Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Разработка и усовершенствование биологических препаратов для диагностики и специфической профилактики хламидиоза животных
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов
Автореферат диссертации по теме "Разработка и усовершенствование биологических препаратов для диагностики и специфической профилактики хламидиоза животных"
На правах рукописи
ЕВСТИФЕЕВ ВИТАЛИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ
РАЗРАБОТКА И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ХЛАМИДИОЗА ЖИВОТНЫХ
06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксиколошей и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
13 МАЙ 2015
005568562
Казань-2015 г
005568562
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») г. Казань.
Научный консультант: Иванов Аркадий Васильевич - Член-
корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РТ и РФ
Официальные оппоненты: Еремец Владимир Иванович — доктор
биологических наук, профессор, зам. директора по науке Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности
Васильев Дмитрий Аркадьевич — доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии им. П. А. Столыпина
Госмапов Рауис Госмановпч — доктор ветеринарных наук, профессор кафедры микробиологии и вирусологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана
Ведущее учреждение:
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко» (ФГБНУ ВИЭВ)
Защита состоится «7» июля 2015 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» по адресу: 420075, г. Казань, Научный городок- 2, ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»; e-mail: \nivi@mail.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г.Казань). Текст объявления о защите размещен на официальном сайте ВАК РФ (http://www.vak.ed.gov.ru); полный текст диссертации, автореферата и отзыв научного консультанта - на официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (http://www.vmvi.ru).
Автореферат разослан <<Jfy> <■-У 2015 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
с. с ^^^ Степанов В.И.
1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследований. Под хламидиозами в настоящее время понимают широкий спектр различных заболеваний диких, домашних и сельскохозяйственных животных, пгац и человека, вызываемых микроорганизмами семейства СЫатусИасеае из порядка СЫ ату так;;. Объединенные этиологаяески эти заболевания различаются по характеру течения и клиническим признакам и в зависимости от тропизма возбудителя поражают практически все системы и органы, передаются между видами животных и человеку, что придает этой инфекции признаки классического зооантропоноза [6, 13, 16].
Отсутствие специфичных и выраженных признаков заболевания хламидиозом, часто латентное течение с периодами обострения, недоступность для антибиотиков на внутриклеточной стадии биологического цикла и иммунологическая толерантность больного организма делают эту инфекцию особенно коварной и способствуют её широкому распространению.
Избирательное поражение тканей, органов и систем при хламидиозе животных обусловлено возрастными, половыми особенностями и физиологическим состоянием организма и клинически проявляется в виде абортов у коров, овец, коз, свиней и лошадей; рождения нежизнеспособного и слабого молодняка; пневмоний, артритов, энтеритов, энцефаломиелитов и конъюнктивитов у телят, ягнят, жеребят и поросят. У быков-производителей часто наблюдается латентное течение в форме бессимптомного хламидионосительства с периодической элиминацией возбудителя сопровождающейся развитием уретрита, орхита, простатита и балянопостита. При этом использование зараженной хламидиями спермы для осеменения коров и телок создают реальные предпосылки для массового распространения инфекции. У инфицированных животных развивается бесплодие, снижается продукгавность и племенная ценность [6, 14, 16].
Анализ данных о действительном уровне распространённости хламидиоза и ущгрбе, наносимом здоровью людей, птицеводству и животноводству, доказывает, что болезнь . представляет собой заслуживающую внимания проблему для животноводства [7, 12].
Учеными были описаны и изучены большинство хламидийных инфекций сельскохозяйственных животных, разработана их диагностика и специфическая профилактика [3, 5, И, 16, 17]. И хотя в этой области и были достигнуты значительные успехи, уровень имеющихся средств диагностики и специфической профилактики хламидиозов не удовлетворяют современным требованиям ветеринарной службы РФ.
Поэтому разработка и усовершенствование средств диагностики и специфической профилактики хламидиозов с.-х. животных, а также их внедрение в ветеринарную практику остаются важнейшей задачей на современном этапе развития биологической науки.
Смешанные инфекции среди маточного поголовья свиней, сопровождающиеся нарушением функции воспроизводства и проявляющиеся рождением нежизнеспособных поросят, гибелью и рассасыванием эмбрионов, смещением ожидаемых опоросов, мумификаций плодов, абортами и мертворождениями, получили значительное распространение.
Наиболее часто, наряду с хламидиозом, у свиней регистрируется парвовирусная инфекция [4]. Учитывая общность клинического проявления, а также совместную этиологическую роль этих возбудителей, представлялось целесообразным создание ассоциированной инактивированной вакцины против парвовирусной и хламидиозной инфекции свиней.
Степень разработанности проблемы. Изучение хламидиозов сельскохозяйственных животных ведется с середины прошлого века, когда МсЫий [23] в 1940 году описал энцефалит крупного рогатого скота. За это время хламидиозы были описаны и изучены практически у всех видов животных [3, 9, 16]. В 80-90-е г. изучены биохимические, антигенные и генетические характеристики хламидийной клетки [20,21].
В дальнейшем были разработаны средства диагностики и специфической профилактики хламидиозов. В нашей стране крупный вклад в создание средств диагностики хламидийных инфекций ннесли сотрудники лаборатории института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР, руководимой И.И. Терских. Ими был разработан оригинальный антиген для внутрикожной пробы у птиц, а также антиген (орвитозный) дляРСК [14].
Крупный вклад в решение проблем диагностики хламидиоза внесли и вносят ученые ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань). Х.З. Гаффаров, Р.Х. Хамадеев, Р.В. Боровик, Р. А Шафикова и другие. В 70-80-е годы прошлого века ими были разработаны и внедрены в ветеринарную практику диагностические наборы для РСК и РИФ. Позднее предлагались различные современные средства и методы диагностики хламидиозов, такие как ИФА и ПЦР [8,10], однако они до настоящего времени не внедрены в повседневную практику ветеринарных лабораторий.
Одновременно с этим разрабатывались и средства специфической профилактики хламидиоза сельскохозяйственных животных. Были предложены и внедрены различные инактнвированные эмульсионные вакцины против хламидиоза для рогатого скота и свиней. Наиболее эффективные и значимые из них были созданы Караваевым Ю.Д. [9], Щербань Г.П. [19], Хамадеевым Р.Х. [16]. Внедрение этих вакцин позволило значительно улучшить эпизоотическую ситуацию по хламидиозу в стране и значительно ограничить его распространение. Но, к сожалению, применение разработанных эмульсионных вакцин на практике выявило ряд их недостатков, что было связано, в первую очередь, с высокой реакгогенностью этих вакцин.
Дальнейшее использование инактивированных эмульсионных вакцин требовало их усовершенствования и изыскания новых подходов к их конструированию, а так же создания ассоциированных вакцин дан свиней.
против парвовнрусной инфекции, которая зачастую протекает совместно с хламидийной инфекцией и имеет схожие признаки.
Цели п задачи исследований. Цель исследований: создание новых и усовершенствование существующих средств диагностики и специфической профилактики хламидиоза сельскохозяйственных животных.
Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:
- разработать технологию получения специфического хламидийного антигена, обладающего высокой активностью и специфичностью при ретроспективной диагностике хламидийных инфекций у животных;
- на основе разработанного специфического хламидийного антигена усовершенствовать имеющиеся и создать новые средства диагностики хламидиоза;
- изучить иммунобиологические свойства и установить оптимальные требования к условиям культивирования, хранения и поддержания активности производственных штаммов хламидий с целью повышения качества биопрепаратов;
усовершенствовать технологию изготовления вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота и разработать научную основу для методов лабораторного контроля качества коммерческих серий вакциньг,
- испытать вакцину против хламидиоза крупного рогатого скота в производственных условиях, зарегистрировать её и внедрить в ветеринарную практику;
- разработать технологию производства и контроля качества вакцины против хламидиоза свиней, испытать опьггно-промышленные серии в производственных условиях, зарегистрировать её и внедрить в ветеринарную практику;
- разработать технологию производства ассоциированной вакцины против парвовнрусной и хламидиозной болезней свиней и испытать её опытно-промышленные серии в лабораторных и производственных условиях.
Научная новизна. Разработана технология получения специфического хламидийного антигена, которая позволяет получать диашостикумы обладающие большей, по сравнению с аналогами, активностью и специфичностью. Научная новизна разработки подтверждена патентом РФ да изобретение №2485972. Технология получения антигена исключает использование ядовитых и аварийно-химически опасных веществ. К тому же предложенный способ является легко воспроизводимым, доступным, что открывает перспективу его промышленного производства.
Изучена эффективность ретроспективной диагностики хламидиоза у сельскохозяйственных животных в РСК и ИФА с использованием разработанного антигена, в результате усовершенствован «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» и впервые на основе разработанного антигена созданы диагностические тест-системы «Набор препаратов для диагностики хламидиоза
крупного рогатого скота методом ИФА» и «Набор препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом ИФА».
Впервые разработана технология изготовления хламидийного эритроцитарного диагаостикума на основе корпускулярного антигена, который обладал высокой активностью и строгой специфичностью, что позволило создать «Нябор препаратов для диагностики хламидиоза животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)».
Изучены иммунобиологические свойства производственных штаммов хламидий и впервые разработан «Стандарт ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» штаммы хламидий от крупного рогатого скота, овец и свиней» СТО 00492374-004-2008, в котором были определены требования к производственным штаммам хламидий и правила их контроля, использования и хранения.
Усовершенствована технология изготовления «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной». В её составе использован усовершенствованный масло-ланолиновый адьювант, использование которого позволило значительно улучшить ее иммуногенные и реакгогенные качества. В этих исследованиях впервые была доказана прямая зависимость между вязкостью, реактогенносткю и иммукогенностыо вакцины, а также установлены оптимальное соотношение антигена с адъювантом и оптимальная вязкость биопрепарата.
Усовершенствованная вакцина была испытана в производственных условиях: её применение в неблагополучных хозяйствах позволило добиться эпизоотического благополучия по хлампдиозу. Научная новизна разработки вакцины подтверждена патентом РФ на изобретение №2301682.
Разработана «Вакцина против хламидиоза свиней инактивированная эмульсионная». Её применение способствовало улучшению эпизоотической обстановки в свинокомплексах. Разработаны эффективные методы лабораторного контроля коммерческих серий вакцины против хламидиоза свиней (Патент №2247577 РФ на изобретение №2301682).
Впервые на основе штамма парвовируса свиней «У-97» и штаммов хламидий «РС-85» и «ЛС-87» разработана и испытана ассоциированная «Вакцина против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней инактивированная эмульсионная».
Теоретическая п практическая значимость исследований. Результаты исследований представляют собой теоретическую и практическую ценность, так как дополняют научные знания о хламидиозах сельскохозяйственных животных и парвовирусной инфекции свиней. Разработаны новые методы и подходы к конструированию ветеринарных диагностических препаратов и вакцин при хламидиозах животных.
В процессе выполнения исследований разработаны или усовершенствованы ряд биологических препаратов, в результате чего некоторые из них внедрены в ветеринарную практику:
- «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных», (ТУ 9388-020-00492374-2007) Регистрационное удостоверение № ПВР-1-2.7/02109;
- «Набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом ИФА, (ГУ 9388-009-00492374-2010);
- «Набор препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом ИФА», (ТУ 9388-010-00492374-2010);
- «Набор препаратов для РНГА при диагностике хламидиоза животных», (ТУ 9388-005-00492374-01);
- «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» (ТУ 9384-002-00492374-2009), Регистрационное удостоверение №ПВР-1 -1.8/02340; №ПВР 1-1.8/02340;
- «Вакцина против хламидиоза свиней инактивированная эмульсионная» (ТУ 9384-003-00492374-2009), Регистрационное удостоверение № ПВР-1-1.8/02339;
- «Вакцина против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней инактивированная эмульсионная», (ГУ 9388-028-00492374-07).
Разработан Стандарт ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» «Штаммы хламидий от крупного рогатого скота, овец и свиней» СТО 00492374-004-2008 внедрение которого повышает качество биологических препаратов.
Методология п методы исследований. Работа выполнялась в период 1995-2015 гг. в ФГБУ «Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». Отдельные этапы работы проводились в Республиканской ветеринарной лаборатории (г. Казань) и Татарской межрегиональной ветеринарной лаборатории (г. Казань), а также в условиях животноводческих и свиноводческих хозяйств РТ, Марий Эл, Чувашии, Башкирии и других регионов РФ, неблагополучных по хламидиозам сельскохозяйственных животных.
В опытах и производственных испытаниях были использованы 11682 головы крупного и мелкого рогатого скота, 18760 свилей, 568 морских свинок массой 350-400 г., 1769 белых мышей массой 18-20 г. и свыше 100000 развивающихся куриных эмбрионов.
Культивирование хламидий осуществляли в желточном мешке . и аллангоисной полости развивающихся куриных эмбрионов [ 1].
При разработке биологических препаратов было использовано 6 штаммов хламидий ("МЗ-89", "СК-89", "250", "РС-85", "ЛС-87", Тостиново-70"), выделенных в разное время при различных патологиях от крупного и мелкого рогатого скота и свиней и штамм парвовируса свиней «У-97».
Идентификацию штаммов хламидий проводили по морфологическим и тинкториальным свойствам микроскопически, по групповой антигенной специфичности — серологически (в РИФ и РСК), используя гипериммунные сыворотки морских свинок, полученные к свежевыделенным штаммам хламидий и группоспецифический антиген из них.
Исследования на хламидноз осуществляли согласно "Методических указании по лабораторным исследованиям на хламидийные инфекции животных", утвержденных зам. руководителя Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства и Продовольствия Российской Федерации от 30 июня 1999 года.
Для постановки реакции связывания комплемента (РСК) использовали «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» (РОСС 1Ш.ФВ01.Н00022) производства ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ» (г. Казань).
В работе применяли непрямой иммуно пероксидизный метод ELISA (ИФА). Для его постановки использовали антивидовые хонъюгаты производства ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
Для постановки реакции непрямой гемагглютинации микрометодом использовали стандартные плексигласовые 96-луночные планшеты с полукруглым дном.
Формалинизацию и танизацию эритроцитов барана проводили общепринятыми методами [15].
Результаты реакции оценивали визуально после осаждения эритроцитарного антигена в контрольных (последних) луночках рядов.
Истощение хламидийных сывороток от неспецифическпх желточных антител при изготовлении наборов для РСК и РНГА осуществляли иммуносорбентом, приготовленном на основе «нормальных» желточных мешков куриных эмбрионов по общепринятому методу [21].
Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) с целью выявления антител к парвовирусному антигену ставили микрометодом на полисткроловых пластинах с U-образными лунками используя эршроциты морской свинки согласно «Методическим указаниям по диагностике парвовирусной болезни свиней», утвержденным Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР 19 февраля 1986 года.
Обнаружение антигена хламидий в патологическом материале осуществляли в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) используя «Набор флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток дня диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (ЖЮСС ШФБ01.В20238) с помощью пммунофлуоресцентной системы микроскопа Nikon Eclipse 200.
Оценку эффективности вакцины проводили по требованиям, предусматривающим проверку на стерильность, безвредность, антигенную активность и иммуногеяность.
Кинематическую вязкость вакцины определяли вискозиметром Пшпсевича (ВПЖ-2). Метод основан на пропускании определенного объема эмульсии через капилляр с диаметром 2,37 мм под собственной силой тяжести в промежуток времени.
Основные положения, выносимые на запцпу:
1. Способ получеши специфического хламидийного антигена и результаты его испытания для диагностики хламидиоза животных в РСК и ИФА.
2. Разработка новых и усовершенствование существующих средств лабораторной диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных, а именно тест-систем для РСК, ИФА и РИГА.
3. Изучение иммунобиологических свойств производственных штаммов хламидий и разработка Стандарта ФГУ «ФЩРБ-ВНИВИ» «Штаммы хламидий от крупного рогатого скота, овец и свиней» СТО 00492374-004-2008.
4. Усовершенствование технологии изготовления и методов лабораторного контроля «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной», а также результаты испытания её эффективности в лабораторных и производственных условиях.
5. Разработка технология изготовления и методов лабораторного контроля «Вакцины против хламидиоза свиней инактивированной эмульсионной» и результаты испытания её эффективности в лабораторных и производственных условиях.
6. Технология изготовления ассоциированной «Вакцины против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней инактивированной эмульсионной» и результаты испытания её эффективности в лабораторных и производственных условиях.
Степень достоверности п апробация результатов. Статистическую обработку цифрового материала проводили методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стыоденту на персональном компьютере с использованием программного пакета Microsoft Excel 2007.
Основные результаты диссертации представлены и доложены на ежегодных отчетных научных сессиях ФГБУ «ФЩРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 1995-2015 гг.; Всероссийских и международных научных конференциях и симпозиумах (Казань 2003, 2004, 2005, 2007, 2011, 2012, 2013, Покров, 2008; Щелково, 2006, 2008; Харьков, 2013; Чикаго (США), 2010; Ираклион (Греция), 2011; Пиза (Италия), 2014).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 97 научных работ, в том числе 23 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ; получено 3 патента РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 417 страницах компьютерно го текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, заключение, рекомендации производству, список использованной литературы, состоящий из 320 источников, в том числе 124 - иностранных авторов и приложения. Диссертация содержит 82 таблицы и 4 рисунка.
2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
2.1 Разработка и усовершенствование средств ретроспективной диагностики хламидноза животных.
2.1.1 Разработка способа получения специфического хламидийного антигена для ретр ошективной дпагностикп хламидноза животных.
Несмотря на совершенствование лабораторной диагностики хламидиозов с учетом достижений современной молекулярной биологии, в настоящее время основными методами, позволяющими осуществлять массовые серологические исследования животных, остаются реакция связывания комплемента (РСК) и иммуноферментный анализ (ИФА).
Ранее в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» был разработан и внедрен способ получения специфического хламидийного антигена для РСК [2] недостатком которого были его низкая специфичность и применение в методике его получения этилмеркаптана, относящегося к группе «Аварийно-химически опасных веществ» (АХОВ) и признанного вреденым для здоровья людей, занятых в производстве.
Формула этилмеркаптана или по другому этантиола С^Н^БН, представляет формулу этанола - С2Н5ОН с замещенным радикалом -БН на -ОН, который собственно и придает ядовитые свойства этому соединению.
С целью установления пригодности этанола в качестве реагента при изготовлении специфического хламидийного антигена было проведено три серии опытов.
Для проверки этой гипотезы в технологии изготовления хламидийного антигена этилмеркаптан был заменен на 96 градусный этанол в тех же пропорциях - 1% в объеме полуфабриката антигена. Исследование аналогичных антигенов, приготовленных с использованием 2 реагентов, показало, что этанол может быть использован в этой технологии, однако такие антигены были менее активны, и поэтому его эффективность была достигнута путем повышения концентрации (Таблица 1).
Из результатов проведенных опытов было видно, что увеличение концентрации этанола до 2% значительно увеличивает активность антигена. 3% концентрация этанола показала аналогичную этилмеркаптану активность антигенов. Однако, в контролях такие антигены проявляли знтикомплементарные свойства. Поэтому оптимальной оказалась 2% концентрация этанола.
Таким образом, удалось исключить из производственного цикла этилмеркаптан, заменив его на этанол, тем самым сделав технологию экологически безопасной без ущерба активности и специфичности антигена, а так же упростить требования к условиям его производства.
Таблица №1 - Результаты испытания разных концентраций этанола в технологии изготовления хламидийного антигена в сравнении с этилмеркаптаном
№ серии опыта Антиген Наименование сывороток К
88-1 88-2 ЭЗ-З 88-4 8Ы-1 8КГ-2
№1 Этанол 1% 1:64 1:64 1:64 1 128 - - -
Этанол 2% 1:128 1:128 1:128 1 128 - - -
Этанол 3% 1:128 1:128 1:128 1 128 - - 1:5
ЭМ 1:128 1:128 1:128 1 128 _ - -
№2 Этанол 1% 1:32 1:32 1:32 1:32 - - -
Этанол 2% 1:128 1:128 1:64 1 128 - - -
ЭтанолЗ% 1:128 1:128 1:128 1 128 1:5 - 1:5
ЭМ 1:128 1:128 1:128 1 128 - - -
№3 Этанол 1% 1:64 1:32_ 1:64 1 128 - - -
Этанол 2% 1:128 1:128 1:128 1 256 - - -
ЭтанолЗ% 1:128 1:128 1:256 1 256 1:5 - 1:10
ЭМ 1:128 1:128 1:256 1 256 - - -
Примечание:
Ж1 - сыворотка специфическая позитивная к хлалтдийному антигену;
SN-сыворотка нормальная негативная к хламидийпому антигену;
К - контроль антигена на антикомплементарность;
ЭМ - этилмеркаптан.
Из результатов проведенных опытов было видно, что увеличение концентрации этанола до 2% значительно увеличивает активность антигена. 3% концентрация этанола показала аналогичную этилмеркапгану активность антигенов. Однако, в контролях такие антигены проявляли антикомплементарные свойства. Поэтому оптимальной оказалась 2% концентрация этанола.
Таким образом, удалось исключить из производственного цикла этилмеркаптан заменив его на этанол, тем самым сделав технологию экологически безопасной без ущерба активности и специфичности антигена, а так же упростить требования к условиям производства.
Дальнейшие исследования были направлены на повышение активности и специфичности хламидийного антигена.
На сегодняшний день в биологической промышленности России антиген для серологической диагностики хламидиоза готовиться по 2 методам: первый, так называемый детергентный метод, усовершенствованный нами с применением ДСН (додецилсульфата натрия) и этанола взамен этилмеркаптана и способ с применением эфира [18]. Основные этапы производства антигенов приведены в таблице 2. Оба метода имеют свои достоинства и недостатки, связапные с активностью и специфичностью. Изучив этапы производства двух методов теоретически можно было предположить, что оба способа могут дополнить друг друга, что в итоге повысит активность и специфичность получаемых антигенов.
Таблица 2 - Этапы получения антигенов различными способами
1 ■ - № этапа Наименование способа
Детергентный Эфирный
1 Получение биомассы хламидий на РКЭ
2 Инактивация биомассы хламидий-
3 Очистка биомассы хламидий
4 Обработка антигена детергентами Экстракция антигена эфиром
5 Диализ с целью удаления детергента Испарение эфира
6 Стандартизация антигена
Для этого необходимо было антиген, разрушенный детергентами, подвергнуть экстракции эфиром, что предположительно могло повысить его специфичность и активность.
Для проверки гипотезы параллельно были изготовлены 3 серии антигенов по 3 разным технологиям: детергентной, эфирной и новой (Рисунок 1).
я
о
Е £
53
а, о О
900 800 700 600 500 400 ?00 200 100
ш Серия 3 0 Серия 2 Серия 1
Детергентный Эфирный Новый метод
Рисунок 1 - Суммарные показатели средних титров антигенов, изготовленных тремя разными способами с позитивными сыворотками крови.
На рисунке видно, что суммарный титр эфирных антигенов составил 1:160. Несколько выше был этот показатель при детергентом способе - 1:224. Титр трех серий антигенов изготовленных по новой технологии составлял 1:832, что превосходило титры детергентных и эфирных антигенов в 5,2 и 3,7 раза соответственно.
Таким образом, на основе механизма действия ДСН и этанола, с одной стороны, способных разрушить ультраструктуру микроорганизма и экстракции эфиром липидной фракции клеточной стенки хламидий — с другой, было достигнуто повышение активности и специфичности антигена, превосходящей аналоги в несколько раз.
По результатам исследований был получен Патент РФ на изобретение №2485972 «Способ получения антигена дня ретроспективной диагностики хламидиоза животных».
2.1.2 Усовершенствование «Набора антигенов п сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных». В предыдущие годы в нашем Центре был разработан «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов животных», основным компонентом которого является специфический хламидийный антиген и три контрольных компонента: 2 сыворотки (позитивная и негативная) и контрольный антиген. Ранее в наборе был использован детергентный антиген. Включение в состав набора антигена изготовленного по новой технологии открывало перспективу повышения его качества (активности и специфичности).
Первоначально были проведены исследования специфичности и активности двух антигенов в составе набора с гомологичными и гетерологичными сыворотками крови разных видов животных, показавшие, более высокую активность и специфичность предлагаемого антигена по сравнению с коммерческим.
Опираясь на это, с 2006 по 2012 годы сравнительному исследованию в РСК с двумя антигенами, было подвергнуто почти 3 тысячи сывороток крови крупного и мелкого рогатого скота, свиней и лошадей более чем из 90 неблагополучных по хламидийной инфекции хозяйств (Таблица 3).
Таблица 3 - Данные сравнительного исследования сывороток крови сельскохозяйственных животных на хламидиоз в РСК двумя антигенами.
Год Кол-во хозяйств Кол-во проб Новый антиген Кол-во/процент положит, проб Традиционный антиген Кол-во/процент положит, проб
2006 9 356 93/26 64/18
2007 12 495 154/31 121/24
2008 14 365 65/18 39/11
2009 8 335 63/19 32/10
2010 21 413 103/25 69/17
2011 16 685 98/14 55/8
2012' 11 336 53/16 31/9
Итого: 91 2985 629/21 407/14
Было доказано, что с использованием антигена, полученного по предложенному нами способу, удается выявлять в 1,5 раза больше положительных результатов. Следует отметить, что РСК с новым антигеном, была всегда воспроизводимой, а ее результаты — корректны и логичны.
Исходя из результатов исследований, предложенный антиген был включен в состав диагностического набора для РСК, который прошел процедуру декларации и сертификации в ФГБУ «ВГНКИ».
В 2014 году, на основе нового антигена, было произведено 3254 набора, которые были поставлены в 66 регионов Российской Федерации. Отсутствие рекламаций со стороны потребителей подтверждало высокое качество наборов.
2.1.3 Разработка наборов для диагностика хламидиоза KP С и евшей в ИФА на основе пового антигена. Следующим этапом внедрения нового специфического антигена явилась возможность его использования в ИФА с целью диагностики хламидиоза у крупного рогатого скота и свиней. При этом ИФА показал большую по сравнению с РСК чувствительность, а испытуемый антиген высокую специфичность и активность. Так, в ИФА, при диагностике хламидиоза КРС было выявлено в 1,7 раза, а при диагностике хламидиоза свиней в 2 раза больше положительных результатов (Таблица 4).
Таблица 4 - Результаты исследования в РСК и ИФА с новым хламидийным антигеном сывороток крови КРС и свиней
Вид животных Кол-во проб РСК ИФА
Реагировало кол-во (%) Средний титр (М±м) Реагировало кол-во (%) Средний тигр (М±м)
КРС 383 79 (20,6) 1:8,2±0,3 126 (32,9%) 1:605±2,2
Свиньи 36 5 (13,8) 1:6±1,3 10 (27,7) 1:1090±202
На основании этого нами были разработаны две тест-системы для диагностики хламидиоза КРС и свиней. С целью оптимизации процесса постановки реакции, увеличения специфичности, чувствительности и уменьшения расхода реактивов, нами были установлены следующие оптимальные условия проведения ИФА: па поверхности лунок полистироловых планшет адсорбировали специфический хламидийный антиген с концентрацией белка 3,8 мкг/мл, в объеме 100 мкл, время экспозиции составило 18 ч при +4°С. Испытуемые и контрольные сыворотки вносили в первые лунки планшет в разведении 1:100 в объеме 100 мкл, предварительно во все лунки планшет внесли по 100 мкл ФБР-Т, и титровали начиная с разведения 1:200 и до 1:25600. Затем планшеты выдерживали в термостате (37°С) в течение часа. После трехкратного промывания твердой фазы рабочим раствором в объеме 200 мкл, в лунки планшет вносили пероксидазный конъюгат в рабочем разведении 1:800 по 100 мкл и выдерживали в термостате 40 минут. После трехкратного промывания ФБР-Т 200 мкл, в лунки планшет вносили субстрат по 100 мкл (4 мг ОФД + 10 мл ФЦБ + 0,14 мл 3% перекиси водорода), планшеты помещали в
темное место на 10 - 15 минут, реакцию останавливали при появлении слабожелтого окрашивания в отрицательном контроле внесением стоп-реагента в объеме 50 мкл. Учет результатов реакции проводили на спектрофотометре модели Bio-Rad Model 680, при длине волны 490.
Для оценки активности и специфичности антигена вычисляли коэффициент специфичности (К сп) по отношению оптической плотности положительного контроля (ОП пол.) к отрицательном}' контролю (ОП отр.) по формуле: К сп..= ОП пол. / ОП отр.
Для оценки результата вычисляли критический уровень, который определяется как значение оптической плотности отрицательного контроля (ОП отр.) умноженное на 2: ОП Крит-. = ОП отр. х 2
Результат считали положительным, если значение оптической плотности данного образца выше критического уровня (ОП криг. < ОП исп.).
Если оптическая плотность испьпуемого образца меньше или равна оптической плотности отрицательного контроля (ОП исп. < ОП отр.), то результат реакции считается отрицательным.
Если оптическая плотность испьпуемого образца больше оптической плотности отрицательного контроля и меньше или равна критическому уровню (ОП отр. < ОП исп. < ОП криг.) результат реакции считается сомнительным.
В результате в состав наборов вошли все необходимые для проведения анализа компоненты, которые представлены в таблице 5. В зависимости от вида животных в набор входили антитела к иммуноглобулину G (IgG) быка или свиньи, меченные пероксидазой хрена (конъюгат).
Таблица 5 - Состав наборов для диагностики хламидиоза КРС и свиней методом ИФА
Наименование компонентов Способ фасовки Объем Кол-во
Паншеты с хламидийным антигеном полиэтилен 2
Контрольная положительная сыворотка крови коров (К+) Ампулы 0,5 см3 1
Контрольная отрицательная сыворотка крови коров (К-) Ампулы 0,5 см3 1 *
Концентрат фосфатно-буферного раствора с Твин-20 (ФБР-Т) Флаконы 50,0 см3 2
Буфер для разведения конъюгата (БРК) Флаконы 1,0 см3 1
Коньюгат Ампулы 0,2 см3 1
Фосфатно-цигратный буфер (ФЦБ) Флаконы 10,0 ем3 2
Ортофенилдиамин (хромоген), (ОФД) Флаконы 4,0 мг 2
Перекись водорода (Н2О2) 3% раствор Флаконы 2,0 см3 1
Серной кислоты 1М раствор (стоп-реагент) Флаконы 10,0 см3 2
Испытание «Набора препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА» проведенное с гомологичными и гетерологичными сыворотками крови купного рогатого скота показало специфичность и высокую активность его компонентов.
В дальнейшем, с применением данной тест-системы в лабораторных условиях, в сравнении с РСК, исследованию было подвергнуто 372 пробы сывороток крови КРС (Таблица 6).
Таблица 6 - Результаты лабораторного исследования в РСК и ИФА сывороток крови крупного рогатого скота на хламидиоз
Показатели Метод исследования
РСК ИФА
Исследовано сывороток 372
Положительно реагировало 103 (27,1%) 167 (44,8%)
Сред, титры (М±м) 13,4±0,3 325,6±2,2
В результате, в ИФА с хламидийным антигеном реагировало 167 (44,8%), а в РСК только 103 (27,1%) пробы, что ниже в 1,7 раза. Титры антител в ИФА были значительно выше, чем в РСК, что связано с разной чувствительностью двух тестов.
В 2010 - 2011 годах в производственной лаборатории с применением экспериментальных серий тест-системы в ИФА, и параллельно в РСК, было исследовано 1008 проб сывороток крови КРС из 4 хозяйств (Таблица 7).
Таблица 7 - Результаты производственного испытания «Набора препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА» в сравнении с РСК
№ п/п Наименование хозяйств Исследовано сывороток Полоз реащ кительно ровало в
РСК ИФА
1 Алькеевский р-он РТ, ОП «Камкино» 907 71 130
2 Алькеевский р-он РТ, ЖК «Челны» 41 3 5
3 ООО ПД «Заволжье» Зеленодольского р-она РТ 28 - -
4 ООО ПД «Приволжье» Верхнеуслонского р-она РТ 32 6 9
Итого: 1008 80 (7,9%) 144 (12,2%)
При этом в РСК реагировало 80 (7,9%), а в ИФА 144 (14,2%) пробы, что было больше в 1,8 раза.
Аналогичная работа была проведена по испытанию набора препаратов дня диагностики хламидиоза свиней методом ИФА - была доказана специфичность и высокая активность его компонентов, а также большая, по сравнению с РСК, чувствительность (таблица 8).
Таблица 8 - Результаты лабораторного исследования в РСК и ИФА сывороток крови свиней на хламидиоз
Показатели Метод исследования
РСК ИФА
Исследовано сывороток 63
Положительно реагировало 13 (21%) 26 (41%)
Сред титры (MiM) 1:9,6±1,8 1:507±12,9
Из 63 сывороток крови свиней в РСК на хламидиоз реагировало 13 проб, что составило 20,6%, тогда как в ИФА реагировало 26 (41,2%) проб, что было больше в 2 раза. Титры специфических антител в РСК колебались в пределах 1:5 - 1:20, что соответствует иммунному фону неблагополучных по хламидиозу хозяйств. В ИФА этот показатель был в пределах 1:100 - 1:800.
В производственной лаборатории двумя методами была исследована 821 проба сывороток крови свиней из 24 хозяйств, при этом в РСК реагировало 119 (14%) проб, а в ИФА - 239 (29%) сывороток, что больше в 2 раза (Таблица 9).
Таблица 9 - Результаты производственного испытания «Набора препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом ИФА» в сравнении с РСК
Показатели РСК ИФА
Исследовано сывороток 821
Положительно реагировало, кол-во (%) 119 (14%) 239 (29%)
Сред, титры (М±м) 17,3±1,8 265,6±2,9 •
Таким образом, на основе предлагаемого антигена разработаны наборы для диагностики хламидиоза КРС и свиней методом ИФА результаты испытания которых позволили рекомендовать их для использования в ветеринарной практике.
2.1.4 Разработка «Набора препаратов для диагностики хламидиоза животных в реакции непрямой гемагглютппацпи (РНГА)». Проведены исследования с целью разработки эритроцигарного хламидийного антигена для РНГА Первоначально был выбран корпускулярный хламидлйный антиген из штамма хламидий «СК-89», выращенных на аллангоисной оболочке эмбрионов
кур, обладающий высокой специфичностью и активностью в РНГА В качестве клеточной основы для антигена использовали формализированные и танизированные эритроциты барана. При сенсибилизации антигена на клеточную основу применялся глутаровый альдегид. При этом было испытано несколько режимов сенсибилизации, что позволяло добиваться стабильности эритроцитарного антигена.
В дальнейшем была отработана методика постановки РНГА с предлагаемым антигеном, включающая использование различных растворов и компонентов, стандартизации и концентраций антигена, температурных и временных режимов. В результате был создан «Набор препаратов для диагностики хламидиоза животных в РНГА» в состав которого вошли:
- эритроцитарный хламидийный антиген (5 флаконов по 9 см3);
- контрольная хламидийная сыворотка (1 флакон - 2 см3);
- контрольная отрицательная сыворотка (1 флакон - 2 см3);
- «нормальная» сыворотка лошади (1 флакон - 2 см3).
Проведенные в лабораторных условиях испытания показали специфичность и высокую активность компонентов набора, с применением опытных серий которого, и параллельно в РСК, было исследовано 305 сывороток крови свиней, 520 проб КРС и 105 проб сывороток крови лошадей (Таблица 10).
Таблица 10 - Результаты сравнительного исследования в РСК и РНГА сывороток крови разных видов животных
Наименование хозяйств Исследовано проб Положительно реагировало
в РНГА в РСК
Кол./% Титр (М±м) Кол./% Титр (М±м)
Свиньи 305 160/52 62±7,9 84/28 14,7±1,7
КРС 520 211/40 68±3,2 125/24 12,4±2,8
Лошади 105 73/70 5,6+0,11 26/24 3,0±0,18
Полученные результаты показали, что в РНГА у свиней выявлено в 1,9 раза больше положительных проб, чем в РСК; у КРС - в 1,7 раза; а у лошадей - в 2,8 раза. Титры антител в РНГА были также существенно выше.
Испытание диагностикума для оценки поствакцинального иммунитета у крупного рогатого скота и свиней, проведенное на базе неблагополучных хозяйств, подтвердило высокую эффективность этого теста.
Испытание набора для диагностики хламидиоза животных в РНГА проводили в областных и республиканских ветеринарных лабораториях РТ, Марий-Эл, Пермского и Приморского краев, Ульяновской области и в Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории (Таблица 11). Было исследовано более 4 тысяч проб сывороток крови от крупного рогатого скота, овец, свиней и лошадей. При этом получено 280 положительных результатов, что составило 6,5% из общего числа проб.
Таблица 11 - Результаты производственного испытания «Набора препаратов для диагностики хламидиоза животных в реакции непрямой гемагглютинации».
Наименование животных Исследовано проб (кол-во) Реагировало в РНГА
кол-во %
КРС 903 129 14,2
Лошади 453 46 10,1
Свиньи 2933 105 3,6
Итого: 4289 280 6,5
Таким образом, специфичность и высокая чувствительность разработанного набора позволяют рекомендовать его для использования в лабораторной практике в качестве экспресс-метода для диагностики хламидиоза животных и поствакцинальной оценке иммунитета.
2.2 Изучение биологических свойств н стандартизация производственных штаммов хламидий. В 2007 году, согласно требованиям, предъявляемым к производителям биопрепаратов (Указание Главного госинспектора РФ №22-7/443 от 08.05.92 г. «О порядке выдачи разрешения на право выпуска ветеринарных препаратов и аттестации предприятия») и в связи с аттестацией производства выпускаемых ФГУ «ФЦГРБ-ВНИВИ» биологических препаратов по приказу директора ФГУ «ФЦГРБ-ВНИВИ» №98-к от 13.04.2007 г. нами была проведена проверка иммунобиологических свойств производственных штаммов хламидий.
Всего для производства вакцин и диагностических тест-систем в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» используются 6 штаммов хламидий, выделенных в разное время при различных проявлениях хламидиоза у овец, крупного рогатого скота и свиней. В таблице 12 приведены производственные штаммы хламидий и их краткая характеристика.
Таблица 12 - Каталог производственных штаммов хламидий ФГУ «ФЦТРБ-, ВНИВИ» используемых для производства биологических препаратов.
Наименование штамма Систематика Дата депонирования Происхождение штамма
Ростиново-70 СЫ. Ряйаы. 1996 г. ВНИВИ, аборт овец
250 СЫ. Райам 1990 г. ВНИВИ, аборт коров
РС-85 СЫ. РаИам 2000 г. ВНИВИ, аборт свиней
ЛС-87 СЫ. РяШм 2000 г. ВНИВИ, пневмония свиней
СК-89 СЫ. Райай 2000 г. ВНИВИ, конъюнктивит телят
МЗ-89 СЫ. РаЛас1 2000 г. ВНИВИ, менинго -э нце фалит телят
Штаммы хламидий являются основным средством для разработки и производства биопрепаратов. От их иммуногенности и вирулентности зависит качество разрабатываемой и выпускаемой продукции. Учитывая это и согласно требованиям, предъявляемым к производителям биопрепаратов, нами было проведено изучение иммунобиологических свойств штаммов хламидий и впервые разработан Стандарт ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» «Штаммы хламидий от крупного рогатого скота, овец и свиней» СТО 00492374-004-2008 регламентирующий основные требования к производственным штаммам и правила их поддержания, методы контроля, использования: и хранения, что повышает качество выпускаемой продукции.
В результате проведенных проверок было установлено, что штаммы хламидий «КС-89» - возбудитель менингоэнцефалита КРС, «СК-89» -возбудитель конъюнктивита КРС, «250» - возбудитель аборта коров, «РС-85» -возбудитель аборта свиней, «ЛС-87» - возбудитель пневмонии свиней и «Ростиново-70» - возбудитель аборта овец относятся к порядку Chlamydiales, сем. Chlamydiaeeae, роду Chlamydia, виду Chlamydia psittaci.Bce они стерильны в отношении бактериальной и грибковой микрофлоры, специфичны и обладают выраженной инфекционной активностью для развивающихся эмбрионов кур и могут использоваться в качестве производственных при изготовлении препаратов для диагностики и специфической профилактики.
Также, проведена паспортизация и депонирование штаммов в коллекции микроорганизмов ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».
2.3 Разработка и усовершенствование средств специфической профилактики хламидиоза животпых.
Вакцинация остается основным и единственно эффективным средством борьбы с хламидиозом и его профилактики у животных. Поэтому совершенствование и стандартизация технологических процессов, методов их контроля при производстве средств специфической профилактики хламидиоза животных, а так же внедрение новых эффективных биологических препаратов в ветеринарию, несомненно, являются актуальной задачей.
2.3.1 Разработка и усовершенствование пнактнвпрованнои эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота. Исследования, выполненные на первоначальном этапе разработки вакцины против хламидиоза КРС, показали преимущество эмульгированной вакцины из штамма «250». В дальнейшем, учитывая антигенные различия, в вакцину были включены штаммы хламидий «СК» и «МЗ». Вакцина была успешно испытана в лабораторных и производственных условиях, утверждены первичные документы та её изготовление и применение. В условиях лаборатории был налажен полупромышленный выпуск этой вакцины. Однако, возникли определенные трудности в оценке качества выпускаемых серий вакцины: проводить кошроль кг ж до й серии вакцины на антигенную активность и иммуногенность используя крупный рогатый скот, не представлялось возможным.
Поэтому необходимо было выбрать соответствующую биологическую модель и провести анализ, сопоставив эффективность лабораторных методов с
аналогичными производственными экспериментами и на их основе разработать простые и достоверные методы контроля качества коммерческих серий вакцины.
В качестве биологической модели для изучения антигенной активности вакцин были использованы морские свинки. Первоначально необходимо было изучить антигенную активность инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота на морских свинках при различных способах введения.
Результаты изучения антигенной активности 3 экспериментальных серий инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота при различных методах введения морским свинкам (таблица 13) показали, что максимальный уровень комплементсвязывакяцих противохламидийных антител (4,8±0,25 Лог2) формируется на 30-й день после однократной подкожной вакцинации. При внутримышечном и внутрибрюшинном путях введения, накопление специфических комплеменгсвязывающих антител было заметно ниже, соответственно на 1,6 и 2,5 Лог2. Однако при внутрибрюшинном введении вакцины максимальное количество специфических антител (3,3±0,35 Лог2) выявлялось на 45-й день после вакцинации, но их уровень был несколько ниже, чем при подкожной вакцинации в этот же срок (4,2±0,62 Лог2). Следовательно, подкожное введение эмульсионной вакцины является наиболее эффективным методом иммунизации.
Таблица 13 - Накопление специфических антител у морских свинок при разных способах вакцинации против хламидиоза (п=3, Р<0,001)
Способ введения Средние титры антител (М±м) Лог2
на 21 день на 30 день на 45 день
Внутримышечно 2,3*0,3 3,2±0,4 2,8±0,55
Подкожно 3,8±0,4 4,8±0,25 4,2±0,62
Внутрибрюшинно не исследовано 2,3±0,5 3,3±0,35
Контроль отрицательно отрицательно отрицательно,
Иммуногенность вакцпны против хламидиоза КРС испытывались на белых мышах, массой 16-18 г. путем подкожной иммунизации и контрольного заражения через 30 дней внутрибрюшинно в дозе 0,2 мл е разведении 1:10 вирулентной культурой жгамидий штамма «250» с инфекционным тигром Ю-6,3 LD50/0,3 ml. Одновременно инфицировали пнтактных (контрольных) мышей.
Выживаемость вакцинированных мышей после контрольного заражения колебалась в пределах 86,0-92,3% (в среднем 88,6±1,2%) при заболевании и гибели 66,7- 88% (в среднем 78,6±2,6%) пнтактных мышей.
Таким образом, была установлена достоверная разница в гибели мышей в опытных (вакцинированных) и контрольных (не вакцинированных) группах,
что доказывало, во-первых, эффективность испытуемого биопрепарата, а во-вторых, указывало на возможность использования мышей в качестве биологической модели для определения иммуногенности инактивированной эмульсионной вакцины.
Первоначально вакцину против хламидиоза КРС вводили подкожным методом в дозе 2,0 см3. Однако, в производственных условиях подкожное введение вакцины вызывало местную гиперреакцию, характеризующаяся постепенным увеличением в течение 2-3 месяцев гранулемы на месте введения вакцины до 8-10 см и превращением его в капсулированный стерильный абсцесс. Количество животных, проявивших гиперчувствительность на введение вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота, составило по некоторым хозяйствам от 2 до 10% привитого поголовья.
Поэтому дальнейшее применение вакцины проводилось путем глубокой внутримышечной инъекции в той же дозе, что несколько снижало местную реакцию на введение препарата.
С целью изучения поствакцинального и колострального иммунитета у привитых внутримышечным способом коров, нетелей и телят определяли динамику накопления специфических антител (таблица 14).
Таблица 14 - Динамика уровня специфических антител у животных, вакцинированных внутримышечным способом
Наименование хозяйств Сроки (мес.) Кол-во проб Реагировало положительно Средний титр (М*м)
Кол-во %
"Маяк" 1 70 70 100 1:87*23,6
Лаишевский р-н РТ 6 40 37 92,5 1:12*2,2
12 31 13 42 1:11*1,6
«им. В.И. Ленина» 1 33 33 100 1:78*8,4
Владимирской обл. 6 32 30 93 1:13*3,2
12 30 18 60 1:9*2,1
"Нефтяник" 1 50 50 100 1:67*4,8
Альметьевскош 6 50 45 90 1:14*1,3
р-на РТ 9 39 20 51 1:7*0,9
"Ярыш" 1 35 35 100 1:65*2,5
Альметьевского 6 31 28 90 1:13*0,8
р-на РТ 9 30 15 50 1:7*1,4
В результате во всех хозяйствах через 30 дней после вакцинации у 100% животных выявлялись комплементсвязывающие антитела в средних титрах (М*т) от 1:65*2,5 до 1:87*23,6 в зависимости от хозяйств. Через полгода титры антител к хламидийному антигену оставались на высоком уровне, в среднем (М*т) от 1:12*2,2 и до 1:14*1,3. При этом реагировало 90 - 93% привитого
крупного рогатого скота. Через 6 и 12 месяцев после вакцинации, как титры антител, так и количество реагировавших животных были значительно ниже.
Таким образом, достаточно высокий уровень специфических противохламидийных антител формируется у животных к месячному сроку после вакцинации и сохраняется в течение последующих 6 месяцев.
При исследовании в РСК сывороток крови телят, родившихся от вакцинированных коров, была установлена положительная реакция с хламидиозньш антигеном в титрах 1:5-1:80 у 63,3% телят в возрасте до 1 месяца, у 40% в возрасте до 2-х месяцев и у 23,3% животных в возрасте до 3-х месяцев.
Результаты этих исследований легли в основу разработанных методов лабораторного контроля производственных серий вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота и вошли в ТУ 9384-002-00492374-2009 «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивировапная эмульсионная» и в «Инструкции по применению вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота ни активированной эмульсионной»
Начиная с 2001 и по 2009 годы, было изготовлено 22 серии, что составило свыше 80 тысяч доз «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота». Все серии вакцины прошли контроль на антигенную активность и иммуногенность в соответствии с разработанными методами. В дальнейшем все серии вакцин были использованы для иммунизации поголовья крупного рогатого скота с целью профилактики хламидиоза в неблагополучных хозяйствах РТ и РФ.
Эффективность применения «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной» определяли на основании данных по количеству регистрированных случаев абортов и мертворождаемости, а также падежу и вынужденному убою телят, в неблагополучных по хдамидиозу хозяйствах до и после применения вакпины. Установлено, что после её применения количество абортов и мертворождаемость среди маточного поголовья, а также падежа и вынужденного убоя телят сокращается в 4-5 раз.
Таким образом, было .установлено, что если вакцина на 30 день после подкожного введения в дозе 0,5 см3 вызывает у морских свинок формирование антител в титре 1:10 и выше, то такая вакцина способна предохранять белых мышей от заражения вирулентной культурой хлампдий и профилактировать хламидиоз у крупного рогатого скота в производственных условиях.
По результатам лабораторных и широкого производственного испытаний в 2009 году Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота была зарегистрирована в РФ и внедрена в ветеринарную практику.
Однако, несмотря на изменение способа вакцинации, в процессе применения вакцины, появились проблемы связанные с реактогенностъю препарата, которая выражалась возникновением образований в виде гранулем и стерильных абсцессов, что затрудняло её применение. Стало очевидной необходимость совершенствования технологии производства вакцины.
^ Первоначально вакцину изготавливали на основе неполного адъюванта Фрейнда. Затем был разработан более жидкий масляный адьюванг на основе легкого минерального масла и безводного ланолина (МЛА).
С целью понижения реактогенности вакцины была предпринята попытка заменить адьюванг на широко известный коммерческий продукт ISA-70.
Сравнительные исследования показали, что вакцины, изготовленные на основе ISA-70, обладают в 3 раза меньшей вязкостью и ареакгогенны. Однако, антигенная активность и иммуногенность таких вакцин оказалась значительно' ниже. Так, установлено, что введение такой вакцины морским свинкам не вызывает формирование достаточного уровня антител, а после контрольного заражения вакцинированных белых мышей выживает лишь 58% животных против 90% при вакцинации стандартной вакциной.
Следовательно, нужно было изыскать такой адыовант, который бы при низкой реактогенности, стимулировал бы высокий иммунный ответ на введение специфического хламидийного антигена.
В состав МЛА входит 2 компонента: минеральное масло (ПЭС-3) и эмульгатор ланолин. Количество эмульгатора в составе адъюЕанта определяет пропорции, при которых адыовант с водой образуют стойкую эмульсию. Так, если смешивается вода с маслом в соотношении 1:1, тогда количество' эмульгатора в составе адъюванта должно составлять 16 частей. Если это количество будет меньше, эмульсия не образуется. В классическом варианте, который использован в составе разработанных ранее противохламидийных вакцин, МЛА смешивается с антигеном в соотношении 1/1; при этом соотношение масла и эмульгатора в составе адъюванта получается 84/16.
Для снижения вязкости вакцины на основе МЛА в 2 раза уменьшено количество эмульгатора (92/8) и в 2 раза, соответственно, увеличено в составе эмульсии количество масляной части по отношению к водной. Исходя из того, что количество водной части антигена в составе вакцины уменьшилось' пропорционально была увеличена концентрация антигена с 1,5 ед до 2,5 ед оптической плотности.
Далее необходимо было сравнить вакцину на основе усовершенствованного адъюванта (УА) с аналогами на основе МЛА и ISA-70.
Качество вакцин проверяли согласно ТУ 9384-002-00492374-2009. Вакцины проверялись по внешнему виду, стабильности и вязкости эмульсии, стерильности, безвредности и антигенной активности.
Стабильность эмульсии проверяли путем её замораживания при - 40°С и дальнейшего оттаивания при + 37°С. Стабильность и внешний вид оценивали визуально.
Изучение внешнего вида и стабильности эмульсии трех образцов вакцин показало, что все они удовлетворяют предъявляемым требованиям.
Ранее в соответствии с ТУ 9384-002-00492374-2009 контроль эмульсионной вакцины по вязкости и стабильности не проводился. Исходя из результатов наших исследований, нами были внесены изменения в ТУ и методы испытания вакцины были дополнены контролем вязкости и стабильности
эмульсии. За норматив был принят результат измерения вязкости образца вакцины на основе усовершенствованного адъюванга - 80 mmtVc, как наиболее оптимальный и соответствующий лучшим показателям реактогенности и антигенносш.
Определение вязкости вакцин показало значительные различия трех изучаемых образцов. Так, наибольшей вязкостью обладал образец, изготовленный на основе МЛА Его вязкость составила 203 мм2/с. Вязкость вакцины на основе УА была значительно ниже и составляла 81 мм2/с. Наименьший показатель вязкости - 47 мм2/с был зафиксирован у биопрепарата, изготовленного на основе ISA-70.
Антигенная активность трех испытуемых вакцин существенно отличалась (Рисунок 2). Так, наиболее активным в антигенном отношении оказался препарат, созданный на основе МЛА. Максимальный титр антител (1:70) у морских свинок этой группы выявлен на 30 день после иммунизации:. К концу срока наблюдений (6 мес.) титр антител оставался на достаточно высоком уровне, его среднее значение составляло 1:16.
Рисунок 2 - Динамика титров антител у морских свинок после иммунизации вакцинами на основе разных адьювантов.
Так же, высокую антигенную активность показала вакцина, изготовленная на основе УА. Так, к 30 дню после введения вакцины наблюдался максимальный уровень хламидийных антител, которые обнаруживались у 100% морских свинок в титрах от 1:10 до 1:80. Средний титр в этот период составил 1:45, что соответствует требованиям ТУ. В последующем тигры антител в этой группе находились на высоком уровне от 1:12,5 до 1:25 в разные сроки наблюдения и постепенно снижались к 180 дню.
Наименьшую антигенную активность показал препарат на основе коммерческого адыованта ISA-70. Так, через 30 дней в РСК реагировало только 5 из б подопытных животных. Средний титр антител по группе в этот период наблюдений составил 1:9, что было ниже требований предъявляемых ТУ. К 6090 дням наблюдений этот показатель несколько вырос до среднего значения
1:12,5. В последующие сроки наблюдения происходило постепенное снижение уровня антител до 1:12 и 1:8 на 120 и 150 дни наблюдений соответственно. К 180 дню наблюдений реагировало 4 из 6 морских свинок в титре 1:5, что указывало на недостаточную антигенную активность препарата.
Таким образом, в ходе проведенных опытов установлена высокая антигенная активность вакцин изготовленных на основе МЛА и УА.
В ходе проведенных 3 серий опытов по испытанию иммуногенности вакцин установлено (Рисунок 3), что в группе мышей вакцинированных препаратом, изготовленным на основе ISA-70 после контрольного заражения выживало 58% опытных животных.
у' /'"
90 -У У
| ✓ у-"
80 -К / : у /"
70 У У У
60 У У ■■ У у~
50 \у /' '■■ у' У
40 / \ У s
30 1 /
20 ; у х 1 ' У
10 "Т У
0 : У ■f................
□ МЛА аУА SISA-70 Я Контроль
Выживаемость мышей в %
Рисунок 3 - Изучение иммуногенности вакцин, на основе разных адъюзантов
В группе животных, иммунизированных вакциной, изготовленной на основе МЛА, процент выживаемости мышей был выше и составил 88%.
Высокую иммуногенность так же проявила вакцина на основе У А. Так, было установлено, что однократная вакцинация белых мышей этой вакциной защищает в среднем 85% животных от заражения культурой хламидий,
В контрольной группе мышей выживаемость после заражения составила 13,3%, что подтверждает защитное действие вакцин.
В дальнейшем было проведено изучение антигенности вакцины на основе усовершенствованного адьюванта на овцах, которое показало, что к 28 дню после вакцинации в крови у овец накапливались специфические антитела в титрах 1:80 - 1:160, в среднем - 1:130. Уровень антител по группе оставался высоким до конца опыта (Таблица 15).
Таблица 15 - Динамика антител у овец, привитых вакцинами на основе различных адьювантов
Адьювант Средний титр (М±т) антител в РСК по дням исследований
28 35 54 61
УА 1:128*21,91 1:72*8,94 1:64*10,95 1:128*21,91
МЛА 1:56*10,95 1:32*5,48 1:44*10,95 1:72*26,08
У овец, вакцинированных усовершенствованной вакциной, припухлость на месте введения не обнаруживалась, что говорило низкой реактогенности.
На месте введения вакцины, на основе MJIA, у овец наблюдали припухлость и уплотнение в мышце.
Производственные испытания усовершенствованной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота проводили в условиях неблагополучного хозяйства, в котором с 2008 года наблюдали заболевание среди поголовья крупного рогатого скота, проявляющееся у коров и нетелей абортами и мертворождениями, задержанием последа, а также массовыми гинекологическими заболеваниями. Выход телят в расчете на 100 коров и телок составлял примерно 60%.
У молодняка заболевание проявлялось в виде бронхопневмоний и гастроэнтеритов. По этим причинам нередко регистрировали гибель телят текущего года рождения.
Лабораторными исследованиями был установлен диагноз на хламидиоз.
С целью лечения и дальнейшей профилактики рецидивов хламидиоза в 2010 году в хозяйстве провели антибиотикотерапшо окситетрациклина гидрохлоридом в пролонгированной форме и полную вакцинацию поголовья крупного рогатого скота вакциной против хламидиоза.
Вакцинировали клинически здоровых, серонегатинных животных перед осеменением и через 6 месяцев проводили ревакцинацию. Телят вакцинировали против хламидиоза с месячного возраста, через 6 месяцев ревакцинировали.
Анализ состояния иммунизированного поголовья в хозяйстве показал, что введение вакцины не оказывало влияния на состояние животных: температура тела, пульс, дыхание, были в пределах физиологических норм. На месте введения вакцины у животных осложнений не возникало.
После вакцинации сыворотки крови привитых коров исследовали в PCE с хламидийным антигеном с целью определения уровня гуморального иммунитета через 30, 90 и 180 дней. При этом установлено, что в разные периоды реагируют от 92 до 98% животных, со средними титрами от 1:46 до 1:72. Полученные результаты свидетельствуют о высоком уровне гуморального иммунитета
Оценка эффективности вакцины, проведенная на основании фактических данных показала, что до вакцинации количество абортов и мертворождений в
хозяйстве составляло примерно7%, а в результате вакцинации оно снизились до 3 %. Т.е. уменьшилось в 2-3 раза. Также, в 2 раза, уменьшился падеж телят и повысилась показатели выхода телят в расчете на 100 коров (Рисунок 4).
=Аботы и мертворожденна
•Падеж и вынужденный убой
•—Получено телят Ю -I—-------- на 100 коров
2008 2009 2010 2011 2012 2013
Рисунок 4 - Показатели заболеваемости крупного рогатого скота до и после применения вакцины, по годам
Экономическая эффективность на рубль затрат от применения вакцины составила 21 рубль.
Таким образом, удалось усовершенствовать вакцину против хламидиоза крупного рогатого скота, существенно снизив её реактогелность без потери иммуногенности.
Проведенные исследования позволили повторно зарегистрировать усовершенствованную вакцину в 2014 году (Per. удостоверение № ПВР 11.8/02340).
По результатам исследований был получен Патент РФ на изобретение №2301682 «Вакцина для специфической профилактики хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота».
2.3.2 Разработка янактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней. Благодаря широким и целенаправленным исследованиям была подтверждена этиологическая роль хламидий среди свиней в крупных свиноводческих комплексах Нижегородской и Ульяновской областей, республик Татарстан, Марий-эл и Башкортостан. Заболевание проявлялось клинически в виде абортов между 80 и 112 днями супоросности и мертворождаемостъю, рождением нежизнеспособных поросят, гибели молодняка в послеотъемный период их жизни от респираторно-кшпечных инфекций.
При исследовании сывороток крови в РСК с хламидийным антигеном положительно реагировали 52,9% абортировавших свиноматок, 66,6% подсосных маток и 20% хряков-производителей. Хламидиоз в этих комплексах был подтвержден выделением штаммов хламидий, которые оказались патогенны для куриных эмбрионов, белых мышей и морских свинок [16,17].
Широкое распространение хламидийной инфекции в свиноводческих хозяйствах явилось научной предпосылкой для разработки инактивированной вакцины против хламидиоза свиней.
Экспериментальные серии вакцины изготавливали по технологии, ранее разработанной при создании инактивированной эмульсионной вахципы против хламидиоза крупного рогатого скота. При изготовлении вакцины, были использованы штаммы хламидий «PC» и «JIC», выделенные соответственно от абортированного плода свиньи и при поражении легочной ткани от поросенка, которые имели некоторые биологические отличия.
Хламидии инактивировали формальдегидом и глутаровым альдегидом, подвергали очистке и концентрированию методом дифференциального центрифугирования, стандартизировали по оптической плотности, адсорбировали на алюмо-калиевых квасцах и эмульгировали в масляном адьюванте.
Стерильность экспериментальных серий вакцины против хламидиоза свиней определяли по ГОСТ Р 28085 путем высева на бактериальные питательные среды мясо-пептонный агар (МПА), мясопептонный бульон (МПБ), Сабуро-агар и среду Китт-Тароцци (МППБ).
Моделью для определения безвредности вакцины служили лабораторные животные - белые мыши и морские свинки.
Ранее, нами было установлено, что наибольшую антигенную активность вакцина против хламидиоза КРС проявляла при подкожном введении морским свинкам, поэтому контроль антигенной активности вакцины против хламидиоза свиней проводили аналогичным методом. Было установлено, что средние титры антител у вакцинированных свинок со специфическим антигеном по 6-ти сериям колебались в пределах от 1:22,5 до 1:170 (в среднем (М±м) - 1:80,6*26,4), что свидетельствуют о высокой антигенной активности вакцины против хламидиоза свиней.
Изучение иммуногенности вакцины против хламидиоза свиней в лабораторных условиях проводили на белых мышах. Для этого предварительно установили вирулентность производственных штаммов хламидий («РС-85» и «JIC-87») для белых мышей.
Опытную группу мышей вакцинировали подкожно в дозе 0,1-0,15 см3. Животных обеих групп заражали через 28-30 дней после иммунизации вирулентной культурой хламидий штаммов «РС-85» и «JIC-87» с инфекционным тиром IO^LDjo/O^ ml в разведении 10"1, внутрибрюшинно по 0,5 см3, (таблица 16).
Таблица 16 - Результаты изучения иммуногенности вакцины против хламидиоза свиней на белых мышах (п=3, Р<0,001)
Штамм хламидий Наименование групп животных Количество животных в группе Средний % (М*т) выживаемости мышей после заражения
«PC» опытная 45 79,6*4,3
контрольная 45 24*2,4
«Л С» опытная 47 76,6*2,4
контрольная 51 35,6*4,7
В среднем опытная 92 78,2*2,1
контрольная 96 29,8=0,5
Результаты исследований показали, что выживаемость белых мышей после заражения штаммами хламидий «РС-85» и «ЛС-87» колебалась в пределах 7385% (79,6*4,3%) и 73-80% (76,6=0,4%) соответственно. Средний процент выживаемости вакцинированных мышей после контрольного заражения составил 73,2*2,1%.
Средний процент выживаемости мьппей контрольных (не вакцинированных) групп после заражения составил 29,8*3,5%, что доказьшало иммуногенность пспьпуемых 3-х серий вакцины.
Таким образом, была установлена стерильность, безвредность и выраженная антигенная и иммуногенная активность, данного биопрепарата.
Антигенная активность и иммуногенность вакцины была изучена в «остром» опыте на 10 серонегативных по хламидиозу подсвинках с 1-1,5 месячным сроком супоросности, которых разделили на 2 группы. Опытную группу вакцинировали в дозе 2,0 см3, контрольную группу - не вакцинировали.
Изучение ангигенности вакцины путем исследования сывороток крови вакцинированных свиней в РСК перед заражением выявило наличие специфических антител к хламидийному антигену в титрах 1:10 - 1:80 (в среднем 1:45) з пробах сывороток крови животных.
Заражение свиней проводили через 21 день после вакцинации, двумя штаммами хламидий, внутривенным способом в дозах по 5,0 мл с титром 10 ' ЭЛДзо в 0,3 мл.
В результате, у вакцинированных животных клинического проявления и развития хламидийной инфекции не произошло: свинки опытной группы опоросились в срок. Полученные поросята (всего 38 голов) были живые, подвижные, имели живую массу 1200-1300 грамм.
У свиноматок контрольной группы из 76 народившихся поросят 56 (73%) были мертворожденными, их вес колебался в пределах от 500 до 1300 грамм, что свидетельствует о том, что гибель поросят произошла в последнюю неделю супоросности. Остальные 20 поросят оказались слабыми и нежизнеспособными. Кожа и слизистые оболочки у таких поросят были синюшными, их вес составлял
в среднем 908 грамм, что указывает на их недоразвитость. В мазках-отнечатках, приготовленных из плаценты, паренхиматозных органов мертвых и слаборожденных поросят, обнаруживали хламидии.
Полученные результаты свидетельствовали о высокой иммуногенной активности вакцины против хламидиоза свиней.
Производственное испытание Вакцины против хламидиоза свиней проводили в 3-х неблагополучных по хламидийной инфекции хозяйствах, в которых, 2 раза в год вакцинировали всё поголовье свиней. Больных животных перед вакцинацией лечили антибиотиками.
Изучение поствакцинального иммунитета у свиней в неблагополучном хозяйстве показало (Таблица 17), что вакцина является ангагенно активной
Таблица 17 - Изучение поствакцинального иммунитета у свиней в РСК.
Сроки после вакцинации в днях Исследовано проб Положительно реагировало Сре дний титр антител (М±м)
кол-во %
До вакцинации 51 7 14,2 6,8±2,1
21 53 50 94 15± 1,5
30 45 44 98 19,3±2,6
45 65 60 92 18,5±2
90 50 47 94 16,5±1,8
3-10 дн. поросята 18 16 89 7,5±1,3
До вакцинации серопозитивность составляла 14%. На 21 день после вакцинации реагировало 94% свиней в тиграх 1:5-1:40. Максимальный уровень был выявлен на 30 день, когда реагировало 98% свиней. Затем происходило постепенное снижение титра антител в крови вакцинированных животных.
У поросят, полученных от иммунных свиноматок, также выявляли хламидийные антитела.
Оценка эффективности вакцины против хламидиоза свиней, проведенная на основании сравнения фактических данных по количеств}' абортов и мертворождений, а также падежу и вынужденному убою показала, что в результате применения вакцины эти показатели уменьшились в среднем по трем хозяйствам в 4,5 и 2 раза соответственно.
Таким образом, удалось разработать эффективное средство специфической профилактики хламидиоза свиней.
Сопоставив результаты лабораторных опытов и производственных испытаний, мы пришли к выводу о возможности оценки качества вакцины на морских свинках по уровню поствакцинальных специфических антител.
С 2000 по 2014 годы, по разработанной технологии, было изготовлено и использовано в широких производственных испытаниях 263 тысячи доз вакцины.
По итогам этих испытаний «Вакцина против хламидиоза свиней ннактивированная эмульсионная» была зарегистрирована Россельхознадзором РФ и внедрена в ветеринарную практику (Per. удостоверение № ПВР 11.8/02340).
По результатам разработки вакцины против хламидиоза свиней на основе 2-х штаммов хламидий «РС-85» и «ЛС-87» был получен Патент РФ на изобретение №2247577.
2.3.3 Разработка ассоциированной вакцины против парвовнруспой и хламидиозной болезней свиней.
Инфекции свиней, вызывающие нарушение функций воспроизводства и проявляющиеся рождением нежизнеспособных поросят, гибелью и рассасыванием эмбрионов, смещением ожидаемых опоросов, мумификаций плодов, абортами и мертворождениями, получили значительное распространение.
Эпизоотологический и серологический мониторинг, осуществленный нами в 1996-2004 гг. в 22 свиноводческих хозяйствах 5 областей и республик Среднего Поволжья и Предуралья показал, что удельный вес неблагополучных по парвовирусной болезни свиней хозяйств составил 95,2%. Наряду с этим, было установлено, что в 8 свиноводческих комплексах имеет место смешанное течение парЕовирусной болезни и хламидиоза, в которых заболевание клинически проявлялось в виде абортов между 80-112 днями супоросностп, мертворождаемостыо на 114-115-й день после осеменения и рождением нежизнеспособных поросят. При исследовании на хламидиоз проб сывороток крови в РСК положительно реагировали до 59% абортировавших свиноматок. Специфические противохламидийные антитела выявлялись в титрах 1:10-1:40. Эти показатели у свиноматок составляли 27,5-30,6%, хряков-производителей — 16,9-19,5% . Из патологического материала абортированных плодов был выделен возбудитель хламидиоза и парвовирус свиней.
Учитывая общность клинического проявления парвовирусной и хламидиозной инфекций, а также их смешанное течение, представлялось целесообразным создание ассоциированной вакцины против этих возбудителей.
За основу при конструировании инактивированной эмульсионной вакцины против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней была взята технология производства разработанной ранее «Вакцины против хламидиоза свиней инактивированной эмульсионной», с использованием штаммов хламидий «РС-86» и «ЛС-89». Для получения парвовирусного антигена использовали штамм парвовируса «У-97» выделенный и идентифицированный сотрудниками лаборатории эпизоотологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань).
Вирусную суспензию получали путем репродукции в перевиваемых клетках почек эмбриона свиней (линия ППК) в круговом монослое в роллерной установке промышленного типа, очистку и концентрацию проводили путем
сухого диализа на ПЭГ и инактивировали формалином. Инфекционный титр штамма на этой культуре клеток был не ниже 10 - 10 ' ТЦЦлуыл-
Составление серии ассоциированной вакцины осуществляли путем разведения инактивированной биомассы хламидий концентрированной культуральной парвовирусной суспензией, добавления масляного адьюванга и эмульгирования продукта.
Каждая серия ассоциированной вакцины проверялась на стерильность, безвредность и антигенную активность. По результатам контроля все серии вакцины соответствовали предъявляемым требованиям: в результате отсутствия роста колоний микроорганизмов на питательных средах вакцина была признана стерильной, а выживаемость белых мышей и морских свинок в течение 20 дней после внутрибрюпшнного введения свидетельствовало о безвредности препарата.
Антигенную активность ассоцшгрованной вакцины в отношении хламидиоза определяли путем подкожной вакцинации морских свинок в дозе 0,5 см3 и исследования через 30 дней сывороток крови в РСК с хламидийным антигеном; в отношении парвовируса свиней - на 5 кроликах массой 2,5 — 3,0 кг, которых иммунизировали внутримышечно в дозе 1,0 см3. На 21-ый день после вакцинации сыворотку крови кроликов исследовали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с антигеном парвовируса (Таблица 18).
Таблица 18 - Накопление специфических антител в крови морских свинок и кроликов после вакцинации ассоциированной вакциной против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней
№ серии вакцин Кол-во вак-х кроликов/ мор.свинок Кол-во реагирующих кроликов/ мор.свинок Средние титры антител с антигеном (MJm)
хламидийным пар во вирусным
Серия №1 5/6 4/6 1:25 1:166
Серия №2 5/6 5/6 1:22,5 1:268
Серия №3 5/6 3/6 1:47 1:140
Серия №4 5/6 5/6 1:42 1:90
Серия №5 5/6 5/6 1:76 1:115
Средний титр антител (МЫ) 1:42,2±16,4 1:15б±22,9
л _
Анализ уровня комплементсвязывающих антител в крови опытных животных показал, что средние титры (М±м) антител у вакцинированных свинок со специфическим антигеном колебались в пределах от 1:22,5 до 1:76 (в среднем <М±м) по 5-га сериям -1:42,2±16,4).
У кроликов средние титры (М±м) антител в РТГА, к антигену парвовируса, колебались от 1:90 до 1:268 (в среднем (М±м) по 5-тн сериям - 1:156±22,9), что
свидетельствовало о высокой антигенной активности ассоциированной вакцины против парвовируса и хламидиоза свиней.
С целью оценки антигенной и иммуногенной активности ассоциированной вакцины в остром опыте с контрольным заражением были использованы 6 клиничестат здоровых подсвинок случного возраста, серонегативные в отношении парвовируса и хламидий. Согласно схеме опыта, трем свинкам опытной группы за 15 дней до случки было введено внутримышечно, в область шеи, по 2,0 см3 ассоциированной вакцины против парвовирусной и хламидиозной инфекции свиней. Подсвинки контрольной группы не были вакцинированы. Сыворотки крови этих животных параллельно исследовались в РТГА с парвовирусным антигеном и в РСК с хламидиозным диагаостикумом.
На 14-й день после вакцинации в сыворотке крови опытной группы животных в РТГА были обнаружены ашигемагглютинины к парвовирусу свиней в титрах 1:256 (8,0 lg), на 56-й день - 1:512 (9,0 lg). В РСК с хламидийным антигеном комплементсвязывающие антитела обнаруживались на 56 после вакцинации в титрах 1:5-1:10 (3,2 lg).
Контрольное заражение парвовирусом и хламидиями вакцинированных (опытных) и интактных (контрольных) подсвинок осуществлялось через 8 недель после вакцинации, т.е. на 30-43-й дни супоросности. Штамм «У-97» парвовируса свиней с титром 107,0-107'6 ТЦЦ50/мл был введен внутримышечно в дозе 2,0 см3 и перорально — 5,0 см3. Возбудитель хламидийного аборта свиней -штамм «РС-86» с тигром 106,5 ЭДД с/0,3 мл инокулировали внутримышечно в дозе 2,0 см3 и перорально - 10,0 см
Спустя 6 недель после заражения был произведен контрольный убой по одной свиноматке из каждой группы и проведены вирусологические и бактриологические исследования плодов на предмет обнаружения парвовнрусного и хламидийного антигенов.
В результате проведенных опытов в суспензиях внутренних органов мумифицированных и мертвых плодов свиноматки контрольной группы в РГА был выявлен парвовирус и в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) -хламидпйный антиген. В то же время в живых плодах свиноматки опытной группы антигены парвовируса и хламидий не были обнаружены.
У двух вакцинированных и зараженных свиноматок родились нормально развитые жизнеспособные поросята по 9 и 12 голов соответственно. У свиноматки контрольной группы, зараженной в период 40-дневной супоросности, родились 7 мертвых плодов и 4 нежизнеспособных поросенка, которые пали в течение 5-6 часов после опороса. У другой свиноматки, зараженной в 56-й день супоросности, исход беременности завершился рождением 5 мертвых и 4 нежизнеспособных поросят.
В сыворотке крови всех живых поросят, взятой до приема молозива, в РТГА с парвовирусным антигеном и в РСК с хламидийным антигеном антитела не выявлялись.
Следовательно, предупреждена трансплацентарная передача парвовируса и хламидий, что свидетельствует о высокой эффективности вакцины против парво вирусной и хламидиозной болезней свиней.
Эффективность применения ассоциированной вакцины была испытана в свинокомплексе, где была установлена смешанная парвовирусная и хлаштдийная инфекция проявляющаяся абортами и мертворождением.
Изучение поствакциншгьно иммунитета показало, что все половозрастные группы свиней, иммунизированные ассоциированной вакциной, имели высокий уровень содержания специфических антител к парвовирусному и хламидийному антигенам. Так, в зависимости от группы животных, специфические хламидийные антитела обнаруживались в РИГА в средних титрах от 1:220 у хряков-производителей и до максимального уровня - 1:615 у свиноматок на 50 день супоросности. К антигену парвовируса также реагировали все группы вакцинированных животных. Минимальный уровень антител к парвовирусному антигену был зафиксирован также у хряков-производителей. В этой группе он составил 1:320, а наиболее высокий уровень парвовирусных антител был в группе проверяемых свиноматок - 1:1024.
Анализ эффективности вакцины показал, что в результате её применения в хозяйстве в 2,3 раза сократились аборты, в 1,5 раза уменьшился падеж поросят, что позволило получить дополнительно в среднем за год от 1200 до 1800 поросят (Рисунок 5).
Таким образом, разработанная ассоциированная вакцина обеспечивает формирование у свиней напряженного иммунитета и позволяет профилактировать в неблагополучном хозяйстве развитие смешанной парво-хламидийной инфекции.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
0 до вакцинации И после вакцинации
1997 1998 1$99 2000 2001
Рисунок 5 - Количество абортов в свинокомплексе «Рощинский» до и после применения вакцины
3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Обобщая результаты проведенных исследований по разработке и усовершенствованию средств диагностики и специфической профилактики хламидиоза крупного рогатого скота и свиней, а также парвовирусно-хламидийной инфекции у свиней, можно сделать следующие выводы:
1. Разработан способ получения специфического хламидийного антигена для ретроспективной диагностики хламидиоза, сущность которого состоит в том, что сначала элементарные тельца хламидий подвергаются обработке детергентами и только затем происходит экстракция антигена эфиром, не из цельной микробной клетки, а предварительно разрушенной, что улучшает доступность антигена для экстракции и позволяет получать специфические хламидийные антигены с высокой активностью, превосходящей аналоги в несколько раз.
2. Усовершенствована технология промышленного производства «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» на основе использования более перспективного способа получения специфического хламидийного антигена. Производственные испытания набора препаратов в РСК доказали его специфичность и эффективность при диагностике хламидийной инфекции сельскохозяйственных животных. В результате усовершенствования чувствительность набора повысилась в 1,5 раза.
3. На основе предложенного специфического хламидийного антигена были разработаны тест-системы для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота и свиней методом ИФА Лабораторные и производственные испытания доказали специфичность компонентов тест-систем и их высокую активность, в результате чего было установлено, что «Набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом ИФА» и «Набор препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом ИФА» являются эффективными средствами серологического скрининга и иммунологического мониторинга поголовья крупного рогатого скота и свиней в отношении хламидийной инфекции и позволяют выявлять в 2 раза больше положительных результатов, чем РСК
4. Впервые разработана технология изготовления хламидийного эрихроцитарного диагностикума на основе корпускулярного антигена и создан экспресс-тест "Набор препаратов для диагностики хламидиозов животных в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА)". В процессе лабораторных и производственных испытаний диагностического набора подтверждена его высокая активность, строгая специфичность и в 2-3 раза большая, по сравнению с РСК, чувствительность при ретроспективной диагностике хламидиоза у животных.
5. Изучением иммунобиологических свойств 6-ти производственных штаммов хламидий («Ростиново-70», «250», «СК-89», «МЗ-89», «РС-85» и «ЛС-87»), выделенных при различных формах патологий крупного и мелкого рогатого скота и свиней, подтверждены их широкий антигенный спектр и
высокая иммуногенность. Проведенные исследования позволили впервые разработать Стандарт ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» «Штаммы хламидий от крупного рогатого скота, овец и свиней» (СТО 00492374-004-2008), в котором регламентированы требования к производственным штаммам хламидий и правила их контроля, поддержания, использования и хранения, что повышает качество изготовляемых на их основе диагностических и вакцинных биопрепаратов.
6. Сопоставление результатов изучения антигенной активности «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной» на морских свинках с показателями её иммуногенности на белых мышах, а так же изучение эффективности в производственных условиях, позволили разработать достоверные методы лабораторного контроля производственных серий биопрепарата. Установлено, что если вакцина вызывает формирование у морских свинок высокого уровня антител в титре 1:10 и выше (средний титр (М±м) log2 - 4,8±0,25) на 30 день после иммунизации, то её применение в неблагополучном хозяйстве способно защитить поголовье крупного рогатого скота от заражения и развития хламндийной инфекции.
7. Усовершенствована технология изготовления «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной»: при её конструировании использован усовершенствованный масло-ланолиновый адьюванг, в результате проведенных исследований удалось в 3 раза понизить вязкость и реактогенность вакцины сохранив при этом её высокую иммуногенность. Установлена прямая зависимость между вязкостью, реактогенностью и иммуногенностью препарата. Результатами опытов было доказано, что оптимальной является вязкость равная 80 мм2/с.
В результате применения усовершенствованной вакцины в 2,5 раза снижается количество абортов и мертворождаемооть, в 2 раза уменьшается падеж и вынужденный убой телят, а их рождаемость повышается на 20-25%. При этом до минимума снижаются такие заболевания как пневмонии, артриты, энтериты, конъюнктивиты, вагиниты и ряд других симптомов, обусловленных этиологической ролью хламидий.
8. Изучение антигенной активности и иммуногенности «Вакцины против хламидиоза свиней инактивированной эмульсионной» показало, что её подкожное введение индуцирует у морских свинок синтез КС-антител к хламидийному антигену в среднем титре 1:80,6±26,4 на 30 сутки после введения и обеспечивает защиту 78,2±2,1 % белых мышей от развития хламндийной инфекции после контрольного заражения вирулентной культурой хламидий; вакцинация супоросных свиноматок однократно, в дозе 2,0 см , создает у них выраженный иммунитет, способный защитить их от хламндийной инфекции после контрольного заражения штаммами хламидий «РС-85» и «JIC-87».
Анализ результатов клинико-эпизоотологических обследований неблагополучных по хламидиозу свиноводческих хозяйств, в которых применялась вакцина, показал, что её применение способствовало улучшению эпизоотической обстановки: в свинокомплексах в 4,5 раза сократились аборты и
мергворождаемость, в 2 раза снизилась заболеваемость и гибель поросят от инфекции, что влияло на рост и повышение продуктивности животных.
9. Впервые, на основе штамма парвовируса свиней «У-13» и штаммов хламидай «РС-85» и «JIC-87», разработана «Вакцина против парвонирусной и хламидиозной болезней свиней инактивированная эмульсионная» обладающая высокой антигенной активностью и иммуногенностью. Так, её подкожное введение морским свинкам в дозе 0,5 см3 вызывало формирование противохламидийных КС-антител на 21 день после иммунизации в среднем титре 1:42,2±16,4. У кроликов, в ответ на внутримышечное введение вакцины в дозе 1,0 см3 формировались антитела к парвовирусному антигену выявляемые в РТГА в среднем титре 1:156±22,9. Ассоциированная вакцина, введенная свинкам внутримышечно, за 15 дней до случки, однократно, в дозе 2,0 см3, создавала у животных напряженный иммунитет, который предупреждал трансплацентарную передачу парвовируса и хламидий эмбрионам и плодам.
Анализ эффективности применения ассоциированной вакцины в неблагополучных хозяйствах показал, что в результате её применения в 2,3 раза сократились аборты и мертворожденна, в 1,5 раза уменьшился падеж и вынужденный убой, что позволило получить дополнительно в среднем за год от 1200 до 1800 поросят.
4 ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ
На основе проведенных исследований, разработаны, усовершенствованы и предложены для использования в ветеринарной практике тест-системы для диагностики хламидиоза животных методами РСК, ИФА и РНГА.
Для специфической профилактики хламидиоза сельскохозяйственных животных разработаны и усовершенствованы инакгивированные эмульсионные вакцины для крупного рогатого скота и свиней и ассоциированная вакцина против парвовирусной болезни и хламидиоза свиней.
Материалы исследований вошли в следующие нормативно-технические документы:
- Инструкция по применению «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных», утверждена Заместителем руководителя Россельхознадзора 3 марта 2008 г.;
- Технические условия «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных», (ТУ 9388-02000492374-2007), утверждены 29 января 2008 года директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласованы 3 марта 2008 года с заместителем руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору РФ, а также - с директором ФГУ «ВГНКИ»;
- Инструкция по применению «Набора препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом иммуноферменгаого анализа (ИФА).», утверждена директором ФГУ «ФЦГРБ-ВНИВИ», согласована с Начальником Главного управления ветеринарии КМ РТ 22 октября 2010 года;
- Технические условия «Набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА)», (ТУ 9388-009-00492374-2010), утверждены 'директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласованы с Начальником Главного управления ветеринарии КМ РТ 22 октября 2010 года;
- Инструкция по применению «Набора препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом иммуноферментного анализа (ИФА)», утверждена директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ, согласована с Начальником Главного управления ветеринарии КМ РТ 11 мая 2011 года;
- Технические условия «Набор препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом иммуноферментного анализа (ИФА)» (ГУ 9388-005-004923742011), утверждены директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ, согласованы с Начальником Главного управления ветеринарии КМ РТ 11 мая 2011 года;
- Временное наставление по применению набора препаратов для диагностики хламидиоза животных в реакции непрямой гемахтлютинацки (РИГА) (в порядке широких производственных испытаний в 2001-2003 г.г.), утверждено заместителем руководителя Департамента ветеринарии МСХ РФ 10 июля 2001 г.;
- Технические условия «Набор препаратов для диагностики хламидиоза животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)» (ГУ 9388-00500492374-01) утверждены директором «ВНИВИ», согласованы заместителем руководителя Департамента ветеринарии МСХ РФ и Директором «ВПЖИ» 5 марта 2001 г.;
- Инструкция по применению «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инаютшированной эмульсионной», утверждена Заместителем руководителя Россельхознадзора 8.04.2009 г.;
- «Технические условия (ТУ 9384-002-00492374-2009) Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инакгавированная эмульсионная», которые были утверждены 8 апреля 2009 года директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и согласованы с заместителем руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосанигарному надзору РФ, а также - с директором ФГУ «ВГНКИ»
- Извещение №1 об изменении ТУ 9384-002-00492374-2009 «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактививрованная эмульсионная») были утверждены Директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и согласованы с заместителем руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фигосанитарному надзору РФ, а также - с директором ФГУ «ВГНКИ» 25 октября 2012 года.
- Инструкция по применению «Вакцины против свиней инактивированной эмульсионной», утверждена Заместителем руководителя Россельхознадзора 8.04.2009 г.;
Технические условия «Вакцина против хламидиоза свиней инактивированная эмульсионная», (ТУ 9384-001-00492374-2009), утверждены 8 апреля 2009 года директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласованы с
заместителем руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фигосанитарному надзору РФ, а также - с директором ФГУ «ВГНКИ»;
- Временное наставление по применению «Ассоциированной вакцины против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней инактивированной и эмульгированной» (в порядке производственного опыта), утверждено Начальником Главного управления ветеринарии КМ РТ 12 мая 1998 г.;
- Технические условия «Ассоциированная вакцина против парвовирусной и хламидиозной болезней свиней инактивированная и эмульгированная» (в порядке производственного опыта) (ТУ 9388-003-00492374-98), утверждены директором ВНИВИ 27 апреля 1998 г., согласованы Начальником Главного управления ветеринарии КМ РТ.
- Стандарт ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» «Штаммы хламидий от крупного рогатого скота, овец и свиней» (СТО 00492374-004-2008), утвержден Директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 15 декабря 2008 года.
Таким; образом, разработанные и усовершенствованные нами биологические препараты позволяют в полном объеме проводить своевременный серологический мониторинг и профилактику хламидийных инфекций поголовья сельскохозяйственных животных, а так же профилакгировать развитие, смешанной с хламидиозом, парвовирусной инфекции свиней.
Список использованной литературы:
1. Авторское свидетельство, №1641883 СССР. Способ получения биомассы хламидий / Ф.М Хусаинов и др. заявл.24.10.88.
2. Авторское свидетельство, №543259 СССР. Способ получения антигена для серологической диагностики вирусных заболеваний / Р.В. Боровик, Хамадеев Р.Х, Гаффаров Х.З., Шафикова Р.А заявл. 17.09.73.
3. Барбарова, Л .А Хламидиоз лошадей (эпизоотология, диагностика и меры борьбы): авгореф. дис. ... канд. наук: 03.00.07. 16.00.03 /Барбарова Любовь Андреевна. - Казань, 2002. - 16 с.
4. Байбиков, Т.З. Парвовирусная инфекция свиней и её профилактика / Т.З. Байбиков, Е. Долганова, А. Толокнов, С.Г. Ерофеев // Свиноводство. - 2001. -№6. - С. 22-23.
5. Бортничук, В.А Хламидиоз свиней / В.А Бортничук. Киев: «Урожай», 1991.-191с.
6. Гаффаров, Х.З. Инфекционные болезни рогатого скота хламидийной, микоплазменной и вирусной этиологии, разработка диагностических и лечебно-профилактических препаратов: автореф. дис. ... докт. вет. наук: 16.00.03 / Гаффаров Харис Зарипович. - Казань, 1986. - 45 с.
7. Иванов, А.В. Современные аспекты биобезопасности/ АВ. Иванов, АН. Чернов, Р.Х Юсупов // Ветеринарный врач. - №5. - 2010. - С. 37-40.
8. Идрисов, Г.З. Обнаружение Chlamydia psittaci методом ДНК-ДНК гибридизации с помощью ДНК зонда / Г.З. Идрисов, Ф.З. Авзалов, ХЗ.
Гаффаров, Ю.В. Гоголев, В.М Чернов // Матер. Всероо. науч-метод. конф. по патологической анатомии с.-х животных. Казань. - 1998,- С. 40-44.
9. Караваев, Ю.Д. Хламидиозный аборт овец (этиология, диагностика, специфическая профилактика): автореф. дис. ... докг. вет наук: 16.00.03 / Караваев Юрий Дмитриевич. - М., 1987. -39 с.
10. Люлькова, Л.С. Промышленная технология изготовления наборов (тест-систем) для диагностики хламидиоза животных (РСК, ИФА) и ИНАН лошадей (РДП ИФА): автореф. дис. ... докт. биол. наук: 03.00.23 / Люлькова Лариса Сергеевна. - Щелково, 2013. - 59 с.
11. Митрофанов, П.М Хламидиоз крупного рогатого скота и меры борьбы с ним / П.М Митрофанов, В.А Семенов, Р.Х. Хамадеев // ЧГСА Мин. с.-х. и П ЧР, Чебоксары, - 2001. - С. 31-42.
12. Обухов, И.Л. Хламидиоз / И.Л. Обухов, Д.А Васильев. Монография, Ульяновск, 2003. - 135 с.
13. Самуйленко, АЯ. Ветеринарные аспекты обеспечения продовольственной безопасности России / А Я. Самуйленко, Л.А. Немннущая, Е.О. Литвинова и др. // Ветеринария. - 2012. - № 3. - С. 9-12.
14. Терских, И.И. Орнитоз и другие хламндийные инфекции / И.И. Терских. М: «Медицина». - 1979. - 270 с.
15. Фримель, Г. Реакция гемагглютинации / Г. Фримель // Иммунологические методы: Пер. с нем. Тарасова АП. - Москва, «Медицина».-1984.-211-219 с.
16. Хамадеев, Р.Х. Хламидиозы рогатого скота и свиней (эпизоотология, диагностика, специфическая профилактика и меры борьбы): дис. ... докт. вет. наук: 16.00.03 / Хамадеев Рифнур Хазиевич - Казань, 1991. -С. 514.
17. Хусаинов, Ф.М Хламидиозы свиней и крупного рогатого скота в Среднем Поволжье / Ф.М Хусаинов, Р.Х. Хамадеев. В.В. Евстифеев // Матер.науч. конф., посвященной 125-летию академии, 4.1.- Казань, 1998.-С. 113-114.
18. Червонский, В.М. Антиген для РСК при орнкгозе-писттакозе / В.М. Червонский, О.М Попова //Вопросы вирусологии. - 1959. -№1. -С.68-71.
19. Щербань, Г.П. Хламидиоз крупного рогатого скота и меры борьбы с ним / Г.П. Щербань, В.П. Зимина // Ж. Ветеринария. - 1986. - № 8. - С. 46-48.
20. Avrameas, S. The cross-linking of proteins with glutaralde hide and its use for the preparation of immunoadsorbents / S. Avrameas, T. Ternyck // Immunochemistry - 1969. - S.6. - P. 53 - 66.
21. Byrne, C.J. Parasite - specified phagocytosis of Chi. psittaci and Chi. trachomatis by L and Hela cells / C.J. Byrne, LW. Moulder // J. Infect. And Immun. -1978.-№19.-P. 598-606.
22. Lamert, J.K. Cytotoxic cell induced after Chlamj'dia psittaci infection in mice / J.K. Lamert//Infect. ImmunoL 1982. - V.35. - P. 1011-1017.
23. Mc Nutt, S.H. Sporadic bovine encephalomyelitis (Bus disease) / S.H. Mc Nutt // Cornell. Yen. - 1940. - V. 30. - P. 437-438.
5 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
5.1 Статьи, включенные в перечень научных изданий ВАК для опубликования результатов исследований
1. Хамадеев, Р.Х Течение хламидиоза и его профилактика на свинокомплексе / Р.Х Хамадеев, Ф.М Хусаинов, АЗ. Равилов, В.В. Евстпфеев, Ф.З. Магзянов // Ветеринария. - 2000. - № 12. - С. 14-17.
2. Хамадеев, Р.Х. Совершенствование диагностики, мер борьбы и специфической профилактики хламидиозов / Р.Х Хамадеев, Ф.М. Хусаинов, КВ. Евстпфеев, Л.А. Барбарова, АЗ. Равилов //' Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. - Казань, 2003. - Т. 174,- С. 177-184.
3. Хамадеев, Р.Х Основные факторы эпизоотического процесса и разработка средств специфической профилактики хламидиоза / Р.Х Хамадеев, Ф.М. Хусаинов, КВ. Евстпфеев, Л.А. Барбарова // Журнал Сельскохозяйственная биология (серия животные). - 2004. - №6. - С.70-73.
4. Хамадеев, Р.Х Обеспечение эпизоотического благополучия хозяйств по хламидиозу крупного рогатого скота / Р.Х Хамадеев, Ф.М Хусаинов, В.В. Евстифеев, Ю.Г. Крысенко, Л. А Барбарова, АЗ. Равилов, П.М Митрофанов // Ветеринария.-2005. -№1. - С. 3-6.
5. Хусаинов, Ф.М Клинико-эшиоотологические особенности и разработка средств специфической профилактики хламидиоза сельскохозяйственных животных / Ф.М Хусаинов, В.В. Евстпфеев, Л.А Барбарова, Р.Х Хамадеев // Ветеринарный врач. - 2005. - №2. - С.42-48.
6. Абдеева, М.З. Оценка иммуногенной активности ассоциированной вакцины против парвовирусной и хламидийной инфекций свиней /МЗ. Абдеева, Х.З. Гаффаров, В.В. Евстифеев, Ф.М Хусаинов, АЗ. Равилов // Ветеринарный врач,- 2006,- №1,- С. 20-24.
7. Бакиров, И.Х Фенотшшческие свойства нового штамма хламидий, выделенного от кошек при конъюнктивите / И.Х Бакиров, Р.Х Равилов, В.Н. Кашов, Г.М Исхаков, КВ. Евстпфеев, Ф.М Хусаинов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. - Казань, 2006,- С. 21-28.
8. Хамадеев, Р.Х. Хламидаоз сельскохозяйственных животных: диагностика, меры борьбы и специфическая профилактика / Р.Х. Хамадеев, В.В. Евстифеев, Ф.М Хусаинов, Л.А Барбарова // Ветеринарный врач.- 2006,- №1.-С.29-31.
9. Хусаинов, Ф.М Кдинико-эпизоотологическое проявление хламидиоза КРС в хозяйствах Среднего Поволжья и Предуралья / Ф.М Хусаинов, В.В. Евстифеев, Л.А Барбарова//Ветеринарныйврач. -2006. -№1.-С. 32-37.
10. Хусаинов, Ф.М Изучение биологических свойств штаммов хламидий, изолированных от сельскохозяйственных животных / Ф.М Хусаинов, ХЗ.
Гаффаров, Ф.З. Авзалов, В.В. Евстпфеев, Л.А Барбарова // Ветеринарный врач. - 2007. -№3. - С. 11-14.
11. Хусаинов, Ф.М Результаты лабораторных исследований на хламидиоз биоматериалов от нетелей, завезенных из стран Западной Европы / Ф.М. Хусаинов, В.В. Евстпфеев, Л.А. Барбарова, Ф.З. Авзалов // Спепвьшуск «Актуальные проблемы здоровья скота, завозимого в Россию в рамках программы «Развитие агропромышленного комплекса». Ветеринарный врач. — 2007. -С. 29-32.
12. Хусаинов, Ф.М Иммуноморфологическая оценка эффективности инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней / Ф.М. Хусаинов, Ф.З. Авзалов, В.В. Евстпфеев // Ветеринарный врач,- 2008,- №3.- С. 26-29.
13. Хусаинов, Ф.М. Мониторинг хламидиоза животных в зоне Среднего Поволжья и Предуралья / Ф.М Хусаинов, Ф.З. Авзалов, B.R Евстпфеев // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. - Казань, 2008. - Т. 192. - С. 165-168.
14. Евстпфеев, В.В. Применение иммуноферментного анализа для диагностики хламидиоза КРС / В.В. Евстпфеев, Ф.М Хусаинов, Л.А Барбарова, Г.И. Хусаинова, Д.Ю. Хисматова // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. - Казань, 2010. - Т. 200,-С.69-72.
15. Иванов, AB. Разработка и испытание тест-системы для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом ИФА / A.B. Иванов, В.В. Евстпфеев, Ф.М Хусаинов, Л.А. Барбарова, Д.Ю. Хисматова, Ф.Г. Ахметов, АР. Садриев // Ветеринарный врач. - 2011. - №2. - С. 10-14.
16. Хисматова, Д.Ю. Результаты испытания «Набора препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом ИФА> / Д.Ю. Хисматова, В.В. Евстпфеев, Ф.М Хусаинов, Л.А Барбарова, Г.И. Хусаинова // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины Н.Э. Баумана. Казань, 2011. - Т. 208,- С. 299-302.
17. Евстпфеев, В.В. Опьгт усовершенствованной инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза рогатого скота / RB. Евстпфеев, Ф.М Хусаинов, Л.А Барбарова, Г.И. Хусаинова, Н.Р. Мнфтахов, Д.И. Нигьматуллина // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2012. - Т. 211. - С 61-66.
18. Хусаинов, Ф.М Выделите и идентификация хламидий от больных кошек, обитающих в Республике Татарстан / Ф.М Хусаинов, В.В. Евстпфеев, Л.А Барбарова, Д.Р. Губайдулина, Ф.З. Авзалов, Т.Х. Фаизов, К.В. Усольцев // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринар! гой медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2013. - Т. 216. - С. 370-372.
19. Евстпфеев, В.В. Усовершенствование инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза рогатого скота / В.В. Евстпфеев, Д.И. Нигьматуллина, Ф.М. Хусаинов, Л.А Барбарова // Ветеринарный врач. -2014. - №1. - С.38-42.
20. Евстифесв, В.В. Испытание усовершенствованной вакцины против хламидиоза рогатого скота / КВ. Евстифесв // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2015. - Т. 221. - С. 63-67.
21. Евстифесв, В.В. Результаты испытания: «Набора препаратов для диагностики хламидиоза свиней методом иммуно ферментного анализа» / В. В. Евстифесв // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2015. - Т. 221. - С. 67-71.
22. Евстпфеев В. В. Усовершенствование средств специфической профилактики хламидиоза крупного рогатого скота. / В.В. Евстифеев // Достижения науки итехпики АПК. - 2015. - Т.29 - №3. - С.54-55.
23. Евстифеев В.В. Разработка тест-системы для диагностики хламидиоза свиней методом ИФА / В.В. Евстифеев // Ветеринарный врач. - 2015. - №2. -С.20-24.
5.2 Патенты РФ па изобретения
1. Патент РФ № №2247577. «Вакцина для специфической профилактики хламидиоза свиней» / Р.Х Хамадеев, Ф.М. Хусаинов, В.В. Евстпфеев, Л.А Барбарова, АЗ. Равилов - Заявка №2002135777, приоритет изобретения от 20 декабря 2002 года.
2. Патент РФ №2301628. «Вакцина для специфической профилактики хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота» / Ф.М. Хусаинов, В.В. Евстифесв, Л.А Барбарова, АВ. Иванов - Заявка №2005140902, приоритет изобретения от 06 декабря 2005 года.
3. Патент РФ №2485972. «Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиоза животных» / ВВ. Евстпфеев, Ф.М Хусаинов, Л.А Барбарова, АВ. Иванов, Д.Ю. Хисматова, Г.И. Хусаинова, АА. Иванов - Заявка №2011146392, приоритет изобретения от 15 ноября 2011 года.
5.3 Основные статьи, опубликованные в журналах, материалах п сборниках конференций
1. Хамадеев, Р.Х Получение эршроцитарного днапюстикума для выявления антител при хламидиозе / Р.Х Хамадеев, Ф.М Хусаинов, В.В. Евстпфеев, АЗ. Равилов // Матер. У Всероссийской конференции «Научн. основы производства вет. биол. препаратов». - Щелково, 1996. -С.153-154.
2. Хамадеев, Р.Х. Сравнительная оценка серологических методов РСК, РНГА и ИФА при диагностике хламидиозной инфекции крупного рогатого скота и свиней / Р.Х Хамадеев, Ф.М Хусаинов, В.В. Евстифеев, АЗ. Равилов // Матер. Всерос. научн. конф. «Инфек. болезни мол. с.-х. животных». - Москва, 1996.-С. 12-14.
3. Хамадеев, Р.Х Эффективность вакцины против хламидиоза свиней в производственных условиях / Р.Х Хамадеев, Ф.М Хусаинов, В.В. Евстифеев,
МЗ. Магзянов, АЗ. Равилов // Матер. Междунар. научно-иракгич. конф. «Ветеринарные и зооинженерные проблемы животноводства». - Витебск, 1996. -С.143-145.
4. Хамадеев, Р.Х. Разработка эритрощггарного диагностикума для обнаружения и иденгиф1псадии возбудителя хламидиоза / Р.Х Хамадеев, Ф.М Хусаинов, АЗ. Равилов, ВВ. Евстпфеев, Л.А Барбарова // Матер, юбилейной научн. конф. посвящ. 50-летию центра воен.-техн.биол. защиты НИИ микробиологии МО РФ. - Екатеринбург, 1999. -С.65-67.
5. Хамадеев, Р.Х Диагностика хламидиозов сельскохозяйственных животных / Р.Х. Хамадеев, В.В. Евсгафеев, Ф.М Хусаинов, Л.А Барбарова // Сборник научных трудов ВГНКИ. - Москва, 2001. - Т. 62. - С.236-240.
6. Евстпфеев, КВ. Усовершенствование комплементсвязывающего антигена для диагностики хламидиоза животных / КВ. Евстифеев, Ф.М Хусаинов, Л.А Барбарова // Матер. Всеросс. научно-практич. конф. по актуальным проблемам Агронром. комплекса. Казань. - 2004. - С.33-34.
7. Хусаинов, Ф.М Изучение набора диашостнкумов для иммуноферментного анализа при хламидиозе свиней / Ф.М Хусаинов, КВ. Евстпфеев, Л А Барбарова, АЗ. Равилов // Матер. Междунар. научно-пракгич. конф., посвящ. 80-летию ФГУП «Щелковский биокомбинат». «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее» - 20-23 сентября 2004, Щелково. — С. 157158.
8. Хусаинов, Ф.М Распространение хламидиоза сельскохозяйственных животных в зоне Среднего Поволжья / Ф.М Хусаинов, В.В. Евстпфеев, АЗ. Равилов // Ветеринария сельскохозяйственных животных. - 2006. - №6. - С. 1215.
9. Евстпфеев, В.В. Специфическая профилактика хламидиоза сельскохозяйственных животных / КК Евстпфеев, Ф.М Хусаинов, Л.А Барбарова // Труды Междунар. науч.-практич. конф., посвящ. 50-летию ВНИИВВиМ «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных». -Покров, 2008. - Т 2. - С. 240-242.
10. Хусаинов, Ф.М, Оценка эффективности средств специфической профилактики хламидиозов рогатого скота и лошадей в хозяйствах Российской Федерации / Ф.М Хусаинов, В.В. Евстпфеев, ЛА Барбарова // Научно-технический бюллетень института биологии животных. - Львов, 2009. - Выи. 10. - №3. - С.192-195.
11. Евстпфеев, В.В. Применение иммуноферментного анализа для диагностики хламидиоза КРС и свиней / В.В. Евстифеев, Ф.М Хусаинов, Л.А Барбарова, Г.И. Хусаинова, Д.Ю. Хисматова // Матер.конф. «Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики болезней животных и птиц». -Екатеринбург, 2010. - Вып. 3.- С. 118-121.
12. Евстпфеев, В.В. Тест-система для иммуноферментной диагностики хламидиоза у крупного рогатого скота / В.В. Евстифеев, Ф.М. Хусаинов, Л.А
Барбарова, Д.Ю. Хисматова // Труды XVIII Междунар. Моск. кошр. - М., 2010. - С. 305-306.
13. Евстнфеев, В.В. Иммуноферментная диагностика хламидиоза КРС / RR Евстнфеев, Ф.М Хусаинов, Л.А Барбарова, Г.И. Хусаинова, Д.Ю. Хисматова // Тезисы докладов Междунар. научн. конф. посвящ. 80-летию ВГНКИ «Лекарственные препараты для животных». - Москва. - 2011,- С.65-66.
14. Евстнфеев, RR Опыт использования различных адыовантов при конструировании инактивированной вакцины против хламидиоза рогатого скота / RR Евстнфеев, Д.И. Нигьматуллина, Ф.М Хусаинов, Л.А. Барбарова, Г.И. Хусаинова, Н.Р. Мифгахов // Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК: Матер, междунар. научно-практич. конф. 5-7 декабря 2012, Щелково. - С.277-283.
15. Евстнфеев, RB. Усовершенствование средств ретроспективной диагностики хламидиоза животных / RB. Евстнфеев, Л.А Барбарова, Д.И. Нигьматуллина, Г.И. Хусаинова, Н.Р. Мифгахов // Научн. академия аграрных наук. Национ. науч. центр ин-та экспериментальной и клинической ветер, мед Межвидом, тематич. науч. сборник 97. Харьков, 2013. - С.88-90.
16. Evstifeev, V. Serological diagnosis of Chlamydia infection in cattle / Y.Evstifeev, F. Khusainov, E. Sliuralev, M. Mukminov, A Ivanov, L. Barbarova, T. Faizov, A. Ivanov//3rd EAVLD Congress, Pisa (Italy), 12-15 October, 2014. Abstract book. -2014. - P. 103.
Формат 60*84. Объем 2,87.л. Тираж 100 экз. Бумага офсетная. Печать RIZO. Заказ № 315 Отпечатано с готового оригинал-макета
в типографии ООО «Альфа-К» 420029, РТ, г. Казань, ул. Сибирский тр. 34, корп. 10 Тел. 8 917 260 06 28, 510 96 35
-
Евстифеев, Виталий Валерьевич
-
доктора биологических наук
-
Казань, 2015
-
ВАК 06.02.02
- Хламидиоз плотоядных животных
- Фармакокоррекция иммунного статуса коров и телят при специфической профилактике хламидиоза
- Хламидиоз лошадей
- Усовершенствование средств диагностики и специфической профилактики хламидиоза крупного рогатого скота
- Клинико-эпизоотологические особенности и специфическая профилактика хламидиоза и смешанных респираторных инфекций крупного рогатого скота в Удмуртской Республике
