Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хламидиоз плотоядных животных

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора ветеринарных наук, Равилов, Рустам Хаметович, Казань

■■ ' пень

At

/

1У / КУ /

ВСЕРОССИЙСКИЙтУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

РАВИЛОВ РУСТАМ ХАМЕТОВИЧ

ХЛАМИДИОЗ ПЛОТОЯДНЫХ животных

(этиология, диагностика, профилактика и меры борьбы)

03.00.07.-микробиология

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Диссертация

на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Научные консультанты:

доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РТ АЛИМОВ А.М.

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник, заслуженный деятель науки РТ ХАМАДЕЕВ Р.Х.

Казань - 98

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................................................................8

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................................................................................16

1.1. Таксономическое положение хламидий........................................................................................18

1.2. Биологические свойства хламидий...............................................................................21

1.2.1. Морфология и цикл развития......................................................................................................................21

1.2.2. Химический состав..................................................................................................22

1.2.3. Антигенная структура.........................................................................24

1.2.4. Токсичность................................................................................................................................................................................26

1.2.5. Интерфероногенность и интерфероночувствительность................................28

1.2.6. Устойчивость хламидий при хранении и воздействии физико-химических факторов..............................................................28

1.3. Лабораторная диагностика хламидиозов .................................................................................32

1.3.1. Выявление морфологических структур хламидий......................................................33

1.3.2. Индикация и идентификация антигенов хламидий в патологическом материале..............................................................................34

1.3.3. Выделение и культивирование возбудителя........................................................................36

1.3.4. Серологические реакции............................... ........................................................................37

1.3.5. Использование моноклональных антител в диагностике хламидийных инфекций..............................................................................................................................................44

1.3.6. Иммунохимическая идентификация хламидийных антигенов................46

1.3.7. Генодиагностика хламидиозов............................................................................48

1.4. Меры борьбы с хламидиозами животных и их специфическая профилактика............................................................................................53

1.5. Биологические особенности некоторых клеточных пушных зверей

и домашних плотоядных............................................................................................................................................57

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................................62

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................................................................................62

2.1. Штаммы хламидий..............................................................................................................................................................62

2.2. Сыворотки и патологический материал............................................................................................62

2.3. Подопытные животные и куриные эмбрионы......................................................................63

2.4. Эпизоотологическое обследование..........................................................................................................63

2.5. Выделение и идентификация возбудителей.............................................................64

2.6. Изучение биологических свойств..........................................................65

2.6.1. Морфологические свойства.................... ........................................................65

2.6.2. Патогенность............................................................................................................................................................................66

2.6.3. Токсичность..........................:..............................................................................................................68

2.6.4. Антигенные свойства.................................. ..............................................................................68

2.6.5. Иммуногенность...........................................................................••••• 69

2.7. Серологические реакции..........................................................................................................................................69

2.8. Изучение иммунохимического состава антигенов хламидий......................73

2.9. Молекулярно-генетические методы индикации и идентификации возбудителей..................................................................................................................................................................................73

2.10. Экспериментальное воспроизведение хламидиозов клеточных и домашних плотоядных..........................................................................75

2.11. Изучение возможности обезвреживания хламидий in ovo и in vivo.. 77

2.12. Разработка инактивированной вакцины против хламидиозов пушных зверей.................................................................................................................................78

2.13. Статистическая обработка результатов исследований..............................................80

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ......................82

3.1. Анализ эпизоотического состояния по хламидиозу звероводческих хозяйств и поголовья домашних плотоядных животных........................................82

3.2. Лабораторная диагностика хламидиозов пушных зверей и домашних плотоядных....................................................................................................................................................100

3.2.1. Серологические исследования......................................................................................................................100

3.2,2.Вы деление возбудителей хламидиозов от клеточных и домашних

плотоядных на куриных эмбрионах..................................................... 102

3.3. Биологические свойства изолятов хламидий...................................... 106

3.3.1 Изучение морфологии хламидий........................... ............................. 106

3.3.2 Патогенность изучаемых штаммов хламидий для куриных эмбрионов и лабораторных животных................................................. 113

3.3.3 Токсичность штаммов хламидий, выделенных от клеточных и домашних плотоядных.......................................................................... 121

3.3.4 Антигенные свойства возбудителей хламидийных инфекций плотоядных............................................................................................ 122

3.3.5 Иммунохимический анализ антигенов хламидий, выделенных от плотоядных............................................................................................ 123

3.3.6 Иммуногенные свойства хламидий, вызывающих заболевания у плотоядных............................................................................................ 131

3.4 Усовершенствование лабораторных методов индикации и идентификации возбудителей хламидийных инфекций сельскохозяйственных, клеточных и домашних животных................ 132

3.4.1 Изучение возможности использования иммуноферментного метода для ретроспективной диагностики хламидиозов плотоядных............................................................................................ 133

3.4.2 Разработка набора препаратов для выявления хламидийных антигенов методом ИФА...................................................................... 140

3.4.3 Получение и изучение возможности использования моноклональных антител для диагностики хламидиозов................... 149

3.4.4 Выделение ДНК хламидий и разработка полимеразной цепной реакции для индикации и идентификации возбудителей хламидийных инфекций........................................................................ 156

3.5 Экспериментальное воспроизведение хламидийных инфекций у плотоядных............................................................................................ 165

3.6 Изучение возможности обезвреживания хламидий in ovo и in vivo... 185

3.6.1. Определение активности антимикробных препаратов в отношении хламидий, выделенных от плотоядных............................ 186

3.6.2. Изучение эффективности химиопрофилактики и терапии хламидиозов пушных зверей и домашних плотоядных...................... 190

3.7. Разработка инактивированной полиштаммовой эмульсионной вакцины против хламидиозов пушных зверей.................................... 193

3.7.1. Разработка технологии получения вакцинного препарата для профилактики хламидиозов пушных зверей....................................... 193

3.7.2. Изучение безвредности, антигенной активности и иммуногенности инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиозов пушных зверей в лабораторных условиях..................... 196

3.7.3. Производственные испытания полиштаммовой инактивированной вакцины против хламидиозов пушных зверей.................................... 201

3.8. Организация диагностических, профилактических и противоэпизоотических мероприятий при хламидийных инфекциях клеточных и домашних плотоядных.................................................... 204

3.8.1. Мероприятия по диагностике, профилактике и ликвидации хламидиоза пушных зверей.................................................................. 205

3.8.2. Мероприятия по диагностике, профилактике и лечению хламидиоза домашних плотоядных..................................................... 208

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.................. 215

5. ВЫВОДЫ............................................................................................. 239

6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ............................................. 241

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ......................... 243

ПРИЛОЖЕНИЯ.................................................................................. 302

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЖ - асцитная жидкость

АТФ - аденозин трифосфат

ГАТ - гипоксантин-аминоптерин-тимидин

ГТФ - гуанозин трифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

ЖОКЭ - желточная оболочка куриных эмбрионов

з/с - зверосовхоз

ИФА - иммуноферментный анализ

кД- кило дальтон

КЭ - куриные эмбрионы

МКАТ - моноклональные антитела

М.м. - молекулярная масса

MTIA - мясо-петттонный агар

МПБ - мясо-пептонный бульон

МППБ - мясо-пептонный печеночный бульон

НТД - нормативно-техническая документация

ОП - оптическая плотность

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЛТ - пситтакоз-лимфогранулема-трахома

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

РДСК - реакция длительного связывания комплемента

РИА - радиоммунный анализ

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

РН - реакция нейтрализации

4 РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

РНК - рибонкулеиновая кислота

РНСК - реакция непрямого связывания комплемента

РП - реакция преципитации

РСК - реакция связывания комплемента

РЭМА - реакция энзиммеченных антител

ТУ - технические условия

ФБ - фосфатный буфер

ФББР - фосфатно-буферный физиологический раствор

ФИТЦ - флуоресцеинизоционат

ХАО - хорионаллантоисная оболочка

шт. - штамм

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭЛД50 - инфекционный титр, определяемый на куриных эмбрионах

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Хламидиозы - инфекционные заболевания человека, птиц и животных. Паразитируя в организме, хламидии вызывают широкий спектр клинических проявлений болезни, таких как: аборты, пневмонии, энтериты, артриты, конъюнктивиты, уретриты, орхиты, энцефалиты и т.д., которые приводят к гибели животных, снижению их продуктивности и племенной ценности, недополучению приплода, тем самым наносят значительный экономический ущерб животноводству и представляют угрозу здоровью людей.

В настоящее время хламидийные инфекции описаны и изучены у большинства сельскохозяйственных животных: крупного и мелкого рогатого скота, свиней, лошадей и птиц (87,101,123,168, 233, 267, 423, 444 и другие).

История звероводства в нашей стране насчитывает несколько десятилетий. За сравнительно короткий срок накоплен большой опыт разведения пушных зверей в специализированных хозяйствах, где содержатся десятки тысяч животных. Разработаны эффективные методы содержания и кормления зверей с ценным мехом в неволе. Особое значение в благополучном состоянии клеточного звероводства имеет совершенствование методов диагностики, профилактики и лечения различных инфекционных болезней пушных зверей. В этом плане проводится большой объем исследований, однако многие вопросы, касающиеся изучения причин, вызывающих у пушных зверей различные нарушения процесса плодоношения и другую патологию изучены недостаточно. Поголовье пушных зверей нередко подвержено различным инфекционным заболеваниям, этиология которых остается невыясненной. Отдельные авторы (36, 92, 151) высказывали предположения, что патологические процессы у пушных зверей могут быть вызваны микроорганизмами рода хламидий. Кроме того, в доступной литературе имеются единичные сообщения о хламидийной природе заболеваний у

домашнш собак и кощек (92, 127, 128, 248» 284, 494), Тем не менее» многие вопросы' эпизоотологии, этиологии, симптоматики, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики хламидиозов клеточных и домашних плотоядных остаются нерешенными и требуют детального изучения.

Рутинные методы лабораторной диагностики хламидиозов включают обнаружение возбудителя в органах и тканях путем световой и люминесцентной микроскопии, выделение возбудителя на развивающихся куриных эмбрионах, выявление в сыворотках крови больных и переболевших животных комплементсвязывающих антител. Эти тест-системы имеют целый ряд недостатков (длительность получения ответа, низкая чувствительность и специфичность, субъективность оценки результатов исследования). В последние годы для индикации и идентификации хламидий предложены современные иммунохимические и молекулярно-генетические методы, такие как: иммуноферментный анализ, иммуноблотинг, гибридомные технологии, полимеразная цепная реакция и другие (16, 54, 64, 102, 134, 218, 229, 279, 281, 309, 373, 391, 396, 411, 412, 459, 529, 582 и другие). Перечисленные методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью, воспроизводимостью и возможностью одновременно исследовать большое число проб, простотой постановки и учета результатов, способностью выявлять межвидовые и межштаммовые различия хламидий. Исходя из этого, перспективным является совершенствование лабораторной диагностики хламидийных инфекций животных, в том числе пушных зверей и домашних плотоядных с учетом достижений современной биотехнологии.

Приоритетным в профилактике и ликвидации хламидиозов сельскохозяйственных животных остается применение антимикробных препаратов, к которым чувствительны хламидии, и вакцин. Разработаны и внедрены в ветеринарную практику протективные биопрепараты при хламидийных инфекциях крупного и мелкого рогатого скота, свиней и птиц

(87, 164, 193, 203, 233, 426, 446, 478 и другие). Однако, вопросы химиотерапии и специфической профилактики при хламидиозах пушных зверей и домашних плотоядных до настоящего времени остаются открытыми. Кроме того, актуальным является разработка научно-обоснованных мероприятий по диагностике, профилактике и ликвидации инфекционных болезней плотоядных хламидийной природы.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - комплексное изучение этиологической роли хламидий, усовершенствование методов диагностики, разработка средств профилактики и противоэпизоотических мероприятий при хламидиозах клеточных и домашних плотоядных.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

- провести комплекс исследований по выяснению этиологической роли хламидий при различной патологии у пушных зверей и домашних плотоядных и изучить биологические свойства выделенных изолятов;

- изучить пригодность диагностических тестов, применяемых при хламидиозах сельскохозяйственных животных, для диагностики хламидийных инфекций плотоядных;

- разработать современные тест-системы для диагностики хламидиозов;

- разработать инактивированную вакцину против хламидиозов пушных зверей;

- разработать научно-обоснованные рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации хламидийных инфекций клеточных и домашних плотоядных.

Научная новизна. Впервые комплексными (эпизоотологическими, клиническими, патологоанатомическими, серологическими,

бактериологическими и иммунобиологическими) исследованиями доказана этиологическая роль хламидий в патологии плотоядных животных. Выделены и идентифицированы оригинальные штаммы хламидий от лисиц, песцов и собак,

которые по биологическим характеристикам являются типичными представителями рода Chlamydia и обладают выраженными патогенными и антигенными свойствами, подтвержденными лабораторными испытаниями и при экспериментальном воспроизведении хламидийных инфекций у пушных зверей и домашних плотоядных. Штаммы хламидий "БЛ-84" и "ПП-87", соответственно возбудители хламидиоза лисиц и песцов, признаны изобретениями (авторские свидетельства №№ 1667869 и 1667870) и использованы для изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиозов пушных зверей.

Разработаны, усовершенствованы и апробированы в лабораторных и производственных условиях современные методы (ИФА, РИФ, иммуноблотинг и ПЦР) индикации и идентификации возбудителей хламидийных инфекций пушных зверей и домашних плотоядных животных на основе применения поли-и моноклональных антител, а также препаратов ДНК хламидий. Один из гибридомных клонов, секретирующий моноклональные антитела к хламидийиым антигенам, признан изобретением (авторское свидетельство № 1639060) и депонирован в "Банке клеточных культур" института цитологии АН СССР.

Впервые разработана система мероприятий по профилактике и ликвидации хламидиозов клеточных и домашних плотоядных с использованием антимикробных препаратов широкого спектра действия и полиштаммовой инактивированной эмульсионной вакцины, которая успешно апробирована в производственных условиях.

Практическая ценность. Результаты исследований позволили в�