Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Усовершенствование средств диагностики и специфической профилактики хламидиоза крупного рогатого скота

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование средств диагностики и специфической профилактики хламидиоза крупного рогатого скота"

На правах рукописи №

НИГЬМАТУЛЛИНА ДИАНА ИДРИСОВНА

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ХЛАМИДИОЗА КРУПНОГО

РОГАТОГО СКОТА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 СЕН 2014

Казань-2014

005552283

Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный центр токсикологической,

радиационной и биологической безопасности» - (ФЦТРБ-ВНИВИ)

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, доцент

Бвстифеев Виталий Валерьевич;

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, доцент

Плотникова Эдие Миначетдиновна

Официальные оппоненты: Авзалов Фоат Зиатдинович

доктор ветеринарных наук, профессор кафедры патологической анатомии и гистологии ФГБУ ВПО «Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана»; Бушов Александр Владимирович доктор биологических наук, профессор кафедры разведения, генетики и животноводства ФГБУ ВПО «Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии им. П.А.Столыпина».

Ведущая организация: «Всероссийский научно-исследовательский

и технологический институт биологической промышленности»

Защита состоится г. в 10.00 часов на заседании

диссертационного совета Д - 220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок - 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ -

ВНИВИ» (г. Казань).

Электронный вариант автореферата и текст объявления о защите размещен на официальных сайтах ВАК РФ www.vak.ed.gov.ru; полный текст диссертации, автореферата и отзыв научного руководителя - на официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru.

Автореферат разослан « 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного л ^/г

совета, кандидат ветеринарных наук^гр^^ГП^ ' в-и- Степанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Хламидиоз сельскохозяйственных животных - это большая группа болезней, объединенных этиологически, но в большинстве своем различающихся по характеру течения инфекционного процесса и формам его клинического проявления. Полнморфность возбудителя хламидиоза и отсутствие строгой органотропности определяет отсутствие конкретного симптомокомплекса заболевания, ввиду чего клиника хламидиозов чрезвычайно разнообразна (Самуйленко А.Я., Неминущая Л.А., Литвинова Е.О. Ветеринарные аспекты обеспечения продовольственной безопасности России // Ветеринария. 2012. №3. С.9-12). Хламидиозы характеризуются абортами маточного поголовья, рождением нежизнеспособного или слабого молодняка с симптомами пневмонии, полиартритов, энтеритов, энцефаломелитов и конъюнктивитов. Иногда, при генерализованной форме, хламидии поражают все системы и органы, нередко приводя к летальному исходу.

Хламидиозы относятся к зооантропонозам с выраженной природной очаговостью (Курбанов И.А., Авзапов Ф.З., Лабутина Л.Ф. Диагностика, меры борьбы и профилактика хламидийных абортов крупного рогатого скота / Казань, 1982. 29с.; Гаффаров ХЗ. Инфекционные болезни рогатого скота хламидийной, микоплазменной и вирусной этиологии, разработка диагностических и лечебно-профилактических препаратов: автореф. дис. ... докт. вет. наук: 16.00.03 / Гаффаров Харис Зарипович. Казань, 1986. 45с.; Хамадеев Р.Х., Хусаинов Ф.М. Хламидиоз крупного рогатого скота // Ветеринария. 1990. - №2. С.48-50).

Постановка диагноза на хламидиоз требует обязательного использования лабораторных методов исследования (Колычев Н.М., Кисленко В.Н., Госманов Р.Г. [и др.]. Руководство по микробилопш и иммунологии ¿Новосибирск, Арта 2010.129с.).

Одним из важных этапов в лабораторной диагностике хламидиоза занимают ретроспективные методы, позволяющие обнаруживать антитела в сыворотках крови больных животных (Шафикова P.A., Гаффаров Х.З. Выявление антител к возбудителю хламидиозного аборта овец в РЭМА // Актуал. вопр. инф. патол. в промыш. животн.: КВИ. Казань, 1987. - С.35-40; Иванов A.B., Плотникова Э.М., Низамов Р.Н. [и др.]. Биологическая безопасность: молекулярно-клеточные аспекты диагностики зооантропонозов / - М.: Планида, 2012.288 е.).

Серологические методы являются наиболее доступными средствами проведения мониторинга хозяйств на хламидиоз, из них в ветеринарии, на сегодняшний день, основным остается реакция связывания комплемента (РСК) с группоспецифическим хлам иди иным антигеном. Но, к сожалению, этот метод имеет ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью, длительностью получения ответа и т.п.

Наиболее перспективным диагностическим тестом является иммуноферментный анализ (ИФА). Разработанный в 70-е годы прошлого столетия, сегодня он получил широкое распространение в ветеринарной и

медицинской диагностике. По чувствительности иммуноферментный анализ в 5-10 раз, а по специфичности в 2-3 раза превосходит РСК (Домейка М.А., Ришкявичене В.П., Люткивячене В.И. Некоторые методические особенности проведения иммуноферментного анализа для изучения хламидиозов крупного рогатого скота // Ферментативные препараты в ветеринарии и животноводстве: тезисы докладов науч. - практ. конф., 28-29 сентября 1989. С.32-33; Обухов И.П., Груздев К.Н., Панин А.Н. Использование полнмеразной цепной реакции в практических ветеринарных лабораториях // Ветеринария. 1997. №2. С.24-27). Его практическое применение для ретроспективной диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в нашей стране во многом сдерживается отсутствием доступных отечественных тест-систем. Проблема в том, что для проведения ИФА требуются антигены с высокой степенью очистки, однако из-за дорогостоящей технологии они в промышленных масштабах не выпускаются.

Вакцинопрофилактика до настоящего времени остается основным методом борьбы с хламидиозом и его профилактики (Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Еремец Н.К. Совершенствование и стандартизация технологических процессов, методов контроля и управления качеством противовирусных вакцин // Ветеринарный врач. 2011. №3. С.4-7). Использование только антибиотиков с профилактической и лечебной целью экономически не оправданно и не эффективно (Евстифеев В.В., Иванов A.B., Хусаинов Ф.М. Специфическая профилактика хламидиоза животных. Матер, междунар. конф. «Актуальные пробл. здоровья скота, завозимого в Россию в рамках нацпроекта «Развитие агропромышл. комплекса» Казань. 2008. С. 240-242).

Для этих целей отечественными и зарубежными авторами (Хамадеев Р.Х., Хусаинов Ф. М., Беклешова А.Ю. Оценка иммуногенной активности вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота II Матер. Всесоюзн. науч.- конф. М.: 1991. С.44; Караваев Ю.Д. Семенова И.Н., Калугина И.А. [и др.]. Эффективность новых методов и средств специфической профилактики и лечения хламидиоза и некробактериоза животных // Международный аграрный журнал. Казань. 1998. №4. С.46-50), разработан целый ряд вакцинных препаратов. Всех их объединяет использование в своем составе масляных адъювантов, что обусловлено, характерной для возбудителя хламидиоза низкой иммуногенностью. Однако, побочные реакции, получаемые при использовании масляных адъювантов, заставляют исследователей изыскивать наиболее эффективные из них, которые бы при стимулировании высокого иммунного ответа не вызывали местных осложнений у привитых животных.

На сегодняшний день имеется большой выбор новых коммерческих готовых адъювантных продуктов, а также адъювантов на стадии разработки и испытаний, предназначенных для разных видов животных, направленных на инициацию различных типов иммунного ответа, сочетающих в себе различные уровни показателей эффективности и безопасности. Поэтому исследования по включению различных типов адъювантов в состав инактивированных вакцин весьма актуальны, их проводят большинство европейских фирм, занимающихся

производством биопрепаратов для ветеринарии (Кукушкин С.А., Байбиков Т.З., Каныиина A.B. Грипп свиней (эпизоотология, диагностика, меры борьбы и профилактики) // Ветеринария. 2009. №9. С.3-7).

Таким образом, в настоящее время вопросы усовершенствования средств диагностики и специфической профилактики хламидиоза рогатого скота являются актуальной задачей, требуют изучения и изыскания новых, более эффективных биологических препаратов и внедрения их в ветеринарную практику.

Степень разработанности проблемы. В центре внимания научного поиска остается проблема усовершенствования технологии изготовления и применения инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза рогатого скота на основе адьювантов, позволяющих повысить иммуногенную активность вакцины путем установления оптимальной концентрации хламидийнонго антигена, обладающей умеренной реактогенностью и обеспечивающей формирование напряженного противохламидийного иммунитета у животных.

Ранее в секторе по производству биологических биопрепаратов по изучению хламидийных инфекций ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» была разработана технология получения инактивированных эмульсионных вакцин против хламидиоза. Применение этих вакцин позволяло оздоравливать хозяйства от хламидиозной инфекции. Но, к сожалению, применение этих препаратов на практике выявило ряд их недостатков, что было связано с высокой степенью вязкости таких вакцин и, как следствие, их высокой реактогенностью.

Дальнейшее использование таких вакцин требовало их усовершенствования, изыскания новых подходов к их конструированию.

В предыдущие годы в нашем Центре метод ИФА использовали для диагностики хламидиоза овец Шафикова P.A. и др. (1988). При этом исследователи использовали групповой антиген хламидий, который применялся ранее для РСК, но не обладал достаточной специфичностью для ИФА, в результате чего было трудно дифференцировать положительные результаты из-за наличия «фона» в отрицательных образцах. Также была предпринята попытка использования корпускулярного антигена хламидий. Это несколько повысило специфичность реакции, но усложнило получение антигена.

Ранее в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» был усовершенствован способ изготовления специфического антигена хламидий, который позволял получать препараты с более высокой специфичностью и чувствительностью, чем коммерческий антиген, применяемый в РСК (Патент на изобретение №2485972 «Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных»). Этот антиген показал хорошие результаты в РСК, но в ИФА его использование не изучалось.

Цели и задачи исследований. Целью исследований явилось усовершенствование и разработка средств лабораторной диагностики и специфической профилактики хламидиозов сельскохозяйственных животных.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Сконструировать вакцины против хламидиоза КРС на основе различных масляных адъювантов и изыскать наиболее оптимальный, который позволит получать вакцины с высокой иммуногенностью при низкой реактогенности.

2. Изучить антигенные и иммуногенные свойства усовершенствованной вакцины на лабораторных животных и эффективность её применения в неблагополучных хозяйствах для профилактики хламидиоза крупного рогатого скота.

3. Испытать предложенный хламидийный антиген для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА, отработать методику постановки реакции.

4. Создать набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота в ИФА и испытать его специфичность и активность в лабораторных и производственных условиях.

Научная новнзна работы. Усовершенствована технология изготовления адъюванта в составе «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной» в результате чего понижены вязкость и реактогенность биопрепарата, но сохранена его высокая иммуногенность.

Для диагностики хламидиоза животных методом иммуноферментного анализа испытан новый хламидийный антиген и на его основе создана тест-система, которая обладает высокой специфичностью и активностью.

Теоретическая и практическая значимость. В результате проведенных исследований усовершенствована технология изготовления вакцины для специфической профилактики хламидиоза рогатого скота, которая позволяет добиться эпизоотической стабильности в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах не вызывая осложнений у привитых животных.

Разработан и предложен для ветеринарных лабораторий «Набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом ИФА». Результаты проведенных исследований вошли в нормативную документацию.

Методология и методы исследований.

Работа выполнена в 2010-2014 гг. в секторе по производству лечебных средств ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» в соответствии с тематическим планом НИР (№ госрегистрации 01200202602).

В работе использовали следующие материалы:

1763 проб сыворотки крови крупного рогатого скота и овец.

2 штамма хламидий вида Chi. psittaci:

«250»- возбудителя аборта коров

«Ростиново-70» - возбудителя аборта овец

Штаммы депонированы в ВГНКИ и стандартизированы согласно СТО 00492374-004-2008.

Лабораторные животные: 168 морских свииок массой 350-400 г, 810 белых мышей массой 18-20 г; 10000 куриных эмбрионов 6-7 дневного возраста; 10 овец массой 40-45 кг, свыше 10000 крупного рогатого скота.

Исследования проводились с использованием следующих методов:

1) Клинических - определение температуры тела, числа ударов пульса и дыхательных движений в минуту; изменение массы тела, визуальный осмотр кожи, волосяного покрова, слизистых оболочек.

2) Морфологических - взятие крови у опытных и контрольных животных осуществляли путем: пункции сердца - морские свинки, из яремной вены -овцы, 1-6 месячные телята, коровы.

3) Бактериологических - методом посева на питательные среды агар-Сабуро, среды Китта-Тароцци, МПБ и МППБ под вазелиновым маслом в отношении бактерий и грибков. В посевах не должно быть признаков роста бактериальной и грибковой микрофлоры.

Для морфологической идентификации хламидий в инфицированных куриных эмбрионах готовили из кусочков желточных мешков мазки-отпечатки и окрашивали их модифицированным методом Стемпа.

4) Диагностических - специфические хламидийные антитела выявляли двумя методами: в РСК и в ИФА. РСК ставили по общепринятой методике используя «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидаоза сельскохозяйственных животных» производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Непрямой вариант ИФА ставили согласно общепринятой методике. Учет результатов реакции проводили инструментально на спектрофотометре модели Bio-Rad Model 680, при длине волны 490. При этом использовали

количественный метод.

5) Метода определения вязкости - кинематическую вязкость вакцин

устанавливали при помощи вискозиметра ВПЖ-2 путем пропускания определенного объема эмульсии через капилляр с диаметром 2,37 мм под собственной силой тяжести засекая промежуток времени.

6) Математических - обработку экспериментально полученного цифрового материала проводили методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стыоденту на персональном компьютере с использованием программного пакета Microsoft Excel 2007.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изучение эффективности коммерческого адыованта в составе вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота.

2. Усовершенствование адыованта и конструирование на его основе вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота.

3. Испытание вакцины на основе усовершенствованного адыованта в лабораторных и производственных условиях.

4. Изучение возможности использования хламидийного антигена изготовленного по новой технологии для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом ИФА, отработка методики постановки теста,

разработка диагностического набора и его испытание в лабораторных и производственных условиях.

Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты диссертации представлены и доложены на ежегодных отчетных научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2010-2013 гг.; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК» (Казань, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» (Казань, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 - в изданиях, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки Российской Федерации.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 151 странице компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, списка использованной литературы, списка иллюстрированного материала, библиографического списка и приложений. Работа содержит 16 таблиц, иллюстрирована 2 рисунками. Список использованной литературы включает 214 библиографических источников, в том числе 92 на иностранном языке и 3 ссылки на интернет - сайт.

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1 Изучение эффективности применения коммерческого адъюванта в составе «Вакцины против хламидиоза рогатого скота инактивированной эмульсионной»

Первоначально были проведены исследования по конструированию вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота на основе коммерческого адъюванта Montanide ISA 70.

В качестве стандартного образца была использована «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» (ТУ 9384-002-00492374-2009) на основе масло-ланолинового адъюванта.

2.1.1 Изготовление экспериментальных серий вакцины

Для приготовления антигенной части вакцины, согласно разработанной ранее технологии, был использован штамм хламидий: «250» - возбудитель аборта коров.

Масло-ланолиновый адъювант связывается с антигеном в равных частях (1:1), a Montanide ISA 70 образует эмульсию при соотношении с антигеном 7:3. Исходя из этого, концентрацию антигена в вакцине увеличили с 1,5 до 2,5 ед. оптической мутности.

Антиген и адъювант смешивали механическим способом при частоте вращения вала мешалки 3000-4000 об/мин в течение 3-5 минут.

Качество вакцин проверяли согласно ТУ 9384-002-00492374-2009. Стабильность эмульсии, стерильность и безвредность соответствовали предъявляемым ТУ требованиям.

2.13 Изучение антнгенной активности и иммуногенностн вакцин

Изучение антигенной активности вакцин показало существенные различия в титрах вырабатываемых антител. У морских свинок, иммунизированных контрольной вакциной, титры антител в РСК были на высоком уровне (средний титр через 30 дней после вакцинации составил 1:15), что соответствовало требованиям технических условий.

В группе животных, вакцинированных препаратом на основе ИЗА-70, уровень антител на 30 сут был значительно ниже и составлял в среднем по группе 1:6,25, что не соответствовало ТУ и говорило о недостаточно высокой антигенной активности препарата.

Для изучения иммуногенностн вакцнн белых мышей массой 16 - 18 г, вакцинировали подкожно в дозе 0,2 см3 по 20 голов. Через 30 дней мышей заражали вирулентной культурой хламидий штамма «250».

Предварительно установили патогенность штамма хламидий «250» для белых мышей. Оптимальной заражающей дозой при внутрибрюшинном способе заражения в объеме 0,5 см было выбрано разведение 10"', при котором погибало 87% зараженных мышей.

В ходе опытов установлено, что вакцинация мышей против хламидиоза препаратом на основе масло ланолинового адьюванта защищала в среднем 90% животных от заражения.

Вакцина на основе ISA-70, защищала в среднем 58,3% вакцинированных животных от контрольного заражения, что было ниже в 1,5 раза.

2.2 Усовершенствование масло-ланолинового адьюванта

Проведенные опыты показали, что при низкой вязкости и отсутствии реактогенности вакцины на основе ИЗА-70 не удовлетворяют своей антигенной активностью и иммуногенностью. Напротив, вакцины на основе масло-ланолинового адьюванта обладали высокой антигенной и иммуногенной активностью, но проявили реактогенность.

Следовательно, нужно было уменьшить реактогенность, сохранив при этом на высоком уровне антигенную активность и иммуногенность.

Для этого мы усовершенствовали масло-ланолиновый адъювант.

В состав MJIA входит 2 компонента: минеральное масло (ПЭС-3) и эмульгатор ланолин. Количество эмульгатора в составе адьюванта определяет пропорции, при которых адъювант с водой образуют стойкую эмульсию: если мы смешиваем воду с маслом в соотношении 1:1, количество эмульгатора в составе адьюванта должно составлять 16 частей. Если это количество будет меньше, эмульсия не образуется. В классическом варианте, который использован в составе разработанных ранее противохламидийных вакцин (патент РФ №2247577 и патент РФ №2301682), МЛА смешивается с антигеном в соотношении 1/1, при этом соотношение масла и эмульгатора в составе адьюванта - 84/16.

Для снижения вязкости вакцины на основе МЛА мы в 2 раза уменьшили количество эмульгатора (92/8) и в 2 раза, соответственно, увеличили в составе эмульсии количество масляной части по отношению к водной.

2.2.1 Конструирование вакцины против хламидноза рогатого скота на основе усовершенствованного адъюванта

Далее необходимо было создать на основе усовершенствованного адъюванта вакцину и сравнить её с аналогами на основе масло-ланолинового адъюванта и ISA-70.

Для изготовления вакцины на основе усовершенствованного адъюванта концентрацию антигена пропорционально увеличивали до 2,5 ед. оптической мутности.

Из биомассы хламидий штамма «250» в аналогичных условиях были изготовлены экспериментальные серии вакцин против хламидиоза рогатого скота с тремя различными адъювантами:

1. Вакцина на основе коммерческого адъюванта французской фирмы Seppic «Montanide ISA-70»;

2. Вакцина на основе масло-ланолинового адъюванта (MJIA);

3. Вакцина на основе усовершенствованного адъюванта (УА).

2.2.2 Изучение стерильности, стабильности и вязкости эмульсий на основе усовершенствованного адъюванта и сравнение с коммерческими аналогами

Качество вакцин проверяли согласно ТУ 9384-002-00492374-2009 по внешнему виду, стабильности и вязкости эмульсии, стерильности и безвредности.

Изучение внешнего вида и стабильности эмульсии трех образцов вакцин показало, что все они удовлетворяют предъявляемым требованиям. Вакцины представляют собой эмульсию белого цвета. Разрушения эмульсии во всех трех образцах после охлаждения и нагрева не происходило.

Изучение стерильности и безвредности вакцин также выявило их соответствие предъявляемым ТУ требованиям.

Ранее в Технических условиях (ТУ 9384-002-00492374-2009) «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» контроль эмульсионной вакцины по вязкости не проводился. Исходя из результатов наших исследований мы внесли в ТУ изменения и дополнили методы испытания вакцины контролем вязкости эмульсии.

Определение вязкости вакцин показало значительные различия трех изучаемых образцов. Так, наибольшей вязкостью обладал образец на основе масло-ланолинового адъюванта. Его вязкость составила 203 мм /с. Вязкость вакцины на основе усовершенствованного адъюванта была значительно ниже и составляла 81 мм2/с. Наименьший показатель вязкости - 47 мм /с был зафиксирован у биопрепарата, изготовленного на основе ISA-70.

За оптимальный показатель был принят результат измерения вязкости образца вакцины на основе усовершенствованного адъюванта - 80 мм /с, как наиболее соответствующий лучшим показателям реактогенности и антигенности, что было установлено нами в последующих опытах.

2.2.3 Изучение антигенной активности и иммуногенности вакцины против хламндиоза рогатого скота на основе усовершенствованного адъюванта на лабораторных животных

Антигенную активность и местную реакцию на введение биопрепаратов проверяли на морских свинках. Каждой вакциной было иммунизировано по 6 морских свинок (18), четырех свинок не вакцинировали (контроль). Вакцины вводили внутримышечно с внутренней стороны бедра в дозе 0,5 см по 0,25 см с каждой стороны.

Наблюдения, проводимые за свинками после прививки, не выявляли клинических признаков ухудшения их состояния. На месте введения вакцины на основе усовершенствованного адъюванта выраженной местной реакции у морских свинок не наблюдалось, что говорило об отсутствии реактогенности препарата. У морских свинок, привитых вакциной на основе ISA-70, реакции на месте введения также не возникало. Биопрепарат, в составе которого был использован масло-ланолиновый адъювант, по-прежнему вызывал образование уплотнения, расположенного в глубине мышцы, рассасывание которого происходило через 2-4 месяца.

Антигенная активность трех вакцин в РСК отличалась как по титрам специфических антител, так и по срокам иммунного ответа (рис. 1).

Наиболее антигенным был препарат на основе масло-ланолинового адъюванта. Средние титры антител на его введение колебались в пределах от 1:15 до 1:70. Максимальный титр антител (1:70) выявлен на 90 день после иммунизации.

Так же высокую антигенную активность показала вакцина на основе усовершенствованного адъюванта. Так, к 30 дню после введения вакцины у 100% морских свинок обнаруживались хламидийные антитела в титрах от 1:5 до 1:20. Средний титр в этот период составил 1:12,5, что соответствует требованиям ТУ. В последующем титры антител в этой группе росли, проявляя средний максимум 1:45 на 90 день и снижались к концу срока наблюдений (180 день) до среднего значения 1:10.

Наименее антигенным был препарат на основе ISA-70. Так, через 30 дней реагировало только 5 из 6 животных. Средний титр в этот период составил 1:9, что было ниже требований предъявляемых ТУ. К 60-90 дням реагировали все животные подопытной группы со средним титром антител 1:12,5. Затем происходил постепенный спад уровня антител до 1:12 и 1:8 на 120 и 150 дни соответственно. К 180 дню реагировало 4 из 6 морских свинок в тшре 1:5, что говорило о недостаточной антигенности препарата.

В контрольной группе антитела не выявлялись, что подтверждало специфичность антител в опытных группах.

Таким образом, в ходе опытов установлена высокая антигенная активность вакцины, изготовленной на основе усовершенствованного адъюванта.

Для изучения иммуногенности вакцин белых мышей массой 16 - 18 г, иммунизировали подкожно в дозе 0,2 см3 по 20 мышей каждой вакциной. Контрольную группу (10 мышей) не вакцинировали.

Через 30 дней мышей заражали внутрибрюшинно вирулентной культурой хламидий штамма «250» в концентрации 10"1 в дозе 0,5 см3.

В ходе проведенных 3 серий опытов установлено (табл. 1), что в группе мышей вакцинированных препаратом на основе ISA-70 после контрольного заражения выживало 58% опытных животных.

В группе животных, иммунизированных противохламидийной вакциной на основе масло-ланолинового адъюванта, процент выживаемости мышей составил 88%.

Высокую иммуногенность проявила также вакцина на основе усовершенствованного адъюванта: однократная вакцинация белых мышей защищала в среднем 85% животных от заражения,

В контрольной группе выживаемость мышей после заражения была минимальной (13,3%), что подтверждает защитное действие вакцин.

Рис. 1 - Динамика титров специфических антител

Таблица 1 - Иммуногенность вакцин против хламидиоза КРС на основе

трех адъювантов

№ серии опытов Кол-во/% выживших мышей Контрольные

УА МЛА 18А-70

1 18(90%) 17(85%) 11 (55%) 0

2 16 (80%) 18 (90%) 12 (60%) 2 (20%)

3 17 (85%) 18(90%) 12 (60%) 2 (20%)0

Средний % выживших 51 (85%) 53 (88%) 35 (58 %) 4 (13,3%)

Таким образом, усовершенствовав масло-ланолиновый адъювант, удалось устранить реактогенность вакцины против хламидиоза КРС и сохранить её антигенные и иммуногенные свойства на достаточно высоком уровне.

2.2.4 Изучение эффективности вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота, изготовленной с использованием усовершенствованного адъюванта на овцах

Для проведения опыта 10 серонегативных овец разделили на 2 группы, которых вакцинировали 2 видами вакцин: 5 животных - опытной вакциной и 5 -контрольной вакциной на основе масло-ланолинового адъюванта. Овец вакцинировали внутримышечно, в дозе 5,0 см3.

Клинические наблюдения, проводимые за овцами после вакцинации, не выявили ухудшения состояния. На месте введения контрольной вакцины у овец наблюдали припухлость и уплотнение в мышце, которое рассасывались в течение срока наблюдений. У овец, иммунизированных экспериментальной вакциной, припухлость на месте введения не обнаруживалась, что говорило об отсутствии реактогенности.

Антигенную активность вакцин оценивали по уровню антител в крови иммунизированных овец, которые определяли в РСК на 28, 35, 54, 61 дни после вакцинации (табл. 2).

Таблица 2 - Уровень гуморальных антител у вакцинированных противохламидиозными вакцинами овец в РСК

Наименование групп Средний титр (М±ш) антител в РСК по дням исследований

28 35 54 61

Опытная (вакцина на основе усовершенствованного адъюванта) 1:128±21,9 1:72±8,9 1:64±10,9 1:128±21,9

Контрольная (вакцина

на основе масло- 1:56±10,9 1:32±5,4 1:44±10,9 1:72 ±26,1

ланолинового адьюванта)

Проведенные исследования позволили сделать заключение о более высокой активности экспериментальной вакцины. Так, к 28 дню после вакцинации в крови у овец накапливались специфические антитела в титрах 1:80 - 1:160, в среднем - 1:128. На 35 и 54 дни в экспериментальной группе наблюдали понижение титров до среднего значения 1:70 и затем их повышение до среднего уровня 1:130.

У контрольной группы овец средний титр антител был ниже. Так, на 28 день он составлял 1:60, на 35 день - 1:35, на 54 день -1:45 и повышался к концу срока наблюдений (61 день) до среднего уровня 1:70

2.2.5 Производственные испытания усовершенствованной вакцины против хламидиоза рогатого скота инактивированной эмульсионной

Производственные испытания вакцины на основе усовершенствованного адьюванта проводили на базе СХПК «им. Вахитова» Кукморского района Республики Татарстан.

С 2008 года в хозяйстве наблюдается заболевание крупного рогатого скота хламидиозом, проявляющееся у коров и нетелей абортами и мертворождениями, задержанием последа, а также массовыми гинекологическими заболеваниями. На 100 коров и телок в хозяйстве получали не более 60 телят. У молодняка заболевание проявлялось в виде бронхопневмоний и гастроэнтеритов, что нередко приводило гибели телят.

С целью лечения и профилактики хламидиоза в хозяйстве провели антибиотикотерапию и вакцинацию всего поголовья скота против хламидиоза.

Телят вакцинировали с месячного возраста в дозе 1,0 см3. Телок случного возраста и коров вакцинировали перед осеменением и через 6 мес проводили ревакцинацию.

Ежегодная вакцинация против хламидиоза была включена в обязательную схему ветеринарно-санитарных мероприятий в хозяйстве. Всего с 2010 по 2013 годы было использовано свыше 10 тыс. доз вакцины.

Анализ состояния иммунизированного поголовья в хозяйстве показал, что температура тела, пульс, дыхание после вакцинации были в пределах физиологических показателей. На месте введения биопрепарата у вакцинированных животных осложнений не возникало.

После вакцинации сыворотки крови привитых коров исследовали в РСК с хламидийным антигеном с целью определения уровня гуморального иммунитета (табл. 3).

Таблица 3 - Уровень поствакцинальных хламидийных антител у крупного рогатого скота в различные сроки

Сроки после вакцинации, дн. Количество исследованных животных, гол. Процент реагирующих животных Средний титр противохламидийных антител М±т

30 70 94 1:72±6,4

90 70 98 1:68±3,2

180 70 92 1:46±2,8

Было установлено, что к месячному сроку у 94% животных формируется высокий уровень антител (средний титр 1:72). Через 3 и 6 мес уровень антител оставался достаточно высоким. В эти периоды реагировало 98 и 94% животных в средних титрах 1:68 и 1:46 соответственно.

Оценку эффективности применения вакцины проводили на основании фактических данных по количеству абортов и мертворождаемости, падежу телят текущего года рождения от хламидиоза, а также - получению телят (табл.

4).

Таблица 4 - Показатели заболеваемости крупного рогатого скота хламидиозом в СХПК «им. Вахитова» до и после применения вакцины

Годы Аборты и мертворождения Падеж телят текущего года рождения Получено телят

Кол-во 1 % Кол-во | % Кол-во | %

до применения вакцины против хламидиоза

2008 61 6,8 55 9,9 576 64

2009 64 7,2 71 12 603 67

после применения вакцины против хламидиоза

2010 26 2,9 34 5,5 702 78

2011 30 3,4 36 4,7 774 86

2012 29 3,2 38 4,2 901 90

2013 28 2,6 49 5,1 968 88

Как видно из приведенных данных, до вакцинации количество абортов и мертворождений в хозяйстве регистрировалось на уровне 6,8 - 7,2%. В результате антибиотикотерапии и вакцинации против хламидиоза количество абортов и мертворождаемость в хозяйстве снизились до 2,6 - 3,4 % в разные годы, т.е. уменьшилось в 2-3 раза.

Также значительно, в 2 раза, уменьшился падеж телят текущего года рождения. Если до применения вакцины погибало 10-12% молодняка, то после её применения падеж телят сократился до уровня 4,2 - 5,5%.

Наиболее серьезные проблемы были с осеменением первотелок и коров, по этой причине хозяйство ежегодно недополучало примерно 20 - 25% телят.

До применения вакцины на 100 голов коров и телок получали 64-67 телят. После проведенных в хозяйстве лечебных мероприятий с использованием гинекологических средств, обработки антибиотиками и вакцинации осеменяемость коров и телок значительно повысилась. Выход телят, благодаря принятым мерам, повысился до 78 - 90%.

Таким образом, проводимые мероприятия с применением «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота полиштаммовой инактивированной эмульсионной» дали положительный результат, что позволило добиться в хозяйстве эпизоотического благополучия поголовья по хламидиозу. Полученные результаты позволяют рекомендовать данную вакцину для профилактики хламидиоза крупного рогатого скота в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах.

23 Разработка «Набора препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА»

Ранее был усовершенствован способ изготовления специфического антигена хламидий, который позволял получать препараты с более высокой специфичностью и чувствительностью, чем коммерческий антиген, применяемый в РСК (Патент на изобретение №2485972 «Способ получения антигена д ля ретроспективной диагностики хламидиозов животных»).

Необходимо было испытать предлагаемый антиген для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа и создать на его основе диагностический набор.

2.3.1 Испытание предложенного специфического хламндийного антигена для диагностики хламидиоза КРС в ИФА

С целью изучения предлагаемого антигена в ИФА для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота исследованию было подвергнуто 383 сыворотки крови из 31 неблагополучного хозяйства РТ и других регионов РФ.

ИФА ставили в непрямом варианте. Для контроля использовали гипериммунную и отрицательную сыворотки крови КРС. Были установлены оптимальные дозы рабочего разведения специфического антигена, пероксидазного коньюгата и оптимальное время экспозиции сывороток и конъюгата.

Для сравнения все пробы исследовались в РСК с использованием «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (№ РОСС Яи.ФВО 1 .В 18712). Результаты исследований представлены в таблице №5.

Таблица 5 - Результаты сравнительного исследования в РСК и ИФА сывороток крови КРС на хламидиоз

Тест Кол-во хозяйств Исследовано сывороток Положительно реагировало Среднеарифм. величина титров (М±м)

РСК 31 383 79 (20,6%) 1:8,2±0,3

ИФА 126 (32,9%) 1:605±2,2

Установлено, что предложенный антиген позволяет диагностировать хламидиоз КРС в ИФА. Так из 383 сывороток в РСК реагировало 79 проб (20,6%), тогда как в ИФА реагировало 126 (32,9%) проб. Титры антител в РСК колебались в пределах 1:5 - 1:20, что соответствует иммунному фону неблагополучных по хламидиозу хозяйств. В ИФА этот показатель был в пределах 1:100- 1:800.

Следовательно, испытуемый антиген показал в ИФА высокую специфичность и большую, по сравнению с РСК, активность. Так, в ИФА при диагностике хламидиоза КРС было выявлено в 1,7 раза больше положительных результатов, чем в РСК.

2.3.2 Подбор компонентов тест-снстемы и отработка режимов постановки ИФА

В результате проведенных исследований были установлены следующие оптимальные условия проведения ИФА и компоненты: на поверхности лунок полистироловых планшет адсорбировали специфический хламидийный антиген с концентрацией белка 3,8 мкг/см3, в объеме 100 мкл, время экспозиции составило 18 ч при +4°С. Испытуемые и контрольные сыворотки вносили впервые лунки планшет в разведении 1:100 в объеме 100 мкл, предварительно во все лунки планшет внесли по 100 мкл ФБР-Т, и титровали, начиная с разведения 1:200 и до 1:25600. Затем планшеты выдерживали в термостате (37°С) в течение часа. После трехкратного промывания твердой фазы рабочим раствором в объеме 200 мкл, в лунки планшет вносили пероксидазный КГ в рабочем разведении 1:800 по 100 мкл и выдерживали в термостате 40 минут. После трехкратного промывания ФБР-Т 200 мкл, в лунки планшет вносили субстрат по 100 мкл (4 мг ОФД + 10 см3 ФЦБ + 0,14 см3 3% перекиси водорода), планшеты помещали в темное место на 10 - 15 мин, реакцию останавливали при появлении слабо-желтого окрашивания в отрицательном контроле внесением стоп - реагента в объеме 50 мкл. Учет результатов реакции проводили на спектрофотометре модели Bio-Rad Model 680, при длине волны 490.

На основе предложенного специфического хламидийного антигена был сконструирован «Набор препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА» в состав которого вошли все необходимые компоненты для проведения анализа (табл. 6).

Таблица 6 - Состав «Набора препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА»

Наименование компонентов Способ фасовки Объем Кол-во

Планшеты с хламидийным антигеном Полиэтилен 2

Контрольная положительная сыворотка (К+) Ампулы 0,5 см3 1

Контрольная отрицательная сыворотка (К-) Ампулы 0,5 см3 1

Концентрат фосфатно-буферного раствора с Твин-20 (ФБР-Т) Флаконы 50,0 см3 2

Буфер для разведения конъюгата (БРК) Флаконы 1,0 см3 1

Антитела к иммуноглобулину в (1§С) меченные пероксидазой хрена (конъюгат) Ампулы 0,2 см3 1

Фосфатно-цитрахный буфер (ФЦБ) Флаконы 10,0 см3 2

Ортофенилдиамин (хромоген), (ОФД) Флаконы 4,0 мг 2

Перекись водорода (Н202) 3% раствор Флаконы 2,0 см3 1

Серной кислоты 1М раствор (стоп-реагент) Флаконы 10,0 см3 2

Контрольные сыворотки и пероксидазный конъюгат были лиофилизированны, растворы - концентрированы, расфасованы во флаконы и закрыты резиновыми пробками с алюминиевыми колпачками. Флаконы с ОФД и перекисью водорода были обернуты фольгой для предотвращения доступа света.

23.3 Испытание специфичности и активности «Набор препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА»

Испытание компонентов набора по внешнему виду и растворимости компонентов установило их соответствие предъявляемым ТУ требованиям.

Для определения активности компонентов набора и их специфичности были использованы различные сыворотки крови КРС содержащие гомологичные и гетерологичные антитела к хламидийному антигену, а также специфические сыворотки крови из наборов и сыворотки крови из 3 неблагополучных хозяйств в количестве 35 проб.

Все сыворотки крови были раститрованы путем двукратных последовательных разведений и исследованы в ИФА с применением компонентов испытуемого набора.

В результате проведенных исследований установлено, что контрольная хламидийная сыворотка крови реагировала в ИФА и РСК положительно в титрах соответственно 1:1600 и 1:80. Контрольная отрицательная сыворотка крови реагировала в обоих тестах отрицательно.

Гетерологичные к хламидийному антигену сыворотки крови (сыворотка позитивная к вирусу герпеса 1 и ИРТ КРС, сыворотка КРС содержащая специфические антитела к вирусу ПГ-3, сыворотка против пастереллеза, сальмонеллеза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита КРС, сыворотка антитоксическая поливалентная против сальмонеллеза телят, сыворотка специфическая преципитирующая лейкозная) реагировали отрицательно с хламидийным антигеном как в ИФА, так и в РСК.

При исследовании сывороток крови из неблагополучных хозяйств положительно реагировало 19 проб.

Таким образом, в результате испытаний «Набор препаратов для серологической диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА)» была доказана специфичность и высокая активность его компонентов.

23.4 Лабораторное испытание «Набор препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА»

С использованием разработанного набора в лабораторных условиях с целью диагностики хламидиоза было исследовано 372 сыворотки крови КРС из 20 неблагополучных хозяйств РТ и других регионов России. Все пробы параллельно исследовались в РСК (табл. 7).

Таблица 7 - Результаты сравнительного исследования в РСК и ИФА сывороток крови крупного рогатого скота на хламидиоз.

Показатели Использованный тест

РСК ] ИФА

Исследовано сывороток 372

Положительно реагировало, кол-во (%) 103 (27,1%) 167 (44,8%)

Средние титры антител (М±м) 1:13,4±0,3 1:325,6±2,2

Из результатов видно, что в ИФА реагировало 167 (44,8%) сывороток крови, тогда как в РСК реагировало 103 (27,1%) пробы, что ниже в 1,7 раза. Титры специфических антител в ИФА были выше, чем в РСК, что связано с разной чувствительностью двух тестов.

Таким образом, высокая чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов ИФА с испытанным набором позволили рекомендовать его для производственных испытаний.

23.5 Производственное испытание «Набор препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА»

Производственные испытания проводились на базе ФГУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория» (г. Казань).

В течение 2010 - 2011 годов с применением экспериментальных серий наборов было исследовано 1008 проб сывороток крови КРС из 4 неблагополучных по хламидиозу животноводческих хозяйств.

В ходе проведенных производственных испытаний установлено, что из 1008 проб в РСК реагировало положительно 62 пробы (5,9%), а в ИФА - 142 (12,2%). Таким образом, в ИФА было выявлено в 2 раза больше положительных результатов, чем в РСК.

Следует отметить, что в сравшггельных опытах результаты ИФА показали хорошую корреляцию с данными базовой реакции — РСК.

Важно подчеркнуть, что величина титров антител в ИФА напрямую зависела от интенсивности проявления клинических признаков заболевания у животных в неблагополучных хозяйствах, т.е. в хозяйствах, где течение хламидиоза носило острый характер, титры антител были значительно выше, чем в хозяйствах с латентной стадией течения хламидийной инфекции. В ряде случаев результаты серологических исследований подтверждены прямой РИФ и выделением возбудителя на куриных эмбрионах.

3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время для мониторинга хозяйств на хламидиоз используется реакция связывания комплемента, которая имеет ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью, длительностью и сложностью проведения анализа.

Наиболее перспективным диагностическим тестом является иммуноферментный анализ. Но его применение для диагностики хламидиоза животных сдерживается отсутствием доступных отечественных тест-систем.

В профилактике и ликвидации хламидиозов животных приоритетным остается применение вакцинных препаратов. Использование антибиотиков экономически не оправданно и далеко не всегда эффективно.

Ранее в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» была разработана технология получения вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота, но, к сожалению, её применение на практике выявило реактогенность, связанную с вязкостью препарата. Дальнейшее использование этой вакцины требовало усовершенствования и изыскания новых менее реактогенных адъювантов.

С учетом изложенного, целью данной работы явилось разработка тест системы ИФА на основе нового антигена и усовершенствование вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота.

В результате проведенных исследований получены следующие выводы:

1. Применение коммерческого адъюванта ИЗА-70 в составе эмульсионной вакцины против хламидиоза КРС снижает её вязкость и

реактогенность, но также значительно снижает антигенную активность и иммуногенность препарата, тем самым наблюдается прямая зависимость антигенности и иммуногенности от вязкости вакцины.

2. Усовершенствование масло-ланолинового адьюванта позволило значительно (в 3 раза) снизить вязкость и реактогенность эмульсионной вакцины против хламидиоза КРС, при этом максимально сохранить её антигенную активность и иммуногенность.

3. Экспериментальные серии вакцин на основе усовершенствованного масло-ланолинового адьюванта по стабильности, безвредности, стерильности, реактогенности, антигенной активности и иммуногенности соответствовали требованиям технических условий. Установлена оптимальная вязкость для эмульсионных инактивированных вакцин против хламидиоза КРС, равная 80 мм2/с.

4.Производственные испытания вакцины на основе усовершенствованного адьюванта показали, что введение препарата не вызывало осложнений у привитых животных и индуцировало выработку специфических антител в высоких титрах, а также позволило добиться в хозяйстве эпизоотического благополучия поголовья по хламидиозу.

5. Установлено, что предлагаемый специфический хламидийный антиген позволяет диагностировать хламидиоз крупного рогатого скота методом ИФА.

6. Созданный на основе испытанного антигена «Набор препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА» обладает специфичностью, а также большей, по сравнению с РСК, активностью и чувствительностью.

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты проведенных исследований позволили рекомендовать для применения в практической ветеринарии:

1. «Набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА)»;

2. «Вакцину против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированную эмульсионную».

Их применение регламентируется следующими нормативными документами:

- «Инструкция по применению набора препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА)», согласованной начальником Главного управления ветеринарии КМ РТ, утверждено директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» профессором Ивановым A.B. 22 октября 2010 г.;

- Технические условия № 9388-009-00492374-2010 «Набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА)», согласованной начальником Главного управления ветеринарии КМ РТ, утверждено директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» профессором Ивановым A.B. 22 октября 2010 г.;

«Инструкция по применению вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной», утвержденной заместителем руководителя Россельхознадзора Н.А.Власовым 8 апреля 2009 г.;

- Извещение №1 об изменении ТУ №9384-002-00492374-2009 «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная», от 25.10.2012 г.

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Евстифеев, В.В. Опыт усовершенствованной инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза рогатого скота / В.В. Евстифеев, Ф.М. Хусаинов, Л.А. Барбарова, Г.И. Хусаинова, Н.Р. Мифтахов, Д.И. Нигьматуллина // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2012. - Т. 211. - С.61-66.*

2. Евстифеев, В.В. Опыт использования различных адъювантов при конструировании инактивированной вакцины против хламидиоза рогатого скота / В.В. Евстифеев, Д.И. Нигьматуллина, Ф.М. Хусаинов, Л.А. Барбарова, Г.И. Хусаинова, Н.Р. Мифтахов // Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК: Матер. Междунар. науч .- практ. конф. 5-7 декабря. Щелково, 2012. - С.277-283.

3. Нигьматуллина, Д.И, Испытание инактивированной вакцины против хламидиоза рогатого скота, изготовленной на основе усовершенствованного адьюванта на овцах / Д.И. Нигьматуллина, Г.И. Хусаинова, Н.Р. Мифтахов // Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов: Матер. Межд. науч. - практич. конф. 26-29 марта. - Казань, 2013. - С. 112-114.

4. Нигьматуллина, Д.И. Усовершенствование технологии изготовления противохламидиозной вакцины / Д.И. Нигьматуллина // Матер. VII Московского Междунар. конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы Развития» 19-22 марта. - М.: 2013. - С. 446-448.

5. Евстифеев, В.В. Усовершенствование средств ретроспективной диагностики хламидиоза животных / В.В. Евстифеев, Л.А. Барбарова, Д.И. Нигьматуллина, Г.И. Хусаинова, Н.Р. Мифтахов // Науч. академия аграрных наук. Национ. науч. центр ин-та экспериментальной и клинической, вет. мед. Межвидом, тематич. науч. сборник № 97. Харьков, 2013. - С.88-90.

6. Евстифеев, В.В., Усовершенствование инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза рогатого скота / В.В. Евстифеев, Д.И. Нигьматуллина, Ф.М. Хусаинов, Л.А. Барбарова // Ветеринарный врач. — 2014. -№1 - С. 38-42.*

* - статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ

Отпечатано в ООО «Печатный двор». г. Казань, ул. Журналистов, 2Л, оф. 022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД №7-0215 от 01.11.2001 г Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 15.07.2014 г. Печ.л. 1,4 Заказ № К- 7414. Тираж 80 экз. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать -ризография.