Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Влияние различных типов адъювантов на эффективность вакцин против инфекционных болезней свиней

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Влияние различных типов адъювантов на эффективность вакцин против инфекционных болезней свиней"

На правах рукописи

ШЕМЕЛЬКОВ ЕВГЕНИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ АДЪЮВАНТОВ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ СВИНЕЙ

06.02.02. «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

03.01.06. «Биотехнология, в т.ч. бионанотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва-2010г.

004600311

Работа выполнена в лаборатории иммунологии Государственного научного

учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я.Р. Коваленко» Россельхозакадемии и отделе биологического контроля Научно-производственного объединения «НАРВАК».

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Верховский О.А.

Ведущая организация:

ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (ФЦТРБ-ВНИВИ), г. Казань.

Защита диссертации состоится «25» марта 2010г. в 13— ч. на заседании диссертационного совета Д 220.011.01 при ФГУ «ВГНКИ» по адресу: г. Москва, Звенигородское ш., д.5, ФГУ ВГНКИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ВГНКИ.

доктор биологических наук Алипер Т.И.

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Уласов В.И. (ФГУ «ВГНКИ», г. Москва)

доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный ветеринарный врач РФ Байбиков Т.З. (ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир)

Автореферат разослан «_> февраля 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.в.н., доцент, Заслуженный ветеринарный врач

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Инфекционные болезни занимают одно из ведущих мест в патологии свиней и причиняют значительный экономический ущерб отрасли. Поэтому, во многих странах мира вакцинопрофилактика, наряду с диагностическими и карантинными мероприятиями, является важнейшим звеном в системе мер борьбы и самым эффективным методом эпизоотического контроля за этими болезнями (Орлянкин Б.Г. с соавт., 2009 и др.). Специфическая профилактика инфекционных болезней свиней основана на применении живых, инактивированных или субъединичных вакцин с целью создания у животных напряженного иммунитета, и спектр как живых (аттенуированных), так и инактивированных вакцин отличается большим разнообразием (Кракосевич Н.А. с соавт., 2005 и др.). Живые вакцины весьма эффективны, но для профилактики многих инфекционных болезней пока не удаётся получить аттенуированные штаммы возбудителей, которые обеспечивали бы высокую иммуногенную активность и, вместе с тем, были бы полностью безопасны. В связи с этим возникает необходимость применения инактивированных вакцин, которые требуют использования в своем составе, так называемых, адъювантов - веществ, действующих неспецифически и повышающих специфический иммунный ответ (Большакова М.В., 2000; Bertrand F. et al., 2008 и др.).

Согласно ранее существовавшим представлениям, роль адъювантов сводилась только к удержанию антигена на месте введения, благодаря чему последующее его освобождение приводило к вторичному иммунному ответу после первичной стимуляции (Spier R.E., Griffiths J.B., 1990; Bennett В. et al., 1992). Понимание неоднозначности действия адъювантов пришло сравнительно недавно, в процессе изучения надмолекулярной организации и презентации антигенов. Установлено, что адъюванты взаимодействуют с наиболее важными антигенпрезентирующими клетками (макрофаги, клетки Лангерганса, дендритные клетки) и эффекторными клетками (плазматические клетки и естественные киллеры), Т-хелперами и клетками

воспаления (полиморфно-ядерные базофилы, эозинофилы) (Сергеев, В.А. с соавт., 2007).

В зависимости от адъюванта и способа его введения каждый тип клеток может вести себя по-разному: пролиферировать, дифференцироваться, менять клеточные рецепторы и т.д. Различные адъюванты влияют на индукцию и регуляцию синтеза разных классов антител, образование В-клеток памяти и развитие клеточного иммунитета. Комплексное взаимодействие иммунокомпетентных клеток с адъювантами находится под частичным или полным генетическим контролем организма, но сложность и гетерогенность строения антигенов и адьювантов затрудняет выяснение механизма иммунного ответа (Сох J.C., Coulter A.R., 1997; Spickler A.R., Roth J.A., 2003).

Традиционно наиболее используемыми адъювантами при производстве инактивированных вакцин для животных являются минеральные масла и гидроокись алюминия (Spier R.E., Griffiths J.B., 1990; Vogel F.R. and Powell M.F., 1995; Aucouturier J. et al., 2001).

Однако, на сегодняшний день имеется большой выбор новых коммерческих готовых адъювантных продуктов, а также адъювантов на стадии разработки и испытаний, предназначенных для разных видов животных, направленных на инициацию различных типов иммунного ответа, сочетающих в себе различные уровни показателей эффективности и безопасности. Поэтому исследования по включению различных типов адъювантов в состав инактивированных вакцин весьма актуальны, их проводят большинство европейских фирм, занимающихся производством биопрепаратов для ветеринарии (Кукушкин С.А., 2009; Liu С. et al., 2007; Deville S. et al., 2009).

На отечественном ветеринарном рынке существует достаточно большой ассортимент вакцин против экономически значимых инфекционных болезней свиней. Так, в частности, известны вакцина инактивированная концентрированная против парвовирусной болезни, лептоспироза, болезни

Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ПЛАР), вакцина инактивированная концентрированная против парвовирусной болезни, лептоспироза и болезни Ауески (ПЛА), вакцина инактивированная против болезни Ауески и рожи свиней и другие, выпускаемые «НПО НАРВАК» (Орлянкин Б.Г. с соавт., 2001). Однако современные успехи в области разработки новых типов адъювантов обусловливают дальнейшие исследования, направленные на повышение иммуногенных свойств и улучшение технологии производства традиционных и разрабатываемых вакцин против инфекционных болезней свиней за счет включения в их состав наиболее эффективных адъювантов (Aucouturier J. et al., 2001; Bertrand F. et al., 2008 и др.).

Целью работы является сравнительная оценка влияния различных типов адъювантов на эффективность поливалентных (комбинированных) вакцин против инфекционных болезней свиней.

Основные задачи исследований.

1. Изготовить опытные образцы вакцин ПЛАР и ПЛА с различными типами адъювантов.

2. Изучить стабильность изготовленных препаратов в процессе хранения. Дать сравнительную оценку безвредности опытных образцов вакцин ПЛАР и ПЛА.

3. Определить иммуностимулирующий эффект различных типов адъювантов в составе вакцин ПЛАР и ПЛА в опытах на лабораторных животных.

4. Изучить формирование поствакцинального гуморального иммунного ответа у свиней на введение опытных образцов вакцин ПЛАР и ПЛА.

5. Разработать технологию изготовления инактивированной вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней при включении в ее состав различных типов адъювантов.

6. В опытах на лабораторных и естественно-восприимчивых животных определить безвредность, антигенную и иммуногенную активность опытных

образцов вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней, содержащих различные типы адъювантов. Выбрать наиболее эффективный в иммунологическом отношении препарат.

7. Провести оценку эффективности вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней, приготовленной с выбранньм адъювантом, в свиноводческом хозяйстве промышленного типа.

Научная новизна работы. Впервые дана сравнительная оценка влияния новых (MONTANIDE ISA 773, ISA 763а, ISA 28; MONTAMDE IMS 1313, IMS 2214, IMS 251c, IMS 1335; MONTAMDE GEL 01 PR; MONTAMDE IMP 01) и традиционных адъювантов (PIONIER 7028P и ГОА) на формирование поствакцинального иммунного ответа у лабораторных и естественно-восприимчивых животных. Получены новые данные и показан различный иммуностимулирующий эффект адъювантов при включении их в состав вакцин против инфекционных болезней свиней. На основании сравнительных исследований подтверждены некоторые закономерности формирования поствакцинального иммунного ответа у свиней.

На основе наиболее иммунологически эффективного адъюванта нового поколения MONTAMDE GEL 01 PR разработан новый вакцинный препарат, предназначенный для специфической профилактики парвовирусной болезни и рожи свиней.

Практическая значимость исследований. Опытным путем установлены различия в антигенной активности вариантов вакцин ПЛАР и ПЛА, изготовленных на основе различных типов адъювантов. По результатам проведенных экспериментов из девяти новых адъювантных продуктов был выбран MONTANIDE GEL 01 PR, использование, которого позволяет конструировать инактивированные вакцины для свиней, не уступающие по своей эффективности вакцинам на основе минеральных масел, а по показателям безвредности и простоте использования - вакцинам на основе гидроокиси алюминия.

Для ветеринарной практики предложена инактивированная вакцина против парвовирусной болезни и рожи свиней. Экспериментально установлена безвредность, иммунологическая эффективность вакцины и возможность оценки ее качества на лабораторных животных. Показана высокая антигенная и иммуногенная активность препарата для хряков-производителей, свиноматок и возможность его использования для формирования колострального иммунитета у поросят. Установлено, что в экспериментальных и производственных условиях вакцинация предлагаемым препаратом обеспечивает выраженный протективный эффект, снижая количество нарушений воспроизводительной функции у свиноматок, вызываемых парвовирусом свиней, и эффективную профилактику рожи свиней.

На вакцину против парвовирусной болезни и рожи свиней разработана и утверждена нормативная документация.

Основные положения, выносимые на защиту. Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

результаты исследований по сравнительной оценке иммуностимулирующего эффекта различных типов адъювантов в составе экспериментальных образцов вакцин ПЛАР и ПЛА;

результаты исследований по разработке и определению эффективности экспериментальных образцов вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней, изготовленных с использованием MONTANIDE GEL Ol PR, MONTANIDE IMS 1313, PIONIER 7028P и ГОА в качестве адъювантов;

- эффективность применения разработанной вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней, изготовленной на основе адъюванта MONTANIDE GEL 01 PR, в лабораторных и производственных условиях.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на международной научно-практической конференции

«Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел», посвященной 100-летию со дня рождения академика ВАСХНИЛ Саркисова А.Х. (г. Москва, 2009 г.); научно-производственных совещаниях «НПО НАРВАК» и AHO «НИИ ДПБ» (г. Москва, 2008-2009 гг.); межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (г. Москва, 2009 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 научные работы, в том числе 3 работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно.

Автор приносит благодарность за оказание научно-методической помощи в организации и проведении исследований научным руководителям д.б.н. профессору Верховскому O.A., и д.б.н. Алиперу Т.И., научному консультанту «НПО НАРВАК» д.в.н. профессору Орлянкину Б.Г., сотрудникам отдела биологического контроля «НПО НАРВАК» во главе с руководителем отдела д.б.н. Соболевой Г.Л., сотрудникам ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Материалы диссертации иллюстрированы 16 таблицами и 12 рисунками. Список литературы включает 155 источников (50 отечественных и 105 зарубежных авторов).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Прототипные модели вакцин. В качестве прототипов для изготовления экспериментальных серий вакцин на основе различных типов

адъювантов были использованы коммерческие препараты: вакцина инактивированная концентрированная против парвовирусной болезни, лептоспироза, болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ПЛАР) и вакцина инактивированная концентрированная против парвовирусной болезни, лептоспироза и болезни Ауески (ПЛА), ТУ №938400-067-95.

Вирусы. В опытах использовали следующие вакцинные штаммы вирусов: штамм «К-1» вируса болезни Ауески, штамм «И-82» парвовируса свиней, штамм «ОБ» вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

Бактерии. В качестве бактериальных компонентов использовали концентрат производственных инактивированных штаммов лептоспир серогрупп Pomona, Tarassovi и Icterohaemorragiae и концентрат инактивированных штаммов М2; 1933; 1893 Е. Rhusiopathiae.

При постановке реакции микроагглютинации в качестве антигена использовали диагностические штаммы лептоспир серогрупп Pomona, Tarassovi и Icterohaemorragiae.

Для контрольного заражения белых мышей использовали вирулентный штамм №149 Е. rhusiopathiae.

Культивирование вирусов. Вирус болезни Ауески выращивали в перевиваемой культуре клеток СПЭВ, парвовирус свиней выращивали в перевиваемой культуре клеток ППЭС, вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней - в перевиваемой культуре клеток MARK-145. Накопление вирусов в культуре клеток оценивали по цитопатическому действию, ПВС -по геммагглютинирующей активности с использованием эритроцитов морской свинки. Инфекционный титр вируса вычисляли по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД50/СМ3, ПВС - в гемагглютинирующих единицах (ГАЕ).

Инактивация вирусных антигенов. Для инактивации ВБА, ПВС и ВРРСС использовали формалин, содержащий не менее 37% формальдегида.

Время экспозиции при температуре 37°С для ВБА и ПВС - 72 ч, для ВРРСС -24 ч.

Адъюванты. В работе были использованы следующие адъюванты: гидроокисьалюминия - 6% гель, минеральное масло PIONIER. 7028Р с эмульгатором MONT ANIDE 888, смесь минерального и неминерального масел MONTANIDE ISA 773 и MONTANIDE ISA 28, неминеральное масло MONTANIDE ISA 763а, адъюванты серии MONTANIDE IMS (IMS 1313, IMS 2214, IMS 251c, IMS 1335), адъюванты MONTANIDE GEL 01 PR и MONTANIDE IMP Ol.

Образцы вакцин, содержащие в качестве адъюванта ГОА, готовили путем интенсивного смешивания во флаконах. Для изготовления вакцин, содержащих масляные адъюванты, использовали лабораторный диспергатор IKA Т25 basic (10000 об/мин, 5 мин). Образцы вакцин, содержащие в качестве адъюванта гель или иммунозоли, изготавливали с использованием лабораторной магнитной мешалки Microstirrer (1000 об/мин, 5 мин). Соотношения антигенной части и адъювантов выдерживались исходя из рекомендаций фирм-производителей адъювантов.

Экспериментальные животные. В качестве лабораторных животных использовали белых мышей массой 18-20 г, морских свинок массой 350-400г, кроликов массой 3-3,5 кг, в качестве естественно-восприимчивых - поросят в возрасте 50, 110-115 дней, основных и ремонтных свиноматок, сформированных в соответствующие группы по принципу аналогов.

Материалом для исследований служила сыворотка крови экспериментальных животных, в которой определяли содержание специфических антител в различных серологических тестах.

Реакция нейтрализации (PH). РН ставили микрометодом в 96-луночных полистироловых планшетах по стандартной методике с постоянной дозой соответствующего вируса (1000 ТЦДдаСм3). Вируснейтрализующий татр сыворотки выражали как предельное ее

разведение, ингибирующее развитие ЦПД вируса в 50% зараженных культур клеток.

Реакция гемагглютинации (РГА) и торможения гемагглютинации (РТГА). Реакции ставили микрометодом в 96-луночных полистироловых планшетах с U-образным дном, с использованием эритроцитов морской свинки. За титр антител принимали предельное разведение сыворотки, полностью подавляющее гемагглютинирующую активность вируса.

Реакция микроагглютинации (PMA). РМА использовали для выявления специфических антител к лептоспирам различных серогрупп. РМА ставили микрометодом в 96-луночных полистироловых планшетах с U-образным дном. За титр антител принимали предельное разведение сыворотки, в котором агглютинировало не менее 50% лептоспир в поле зрения микроскопа.

Коммерческие ИФА-наборы. В работе были использованы коммерческие наборы ИФА производства Автономной некоммерческой организации «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных» (AHO «НИИ ДПБ»): набор для выявления антител к антигену gB вируса болезни Ауески иммуноферментным методом «Ауески gB-CEPOTECT» и набор для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней иммуноферментным методом «РРСС-СЕРОТЕСТ».

Проведение контрольного заражения. Оценку иммуногенной активности вакцины по компоненту Е. rhusiopathiae проводили на беспородных белых мышах массой 18-20 г. Животных соответствующей группы (и=20) вакцинировали однократно подкожно в дозе 0,2 см3. Заражение мышей проводили на 21-е сутки после иммунизации, для чего использовали суточную бульонную культуру вирулентного для белых мышей штамма №149 E.rkusiopathiae в дозе 10ЛД5о. В качестве контроля проводили заражение 10 невакцинированных белых мышей. Результаты эксперимента учитывали через 7 суток после заражения.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программ Microsoft Office Excel 2003, Stat Plus 2005.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Влияпие различных типов адъювантов па антигенную активность вакцин ПЛАР и ПЛА.

На первом этапе работы из одной партии инактивированных антигенов было изготовлено 4 экспериментальные серии вакцин ПЛАР и ПЛА. Каждая серия включала 6-8 опытных образцов на основе различных адъювантов.

Каждый экспериментальный образец вакцины был проверен на контаминацию грибковой и бактериальной микрофлорой путем высева на МПА, МПБ, МППБ и бульон Сабуро (ГОСТ 28085-89), а так же стабильность при изготовлении и в процессе хранения.

. Безвредность и антигенную активность изготовленных препаратов проверяли на лабораторных (белые мыши, кролики и морские свинки) и естественно-восприимчивых (поросята в возрасте 50-115 дней) животных.

Изучение гуморального иммунного ответа у лабораторных животных проводили путем двукратной вакцинации кроликов и морских свинок изготовленными образцами вакцины. Кровь брали до и через 28 суток после 1-й и 2-й иммунизаций. В качестве контроля в каждом опыте использовали группу неиммунных животных.

Изучение развития поствакцинального иммунного ответа у естественновосприимчивых животных проводили путем внутримышечного введения каждого образца вакцины поросятам, сформированным в группы по принципу аналогов («=25), в дозе 2,0 см3. До иммунизации кровь выборочно брали у 10 голов поросят из каждой группы, после иммунизации - у 15 голов. Вакцинацию и взятие крови проводили по схемам, представленным в табл.1.

В качестве контрольной группы в каждом опыте использовали невакцшшрованных животных («=10).

Схема вакцинации и получения крови у поросят.

Таблица 1.

Вакцина, серия Возраст поросят, сут Количество вакцинаций Взятие проб крови

ПЛАР эксп. с. 1. 110 одна до и через 30 сут после вакцинации

ПЛАР эксп. с. 2. 50 две до, через 30 сут после 1-й и 2-й вакцинаций

ПЛА эксп. с. 3. 110 одна до, через 30 и 90 сут после вакцинации

ПЛА эксп. с. 4. 115 две до, через 30 сут после 1-й и 2-й вакцинаций

Антигенную активность компонентов вакцины оценивали по уровню специфических антител в сыворотке крови вакцинированных животных в РН, РТГА, РМА, ИФА.

Результаты исследований показали, что все экспериментальные образцы вакцин соответствуют требованиям ГОСТ 28085-89 и не контаминированы бактериальной и грибковой микрофлорой.

Все исследованные образцы вакцин оставались стабильными по результатам всех методов контроля, за исключением вариантов, изготовленных на основе адъюванта MONTANIDE IMS 251с, нестабильных при выдерживании при температуре 37°С. Для эмульгированных вариантов вакцин допускалось отслоение эмульсии (образование в верхней части прозрачной фракции) не более 10%.

Изучение безвредности изготовленных препаратов показало, что образцы, содержащие в качестве адъювантов иммунозоли, гель, неминеральное масло ISA 763а, MONTANIDE IMP 01 и ГО А, являлись ареактогенными и не вызывали значительных изменений на месте введения вакцины. Образцы, изготовленные с использованием минерального масла, а так же смеси минерального и неминерального масел, в некоторых случаях, вызывали на месте введения формирование плотных округлых образований величиной с горошину у белых мышей и ограниченных безболезненных припухлостей у подсвинков.

Результаты опытов, проведенных на лабораторных и естественно-восприимчивых животных, с использованием вакцины ПЛАР эксп. с.1 и с.2

свидетельствуют о том, что наиболее высокий уровень специфических антител к вирусным и бактериальным компонентам вакцины установлен у животных, иммунизированных препаратом, изготовленным с использованием адъювантов PIONIER 7028Р, IMS 1313 и ISA 773 (табл.2). Вакцины, изготовленные на основе адъювантов IMS 2214, IMS 251с, ISA 28, ISA 763а и ГОА оказались менее эффективными. У животных, иммунизированных данными образцами вакцины, установлены более низкие титры специфических антител.

Таблица 2.

Оценка поствакцинапъного гуморального иммунного ответа у 50-ти суточных поросят после двукратного применения вакцины ПЛАР, эксп. серия 2.

№ группы и соотношение компонентов вакцины Срок исследования ТИТР АНТИТЕЛ к*

ВБА (РН) пвс (РТГА) ВРРСС (РН) ЛЕПТОСПИРАМ (РМА)

Рош Таг let

№1 IMS 1313-50% АГ**-50% 0 20 112 0 <50 <50 <50

I 121 456 10 1024 1024 816

2 376 1012 42 3250 3167 2784

т IMS251c-50% АГ-50% 0 19 121 0 <50 <50 <50

1 93 309 8 960 730 763

2 180 740 20 2121 2054 1895

№3 IMS 2214-50% АГ-50% 0 24 119 0 <50 <50 <50

1 97 383 6 864 973 635

2 194 801 18 2015 2301 1897

№4 ISA 773-70% АГ - 30% 0 18 104 0 <50 <50 <50

1 112 402 12 1156 1004 901

2 275 983 36 3286 3097 2693

№5 ГОА-20% АГ-70% 0 20 99 0 <50 <50 <50

I 85 320 4 793 689 601

2 176 695 19 2001 1812 1902

№6 PIONIER 7028Р-50% АГ-50% 0 22 115 0 <50 <50 <50

1 ИЗ 418 10 1086 937 800

2 301 1003 31 3016 2984 2545

К 0 19 109 0 <50 <50 <50

1 20 112 4 <50 <50 <50

2 18 124 4 <50 <50 <50

Примечание: здесь и далее в таблицах и рисунках: *- приведены средние геометрические значения титров антител, выраженных в обратных величинах; ** - АГ -антигенная часть вакцины. К - контрольная группа животных.

Результаты РН в отношении ВРРСС положительно коррелировали с результатами ИФА (г=0,9, Р<0,5), по данным которого уровень специфических антител к ВРРСС был выше у поросят 1-й, 4-й и 6-й групп (рис.1).

60--------------,

1 2 3 4 5 6

группа животных

Рис.1. Относительное содержание антител к вирусу РРСС установленное методом ИФА в сыворотке крови поросят после двукратного применения вакцины ПЛАР, эксп. серия 2.

Исследования сыворотки крови лабораторных животных, которым вводили вакцину ПЛА (эксп. с.З), показали, что наибольшей антигенной активностью обладали варианты вакцины, изготовленные с использованием адъювантов PIONIER 7028Р, IMS 1313 и GEL 01 PR.

Аналогичные результаты были получены при испытании этой вакцины на 110-суточных поросятах (табл.3).

Таблица 3.

Оценка поствакцинального гуморального иммунного ответа у 110- суточных поросят после однократного применения вакцины ПЛА, эксп серия 3.

№ группы и соотношение компонентов вакцины Время после вакцинации, суг. ТИТР АНТИТЕЛ* к

ВБА (РН) ПВО (РТГА) ЛЕПТОСПИРАМ (РМА)

Pom Таг let

№1 IMS 1313-50% АГ**-50% 0 7 83 <50 <50 <50

30 177 308 1036 984 979

90 122 304 817 693 587

№2 Gel Ol PR-10% АГ-90% 0 32 97 <50 <50 <50

30 233 297 1097 1016 956

90 74 214 824 717 693

№3 Gel Ol PR-10% АГ-50% 0 18 91 <50 <50 <50

30 112 338 915 947 854

90 51 304 626 591 530

№4 Gel 01 PR -15% АГ-85% 0 21 82 <50 <50 <50

30 170 353 983 923 897

90 70 210 604 612 501

№5 ГОА-20% АГ-70% 0 21 95 <50 <50 <50

30 128 253 817 804 794

90 58 202 324 395 298

№6 PIONIER 7028Р-50% АГ-50% 0 32 102 <50 <50 <50

30 441 281 1112 1002 930

90 122 215 554 535 492

К 0 21 89 <50 <50 <50

30 24 90 <50 <50 <50

90 23 97 <50 <50 <50

Как видно из данных табл.3 наиболее высокий уровень антител к ВБА после вакцинации установлен у животных, вакцинированных препаратом на основе адъюванта PIONIER 7028Р, однако через 90 суток после иммунизации титр антител значительно снижался. У животных, иммунизированных вариантами вакцины на основе адъювантов IMS 1313 и GEL 01 PR, установлен высокий уровень специфических антител, как к вирусным, так и к бактериальным компонентам вакцины, который не так резко снижался через 90 суток после вакцинации. Результаты РН положительно коррелировали с результатами ИФА (г=0,9, Р<0,05), по данным которого уровень антител к ВБА был выше у поросят 1-й, 2-й и 6-й групп (рис.2).

□ о

«30 0 90

1 2 3 4 5 6 к

группа животных

Рис. 2. Относительное содержание антител к вирусу болезни Ауески в сыворотке крови поросят, установленное методом ИФА.

Результаты исследования поствакцинального иммунного ответа у лабораторных животных при использовании вакцины ПЛА (эксп. с.4) показали, что наиболее высокой антигенной активностью в отношении вирусных и бактериальных компонентов обладали варианты вакцины, изготовленные с использованием следующих адъювантов: IMS 1313, PIONIER 7028Р и GEL 01 PR (Р<0,05). Варианты вакцины на основе адъювантов IMS 1335, ГОА и IMP 01 обусловливали индукцию более низкого уровня специфических антител после первой вакцинации и меньший их прирост после бустерной иммунизации.

В результате исследований 115-дневных поросят, двукратно иммунизированных вакциной ПЛА (эксп.с.4), было установлено, что наилучшей антигенной активностью как в отношении вирусных, так и в отношении

бактериальных компонентов обладали варианты вакцины, изготовленные с использованием адъювантов IMS 1313, GEL 01 PR и PIONIER 7028P. У животных, иммунизированных вариантами вакцины на основе адъювантов IMS 1335, ГОА и IMP 01, установлен более низкий уровень специфических антител после первой вакцинации и не столь выраженный прирост уровня антител после второй (табл.4).

Таблица 4.

Оценка поствакцинального гуморального иммунного ответа у 115-ти суточных поросят после двукратного применения вакцины ПЛА, эксп. серия 4.

№ группы и соотношение компонентов вакцины Срок исследования ТИТР АНТИТЕЛ к*

ВБА (РН) пвс (РТГА) ЛЕПТОСПИРАМ (РМА)

Рош Таг let

№1 IMS 1313-50% АГ**-50% 0 21 89 <50 <50 <50

1 128 426 918 1016 836

2 400 1921 4128 4015 3600

№2 Gel Ol PR-10%-АГ-90% 0 19 101 <50 <50 <50

I 136 512 1029 1117 985

2 474 1948 3917 4260 3976

№3 Gel 01 PR -10% АГ-50% 0 23 91 <50 <50 <50

1 110 417 936 854 915

2 376 1813 3283 2937 3012

№4 IMS 1335-50% АГ-50% 0 24 114 <50 <50 <50

1 104 309 847 911 749

2 320 1253 2937 2400 2781

№5 ША-20% АГ-70% 0 21 102 <50 <50 <50

1 93 300 852 817 823

2 292 1115 2019 1983 2100

т PIONIER 7028Р-50% АГ-50% 0 20 104 <50 <50 <50

1 128 427 923 942 894

2 395 1893 3291 3117 3235

№7 IMP01 -10% АГ-90% 0 18 95 <50 <50 <50

1 112 327 874 901 896

2 324 1811 2516 2432 2015

№8 1MP01 -10% АГ-50% 0 25 98 <50 <50 <50

1 101 291 632 541 549

2 295 1017 2004 1743 1832

КОНТРОЛЬНАЯ ГРУППА 0 25 97 <50 <50 <50

1 19 98 <50 <50 <50

2 24 112 <50 <50 <50

Для изучения изменения в процессе хранения антигенных свойств компонентов, входящих в состав вакцин, была проведена иммунизация лабораторных животных вакциной ПЛА (эксп. с.З) после ее изготовления (А), через 12 месяцев хранения (Б) при температуре 4°С.

Результаты опыта свидетельствовали о том, что все варианты вакцины обладали выраженной антигенной активностью и стабильностью в процессе хранения (табл.5).

Таблица 5.

Оценка поствакцинального гуморального иммунного ответа у лабораторных животных после однократного применения вакцины ПЛА, эксп. серия 3. после изготовления и через 12 месяцев хранения.

Ла группы и соотношение компонентов вакцины Срок исследования ТИТР АНТИТЕЛ к*

ВБА (РН) м/св пвс (РТГА) м/св ЛЕПТОСПИРАМ (PMA) кролики

Pom Таг let

А 5 А Б А Б А Б А Б

№1 IMS 1313-50% АГ**-50% 0 0 0 8 20 <50 <50 <50 <50 <50 <50

1 65 63 127 134 634 547 252 312 252 306

№2 Gel 01 PR -10% АГ-90% 0 0 0 16 19 <50 <50 <50 <50 <50 <50

1 90 87 123 121 604 598 400 400 346 312

№3 Gel 01 PR-10%-АГ-50% 0 0 0 16 15 <50 <50 <50 <50 <50 <50

1 64 60 86 87 505 465 400 432 504 400

№4 Gel 01 PR-15% АГ-85% 0 0 0 16 21 <50 <50 <50 <50 <50 <50

1 71 62 90 94 1008 800 400 346 800 634

№5 ГОА-20% АГ-70% 0 0 0 11 22 <50 <50 <50 <50 <50 <50

1 32 47 77 82 1600 800 432 400 800 547

№6 PIONIER 7028Р-50% АГ-50% 0 0 0 32 23 <50 <50 <50 <50 <50 <50

1 84 75 95 124 1131 1100 400 432 400 400

КОНТРОЛЬНАЯ ГРУППА 0 0 0 11 21 <50 <50 <50 <50 <50 <50

1 0 0 16 20 <50 <50 <50 <50 <50 <50

Анализ данных, приведенных в табл. 5, позволил заключить, что хранение экспериментальных образцов при температуре 4°С в течение 12 месяцев не приводило к достоверному снижению антигенных свойств компонентов, входящих в состав вакцины.

Целью нашей работы была не только сравнительная оценка влияния разных адъювантов на эффективность существующих вакцин, но и разработка нового вакцинного препарата на основе наиболее эффективного адъюванта. В этой связи следующим этапом нашей работы стала разработка инактивированной вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней с

использованием новых адъювантных средств, испытанных в предыдущих опытах.

2.2. Разработка и оценка эффективности вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней при использовании различных типов адъювантов.

На первом этапе исследований был проведен подбор оптимальной концентрации компонента Е. rhusiopathiae в вакцине, которая бы обеспечивала максимальную защиту от заболевания и, вместе с тем, не снижала показатели безвредности препарата. Для этого изготовили 5 вариантов вакцины с содержанием 25% суспензии ПВС и концентрацией бактериального компонента 1,2, 5,10 и 20 млрд. микробных тел в одной дозе препарата (одна иммунизирующая доза для свиней 2,0 см3). Эффективность бактериального компонента определяли в опыте прямого заражения вакцинированных белых мышей.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что оптимальной концентрацией Е. rhusiopathiae является 5 млрд. микробных клеток в 1 дозе вакцины, т.е. 2,5 млрд. микробных клеток в 1,0 см3 готового препарата. Иммунизация мышей данным образцом вакцины обеспечивала выживаемость 80% мышей после заражения. Меньшая концентрация Е. rhusiopathiae не обусловливала необходимый уровень протективного иммунитета, а увеличение концентрации Е. rhusiopathiae не влекло за собой повышения иммуногенных свойств вакцины, но вызывало повышение реактогенности испытуемых образцов.

Следующим этапом нашей работы было изготовление опытных образцов вакцины с использованием четырех типов адъювантов: MONTAN1DE IMS 1313, MONTANIDE GEL 01 PR, минерального масла PIONIER 7028Р с добавлением эмульгатора MONTANIDE 888 и ГОА.

Изготовленные образцы были исследованы на стерильность, стабильность, безвредность, антигенную и иммуногенную активность в опытах на лабораторных и естественно-восприимчивых животных.

Белых мышей вакцинировали однократно подкожно в дозе 0,2 см3, морских свинок - однократно внутримышечно в дозе 1 см3, ремонтных' свиноматок - однократно внутримышечно в дозе 2,0 см3. Взятие проб крови у морских свинок и ремонтных свиноматок осуществляли до и через 28 суток после вакцинации.

На основании проведенных исследований был сделан вывод, что все изготовленные экспериментальные образцы вакцины соответствовали требованиям ГОСТ 28085-89 и не были контаминированы бактериальной и грибковой микрофлорой, оставались стабильными при всех методах контроля.

Изучение безвредности изготовленных препаратов показало, что образцы, содержащие в качестве адъювантов IMS 1313, GEL 01 PR и ГОА, являлись ареактогенными и не вызывали значительных изменений на месте введения вакцины. Введение образца, изготовленного с использованием минерального масла, в некоторых случаях, вызывало на месте инъекции формирование плотных округлых образований величиной с горошину у белых мышей и ограниченных безболезненных припухлостей у подсвинков.

Изучение антигенной активности парвовирусного компонента на лабораторных (морские свинки) и естественно-восприимчивых животных (ремонтные свиноматки в возрасте 180 дней) показало, что введение экспериментальной вакцины сопровождалось развитием выраженного гуморального иммунного ответа к ПВС, уровень которого варьировал в зависимости от типа используемого адъюванта (табл.6).

Таблица 6.

Оценка поствакцинального гуморального иммунного ответа к ПВС у лабораторных и естественно-восприимчивых животных после применения __вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней._

ЖИВОТНЫЕ ТИТР АНТИТЕЛ к ПВС* в РТГА ГРУППА ЖИВОТНЫХ

№1 IMS 1313 №2 Gel 01 PR №3 PIONIER 7028P №4 ГОА Х»5 К**

Морские свинки до вакцинации 20 16 18 20 18

после вакцинации 244 256 278 121 22

Ремонтные свиноматки до вакцинации 32 32 31 32 31

после вакцинации 289 347 395 190 32

Примечание: *- приведены средние геометрические значения титров антител, выраженных в обратных величинах, ** - в качестве контроля использовались невакцинированные животные соответствующего вида.

Данные, представленные в таблице 6, позволяют сделать заключение о том, что более высокой антигенной активностью в отношении парвовирусного компонента обладали варианты вакцин, изготовленные с использованием адъювантов PIONIER 7028Р, IMS 1313 и GEL 01 PR, о чем свидетельствует высокий уровень специфических антител, установленный в пробах сыворотки крови иммунизированных животных. Вакцина на основе ГОА менее эффективна.

Иммуногенная активность образцов вакцины в опытах на белых мышах так же значительно варьировала в зависимости от типа используемого адъюванта (рис.3).

Рис. 3. Оценка протективного иммунитета экспериментальных образцов вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней при использовании в ее составе различных типов адъювантов.

Как видно из данных, приведенных на рис.3, вакцина против парвовирусной болезни и рожи свиней, изготовленная с использованием адъюванта MONTANTOE GEL 01 PR, обладала выраженной иммуногенной активностью и, стимулируя формирование напряженного иммунитета, в 100% случаев обеспечивала защиту вакцинированных мышей от контрольного заражения. 90%-ную защиту животных обеспечила вакцина на основе иммунозоля - MONTANIDE IMS 1313 (Р<0,05). Образец вакцины, изготовленный с использованием адъюванта минерального масла PIONIER 7028Р, показал более низкую иммуногенную активность (выживаемость мышей - 85%). Самую низкую эффективность показала вакцина на основе ГОА (выживаемость мышей - 55%). В контрольной группе гибель мышей составила - 100%.

Таким образом, наиболее высокую антигенную и иммуногенную активность показали варианты вакцины, в которых в качестве адъювантов были использованы MONTANTOE GEL 01 PR и минеральное масло PIONIER 7028Р. Однако, вариант вакцины на основе масла PIONIER 7028Р уступает образцу, содержащему адъювант MONTANIDE GEL 01 PR по показателям безвредности, обладает значительно большей вязкостью и менее стабилен в процессе хранения.

Образцы вакцины, изготовленные с использованием адъювантов MONTANIDE IMS 1313 и ГОА, оказались менее эффективными.

Таким образом, для изготовления производственных серий инактивированной вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней в качестве адъюванта нами рекомендован MONTANIDE GEL 01 PR.

2.3. Производственные испытания вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней.

В 2009 г на базе ряда свиноводческих хозяйств РФ проведены производственные испытания трех экспериментальных серий

инактивированной вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней с адъювантом MONTANIDE GEL Ol PR.

В хозяйствах вакцинировали основных и ремонтных свиноматок. Вакцину вводили внутримышечно в дозе 2,0 см3. Ремонтных свинок вакцинировали двукратно: первый раз за 1 месяц до осеменения, повторно через 14 дней. Основных свиноматок прививали однократно за 1,5 - 2 месяца до опороса.

В качестве контроля использовали ремонтных свинок и основных свиноматок, которых вакцинировали против парвовирусной болезни и рожи свиней коммерческими вакцинами, применяемыми в данных хозяйствах для специфической профилактики вышеуказанных болезней согласно утвержденному плану противоэпизоотических мероприятий. Коммерческие вакцины применяли в соответствии с инструкцией производителя препарата.

Эпизоотическую эффективность вакцины в хозяйствах определяли по отсутствию случаев регистрации рожи у иммунизированных животных и подсосных поросят, полученных от вакцинированных свиноматок, а так же по учету числа случаев нарушения воспроизводительной функции свиноматок и учету числа выхода живых поросят при опоросе на одну свиноматку.

Результаты проведенных испытаний показали эффективность экспериментальной вакцины в отношении парвовирусной болезни свиней. В целом уровень оплодотворяемости и выход поросят на одну свиноматку в группах животных, где применялась экспериментальная вакцина, был несколько выше, а уровень прохолостов свиноматок ниже, чем в группах, где использовались коммерческие вакцины (табл.7).

От животных, вакцинированных разработанной вакциной, получено в среднем 9,25 поросенка на одну свиноматку, в то время как в контрольных группах выход поросят составил 8,99 голов на одну свиноматку. Количество прохолостов в среднем составило 12,75% в группах животных, где

применялась инактивнрованная вакцина против парвовирусной болезни и рожи свиней и 13,8 % в контрольных группах животных.

Таблица 7.

Результаты производственных испытаний вакцины

в отношении парвовирусной болезни свиней _

Хозяйство Используемая вакцина Количество свиноматок в опыте Получено живых поросят при опоросе на одну свиноматку, гол. Прохолосты у свиноматок, %

Рем. Осн. Рем. Осн. Рем. Осн.

ФГУП «Пермский свинокомплекс» Перм. область Вакцина против парвовирусной болезни и рожи свиней с.1. 375 - 8,8 - 15,7 -

ООО «Машкино» Московская область Вакцина против парвовирусной болезни и рожи свиней с.2. 60 10 9 9,3 14 12,1

Коммерческая моновакцина против парвовирусной болезни свиней 21 15 8,8 9,15 14,3 12,4

ЗАО «Талицкое» Свердловская область Вакцина против парвовирусной болезни и рожи свиней с.2. 124 27 9,0 9,5 13,5 11,9

Коммерческая моновакцина против парвовирусной болезни свиней 47 14 8,6 9,1 15,8 13,9

ЗАО «Талицкое» Свердловская область Вакцина против парвовирусной болезни и рожи свиней с.З. 163 34 9,2 9,6 13,9 12,5

Коммерческая моновакцина против парвовирусной болезни свиней 62 18 8,7 9,3 16 13,8

ООО «Согласие» Тюменская область Вакцина против парвовирусной болезни и рожи свиней с.З. 118 31 8,9 9,4 12,9 11,2

Коммерческая комбинированная вакцина против парвовирусной болезни и рожи свиней (иностр. производства) 49 12 8,8 9,4 12,9 11,1

Примечание: приведены данные полученные в опытных (применялась разработанная вакцина) и контрольных (применялись коммерческие вакцины против парвовирусной болезни свиней) группах животных.

Случаев регистрации рожи у вакцинированных свиноматок и поросят сосунов, полученных как от свиноматок опытных групп, так и от животных контрольных групп, не отмечалось.

23

3. выводы.

1. Отработана технология изготовления вакцин ПЛАР (вакцина инактивированная концентрированная против парвовирусной болезни, лептоспироза, болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней) и ПЛА (вакцина инактивированная концентрированная против парвовирусной болезни, лептоспироза и болезни Ауески) с разными типами адъювантов. Изготовлено четыре экспериментальные серии вакцин.

2. Установлено, что все изготовленные образцы вакцин, за исключением вариантов на основе адъюванта MONTANIDE IMS 251с, оставались стабильными в течение длительного времени хранения (срок наблюдения 12 месяцев).

3. В опытах на лабораторных животных установлено, что варианты вакцин, изготовленные на основе минерального масла и смеси минерального и неминерального масел, отличались довольно высокой реактогенностью. Образцы вакцин, в составе которых в качестве адъювантов использованы ГОА, MONTANIDE GEL 01 PR, продукты серии MONTANIDE IMS (иммунозоли), MONTANIDE IMP 01, MONTANIDE ISA 763a, были безвредными.

4. В экспериментальных условиях на лабораторных животных установлено, что вакцины, на основе разных типов адъювантов, обладали различной антигенной активностью, что обусловило различия в содержании специфических антител у иммунизированных кроликов и морских свинок. Наиболее антигенно активными были варианты вакцин, изготовленные с применением адъювантов MONTANIDE GEL 01 PR, MONTANIDE IMS 1313, MONTANIDE ISA 773 и минерального масла PIONIER 7028P с добавлением эмульгатора MONTANIDE 888. Хранение экспериментальных вакцин при температуре 4-6°С в течении 12 месяцев не вело к снижению антигенной активности компонентов, входящих в их состав.

5. В опытах на естественно-восприимчивых животных установлено, что разные адъюванты в составе вакцин ПЛАР и ПЛА обладали различным

иммуностимулирующим эффектом на формирование поствакцинального гуморального иммунного ответа. Образцы вакцин, изготовленные на основе адъювантов MONT ANIDE GEL Ol PR, PIONIER 7028P с добавлением эмульгатора MONTANIDE 888 и MONTANIDE IMS 1313, вызывали наиболее напряженный и продолжительный иммунный ответ у вакцинированных поросят.

6. Разработана технология изготовления инактивированной вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней. Определена оптимальная концентрация вирусного и бактериального компонентов в одной иммунизирующей дозе вакцины. Изготовлено четыре экспериментальных варианта вакцины на основе адъювантов MONT ANIDE GEL Ol PR, MONTANIDE IMS 1313, PIONIER 7028P с добавлением эмульгатора MONTANIDE 888 и ГОА.

7. В опытах на лабораторных и естественно-восприимчивых животных установлено, что по показателям безвредности, антигенной и иммуногенной активности, технологичности изготовления вакцины и использования готового продукта наиболее оптимальным оказался вариант вакцины, изготовленный на основе адъюванта MONTANIDE GEL Ol PR.

8. В производственных условиях установлена профилактическая эффективность вакцинации свиноматок и хряков-производителей разработанной вакциной. Использование вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней позволило получать в среднем от каждой вакцинированной свиноматки на 0,26 поросенка больше, чем от животных в контрольных группах (привитых коммерческими вакцинами) и снизить число прохолостов в 1,08 раза. Случаев регистрации рожи у вакцинированных животных, а так же у поросят-сосунов, полученных от иммунизированных свиноматок, не наблюдали.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Материалы проведенных исследований вошли в следующие нормативные документы:

- СТО 76418883-0001-2009 «Вакцина против рожи и парвовирусной болезни свиней инактивированная (ВЕРРЕС-ЭП)», согласовано с Россельхознадзором МСХ РФ 17 декабря 2009 года.

- Инструкцию по применению вакцины против рожи и парвовирусной болезни свиней инактивированной (ВЕРРЕС-ЭП), утвержденную Россельхознадзором МСХ РФ 17 декабря 2009 года.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Шемельков, Е.В. Антигенная активность вакцины против инфекционных болезней свиней при включении в ее состав адъювантов / Е.В. Шемельков, Ю.Н. Федоров, O.A. Верховский // Сельскохозяйственная биология. 2008.- №4 с. 101-106.

2. Шемельков, Е.В. Сравнительная оценка активности вакцины против рожи свиней при использовании в ее составе различных адъювантов / Е.В. Шемельков, O.A. Верховский // Труды ВИЭВ том 75.- М., 2009.- 666-669с.

3. Шемельков, Е.В. Влияние различных типов адъювантов на эффективность вакцин ПЛАР и ПЛА / Е.В. Шемельков, O.A. Верховский, Б.Г. Орлянкин // Ветеринария. 2009.- № 11 с. 23-29.

4. Шемельков, Е.В. Адъюванты и их влияние на поствакцинальный иммуногенез у лабораторных животных / Е.В. Шемельков, O.A. Верховский // Ветеринарный врач. 2009,- № 5 с. 27-30.

Подписано в печать 09.02.2010 г.

Заказ № 3252 Тираж: 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Шемельков, Евгений Владимирович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Производство и виды вакцинных препаратов.

2.2. Строение и свойства антигенов.

2.3. Специфический иммунный ответ.

2.4. Механизм действия адъювантов и характеристика основных типов адъювантов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ АДЪЮВАНТОВ НА АНТИГЕННУЮ АКТИВНОСТЬ ВАКЦИН ПЛАР И ПЛА.

4.1. Изготовление экспериментальных серий вакцин с различными адъювантами. Изучение безвредности и стабильности изготовленных образцов в процессе хранения.

4.2. Оценка гуморального иммунного ответа у лабораторных животных, иммунизированных экспериментальными образцами вакцин ПЛАР и ПЛА.

4.3. Контроль антигенной активности вакцины ПЛА в процессе хранения.

4.4. Оценка гуморального иммунного ответа у свиней, иммунизированных экспериментальными образцами вакцин ПЛАР и ПЛА.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Влияние различных типов адъювантов на эффективность вакцин против инфекционных болезней свиней"

Инфекционные болезни занимают одно из ведущих мест в патологии свиней и причиняют значительный экономический ущерб отрасли. Поэтому, во многих странах мира вакцинопрофилактика, наряду с диагностическими и карантинными мероприятиями, является важнейшим звеном в системе мер борьбы и самым эффективным методом эпизоотического контроля за этими болезнями [34, 35]. Специфическая профилактика инфекционных болезней свиней основана на применении живых, инактивированных или субъединичных вакцин с целью создания у животных напряженного иммунитета, и спектр как живых (аттенуированных), так и инактивированных вакцин отличается большим разнообразием [42]. Живые вакцины весьма эффективны, но для профилактики многих инфекционных болезней пока не удаётся получить аттенуированные штаммы возбудителей, которые обеспечивали бы высокую иммуногенную активность и, вместе с тем, были бы полностью безопасны. В связи с этим возникает необходимость использования инактивированных вакцин, которые требуют использования в своем составе, так называемых, адъювантов - веществ, действующих неспецифически и повышающих специфический иммунный ответ [1, 6, 7].

Согласно ранее существовавшим представлениям, роль адъювантов сводилась только к удержанию антигена на месте введения, благодаря чему последующее его освобождение приводило к вторичному иммунному ответу после первичной стимуляции [6, 63]. Понимание неоднозначности действия адъювантов пришло сравнительно недавно, в процессе изучения надмолекулярной организации и презентации антигенов. Установлено, что адъюванты взаимодействуют с наиболее важными антигенпрезентирующими клетками (макрофаги, клетки Лангерганса, дендритные клетки) и эффекторными клетками (плазматические клетки и естественные киллеры), Т-хелперами и клетками воспаления (полиморфно-ядерные базофилы, эозинофилы) [46]. В зависимости от адъюванта и способа его введения каждый тип клеток может вести себя по-разному: пролиферировать, дифференцироваться, менять клеточные рецепторы и т.д. Различные адъюванты влияют на индукцию и регуляцию синтеза разных классов антител, образование В-клеток памяти и развитие клеточного иммунитета. Комплексное взаимодействие иммунокомпетентных клеток с адъювантами находится под частичным или полным генетическим контролем организма, но сложность и гетерогенность строения антигенов и адъювантов затрудняет выяснение механизма иммунного ответа [77, 147].

Традиционно наиболее используемыми адъювантами при производстве инактивированных вакцин для животных являются минеральные масла и гидроокись алюминия [6, 60, 153].

Однако на сегодняшний день имеется большой выбор новых коммерческих готовых адъювантных продуктов, а также адъювантов на стадии разработки и испытаний, предназначенных для разных видов животных, направленных на инициацию различных типов иммунного ответа, сочетающих в себе различные уровни показателей эффективности и безопасности. Поэтому исследования по включению различных типов адъювантов в состав инактивированных вакцин весьма актуальны, их проводят большинство европейских фирм, занимающихся производством биопрепаратов для ветеринарии [25, 79, 119].

На отечественном ветеринарном рынке существует достаточно большой ассортимент вакцин против экономически значимых инфекционных болезней свиней. Так, в частности, известны вакцина инактивированная концентрированная против парвовирусной болезни, лептоспироза, болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ПЛАР), вакцина инактивированная концентрированная против парвовирусной болезни, лептоспироза и болезни Ауески (ПЛА), вакцина инактивированная против болезни Ауески и рожи свиней и другие, выпускаемые НПО НАРВАК [41]. Однако современные успехи в области разработки новых типов адъювантов обусловливают дальнейшие исследования, направленные на повышение иммуногенных свойств и улучшение технологии производства традиционных и разрабатываемых вакцин против инфекционных болезней свиней за счет включения в их состав наиболее эффективных адъювантов [1,60].

Целью работы является сравнительная оценка влияния различных типов адъювантов на эффективность поливалентных (комбинированных) вакцин против инфекционных болезней свиней.

Основные задачи исследований.

1. Изготовить опытные образцы вакцин ПЛАР и ПЛА с различными типами адъювантов.

2. Изучить стабильность изготовленных препаратов в процессе хранения. Дать сравнительную оценку безвредности опытных образцов вакцин ПЛАР и ПЛА.

3. Определить иммуностимулирующий эффект различных типов адъювантов в составе вакцин ПЛАР и ПЛА в опытах на лабораторных животных.

4. Изучить формирование поствакцинального гуморального иммунного ответа у свиней на введение опытных образцов вакцин ПЛАР и ПЛА.

5. Разработать схему изготовления инактивированной вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней при включении в ее состав различных типов адъювантов.

6. В опытах на лабораторных и естественно-восприимчивых животных определить безвредность, антигенную и иммуногенную активность опытных образцов вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней, содержащих различные типы адъювантов. Выбрать наиболее эффективный в иммунологическом отношении препарат.

7. Провести оценку эффективности вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней, приготовленной с выбранным адъювантом, в свиноводческом хозяйстве промышленного типа.

Научная новизна работы.

Впервые дана сравнительная оценка влияния новых (MONTANIDE ISA 773, ISA 763а, ISA 28; MONTANIDE IMS 1313, IMS 2214, IMS 251c, IMS 1335; MONTANIDE GEL 01 PR; MONTANIDE IMP 01) и традиционных адъювантов (PIONEER 7028P и ГО А) на формирование поствакцинального иммунного ответа у лабораторных и естественно-восприимчивых животных. Получены новые данные и показан различный иммуностимулирующий эффект адъювантов при их включении в состав вакцин против инфекционных болезней свиней. На основании сравнительных исследований подтверждены некоторые закономерности формирования поствакцинального иммунного ответа у свиней.

На основе наиболее иммунологически эффективного адъюванта нового поколения MONTANIDE GEL 01 PR разработан новый вакцинный препарат, предназначенный для специфической профилактики парвовирусной болезни и рожи свиней.

Практическая значимость исследований.

Опытным путем установлены различия в антигенной активности вариантов вакцин ПЛАР и ПЛА, изготовленных на основе различных типов адъювантов. По результатам проведенных экспериментов из девяти новых адъювантных продуктов был выбран MONTANIDE GEL 01 PR, использование которого позволяет конструировать инактивированные вакцины для свиней, не уступающие по своей эффективности вакцинам на основе минеральных масел, а по показателям безвредности и простоте использования - вакцинам на основе гидроокиси алюминия.

Для ветеринарной практики предложена инактивированная вакцина против парвовирусной болезни и рожи свиней. Экспериментально установлена безвредность, иммунологическая эффективность вакцины и возможность оценки ее качества на лабораторных животных. Показана высокая антигенная и иммуногенная активность препарата для хряковпроизводителей, свиноматок и возможность его использования для формирования колострального иммунитета у поросят. Установлено, что в экспериментальных и производственных условиях вакцинация предлагаемым препаратом обеспечивает выраженный протективный эффект, снижая количество нарушений воспроизводительной функции у свиноматок, вызываемых парвовирусом свиней, и показатель заболеваемости рожей свиней.

На вакцину против парвовирусной болезни и рожи свиней разработана и утверждена нормативная документация.

Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения: результаты исследований по сравнительной оценке иммуностимулирующего эффекта различных типов адъювантов в составе экспериментальных образцов вакцин ПЛАР и ПЛА; результаты исследований по разработке и определению эффективности экспериментальных образцов вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней, изготовленных с использованием MONTANIDE GEL 01 PR, MONTANIDE IMS 1313, PIONIER 7028P и ГОА в качестве адъювантов; эффективность применения разработанной вакцины против парвовирусной болезни и ролей свиней, изготовленной на основе адъюванта MONTANIDE GEL 01 PR, в лабораторных и производственных условиях.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы доложены на международной научно-практической конференции «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел», посвященной 100-летию со дня рождения академика ВАСХНИЛ Саркисова А.Х. (г.Москва, 2009г.); научно-производственных совещаниях «НПО НАРВАК» и АНО «НИИ ДПБ» (г.Москва, 2008-2009гг.); межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (г.Москва, 2009г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 4 научные работы, в том числе 3 работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад соискателя.

Работа выполнена соискателем самостоятельно.

Автор приносит благодарность за оказание научно-методической помощи в организации и проведении исследований научным руководителям д.б.н. профессору Верховскому О.А., и д.б.н. Алиперу Т.И., научному консультанту «НПО НАРВАК» д.в.н. профессору Орлянкину Б.Г., сотрудникам отдела биологического контроля «НПО НАРВАК» во главе с руководителем отдела д.б.н. Соболевой Г.Л., сотрудникам ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 158 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований,

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Шемельков, Евгений Владимирович

7. ВЫВОДЫ.

1. На основе прототипных вакцин ПЛАР (вакцина инактивированная концентрированная против парвовирусной болезни, лептоспироза, болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней) и ПЛА (вакцина инактивированная концентрированная против парвовирусной болезни, лептоспироза и болезни Ауески) были изготовлены четыре экспериментальные серии вакцин, содержащие в своем составе различные типы адъювантов.

2. Установлено, что все изготовленные образцы вакцин (за исключением вариантов на основе адъюванта MONTANIDE IMS 251с) оставались стабильными в течение длительного времени хранения (срок наблюдения 12 месяцев).

3. В опытах на лабораторных животных установлено, что варианты вакцин, изготовленные на основе минерального масла и смеси минерального и неминерального масел отличались довольно высокой реактогенностью. Образцы вакцин, в состав которых в качестве адъювантов включены ГОА, MONTANIDE GEL 01 PR, продукты серии MONTANIDE IMS (иммунозоли), MONTANIDE IMP 01, MONTANIDE ISA 763a были безвредны.

4. В экспериментальных условиях на лабораторных животных установлено, что изготовленные образцы вакцин, на основе разных типов адъювантов, обладали различной антигенной активностью, что обусловило различия в содержании специфических антител у иммунизированных кроликов и морских свинок. Показано, что наиболее антигенно активными оказались варианты вакцин, изготовленные с применением адъювантов MONTANIDE GEL 01 PR, MONTANIDE IMS 1313, MONTANIDE ISA 773 и минерального масла PIONIER 7028P с добавлением эмульгатора MONTANIDE 888. Хранение экспериментальных образцов вакцины при температуре 4-6°С в течение 12 месяцев не вело к снижению антигенной активности компонентов, входящих в ее состав.

5. В опытах на естественно-восприимчивых животных было установлено, что различные типы адъювантов в составе вакцин ПЛАР и ПЛА обладали различным иммуностимулирующим эффектом на формирование поствакцинального гуморального иммунного ответа. Образцы вакцин, изготовленные на основе адъювантов MONTANIDE GEL 01 PR, PIONIER 7028P с добавлением эмульгатора MONTANIDE 888 и MONTANIDE IMS 1313, вызывали наиболее напряженный и продолжительный иммунный ответ у вакцинированных поросят.

6. Разработана схема изготовления инактивированной вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней. Определена оптимальная концентрация вирусного и бактериального компонентов в одной иммунизирующей дозе вакцины. Изготовлено четыре экспериментальных варианта вакцины на основе адъювантов: MONTANIDE GEL 01 PR, MONTANIDE IMS 1313, PIONIER 7028P с добавлением эмульгатора MONTANIDE 888 и ГОА.

7. В опытах на лабораторных и естественно-восприимчивых животных установлено, что по показателям безвредности, антигенной и иммуногенной активности, технологичности изготовления вакцины и использования готового продукта наиболее оптимальным оказался вариант вакцины, изготовленный на основе адъюванта MONTANIDE GEL 01 PR.

8. В производственных условиях установлена профилактическая эффективность вакцинации свиноматок и хряков-производителей разработанной вакциной. Использование вакцины против парвовирусной болезни и рожи свиней позволило получать в среднем от каждой вакцинированной свиноматки на 0,26 поросенка больше, чем от животных в контрольных группах (привитых коммерческими вакцинами) и снизить число прохолостов примерно в 1,08 раза. Случаев регистрации рожи у вакцинированных животных, а так же у поросят-сосунов, полученных от иммунизированных свиноматок не наблюдали.

8. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Материалы проведенных исследований вошли в следующие нормативные документы:

- СТО 76418883-0001-2009 «Вакцина против рожи и парвовирусной болезни свиней инактивированная (ВЕРРЕС-ЭП)», от 17 декабря 2009 года, согласовано с Россельхознадзором МСХ РФ 17 декабря 2009 года.

- Инструкция по применению вакцины против рожи и парвовирусной болезни свиней инактивированной (ВЕРРЕС-ЭП), утверждено Россельхознадзором 17 декабря 2009 года.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Шемельков, Евгений Владимирович, Москва

1. Адъюванты для ветеринарных вакцин / F. Bertrand, G. Ionkoff, S. Deville, L. Dupuis, J. Aueouturier // Проблемы биотехнологии, стандартизации и обеспечения контроля препаратов, кормов и кормовых добавок.- Киев: Дорадо, 2008.- 95с.

2. Ашмарин, Н.П. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов / Н.П. Ашмарин, И.П. Васильев, В.А. Амбросов.- Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1974,- 76с.

3. Балышева, В.И. Ассоциированная инактивированная вакцина против болезней Ауески и Тешена / В.И. Балышева, А.А. Шишкова, В.И. Жестерев // Ветеринария.- 2007.- №6. с.20-23.

4. Баян, Д. Дуламсурен. Разработка инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза рогатого скота, лошадей и свиней: автореф. дисс. . канд. вет. наук / Баян Дуламсурен.- Владимир., 2005.- 12с.

5. Биотехнология / под ред. Е.С. Воронина.- Спб., 2005.- 474с.

6. Биотехнология клеток животных. Т. 1, 2. / под ред. R.E. Spier, J.B. Griffiths; перевод с англ. В.М. Тарасенко, под ред. Г.А. Сафонова.- М., 1990.-с.138-287.

7. Большакова, М.В. Эффективность противоящурных вакцин в зависимости от используемого адъюванта: автореф. дисс. . канд. биол. наук / М.В. Большакова.- Щелково., 2000. 20с.

8. Ветеринарные препараты: справочник / под ред. Д.Ф. Осидзе.- М.: Колос, 1981.- 266с.

9. Ветеринарная микробиология / под. ред. Е.В. Козловского и П.А, Емельяненко.- М.: Колос, 1982.- 198с.

10. Вирусология. Методы. / Баррет Т., Берд. П, Клегг Дж. и др. под ред. Б. Мейхи.- М.: Мир, 1988.- 173с.

11. Вирусология в 3-х тт.: уч. пособие / под ред. Б. Филдса, Д. Найпа.-М.: Мир, 1988.

12. Воробьев, В. А. Адъюванты (неспецифические стимуляторы иммуногенеза) / В.А. Воробьев, Н.Н. Васильев.- М.: Медицина, 1969.- 206с.

13. Галактионов, В.Г. Иммунология / В.Г. Галактионов.- М.: Академия, 2004,-216с.

14. Диагностика вирусных болезней животных: справочник / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина.- М.: Агропромиздат, 1991.- 312с.

15. Иммунологические методы / X. Амброзиус, X. Фибих, 3. Вихнер. под ред. Г. Фримеля.- М.: Медицина, 1987.- 375с.

16. Иммуногенетика и искусственные антигены / под ред. Р.В. Петрова М., 1988.-198 с.

17. Иммунология / под ред. Е.С. Воронина.- М.: Колос-пресс, 2002.89с.

18. Калюкина, А.И. изучение возможности применения рекомбинантного белка HSP70 туберкулезной микобактерии в профилактики

19. Каплун, А.П. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ / А.П. Каплун, Ле Банг Шон, Ю.М. Краснопольский и др. М., 2005.- 34с.

20. Клюкина, Н.Д. Полиакриловая кислота как адъювант в противоящурной вакцины: автореф. дисс. . канд. вет. наук / Н.Д. Клюкина.-Владимир., 2007.- 16с.

21. Кукушкин, С.А. Нарушение функций воспроизводства у свиней / С.А. Кукушкин, A.M. Рахманов //Вет. консультант.- 2003.- №3(51). с.3-4.

22. Кукушкин, С.А. Разработка средств специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней: автореф. дисс. . докт. вет. наук / С.А. Кукушкин,- М., 2009.- 16с.

23. Лихолетов, С.М. современные аспекты разработки вакцин, адъювантов и иммуномодуляторов / С.М. Лихолетов // Успехи современной биологии.-М., 1988.-Т. 105. с.83-97.

24. Малахов, Ю.А. Лептоспироз животных / Ю.А. Малахов, А.Н. Панин, Г.Л. Соболева.- Ярославль: ДИА-пресс, 2000.- 375с.

25. Мамков, Н.С. Масляные адъюванты для противоящурных вакцин: автореф. дисс. . докт. вет. наук / Н.С. Мамков.- Владимир., 1999.- 19с.

26. Медуницын, Н.В. Вакцинология / Н.В. Медуницын.- М.: Триада-Х, 2004.- 146с.

27. Мертвецов, Н.П. Современные подходы к конструированию молекулярных вакцин/Н.П. Мертвецов.- Новосибирск, 1987.- 182с.

28. Михайлов, В.В. Иммобилизированные препараты в вирусологии и вакцинологии / В.В. Михайлов, Р.А. Хамитов, Б.В. Кравцов // Вопросы вирусологии.- 1995.- №5. с. 194-197.

29. Нургалиев, Ф.М. Ассоциированная инактивированная вакцина против парвовирусной болезни, стрептококкоза и сальмонеллеза свиней,оценка ее иммуногенных свойств: автореф. дисс. . канд. вет. наук / Ф.М. Нургалиев.- Казань., 2006.- с.18.

30. Орлянкин, Б.Г. Диагностика и специфическая профилактика парвовирусной болезни свиней: автореф. дисс. . докт. вет. наук / Б.Г. Орлянкин.- М., 1988.- 27с.

31. Орлянкин, Б.Г., Инфекционные респираторные болезни свиней / Б.Г. Орлянкин, Т.И. Алипер, Е.А. Непоклонов // Ветеринария.- 2005.- №11 с.3-6.

32. Орлянкин, Б.Г. Патология репродукции свиней / Б.Г. Орлянкин // Российский ветеринарный журнал.- 2009.- №2 с.4-6.

33. Особенности иммунитета свиней и стратегия разработки вакцин против инфекционных болезней / JI. Энхуанес // мат. секц. Проблемы инфекционной патологии свиней / XV Московский международный ветеринарный конгресс.- М., 2007.- 15с.

34. Раев, С.А. Вакцина против вирусной лейкемии кошек / С.А. Раев, Е.А. Непоклонов, R. Herwijnen, А.Н. Мухин, Т.И. Алипер // Ветеринария.-2009.- №3 с.22-25.

35. Петров, Р.В., Хаитов, P.M. Искусственные антигены и вакцины / Р.В. Петров, P.M. Хаитов.- М., 1988.- 145с

36. Противовирусные вакцины будущего / Б.Г. Орлянкин, Т.И. Алипер, Е.А. Непоклонов // сборник научных работ специалистов «НПО НАРВАК».-М., 2001.-91с.

37. Профилактика болезней молодняка свиней / А.Н. Кракосевич // мат. секц. Проблемы инфекционной патологии свиней / XIII Московский международный ветеринарный конгресс.- М., 2005.- 29с.

38. Прудников, В. С. Изучение иммуноморфогенеза при болезнях и вакцинациях животных / В. С. Прудников, Ф.Д. Гуков, И.М. Луппова, А.И. Жуков, В.Н. Грушин // Ветеринария. 2005.- №4 с.20-22.

39. Сафонов, Н.А., Физиология иммунной системы / Н.А. Сафонов, В.Д, Фомина. М.: Изд-во MB А, 2002- 24с.

40. Сергеев, В.А. Вирусы и вирусные вакцины / В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов, Т.И. Алипер.- М.: Библионика, 2007.- 186с.

41. Скворцова, И.И. Биологические свойства парвовируса свиней и его антигенная активность в ассоциации с Leptospira interrogans: автореф. дисс. . канд. вет. наук/И.И. Скворцова.- М., 1992.- 24с.

42. Сюрин, В.Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина.- М.: ВНИИТИБП, 1998.- 573с.

43. Теоретические и экспериментальные обоснования разработки новых вакцин / В.П. Риженко и др. // Проблемы биотехнологии, стандартизации и обеспечения контроля препаратов, кормов и кормовых добавок.- Киев: Дорадо, 2008.- 51с.

44. Шутов, А.Э. Адъювантные свойства некоторых биостимуляторов при вакцинопрофилактике вирусного трансмиссивного гастроэнтеритакоронавирусной инфекции) свиней: автореф. дисс. . канд. вет. наук / А.Э. Шутов.- СПб., 1996. 16с.

45. Abel G., Szollosi J., Chihara G. and Fachet J. Effect of Lentinan and Mannan on phagocytosis of fluorescent latex microbeads by mouse peritoneal macrophages: a flow cytometric study, tnt. J. tmmunophannac. 1989.- №11. p.615-621.

46. Adam A., Ciorbaru R., Petit J.F. and Lederer E. Isolation and properties of a macromolecular, water soluble, immuno-adjuvant fraction from the cell wall of Mycobacterium smegmatis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 39. p.851-854.

47. Allison A.C. and Byars N.E. An adjuvant formulation that selectively elicits the formation of antibodies of protective isotypes and of cell-mediated immunity. J. Irnrnun. Meth. 1986,- №95. p. 157-168.

48. Allison A.C. and Byars N.E. Adjuvants for a new generation of vaccines. In: New Generation Vaccines (Eds Woodrow, G.C. and Levine, M.M.). Marcel Dekker, Inc. New York, 1990.- p. 129-140

49. Allison A.C. and Byars N.E. Syntex adjuvant formulation. Res. Immun. 1992.-№143. p.519-525.

50. Alving C.R. and Richards R.L. Liposomes containing lipid A: a potent nontoxic adjuvant for a human malaria sporozoite vaccine. Immun. Lett. 1990.-№25. p.275-280.

51. Alving C.R. Immunologic aspects of liposomes: presentation and processing of liposomal protein and phospholipid antigens. Biochim. Biophys. Acta Rev. Biomembr. 1992.- №113. p.307-322.

52. Alving C.R., Verma J.N., Rao M. et al. Liposomes containing lipid A as a potent non-toxic adjuvant. Res. Immun. 1992,- №143. p.197-1 98.

53. Alving C.R. Liposomal vaccines: Clinical status and immunological presentation for humoral and cellular immunity. Ann N Y Acad Sci 1995.- №754. p.143-152.

54. Aucouturier J., Dupuis L., Ganne V. Adjuvants designed for veterinary and human vaccines. Vaccine. 2001.- №19. p.2666-2672.

55. Barr I.G. and Mitchell G.F. ISCOMS (immunostimulating complexes): the first decade. Immun. Cell Biol. 1996,- №74. 8-25.

56. Beacock-Sharp H., Donachie A.M., Robson N.C., Mowat A.M. A role for dendritic cells in the priming of antigen-specific CD4+ and CD8+ Tlymphocytes by immune-stimulating complexes in vivo. Int Immunol. 2003.-№15. p.711-720.

57. Bennett В., Check I.J., Olsen M.R. and Hunter R.L. A comparison of commercially available adjuvants for use in research. J. Immun. Meth. 1992.-№153. p.31-40.

58. Bomford R., Stapleton M., Winsor S. et al. Adjuvanticity and ISCOM formation by structurally diverse saponins. Vaccine 1992.- №10. p.572-577.

59. Bradfield J.W., Souhami R.L. and Addison I.E. The mechanism of the adjuvant effect of dextran sulphate. Lmmunoiogy 1974.- №26. p.383-392.

60. Brewer J.M., Richmond J. and Alexander J. The demonstration of an essential role for macrophages in the in vivo generation of IgG2a antibodies. Cin. Exp. Immun. 1994.-№97. p.164-171.

61. Brey R.N. Development of vaccines based on formulations containing nonionic block copolymers. In: Powell MF, Newman MJ, ed. Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach. New York, NY: Plenum Press; 1995.- p.297-311.

62. Brey R.N. Copolymer adjuvants. Adv. Exp. Med. Biol. 1995.- №383 p.23-34.

63. Cambier J.C., Pleiman C.M. and Clark M.R. Signal transduction by the В cell antigen receptor and its coreceptors. A. Rev Immun. 1994.- №12 p.457-486.

64. Call D., Knight P.A., Hampson F. Adjuvant activity of polyelectrolytes. J. Immunol. 1972,- №23. p.569-575.

65. Chinnah A.D., Baig M.A., Tizard I.R. and Kemp M.C. Antigen dependent adjuvant activity of a polydispersed 6-(l,4)-linked acetylated mannan (acemannan). Vaccine. 1992.- №10. p.551-557.

66. Chu R.S., Targoni O.S., Krieg A.M., et al. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper (Thl) immunity. J. Exp. Med. 1997.-№186. p.1623-1631.

67. Cooper P.D. and Steele E.J. Algammulin, a new vaccine adjuvant comprising gamma inulin particles containing alum: preparation and in vitro properties. Vaccine. 1991.- № 9. p.351-357.

68. Cox J.C. and Coulter A.R. Advances in adjuvant technology and application, In: Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology (Ed. Yong, W.K.). CRC Press, Boca Raton, 1992.- p.49-112.

69. Cox J.C, Coulter A.R. Adjuvants a classification and review of their modes of action. Vaccine. 1997.- №15. p.248-256.

70. Cox J.C., Sparks R.E., Jacobs I.C. and Mason N.S. Patent. Vaccine preparations. 1994.- PCT/AU93/00677.

71. Deville S., Laval A. and Parker R. Adjuvant formulation for influenza H1N1 and H3N2 pig vaccines. Vaccine. 2009.- №7. p.451-457.

72. Den Haan JMM, Bevan M.J. Antigen presentation to CD81 T cells: Cross-priming in infectious diseases. Curr Opin Immunol. 2001.- №13. p.437-441.

73. Dozmorov I.M., Kuzin I.I., Lutsan N.I. et al. Comparative study of immunomodulatory properties of muramyl peptides on immune system cells of young and old mice. Immunopharmac. Immunotoxic. 1994.- №16. p. 149-1 63.

74. Ellouz F., Adam A., Ciorbaru R, and Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974.- №59. p. 1317-1325.

75. Freund J., Casals J., Hosmer E.P. Sensitization and antibody formation after injection of tubercle bacilli and paraffin oil. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1937.-№37. p.509-513.

76. Freund J., Thomson K.J., Hough H.B., Sommer H.E. and Pisani T.M. Antibody formation and sensitization with the aid of adjuvants. J. Immun. 1948.-№60. p.383-398.

77. Freund J. The effect of paraffin oil and mycobacteria on antibody formation and sensitization. A review. Am. J. Clin. Pathol. 1951.- №21. p.645-656.

78. Fruh K., Gossen M., Wang K., Bujard H., Peterson P.A. and Yang Y. Displacement of housekeeping proteasome subunits by МНС-encoded LMPs: a newly discovered mechanism for modulating the multicatalytic proteinase complex. EMBO JI. 1994.- №13. p.3236-3244.

79. Gallucci S., Lolkema M., Matzinger P. Natural adjuvants: Endogenous activators of dendritic cells. Nat. Med. 1999.- №5. p.1249-1255.

80. Glenn G.M., Scharton-Kersten Т., Vassell R., et al. Transcutaneous immunization with bacterial ADP-ribosylating exotoxins as antigens and adjuvants. Infect. Immun. 1999.- №67. p. 1100-1106.

81. Glenny A.T, Pope C.G., Waddington H., Wallace U., The antigenic value of toxoid precipitated by potassium alum., Journal of Pathology and Bacteriology. 1926.-№29. p.38-45.

82. Glenny A.T., Pope C.G., Waddington H. and Wallace, Lt. Immunological notes. J. Path. Bact. 1926.- №29. p.31-39.

83. Goldberg A.L. and Rock K.L. Proteolysis, proteasomes and antigen presentation. Nature. 1992.- №357. p.375-379.

84. Gradon J.D., Lutwick L.I. Maintaining and enhancing vaccine immunogenicity. Infect. Dis. Clin. North. Am. 1999.- №13. p.39-60.

85. Gregoriadis G. and Panagiotidi C. lmmunoadjuvant action of liposomes; comparison with other adjuvants. Immun. Left. 1989.- №20. p.237-240.

86. Gupta R K., Relyveldt E.H., Lindblad E.B., Bizzini В., Ben-Efraim S. and Gupta C.K. Adjuvants a balance between toxicity and adjuvanticity. Vaccine. 1993.- №11. p.293-306.

87. Hamaoka Т., Katz D.H. and Benacerraf B. Hapten-specific IgE antibody responses in mice. Cooperative interactions between adoptively transferred T and В lymphocytes in the development of IgE response. J. Exp. Med. 1973.- №138. p.538-556.

88. Harold F., Stills Jr., Adjuvants and antibody production: Dispelling the Myths Associated with Freund's Complete and Other Adjuvants. J. Biotechnol. 1993.-№9. p.153-162.

89. Heath A.W. and Playfair J.H. Cytokines as immunological adjuvants. Vaccine. 1992. №10. p.427-434.

90. Hoskinson R.M., Rigby R.D.G., Mattner P.E. et al. Vaxstrate: an anti-reproductive vaccine for cattle. Aust. J. Biotechnol. 1990.- №4. p. 166-170.

91. Hovanessian A.G., Galabru J., Riviere Y. and Montagnier L. Efficiency ofpoly(A) poly(U) as an adjuvant. Immun. Today. 1988.- №9. p.161-162.

92. Hughes H.P. Cytokine adjuvants: Lessons from the past-Guidelines for the future? Vet. Immunol. Immunopathol. 1998.- №63. p. 131-138.

93. Hunter R., Strickland F. and Kezdy F. The adjuvant activity of nonionic block polymer sutfactants. The role of hydrophile-lipophile balance. J. Immun. 1981.-№127. p.1244-1250.

94. Hunter R., Olsen M. and Buynitzky S. Adjuvant activity of non-ionic block copolymers. Effect of molecular weight and formulation on titre and isotype of antibody. Vaccine. 1991.- №9. p.250-256.

95. Hunter R.L., Kidd M.R., Olsen M.R., Patterson P.S. and Lai A.A. Induction of long-lasting immunity to Plasmodium yoelii malaria with whole blood-stage antigens and copolymer adjuvants. J. Immun. 1995.- №154. p. 17621769.

96. Jiang W., Swiggard W.J., Heufler C. ef al. The receptor DEC-205 expressed by dendritic cells and thymic epithelial cells is involved in antigen processing. Nature 1995.- №375. p.151-155.

97. Johnson A.G. and Tomai M.A. A study of the cellular and molecular mediators of the adjuvant action of a nontoxic monophosphoryl lipid A. Adv. fxp. Med. Biof. 1990,- №256. p.567-579.

98. Kensil C.R. Saponins as vaccine adjuvants. In: Critical Previews In: Therapeutic Drug Carrier Systems. 1996.- №13. p.1-55.

99. Kersten G.F., Crommelin. D.J. Liposomes and ISCOMs as vaccine formulations. Biochim. Biophys. Act. 1995,- №1241. p. 117-138.

100. Klinman D.M., Barnhart K.M., Conover J. CpG motifs as immune adjuvants. Vaccine. 1999.- №17 p. 19-23.

101. Kreuter J. Possibilities of using nanoparticles as earners for drugs and vaccines. J. Microencaps. 1988.- №5. p.115-127.

102. Krishnan L., Dicaire C.J., Patel G.B., Sprott G.D. Archaeosome vaccine adjuvants induce strong humoral, cell-mediated, and memory responses: Comparison to conventional liposomes and alum. Infect. Immun. 2000.- №68. p.54-63.

103. Lanzavecchia A. Receptor-mediated antigen uptake and its effect on antigen presention to class 11-restricted T lymphocytes. A. Rev. Immun. 1990.-№6. p.773-793.

104. Lofthouse S.A., Andrews A.E., Elhay M.J., et al. Cytokines as adjuvants for ruminant vaccines. Int. J. Parasitol. 1996.- №26. p.835-842.

105. Lowell G.H. Proteosomes, hydrophobic anchors, iscoms, and liposomes for improved presentation of peptide and protein vaccines. In: New Generation Vaccines. (Eds. Woodrow G.C. and Levine M.M.). Marcel Dekker, Inc. New York, 1990.- p.141-160.

106. Lefrancier P., Derrien M., Lederman I., Niff F., Choay J. and Lederer E. Synthesis of some new analogs of the immunoadjuvant glycopeptide MDP (Nacetyl-muramyl-L-alanyl-Disoglutamine). Int. J. Pep. Prot. Res. 1978.- №11. p.289-296.

107. Lefrancier P., Derrien M., Jamet X. et al. Apyrogenic, adjuvant-active Nacetylmuramy 1-dipeptides. J. Med. Chem. 1982.- №25. p.87-90.

108. Linbland E.B. Aluminium adjuvants in retrospect and prospect. Vaccine. 2004.- №22. p.358-368.

109. Liu C., Wei Y., Zhang C., Zhang Z. and Yuan J. Comparison of adjuvant for porcine circovirus type 2 inactivated vaccines. J. of Preventive Vet. Medicine. 2007.- №9. p.690-672.

110. Macy D.W. Vaccine adjuvants. Semin. Vet. Med. Surg. (Small Anim). 1997.- №12. p.206-211.

111. Mancino D., Ovary Z. Adjuvant effects of amorphous silica and of aluminium hydroxide on IgE and IgGl antibody production in different inbred mouse strains, tnt. Arch. Allergy Appl. Immun. 1980.- №61. p.253-258.

112. Mark A., Bjorksten B. and Granstrom M. Immunoglobulin E responses to diphtheria and tetanus toxoids after booster with aluminium-adsorbed and fluid DT-vaccines. Vaccine. 1995.- №13. p.669-673.

113. Meyer ЕюК. Vaccine-associated adverse events. Vet. Clin. North. Am. Small Anim. Pract. 2001.- №31. p.493-514.

114. Morein В., Liivgren K., Hoglund S. and Sundquist B. The ISCOM: an immunostimulating complex. Immun. Today. 1987.- №8. p.333-338.

115. Morein В., Villacres-Eriksson M., Sjolander A., Lovgren Bengtsson K. Novel adjuvants and vaccine delivery systems. Vet. Immunol. Immunopathol. 1996.- №54. p.373-384.

116. Morein В., Lovgren-Bengtsson К. and Cox J. Modem adjuvants. Functional aspects. In: Concepts in Vaccine Devetopment (Ed. Kaufmann, S.H.E.). Walter de Gruyter, Berlin. New York, 1996.- p.243-263.

117. Neeijes J.J. and Momburg F. Cell biology of antigen presentation. Curr. Opin. Immun. 1993.- №5. p.27-34.

118. Nicklas W. Aluminum salts. Res. Immun. 1992.- №143. p.489-494.

119. Niblack J.F., Otterness I.G., Hemsworth G.R., Wolff J.S., Hoffman W.W. and Kraska A.R. CP-20,961: a structurally novel, synthetic adjuvant. J. Reticuloendofh. Sot. 1979.- №26. p.655-666.

120. Oxenius A., Martinic M.A., Hengartner H., Klenerman P. CpG containing oligonucleotides are efficient adjuvants for induction of protective antiviral immune responses with T-cell peptide vaccines. J. Virol. 1999.- №73. p.4120-4126.

121. Park S.J., Kim W.H., Han K.H., Chon C.Y. et al. Adjuvant effect of Polyadenylic. Polyuridylic acid on antibody production of recombinant Hepatitis В surface antigen in mice. Inf. J. Immunopharmac. 1995.- №17. p.513-516.

122. Pederson N.C., Black J.W. Attempted immunization of cats against feline infectious peritonitis, using avirulent live virus or sublethal amounts of virulent virus. Am. J. Vet. Res. 1983.- №44. p.229-234.

123. Playfair J.H. and DeSouza J.B. Vaccination of mice against malaria with soluble antigens. The effect of detergent, route of injection, and adjuvant. Parasite Immun. 1986.- №8. p.409-414.

124. Ramon G. Sur laugmentation anormale de lantitoxine chez lechevaux producteurs de serum antidiphterique. Bull. Soc. Cent. Med. Vet. 1925.- №101. p.227-234.

125. Ramon G. Procedures pour acroitre la production des antitoxines. Ann Inst Pasteur (Paris). 1926. №40. p. 1-10.

126. Ribi E., Cantrell J. and Takayama K. A new immunomodulator with potential clinical applications: monophosphotyl lipid A, a detoxified endotoxin. Cin. Immun. Newslett. 1985.- №6. p.33-36.

127. Ribi H.O., Ludwig D.S., Mercer K.L., Schoolnik G.K. and Kornberg R.D. Three-dimensional structure of Cholera toxin penetrating a lipid membrane. Science. 1988.- №239. p. 1272-1276.

128. Ronnberg В., Fekadu M. and Morein B. Adjuvant activity of non-toxic Quillaia saponaria Molina components for use in ISCOM matrix. Vaccine. 1995.-№13. p.1375-1382.

129. Roth J.A. Mechanistic bases for adverse vaccine reactions and vaccine failures. Adv. Vet. Med. 1999.- №41. p.681-700.

130. Salk J.E. and Laurent A.M. The use of adjuvants in studies on influenza immunization. I. Measurements in monkeys of the dimensions of antigenicity of virus-mineral oil emulsions. J. Exp. Med. 1952.- №95. p.429-447.

131. Schijns VEJC. Immunological concepts of vaccine adjuvant activity. Curr. Opin. Immunol. 2000.- №12. p.456-463.

132. Shu Q., Hillard M.A., Bindon B.M., et al. Effects of various adjuvants on efficacy of a vaccine against Streptococcus bovis and Lactobacillus spp. in cattle. Am. J. Vet. Res. 2000.- №61. p.839-843.

133. Sjolander A., Cox J. C. and Barr I. G. ISCOMs: an adjuvant with multiple functions., Journal of Leukocyte Biology. 1998.- v.64. p.123-134.

134. Sjolander A., Drane D., Maraskovsky E., et al. Immune responses 280 Spickler and Roth to ISCOMt formulations in animal and primate models. Vaccine. 2001.- №19. p.2661-2665.

135. Sjolander A., Cox J.C., Barr I.G. ISCOMs: An adjuvant with multiple functions. J. Leukoc. Biol. 1998.- №64. p.713-723.

136. Spickler A. R., Roth J. A. Adjuvants in Veterinary Vaccines: Modes of Action and Adverse effects. J. Vet. Intern. Med. 2003.- №17. p.273-281.

137. Stewart-Tull D.E. (Ed.) The Theory and Practical Applicationof Adjuvants. John Wiley and Sons Ltd., Chichester, 1994.

138. Suna H.X., Xiea Y., Ye Y.P. Advances in saponin-based adjuvants. Vaccine. 2009.- №27. p. 1787-1796.

139. Tsuda Т., Sugimura Т., Murakami Y. Evaluation of glycoprotein gll ISCOMs subunit vaccine for pseudorabies in pig. Vaccine. 1991.- №9. p.648-652.

140. Usinger W.R. A comparison of antibody responses to veterinary vaccine antigens potentiated by different adjuvants. Vaccine. 1997.- №15. p. 192197.

141. Vogel F.R. and Powell M.F. A compendium of vaccine adjuvants and excipients. In: Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach (Eds. Powell, M.F. and Newman, M.J.). Plenum Press, New York, 1995.- p. 141-228

142. Vogel F.R. Improving vaccine performance with adjuvants. Clin. Infect. Dis. 2000.- №30. p.266-270.

143. Zeidner N.S., Belasco D.L., Dreitz M.J., et al. Gliding bacterial adjuvant stimulates feline cytokines in vitro and antigen-specific IgG in vivo. Vaccine. 1995.- №13. p.1294-1299.