.

25. Fijak M, Meinhardt A. The testis in immune privilege. // Immunol Rev. 2006. - N 213.- P.66-81.

26. Giri M., Ugen K.E., Weiner D.B. DNA vaccines against human immunodeficiency virus type 1 in the past decade // Clin Microbiol Rev. 2004. - N 17(2). - P. 370-389.

27. Guarnieri F.G., Arterburn L.M., Penno M.B., Cha Y., Augus, J.T. The motif Tyr-X-X-hydrophobic residue mediates lysosomal membrane targeting of lysosome-associated membrane protein 1. // J. Biol. Chem. 1993. -N 25. - P. 1941-1946.

28. Guidance for Industry: Considerations for Plasmid DNA Vaccines for Infectious Diseases:http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulator ylnformation/Guidances/V accines/ucm091968.pdf

29. Hanke T. STEP trial and HIV-1 vaccines inducing T-cell responses. // Expert Rev Vaccines. 2008. - N 7(3). - P.303-309.

30. Hanke T, McMichael AJ. Design and construction of an experimental HIV-1 vaccine for a year-2000 clinical trial in Kenya. // Nat Med. 2000. - N 6(9). - P.951-955.

31. Harari A., Enders F.B., Cellerai C., Bart P.A., Pantaleo G. Distinct profiles of cytotoxic granules in memory CD8 T cells correlate with function, differentiation stage, and antigen exposure. // J Virol. 2009. -N 83(7). - P.2862-2871.

32. Heath WR, Belz GT, Behrens GM, Smith CM, Forehan SP, Parish IA, Davey GM, Wilson NS, Carbone FR, Villadangos JA. Cross-presentation, dendritic cell subsets, and the generation of immunity to cellular antigens. // Immunol Rev. 2004. - N 199. - P.9-26.

33. Ilemmi H., Takuechi O., Kawai T. A toll-like receptor recognizes bacterial DNA // Nature. 2000. - Vol.408. - P. 740-745.

34. Huang CL, Yang YH, Wang LC, Lin YT, Tsai YY, Chiang BL. Humoral and cellular immune response after measles vaccination in Taiwan. // J Microbiol Immunol Infect. -2005.-N 38(3).-P.169-175.

35. Huisman W, Martina BE, Rimmelzwaan GF, Gruters RA, Osterhaus AD. Vaccine-induced enhancement of viral infections. // Vaccine. — 2009. -N 27(4). P.505-512.

36. Hung CF, Yang M, Wu TC. Modifying professional antigen-presenting cells to enhance DNA vaccine potency. // Methods Mol Med. 2006. -N 127. - P. 199-220.

37. Huthoff H., Towers G.J. Restriction of retroviral replication by APOBEC3G/F and TRIM5alpha. // Trends Microbiol. 2008. -N 16(12). - P.612-619.

38. Kang Y.K., Andjelic S., Binley J.M., Crooks E.T., Franti M., Iyer S.P., Donovan G.P., Dey A.K., Zhu P., Roux K.H., Durso R.J., Parsons T.F., Maddon P.J., Moore J.P., Olson

39. W.C. Structural and immunogenicity studies of a cleaved, stabilized envelope trimer derived from subtype A HIV-1. // Vaccine. 2009. -N 27(37). - P.5120-5132.

40. Kaur M, Rai A, Bhatnagar R. Rabies DNA vaccine: no impact of MHC class I and class II targeting sequences on immune response and protection against lethal challenge. // Vaccine. 2009. -N 27(15). - P.2128-2137.

41. Kim B.M., Lee D.S., Choi J.H., Kim C.Y., Son M., Suh Y.S., Baek K.H., Park K.S., Sung Y.C., Kim W.B. In vivo kinetics and biodistribution of a HIV-1 DNA vaccine after administration in mice // Arch Pharm Res. 2003. - N26(6). - P. 493-498.

42. Kim J.H., Jacob J. DNA vaccines against influenza viruses. // Curr Top Microbiol Immunol. 2009 -N 333. - P. 197-210.

43. Klenerman P, Wu Y, Phillips R. HIV: current opinion in escapology. // Curr Opin Microbiol. 2002. -N 5(4). - P.408-413.

44. Ко SY, Cheng C, Kong WP, Wang L, Kanekiyo M, Einfeld D, King CR, Gall JG, Nabel GJ. Enhanced induction of intestinal cellular immunity by oral priming with enteric adenovirus 41 vectors. // J Virol. 2009. -N 83(2). - P.748-756.

45. Kramer V.G., Siddappa N.B., Ruprecht R.M. Passive immunization as tool to identify protective HIV-1 Env epitopes. // Curr HIV Res. 2007. -N 5(6). - P.642-655.

46. Kuck D, Lau T, Leuchs B, Kern A, Muller M, Gissmann L, Kleinschmidt JA. Intranasal vaccination with recombinant adeno-associated virus type 5 against human papillomavirus type 16 LI. // J Virol. 2006. -N 80(6). - P.2621-2630.

47. Kumar A., Kumar V., Shukla G.C., Rao K.V. Immunological characteristics of a recombinant hepatitis В virus-derived multiple-epitope polypeptide: a study in polyvalent vaccine design. // Vaccine. 1994. -N 12(3). - P.259-266.

48. Kumar V., Prakash O., Manpreet S., Sumedh G., Medhi B. Genetic basis of HIV-1 resistance and susceptibility: an approach to understand correlation between human genes and HIV-1 infection. // Indian J Exp Biol. 2006. - N 44(9). - P.683-692.

49. Le TT, Drane D, Malliaros J, Cox JC, Rothel L, Pearse M, Woodberry T, Gardner J, Suhrbier A. Cytotoxic T cell polyepitope vaccines delivered by ISCOMs. // Vaccine. -2001.-N 19(32). -P.4669-4675.

50. Lebedev L.R., Karpenko L.I., Poryvaeva V.A., Azaev M.Sh., Riabchikova E.I., Gileva I.P., Il'ichev A.A. Design of virus-like particles, exposing HIV-1 epitopes. // Mol. Biol. (Mosk). 2000. - N 34. - P.480-485.

51. Lieberman J, Frankel FR. Engineered Listeria monocytogenes as an AIDS vaccine. // Vaccine. 2002. - N 20(15). - P.2007-2010.

52. Lieberman J., Shankar P., Manjunath N., Andersson J. Dressed to kill? A review of why antiviral CD8 T lymphocytes fail to prevent progressive immunodeficiency in HIV-1 infection // Blood. 2001. - N 98. - P. 1667-1677.

53. Lin X, Dashti A, Schinazi RF, Tang J. Intracellular diversion of glycoprotein GP160 of human immunodeficiency virus to lysosomes as a strategy of AIDS gene therapy. // FASEB J. 1993. -N 7(11). - P. 1070-1080.

54. Lin J., Calcedo R., Vandenberghe L.H., Bell P., Somanathan S., Wilson J.M. A new genetic vaccine platform based on an adeno-associated virus isolated from a rhesus macaque. // J Virol. 2009. - Epub ahead of print.

55. Lin J., Calcedo R., Vandenberghe L.H., Figueredo J.M., Wilson J.M. Impact of preexisting vector immunity on the efficacy of adeno-associated virus-based HIV-1 Gag vaccines. // Hum Gene Ther. 2008. -N 19(7). - P.663-669.

56. Liu MA. Gene-based vaccines: Recent developments. // Curr Opin Mol Ther. 2010. -N12(1). — P.86-93.

57. Liu C., Fan M., Xu Q., Li Y. Biodistribution and expression of targeted fusion anti-caries DNA vaccine pGJA-P/VAX in mice. // J Gene Med. -2007. N 10. - P.298-305.

58. Liu WJ, Liu XS, Zhao KN, Leggatt GR, Frazer IH. Papillomavirus virus-like particles for the delivery of multiple cytotoxic T cell epitopes. // Virology. 2000. - N 273(2). — P.374-382.

59. Liu J., O'Brien K.L., Lynch D.M., Simmons N.L., La Porte A., Riggs A.M., Abbink P., Coffey R.T., Grandpre L.E., Seaman M.S., Landucci G., Forthal D.N., Montefiori D.C.,

60. Carville A., Mansfield K.G., Havenga M.J., Pau M.G., Goudsmit J., Barouch D.H. Immune control of an SIV challenge by a T-cell-based vaccine in rhesus monkeys. // Nature. 2009. - N 457(7225). - P.87-91.

61. Liu L., Wan Y., Xu J., Huang X., Wu L., Liu Y., Shao Y. Immunogenicity comparison between codon optimized HIV-1 CRF BC 07 gpl40 and gpl45 vaccines. // AIDS Res Hum Retroviruses. 2007. - N 23(11). - P. 1396-1404.

62. Livingston В., Crimi C., Newman M., Higashimoto Y., Appella E., Sidney J., Sette A. A rational strategy to design multiepitope immunogens based on multiple Th lymphocyte epitopes. //J Immunol. 2002.-N 168(11). - P.5499-5506.

63. Livingston BD, Newman M, Crimi C, McKinney D, Chesnut R, Sette A. Optimization of epitope processing enhances immunogenicity of multiepitope DNA vaccines. // Vaccine. -2001. -N 19(32).-P.4652-60.

64. Livingston B, Crimi C, Newman M, Higashimoto Y, Appella E, Sidney J, Sette A. A rational strategy to design multiepitope immunogens based on multiple Th lymphocyte epitopes. // J Immunol. 2002. -N 168(11). - P.5499-5506.

65. G., Giuliani M., Laguardia M.E., Monini P., Magnani M., Ensoli F., Ensoli B. Phase I therapeutic trial of the HIV-1 Tat protein and long term follow-up. // Vaccine. 2009. -N27(25-26). -P.3306-12.

66. Loots K, Vleugels B, Ons E, Vanrompay D, Goddeeris BM. Evaluation of the persistence and gene expression of an anti-Chlamydophila psittaci DNA vaccine in turkey muscle. // BMC Vet Res. 2006. - N2. - P. 18.

67. Lori F., Weiner D.B., Calarota S.A., Kelly L.M., Lisziewicz J. Cytokine-adjuvanted HIV-DNA vaccination strategies. // Springer Semin Immunopathol. 2006. - N 28(3). -P.231-238.

68. Lu S. Immunogenicity of DNA vaccines in humans: it takes two to tango. // Hum Vaccin.- 2008. N 4(6). - P.449-452.

69. Macmillan L, Ifere GO, He Q, Igietseme JU, Kellar KL, Okenu DM, Eko FO. A recombinant multivalent combination vaccine protects against Chlamydia and genital herpes. // FEMS Immunol Med Microbiol. 2007. - N 49(1). - P.46-55.

70. Malenbaum S.E., Yang D., Cheng-Mayer C. Evidence for similar recognition of the conserved neutralization epitopes of human immunodeficiency virus type 1 envelope gpl20 in humans and macaques. // J Virol. 2001. -N 75(19). - P.9287-9296.

71. Martin Т., Parker S.E., Hedstrom R., Le Т., Hoffman S.L., Norman J., Hobart P., and Lew D. Plasmid DNA Malaria Vaccine: The Potential for Genomic Integration after Intramuscular Injection // Human Gene Therapy. -1999. N. 10. - P.759-768.

72. McBurney S.P., Ross T.M. Developing broadly reactive HIV-1/AIDS vaccines: a review of polyvalent and centralized HIV-1 vaccines. // Curr Pharm Des. 2007. - N 13(19). -P. 1957-1964.

73. Medjitna TD, Stadler C, Bruckner L, Griot C, Ottiger HP. DNA vaccines: safety aspect assessment and regulation. // Dev Biol (Basel). 2006. -N. 126. - P.261-270.

74. Morikawa Y. HIV capsid assembly. // Curr HIV Res. 2003. - N1(1). - P. 1-14.

75. Morrow M.P., Weiner D.B. Cytokines as adjuvants for improving anti-HIV responses. // AIDS. 2008. - N 22(3). - P.333-338.

76. Naito M, Itoh M. Patterns of infiltration of lymphocytes into the testis under normal and pathological conditions in mice. // Am J Reprod Immunol. 2008. -N.59. - P.55-61.

77. Naumenko V.S., Osipova D.V., Kostina E.V., Kulikov A.V. Utilization of a two-standard system in real-time PCR for'quantification of gene expression in the brain // Journal of Neuroscience Methods. 2008. -N.170. - P.197-203.

78. Orsag P, Kvardova V, Raska M, Miller AD, Ledvina M, Turanek J. Quantitative realtime PCR study on persistence of pDNA vaccine pVax-Hsp60 TM814 in beef muscles. // Genet Vaccines Ther. 2008. - N.6. - P. 11.

79. Oscherwitz J, Gotch FM, Cease KB, Berzofsky JA. New insights and approaches regarding B- and T-cell epitopes in HIV vaccine design. // AIDS. 1999. - N .13 Suppl A. - SI63-74.

80. Ovsyannikova I.G., Jacobson R.M., Vierkant R.A., Pankratz V.S., Poland G.A. HLA supertypes and immune responses to measles-mumps-rubella viral vaccine: Findings and implications for vaccine design // Vaccine. 2007. - N 25. - P.3090-3100.

81. Pantophlet R., Wrin Т., Cavacini L.A., Robinson J.E., Burton D.R. Neutralizing activity of antibodies to the V3 loop region of HIV-1 gpl20 relative to their epitope fine specificity. //Virology. 2008. -N 381(2). - P.251-260.

82. Patterson S., Papagatsias Т., Benlahrech A. Use of adenovirus in vaccines for HIV. // Handb Exp Pharmacol. 2009. - N 188. - P.275-293.

83. Pease J.E, Horuk R. Chemokine receptor antagonists: Part 1. // Expert Opin Ther Pat. -2009.-N 19(1). P.39-58.

84. Pitisuttithum P. HIV-1 prophylactic vaccine trials in Thailand. // Curr HIV Res. 2005. -N 3(1). - P.17-30.

85. Real G., Llorente M., Lucas P., Kremer L., Toran J.L., Martinez A.C. Antibody repertoire against HIV-1 gpl20 triggered in nude and normal mice by GM-CSF/gpl20 immunization // Mol. Immunol. 1999. - N 36. - P.721-731. '

86. Reinhart ТА, Qin S, Sui Y. Multiple roles for chemokines in the pathogenesis of SIV infection. // Curr HIV Res. 2009. -N 7(1). - P.73-82.

87. Rerks-Ngarm S, Pitisuttithum P, Nitayaphan S, Kaewkungwal J, Chiu J, Paris R, Premsri N, Namwat C, de Souza M, Adams E, Benenson M, Gurunathan S, Tartaglia J, McNeil JG, Francis DP, Stablein D, Birx DL, Chunsuttiwat S, Khamboonruang C, Thongcharoen

88. P, Robb ML, Michael NL, Kunasol P, Kim JH; the MOPH-TAVEG Investigators. Vaccination with ALVAC and AIDS VAX to Prevent HIV-1 Infection in Thailand. // N Engl J Med. 2009. - Epub ahead of print.

89. Robertson JS, Griffiths E. Assuring the quality, safety, and efficacy of DNA vaccines. Methods Mol Med. 2006;127:363-74.

90. Romagnani S. T-cell subsets (Thl versus Th2) // Ann. Allergy Asthma Immunol. 2000. -N 85. - P.9-18.

91. Sallberg M, Frelin L, Weiland O. DNA vaccine therapy for chronic hepatitis С virus (HCV) infection: immune control of a moving target. // Expert Opin Biol Ther. 2009. -N 9(7). - P.805-815.

92. Sanyal G., Shi L. A review of multiple approaches towards an improved hepatitis В vaccine. // Expert Opin Ther Pat. 2009. -N 19(1). - P.59-72.

93. Schalk J.A., Mooi F.R., Berbers G.A., van Aerts L.A., Ovelgonne H., Kimman T.G. Preclinical and clinical safety studies on DNA vaccines // Hum Vaccin. 2006. - N 2(2). - P.45-53.

94. Schell J., Rose N.F., Fazo N., Marx P.A., Hunter M., Ramsburg E., Montefiori D., Earl P., Moss В., Rose J.K. Long-term, vaccine protection from AIDS and clearance of viral DNA following SHIV89.6P challenge. // Vaccine. 2009. -N 27(7). - P.979-986.

95. Shirai M., Kurokohchi K., Pendleton C.D., Arichi Т., Boyd L.F., Takahashi H. Reciprocal cytotoxic T lymphocytes cross-reactivity interactions between two major epitopes within HIV-1 gpl60 // J. Immunol. 1996. -N 157. - P.43 99-4411.

96. Shortman K, Lahoud MH, Caminschi I. Improving vaccines by targeting antigens to dendritic cells. // Exp Mol Med. 2009. - N 41(2). - P.61-66.

97. Simone R., Piatti G., Saverino D. The inhibitory co-receptors: a way to save from anergy the HIV-specific T cells. // Curr HIV Res. 2009. - N 7(3). - P.266-272.

98. Singh M., Briones M., Ott G., OTIagan D. Cationic microparticles: A potent delivery system for DNA vaccines // PNAS. 2000. - N 97(2). - P.811-816.

99. Stamatatos L., Morris L., Burton D.R., Mascola J.R. Neutralizing antibodies generated during natural HIV-1 infection: good news for an HIV-1 vaccine? // Nat Med. 2009. -N 15(8).-P.866-870.

100. Suhrbier A. Polytope vaccines for the codelivery of multiple CDS T-cell epitopes. // Expert Rev Vaccines. 2002. - N 1(2). - P.207-213.

101. Suzuki H., Kidokoro M., Fofana I.B., Ohashi Т., Okamura Т., Matsuo К., Yamamoto N., Shida H. Immunogenicity of newly constructed attenuated vaccinia strain LC16m8Delta that expresses SIV Gag protein. // Vaccine. 2009. -N 27(7). - P.966-971.

102. Tang D.C., DeVit M., Johnston S.A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response //Nature. 1992.-N 356(6365).-P. 152-154.

103. Thatte J., Rath S., Bal V. Analysis of immunization route-related variation in the immune response to heat-killed Salmonella typhimurium in mice. // Infect Immun. 1995. - N 63(1). - P.99-103.

104. Tuomela M., Malm M., Wallen M., Stanescu I., Krohn K., Peterson P. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU®-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method // Vaccine 2005. - N 23. - P.890-896.

105. Wang В., Ugen K.E., Srikantan V., Agadjanyan M.G., Dang K., Refaeli Y., Sato A.I., Boyer J., Williams W.V., Weiner D.B. Gene inoculation generates immune responses against human immunodeficiency virus type 1 // PNAS. 1993. - N 90(9). - P.4156-4160.

106. Wang X, Hone DM, Haddad A, Shata MT, Pascual DW. M cell DNA vaccination for CTL immunity to HIV. // J Immunol. 2003. -N 171(9). - P.4717-4725.

107. Wang F., He X.W., Jiang L., Ren D., He Y., Li D.A., Sun S.H. Enhanced immunogenicity of microencapsulated multiepitope DNA vaccine encoding T and В cell epitopes of foot-and-mouth disease virus in mice. // Vaccine. 2006. - N 24(12). — P.2017-2026.

108. Wang В., Merva M., Dang K. Immunization by direct DNA inoculation induces rejection of tumor cell challenge // Hum. Gene Ther. 1995. -N 6. - P.407-418.

109. Wang X, Seed B. A PCR primer bank for quantitative gene expression analysis. Nucleic Acids Res. 2003;31(24):el54.

110. Wee E.G., Patel S., McMichael A.J., Hanke T. A DNA/MVA-based candidate human immunodeficiency virus vaccine for Kenya induces multi-specific T cell responses in rhesus macaques // J Gen Virol. 2002. -N 83(Pt 1). - P. 75-80.

111. Woodman Z., Williamson C. HIV molecular epidemiology: transmission and adaptation to human populations. // Curr Opin HIV AIDS. 2009. - N 4(4). - P.247-252.

112. Wu K., Kim G.N., Kang C.Y. Expression and processing of human immunodeficiency virus type 1 gpl60 using the vesicular stomatitis virus New Jersey serotype vector system. // J Gen Virol. 2009. - N 90(Pt 5). - P. 1135-1140.

113. Yewdell J.W., Bennink J.R. Mechanisms of viral interference with MHC class I antigen processing and presentation // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1999. -N 15. - P.579-606.

Информация о работе

Ужаченко, Роман Владимирович
кандидата медицинских наук
Кольцово, 2010
ВАК 03.02.02

Диссертация

Особенности иммунного ответа, индуцированного комбинированной ДНК-белковой вакциной КомбиВИЧвак - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы