Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка и испытание живой сухой вакцины против эпизоотической диареи свиней (вакцина Веррес-ЭДС) в экспериментальных и производственных условиях

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Разработка и испытание живой сухой вакцины против эпизоотической диареи свиней (вакцина Веррес-ЭДС) в экспериментальных и производственных условиях"

На правах рукописи

СЕРГЕЕВ ОЛЕГ ВИТАЛЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЕ ЖИВОЙ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ДИАРЕИ СВИНЕЙ (ВАКЦИНА ВЕРРЕС-ЭДС) В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ

06.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

28 №Г 21№

Москва-2014

О

005552005

Работа выполнена в лаборатории сравнительной вирусологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант: Доктор биологических наук, профессор

Алипер Тарас Иванович

Официальные оппоненты: Валихов Алексей Федорович

доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры генетики и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет имени К.А.Тимирязева» (ФГБОУ ВПО РГАУ-МСХА)

Кузнецов Дмитрий Павлович доктор биологических наук, профессор, заместитель генерального директора по производству и технологиям РОАО Росагробиопром

Куриннов Виктор Васильевич

доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией диагностики ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» (ГНУ ВНИИВВиМ)

Ведущая организация: ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

(ФГБУ ВНИИЗЖ)

Защита диссертации состоится 9 октября 2014 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.011.01 на базе ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») по адресу: 123022, г.Москва, Звенигородское шоссе, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ВГНКИ» и на сайте http://www.vgnki.ru/graduate_course/dissertat

Автореферат разослан «¿3» 2014 г. и размещен на сайтах

http://www.vgnki.ru/graduate_course/autoreferat и http://www.vak2/ed.gov.ru

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор ' ' ' Букова Наталия Константиновна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы

Эпизоотическая диарея свиней (ЭДС) является высококонтагиозным вирусным заболеванием свиней, характеризующимся изнурительной диареей и дегидратацией организма. Заболеванию подвержены свиньи всех возрастов, но наиболее восприимчивыми являются новорождённые поросята до двухнедельного возраста, смертность среди которых колеблется в пределах 30-100%. ЭДС по клиническим признакам, патологоанатомической картине и эпизоотологии очень сходна с трансмиссивным гастроэнтеритом свиней (ТГС). Фактически TTC и ЭДС - заболевания-двойники, вызываемые двумя кишечными коронавирусами свиней, не имеющими антигенного родства. Оба заболевания характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью новорождённых поросят. Главными отличиями ЭДС являются отсутствие рвоты и более низкая смертность новорождённых поросят, более тяжёлое течение болезни у свиней в период откорма, а также латентное инфицирование и более медленное распространение. Летальность среди свиней, начиная с послеотьёмного возраста, составляет обычно 1-3 %. ЭДС, как правило, возникает внезапно и после одной или нескольких вспышек часто приобретает стационарный (энзоотический) характер.

В России ЭДС впервые обнаружена в крупных свиноводческих хозяйствах в 2006 г. (НПО НАРВАК). В полевых условиях разные штаммы вируса ЭДС обладают различной вирулентностью. Штаммы вируса, циркулирующие в странах Азии, в целом характеризуются более высокой вирулентностью по сравнению со штаммами, циркулирующими в странах Европы [Sueyoshi et al., 1995; Song and Park, 2012]. Причина данной географической зависимости неясна. Существенные экономические потери, причиняемые ЭДС некоторым странам азиатского региона, явились основанием для интенсивного изучения заболевания и его возбудителя. Можно выделить следующие направления исследований по ЭДС, в которых достигнут наибольший прогресс: этиология, эпизоотология, иммунобиология, диагностика и специфическая профилактика. Результаты исследований в данных направлениях являются научной основой для разработки эффективных мер борьбы против ЭДС. Изучены иммунобиологические свойства вируса ЭДС, особенности его репродукции in vitro, строение вириона и вирусного генома.

Центральным звеном в научном и практическом отношении явилась разработка метода культивирования вируса ЭДС вне организма. Решение этой важной и трудной задачи обеспечило возможность его выделения и изучения, а также разработки и изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Размножение вируса ЭДС в культуре клеток позволило лишить его вирулентности при сохранении защитных свойств, а также обеспечило возможность оценивать его биологическую и антигенную активность, что определило успех

при разработке средств специфической защиты. Размножение вируса ЭДС in vitro связано с необычным явлением в биологии вирусов. Линии клеток естественного хозяина - свиньи (СПЭВ, ПП, РК-15 и др.), высокочувствительные к вирусу ТГС, оказались нечувствительными к вирусу ЭДС. В то же время линия клеток Vero, произошедшая от естественно нечувствительного хозяина — обезьяны, оказалась чувствительной к вирусу ЭДС, но не к вирусу ТГС. При выделении полевого вируса ЭДС в культуре клеток Vero после нескольких пассажей его репликация сопровождается выраженным ЦПЭ. Однако в этой уникальной по чувствительности к вирусу ЭДС культуре клеток он накапливается в невысоком титре не выше 6,0 - 7,0 lg ТЦЦ50 /мл даже после продолжительной адаптации [Song et al., 2003]. Серийное пассирование вирулентных штаммов вируса ЭДС в культуре клеток быстро приводит к снижению и потере вирулентности и получению аттенуированных вакцинных штаммов [Kweon et al., 1999]. Молекулярной основой атгенуации вируса ЭДС и её необратимости при серийном размножении в культуре клеток считается делеция в последовательности вспомогательного гена ORF3.

Многие вопросы эпизоотологии ЭДС остаются невыясненными, в частности, частота латентного инфицирования и носительство вируса ЭДС различными технологическими и возрастными группами свиней. Известно, что в хозяйствах при ЭДС острая инфекция чаще, чем при ТГС переходит в хроническую форму [Pensaert and Yeo, 2006]. В качестве возможного объяснения этому и другим особенностям ЭДС можно считать тропизм вируса in vivo -предпочтительное размножение вируса ЭДС в энтероцитах крипт тонкого кишечника свиней.

Предварительный диагноз ТГС/ЭДС ставят на основании клинических признаков, патологоанатомических изменений и эпизоотологических данных. Окончательный (этиологический) диагноз устанавливают на основании результатов лабораторных исследований. Лабораторная диагностика включает обнаружение вирусного антигена или вирусной нуклеиновой кислоты и специфических антител. Серологические методы, помимо диагностического значения, представляют ценность для оценки иммунитета в практических условиях. Наиболее чувствительным и специфическим методом дифференциальной диагностики ТГС/ЭДС является гнездовая (дуплексная) версию ПЦР [Kim et al., 2000, 2001]. Для дифференциации вирусов ЭДС и ТГС в практических условиях удобным оказался метод иммунохроматографии на стрипах [Kang et al., 2007].

Специфическая профилактика ЭДС представляет собой актуальную проблему для ряда стран с развитым свиноводством. Как и в случае ТГС, основу стратегии специфической профилактики ЭДС составляет пассивный лактогенный иммунитет, то есть иммунизация супоросных свиноматок и защита потомства антителами молозива и молока [Saif, Wesley, 1999]. Основным медиатором лактогенного иммунитета служит иммуноглобулин IgA, который

нейтрализует вирус на поверхности слизистой оболочки и предупреждает развитие инфекции [Stokes, Waly, 2006]. Роль клеточного иммунитета в защите свиней от ЭДС не изучена [Song, Park, 2012].

Для специфической профилактики ЭДС в разных странах применяют различные живые вакцины из культуральных аттенуированных штаммов вируса ЭДС. Создание инактивированной вакцины против ЭДС представляется экономически невыгодным направлением. Живые вакцины вводят супоросным свиноматкам, как правило, внутримышечно, хотя одна группа авторов показала, что оральное введение вакцины приводит к более выраженному иммунитету у свиноматок и лучшей защите потомства от инфекции по сравнению с внутримышечным введением [Song et al., 2007]. Однако оральное введение неприемлемо при массовой вакцинации в условиях крупных свиноводческих хозяйств. Существуют опасения некоторых исследователей, что напряжённость иммунитета, индуцированного некоторыми коммерческими живыми вакцинами, часто недостаточна, так как после вакцинации свиноматок вирус ЭДС выделяется с фекалиями у экспериментально зараженных поросят примерно так же, как у серонегативных поросят контрольной группы [Yuan et al., 1998]. Однако главным критерием практической ценности живых вакцин против ЭДС является их безопасность и эпизоотическая эффективность, которая тесно коррелирует с уровнем лактогенного иммунитета (титр ВНА в молозиве и молоке) у вакцинированных свиноматок.

1.2. Цель и задачи исследования Целью исследования являлась разработка эффективной живой вакцины против ЭДС и условий её применения в ветеринарной практике. В задачи исследования входило:

1. Получить вакцинный культуральный штамм вируса ЭДС и изучить его антигенные (иммуногенные) свойства;

2. Определить генетическую основу атгенуации вируса ЭДС;

3. Оптимизировать условия размножения вакцинного штамма вируса ЭДС в перевиваемой культуре клеток;

4. Разработать условия изготовления и контроля живой сухой вакцины и режим её хранения;

5. Определить оптимальную схему вакцинации свиней в практических условиях;

6. Изготовить экспериментальные серии вакцины и испытать их эффективность в лабораторных и производственных условиях;

7. Изготовить производственные серии вакцины и испытать их в неблагополучных по ЭДС хозяйствах;

8. Изучить возможность одновременной иммунизации свиней против ЭДС и TTC;

9. Составить и утвердить нормативную документацию на живую сухую вакцину против ЭДС в установленном порядке.

1.3. Научная новизна работы

Выявлено существенное различие между «вирусами-близнецами» ЭДС и ТГС при культивировании in vitro. Различие заключалось в том, что полевой вирус ЭДС вопреки общеизвестной закономерности не размножался в культуре клеток естественного хозяина -свиньи (линии клеток СПЭВ, ППС, РК-15), но размножался в культуре клеток нечувствительного вида — зелёной мартышки (линия клеток Vero). Вирус ЭДС размножался in vitro мене интенсивно, чем вирус ТГС. В культуре клеток Vero он накапливался незначительно даже после 40 пассажей (Ю40 - Ю5-0 ТЦДзо / мл), что исключало возможность его использования для изготовления инактивированной вакцины. В результате пассирования полевого вирулентного вируса ЭДС в культуре клеток Vero получен авирулентный штамм ИС, отвечающий требованиям, предъявляемым к штаммам для изготовления живых вакцин. Вирулентность полевого вируса ЭДС исчезла относительно быстро (после 26 — 28 пассажей в культуре клеток Vero) и связана с делецией в гене ORF3. Длительное пассирование аттенуированного штамма ИС в культуре клеток Vero (110 пассажей) сопровождалось лишь незначительным повышением его инфекционное™ (1050 - 106-3 ТЦДзо / мл) при сохранении антигенное™. При аттенуации различных вирусов такое явление наблюдается редко и свидетельствует о необычной стабильности антигенных свойств штамма ИС вируса ЭДС при длительной репликации in vitro.

Определены условия удовлетворительного накопления вакцинного штамма ИС в культуре клеток Vero. Различные изменения условий культивирования не привели к повышению его репликации.

Ревакцинация свиней сопровождалась повышением иммунного ответа. Наилучшие результаты получены при двукратном внутримышечном введении вакцины ИС в дозе 1040 ТДД50 с интервалом 15-20 дней.

Одновременное введение инактавированной вакцины против ТГС и живой вакцины против ЭДС сопровождалось подавлением иммунного ответа против обоих заболеваний. Последовательное введение указанных вакцин супоросным свиноматкам с интервалом 21 день приводило к образованию выраженного иммунитета против каждого заболевания.

В период вспышки ЭДС (2008-2010 гг.) выявлены некоторые особенности течения болезни. В отдельных свиноводческих комплексах отмечена высокая заболеваемость свиней в период доращивания (>60%) и в период откорма (>90%), а также спонтанная латентная иммунизация свиноматок полевым вирусом и, как следствие, низкая заболеваемость поросят (около 20%) в возрасте до 2 недель.

1.4. Практическая значимость работы

На основании результатов исследований, представленных в диссертационной работе, впервые в России разработана и внедрена в ветеринарную практику сухая живая вакцина против эпизоотической диареи свиней (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) и определены условия её практического применения. Доказана безопасность и высокая эпизоотическая эффективность применения вакцины в промышленном свиноводстве. Разработаны и внедрены СТО на производственное изготовление сухой живой вакцины против ЭДС и инструкция по её применению. Вакцина ВЕРРЕС-ЭДС против эпизоотической диареи свиней используется в ветеринарной практике с 2008 года. Изготовление и применение вакцины проводится в соответствии с нормативной документацией, утверждённой и зарегистрированной в установленном порядке.

1.5. Личное участие автора

Экспериментальные исследования были выполнены автором лично либо при его непосредственном участии в коллективных работах. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в постановке целей и задач, планировании и проведении экспериментов и интерпретации полученных результатов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

1.6. Апробация

Основные положения диссертации опубликованы, доложены и одобрены на: заседаниях Учёного совета ООО Ветбиохим в 2008 - 2010 гг., заседаниях Учёного совета ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России, XVII Московском международном ветеринарном конгрессе (2009), V Международном конгрессе по вакцинам (Сиэтл, США, 2011).

1.7. Публикация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 11 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, в том числе 1 патент.

1.8. Объём и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и практических предложений, списка литературных источников и приложений. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, включает 31 таблицу, 7 рисунков, 184 источника литературы.

1.8. Основные положения, выносимые на защиту

1. Выбор культуры клеток для размножения вируса ЭДС с целью изготовления вакцины

2. Получение вакцинного штамма ИС вируса ЭДС в результате пассирования в культуре клеток

3. Оптимизация условий размножения вакцинного штамма ИС in vitro

4. Антигенность (иммуногенность) вакцинного штамма ИС при длительном пассировании в культуре клеток

5. Разработка живой сухой вакцины из аттенуированного штамма ИС

6. Изготовление и контроль живой сухой вакцины против ЭДС в лабораторных и производственных условиях

7. Разработка оптимальной схемы применения живой сухой вакцины против ЭДС в ветеринарной практике

g. Результаты применения живой сухой вакцины против ЭДС в производственных условиях

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

2.1.1. Вирус. Исходный вирулентный вирус ЭДС, использованный для аттенуации in vitro с целью изготовления вакцины или для экспериментального заражения поросят, представлял собой суспензию кишечного материала, взятого от поросят, инфицированных в полевых условиях. Вирус ЭДС первоначально был выделен от больных поросят в культуре клеток Vero. В течение первых пассажей в этой культуре вирус размножался слабо без выраженного ЦПЭ. Вирус 20 пассажа в культуре клеток Vero обладал выраженным ЦПЭ и имел титр 2,5 lg ТЦДзо/мл.

2.1.2. Однослойные культуры клеток. Из флакона с выросшим клеточным монослоем удаляли ростовую среду, монослой промывали 1-2 раза раствором Версена (0,02%) и 1 раз смесью растворов Версена (0,02%) и трипсина (0,025%) в соотношении 4:1, затем выдерживали при 37°С 5-10 мин. После отделения клеток от стенки флакона их разводили средой DMEM с сывороткой. Клеточную суспензию, содержащую 1-2 х 105 клеток/мл, вносили по 150 мл в 1,5 мл флаконы. Клетки всех линий выращивали в течение 3-4 дней при 37°С. Срок формирования монослоя: 4g-72 часа. Клетки СПЭВ выращивали на среде 199, остальные - на среде DMEM с 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота (FetaClone) и антибиотиком (2 мкг/мл гентамицина или 2,5 мкг/мл ципрофлоксацина). Клетки всех линий выращивали в течение 3-4 дней и пересевали с коэффнциэнтом 1:4 — 1:5.

2.1.3. Выращивание вируса в культуре клеток. Для выращивания вируса использовали клетки Vero, покрывающие ростовую поверхность флакона на 95-100%. Клетки отмывали раствором Хэнкса и заражали вирусом с множественностью 0,1 ТЦД50 на клетку. Вирус вносили одновременно с поддерживающей средой (DMEM с антибиотиками без сыворотки), содержащей трипсин в концентрации 5 мкг/мл. Выраженный ЦПЭ развивался через 18-20 часов после заражения. В этот период (разрушение не менее 70% клеток монослоя) культивирование

вируса прекращали, и сосуды с инфицированной культурой клеток интенсивно встряхивали. В случаях, когда на стенках культуральных сосудов оставалась значительная часть клеток, сосуды кратковременно замораживали. Вирус-содержащую культуральную суспензию сливали в пластиковые бутыли и хранили при минус 20°-70°С. Вирус ЭДС, адаптированный к культуре клеток Vero (титр 103-5 - Ю6 0 ТЦД^/мл), использовали для изготовления экспериментальных серий вакцины.

2.1.4. Титрование вируса в культуре клеток. Инфекционность вируса в жидком и лиофилизированном препаратах определяли методом титрования в культуре клеток Vero в 96-луночных плашках. Клетки Vero в 96-луночных плашках выращивали стандартным способом в атмосфере 4% СОг. Концентрация клеток при посеве: 2-4 х 10' клеток/мл, в лунку вносили 100 мкл клеточной суспензии, срок формирования монослоя: 24-48 ч. Перед внесением разведений вируса монослой в лунках промывали 1-2 раза раствором Хэнкса. Серийные 10-кратные разведения вируса готовили в среде DMEM, содержащей трипсин (5 мкг/мл) и гентамицин (20 мкг/мл). Разведения от 10"1 до 10"! вносили в отмытые от ростовой среды лунки по 100 мкл, каждое разведение в 4 лунки. Плашки инкубировали при 37°С, 4% СОг. Результаты титрования вируса учитывали через 48-72 ч. Титр вируса определяли по методу Рида-Менча и выражали в единицах ТЦД50 /мл.

2.1.5. Экспериментальные животные. Аттенуацию вируса, безопасность, антигенность и иммуногенную активность вакцинного препарата оценивали на супоросных свиноматках, новорожденных поросятах, откормочных свиньях и лабораторных животных. Новорожденных поросят содержали под своими матерями или изолированно в искусственных условиях сразу после рождения. Поросят в возрасте 30-35 и 65-70 дней содержали в течение всего опыта технологическими группами. В качестве лабораторных животных использовали морских свинок. Свиней всех возрастов прививали с помощью шприца-полуавтомата с силиконовой насадкой вместо иглы.

2.1.6. Сбор и приготовление образцов для исследований. Пробы сыворотки крови, молозива и молока свиней исследовали серологическими методами до и после вакцинации. Кровь брали из наружной ушной вены в стерильные флаконы и выдерживали 2 часа в термостате при 37° С, затем выдерживали в течение ночи при 4° С. Сыворотку отделяли центрифугированием при 1500 об/мин в течение 20 мин. Молозиво и молоко брали в стерильные флаконы. Для получения молозива/молока свиноматкам внутривенно вводили 50 ед окситоцина. Каждую пробу получали не менее чем из трех долей вымени. Полученные пробы центрифугировали в режиме 19000 об/мин в течение 2 часов, после чего собирали среднюю фракцию, содержащую сыворотку. Все пробы до исследования хранили при минус 20° С.

2.1.7. Реакция нейтрализации вируса. Реакцию нейтрализации использовали для оценки антигенной активности вакцинного вируса по уровню вируснейтрализующих антител (ВНА) в сыворотке крови свиней до и после вакцинации и в молозиве (молоке) свиноматок, взятом в день опороса и в последующие дни.

Для реакции нейтрализации вируса использовали культуру клеток Vero со сплошным монослоем в 96-луночных пластиковых планшетах, предварительно отмытые от ростовой среды средой ДМЕМ.

Пробы иммунной сыворотки крови свиней предварительно инактивировали при 56° С 30 мин. Пробы молозива/молока замораживали, оттаивали и обезжиривали центрифугированием при 3000 об/мин 10 мин. Затем готовили серийные 2- или 10-кратные разведения на среде ДМЕМ с антибиотиком.

Для активации вируса ЭДС в суспензию, содержащую вирус, добавляли трипсин до концентрации 20 мкг/мл и инкубировали 30 мин при 37°С. Активированный вирус разводили средой ДМЕМ до концентрации 2-4 х 103 ТЩЬо/мл и смешивали с равным объёмом серийного разведения сыворотки или молозива. После инкубации 1 ч при 37°С смесь вирус-сыворотка вносили в отмытые от ростовой среды лунки с монослоем по 100 мкл. Доза вируса в каждой лунке составляла 100-200 ТЦД50. Смесь каждого разведения сыворотки вносили в 4 лунки. Клетки со смесью вирус-сыворотка инкубировали 1 ч при 37°С в атмосфере 4% СОг, после чего смесь удаляли, монослой отмывали от сыворотки и вносили поддерживающую среду ДМЕМ с трипсином (5-10 мкг / мл) по 100 мкл в лунку. Планшеты инкубировали при 37° С, 4% СОг. Результаты реакции учитывают через 5 суток при наличии ЦПЭ в культуре, заражённой вирусом в рабочем разведении без сыворотки (контроль +) и отсутствии ЦПЭ в лунках с незаражённой культурой клеток (контроль —).

2.1.8. Изготовление сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС. Стабилизирующие среды. С целью уменьшения потери активности в результате сушки вирусную суспензию смешивали с одной из трёх стабилизирующих (защитных) сред, использованных в работе: декстраново-желатиновой, пептонно-желатозной и молоком.

Декстраново-желатиновую среду готовили следующим образом. В 2/3 конечного объёма бидистилированной воды вносили компоненты в следующем порядке (в граммах на 1 л воды): гидрофосфата калия 1,25, дигидрофосфата калия 0,5, желатина 30, декстрана 50, сорбита 50, сахарозы 30, гидролизата казеина 20. Каждый следующий компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После доведения рН до 7,3-7,4 2М гидроксидом калия добавляли бидистиллят до конечного объёма и автоклавировали при 121-125° С в течение 30 мин.

Пептонно-желатозную среду готовили смешиванием равных объёмов двух растворов. Первый раствор содержал (в порядке растворения) дигидрофосфат калия 0,27%, лактозу 10% и пептон 10%. Второй раствор содержит дигидрофосфат калия 0,27% и желатозу 4%. Для растворения компонентов смеси нагревают или оставляют на ночь. pH обоих растворов доводят до 7,3-7,4 2М гидроксидом калия. После автоклавирования при 121-125° С 30 мин растворы смешивали.

Молоко готовили альтернативно двумя способами. 1) Сухое обезжиренное молоко стерилизовали гамма-облучением интенсивностью 2 млн рад. Растворяли в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (pH 7,3-7,4) в весовой пропорции 1:6, затем центрифугировали суспензию в 50-мл центрифужных пробирках при 5 000 об/мин в течение 10 мин. 2). Коммерческое пастеризованное молоко 2,5 или 3,2 % жирности стерильно разливали в 50 -мл центрифужные пробирки, однократно замораживали-оттаивали, затем центрифугировали суспензию в 50-мл центрифужных пробирках при 5 000 об/мин в течение 10 мин. После проверки pH (7,2-7,4) супернатант сливали и смешивали с вирусной суспензией или хранили в замороженном виде.

Вирусную суспензию смешивали с декстраново-желатиновой средой в отношении 0,7 : 0,3, с пептонно-желатозной средой или молоком - в отношении 1:1.

Лиофилизация вакцины. Смесь культурального вируса со стабилизирующей средой расфасовывали вручную (малые объёмы) или на автоматической линии по 1 мл во флаконы объёмом 3 см3, устанавливали на каждый флакон резиновую пробку с пазами для удаления влаги.

Для сушки в лабораторной установке Christ Alpha расфасованную вакцину предварительно замораживали в холодильнике при минус 60°-70 °С в течение 16 ч, затем помещали в сушильную установку. При производственной сушке расфасованную вакцину замораживали в установке Christ Epsilon перед началом сублимации. Сразу после расфасовки в один или два флакона с вакциной помещали датчики температуры. Замораживание проводили в течение 6-8 ч до достижения в материале температуры полного замораживания, минус 50° С или ниже.

Лиофилизацию проводили при значениях вакуума в камере около 0,16 мБар в течение не менее 50 ч. После удаления из препарата около 90% влаги проводили досушивание при температуре 30-35°С в течение 15 ч. По окончании лиофилизации флаконы герметично укупоривали непосредственно в камере сублиматора с помощью прижимных плит, после чего камеру заполняли атмосферным воздухом. После определения вакуума и остаточной влажности флаконы с сухой вакциной закатывали алюминиевыми колпачками.

2.1.9. Определение параметров сухой вакцины. Вакцина считается пригодной для практического применения только при наличии вакуума во флаконах. Поэтому все флаконы с сухой вакциной проверяли на наличие вакуума с помощью аппарата Д'Арсонваля. Светящийся разряд во флаконах свидетельствовал о наличии вакуума.

Определяли уменьшение массы сухой вакцины после досушивания её по ГОСТ № 24061 - 89 (CT СЭВ 6279 - 89). Массовая доля влаги в сухой вакцине должна быть в пределах 1-4%.

6 флаконов с сухой вакциной, содержащих вакуум, выдерживали в течение 7 суток при 37° С. По истечении этого срока определяли активность вируса в усреднённой пробе титрованием вируса в культуре клеток.

2.1.10. Выделение вирусной РНК. Для выделения РНК из монослоя и суспензии культуры клеток использовали методику выделения с тризолом (Gibco BRL, Life Technologies).

Для жидких образцов: к 500 мкл образца добавляли 500 мкл тризола и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем добавляли 200 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и снова инкубировали 10 мин. при комнатной температуре. Центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4° С. Отбирали верхнюю РНК-содержащую водную фазу и добавляли к ней равный объем 100% изопропанола. Инкубировали при минус 20° С в течение 20 мин. Центрифугировали 15 мин., 13000 об/мин при +4°С. Образовавшийся осадок РНК промывали дважды 75% этанолом, подсушивали при 37° С в течение 20-30 минут и растворяли в 30-40 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC).

Для монослоя и тканевых образцов: на монослой клеток наносили тризол из расчета 37,5 мкл на 1 см2 культуралыюй поверхности, дожидались отделения монослоя от поверхности чашки, переносили суспензию клеток в тризоле -в микроцентрифужную пробирку (1,5 мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5-10 минут. Затем добавляли 200 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и снова инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Для разделения фаз центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4°С. Затем отбирали верхнюю РНК-содержащую водную фазу и добавляли к ней равный объем 100% изопропанола. Инкубировали при минус 20" С в течение 20 минут, центрифугировали 15 минут, 13000 об/мин при +4° С. Образовавшийся осадок РНК промывали и растворяли, как указано выше.

2.1.11. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ - ПЦР) для детекции генома вируса ЭДС. В работе использовали метод множественной ПЦР, позволяющий обнаружение и различение геномов вирусов ТГС и ЭДС в одной пробе. Две пары праймеров, последовательности которых приведены ниже, подобраны на основе геномных последовательностей штамма CV777 вируса ЭДС и штамма Purdue вируса ТГС. Специфические праймеры были подобраны таким образом, чтобы исключить перекрёстные реакции для этих

двух вирусов и неспецифические реакции. Условия проведения реакции отрабатывали на матрице двух референтных штаммов вируса ТГС, ТМК и Miller, и референтного штамма CV777 вируса ЭДС. Последовательности праймеров соответствуют консервативным участкам гена мембранного белка (М) вируса ЭДС и гена нуклеокапсида (N) вируса ТГС. Размеры специфических фрагментов соответствуют 412 п.н. и 612 п.н. для вирусов ЭДС и ТГС. Последовательности праймеров приведены ниже.

М, прямой праймер: 5'-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3* M, обратный праймер: 5'-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3' N, прямой праймер: 5'-GATGGCGACCAGATAGAAGT-3' N, обратный праймер: 5'-GCAATAGGGTTGCTTGTACC-3'

Состав реакционной смеси: 1 мМ MgSO-t, 50 мМ Трис-HCl (pH 8,3), 1,5 мМ MgCh, 0,01% желатина, 0,1% тритона Х-100, 0,25 мМ смеси четырёх дезокси-нуклеотид-трифосфатов (dNTPs), 2,5 ед. Taq-полимеразы, 2,5 ед. обратной транскриптазы (AMV-ревертазы), по 0,25 мкМ каждого праймера и 2—5 мкл РНК-содержащего препарата. Вода — до 25 мкл.

Режим проведения реакции. 1 цикл обратной транскрипции: 42° С — 45 мин, 94° С — 2 мин; 40 циклов амплификации: 94° С - 30 сек, 55°С - 30 сек, 72° С - 30 сек; 1 цикл общей элонгации: 95° С - 30 сек, 60° С - 30 сек, 72° С - 10 мин; охлаждение до 0°С. ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия). 2.1.12. Определение нуклеотидной последовательности гена ORF3 вируса ЭДС. Для секвенирования гена ORF3 по двум цепям использовали праймеры, разработанные Song с соавторами [2003]. Нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера при помощи секвенирования ПЦР-продукта с использованием набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) согласно инструкции изготовителя. Электрофорез ДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

2.1.16. Компьютерный анализ полученных последовательностей. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакетов программ BioEdit (version 7.0.0. Copyright© 1997-2004) и программы SeqMan из пакета программ Lasergene (version

7.1.0.(44) Copyright О 1993-2006).

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Культуральные свойства и аттенуация полевого изолята вируса ЭДС с целью получения вакцинного штамма. Полевой вирус эпизоотической диареи свиней (ЭДС) был передан в ЗАО НПО НАРВАК в виде культуральной жидкости. Данный вирус был выделен в культуре клеток Vero из кишечника больного поросёнка и к моменту передачи прошёл шесть серийных пассажей в культуре клеток Vero.

Серийное пассирование вируса в культуре клеток Vero и оценка его аттенуации. Прежде всего, предстояло выяснить культуральные и вирулентные свойства полученного вируса. Выявление спектра чувствительных линий клеток естественного хозяина представляло интерес с целью выбора наиболее пригодного клеточного субстрата для исследовательских и производственных целей. На первом этапе исследовали чувствительность линий клеток СПЭВ и ППК, используемых в работе с вирусом ТГС. В отличие от линии клеток Vero, обе линии клеток оказались нечувствительными к вирусу ЭДС. Поэтому для дальнейших исследований и прежде всего для аттенуации вируса ЭДС использовали линию клеток Vero.

В процессе решения различных задач вирус ЭДС прошёл более 100 серийных пассажей в культуре клеток Vero. Размножение вируса постоянно сопровождалось характерным ЦПЭ, который выражался в интенсивном формировании вакуолизированных синцитиев, сливающихся в симпласты (рис. 1). По мере пассирования период наступления выраженного ЦПЭ постепенно сокращался, а накопление вируса постепенно повышалось. Так, в течение первых 20 пассажей вирус накапливался в титре 3,0-3,5 Ig ТЦД50/МЛ, а после 40 пассажей титр вируса был в пределах 4,0-5,0 Ig ТЩЬо/мл.

Выраженный ЦПЭ наступал через 18 ч, а разрушение монослоя - через 24-26 ч после заражения (табл. 1).

Таблица 1. Инфекционностъ и цитопатическая активность штамма ИС в зависимости от длительности пассирования в культуре клеток Vero

Номер пассажа Фактическая множественность заражения, ТЦДзо/клетка Время наступления ЦПЭ, часы Характер ЦПЭ Накопление вируса, lg ТЦД50/мл

10-20 0,001 40-48 Единичные небольшие синцитии 3,00 - 3,50

21 -40 0,001 36-42 Отдельные синцитии 3,50-4,50

41 -60 0,01 18-24 Множественные синцитии 4,00-5,33

61 -80 0,01 18-20 Множественные синцитии или симпласт 4,66-5,66

81-115 0,1 16-18 Симпласт 5,50 - 6,50

Рис. 1. Цитопатогенный эффект вируса ЭДС в культуре клеток Vero. Увеличение х 100

A. Незаражённые клетки в монослое.

Б. Монослой через 15 ч после заражения вирусом.

B. Монослой через 20 ч после заражения вирусом.

Результаты проведенных исследований (табл.1) показали, что время наступления цитопатического эффекта и накопления вируса зависели от длительности пассирования и множественности заражения культуры клеток Vero. После 80 пассажей вирус накапливался максимально в титре 5,50 - 6,50 Ig ТЦДзо/мл.

Начиная с 40 пассажа, вирус периодически использовали для изготовления экспериментальных образцов живой вакцины.

С целью аттенуации полевой вирус серийно пассировали в культуре клеток Vero. Вирулентность культурального вируса ЭДС на уровне 15, 26 и 30 пассажей в культуре клеток Vero изучали в опытах на 2-3-дневных безмолозивных поросятах, полученных от свиноматок, серонегативных к вирусам ЭДС и TTC. Культуральную вируссодержащую жидкость поросятам вводили орально в объёме 2 мл. Доза вируса составляла 3,33 lg ТЦД50 (15 пассаж) и 3,66 lg ТЦД50 (26 и 30 пассажи). Вирус 15 пассажа вызвал слабовыраженную диарею через 16 часов после введения, которая прекратилась через 48 часов. У поросят, которым ввели вирус 26 пассажа, отклонений от нормального состояния не отмечали в течение всего периода наблюдения. Безмолозивные поросята, которым ввели вирус 30 пассажа, оставались нормальными в течение всего периода наблюдения (7 дней).

Из результатов этого опыта следует, что после 25-30 серийных пассажей в культуре клеток Vero вирус ЭДС полностью утратил вирулентность для новорождённых поросят.

Авирулентный штамм вируса ЭДС получил название ИС. В дальнейшем его использовали в исследовательских целях и разработке живой вакцины.

Антигенносгь штамма ИС в зависимости от длительности аттенуации вируса. Антигенные свойства штамма ИС, аттенуированного в культуре клеток Vero, определяли на серонегативных к вирусу ЭДС поросятах послеотьёмного возраста (35-40 дней). Поросят иммунизировали внутримышечно, однократно. Через 21 день после введения вируса определяли титр ВНА в сыворотке крови.

В первом опыте вирус, прошедший 40 пассажей в культуре клеток Vero, вводили в дозе 4,0 и 5,0 lg ТЦД30. Введение вируса вызывало образование ВНА в титре 1:32 - 1:40 и 1:60 - 1:80 соответственно дозе инокуляции. Данные этого опыта показали антигенность вакцинного штамма вируса ЭДС для свиней, степень которой зависит от дозы вакцины.

В следующем опыте с целью определения возможного диапазона пассирования вакцинного штамма ИС без снижения его антигенной активности исследовали вирус 40, 60 и 80 пассажей в культуре клеток Vero. Вирусом одного уровня пассажа прививали группу 35-40-дневных поросят, которых в соответствии с технологией в период доращивания содержали в одном секторе (53-71 голов). Доза иммунизации составляла 4,0 lg ТЦД50. Титр ВНА в сыворотке крови определяли у 5 поросят из каждого сектора.

Результаты исследования показали, что штамм ИС, прошедший 40, 60 и 80 пассажей в культуре клеток Vero, не различается по антигенной активности для свиней. Поросята, иммунизированные вирусом всех трёх уровней пассажа, развили антительный ответ сходной интенсивности. Титр ВНА составлял 1:30 - 1:40 (табл. 2).

Таблица 2. Антигенность штамма ИС в зависимости от длительности пассирования в культуре клеток Vero

Доза Число Титр ВНА

Пассаж вируса прививочного вируса, ТЦД50 привитых поросят До иммунизации (контроль) После иммунизации

40-45 104 60 1:15, 1:20, 1:15, 1:30, 1:40, 1:30, 1:30, 1:30(1:32)

60-65 104 53 1:10, 1:20(1:16) 1:60, 1:40, 1:30, 1:40, 1:30 (1:40)

80-85 10" 71 1:30, 1:40, 1:30, 1:30, 1:20(1:30)

Примечание. В скобках указан уровень ВНА в среднем по каждой группе поросят

Таким образом, вследствие аттенуации вируса ЭДС получен авирулентный штамм, обладающий выраженной антигенностью.

Изменения в геноме штамма ИС вируса ЭДС как результат адаптации к культуре клеток Vero. Адаптация и размножение вируса ЭДС в культуре клеток Vero сопровождается мутациями в неструктурном вирусном гене ORF3. Целью настоящего исследования являлось изучение изменений, произошедших в гене ORF3 штамма ИС в ходе его адаптации к размножению в культуре клеток Vero. Для этого сравнивали первичную структуру гена ORF3 трёх вариантов вируса: штамма ИС, прошедшего 70 и 110 пассажей в культуре клеток (соответственно ИС70 и ИС110), и полевого изолята. В качестве референс-последовательности была взята последовательность гена ORF3 прототипного штамма CV777 вируса ЭДС (GenBank, NCBI, номер доступа Z24733).

Сравнение последовательностей ORF3 ИС70, ИС110 и CV777 выявило делеции размером 29 и 38 нуклеотидов в 5'-концевом участке гена соответственно ИС70 и ИС110. 2.2.2. Оптимизация условий массового культивирования вируса. Для изготовления вакцинных препаратов большой интерес представляет повышение выхода культурального вируса. С целью получения максимально возможного выхода штамма ИС вируса ЭДС изучали зависимость накопления вируса в культуре клеток Vero от различных факторов: 1) состояния культуры клеток, 2) наличия следов сыворотки в среде, 3) дозы заражения и 4) способа культивирования (роллерная или статическая культура). Серию опытов проводили с длительно адаптированным вирусом (50-60 пассажей), обладающим выраженной репродукцией (значения инфекционной активности 4,50 - 5,50 Ig ТЦД50/МЛ).

Клетки Vero выращивали в 1,5 л матрасах или в роллерных сосудах ёмкостью 3 л. В культуру клеток, выращенную в 1,5 л матрасах или в 3 л роллерных сосудах, вносили соответственно по 150 или 250 мл поддерживающей среды DMEM с антибиотиком и трипсином (5 мкг / мл). Культуру клеток, выращенную различным способом, заражали вирусом одновременно и инкубировали при 37°С до выраженного цитопатогенного эффекта (поражение не менее 80% клеток монослоя).

Состояние культуры клеток. Сравнивали накопление вируса ЭДС в культуре клеток Vero в зависимости от интенсивности клеточного роста (формирование монослоя на 85-90 и на 95100%). После удаления ростовой среды и однократного промывания монослоя клеток раствором Хэнкса в культуральные сосуды вносили поддерживающую среду ДМЕМ, содержащую трипсин (5 мкг / мл) и вирус 75-85 пассажа (0,1 ТЦЦзо / клетка). Накопление вируса определяли через 18 ч после заражения при ярко выраженном ЦПЭ. Инфекционную активность вируса определяли титрованием в культуре клеток Vero.

Из результатов, представленных в таблице 3, видно, что в культуре клеток с более развитым монослоем вирус накапливается в большем титре. Наблюдения также показали, что возраст заражаемого монослоя Vero в пределах 48 - 96 ч имеет меньшее значение для накопления вируса ЭДС, чем численность (плотность) клеток в монослое.

Таблица 3. Накопление вируса в зависимости от интенсивности формирования клеточного монослоя

Номер Пассаж Титр вируса, lg ТЦДзо/мл

опыта вируса Монослой 85-90% Монослой 95-100%

1 75 5,33 - 5,50 5,50 - 6,00

2 80 5,00 - 5,33 5,33 - 5,76

3 85 5,17-5,33 5,66 - 6,00

Так как перед заражением при смене ростовой среды на поддерживающую в ней могут остаться следы сыворотки крови, которая угнетает репродукцию вируса ЭДС, представлялось целесообразным изучить значение такой возможности. Перед заражением однослойной культуры вирусом остатки ростовой среды, содержащей сыворотку, удаляли однократным промыванием раствором Хэнкса (20-25% объёма ростовой среды). В качестве контроля использовали культуру клеток без промывания раствором Хэнкса перед заражением.

Вирус (0,1 ТЦД;о/клетка) вносили вместе с поддерживающей средой. Накопление вируса в культуре определяли через 18 ч после инкубирования. В культуре клеток, отмытой от ростовой среды, титр вируса был выше в 30-50 раз по сравнению с титром вируса в неотмытой

культуре (табл. 4). Это, вероятно, связано с частичной нейтрализацией трипсина остатками

сыворотки ростовой среды.

Таблица 4. Влияние удаления следов ростовой среды перед заражением на размножение вируса ЭДС

Номер опыта Титр вируса, Ig ТЦД50/МЛ

Без удаления С удалением

1 3,76-4,23 5,33 - 5,66

2 3,33 - 3,66 5,00 - 5,50

3 4,00 - 4,50 5,50 - 5,83

Зависимость накопления вируса от дозы заражения. После удаления ростовой среды и однократного промывания раствором Хэнкса культуру клеток заражали вирусом с множественностью 0,1; 0,01; 0,001 и 0,0001 ТЦДзо/клетка. Через 18 ч во всех заражённых культурах развился ЦПЭ, характерный для вируса ЭДС. Интенсивность ЦПЭ коррелировала с заражающей дозой вируса. Все культуры клеток инкубировали до развития выраженного ЦПЭ.

Результаты этого исследования (табл. 5) показали прямую зависимость накопления вируса от дозы заражения независимо от уровня пассажа. Накопление вируса было максимальным (5,33-6,23 1% ТЩЦо/мл) в культуре клеток, инфицированной с множественностью заражения 0,01 и 0,1 ТЩЬо/клетка.

Таблица 5. Накопление вируса ЭДС при различной дозе заражения

Пассаж вируса Заражающая доза вируса, ТЦД50 /клетка

0,0001 0,001 0,01 0,1

Накопление вируса, lg ТЦД50/МЛ

50 4,33-4,76 4,83 - 5,23 5,33 - 5,50 5,50 - 5,83

80 4,23 - 4,50 5,00 - 5,33 5,50 - 5,66 5.66 - 6,23

Культивирование вируса ЭДС в роллерных и статических условиях. Культуру клеток Vero, сформировавшую монослой на 95-100% в статических матрасах объёмом 1,5 л и в роллерных бутылях объёмом 3 л, после удаления ростовой среды использовали для выращивания вируса ЭДС.

Вирус 82-86 пассажей с исходным титром 5,50-6,00 lg ТЦД50 /мл вносили в дозе 0,1 ТЦД50 /клетка вместе с поддерживающей средой (содержащей трипсин в концентрации 5 мкг/мл) после удаления следов ростовой среды. В каждом опыте заражали по 3-5 сосудов со статической или роллерной культурой. Урожай вируса собирали через 18 ч после заражения при ярко выраженном ЦПЭ.

Результаты исследования представлены в таблице 6. По накоплению вируса ЭДС оба способа культивирования практически не различались между собой.

Таблица 6. Накопление вируса в зависимости от способа культивирования

Номер Число заражённых культур Накопление вируса, lg ТЦЦ50/МЛ

опыта Статических Роллерных В статической культуре В роллерной культуре

1 5 5 4,76 - 5,23 5,00 - 5,50

2 6 5 5,00 - 5,50 5,00 - 5,66

3 6 3 5,33 - 5,66 5,33 - 5,66

Размножение штамма ИС в других линях клеток и в сублиниях клеток Vero. Данное исследование было проведено с целью возможного выявления высокопродуктивной линии клеток для производственного размножения штамма ИС вируса ЭДС. Изучали способность указанного штамма к размножению в культуре клеток перевиваемых линий различного происхождения (РК15, SK6, IB-RS2, MARC-145 и HRT). Прежде всего, интересовала возможность накопления вакцинного штамма в большем титре по сравнению с его накоплением в культуре клеток Vero.

Исходным материалом являлся штамм ИС 90 - 100 пассажа в культуре клеток Vero (5,50 - 6,00 lg ТЦДзо / мл). Размножение вируса в клеточных культурах различного происхождения определяли в течение нескольких серийных пассажей. Культуры клеток выращивали в пластиковых матрасах ёмкостью 50 см3.

Для заражения брали культуры клеток, сформировавшие монослой на 90-100% (24 - 48 ч после пересева). Перед заражением монослой дважды промывали от ростовой среды. В сосуды с отмытым монослоем вносили 10 мл соответствующей ростовой среды без сыворотки, содержащей вирус в дозе 0,1-1,0 ТЦД50 на клетку и трипсин в концентрации 5 мкг/мл. За развитием ЦПЭ наблюдали в течение 96 часов. В качестве контроля использовали те же культуры клеток, не заражённые вирусом, а также заражённую и незаражённую культуру клеток Vero. Культуры замораживали в период развития ЦПЭ, а при его отсутствии - через 96 часов после заражения. После размораживания культуральную жидкость использовали для очередного пассажа в гомологичной линии клеток (серийные пассажи).

Результаты адаптации вируса к новым линиям клеток учитывали по развитию ЦПЭ, биопробе в культуре Vero и с помощью ПЦР анализа.

Из данных, приведенных в табл. 7, видно, что из 6 исследованных линий клеток чувствительными к размножению штамма ИС после 100 пассажей в культуре клеток Vero оказались две линии: IB-RS2 и MARC-145.

В культуре клеток MARC-145 штамм ЭДС прошёл пять серийных пассажей, максимальная активность вируса (4,23 lg/мл) была в первых двух пассажах. В ходе дальнейшего пассирования в данной культуре активность вируса снижалась и в пятом пассаже составила около 3,00 lg/мл.

В культуре клеток IB-RS2 вирус прошёл восемь серийных пассажей, максимальная активность была отмечена в шестом пассаже (4,76 lg/мл).

Результаты данного исследования показали, что из всех использованных культур клеток только Vero поддерживает репликацию штамма ИС на относительно высоком уровне, удовлетворяющем требованиям изготовления живой вакцины. Только культуру клеток Vero использовали в дальнейшем для производственного культивирования вируса.

Таблица 7. Чувствительность различных линий клеток к размножению вакцинного

штамма ИС вируса ЭДС

Пассаж вируса Культура клеток Происхождение Размножение и цитопатические изменения Результат выявления вируса ЭДС

Номер пассажа В клетка х Vero Методо м ПЦР

1 2 3 4 5

90 СП ЭВ Почка свиньи + + + НИ НИ - -

90 PK-15 То же - - - - НИ - -

100 SK6 То же + + + + + - -

100 IB-RS2 То же - + + + + + +

100 MARC-145 Почка зелёной мартышки + + + + + + +

90 HRT Кишечник человека - - НИ ни НИ - -

Примечание. + наличие ЦПЭ. + сомнительный результат, - отсутствие ЦПЭ, НИ ~ не исследовачи

Так как предыдущее исследование показало, что для массового культивирования штамма ИС пригодна только культура клеток Vero, было целесообразно сравнить его накопление в культуре различных доступных сублиний клеток Vero. Культуру клеток Vero трёх сублиний: испанской, английской и российской (Vero В) выращивали и заражали в одинаковых оптимальных условиях. Из представленных в табл. 8 данных видно, что накопление вируса было сходным во всех использованных сублиниях клеток Vero. Любая из этих трёх сублиний клеток пригодна для производственного культивирования штамма ИС вируса ЭДС.

Таблица 8. Накопление штамма ИС в сублиниях клеток Vero

Сублиния Vero Испанская Английская Vero В (Россия)

Пассаж вируса ЭДС для заражения 85 87 90 85 88 90 87 88 90

Накопление вируса в сублинии, lg ТЦДзо / мл 5,66 6,17 6,00 5,76 5,66 6,00 6,00 5,66 6,00

2.23. Разработка технологии изготовления и контроля живой сухой вакцины в экспериментальных условиях. Предыдущие исследования позволили получить два важных результата, определивших дальнейшую стратегию разработки средств специфической профилактики ЭДС. Титр культурального вируса ЭДС повысился в ходе серийного пассирования в культуре клеток Vero, однако не достиг уровня, пригодного для изготовления инактивированной вакцины (> Ю70 ТЦДзо/мл). Серийное пассирование полевого вируса ЭДС в культуре клеток Vero относительно быстро (25-30 пассажей) привело к потере вирулентности, что было установлено в опыте на новорожденных поросятах. После потери вирулентности аттенуированный штамм вируса ЭДС ещё в течение длительного серийного пассирования в культуре клеток Vero сохранял выраженные антигенные и иммуногенные свойства. Эти данные определили возможность и целесообразность разработки живой вакцины на основе аттенуированного штамма ИС вируса ЭДС.

Были изготовлены экспериментальные серии живой вакцины против ЭДС: восемь серий сухой и три серии замороженной вакцины для проведения испытаний на безвредность (реактогенность) и сохранность в сухом и замороженном состояниях.

Живая вакцина против ЭДС получила название вакцина ВЕРРЕС-ЭДС. Изготовление сухой вакцины. Предстояло изучить влияние различных условий лиофилизации вакцины, допустимый срок хранения сухой вакцины и сохранность жидкой вакцины в замороженном состоянии.

Сохранность вируса ЭДС в процессе изготовления сухой вакцины. При производстве и использовании живых вакцин важное значение уделяется так называемой «холодовой цепи». Целью данного раздела работы являлась разработка способа производственного изготовления сухой вакцины ИС-ЭДС и условий её хранения, обеспечивающих максимальную биологическую активность вакцинного вируса. Максимальное сохранение биологической активности вакцинного вируса в сухом препарате является особенно важным, если учесть, что в

культуре клеток он накапливается в относительно низком титре (5,50 — 6,50 ТЦДзо/мл). Для достижения этой цели необходимо было выбрать: наиболее эффективную для данного вируса стабилизирующую среду, оптимальный режим лиофилизации и метод ускоренной оценки стабильности сухой вакцины.

В процессе изготовления сухой вакцины определяли титр вируса до смешивания со стабилизатором, после смешивания со стабилизатором, после замораживания (перед сушкой), сразу после сушки и после испытания сухой вакцины методом ускоренного старения. В качестве исходного материала для приготовления сухой вакцины использовали вирус 45 - 114 пассажей в культуре клеток Vero с титром 5,50 - 6,33 Ig ТЦД50 / мл.

Среда высушивания. Сравнивали протективную эффективность трёх защитных сред при лиофилизации вируса. Состав и способ приготовления сред №1, К»2 и №3 и смешивание их с вирусной суспензией описан в главе 1.5 раздела «Материалы и Методы». Лиофилизацию вируса со всеми вариантами защитной среды проводили одновременно в аппарате Christ Alpha. Протективный эффект трёх защитных сред по биологической активности вакцинного штамма оценивали сразу после лиофилизации.

Из представленных данных видно, что активность вируса ЭДС снижалась ещё на начальной стадии - после добавления стабилизирующей среды и последующего замораживания (табл. 9). Потеря активности вируса на этой стадии со средой №1, №2 и №3 соответственно составляла 0,00 -0,24, 0,33 - 0,50 и 0,00 - 0,34 lg ТЦД50 / мл.

В процессе высушивания с защитной средой №1 или №2 вирус терял 0,50 - 0,84 lg ТЦДзо! мл, а с защитной средой №3 - 0,66 - 0.84 lg ТЦД50 / мл.

Таким образом, суммарное снижение активности вируса по сравнению с исходной культуральной суспензией составило 0,66 - 0,84; 1,00 - 1,24 и 0,84 - 1,00 lg ТЦД50 / мл при использовании соответственно защитной среды №1, №2 и №3.

Для оценки стабильности вакцинного препарата в будущем при длительном хранении проводили испытание методом «ускоренного старения» (37°С, 7 суток). В ходе ускоренного старения активность вируса снижалась на 1,00; 1,43 — 1,53 и на 1,33 — 1,66 Ig ТЦДзо / мл соответственно в препаратах с защитной средой №1, №2 и №3.

Результаты проведённых исследований показывают, что наиболее эффективной из испытанных защитных сред является декстраново-желатиновая (среда №1, табл. 9).

Дополнительно была проведена сушка вирусной культуральной суспензии с консервированным концентрированным молоком (табл. 10). Вирусную суспензию смешивали с концентрированным молоком в отношениях 1:1, 2:1 и 4:1. Образцы сушили в сублиматоре Christ alpha. В качестве контроля одновременно сушили смеси вируса с декстраново-желатиновым и пептонно-желатозным стабилизаторами в соответствующих пропорциях.

Таблица 9. Активность вируса ЭДС при высушивании с тремя защитными средами

Защитная среда Активность вируса ЭДС, ^ ТЦД50! мл

Исходная суспензия Смесь вируса с защитной средой После замораживания После сушки После ускоренного старения

Декстраново-желатиновая (№1) 6,00 5,76 6,00 5,33 4,33

5,66 5,50 5,50 5,00 4,00

5,50 5,50 5,50 4,66 3,66

Пептонно-желатозная (№2) 6,00 5,66 5,66 4,76 3,23

5,66 5,50 5,33 4,66 3,23

5,50 5,33 5,00 4,50 3,00

Молоко обезжиренное (№3) 6,00 5,66 5,66 5,00 3,50

5,66 5,50 5,50 4,66 3,33

5,50 5,33 5,33 4,66 3,00

Таблица 10. Активность вируса при сушке с концентрированным молоком

Содержание молока в вирусной суспензии, % Активность вируса, ^ ТЦЦ50 / мл

Смесь вируса с защитной средой После замораживания После сушки После ускоренного старения

50 5,24 5,33 3,50 2,00

33 5,33 5,33 3,50 <2,00

20 5,50 5,50 4,00 2,33

Из результатов этих исследований, представленных в табл. 10, видно, что концентрированное молоко (обезжиренное и необезжиренное) в качестве защитной среды менее пригодно по сравнению с другими защитными средами. Увеличение концентрации молока в смеси не приводило к улучшению сохранности вируса в сухом препарате. Однако молоко хорошо защищало вирус при замораживании.

Изготовление экспериментальных серий сухой вакцины. С целью оценки воспроизводимости результатов изготовления сухой вакцины и дальнейшего изучения её свойств при хранении изготовили восемь экспериментальных серий сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС. В качестве защитной среды использовали декстраново-желатиновый стабилизатор. Лиофилизацию экспериментальных серий вакцины проводили в аппарате Christ Alpha, каждая серия насчитывала 80-100 флаконов.

Установлено, что после смешивания с защитной средой активность вируса снижалась не больше, чем на 0,16 lg ТЦД50 / мл, а в результате высушивания — на 0,50 — 0,84 lg ТЩЬо / мл. Суммарное снижение активности вируса по сравнению с исходной культуральной суспензией составляло 0,50-1,00 lg ТЦД50 /мл. В результате ускоренного старения инфекционная активность вируса в сухой вакцине снижалась на 1,00—1,23 lg ТЦД50 / мл (табл. 11).

Таблица 11. Изменение активности вируса в процессе изготовления экспериментальных

серий сухой вакцины

Серия вакцины Пассаж вируса Активность вируса, lg ТЦЦ;о/ мл

Исходная суспензия Смесь вируса со стабилизатором до сушки Вакцина после сушки Сухая вакцина после ускоренного старения

1 45 4,33 4,17(0,16) 3,66 (0,51) 2,66(1,00)

2 58 5,00 5,00 (0,00) 4,23 (0,77) 3,00(1,23)

3 91 5,66 5,50(0,16) 4,83 (0,67) 3,66(1,17)

4 102 5,50 5,50 (0,00) 4,66 (0,84) 3,66(1,00)

5 103 6,33 6,24 (0,09) 5,66 (0,58) 4,66(1,00)

6 111 5,66 5,66 (0,00) 5,00 (0,66) 4,00(1,00)

7 113 6,33 6,33 (0,00) 5,66 (0,67) 4,66(1,00)

8 114 6,00 6,00 (0,00) 5,33 (0,67) 4,33 (1,00)

Примечание. В скобках указано снижение инфекционной активности вируса по сравнению

с предыдущим этапом изготовления вакцины

Эти данные согласуются с результатами, приведёнными в табл. 9, и свидетельствуют о воспроизводимости выбранного режима изготовления сухой вакцины. Выбранный режим использовали в дальнейших исследованиях, а также при изготовлении производственных серий сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС.

Сохранность вакцинного штамма в сухой вакцине. Для определения срока годности вакцины образцы всех восьми экспериментальных серий помещали на хранение при 2-8° С (согласно инструкции по применению вакцины ВЕРРЕС-ЭДС). Через различный срок хранения (3, 6, 9 и 12 месяцев) определяли биологическую активность вакцины. Все серии вакцины, как указано выше, также были испытаны в режиме ускоренного старения. Результаты этого исследования приведены в табл. 12.

Таблица 12. Активность вируса в экспериментальных сериях сухой вакцины в процессе хранения при температуре 2 - 8° С

Серия Активность вируса, ^ ТЦД50 / мл

Сразу после сушки После ускоренного старения После хранения

Через 3 мес. Через 6 мес. Через 9 мес. Через 12 мес.

1 3,66 2,66 3,66 3,50 3,33 3,00

2 4,23 3,00 4,00 4,00 3,66 3,50

3 4,83 3,66 4,66 4,50 4,33 4,00

4 4,66 3,66 4,50 4,33 4,23 4,00

5 5,66 4,66 5,50 5,33 5,00 5,00

6 5,00 4,00 5,00 4,76 4,66 4,33

7 5,66 4,66 5,50 5,33 5,33 5,00

8 5,33 4,33 5,00 4,83 4,66 4,50

Через каждые три месяца хранения активность вируса в сухой вакцине снижалась на 0,00 - 0,33 ^ ТЦД50 / мл, за 12 мес. хранения активность вируса снижалась на 0,50 - 0,83 ТЦД50 / мл. При испытании в режиме ускоренного старения активность вируса в вакцине снижалась на 1,00 - 1,23 ^ ТЦД50 / мл (в большинстве случаев на 1,00 ^ ТЩЬо / мл).

Изучение стабильности сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС при испытании в режиме ускоренного старения в сравнении с её сохранностью при 2 - 8° С в течение 12 мес. показало ценность данного метода для предварительной оценки будущей стабильности вакцины при длительном хранении. Так, испытание 8 серий сухой вакцины методом ускоренного старения показало снижение титра инфекционности на 1,00 — 1,23 ТЦД50 / мл (в среднем на 1,00 тогда как те же серии вакцины через 12 месяцев хранения при 2-8° С снижали активность на 0,50-0,83 ^ ТЦЦ50 / мл (в среднем на 0,70 1§). Из результатов этого исследования можно сделать следующее заключение: если при ускоренном старении сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС

биологическая активность вакцинного штамма вируса снижается на 1,00 ТЦД50 / мл, можно с большой долей вероятности утверждать, что при хранении в течение 12 мес. при 2-8° С его активность снизится не больше, чем на 0,83 \g ТЦД50 / мл.

Таким образом, метод ускоренного старения представляет интерес как экспресс метод оценки новых стабилизаторов, режимов сублимации и в целом качества сухих вакцин. Контроль вакцины на безвредность и реактогенность. Безвредность аттенуированного штамма И С и сухой вакцины проверяли на морских свинках массой 350-400 г. Испытуемые препараты вводили однократно внутримышечно в область бедра. Вакцинный вирус и сухую вакцину вводили трём морским свинкам в дозе 4,0 ^ ТЦД50 в объёме 2 см3. За морскими свинками наблюдали в течение 10 дней. Все испытуемые препараты: вакцинный вирус 36 - 40 пассажей и сухая вакцина серий 1 и 2 оказались безвредными при контроле на морских свинках.

2.2.4. Разработка способа применения живой вакцины против ЭДС. Для иммунизации свиней против ЭДС в производственных условиях необходимо было определить схему введения вакцины. В связи с этим на данном этапе работы изучали антигенность вакцинного штамма в зависимости от способа введения, прививочной дозы вируса и кратности вакцинации. Способ введения вакцины. В качестве предварительного этапа провели оценку применения живой вакцины против ЭДС на серонегативных свиньях двух технологических групп: супоросных свиноматках (возраст 3,5—4 года) и поросятах послеотьёмного возраста (35-40 дней), с использованием различных способов введения живой вакцины, а также последовательности применения живой и инактивированной «кишечной» вакцины.

Для иммунизации свиней применяли вакцинный вирус в виде культуральной жидкости (активность 5,0-6,0 ^ ТЦДзо/чл) иинактивированную «кишечную» вакцину против ЭДС (табл. 13).

Таблица 13. Схема применения двух вакцинных препаратов

Схема вакцинации Супоросные свиноматки Послеотъёмные поросята

Вакцинация Ревакцинация Вакцинация Ревакцинация

1 Орально Орально - -

2 Орально В/М инакт. - -

3 - - Орально -

4 - - В/М жив. -

5 - - В/М жив. В/М инакт.

Примечания. Орально: вакцинный вирус в дозе 5,66 lg ТЦДю свиноматкам (ЛЫ и №2) или 5,0 lg ТЦДт поросятам; В/М жив.: живой вакцинный вирус внутримышечно в дозе 5,0 lg ТЦЦю: В/М инакт.: инактивированная вакцина внутримышечно в объёме 5 .мл.

Наличие и выраженность иммунитета определяли по титру ВНА в сыворотке крови свиней через 21 день после вакцинации и через 15 дней после ревакцинации.

ВНА в высоком титре обнаружены в сыворотке крови и молозиве вакцинированных свиноматок, а также в сыворотке крови их потомства.

Титр ВНА в молозиве при вакцинации по схеме 1 был выше, чем по схеме 2 (табл. 14). Высокий титр ВНА в крови новорождённых поросят указывает на эффективную передачу колостральных антител потомству. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии преимущества ревакцинации супоросных свиноматок инактивированной вакциной против ЭДС.

Таблица 14. Сероконверсия у вакцинированных свиноматок и колостральный иммунитет у их потомства

Схема Титр ВНА у свиноматок Колостральный иммунитет у новорождённых поросят

вакци- Сыворотка крови Наличие иммунитета

нации свиноматок До вакцинации После ревакцинации Молозиво Титр ВНА в крови при контрольном заражении 4

1 <1:10 1:320 1:320* 1 1 1 240 160 320 + + +

2 <1:10 1:240 1:240* 1 1 320 160 + +

1:80 +

Примечания: * - пробы молозива в день опороса, & - на основании данных ПЦР

В сыворотке крови поросят послеотьёмного возраста, полученной через 21 и 36 дней после вакцинации (независимо от ревакцинации), обнаружены ВНА в значительном титре (1:80-1:320). Наиболее высокий титр ВНА обнаружен у поросят, привитых двукратно внутримышечно. Титр ВНА у поросят повысился между 21 и 36 днями независимо от ревакцинации (табл. 15).

Принципиального различия в титре ВНА в крови вакцинированных свиноматок, новорождённых поросят и вакцинированных поросят послеотьёмного возраста не выявлено. Это свидетельствует о возможности использования поросят послеотьёмного возраста вместо супоросных свиноматок при оценке иммуногенности живой вакцины против ЭДС на стадиях её разработки, оптимизации способа применения, а также при выборочном контроле иммуногенности производственных серий вакцины на основе сероконверсии.

Таблица 15. Вирусиейтрализующие антитела в сыворотке крови 35-40-дневных поросят

Схема Номер Титр ВНА в сыворотке крови

вакцинации поросят До вакцинации Через 21 день после вакцинации Через 36 дней после вакцинации

1 <1:10 1:160 1 240

3 2 То же 1:160 1 160

3 То же 1:80 1 160

4 <1:10 1:120 1 240

4 5 То же 1:160 1 160

6 То же 1:160 1 240

7 <1:10 1:120 1 320

5 8 То же 1:80 1 160

9 То же 1:160 1 320

Для вакцинации свиней в производственных условиях выбрано внутримышечное введение, так как его эффективность была показана в предыдущем исследовании (схема 4, табл. 13).

Колостральный иммунитет у поросят. Экспериментальное заражение трёхдневных поросят вирулентным вирусом (по три поросёнка под каждой вакцинированной свиноматкой) не вызвало диарейного синдрома ЭДС или каких-либо отклонений от физиологической нормы за весь период наблюдения (7 дней). Незаражённые поросята также оставались клинически здоровыми. Исследование фекалий как экспериментально заражённых, так и незаражённых новорождённых поросят на наличие вируса ЭДС методом ПЦР в течение всего периода наблюдения дало отрицательные результаты.

Данные экспериментального заражения поросят, а также выраженный титр колостральных антител свидетельствуют о надёжном пассивном иммунитете у поросят, полученных от вакцинированных свиноматок (табл. 14).

Антигенность штамма ИС в зависимости от прививочной дозы. Минимальную дозу вируса ЭДС, обеспечивающую создание выраженного антительного ответа, определяли на свиньях. Использовали штамм ИС, прошедший 80 - 85 пассажей в культуре клеток Vero.

Исследования проводили в ранее неблагополучном по ЭДС хозяйстве, в котором супоросных свиноматок прививали инактивированной «кишечной» вакциной против ЭДС. Антигенность вакцинного штамма ИС вируса ЭДС изучали на ранее невакцинированных 65-70-дневных поросятах, у которых в данный период индивидуальная и групповая серопозитивность к вирусу ЭДС была на низком уровне (табл. 16).

Четыре группы поросят иммунизировали с использованием следующих прививных доз вируса: 5,0; 4,0; 3,0 и 2,0 lg ТЦД50 в объёме 2 мл. Антигенность вакцинного вируса оценивали по титру ВНА в сыворотке крови поросят в день вакцинации и через 21 день после вакцинации.

Сыворотку крови поросят всех групп исследовали одновременно. В качестве контроля служила сыворотка крови поросят, взятая в день иммунизации. Каждой дозой вируса прививали всех поросят в одном секторе (64-68 голов). Титр ВНА определяли у 5 поросят из каждого сектора.

Таблица 16. Антигенность вакцинного вируса в зависимости от прививочной дозы

Пассаж вируса Доза прививочного вируса, IgTUZbo Число привитых поросят Титр ВНА

До иммунизации После иммунизации

80-85 5,0 66 1:15, 1:20, 1:15, 1:10, 1:20(1:16) 1 1 60, 1:80, 1:80, 120, 1:60 (1:80)

80-85 4,0 68 1 1 60, 1:40, 1:40, 1:40, 30 (1:42)

80-85 3,0 64 1 1 20, 1:20,1:30, 1:30, 20 (1:24)

80-85 2,0 68 1 1 10, 1:10, 1:15,1:10, 20 (1:13)

Установлена прямая зависимость титра ВНА от прививочной дозы вируса. Увеличение дозы вируса в 10 раз сопровождалось повышением титра ВНА приблизительно в 2 раза (табл. 16).

Данные по зависимости антигенности штамма ИС вируса ЭДС от длительности аттенуации и от прививочной дозы суммированы в табл. 17. Установлено, что антигенность штамма ИС зависит от прививочной дозы, а не от продолжительности аттенуации в исследованном диапазоне - 40-85 пассажей.

Таблица 17. Суммарные данные о влиянии длительности аттенуации и прививочной дозы на

антигенность вакцинного штамма ИС

Пассаж вируса Доза вируса, lg ТЦЦ50 Число свиней Титр ВНА

Привито Исследовано Индивидуальные сыворотки Среднее значение по группе свиней

40-45 4,0 60 5 1:30, 1:40, 1:30, 1:30, 1:30 1:32

60-65 4,0 53 5 1:60, 1:40, 1:30, 1:40, 1:30 1:40

80-85 5,0 66 5 1.60, 1:80,1:80, 1:120, 1:60 1:80

4,0 71 5 1:60, 1:40, 1:40, 1:40, 1:30 1:42

3,0 64 5 1:20, 1:20, 1:30, 1:30, 1:20 1:24

2,0 68 5 1:10,1:10,1:15, 1:10, 1:20 1:13

Антигенность штамма И С в зависимости от кратности и дозы введения. Пять групп свиней в возрасте 65-70 дней иммунизировали внутримышечно одно- и двукратно с использованием разных прививочных доз вируса. Три группы свиней иммунизировали однократно в дозе 5,0; 4,0 и 3,0 ^ ТЦЦзо и две группы свиней иммунизировали двукратно в дозе 4,0 и 3,0 1ё ТЦЦзо в объёме 2 мл. Двукратную вакцинацию проводили с интервалом 15 дней. Антигенность вакцинного вируса оценивали по титру ВНА в сыворотке крови животных через 21 и 36 дней после прививки в случае однократной вакцинации и через 30 дней после второй прививки в случае двукратной вакцинации. Сыворотку крови всех групп свиней (по 10 голов в каждой) исследовали одновременно. В качестве контроля служила сыворотка крови, взятая в день иммунизации. Титр ВНА у свиней в день вакцинации в среднем по группе из 10 животных был равен 1:12.

Результаты данного исследования (табл. 18) показали, что: антигенность вакцинного штамма ИС находится в прямой зависимости от дозы вируса и кратности вакцинации; двукратная вакцинация в дозе 4,0 ^ ТЦД50 вызывала сходный антительный эффект с однократной вакцинацией в дозе 5,0 ^ ТЦД50 (титр ВНА 1:80); двукратная вакцинация в дозе 3,0 ^ ТЦД50 вызывала образование ВНА в значительно более низком титре (1:34), чем одно- и двукратная вакцинация с использованием более высоких доз вакцины.

Таблица 18. Антигенность штамма ИС для свиней в зависимости от дозы и кратности вакцинации

Доза вакцинации, 18 ТЦЦзо Кратность вакцинации Титр ВНА после вакцинации

Через 21 день Через 36 дней

5,0 Однократно 1 1 1 60;1:40;1:30;1:40; 30;1:60;1:40;1:30, 40;1:30 (1:40) 1 1 1 40; 1:60;1:120; 1:60; 60;1:60;1:40;1:60; 80; 1:80 (1:80)

4,0 Однократно 1 1 1 30; 1:40; 1:40; 1:30; 20; 1:20; 1:30; 1:20; 40; 1:40(1:32) 1 1 1 60; 1:80; 1:60; 1:40; 60; 1:40; 1:60; 1:80; 40; 1:80(1:60)

3,0 Однократно 1 (1 20,1:20,1:20,1:30,1:20 :20) 1:30,1:40,1:30,1:30,1:20 (1:30)

4,0 Двукратно Через 30 дней после вакцинации

1:80; 1:120; 1:60;1:60;1:80; 1:80;1:80;1:120; 1:80; 140(1:80)

3,0 Двукратно 1:30;1:40,1:30;1:40;1:30;1:20;1:30;1:30; 1:40; 1:30 (1:34)

Примечание: в скобках указан уровень ВНА в среднем по каждой группе

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что двукратная внутримышечная вакцинация более эффективна для формирования антительного ответа против вируса ЭДС у

свиней по сравнению с однократной вакцинацией. Двукратная вакцинация в дозе 4,0 Ig ТЦД50 представляется оптимальной для практического применения.

Применение экспериментальной серии сухой вакцины в неблагополучном по ЭДС хояйстве. Первую пробную серию сухой вакцины, изготовленную в конце 2008 г., применили в начале 2009 г. с целью испытания в неблагополучном по ЭДС хозяйстве СПК «Агрофирма Красная Звезда» Вологодской области. Результаты применения данной серии вакцины имели прототипное значение для дальнейшего массового изготовления и применения вакцины в неблагополучных по ЭДС хозяйствах. Экспериментальная серия сухой вакцины, приготовленная из вируса 40-45 пассажа в культуре клеток Vero, имела активность 4,0 lg ТЦД50 /мл.

Свиней прививали двукратно с интервалом 15 дней в объёме 2 мл. Супоросных свиноматок и ремонтных свинок прививали на 75-80 и 90-95 дни супоросности (примерно за 40 и 25 дней до опороса). Кроме того, прививали двукратно поросят в возрасте 30-35 дней. Специфическую сероконверсию, обусловленную вакцинацией, оценивали по титру ВНА в сыворотке крови привитых животных (табл. 19) и в молозиве свиноматок через сутки после опороса (табл. 20), а также в крови поросят через 2,4, 7 и 15 дней после рождения (табл. 21).

Таблица 19. Основные показатели антигенной и иммуногенной активности первой экспериметальной (прототипной) серии сухой живой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС

Группа животных Титр ВНА в сыворотке крови

Перед вакцинацией 3 недели после первой вакцинации 2 недели после второй вакцинации

Свиноматки основные (группа 1) 1:40; 1 1 80; 1:40; 1:80; 40 (1:60) 1:240; 1:320; 1:240; 1:160; 1:160(1:224) 1 1 240 320 1 1 320; 1 240 (1 320; 288)

Ремонтные свинки (группа 2) 1:10; 1 1 20; 1:10; 1:40; 20(1:20) 1:80; 1:120; 1:160; 1:160 (1:136) 1 1 240 240 1 1 160; 1 320(1 320; 256)

Поросята после отъёма (группа 3) 1:10; 1 1:20; 1 1 20; 1:20; 1:20; 10; 1:10; 1:20; 20(1:15) 1:160; 1:120; 1:80; 1:120; 1:160 (1:124) 1 1 1 160 120 120 1 1 1 160; 1 160; 1 160 (1 120; 160; 145)

Таблица 20. Поствакцинальные колостральные антитела

Титр ВНА в молозиве в день опороса

Основные свиноматки Ремонтные свинки

1:320; 1:240; 1:160; 1:120; 1:240; 1:320, 1:120; 1:120; 1:240; 1:240 (1:212) 1:120; 1:120; 1:240; 1:240; 1:160 (1:176)

Результаты исследования, приведённые в табл. 20, показали, что сухая вакцина в дозе 4,0 ^ ТЦЦзо /мл вызывала выраженную сероконверсию у всех трёх групп свиней, особенно после

двукратного применения. Кроме того, вакцинация поросят в послеотъёмный период показала возможность их использования при оценке вакцины в зависимости от дозы и схемы вакцинации. В данном неблагополучном по ЭДС хозяйстве специфическая серопозитивность перед вакцинацией была наиболее выраженной у основных свиноматок, по-видимому, за счёт предшествовавшего латентного инфицирования полевым вирусом (одна из характерных особенностей течения ЭДС в полевых условиях).

Исследование колострального иммунитета у двукратно вакцинированных свиней показало наличие в молозиве в день опороса специфических ВНА в высоком титре. У основных свиноматок - 1:120- 1:320, у ремонтных свинок - 1:120- 1:240.

Анализ динамики колостральных антител в сыворотке крови поросят в течение первых 15 дней жизни (табл. 21) показал постепенное снижение концентрации ВНА более чем в 3 раза (с 1:190 до 1:60). Исходя из этих данных можно заключить, что период полужизни колостральных антител против вируса ЭДС составляет около 7 дней.

Таблица 21. Титр материнских ВНА в сыворотке крови поросят-сосунов

Средний титр ВНА в молозиве в день опороса (из Табл. 20) Дни после рождения

2 4 7 15

1:212 1:120; 1:320; 1:160; 1:160 (1:190) 1:120; 1:80; 1:120; 1:120 (1:110) 1:120; 1:80; 1:80; 1:80 (1:90) 1:40; 1:80; 1:60; 1.60 (1:60)

2.2.5. Изготовление и применение живой сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС в хозяйствах, неблагополучных по ЭДС. Изготовление и контроль живой сухой вакцины в производственных условиях. При изготовлении производственных серий сухой вакцины использовали технологию, разработанную для изготовления экспериментальных серий сухой вакцины. В 2010-2011 гг изготовлено восемь серий сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС. Лиофилизацию вакцины проводили в аппарате Christ Epsilon. Использовали вирус, прошедший 60 - 100 пассажей в культуре клеток Vero, с титром инфекционной активности 5,50 - 6,33 lg ТЦД50 / мл. Перед лиофилизацией смесь вируссодержащей жидкости с защитной средой расфасовывали по 1 мл в 3 см3 флаконы, как описано в разделе Материалы и методы. Количество флаконов с вакциной в одной серии значительно различалось, от 1500 до 30 000. После определения активности вируса в сухой вакцине рассчитывали число прививочных доз вакцины в единице фасовки (1 мл во флаконе), исходя из значения 4,00 lg ТЦД50 для одной прививочной дозы вакцины.

Из данных, представленных в табл. 22, видна прямая зависимость снижения титра инфекционной активности вируса с увеличением объёма серии сухой вакцины. Так, например, при лиофилизации вакцины объёмом 1,2 - 2,3 л (серии 1-3) потеря инфекционное™ вируса составила 0,66 ^ ТЦД50 / мл, тогда как при лиофилизации вакцины объёмом 12 - 21,5 л (серии 4-8) потеря инфекционности составила 0,83 - 1,00 1$ ТЦЦ50/ мл. Однако следует отметить, что указанное различие не выявлялось при испытании серий вакцины методом ускоренного старения.

Таблица 22. Основные сведения, характеризующие изготовление производственных серий

сухой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС

№ серии Объём вируссодер жащей КЖ, л Объём смеси вируссодерж ащей КЖ и защитной среды, л Активность вируса в вакцине, lg ТЦД50/МЛ Число прививочных доз

Перед сушкой Сразу после сушки После ускоренного старения В 1 мл В серии

1 1,6 2,3 5,66 5,00 4,00 6 13 800

2 0,84 1,2 6,00 5,33 4,50 10 12 000

3 1,4 2,0 5,66 5,00 4,33 6 12 000

4 15,0 21,5 5,66 4,66 3,66 3 64 500

5 7,4 12,0 5,50 4,50 3,50 3 36 000

6 11,9 17,0 5,66 4,83 3,66 5 85 000

7 14,0 20,0 5,66 4,66 3,50 3 60 000

8 10,8 15,5 5,50 4,50 3,50 3 46 500

Распространение ЭДС в крупных свиноводческих хозяйствах России. С целью проведения эффективной вакцинопрофилактики ЭДС в промышленном свиноводстве России была изучена распространённость заболевания в 26 крупных свиноводческих хозяйствах (2007-2013 гг.). Так как по клинической картине ЭДС неотличима от трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС), диагностику проводили двумя лабораторными методами: обратной транскрипцией -полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) и имунохроматографией. Оба данных метода широко применяются для дифференцирования ЭДС и ТГС.

Методом ОТ-ПЦР на наличие РНК вирусов ЭДС и ТГС исследовали 310 проб кишечного материала, взятого от больных, погибших или вынужденно убитых свиней разного

возраста. 136 проб содержали вирус ЭДС, 18 — вирус ТГС, 6 проб содержали одновременно оба вируса.

Методом иммунохроматографии на наличие антигенов вирусов ТГС и ЭДС исследовали 110 проб кишечного материала, взятого в основном от больных поросят. Вирус ЭДС обнаружили в 46 пробах, вирус ТГС - в 22 пробах. Ни одной пробы, положительной на оба вируса, не выявлено.

Проведённое исследование показало значительно более широкое распространение ЭДС в промышленном свиноводстве России в настоящее время по сравнению с ТГС, что указывает на особую актуальность вакцинопрофилактики ЭДС в промышленном свиноводстве РФ с использованием опыта борьбы против TTC.

Вакцинопрофилактика ЭДС в производственных условиях. Как указано выше, в неблагополучных по ЭДС хозяйствах применяли три варианта вакцины против ЭДС. Однако основную роль в профилактике данного заболевания играла живая вакцина ВЕРРЕС-ЭДС. Эпизоотологическая эффективность данной вакцины была изучена в ходе её применяли в пяти неблагополучных по ЭДС хозяйствах: СПК «Агрофирма Красная Звезда» Вологодской области (-20 ООО свиней), МП «Совхоз Шелонский» Псковской области (-25 ООО свиней), ЗАО «Им. Фрунзе» Белгородской области (-40 ООО свиней), ЗАО «Тропарёво» Московской области (-13 000 свиноматок) и ЗАО «Алексеевский Бекон» Белгородской области (-14 000 свиноматок). Первые два хозяйства до 2009 года были неблагополучными по трансмиссивному гастроэнтериту свиней (ТГС), а с 2009 г. заболевание свиней ТГС прекратилось благодаря применению инактивированной культуральной вакцины ТР-1 (НПО НАРВАК). ЭДС в СПК «Агрофирма Красная Звезда» впервые зарегистрировали в январе 2008 г., а в остальных хозяйствах - в начале 2010 г. Наличие вируса ЭДС в данных хозяйствах было установлено неоднократными лабораторными исследованиями в ООО «НПО НАРВАК» и ВНИИЗЖ с применением ПЦР, РН, иммунохроматографии и ИФА.

Результаты вакцинации оценивали по прекращению заболевания в хозяйстве, общему состоянию иммунизированных свиней, рождаемости, сохранности и приросту массы тела поросят, а также по уровню ВНА в сыворотке крови и молозиве свиней.

СПК «Агрофирма Красная Звезда». ЭДС в хозяйстве проявилась массовой диареей и гибелью 80-90% новорождённых поросят. У свиноматок диарея возникала редко, протекала легко, без повышения температуры тела и каких-либо осложнений. У свиней в период доращивания и откорма диарейный синдром не наблюдали.

Для снижения экономического ущерба и при отсутствии других средств специфической профилактики в хозяйстве в марте 2008 г. стали применять инактивированную вакцину против ЭДС, приготовленную из кишечного вируса больных поросят. Её применяли аналогично

вакцине ТР-1 против TTC. Применение инактивированной вакцины сократило заболеваемость и гибель поросят с 80-90% до 40-50%, но не сопровождалось ликвидацией болезни. Поэтому в январе 2009 г. в соответствии с решением Россельхознадзора хозяйство начало испытание живой вакцины против ЭДС в производственных условиях. Экспериментальную живую вакцину против ЭДС применяли согласно временной инструкции ООО «НПО НАРВАК». Супоросных свиноматок прививали внутримышечно в дозе 4,0 lg ТЦД50 (2 мл) двукратно на 7580 и 90-95 дни супоросности. Заболевание ЭДС в хозяйстве прекратилось через 3-4 недели после начала вакцинации.

Всего в 2009 г. иммунизировали 6185 основных свиноматок и ремонтных свинок. От вакцинированных свиноматок получено 48 360 поросят (9,3 поросёнка на 1 свиноматку). Сохранность поросят, полученных от вакцинированных свиноматок на участке опороса (возраст поросят 30 дней), достигала 97%. Суточный привес массы тела поросят в группе 0-2 составил 270 граммов. При передаче на доращивание в возрасте 2 месяца масса тела поросят в среднем была 18,2 кг. При изучении влияния дозы вакцины и кратности её применения на создание иммунитета у вакцинированных свиноматок (170 голов) установлено, что однократная вакцинация в дозе 3,5 Ig ТЦД50 оказалась недостаточной для защиты их потомства, тогда как двукратная прививка основных свиноматок и ремонтных свинок в дозе 3,5 - 4,0 lg ТЦД50 надёжно защищала практически всех новорождённых поросят от ЭДС.

Кроме супоросных свиноматок живой вакциной против ЭДС были привиты 508 поросят 60-70-дневного возраста. Вакцинация супоросных свиноматок и поросят в период доращивания не сопровождалось какими-либо отклонениями от физиологической нормы. Заболевание и гибель новорождённого молодняка с признаками диареи, характерной для ЭДС, прекратились при опоросе вакцинированных основных и ремонтных свиноматок. Лабораторные исследования фекальных масс новорожденных поросят методом ПЦР подтвердили отсутствие ЭДС в хозяйстве. Благополучие хозяйства по ЭДС сохранялась до конца периода наблюдения (декабрь 2011 г.). Вакцинация против ЭДС в хозяйстве не проводится с конца 2009 г.

Экономическая эффективность применения живой вакцины против ЭДС в хозяйстве согласно его данным составила 2382000 руб.

Результаты испытания живой вакцины против ЭДС в СГТК «Агрофирма Красная Звезда» позволили хозяйству сделать следующее заключение: «Живая вакцина против ЭДС, разработанная ООО «НПО НАРВАК», является безопасным и высоко эффективным средством специфической профилактики ЭДС».

МП «Совхоз Шелонский». Эпизоотическую диарею в хозяйстве впервые обнаружили в январе 2010 у свиней в период откорма и доращивания. Заболевание сопровождалось диареей (фекальные массы серо-бурого цвета), угнетением, отказом от корма и истощением.

Температура тела была в пределах нормы. На участке доращивания из 7 564 свиней заболели 4500 голов (69%), погибли 46, вынужденно убиты 150 голов. На участке откорма из 9 619 свиней заболели 9 500 голов (~ 99%), погибли 32. На участке опороса из 5325 поросят заболели только 994 поросёнка (-20%), что, по-видимому, связано с естественной иммунизацией свиноматок к периоду опороса. Вспышка диареи также охватила холостых и супоросных свиноматок с клиническими признаками - угнетение, отказ от корма, фекальные массы серо-бурого цвета.

В феврале 2010 г. всех хряков и свиноматок независимо от стадии супоросности привили двукратно вакциной ВЕРРЕС-ЭДС. Всего было иммунизировано 1193 свиноматки, в том числе 170 ремонтных свинок. После вакцинации отклонений от нормы у матерей и их потомства не наблюдали. Заболевание ЭДС в хозяйстве прекратилось через 7 дней после вакцинации живой вакциной ВЕРРЕС-ЭДС. Сохранность поросят, полученных от вакцинированных основных свиноматок и ремонтных свинок, к периоду отъёма соответственно составила 96 и 94%.

ЗАО «Тропарёво». ЭДС в хозяйстве зарегистрировали в январе 2010 г. на одной из двух племенных ферм (-600 свиноматок), трёх репродукторах из пяти (по -2500 свиноматок в каждом) и двух площадках откорма из трёх.

В феврале - апреле 2010 г. в хозяйстве провели специфическую профилактику ЭДС с использованием живой вакцины ВЕРРЕС-ЭДС и инактивированной вакцины против ЭДС, изготовленной из кишечного вируса от заболевших в хозяйстве поросят. Обе вакцины были изготовлены в ООО «Ветбиохим» и применялись согласно временных инструкций, разработанных и утверждённых ООО «Ветбиохим». На племенной ферме №1 (—600 свиноматок) и репродукторе №3 (~2500 свиноматок), где ЭДС наблюдали в конце февраля - начале марта, применили живую вакцину. Отход новорождённых поросят составил 8-11% при технологической норме 8%, а масса тела поросят при отъёме снизилась в среднем на 500 г по сравнению с нормой.

На репродукторе №4 (-2500 свиноматок) при использовании инактивированной «кишечной» вакцины гибель поросят составила 49%, а масса тела к периоду отъёма снизилась в среднем на 2 кг по сравнению с нормой. На четырёх репродукторных фермах (-8000 свиноматок), где вакцинацию против ЭДС не проводили, гибель поросят составила 28-48%, а масса тела к периоду отьёма была в среднем на 2 кг меньше по сравнению с нормой (табл. 23). Таким образом, живая вакцина ВЕРРЕС-ЭДС является существенно более эффективным препаратом по сравнению с инактивированной «кишечной» вакциной, изготовленной из полевого вируса ЭДС.

Таблица 23. Основные результаты вакцинации против ЭДС в ЗАО «Тропарёво»

Наименование вакцины Число свиноматок на репродукторе Отход подсосных поросят, % Вес поросят при отъёме, кг

Живая вакцина ЭДС 600 11 5,5

Живая вакцина ЭДС 2500 8 6,0

-^активированная кишечна вакцина 2500 49 4,5

Невакцинированная ферма 600 48 4,7

Невакцинированная ферма 2500 47 4,7

Невакцинированная ферма 2500 46 4,7

Невакцинированная ферма 2500 28 4,5

ЗАО «Алексеевский Бекон». Испытание живой вакцины против ЭДС, изготовленной ООО «Ветбиохим», проводили с 20.02 по 06.03.2010 г. Хозяйство представляет собой пять изолированных друг от друга участков. В каждом из них имеются помещения павильонной застройки для воспроизводства (2 930 свиноматок), доращивания и откорма. Вспышка ЭДС возникла на двух свинокомплексах среди завезённых из-за рубежа ремонтных свинок. Однако гибели свинок после возникновения ЭДС не наблюдали. Так как свинокомплекс находился на начальной стадии формирования в период завоза маточного поголовья, воздействию возбудителя подверглись только супоросные свиноматки. В феврале - марте 2010 в данном хозяйстве применили живую вакцину против ЭДС.

В благополучном по ЭДС отделении «СК Пирогово 1» с профилактической целью иммунизировали 2771 свиноматку. После вакцинации у свиноматок и родившихся поросят каких-либо отклонений в физиологическом состоянии не отмечали. Число поросят в период отьёма оставалось в пределах технологической нормы, клинических проявлений, характерных для инфекционных болезней с диарейным синдромом, не наблюдали.

Результаты исследования сыворотки крови (табл. 24) ещё раз показали, что двукратная вакцинация супоросных свиноматок значительно эффективнее однократного применения вакцины ВЕРРЕС-ЭДС.

Таблица 24. Уровень гуморального иммунитета у супоросных свиноматок в зависимости

от кратности вакцинации

Наименование хозяйства Кратность вакцинации Титр ВНА у свиноматок

В день вакцинации Через 15 дней после вакцинации Через 15 дней после ревакцинации

Сыворотка крови Молозиво Сыворотка крови Молозиво

ЗАО «Тропарёво» Двукратная <1:4; 1:4; <1:4; <1:4; <1:4 1:20; 1:40, 1:40; 1:60; 1:40 (1:40) Н.И. 1:60;1:120; 1:120; 1:80; 1:80 (1:92) 1:80;1:120; 1:80; 1:120; 1:120 (1:104)

ЗАО «Алексее вский Бекон» Однократна! <1:4; <1:4; <1:4; <1:4 1:40; 1:30; 1:40; 1:40; 1:30 (1:36) 1:40;1:60; 1:60; 1:40; 1:40(1:48) НИ НИ

Примечание. В скобках указаны средние значения по группе. НИ - не исследовали

ЗАО «Им. Фрунзе». Вакциной ВЕРРЕС-ЭДС с марта по май 2010 г. вакцинировали 258 основных свиноматок и 102 ремонтных свинок, от которых при опоросе получили по 1828 и 755 поросят. Из числа новорождённого потомства признаки диареи обнаружены соответственно у 198 и 50 поросят. Сохранность молодняка к периоду отъёма в группе основных свиноматок была 89,1%, а в группе ремонтных свинок - 93,4%. Сохранность поросят в целом по сравнению с периодом, предшествовавшим вакцинации, возросла на 40%. При иммунизации свиноматок отклонений от нормы у матерей и у потомства не отмечали. Заболевание ЭДС в хозяйстве прекратилось через 14 дней после вакцинации свиноматок. 2.2.6. Одновременная и последовательная вакцинация свиней против ЭДС и ТГС. Вирусные гастроэнтериты свиней имеют широкое распространение и причиняют значительный экономический ущерб промышленному свиноводству развитых стран. К этой группе клинически сходных заболеваний относят трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГС), эпизоотическую диарею свиней (ЭДС) и ротавирусную диарею свиней (РВДС). В практических условиях часто имеет место одновременное течение двух заболеваний. Это прежде всего относится к ТГС и РВДС. Отмечены также случаи последовательной смены ТГС на ЭДС в одних и тех же хозяйствах без заметного временного интервала. В связи с этим представляется целесообразным изучить возможность одновременной иммунизации супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС.

В работе использовали основных свиноматок на второй и третьей супоросности. Все свиноматки перед вакцинацией были серонегативными в отношении вирусов ТГС и ЭДС.

Для иммунизации свиноматок использовали живые сухие моновалентные вакцины. Вакцина против ТГС изготовлена из природно аттенуированного мутанта вируса ТГС

(респираторный коронавирус свиней (РКВС), штамм Holland). Вакцина против ЭДС изготовлена из атгенуированного штамма ИС вируса ЭДС. Кроме живой вакцины против TTC использовали инактивированную ГОА-вакцину ТР-1, изготовленную из культурального вакцинного штамма ТМК вируса ТГС. Все указанные вакцины произведены в ООО «НПО НАРВАК» по соответствующим технологиям.

Свиноматок иммунизировали живыми моно- и бивалентными вакцинами внутримышечно в область шеи, двукратно, на 75-80 и 90-95 дни супоросности. При одновременном применении живой вакцины против ЭДС и инактивированной вакцины против ТГС (ТР-1) их вводили свиноматкам одновременно внутримышечно с разных сторон шеи в указанные сроки супоросности.

Живые вакцины вводили в следующих дозах: ТГС (РКВС) - 5,0 lg ТЦДзо, и ЭДС -4,0 lg ТЦД50. Инактивированную вакцину ТР-1 вводили в объёме 2 мл. При одновременном применении двух сухих живых вакцин их после растворения смешивали таким образом, чтобы в прививочном объёме содержалась одна прививочная доза каждой вакцины.

Свиноматок прививали моновалентными вакцинами раздельно против ЭДС и ТГС или одновременно против двух заболеваний. Каждой моновалентной или бивалентной вакциной прививали по 5 свиноматок.

Эффективность иммунизации свиноматок оценивали по уровню ВНА против каждого исследуемого вируса в сыворотке крови до и после иммунизации. Кровь у свиноматок брали в день первой иммунизации и через 1-2 дня после опороса. Титр ВНА к вирусу ЭДС определяли в культуре клеток Vero, а к вирусу ТГС - в культуре клеток СПЭВ. В этих опытах сравнивали пять схем вакцинации:

1. Раздельное введение двух живых сухих вакцин: ВЕРРЕС-ЭДС и РКВС;

2. Введение бивалентной живой вакцины против ЭДС и ТГС;

3. Одновременное введение живой вакцины против ЭДС и инактивированной вакцины против ТГС;

4. Последовательное введение живой вакцины против ЭДС и инактивированной вакцины против ТГС;

5. Последовательное введение инактивированной вакцины против TTC и живой вакцины против ЭДС.

Выраженность иммунного ответа супоросных свиноматок на введение различных моно-и бивалентных вакцин оценивали по уровню специфических ВНА.

Антигенность моновалентных живых вакцин. Сравнительное испытание живых вакцин против ЭДС и ТГС выявило их различную антигенную активность для супоросных свиноматок. Живая вакцина против ЭДС обладала более выраженной антигенной активностью, чем живая

вакцина против ТГС. Титр ВНА в среднем по группе свиноматок соответственно составлял 1:64 и 1:51 (табл.25).

Таблица 25. Антигенность моновалентных живых вакцин против ЭДС и ТГС

Вакцина ВЕРРЕС-ЭДС РКВС (против ТГС)

Титр ВНА к гомологичным вирусам 1:32, 1:32, 1:64, 1:64, 1: 128(1:64) 1:64, 1:32, 1:32, 1:64, 1:64(1:51)

Примечание. В скобках указано среднее значение титра ВНА по группе супоросных свиноматок

Антигенность бивалентной живой вакцины (ЭДС+ТГС). Антигенную активность живой бивалентной вакцины против ЭДС + ТГС сравнивали по титру ВНА к вирусам, входящим в её состав. Результаты этого опыта показали снижение антигенной активности обоих вирусов в бивалентной вакцине по сравнению с моновалентными аналогами (табл. 26). Следовательно, вакцинацию против ЭДС и ТГС с применением живых вакцин целесообразно проводить раздельно.

Таблица 26. Антигенность бивалентной живой вакцины

Титр ВНА к вирусу ЭДС Титр ВНА к вирусу ТГС

На бивалентную вакцину ЭДС+ТГС На моновакцину против ЭДС На бивалентную вакцину ЭДС+ТГС На моновакцину против ТГС

1:16, 1:32, 1:16, 1:32, 1:64(1:32) 1:32, 1:32, 1:64, 1:64, 1: 128(1:64) 1:8, 1:8, 1:16, 1:16, 1: 16(1: 13) 1:64, 1:32, 1:32, 1:64, 1:64(1:51)

Примечание. В скобках указано среднее значение титра ВНА по группе супоросных свиноматок

Одновременное введение вакцин ВЕРРЕС-ЭДС н ТР-1. Учитывая особую актуальность защиты свиней от ТГС и наличие высокоэффективной инактивированной вакцины ТР-1 в качестве основного средства специфической защиты от ТГС в производственных условиях, а также снижение эффективности бивалентной живой вакцины, представлялось важным изучить возможность её одновременного применения с живой вакциной против ЭДС.

В хозяйстве СПК «Агрофирма Красная Звезда» серонегативных свиноматок прививали одновременно против ЭДС и ТГС.

В хозяйствах МП «Совхоз Шелонский» и ЗАО «Залесье» Ярославской обл. свиноматок вакцинировали против TTC, а затем спустя 30-45 дней -против ЭДС. Вакцинацию против ТГС в обоих хозяйствах проводили с профилактической целью, тогда как вакцинацию против ЭДС в тех же хозяйствах проводили в экстренном порядке в связи с внезапным возникновением данного заболевания.

Результаты исследования (табл. 27) показали, что инактивированная вакцина ТР-1 против ТГС обладает значительно более выраженной антигенной активностью по сравнению с живой вакциной на основе РКВС (табл. 25 и 26). При одновременном применении вакцин ТР-1 и ВЕРРЕС-ЭДС снижалась антигенная активность обеих вакцин примерно в 1,5 раза по сравнению с их раздельным применением. Вместе с тем введение вакцины ТР-1, а через 30-45 дней вакцины ВЕРРЕС-ЭДС приводило к такому же антительному ответу к обоим вирусам, как и после их раздельного применения. Эти данные свидетельствуют о значительном подавлении развития иммунитета к обоим вирусам при одновременном применении двух вакцин и указывают на целесообразность их последовательного применения.

Таблица 27. Антигенная активность комбинированной вакцинации супоросных свиноматок

против ТГС и ЭДС

Титр ВНА Хозяйство Вакцины

ТР-1 ВЕРРЕС-ЭДС ТР-1 + ВЕРРЕС-ЭДС

К вирусу ТГС Красная Звезда 1:240 — 1:140

Шелонский 1:80 _ _

Залесье 1:128 _ 1:80

К вирусу ЭДС Красная Звезда — 1:60 1:42

Шелонский 1:60 _

Залесье _ 1:80 1:60

Последовательная вакцинация супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС. Приведённые выше данные показали, что при одновременном применении вакцины против ТГС (инактивированная вакцина ТР-1) и ЭДС (живая вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) защитный эффект вакцинации против ТГС может быть значительно снижен. Кроме того, возникают технические неудобства (введение вакцин с двух сторон шеи), Поэтому представлялось целесообразным изучить эффективность последовательной вакцинации супоросных свиноматок против ТГС и ЭДС. В опыте использовали две группы по 7 супоросных свиноматок. Одну группу супоросных свиноматок (группа 1) вакцинировали вначале против ТГС (вакцина ТР-1), а спустя 21-30 дней - против ЭДС (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС). Другую группу супоросных свиноматок (группа 2) вакцинировали вначале против ЭДС, а спустя 21-30 дней — против ТГС. В каждой группе вакцинировали по 7 серонегативных свиноматок. Кровь для определения титра ВНА у

свиноматок обеих групп брали дважды через 21 день после введения первой вакцины и через 21 день после введения второй вакцины.

Результаты этого опыта (табл. 28) показали, что при последовательной вакцинации супоросных свиноматок против TTC (вакцина ТР-1), а затем против ЭДС (вакцина ВЕРРЕС-ЭДС) и наоборот с интервалом между вакцинациями 21 день антигенность указанных вакцин не снижается. Для гуморального иммунитета не имеет существенного значения, какую из двух вакцин применяли сначала, а какую - потом. Такая схема вакцинации удобна для практического применения против обоих заболеваний и может быть использована в случае необходимости.

Таблица 28. Эффективность двух схем последовательной вакцинации супоросных свиноматок

против ТГС и ЭДС

Группа вакцинированных свиноматок Титр ВНА к вирусу ТГС, срок после первой вакцинации Титр ВНА к вирусу ЭДС, срок после первой вакцинации

21 день 42 дня 21 день 42 дня

1 1:80, 1:160, 1:120, 1:240, 1:80, 1:120, 1:180 1:240, 1:80, 1:60, 1:180, 1:200, 1:160, 1:160 1:50, 1:80, 1:30, 1:40, 1:60, 1:30, 1:40

2 1:240, 1:80, 1:60, 1:180, 1:200, 1:160, 1:160 1:30,1:60, 1:40, 1:40, 1:30, 1:60, 1:30 1:30, 1:60, 1:40, 1:40, 1:30, 1:60, 1:30

Примечание. В скобках указано среднее значение титра ВНА по группе свиноматок

3. ВЫВОДЫ

1. Вирус эпизоотической диареи свиней (ЭДС) по способности размножаться in vitro представляет редкое исключение. Он не размножается в линиях клеток естественного хозяина - свиньи (линии СПЭВ, ППК, РК-15), но размножается в линии клеток нечувствительного вида — обезьяны (линия Vero).

2. Серийное пассирование вируса ЭДС в культуре клеток Vero сопровождалось выраженным ЦПД с образованием синцития и симпластов, умеренным накоплением инфекционного вируса и быстрой аттенуацией.

3. Вирус ЭДС после 26-30 пассажей в культуре клеток Vero утратил вирулентность и не вызывал заболевание суточных безмолозивных поросят при оральном введении. Авирулентный вирус, получивший название штамм ИС, явился основой для создания живой сухой вакцины против ЭДС.

4. Штамм ИС отличается от вирулентного вируса ЭДС делецией в гене ORF3 (не менее 30

нуклеотидов), размер которой увеличивался по мере пассирования в культуре клеток Vero.

5. При массовом размножении штамма ИС в культуре клеток Vero в оптимальном режиме (сформированный монослой, отсутствие следов сыворотки, наличие трипсина 5-10 мкг/мл, М=0,1 ТЦД5о/клетка, 18-24 ч, 37°С) вирус накапливался в титре 105-0-J06-3 ТЦД50/МЛ. Роллерное культивирвание не повышало накопление вируса.

6. Вакцинный штамм ИС сохранял выраженные антигенные (иммуногенные) свойства в процессе серийного пассирования в культуре клеток Vero в течение не менее 90 пассажей (срок наблюдения).

7. Уровень гуморального иммунитета у свиней зависел от дозы и кратности введения вакцинного вируса. Двукратная вакцинация существенно повышала иммунный ответ. При однократном введении увеличение дозы вируса в десять раз (102, 103, 104 и 105 ТЦДзо) повышало титр вируснейтрализующих антител (ВНА) примерно в 2 раза. Двукратное введение вируса в дозе 104 ТЦДзо вызывало такой же иммунный ответ, как однократное введение в дозе I О5 ТЦД50.

8. Двукратная внутримышечная иммунизация свиноматок штаммом ИС в дозе I О4 0 ТЦДзо с

интервалом 2 недели сопровождалась образованием ВНА в титре 1:80 - 1:320, что указывало на наличие протективного иммунитета.

9. Вакцинированные свиноматки с титром ВНА в молозиве в день опороса не менее чем 1:120

способны защищать поросят от ЭДС колостральными антителами не менее чем в течение первых двух недель. Период «полураспада» колостральных ВНА при ЭДС соответствует 7 дням.

10. Активность вируса в сухой живой вакцине ВЕРРЕС-ЭДС, изготовленной в оптимизированном режиме, снижалась в процессе лиофилизации на 0,6 - 0,8 lg ТЦДзо /мл и в процессе хранения сухой вакцины (2 - 8°С) в течение 3, 6 и 12 месяцев соответственно на 0,3, 0,6 и 0,8 lg ТЦДзо/мл. Инфекционная активность вируса в процессе изготовления и хранения сухой вакцины в течение 12 месяцев снижалась не более чем на 1,5 lg ТЦЦ50 /мл.

11. Живая вакцина ВЕРРЕС-ЭДС по эффективности значительно превосходит инактивированную вакцину из кишечного вируса ЭДС больных поросят.

12. При необходимости создания иммунитета одновременно против эпизоотической диареи и трансмиссивного гастроэнтерита свиней вакцинацию следует проводить последовательно соответствующими вакцинами с интервалом 21 день независимо от очерёдности их введения.

4. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ Живая сухая вакцина против ЭДС

о Вакцинный штамм ИС вируса ЭДС. Депонирован в коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России. Удостоверение ГКВ 2467 от 08.10.2009. Стандарт ООО Ветбиохим 2010 г., № 42418073-0019-2010 о Вакцина ВЕРРЕС-ЭДС против ЭДС, живая, сухая.

Стандарт ООО Ветбиохим 2010 г., № 76418883-0003-2010 Инструкция по применению утверждена 04.10. 2010 г. Производственный регламент

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 5.1. Публикации в журналах из перечня ВАК

1. Сергеев, О.В. Эпизоотическая диарея свиней (обзор). / О.В. Сергеев // Вопросы

вирусологии. - 2009. - т.54, №2. - С. 4-8.

2. Сергеев, О.В. Коронавирусные гастроэнтериты свиней (обзор). / О.В. Сергеев // Российский Ветеринарный Журнал. Сельскохозяйственные животные. - 2009. - №2. - С. 20-23.

3. Сергеев, О.В. Испытание аттенуированного штамма вируса эпизоотической диареи свиней в

лабораторных условиях. I О.В. Сергеев, Т.И. Алипер, А.Н. Мухин, В.А. Сергеев И Ветеринария. - 2010. - №1. - С. 21-25.

4 Сергеев, О.В. Использование аттенуированного штамма ИС вируса эпизоотической диареи свиней для изготовления живой вакцины. / О.В. Сергеев, Т.И. Алипер, В.А. Сергеев // Ветеринария. - 2010. - №10. - С. 22-25.

5. Сергеев, О.В. Рецепторные взаимодействия вируса и клетки как начальный этап инфицирования. / О.В. Сергеев // Вопросы вирусологии. - 2011. - т.56, №4. - С. 4-8.

6. Сергеев, О.В. Применение живой вакцины против эпизоотической диареи свиней в производственных условиях. / О.В. Сергеев, Н.В. Логинов, З.В. Гордеева, Т.И. Алипер, В.А. Сергеев // Ветеринария. - 2011. - №6. - С. 8-11.

7. Сергеев, О.В. Одновременная вакцинация свиней против вирусных гастроэнтеритов. / О.В. Сергеев, Т.И. Алипер // Российский Ветеринарный Журнал. Сельскохозяйственные животные. - 2012. - №2. - С. 26-27.

8. Сергеев, О.В. Изменения в последовательности гена ORF3 штамма ИС вируса эпизоотической диареи свиней (ЭДС) как результат адаптации к культуре клеток Vero. / О.

B. Сергеев, А.Г. Южаков, Т.В. Гребенникова, Т.И. Алипер // Ветеринария. - 2012. - №11. -

C.31-32.

9. Сергеев, О.В. Изготовление сухой живой вакцины ИС-ЭДС против эпизоотической диареи свиней. / О.В. Сергеев, П.С. Кочетков, Е.С. Сербис // Ветеринария Кубани. - 2013. - №1. -С. 27-30.

10. Латышев, O.E. Дифференциальная диагностика коронавирусных гастроэнтеритов свиней. / O.E. Латышев, М.А. Арутюнова, О.В. Елисеева, О.В. Сергеев, Т.В. Гребенникова, O.A. Верховский, Т.И. Алипер // Российский Ветеринарный Журнал. Сельскохозяйственные животные. - 2014. - №2. - С. 22-24.

5.2. Публикация в сборнике трудов конгресса

11. Sergeyev, O.V. Efficacy of a live vaccine against porcine epidemic diarrhea (PED). / O.V. Sergeyev, T.I. Aliper // 5th Vaccine & ISV Congress, Abstract Book; Seattle (USA), 2011. -Abstr. P3.4.3.

5.3. Патент

12. Патент № 2440823, Российская Федерация, А61К, А61Р. Живая сухая вакцина «ИС»

против эпизоотической диареи свиней и способ профилактики эпизоотической диареи свиней/ Сергеев О.В., Алипер Т.И., Сергеев В.А., Непоклонов Е.А.// Заявка № 2010131048 от 27.07.2010, опубл. 27.01.2012, Бюл.№3 - 7 с.

Подписано в печать: 12.08.2014 Объем: 2,6 усл.пл. Тираж: 100 экз. Заказ № 985 Отпечатано в типографии «Реглет» 107031, г. Москва, ул. Рождественка, д. 5/7, стр. 1 (495) 623 93 06; www.reglet.ru