Диссертации » Физико-химическая биология » Молекулярная биология

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспериментальная ДНК-вакцина против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальная ДНК-вакцина против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека"

На правах рукописи

Максютов Ринат Амирович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ДНК-ВАКЦИНА ПРОТИВ НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ И ДРУГИХ ОРТОПОКСВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА

03.01.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 НОЯ 2010

Кольцово - 2010

004613802

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Щелкунов С.Н.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Белявская В.А. кандидат биологических наук, доцент Коваленко С.П.

Ведущая организация

Институт химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ) СО РАН (Новосибирск).

Защита состоится 03 декабря 2010 года в 9.00 часов на заседании "диссертационного совета при ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан 02 ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Трошкова Г.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Исторически первым способом защиты людей от опустошительных эпидемий натуральной оспы явилась так называемая вариоляция, заключающаяся во внутрикожном внесении инфекционного материала от больных оспой здоровым людям. Индуцированное таким образом заболевание имело более короткий инкубационный период и протекало в относительно легкой форме по сравнению с обычной респираторной передачей инфекции от человека к человеку. Смертность при вариоляции составляла 0.5-2 % вместо 20-30 %, наблюдавшихся во время эпидемий натуральной оспы. Открытие возможности вакцинации людей, используя инокуляцию вируса оспы коров (ВОК), а затем вируса осповакцины (ВОВ), привело к значительному снижению риска тяжелых побочных реакций.

В 1980 г., учитывая наличие тяжелых поствакцинальных осложнений при использовании классической живой вакцины и подтверждение ликвидации оспы, вакцинацию против данной инфекции ВОЗ рекомендовала в дальнейшем не проводить. Последующее прекращение вакцинации против оспы создало опасную ситуацию, когда человеческая популяция с каждым годом становится все более беззащитной не только перед возможным инфицированием вирусом натуральной оспы (ВНО) в результате теракта или возникновения вируса в природе, но и перед заражением другими близкородственными ортопоксвирусами, такими как вирусы оспы обезьян (BOO) или оспы коров, природным резервуаром которых являются мелкие грызуны. Об этом свидетельствуют участившиеся многочисленные вспышки ортопоксвирусных инфекций среди людей, вызванные такими вирусами как В00, ВОК и ВОВ. Кроме того, ВНО рассматривают как возможный агент биотеррористических атак, которые могут иметь катастрофические последствия для всего населения Земли. Отсутствие эффективных антивирусных препаратов оставляет вакцинопрофилактику единственным специфическим средством сдерживания ортопоксвирусных инфекций среди людей.

Использование классической живой вакцины на основе ВОВ для массовой вакцинации в настоящее время недопустимо из-за относительно большого числа возможных осложнений, что объясняется возросшим в последние годы количеством

категорий людей с супрессивным иммунитетом, таких как пациенты, перенесшие трансплантацию, ВИЧ-инфицированные пациенты, лица принимающие иммунодепрессанты и др. В связи с этим особенно актуальным является разработка современных безопасных вакцин против ортопоксвирусов.

Перспективным является использование ДНК-вакцин - новейшего подхода к иммунопрофилактике вирусных инфекций. При полной безопасности они индуцируют полноценный иммунный ответ против вирусной инфекции. На основе данных о геномных последовательностях ортопоксвирусов и протективных иммуногенов, возникла возможность создания поливалентной ДНК-вакцины на основе комбинации генов вируса натуральной оспы, обеспечивающей высокую иммуногенность и защиту против ортопоксвирусов, патогенных для человека. Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось получение и изучение свойств экспериментальной ДНК-вакцины против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Выбрать гены вируса натуральной оспы для конструирования ДНК-вакцины, обеспечивающие высокую иммуногенность.

• Сконструировать рекомбинантные плазмиды, экспрессирующие под контролем эукариотического промотора иммунодоминантные гены ВНО.

• Определить оптимальный способ иммунизации ДНК-вакцины в зависимости от использованного промотора для эукариотической экспрессии на развитие протективного иммунного ответа.

• Определить влияние изменения кодонового состава выбранного гена ВНО, оптимизированного для экспрессии в клетках млекопитающих, на протективную эффективность соответствующей ДНК-вакцины.

• Оценить иммуногенность и протективную эффективность поливалентной ДНК-вакцины.

Научная новизна и практическая значимость работы

Обоснована необходимость использования генов вируса натуральной оспы для создания ДНК-вакцины против натуральной оспы.

Впервые показано, что ДНК-вакцина на основе генов вируса натуральной оспы обеспечивает защиту против других ортопоксвирусов.

Впервые обнаружено, что ДНК-вакцина на основе гена F8L ВНО с промотором из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса наиболее эффективна при внутрибрюшинном способе иммунизации, а ДНК-вакцина с промотором цитомегаловируса наиболее эффективна при внутрикожном способе иммунизации мышей.

Показано отсутствие влияния измененного кодонового состава гена A30L ВНО, оптимизированного для экспрессии в клетках млекопитающих, на протективную эффективность ДНК-вакцины на его основе.

Показана высокая иммуногенность и протективная эффективность созданной экспериментальной поливалентной ДНК-вакцины на основе комбинации плазмид, экспрессирующих гены A30L, F8L, MIR, A36R и B7R ВНО. Основные положения, выносимые на защиту

1. Поливалентная ДНК-вакцина на основе генов A30L, F8L, MIR, A36R и B7R ВНО обеспечивает полную защиту мышей от инфицирования летальной дозой ортопоксвируса.

2. ДНК-вакцина на основе гена F8L ВНО с промотором из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса наиболее эффективна при внутрибрюшинном способе иммунизации, а ДНК-вакцина с промотором цитомегаловируса и тем же геном наиболее эффективна при внутрикожном способе иммунизации мышей.

3. Изменение кодонового состава гена A30L ВНО, оптимизированного для экспрессии в клетках млекопитающих, не оказывает существенного влияния на протективную эффективность ДНК-вакцины на основе такого гена по сравнению с ДНК-вакциной с природным вариантом этого гена ВНО.

Апробация работы и публикации

По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в реферируемых научных журналах. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: Всероссийская конференция "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск, Россия, 2005), II Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням (Москва, Россия, 2010), XVIII International Poxvirus, Asfivirus, and Iridovirus Symposium (Sedona, USA, 2010)

Вклад автора

Поиск генов и последующий компьютерный анализ потенциальных антигенных детерминант выбранных белков для ВНО, ВОВ, ВОК и BOO, синтез искусственного гена для определения влияния измененного кодонового состава на эффективность ДНК-вакцины, конструирование поливалентной ДНК-вакцины на основе пяти генов ВНО в составе двух векторных плазмид выполнено лично автором. Исследование иммуногенных свойств и протективной эффективности ДНК-вакцины на модельных животных выполнено лично автором при участии Бабкиной И.Н., Гавриловой Е.В., Кочневой Г.В., Нестерова А.Е. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы (206 ссылок). Работа изложена на 109 страницах, содержит 5 таблиц и 25 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Выбор генов ВНО для конструирования ДНК-вакцины

Вирусы рода Orthopoxvirus близкородственны и вакцинация животных или человека представителем одного из видов этого рода приводит к защите от инфекции вирусами других видов. При планировании работы по созданию ДНК-вакцины необходимо было определить спектр генов ортопоксвирусов, кодирующих протективно-значимые белки. Такие исследования ранее были выполнены для белков ВОВ. При отборе мы полагались на то, насколько сильными антигенными свойствами обладает тот или иной вирусный белок, опирались на данные о динамике иммунного ответа организма при вакцинации этим белком, наличии высоких титров антител, специфичных данному белку, в сыворотках людей, вакцинированных классической противооспенной вакциной. По данным литературы наиболее подходящими, на наш взгляд, являются белки ВОВ, кодируемые генами A4L, A27L, A33R, B5R, D8L, H5R, L1R и L4R. В случае ВНО данные гены имеют обозначения A4L, A30L, A36R, B7R, F8L, I5R, MIR и M4R, соответственно. Целесообразно было сравнить организацию выявленных иммунодоминантных белков ортопоксвирусов, поскольку, только люди,

переболевшие натуральной оспой, приобретали практически пожизненный иммунитет против данного заболевания. В то время как вакцинацию ВОВ для поддержания иммунного статуса необходимо проводить повторно через определенные промежутки времени.

Для ответа на этот вопрос, мы сравнили антигенные портреты белков ВНО A4L, A3 OL, A36R, B7R, F8L, I5R, MIR и M4R и их ортологов ВОВ, ВОК, BOO и вируса экгромелии (ВЭ). Потенциальные антигенные детерминанты (эпитопы) исследуемых белков рассчитывали с помощью программы ADEPT (версия 2.1.). Последующий анализ показал, что некоторые белки ВНО слабо отличаются по потенциальным антигенным детерминантам от их ортологов BOB: M4R не отличается, A3 OL и MIR отличаются по одной, a F8L по двум антигенным детерминантам. Продукты генов ВНО A36R (рис. 1), B7R (рис. 2), A4L и I5R имеют значительные отличия по потенциальным антигенным детерминантам по сравнению с их ортологами ВОВ (табл. 1).

10 .20 .30 .40 .50 .60 .70 .30 .90 . 100

varv_ind mmtpknüeeqtsvfsatvygdkiqgknkrkrvigicirismvisllsm1tmsaflivrlnücksakeaaitda tavaaa-lsthrkva-ssttqykhqe

varv_gar ....................................................................................................

varv_bsh ....................................................................................................

vacv_cop ..................................l......................................av......s..............d.k.

vacv~wr ..................................l.......................... ...........av......5..............d.k.

vaotank ...................r..............l......................................av......s..............d.k.

r.pxv rry ..................................l......................................av.....ss..n....a......d.k.

CPXv'üRI ...................................L......................................AV......S..............D.K.

m?xv_zai ..................................l.......................0.............sav......s..............d.k.

mpxv^üsa ..................................l.............................t.......sav......s..............d.k.

ectv_mos ...............................a. . l................................v. . . .save. . -t.5..............drk.

. 110 . 120 . 130 . 140 . 150 . 160 . 170 , 180

varv ind scnglyycgscyifhsqyqlfsdakancatesstlpn'ksdvlttwlidyvedtwgsdgnpitktttoyodsovsqevrkyfcvktmtj

vaev~gar .......................................................................................

varv_3sh

vacvjtop .............l..............ta............i......................s.....................

vacv~wr .............l..............ta............i......................£.....................

vacv~ank .............l..............ta....................к..............s.....................

с pxv~brt ..................ks........га.................e.................s.....................

cpxv~gri ............................ta...................................s.....................

mpxv""za1 .............l____ks.e.......а...................................s................t----

mpxv usa .............l....ks.e.......а...................................s................t----

ectv~mos .............l. . . .ks.e......tv.. li....... а.. .ak.................se.......p.........1. .

Рис. !. Сравнение аминокислотной последовательности белка A36R ВНО с соответствующими ортологами ВОВ, ВОК, BOO и ВЭ. Идентичные аминокислоты в сравниваемых последовательностях вирусных геномов по отношению к последовательности ВНО штамм India-1967 обозначены точками, делеции - прочерком. Цифры над аминокислотной последовательностью обозначают положение аминокислот в анализируемом сегменте. Потенциальные антигенные детерминанты выделены серым цветом. Штаммы VARV_IND, VARV_GAR, VARV BSH, VACV_COP, VACV_WR, VACV_ANK, CPXV_BRT, CPXV GRI, MPXV ZAI, MPXVJJSA, ECTV MOS имеют следующие номера доступа в Pubmed: Х69198, Y16780, L22579, М35027, AY243312, U94848, AF482758, Х94355, AF380138, DQ0H157, AF012825, соответственно.

10 .20 .30 .40 . 5С .60 . 7С .80 .90 . 100

VARV IND MKTISV^ÚLCVLPAWYSTCTVPTMNNAKLTSTKTSFNDK^

VARV_GAR ....................................................................................................

VARV_BSH ....................................................................................................

VACV_COP .......................................NN........U..H.S..........................i............STM..S

VACV_WR .................................................Q..H.S..........................I............STM..S

VACV ANK .......................................NN........Q..H.S..........................I............STM. .S

CPXV~SRT ..................................................................T...................D.......ST...T

C?XV~GRI .................................................Q..R.................................D.......STM..S

MPXV_ZAI .......................................Yi.w........H.................................D.......STM..S

MPXV~USA ....................................................H.................................D.......STM..S

ECTV_MOS .........................................H.......Q..H.................................D.......STM. .R

. 110 . 120 . 130 . 110 . 150 . 160 . 170 . 130 190 . 200

VARV_IND CKDETKYFRC£KKNGNTSWNDTVTCPNA£CQSLQLDHGSCQPVKSKYSFGEHITINCDVGYEV1GASYITCTANSWN'VIPSCQQKCDIPSLSNGLISGST

VARVGAR .............................................i......................................................

VARV_BSH ............................................G.......................................................

VACV~COP .NG............................P...E.............. .YM................S..............................

VACV_WR .NG............................P...E...............VM................S.................M............

VACV~ANK .NG............................P...E............ ...Y.................S..............................

CPXV~BRT ...............................P.R.E......................L..........S..............................

CPXV GRI .NG............................P...E...............YM................S..............................

MPXV~ZAI -NG............................Р...Б.............. -YM............V. . .S..............................

MPXVJJSA .NG............................P...5...............VM............V...S..............................

ECTV~MOS .NS............................P.R.E...............УМ................S..............................

. 210 . 220 . 230 . 240 . 250 . 260 . 270 . 2Б0 . 290 . 300

VARV IND FSIGGVIHLSCKSGFILTGSFSSTCIDGXWNPVLPICIRSNEEFDPVEDGPDDETDLSKLSKDWQYEQEIESI.EATYHI IIVALTIMGVIFLISVIVLV

VARV GAR ....................................................................................................

VARV~BSH ....................................................................................................

VACV_COP .....................................V.T.......Э....................................................

VACVJÍR ...............T.....................V.T.......У....................................................

VACV_ANK ................................I..T.V----К----D....................................................

CPXV BRT ...............R----S..............T.V.TK......0.......................................I............

CPXV_GRI ...............T................I..T.V.......L.D...........I...................................i----

MPXV~ZAI ...............T................I..T.V.........D..................................M............I----

MPXV_USA ...............T................I..T.V.........D..................................M............I....

ECTV~MOS ...............T................I..T.V........ID. D.........1...................................I....

. 310

VARV_IND CS CNKNNDQY К FHKLL L

VARV_GAR .................

VARV_BSH .................

VACV_COP ...Э............P

VACV WR . . ,D............P

VACV[_ANK ...D............P

CPXV_3RT ................P

cpxv_gr: ...d............p

MPXV~ZAI ...D............?

MPXV~USA ...D............?

ECTV_MOS ...D.T..........P

Рис. 2. Сравнение аминокислотной последовательности белка B7R ВНО с соответствующими ортологами ВОВ, ВОК, BOO и ВЭ. Идентичные аминокислоты в сравниваемых последовательностях вирусных геномов по отношению к последовательности ВНО штамм India-1967 обозначены точками. Цифры над аминокислотной последовательностью обозначают положение аминокислот в анализируемом сегменте. Потенциальные антигенные детерминанты выделены серым цветом. Штаммы VARVJND, VARV_GAR, VARV_BSH, VACV_COP, VACV_WR, VAC AN К, CPXV_BRT, CPXV_GRI, MPXV_ZAI, MPXV_USA, ECTV_MOS имеют следующие номера доступа в Pubmed: Х69198, Y16780, L22579, М35027, AY243312, U94848, АР482758, Х94355, AF380138, DQ011157, AF012825, соответственно.

Выявленные различия по антигенным детерминантам дают основания предполагать, что ДНК-вакцина на основе генов ВНО будет более эффективной, чем на основе генов ВОВ в индукции протекгивного иммунитета против натуральной оспы. В качестве практического подтверждения этого предположения могут быть результаты исследования, в котором было показано, что из 26 моноклональных

антител к белку B5R вируса осповакцины, только 16 реагируют с белком-ортологом

В711 вируса натуральной оспы. При этом из 10 оставшихся моноклональных антител, минимум 3 обладают вируснейтрализующей активностью.

Таблица 1

Результаты компьютерного анализа белков ВНО, ВОВ, ВОК, BOO и ВЭ

Белок ВНО штамма India-1967 Длина, а.к. / кол-во эпитопов Гомология, % / кол-во совпадающих эпитопов *

ВНО ** ВОВ ** ВОК ** BOO ** ВЭ ***

A30L 110/5 99.1-100.0/5 96.4-97.3/4 97.3-98.2/4 92.7-93.6/3-4 95.6/3

A36R 184/6 100.0/6 93.6-94.1/3 92.0-95.2 / 3-4 89.8 / 3 85.3 /1

A4L 271/9 99.0-100.0/7-9 88.5-93.2/6 84.5-90.2 / 6-7 87.1-88.2/4 87.5/6

B7R 317/7 99.7-100.0/6-7 92.7-93.1 /3-4 92.4-94.0/4-5 92.7/4 91.1/3

F8L 304/8 100.0 / 8 95.7-96.1 /6-7 93.4-95.1/6-7 92.8 / 6 93.8/6

MIR 250 /8 99.6-100.0 / 7-8 99.2-99.6 /7 99.2/7-8 99.2/8 98.4/7

M4R 251/8 99.2-100.0/8 98.8-99.6 / 8 99.2 / 8 98.4/8 98.4 / 7

I5R 221/8 96.8-100.0/7-8 88.3-88.7/4 87.4-93.7/5-6 90.5-92.8/5 91.4/4

Примечание.

* % гомологии и количество совпадающих эпитопов рассчитаны по отношению к белкам ВНО штамм ЬкИа-1967; ** Данные по нескольким штаммам; *** Данные по одному штамму.

Высокий процент гомологии и большое количество совпадающих эпитопов для белков ВОК и BOO по отношению к белкам ВНО (табл. 1), позволяет предполагать, что ДНК-вакцина на основе генов ВНО сможет также обеспечить перекрестную защиту против оспы коров и оспы обезьян. Количества совпадающих эпитопов для белков ВОК и BOO по отношению к белкам ВНО и ВОВ примерно одинаковы. Это говорит о том, что вакцины на основе генов как ВНО, так и ВОВ будут сравнимо эффективны в индукции защиты против оспы коров и оспы обезьян. Исходя из всего вышесказанного, мы решили исследовать иммуногенность ДНК-вакцин, кодирующих восемь различных белков ВНО: три белка сердцевины вириона (A4L, M4R и I5R), три белка поверхностной мембраны внутриклеточных вирионов (A30L, F8L и MIR) и два белка оболочки внеклеточной формы вируса (A36R и B7R).

Несмотря на то, что ортопоксвирусы отличаются по числу и расположению потенциальных антигенных детерминант, при иммунизации животных представителем одного из видов, формируется перекрестный иммунный ответ, обеспечивающий защиту от других видов ортопоксвирусов. И хотя защита является

субоптимальной, это позволяет проводить доклинические исследования создаваемых вакцин против натуральной оспы на мелких лабораторных животных и патогенных для них ортопоксвирусах. Для мышей самым высокопатогенным ортопоксвирусом является вирус эктромелии, который и был выбран нами для оценки протективной эффективности ДНК-вакцины.

Для конструирования ДНК-вакцин провели расчет олигонуклеотидных праймеров с использованием компьютерной программы О^о 6.31 на основе нуклеотидной последовательности ВНО штамм 1п(На-1967. На основе выполненного анализа в праймеры для последующего клонирования ввели сайты рестрикции Л^КШ и БаП. Для эффективной экспрессии в клетках млекопитающих непосредственно перед АТО-кодоном ввели последовательность Козака. Последовательности праймеров и соответствующие им расчетные длины амплификационных продуктов представлены в таблице 2.

Таблица 2

Праймеры для амплификации генов ВНО с помощью ПЦР

Ген ВНО Последовательности праймеров Длина ПЦР-продукта (п.н.) Назвапие ДНК-вакцины

A4L S'-CCCGGCTAGCCGCCjCCATGGACTTCTTTAACAAGTTCTC-З' 5'-CCCGTCGACTTACTTTTGGAATCGTTCAAA-3' 842 pBKRSV-A4L

A30L 5'-CCCGGCTAGCC(7CC/)CCATGGACGGAACTCTTTTCCCTG-3' 5'-CCCGTCGACGTTACTCATATGGGCGCCGAC-3' 360 pBKRSV-A30L

A36R 54XCGGCTAGCCGCC4CCATGATGACACCAGAAAACGAC-3' 5'-CCCGTCGACTTAGTTCATTGTTTTAACACAAAAAT-3' 581 pBKRSV-A36R

B7R 5'-CCCGGCTAGCCgCCMCCATGAAAACGATTrCCGTrGTTA-3' S'-CCCGTCGACACGGATTTATATTCACAGCAACA-3' 992 pBKRSV-B7R

F8L 5'-CCCGGCTAGCCGCC^CCATGTCACAACAACTATCTCCTA-3' 5'-CCCGTCGACAATCTAGTnTGTTTTTCTCG-3' 944 pBKRSV-F8L

I5R 5'-CCCGGCTAGCCGCC/ICCATGGCGTGGTCAATTACGAATAA-3' 54XCGTCGACTTACTTCTTACAAGTTTTAACTTTTTTACGA-3' 692 pBKRSV-I5R

MIR 5'-CCCCGCTAGCCGCC4CCATGGGTGCCGCGGCAAG-3' 5'-CCCCGTCGACTTCAGTTTTGTATATCCGTGGTAGCAAT-3' 781 pBKRSV-MIR

M4R 5-CCCGGCTAGCCGCC4CCATGAGTCTACTGCTAGAAAACCT-3' 5-CCCGTCGACTCAATCCTTTGTCGGAATAT-3' 782 pBKRSV-M4R

Примечание.

Сайты рестрикции /isuNHI и Sali выделены жирным шрифтом, инициирующий и стоп кодоны подчеркнуты, курсивом выделена последовательность Козака.

Гены ВНО A4L, A30L, A36R, B7R, F8L, I5R, MIR и M4R амплифицировали методом ПЦР, используя созданную ранее коллекцию гибридных плазмид, содержащих фрагменты ДНК ВНО в качестве матрицы (рис. 3) и клонировали в векторную плазмиду pBKRSV ("Stratagene", США) по сайтам рестрикции ^äuNHI и Sali.

Рис. 3. Результат электрофоретического разделения в 2.5 % геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после ПЦР при использовании олигонуклеотидных праймеров подобранных для амплификации генов ВНО.

1. A30L; 2. A36R; 3.15R; 4. MIR; 5. M4R; 6. A4L; 7. F8L; 8. B7R; М. ДНК-маркер, длина в п.н. показана справа.

Наличие вставок подтверждали рестрикционным анализом эндонуклеазами рестрикции ^juNHI и Saä (рис. 4). Для подтверждения правильности вставок секвенировали несколько клонов каждой полученной конструкции.

Для дальнейшей работы выбрали по одному клону каждой рекомбинантной плазмиды с подтвержденными кодирующими последовательностями вирусных генов. Восемь рекомбинантных плазмид были наработаны в препаративных количествах и очищены от эндотоксинов центрифугированием в двухступенчатом градиенте CsCl. Эукариотическая экспрессия генов в плазмиде pBKRSV осуществляется под контролем промотора вируса саркомы Рауса, который наравне с цитомегаловирусным промотором наиболее часто используется при создании ДНК-вакцин.

Рис.4. Результат электрофоретического разделения в 1.5% геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после гидролиза рекомбинантных плазмид эндонуклеазами рестрикции ^smNHI и Sail.

1. pBKRSV-A30L; 2. pBKRSV-A36R; 3. pBKRSV-I5R; 4. pBKRSV-M IR; 5. pBKRSV-M4R; 6. pBKRSV-A4L; 7. pBKRSV-F8L; 8. pBKRSV-B7R; M. ДНК-маркер, длина в п.н. показана справа.

Для изучения иммуногенных свойств полученных конструкций группы животных были дважды независимо иммунизированы каждым из 8-ми препаратов ДНК-вакцин. Также одна группа была иммунизирована смесью 8-ми плазмид с пропорциональным уменьшением концентрации каждой плазмиды. Повторная иммунизация была проведена через три недели после первой.

Были выявлены относительно низкие показатели иммуногенности, требующие оптимизации ДНК-вакцины. Лучшие результаты были получены для ДНК-вакцины, содержащей ген вируса натуральной оспы F8L, которая при двукратном внутрибрюшинном введении мышам индуцировала специфический клеточный и гуморальный иммунный ответ против ВОВ. Отсутствие высокого титра антител, нейтрализующих ВОВ, при иммунизации животных смесью восьми плазмид, по-видимому, обусловлено меньшим количеством каждой плазмиды при инъекции в смеси. Последнее говорит о необходимости уменьшения количества генов в составе

мультиплазмидной ДНК-вакцины с целью увеличения представительства нескольких наиболее протективных иммуногенов.

Определение оптимального способа иммунизации ДНК-вакцины в зависимости от использованного промотора для эукариотической экспрессии на развитие протективного иммунного ответа

Известно, что на эффективность ДНК-вакцины в значительной степени влияют

используемый эукариотический промотор для экспрессии антигена и способ

иммунизации. Поэтому для усиления эффективности создаваемой нами ДНК-вакцины

необходимо было определить оптимальный способ иммунизации в зависимости от

использованного промотора для эукариотической экспрессии на примере гена Р8Ь

ВНО в плане развития протективного иммунного ответа на модели мышей и

высоко патогенного для них вируса эктромелии (оспы мышей).

Ген Р8Ь ВНО переклонировали из полученной ранее рекомбинантной

плазмиды рВКЛЗУ-Р8Ь в плазмиду рсЭХА (рсОКАЗ. 1 /Мус-Н15(-)/1асг, "Ьгайч^еп",

США) по сайтам гидролиза рестриктаз и НгЫШ. Эукариотическая экспрессия

гена в плазмидах рВКЛБУ и рсБКА осуществляется под контролем промотора из

длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса и цитомегаловирусного

промотора, соответственно. Рекомбинантные плазмиды рВКЛЗУ-Р8Ь и рсБИА-Р8Ь

нарабатывали в препаративных количествах и очищали от бактериального

эндотоксина центрифугированием в двухступенчатом градиенте СвСЛ.

Для изучения оптимального способа иммунизации и используемого

промотора, группы по 14 мышей в каждой иммунизировали следующими

препаратами ДНК-вакцин в дозе 100 мкг на мышь: рВКИБУ-РвЬ или рсОЫА-Р8Ь

внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрикожно или подкожно. В качестве

отрицательного и положительного контролей мышей в двух группах

внутрибрюшинно иммунизировали физиологическим раствором или вирусом

осповакцины в дозе 10б бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мышь, соответственно.

Вакцины вводили трехкратно.с трехнедельными интервалами, и через три недели

после последней иммунизации все мыши в группах были внутрибрюшинно

инфицированы вирусом эктромелии штамм К1 в дозе 10 1ЛЭ50.

Наличие ВОВ-специфичных антител в сыворотках крови мышей на 56-е сутки

эксперимента определяли методом ИФА с сорбированным вирусом осповакцины

штамм Л-ИВП (рис. 5). Исходя из полученных данных, все мыши, иммунизированные плазмидами рВКЛ8У-Р8Ь или рсОНА-Р8Ь, продуцировали ВОВ-специфичные антитела. При этом максимальные титры сывороток были получены для внутрибрюшинного способа иммунизации ДНК-вакциной рВКЛ5У-Р8Ь (1/2400 ± 1/428) и внутрикожного способа иммунизации ДНК-вакциной рсОЫА-Р8Ь (1/3000 ± 1/370). Немного меньшие титры были получены при внутрибрюшинном способе иммунизации ДНК-вакциной рсВКА-Б8Ь (1/1550 ± 1/141) и при внугрикожном способе иммунизации ДНК-вакциной рВКЯЗУ-Р8Ь (1/1600 ± 1/370). Минимальные титры наблюдали для обеих ДНК-вакцин, вводимых внутримышечно (рВККБУ-Р8Ь (1/775 ± 1/271) и рсОКА-Р8Ь (1/1100 ± 1/283)) или подкожно (рВКЯ8У-Р8Ь (1/1400 ± 1/214) и рсОМА-Р8Ь (1/800 ± 1/214)).

Рис. 5. Уровень ВОВ-специфичных антител при иммунизации мышей линии ВАЬВ/с внутрибрюшинно (в/б), внутримышечно (в/м), внутрикожно (в/к) или подкожно (п/к) препаратами ДНК-вакцин рсОЫА-Р8Ь или рВКЛ5У-Р8Ь. Представлены средние значения обратных титров сывоторок ± стандартное отклонение (п = 8).

Все мыши, вакцинированные pBKRSV-F8L или pcDNA-F8L, на 56-е сутки эксперимента продуцировали ВОВ-нейтрализующие антитела, что подтверждали методом нейтрализации вируса осповакцины на культуре клеток Vero (рис. 6). Для группы мышей положительного контроля, иммунизированных вирусом осповакцины,

была получена 87.0 ±4.6% нейтрализация для разведения сыворотки 1:100, а для группы отрицательного контроля - 4.0 ±2.6% нейтрализация. При таких же разведениях сывороток более чем 50 % нейтрализация наблюдалась только для внутрибрюшинного способа иммунизации ДНК-вакциной рВКЯ8У-Р8Ь (50.7 ± 4.9 %) и внутрикожного способа иммунизации ДНК-вакциной рсО^-Р8Ь (57.0 ±3.6%). Промежуточные значения нейтрализации обеспечивали ДНК-вакцина рБКЕ^У-РвЬ при внутрикожном (34.7 ± 2.5 %) и подкожном (32.7 ± 3.1 %) способах иммунизации и ДНК-вакцина рсБЫА-Р8Ь при внутрибрюшинном (24.7 ± 2.9 %) и подкожном (22.3 ±4.5%) способах иммунизации. Наименьшую нейтрализацию ВОВ обеспечивали сыворотки, полученные при иммунизации мышей плазмидами рВКК8У-Р8Ь и рсОЫА-Р8Ь при введении их животным внутримышечно: 20.7 ± 1.5 % и 21.3 ± 2.5 %, соответственно.

Рис. 6. Уровень вируснейтрализующих антител при иммунизации мышей линии BALB/c внутрибрюшинно (в/б), внутримышечно (в/м), внутрикожно (в/к) или подкожно (п/к) препаратами ДНК-вакцин pcDNA-F8L или pBKRSV-F8L, выявляемый методом нейтрализации ВОВ на культуре клеток Vero. Представлены средние значения процентов нейтрализации для разведения сывороток 1:100 ± стандартное отклонение (п = 3).

При изучении протективности инфицированием иммунизированных мышей высоковирулентным вирусом экгромеяии штамм К1 в дозе 10 LD50, лучшие результаты были получены для внутрикожного способа иммунизации ДНК-вакциной

рсОИА-Р8Ь (40 % выживших) (рис. 7А) и внутрибрюшинного способа иммунизации ДНК-вакциной рВКИ8\ЧР8Ь (45 % выживших) (рис. 7Б).

А.

в—в—в—о—в—»—в—•

4—pcDNA-F8L.ii/6 ■—рсША-Р81». в/м А—рсВКА-ГЗЬ. в/к рсОНА-Г5Ц п/к -(—■Физраствор •—ВОВ

4 5 6 7 8 9 10 11 12 1В 14 день после инфицирования

—♦—рВККВУ-РЕС., в/0 -Н-рВКЮТЧ^, в/м -А-рБКИЗУ^. в/к -ЭЧ—рБКИБУ-РБЦ п/к —4— Физраствор -♦-ВОВ

1 234.56789 10 11 12 13 14 день после инфицирования

Рис. 7. Выживаемость групп мышей линии ВАЬВ/с трехкратно иммунизированных Енутрибрюшшшо (в/6), внутримышечно (в/м), внутрикожно (в/к) или подкожно (п/к) ДНК-вакцинами рсОЫА-Р8Ь (А) или рБКЛЯУ-РЗЬ (Б) и внутрибрюшинно инфицированных 10 ЬО50 вируса эктромелии штамм К1.

Комбинации рсВЫА-Р817внутрибрюшинно, рсВНА-Р81Уподкожно, рВККБУ-Р817внутрикожно, рВЮ15У-Р817подкожно обеспечивали существенно меньшие

уровни защиты -9, 18, 18 и 9%, соответственно. В группах, иммунизированных внутримышечно ДНК-вакцинами рВКЯ8У-Р8Ь или рсОЫА-Р8Ь, выживших животных не было.

Таким образом, в настоящем эксперименте мы протестировали на мышах линии ВАЬВ/с два препарата ДНК-вакцин: рВК£5У-Р8Ь или рсВИА-Р8Ь, вводимых внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрикожно или подкожно с последующим инфицированием летальной дозой вируса эктромелии. ДНК иммунизация во всех исследуемых группах приводила к наработке ВОВ-специфичных и ВОВ-нейтрализующих антител. Закономерно, что для всех групп мышей, иммунизированных ДНК-вакцинами рВКЛ8У-Р8Ь или рсОИА-Р8Ь, титры ВОВ-специфичных антител коррелируют с титрами ВОВ-нейтрализующих антител.

Нами впервые обнаружено, что ДНК-вакцина с промотором из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса (рБКЕ-БУ) наиболее эффективна при внутрибрюшинном способе иммунизации, а ДНК-вакцина с промотором цитомегаловируса (рсБЫА) и тем же геном иммунодоминантного белка ВНО наиболее эффективна при внутрикожном способе иммунизации.

Исследование влияния изменения кодонового состава гена, оптимизированного для экспрессии в клетках млекопитающих, на протективную эффективность ДНК-вакцины

На повышение эффективности ДНК-вакцины может оказывать влияние оптимизация кодонового состава генов протективных вирусных антигенов, приводящая к увеличению синтеза вирусного белка в клетках млекопитающих. Учитывая то, что весь цикл развития ортопоксвируса проходит в цитоплазматических образованиях, называемых виросомами или вирусными фабриками, и то, что вирус использует свои собственные ферментативные системы синтеза РНК и ДНК, а вирусная ДНК имеет более низкий вС состав по сравнению с геномом клеток млекопитающих, важно было проверить, можно ли значительно увеличить эффективность разрабатываемой вакцины против натуральной оспы в результате оптимизации кодонового состава ортопоксвирусного гена для его экспрессии в ядре клеток млекопитающих.

Поэтому следующей задачей являлось сравнение эффективности ДНК-вакцин на основе природного гена АЗОЬ ВНО и искусственного гена А30Ьор1 с измененным

кодоновым составом, оптимизированным для экспрессии в клетках млекопитающих (рис. 8).

MDGTLFPGDDDLAIE>ATEFF A3 OL ATGGACGGRRCTCiTTTCCCTGGAGRTGATGÄ'TCTTGCÄÄTTCCASCAACrGiVATTTTTC 60 A30L«*....... .С..С. .G.....C..C..C..C..C..G..C..C..C..C..C..G..C...

STKAAKKPEAKREAIVKADG A3 OL TCTACAAAGGCTGCTAAAAAGCCAGAGGCTAAACGCGAAGCAATTGTTAAAGCCGATGGA 120 Ä30L„. AGC..С.....C..C..G.....С.....C..G..G..G..C..C..G..G.....С. .С

DNNEETLKQRLTNLEKKITN A3 OL GACAATAATGAGGAAACTCTCÄAACAACGCBCTAaCTAATTTGGAiÄAAAAAATTACTAAT ISO A30L-«.....С..С.....G..C..G..G..G.....G..C..CC____G..G..G..C..C..C

VTTKFEQIEKCCKRNDDVLF Ä30L GTAACÄACAAAGTTTGAACAAATAGAÄAAGTGTTGTAAÄCGCAATGATGACGTTCTATiT 240 A30L„t ..G..C..C.....C..G..G..C..G.....C..C..G..G..C..C.....G..G..C

ELENHAETLRAAMI SLAKKI A30L AGGTTGGAAAATCACGCTGAAACTCTAAGAGCGGCTATGATATCTCTGGCTAAAAAGATT 300 АЗОЬ-pt. С. .C____G. .С.....C. .G. .C. .GC.G. .С. .C.....CAGC.....C. -G.....С

DVQTGRF. PYE * A3OL GATGTTCAGÄCTGGTCGGCGGCCÄTATGÄGTAA 333 A30L*5t ..C..G.....C..C.....G..C..C____G.

Рис.8. Сравнение нуклеотидной последовательности гена A30L ВНО с последовательностью гена АЗОЦр, оптимизированной по частоте встречаемости кодонов для эффективной экспрессии в клетках млекопитающих. Идентичные нуклеотиды в сравниваемой последовательности гена A30Lopi по отношению к последовательности гена A30L ВНО обозначены точками. Цифры справа от нуклеотидной последовательности обозначают позицию нуклеотидов в гене A30L ВНО. Аминокислотная последовательность белка A30L приведена над нуклеотидной последовательностью гена A30L ВНО,

Имеются различные стратегии синтеза искусственной полинуклеотидной последовательности, основанные на лигировании и/или амплификации длинных олигонуклеотидов. Нами была выбрана стратегия блочного синтеза полинуклеотидной последовательности методом ПЦР. Используя оптимизированную последовательность, рассчитали олигонуклеотидные праймеры длиной 45-49 нуклеотидов с учетом того, что 20 нуклеотидов являются взаимно комплементарными по концевым участкам. Схематическое изображение синтеза искусственного гена A30L ВНО, оптимизированного по частоте встречаемости кодонов для эффективной экспрессии в клетках млекопитающих, представлено на рисунке 9.

A3GL

И

V

1-2

2 4 6 8 10 12

3 5 7 9 11

I4 1б I8 110 112

3-4 5-6 7-8 9-10 11-12

1-2 5-6 9-10

===== 3-4 ::::-:':: •7-8 :", '"..........:, iz. 11-12

i I i

1-2-3-4 5-6-7-8 9-10-11-12

1-2-3-4 9-10-11-12

■"„;„::.:,,.............. 5-6-7-S ............................................=

i

12

A30Lopt

Рис. 9. Схематическое изображение синтеза искусственного гена A30L ВНО, оптимизированного по частоте встречаемости кодонов для эффективной экспрессии в клетках млекопитающих. Над стрелками приведены номера соответствующих олигонуклеотидов.

В первом раунде провели независимые шесть ПЦР для каждой пары праймеров Sense-Antisense: 1-2, 3-4, 5-6, 7-8, 9-10, 11-12 (5 циклов). Во втором раунде провели три ПЦР для соответствующих пар ПЦР-продуктов первого раунда: 12-34, 56-78, 910-1112 (10 циклов). В третьем раунде провели ПЦР для трех ПЦР-продуктов второго раунда: 1234-5678-9101112 с добавлением крайних олигонуклеотидов (25 циклов) (рис. 9). Полученный ПЦР-продукг очищали от неспецифических ПЦР-продуктов, длина которых не соответствовала расчетной, с помощью Gel Extraction Kit ("QIAGEN", Германия) согласно инструкции производителя.

Синтетический ген A30Lopt клонировали в плазмиду pcDNA и после отбора гибридных плазмид осуществляли секвенирование клонированного гена и регуляторных 5'- и 3'-концевых последовательностей. Исправление нуклеотидных замен проводили методом ПЦР с использованием внутренних праймеров, соответствующих выявленным заменам, и внешних праймеров 1/12 с дальнейшим повторением вышеописанных этапов до получения клона без нуклеотидных замен.

Природный ген A30L ВНО переклонировали из полученной ранее рекомбинантной плазмиды pBKRSV-A30L в плазмиду peDNA с последующим подтверждением правильности вставки рестрикционным анализом и секвенированием. Плазмидные ДНК pcDNA, pcDNA-A30L и pcDNA-A30Lopt нарабатывали в клетках E.coli в препаративном количестве и очищали с помощью EndoFree Plasmid Giga Kit ("QIAGEN", Германия) согласно инструкции производителя.

Для изучения влияния оптимального кодонового состава гена на эффективность ДНК-вакцины, четыре группы по 16 мышей в каждой иммунизировали внутрикожно дозой 100 мкг на мышь ДНК-вакцинами pcDNA-A30L и pcDNA-A30Lopt, контрольной плазмидой pcDNA и внутрибрюшинно вирусом осповакцины в дозе 10б БОЕ на мышь в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно. Вакцины вводили трехкратно с трехнедельными интервалами, и через три недели после последней иммунизации все мыши в группах были внутрибрюшинно инфицированы вирусом эктромелии штамм К1 в дозе 10 LDS0. Эксперименты на животных проводили в трех повторах.

Все мыши, вакцинированные pcDNA-A30L или pcDNA-A30Lopt, продуцировали ВОВ-специфичные антитела на 56-е сутки эксперимента, что подтверждали методом ИФА с сорбированным вирусом осповакцины штамм JI-ИВП. Максимальные титры сывороток составили 1/3200 для ДНК-вакцины pcDNA-A30L и 1/6400 для ДНК-вакцины pcDNA-A30Lopt.

Вакцинация мышей ДНК-вакцинами pcDNA-A30L или pcDNA-A30Lop„ вызывала наработку ВОВ-нейтрализующих антител, что подтверждали методом нейтрализации вируса осповакцины на культуре клеток Vero на 56-е сутки эксперимента. Результаты исследований представлены на рисунке 10. Для группы мышей, иммунизированных ДНК-вакциной pcDNA-A30L, выявили 62.0 ± 4.0 % нейтрализации инфекционности ВОВ для разведения сыворотки 1:100, для группы pcDNA-A30Lop, - 67.0 ± 4.0 % (для группы положительного контроля - 85.0 ± 4.5 %, для группы отрицательного контроля - 3.5 ± 0.5 %).

ВОВ pcDNA-A30L poDNA-A30b* pcDNA

Рис. 10. Уровень вируснейтрадизующих антител при иммунизации мышей линии BALB/c внутрикожно препаратами ДНК-вакцин pcDNA-A30L, pcDNA-A30Lt,¡,i или ВОВ, выявляемый методом нейтрализации ВОВ на культуре клеток Vero. Представлены средние значения процентов нейтрализации для разведения сывороток 1:100 ± стандартное отклонение (п = 3).

При изучении протективности инфицированием вирусом эктромелии штамм К1 в дозе 10 LD50 за мышами проводили наблюдение в течение 14 суток (рис. II). В трех группах отрицательного контроля к окончанию срока наблюдения погибли все мыши (выжило 0 %). В трех группах положительного контроля к окончанию срока наблюдения не погибло ни одной мыши (100%). В трех группах, иммунизированных ДНК-вакциной pcDNA-A30L, к окончанию срока наблюдения выжило 4, 4 и 2 мыши из 10 (33.3 ± 11.5 %). В трех группах иммунизированных ДНК-вакциной pcDNA-A30Lop, к окончанию срока наблюдения выжило 7, 4 и 3 мыши из 10 (46.7 ± 20.8 %). Среднее значение протективности для pcDNA-A30Lopt выше среднего значения протективности для pcDNA-A30L, однако, превышение не является статистически достоверным.

Таким образом, в настоящем эксперименте мы показали, что иммунизация мышей ДНК-вакцинами на основе природного гена A30L ВНО или гена A30Lopt с оптимизированным кодоновым составом, приводит к наработке ВОВ-нейтрализующих антител и обеспечивает частичную защиту от инфицирования летальной дозой вируса оспы мышей. При этом ДНК-вакцина на основе гена A30Lopt с оптимизированным кодоновым составом дает более высокие титры ВОВ-специфичных антител по сравнению с ДНК-вакциной на основе природного гена A30L ВНО. Отсутствие статистически достоверных отличий для ДНК-вакцин на основе природного и оптимизированного гена A30L по протективности и титру ВОВ-

нейтрализующих антител свидетельствуют о нецелесообразности оптимизации кодонового состава остальных генов ВНО, входящих в состав разрабатываемой нами противооспенной поливалентной ДНК-вакцины.

день после инфшшроваяяя

Рис. И. Выживаемость мышей линии BALB/c трехкратно иммунизированных внутрикожно ДНК-вакцинами pcDNA-A30L или pcDNA-A30L„pt и внутрибрюшинно инфицированных вирусом эктромелии штамм К1 в дозе 10 LDso- Приведены средние значения трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение (п = 3).

Оценка иммуногенности и протективной эффективности поливалентной ДНК-вакцины на основе генов A3 OL, MIR, F8L, A36R и B7R ВНО

Надежная защита против ортопоксвирусов подразумевает формирование иммунного ответа против двух инфекционных форм вируса - внутриклеточного вириона и внеклеточной формы вируса одновременно, что может быть достигнуто только при использовании иммуногенов поверхностной мембраны внутриклеточного вириона и оболочки внеклеточной формы вируса в составе одной вакцины. Перспективность использования генов A30L, MIR и F8L поверхностной мембраны и генов A36R и B7R оболочки ВНО в разработке ДНК-вакцин против ортопоксвирусов в последние годы была показана для их генов-ортологов ВОВ.

Из ранее исследованных нами восьми генов ВНО, мы выбрали указанные пять для создания поливалентной ДНК-вакцины. Оценку иммуногенности и протективной эффективности решено было проводить для двух вариантов поливалентной ДНК-

вакцины, на основе вектора pBKRSV при внутрибрюшинном способе иммунизации и на основе вектора pcDNA при внутрикожном способе иммунизации. Указанные комбинации промотора и способа иммунизации были определены нами ранее как наиболее эффективные.

Гены MIR, A36R и B7R ВНО переклонировачи из полученных нами ранее рекомбинантных плазмид pBKRSV-MIR, pBKRSV-A36R и pBKRSV-B7R в плазмиду pcDNA с последующим подтверждением правильности вставки рестрикционным анализом (рис. 12) и секвенированием.

М 1 2 3 'v4 5-6 7

8 9 М

ЙШ§|1

MK&g'iff:

> 10000 - ^ggß - - 6000

'V/,->;л" "..........

ИИИ

>мт*т_ 5000

; 4000

3000 2500

2000 * ' - 1500

.. ....

...

юоо

750 500

Рис. 12. Результат электрофоретического разделения в 1.5 % геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после гидролиза рекомбинантной плазмиды эндонуклеазами рестрикции и

ЯЫШ.

1,2, 3. независимые клоны рекомбинантной плазмиды рсВЫА-АЗбЛ. 4, 5, 6. независимые клоны рекомбинантной плазмиды рсВКА-М1 Я. 7, 8, 9. независимые клоны рекомбинантной плазмиды рсВНА-В7К. М. ДНК-маркер, длина в п.н. показана справа.

Плазмидные ДНК рсОИА, рсБМА-АЗОЬ, рсБКА-Б8Ь, рсБК'А-МШ, рсБКА-АЗб^ рсОКА-В7^ рВКЛБУ, рВКИЗУ-АЗОЦ рВЮ18У-Р8Ь, рВОБУ-Мт, pBKRSV-A36R и pBKRSV-B7R нарабатывали в клетках Е.соИ в препаративном

количестве и очищали с помощью EndoFree Plasmid Giga Kit ("QIAGEN", Германия) согласно инструкции производителя.

Для оценки эффективности поливалентной ДНК-вакцины, группы по 22 мыши в каждой иммунизировали внутрикожно смесью плазмид pcDNA-A30L, pcDNA-F8L, pcDNA-MIR, pcDNA-A36R и pcDNA-B7R в дозе 50мкг каждой (суммарная доза 250 мкг на мышь); внутрибрюшинно смесью плазмид pBKRSV-A30L, pBKRSV-F8L, pBKRSV-MIR, pBKRSV-A36R и pBKRSV-B7R в дозе 50 мкг каждой (суммарная доза 250 мкг на мышь); внутрикожно плазмидой pcDNA в дозе 250 мкг на мышь (отрицательный контроль №1); внутрибрюшинно плазмидой pBKRSV в дозе 250 мкг на мышь (отрицательный контроль Ха2); внутрибрюшинно вирусом осповакцины в дозе 10б БОЕ на мышь (положительный контроль). Вакцины вводили трехкратно с трехнедельными интервалами, и через три недели после последней иммунизации все мыши в группах были внутрибрюшинно инфицированы вирусом эктромелии штамм К1 в дозе 10 LDso- Эксперименты на животных проводили в двух повторах.

Ранее, в двух независимых исследованиях других лабораторий были получены противоречивые данные насчет способности гена L1R ВОВ (ортолог MIR ВНО) обеспечивать протективный иммунитет против вируса осповакцины. Так, в работе (Hooper et al, 2000) была показана 80 % защита при вакцинации одиночным геном L1R ВОВ, в то время как Pulford et al. (2004) показали полную гибель мышей, вакцинированных ДНК-вакциной на основе гена L1R ВОВ, при инфицировании летальной дозой ВОВ. Исходя из этого, представлялось интересным оценить возможность ДНК-вакцины на основе одного гена MIR ВНО обеспечивать хотя бы частичную защиту против вируса эктромелии в условиях нашего эксперимента. В противном случае включение гена MIR в состав поливалентной ДНК-вакцины было бы неоправданным. Поэтому, еще одна группа в 22 мыши была иммунизирована внутрикожно плазмидой pcDNA-MIR в дозе 100 мкг. Условия экспериментов были идентичны вышеописанным.

Наличие ВОВ-нейтрализующих антител в сыворотках крови мышей определяли методом нейтрализации вируса осповакцины на культуре клеток Vero спустя две недели после каждой иммунизации (рис. 13). Было показано, что иммунизация мышей ДНК-вакциной на основе только одного гена MIR ВНО вызывает наработку ВОВ-нейтрализующих антител. После трех иммунизации при

титре сывороток мышей равном 1/100 достигалась 25.0 ± 3.5 % нейтрализация вируса осповакцины. Полученные данные подтверждают результаты независимого исследования (Hooper et al, 2000) в котором было показано, что при титре сывороток мышей, иммунизированных ДНК-вакциной на основе одного гена L1R ВОВ (ортолог MIR ВНО), равном 1/200 достигалась 50 % нейтрализация ВОВ.

■ ВОВ Ш pcDNA-£5

Ш pBKRSV-£5 Ш pcDNA-MIR Ц pcDNA □ pBKRSV

иммунизация

Рис. 13. Динамика уровня вируснейтрализующих антител при иммунизации мышей линии BALB/c внутрикожно поливалентной ДНК-вакциной pcDNA-A30L, pcDNA-F8L, pcDNA-MIR, pcDNA-A36R, pcDNA-B7R (pcDNA-¿5); ДНК-вакциной pcDNA-MIR; внутрибрюшинно поливалентной ДНК-вакциной pBKRSV-A30L, pBKRSV-F8L, pBKRSV-MIR, pBKRSV-A36R, pBKRSV-B7R (pBKRSV-£5) или ВОВ, выявляемого методом нейтрализации ВОВ на культуре клеток Vero. Представлены средние значения процентов нейтрализации для разведения сывороток 1:100 ± стандартное отклонение (п= 3).

Иммунизация обоими вариантами поливалентной ДНК-вакцины также индуцировала наработку антител, нейтрализующих ВОВ (рис. 13). При этом проценты нейтрализации ВОВ антителами, полученными после третьей иммунизации ДНК-вакцинами, были сравнимы с процентами нейтрализации, полученными после иммунизации живым вирусом осповакцины (90.0 ± 5.0 %) (представлены данные для титра сывороток мышей равном 1/100). Поливалентная ДНК-вакцина на основе вектора pcDNA (87.0 ±4.0%) вызывала наработку более высокого титра ВОВ-нейтрализующих антител, нежели на основе вектора pBKRSV (80.0 ± 2.5 %). Это

вполне ожидаемый результат, т.к. ранее было показано, что в ряде случаев цитомегаловирусный промотор может быть более эффективным, чем промотор из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса в плане индукции иммунного ответа.

При изучении протективности инфицированием вирусом эктромелии штамм К1 в дозе 10 LD50 за мышами проводили наблюдение в течение 14 суток (рис. 14). В двух группах отрицательного контроля к окончанию срока наблюдения погибло 90 % (иммунизированные pBKRSV) и 100 % (иммунизированные pcDNA) мышей. В группе положительного контроля к окончанию срока наблюдения не погибло ни одной мыши. ВОВ-нейтрализующая активность сывороток мышей, трижды иммунизированных ДНК-вакциной на основе гена MIR ВНО, обеспечивала выживаемость 25 % мышей после инфицирования 10 LDJ0 вируса эктромелии.

Рис. 14. Выживаемость мышей линии ВАЬВ/с трехкратно иммунизированных внутрикожно поливалентной ДНК-вакциной рсША-АЗОЦ рсОКА-Р8Ь, рсОЫА-Мт, рсОЫА-АЗбЯ, рсОИА-В7Я (рсОЫА-£5); ДНК-вакциной рсОМА-М1К; трехкратно иммунизированных внутрибрюшинно поливалентной ДНК-вакциной рВККЗУ-АЗОЬ, рВКЛЗУ-Р8Ц рВЮ^У-МШ, рВКК5У-А36К, рВКК5У-В7Я (рВКЕ5У-£5) и внутрибрюшинно инфицированных вирусом эктромелии штамм К1 в дозе 101Х>зо-

Ранее мы показали, что гены Р8Ь и АЗОЬ поверхностной мембраны ВНО в составе вектора рсБКА при внутрикожной иммунизации обеспечивают 40 % (рис. 7А)

и 33% (рис.11) защиту от инфицирования 10 LD50 вируса эктромелии, соответственно. Последний ген поверхностной мембраны ВНО - MIR, входящий в состав разрабатываемой нами поливалентной ДНК-вакцины, в меньшей степени защищает мышей от летальной эктромелии. Однако даже частичная защита говорит о необходимости включения гена MIR ВНО в состав поливалентной ДНК-вакцины против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека.

Оба варианта экспериментальной поливалентной ДНК-вакцины на основе генов A30L, F8L, MIR, A36R и B7R ВНО, наравне с положительным контролем (мышами, иммунизированными живым ВОВ), обеспечивали полную защиту мышей от инфицирования летальной дозой вируса эктромелии. Мы впервые продемонстрировали, что гены вируса натуральной оспы в составе ДНК-вакцины полностью защищают мышей от летальной ортопоксвирусной инфекции. Ранее подобные исследования были проведены только для генов вируса осповакцины и вируса оспы обезьян.

Таким образом, мы создали экспериментальную поливалентную ДНК-вакцину на основе генов пяти протективных антигенов ВНО - A30L, F8L, MIR поверхностной мембраны внутриклеточных вирионов и A36R и B7R оболочки внеклеточной формы вируса. Созданная ДНК-вакцина против натуральной оспы может быть важна для первичной безопасной вакцинации с возможной последующей ревакцинацией классической вакциной. В этом случае число побочных реакций должно быть значительно снижено. Созданная ДНК-вакцина также обладает потенциалом обеспечивать защиту против других ортопоксвирусов. В группу риска потенциального заражения ортопоксвирусами входят, например, научные сотрудники, работающие с вирусами осповакцины или оспой коров, медицинский персонал и военнослужащие, для которых иммунизация безопасной ДНК-вакциной будет более предпочтительной в силу отсутствия массы побочных эффектов. Также созданная ДНК-вакцина может быть использована в случае массовых вспышек ортопоксвирусных инфекций среди людей, таких как вспышки оспы обезьян, оспы коров или осповакцины. Успешное применение ДНК-вакцины при естественных вспышках ортопоксвирусных инфекций усилит уверенность в возможности ее использования для противодействия натуральной оспе.

выводы

-1. На основании результатов выполненного компьютерного анализа показано, что вирионные белки A30L, A36R, B7R, F8L и MIR ВНО отличаются по 1,3, 4, 2 и 1 потенциальной антигенной детерминанте от их ортологов ВОВ и сделано заключение о необходимости использования генов вируса натуральной оспы для создания ДНК-вакцины против натуральной оспы.

2. Создан набор рекомбинантных плазмид на основе векторной плазмиды pBKRSV, несущей гены A4L, A30L, A36R, B7R, F8L, I5R, MIR и M4R ВНО под контролем промотора из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса, и на основе векторной плазмиды pcDNA3.1, несущей гены A30L, A36R, B7R, F8L и MIR ВНО под контролем промотора цитомегаловируса.

3. Показано, что ген F8L ВНО в составе ДНК-вакцины с промотором из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса наиболее эффективен при внутрибрюшинном способе иммунизации, а в составе ДНК-вакцины с промотором цитомегаловируса наиболее эффективен при внутрикожном способе иммунизации.

4. Показано, что изменение кодонового состава гена A30L ВНО, оптимизированного для экспрессии в клетках млекопитающих, не оказывае влияния на протективную эффективность ДНК-вакцины.

5. Показано, что ДНК-вакцины на основе индивидуальных генов MIR, A30L j F8L ВНО под контролем промотора цитомегаловируса при вмутрикожио; способе иммунизации вызывают наработку ВОВ-нейтрализующих антител i обеспечивают 25, 33 и 40 % защиту мышей от инфицирования вирусо! эктромелии в дозе 10LD50, соответственно.

6. Показано, что экспериментальная ДНК-вакцина на основе смес: рекомбинантных плазмид, содержащих гены пяти антигенов ВНО - A30L F8L, MIR поверхностной мембраны внутриклеточных вирионов и A36R и В71 оболочки внеклеточной формы вируса, вызывает наработку высоких титро ВОВ-нейтрализующих антител и обеспечивает полную защиту мышей о инфицирования вирусом эктромелии в дозе 10LD50.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Максютов P.A., Бабкина И.Н., Нестеров А.Е., Щелкунов С.Н. Создание кандидаткой ДНК-вакцины против ортопоксвирусных инфекций человека // Биотехнология. - 2006. - Т. 4. - С. 23-30.

2. Максютов P.A., Щелкунов С.Н. Оптимизация ДНК-вакцины против ортопоксвирусных инфекций человека на основе гена F8L вируса натуральной оспы И Российский Иммунологический Журнал. - 2010. - Т. 4. - С. 25-32.

3. Maksyutov R.A., Hazina Е.А., Babkina I.N., Shchelkunov S.N. Studies of candidate DNA vaccine against orthopoxvirus infections based on variola virus F8L gene. // Всероссийская конференция "Фундаментальные науки - медицине", Новосибирск, Россия, 4-8 сентября 2005, с. 94.

4. Максютов P.A., Гаврилова Е.В., Щелкунов С.Н. Влияние гуманизации гена A30L вируса натуральной оспы на эффективность ДНК-вакцины против патогенных для человека ортопоксвирусов И II Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням, Москва, Россия, 29-31 марта 2010, с. 186.

5. Maksyutov R.A., Gavrilova E.V., Shchelkunov S.N. Studies of smallpox DNA-vaccine // XVIII International Poxvirus, Asfivirus, and Iridovirus Symposium, Sedona, Arizona, USA, June 5-10 2010, P8.16.

Список используемых сокращений

БОЕ - бляшкообразующая единица

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВНО (VARV) - вирус натуральной оспы

BOB (VACV) - вирус осповакцины

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ВОК (CPXV) - вирус оспы коров

BOO (MPXV) - вирус оспы обезьян

ВЭ (ECTV) - вирус эктромелии

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

LDjo - летальная доза, 50%

Максютов Ринат Амирович Экспериментальная днк-вакцина против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека.

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано в центре оперативной полиграфии ИП. Нестеров. П.Н. 630084 г. Новосибирск, ул. Кропоткина, 555

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Максютов, Ринат Амирович

1. Список используемых сокращений

2. Введение

3. Обзор литературы

3.1. Краткая характеристика натуральной оспы

3.2. Разработка противооспенных вакцин

3.2.1. Первое поколение живых противооспенных вакцин

3.2.2. Второе поколение живых противооспенных вакцин

3.2.3. Третье поколение живых противооспенных вакцин

3.2.4. Четвертое поколение живых противооспенных вакцин

3.2.5. Белковая субъединичная противооспенная вакцина

3.2.6. Противооспенная ДНК-вакцина

3.3. Применение ДНК-вакцин

3.3.1. Конструирование ДНК-вакцины и факторы, влияющие на ее эффективность

3.3.2. Механизм действия ДНК-вакцины

3.3.3. Клинические испытания ДНК-вакцин

3.3.4. Перспективы применения ДНК-вакцин в профилактике ортопоксвирусных 37 инфекций человека

4. Материалы и методы

4.1. Материалы

4.2. Компьютерный анализ

4.3. Амплификация ДНК

4.4. Элюция фрагментов ДНК из агарозпого геля при помощи набора Gel 44 Extraction Kit фирмы "QIAGEN", Германия

4.5. Лигирование

4.6. Приготовление компетентных клеток E.coli

4.7. Трансформация компетентных клеток E.coli

4.8. Выделение плазмидной ДНК в препаративном варианте

4.9. Выделение плазмидной ДНК в аналитическом варианте

4.10. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции

4.11. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот в агарозном геле

4.12. Секвенирование ДНК

4.13. Очистка плазмидной ДНК от эндотоксинов центрифугированием в двухступенчатом градиенте CsCl

4.14. Очистка плазмидной ДНК от эндотоксинов при помощи набора EndoFree 47 Plasmid Giga Kit фирмы "QIAGEN", Германия

4.15. Иммунизация мышей ДНК-вакцинами

4.16. Измерение титра вируснейтрализующих антител

4.17. Измерение титра антител к ВОВ

4.18. Реакция бласттрансформации лимфоцитов

4.19. Изучение протективного иммунного ответа

4.20. Статистическая обработка данных

5. Результаты и обсуждение

5.1. Выбор генов ВНО для конструирования ДНК-вакцины

5.2. Определение оптимального способа иммунизации ДНК-вакцины в 66 зависимости от использованного промотора для эукариотической экспрессии на развитие протективного иммунного ответа

5.3. Исследование влияния изменения кодонового состава гена, 73 оптимизированного для экспрессии в клетках млекопитающих, на протективную эффективность ДНК-вакцины

5.4. Оценка иммуногенности и протективной эффективности поливалентной ДНК- 80 вакцины на основе генов A30L, MIR, F8L, A36R и B7R ВНО

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Максютов, Ринат Амирович

7. Выводы

1. На основании результатов выполненного компьютерного анализа показано, что вирионные белки A30L, A36R, B7R, F8L и MIR ВНО отличаются по 1, 3, 4, 2 и 1 потенциальной антигенной детерминанте от их ортологов ВОВ и сделано заключение о необходимости использования генов вируса натуральной оспы для создания ДНК-вакцины против натуральной оспы.

2. Создан набор рекомбинантных плазмид на основе векторной плазмиды pBKRSV, несущей гены A4L, A30L, A36R, B7R, F8L, I5R, MIR и M4R ВНО под контролем промотора из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса, и на основе векторной плазмиды pcDNA3.1, несущей гены A30L, A36R, B7R, F8L и MIR ВНО под контролем промотора цитомегаловируса.

3. Показано, что ген F8L ВНО в составе ДНК-вакцины с промотором из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса наиболее эффективен при внутрибрюшинном способе иммунизации, а в составе ДНК-вакцины с промотором цитомегаловируса наиболее эффективен при внутрикожном способе иммунизации.

4. Показано, что изменение кодонового состава гена A3 OL ВНО, оптимизированного для экспрессии в клетках млекопитающих, не оказывает влияния на протективную эффективность ДНК-вакцины.

5. Показано, что ДНК-вакцины на основе индивидуальных генов MIR, A30L и F8L ВНО под контролем промотора цитомегаловируса при внутрикожном способе иммунизации вызывают наработку ВОВ-нейтрализующих антител и обеспечивают 25, 33 и 40 % защиту мышей от инфицирования вирусом эктромелии в дозе IOLD50, соответственно.

6. Показано, что экспериментальная ДНК-вакцина на основе смеси рекомбинантных плазмид, содержащих гены пяти антигенов ВНО — A3 OL, F8L, MIR поверхностной мембраны внутриклеточных вирионов и A36R и B7R оболочки внеклеточной формы вируса, вызывает наработку высоких титров ВОВ-нейтрализующих антител и обеспечивает полную защиту мышей от инфицирования вирусом эктромелии в дозе IOLD50.

6. Заключение

Род Orthopoxvirus семейства Poxviridae вкл ючает такие патогенные для человека виды как вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины. Массовая вакцинация традиционной вакциной на основе ВОВ защищала людей не только от ВНО, но и от близкородственных BOO и ВОК (Маренникова и Щелкунов, 1998). После 1980 года в результате повсеместного прекращения иммунизации против ВНО, доля населения, чувствительного к ВНО и другим патогенным для человека ортопоксвирусам, постоянно увеличивается. Об этом свидетельствуют участившиеся многочисленные вспышки ортопоксвирусных инфекций среди людей такими вирусами как BOO, ВОК и ВОВ (Stephenson, 2003; Lewis-Jones, 2004; Campe et al, 2009; Ninove et al, 2009). Кроме того, ВНО рассматривают как возможный агент биотеррористических атак, которые могут иметь катастрофические последствия для всего населения Земли (Онищенко и др., 2000; Spencer and Lightfoot, 2001; Breman and Henderson, 2002). Отсутствие эффективных противовирусных препаратов и опасность использования классической живой вакцины на основе ВОВ из-за большого числа тяжелых поствакцинальных осложнений, требует незамедлительной разработки современных безопасных вакцин против ортопоксвирусных инфекций.

За последние несколько лет были определены иммуногенные и протективные антигены поверхностной мембраны внутриклеточных вирионов (например, A27L, D8L и L1R) и оболочки внеклеточных форм ВОВ (например, A33R и B5R), вызывающие наработку вируснейтрализующих антител и обеспечивающих защиту против ортопоксвирусной инфекции. Показано, что различные комбинации указанных антигенов в формате белковой субъединичной вакцины и/или ДНК-вакцины обеспечивают защиту мышей против вируса осповакцины (Hooper et al, 2000; Hooper et al., 2003; Fogg et al., 2004; Pulford et al., 2004; Sakhatskyy et al, 2006; Fogg et al., 2007; Xiao et al, 2007; Berhanu et al, 2008) и против вируса эктромелии (Xiao et al, 2007), и защиту нечеловекообразных приматов от вируса оспы обезьян (Hooper et al, 2004; Heraud et al., 2006).

Несмотря на успех в разработке белковых субъединичных вакцин и ДНК-вакцин против ортопоксвирусных инфекций, во всех предыдущих работах источником генетического материала для антигенов являлся вирус осповакцины или вирус оспы обезьян, но не вирус натуральной оспы, против которого и создавалась вакцина. Хотя ортопоксвирусы высококонсервативны по генам, кодирующим протективные антигены, и вакцинация человека вирусом осповакцины приводит к защите от инфекции всех ортопоксвирусов, патогенных для человека, известно, что только люди, переболевшие натуральной оспой, приобретают против нее пожизненный иммунитет (Маренникова и Щелкунов, 1998). Производство белковой субъединичной вакцины или ДНК-вакцины не включает работы с живым вирусом и поэтому снимает вопросы безопасности относительно использования антигенов вируса натуральной оспы.

В недавней работе (Aldaz-Carroll et al, 2007) было обнаружено минимум три ВОВ-нейтрализующих моноклональных антитела, специфичных белку B5R ВОВ, не оказывающих нейтрализующего эффекта на вирус натуральной оспы. Это подтверждает, что гуморальный иммунный ответ, индуцированный антигенами ВОВ, не сможет обеспечить такой высокий уровень защиты против натуральной оспы как индуцированный антигенами ВНО.

Поэтому целью данного исследования было получение и изучение свойств экспериментальной ДНК-вакцины на основе генов ВНО против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека.

Для достижения этой цели на первом этапе работы провели углубленный сравнительный анализ аминокислотных последовательностей протективных антигенов ВНО и их ортологов BOB', ВОК, BOO и ВЭ, выявили различия по потенциальным антигенным детерминантам. При этом для генов A36R, B7R, A4L и I5R ВНО имеются значительные различия по антигенным детерминантам по сравнению с их ортологами ВОВ. Выявленные нами различия по антигенным детерминантам между иммуногенами ВНО и их ортологами других ортопоквирусов говорят о необходимости использования генов ВНО, нежели ВОВ, для разработки эффективной ДНК-вакцины против натуральной оспы. При этом наличие совпадающих антигенных детерминант между белками ВНО и ВЭ и способность ортопоксвирусов обеспечивать перекрестный иммунный ответ, позволило нам исследовать протективную эффективность ДНК-вакцины на моделе мышей и высокопатогенном для них вирусе эктромелии.

На следующем этапе работы мы сконструировали 8 рекомбинантных плазмид, на основе вектора pBKRSV, экспрессирующих под контролем промотора вируса саркомы Рауса различные белки ВНО: три белка сердцевины вириона (A4L, M4R и I5R), три белка поверхностной мембраны IMV (A30L, F8L и M1R) и два белка оболочки EEV (A36R и B7R). В эксперименте по проверке иммуногенности было установлено, что ДНК-вакцина, содержащая ген вируса натуральной оспы F8L, при двукратном внутрибрюшинном введении мышам индуцирует специфический клеточный и гуморальный иммунный ответ против ВОВ.

На эффективность ДНК-вакцины в значительной степени влияют используемый эукариотический промотор для экспрессии антигена и способ иммунизации (Doria-Rose and Haigwood, 2003). Поэтому в рамках продолжения работы по созданию ДНК-вакцины мы провели определение оптимального способа иммунизации в зависимости от использованного промотора для эукариотической экспрессии на примере гена F8L ВНО в плане развития протективного иммунного ответа на модели мышей и высокопатогенного для них вируса эктромелии. Для этого дополнительно была сконструирована рекомбинантная плазмида, на основе вектора pcDNA, экспрессирующая ген F8L ВНО под контролем цитомегаловирусного промотора. Мыши были иммунизированы внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрикожно или подкожно препаратами ДНК-вакцин, эукариотическая экспрессия гена F8L в которых осуществляется под контролем RSV или CMV промоторов. Защитный эффект анализируемых вакцин проверяли в эксперименте инфицированием иммунизированных экспериментальных животных вирусом эктромелии в дозе 10 LD50. Все группы были частично защищены от летальной ортопоксвирусной инфекции, кроме мышей, иммунизированных внутримышечно. При этом ДНК-вакцина с промотором из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса была наиболее эффективна при внутрибрюшинном способе иммунизации, а ДНК-вакцина с промотором цитомегаловируса и тем же геном иммунодоминантного белка ВНО наиболее эффективна при внутрикожном способе иммунизации.

IIa повышение эффективности ДНК-вакцины также может оказывать влияние оптимизация кодонового состава генов протективных вирусных антигенов, приводящая к увеличению синтеза вирусного белка в клетках млекопитающих (Haas et al, 1996; Wang et al., 2006). Учитывая то, что весь цикл развития ортопоксвируса проходит в цитоплазматических образованиях, называемых виросомами или вирусными фабриками, а вирусная ДНК имеет более низкий GC состав по сравнению с геномом клеток млекопитающих (Маренникова и Щелкунов, 1998), важно было проверить, можно ли значительно увеличить эффективность разрабатываемой вакцины против натуральной оспы в результате оптимизации кодонового состава оргопоксвирусного гена для его экспрессии в ядре клеток млекопитающих. Поэтому следующей задачей являлось сравнение эффективности ДНК-вакцин на основе природного гена A30L ВНО и искусственного гена A30Lopt с измененным кодоновым составом, оптимизированным для экспрессии в клетках млекопитающих. Для этого были сконструированы рекомбинантные плазмиды, на основе вектора pcDNA, экспрессирующие под контролем CMV промотора природный ген A3 0L ВНО и искусственный гена A30Lopt, предварительно синтезированный методом ПЦР из длинных олигонуклеотидов. В эксперименте на животных было показано, что обе ДНК-вакцины вызывали наработку ВОВ-нейтрализующих антител и обеспечивали частичную защиту от инфицирования летальной дозой вируса оспы мышей. При этом ДНК-вакцина на основе гена А30Ьор( с оптимизированным кодоновым составом не обеспечивала статистически достоверных более высоких титров ВОВ-специфичных и ВОВ-нейтрализующих антител и большую защиту против инфекции, что свидетельствует о нецелесообразности оптимизации кодонового состава остальных генов ВНО, входящих в состав противооспенной поливалентной ДНК-вакцины.

Из ранее исследованных нами восьми генов ВНО, мы выбрали наиболее перспективные три гена поверхностной мембраны 1МУ (АЗОЬ, Р8Ь и М1Я) и два гена оболочки ЕЕУ (А3611 и В7К) для создания комбинированной поливалентной ДНК-вакцины. Оценку иммуногенности и протективной эффективности проводили для двух вариантов поливалентной ДНК-вакцины: на основе вектора рВККЭУ при внутрибрюшинном способе иммунизации и на основе вектора рсОИА при внутрикожном способе иммунизации. Указанные комбинации промотора и способа иммунизации были определены нами ранее как наиболее эффективные. В эксперименте на животных было установлено, что оба варианта поливалентной ДНК-вакцины на основе генов АЗОЬ, 178Ь, М111, АЗ611 и В7К. ВНО, наравне с живым вирусом осповакцины, вызывают наработку высоких титров ВОВ-нейтрализующих антител и обеспечивают полную защиту животных против летальной дозы высокопатогенного вируса эктромелии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Максютов, Ринат Амирович, Кольцово

1. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике. М.: Наука. -1990.

2. Максютов З.А., Максютов А.З. Пакет программ ADEPT: средство разработки новых методов предсказания белковых антигенных детерминант. // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. 2004. - Т. 8. - № 2. - С. 71.

3. Маниатис Т., Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир. - 1984. - С. 480.

4. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. -Москва: КМК Scientific Press Ltd. 1998. - С. 386.

5. Методические рекомендации. Натуральная оспа (клиника, лечение, иммунопрофилактика). — Москва: ФМБА. 2006. - 60 с.

6. Онищенко Г.Г., Сандахчиев Л.С., Нетесов С.В., Щелкунов С.В. Биотерроризм как национальная и глобальная угроза. // Журн. микробиол. 2000. - Т. 6. - С. 83-85.

7. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир. 2000. - 582 с.

8. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Новосибирск: Сибирское Университетское Издательство. 2010. - 514 с.

9. Agrawal S., Gupta S., Agrawal A. Vaccinia virus proteins activate human dendritic cells to induce T cell responses in vitro. // Vaccine. 2009. - V. 27. - P. 88-92.

10. Akbari O., Panjwani N., Garcia S., Tascon R., Lowrie D., Stockinger B. DNA vaccination: transfection and activation of dendritic cells as key events for immunity. // J. Exp. Med. -1999.-V. 189.-P. 169-178.

11. Amer M., El-Gharib I., Rashed A., Farag F., Emara M. Human cowpox infection in Sharkia Governorate. // Egypt. Int J Dermatol. 2001. - V. 40. - № 1. - P. 14-17.

12. Anon. Note for guidance on the development of vaccinia virus based vaccines against smallpox. In: C.f.P.M.P.T.E.A.f.t.E.o.M. Products (Ed.), Evaluation of Medicines for Human Use 2002. - P. 1-19.

13. Antoine G., Scheiflinger F., Dorner F., Falkner F.G. The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses. // Virology. — 1998. V. 244. - № 2. - P. 365-396.

14. Baroudy B.M., Moss B. Sequence homologies of diverse length tandem repetitions near ends of vaccinia virus genome suggest unequal crossing over. // Nucleic Acids Res. — 1982.-V. 10.-P. 5673-5679.

15. Baxby D., Bennett M., Getty B. Human cowpox 1969-93: a review based on 54 cases. // Br. J. Dermatol. 1994. - V. 131. - P. 598-607.

16. Benvenisti L., Rogel A., Kuznetzova L., Bujanover S., Becker Y., Stram Y. Gene gun-mediate DNA vaccination against foot-and-mouth disease virus. // Vaccine. 2001. - V. 19.-P. 3885-3895.

17. Blackford S., Roberts D.L., Thomas P.D. Cowpox infection causing a generalized eruption in a patient with atopic dermatitis. // Br. J. Dermatol. 1993. - V. 129. - P. 628-629.

18. Blasco R., Moss B. Role of cell-associated enveloped vaccinia virus in cell-to-cell spread. // J. Virol. 1992. - V. 66. - P. 4170—4179.

19. Bojak A., Hammer D., Wolf H., Wagner R. Muscle specific versus ubiquitous expression of Gag based HIV-1 DNA vaccines: a comparative analysis. 11 Vaccine. 2002. - V. 20. — P.1975-1979.

20. Bojak A., Wild J., Wolf H., Wagner R. Efficiency of a myogenic DNA vaccine is strictly dependent upon cellular localization of HIV-1 Pr55. // Vaccine. 2002b. - V. 20. - P. 1980-1984.

21. Bray M., Buller M. Looking back at smallpox. // Clin. Infect. Dis. 2004. - V. 38. - P. 882-889.

22. Breman J.G., Henderson D.A. Current concepts: diagnosis and management of smallpox. // N. Engl. J. Med. 2002. - V. 346. - P. 1300-1308.

23. Campe H., Zimmermann P., Glos K., Bayer M., Bergemann H., Dreweck C., Graf P., Weber B.K., Meyer PI., Biittner M., Busch U., Sing A. Cowpox virus transmission from pet rats to humans, Germany. // Emerg. Infect. Dis. 2009. - V. 15. - P. 777-780.

24. Carletti F., Bordi L., Castilletti C., Di Caro A., Falasca L., Gioia C. Cat-to-human orthopoxvirus transmission northeastern Italy. // Emerg. Infect. Dis. 2009. - V. 15. - P. 499-500.

25. Chapman B.S., Thayer R.M., Vincent K.A., Haigwood N.L. Effect of intron A from human cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells. //Nucleic Acids Res. 1991. - V. 19. - P. 3979-3986.

26. Chung C.S., Hsiao J.C., Chang Y.S., Chang W. A27L protein mediates vaccinia virus interaction with cell surface heparan sulfate. // J. Virol. 1998. - V. 72. - P. 1577-1585.

27. Committee on Infectious Diseases. American Academy of Pediatrics. Smallpox vaccine. // Pediatrics. 2002. - V. 110. -№ 4. - 841-845.

28. Dai K., Liu Y., Liu M., Xu J., Huang W., Huang X., Liu L., Wan Y., Hao Y., Shao Y. Pathogenicity and immunogenicity of recombinant Tiantan Vaccinia Virus with deleted C12L and A53R genes. // Vaccine. 2008.

29. Damaso C.R., Esposito J.J., Condit R.C., Moussatche N. An emergent poxvirus from humans and cattle in Rio de Janeiro State: Cantagalo virus may derive from Brazilian smallpox vaccine. // Virology. 2000. - V. 277. - № 2. - P. 439-449.

30. Damon I.K., Roth C.E., Chowdhary V. Discovery of monkeypox in Sudan. // N. Engl. J. Med. 2006. - V. 355. - № 9. - P. 962-963.

31. Davis M.G., Huang E.S. Transfer and expression of plasmids containing human cytomegalovirus immediate-early gene 1 promoter-enhancer sequences in eukaryotic and prokaryotic cells. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1988. - V. 10. - P. 6-12.

32. Demkowicz W.E., Maa J.S., Esteban M. Identification and characterization of vaccinia virus genes encoding proteins that are highly antigenic in animals and are immunodominant in vaccinated humans. // J. Virol. 1992. - V. 66. - P. 386-398.

33. Denes B., Gridley D.S., Fodor N., Takatsy Z., Timiryasova T.M., Fodor I. Attenuation of a vaccine strain of vaccinia virus via inactivation of interferon viroceptor. // J. Gene Med. -2006.-V. 8.-P. 814-823.

34. Doria-Rose N.A., Haigwood N.L. DNA vaccine strategies: candidates for immune modulation and immunization regimens. // Methods. 2003. - V. 31. - P. 207-216.

35. Empig C., Higgins K., Edghill-Smith Y., Silvera P. Attenuated smallpox vaccine LC16m8 protects Cynomolgus monkeys from Lethal IV monkeypox-zaire challenge. Washington: ASM-Biodefence. 2006b.

36. Ennis F.A., Cruz J., Demkowicz W.E. , Rothman A.L., McClain D.J. Primary induction of human CD8+ cytotoxic T lymphocytes and interferon-gamma-producing T cells after smallpox vaccination. // J. Infect. Dis. 2002. - V. 185. - № 11. - P. 1657-1659.

37. Ertl P.F., Thomsen L.L. Technical issues in construction of nucleic acid vaccines. // Methods.-2003.-V. 31.-P. 199-206.

38. Feltquate D.M., Heaney S., Webster R.G., Robinson H.L. Different T helper cell types and antibody isotypes generated by saline and gene gun DNA immunization. // J. Immunol. -1997.-V. 158.-P. 2278-2284.

39. Fenner F., Henderson D.A., Arita I., Jezek Z., Ladnyi I.D. Smallpox and its eradication. // World Health Organization: Geneva. 1988.

40. Fenner F. Risks and benefits of vaccinia vaccine use in the worldwide smallpox eradication campaign. // Res. Virol. 1989. -V. 140. -№ 5. -PP. 465-466, 487-491.

41. Flexner C., Hugin A., Moss B. Prevention of vaccinia virus infection in immunodeficient mice by vector-directed IL-2 expression. //Nature. 1987. - V. 330. - P. 259-262.

42. Frey S.E., Newman F.K., Cruz J., Shelton W.B., Tennant J.M., Polach T., Rothman A.L., Kennedy J.S., Wolff M., Belshe R.B., Ennis F.A. Dose-related effects of smallpox vaccine. // N. Engl. J: Med. 2002. - V. 346. - P. 1275-1280.

43. Galmiche M.C., Goenaga J., Wittek R., Rindisbacher L. Neutralizing and protective antibodies directed against vaccinia virus envelope antigens. // Virology. 1999. - V. 254. -P. 71-80.

44. Goebel S.J., Johnson G.P., Perkus M.E., Davis S.W., Winslow J.P., Paoletti E. The complete DNA sequence of vaccinia virus. // Virology. 1990. - V. 179. - № 1. - P. 247266.

45. Gurunathan S., Klinman D.M., Seder R.A. DNA vaccines: immunology, application and optimization. // Annu. Rev. Immunol. 2000. - V. 18. - P. 927-974.

46. Gurvich E.B. The age-dependent risk of postvaccination complications in vaccinees with smallpox vaccine. // Vaccine. 1992. - V. 10. - № 2. - P. 96-97.

47. Haas J., Park E.C., Seed B. Codon usage limitation in the expression of HIV-1 envelope glycoprotein. // Curr. Biol. 1996. - V. 6. -№ 3. - P. 315-324.

48. Harari A., Bart P.A., Stohr W., Tapia G., Garcia M., Medjitna-Rais E., Burnet S., Cellerai

49. Harding C.V., Song R. Phagocytic processing of exogenous particulate antigens by macrophages for presentation by class I MHC molecules. // J. Immunol. 1994. - V. 153. -P. 4925-4933.

50. Hasan U.A., Abai A.M., Harper D.R., Wren B.W., Morrow W.J.W. Nucleic acid immunization: concepts and techniques associated with third generation vaccines. // J. Immunol. Methods. 1999. - V. 229. - P. 1-22.

51. Hekker A.C., Bos J.M., Rai N.K., Keja J., Cuboni G., Emmet B., Djalins J. Large-scale use of freeze-dried smallpox vaccine prepared in primary ultures of rabbit kidney cells. Bull World Health Organ. 1976. - V. 54. - P. 279-284.

52. Henderson D.A. The looming threat of bioterrorism. // Science. 1999. - V. 283. - P. 1279-1282.

53. Heraud J.M., Edghill-Smith Y., Ayala V., Kalisz I., Parrino J., Kalyanaraman V.S., Manischewitz J., King L.R., Hryniewicz A., Trindade C.J., Hassett M., Tsai W.P., Venzon

54. D., Nalca A., Vaccari M., Silvera P., Bray M., Graham B.S., Golding H., Hooper J.W., Franchini G. Subunit recombinant vaccine protects against monkeypox. // J. Immunol. -2006.-V. 177.-P. 2552-2564.

55. Hirayama M. Smallpox vaccination in Japan. In: Fukumi H, editor. The vaccination theory and practice. Tokyo: International Medical Foundation of Japan. 1975. - P. 113-124.

56. Honlinger B., Huemer H.P., Romani N., Czerny C.P., Eisendel K., Hopel R. Generalized cowpox infection probably transmitted from a rat. // Br. J. Dermatol. 2005. - V. 153. - P. 451-453.

57. Hooper J.W., Kamrud K.I., Elgh F., Custer D., Schmaljohn C.S. DNA vaccination with hantavirus M segment elicits neutralizing antibodies and protects against seoul virus infection. // Virology. 1999. - V. 255. - P. 269-278.

58. Hooper J.W., Custer D.M., Schmaljohn C.S., Schmaljohn A.L. DNA vaccination with vaccinia virus L1R and A33R genes protects mice against a lethal poxvirus challenge. // Virology. 2000. - V. 266. - P. 329-339.

59. Hooper J.W., Custer D.M., Thompson E. Four-gene-combination DNA vaccine protects mice against a lethal vaccinia virus challenge and elicits appropriate antibody responses in nonhuman primates. // Virology. 2003. - V. 306. - P. 181-195.

60. Hooper J.W., Thompson E., Wilhelmsen C., Zimmerman M., Ichou M.A., Steffen S.E., Schmaljohn C.S., Schmaljohn A.L., Jahrling P.B. Smallpox DNA vaccine protects nonhuman primates against lethal monkeypox. // J. Virol. 2004. - V. 78. - P. 4433—4443.

61. Hsiao J.C., Chung C.S., Chang W. Vaccinia virus envelope D8L protein binds to cell surface chondroitin sulfate and mediates the adsorption of intracellular mature virions to cells. // J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 8750-8761.

62. Hu F.Q., Smith C.A., Pickup DJ. Cowpox virus contains two copies of an early gene encoding a soluble secreted form of the type II TNF receptor. // Virology. 1994. - V. 204.-№ 1.-P. 343-356.

63. Iwasaki A., Torres C.A., Ohashi P.S., Robinson H.L., Barber B.II. The dominant role of bone marrow-derived cells in CTL induction following plasmid DNA immunization at different sites. // J. Immunol. 1997. - V. 159. - P. 11-14.

64. Iwasaki A., Stiernholm B.J., Chan A.K., Berinstein N.L., Barber B.H. Enhanced CTL responses mediated by plasmid DNA immunogens encoding costimulatory molecules and cytokines. // J. Immunol. 1997b. - V. 158. - P. 4591-4601.

65. Jacobs B.L., Langland J.O., Kibler K.V., Denzler K.L., White S.D., Ilolechek S.A., Wong S., Huynh T., Baskin C.R. Vaccinia virus vaccines: past, present and future. // Antiviral Res.-2009.-V. 84. P. 1-13.

66. Kemper A.R., Davis M.M., Freed G.L. Expected adverse events in a mass smallpox vaccination campaign. // Eff. Clin. Pract. 2002. - V. 5. - № 2. - P. 84-90.

67. Kenner J., Cameron F., Empig C., Jobes D.V., Gurwith M. LC16m8: an attenuated smallpox vaccine. // Vaccine. 2006. - V. 24. - P. 7009-7022.

68. Klinman D.M., Yi A.K., Beaucage S.L., Conover J., Krieg A.M. CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 2879-2883.

69. Kodihalli S., Haynes J.R., Robinson H.L., Webster R.G. Cross-protection among lethal H5N2 influenza viruses induced by DNA vaccine to the hemagglutinin. // J. Virol. 1997. -V. 71.-P. 3391-3396.

70. Kondo T., McGregor M., Chu Q., Chen D., Horimoto T., Kawaoka Y. A protective effect of epidermal powder immunization in a mouse model of equine herpesvirus-1 infection. // Virology. 2004. - V. 318. - P. 414-419.

71. Kovacs G.R., Moss B. The vaccinia virus H5R gene encodes late gene transcription factor 4: purification, cloning, and overexpression. // J. Virol. 1996. - V. 70. - P. 6796-6802.

72. Kozak M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in position +5 and +6. // EMBO J. 1997. - V. 16. - P. 2482-2492.

73. Kretzschmar M., Wallinga J., Teunis P., Xing S., Mikolajczyk R. Frequency of adverse events after vaccination with different vaccinia strains. // PLoS Med. 2006. - V. 3. — № 8.-P. 272.

74. Krieg A.M., Yi A.K., Matson S., Waldschmidt T.J., Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A., Klinman D.M. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. // Nature. 1995. - V. 374. - P. 546-549.

75. Kushner P.J., Baxter J.D., Duncan K.G., Lopez G.N., Schaufele F., Uht R.M., Webb P., West B.L. Eukaryotic regulatory elements lurking in plasmid DNA: the activator protein-1 site in pUC. // Mol. Endocrinol. 1994. - V. 8. - P. 405^107.

76. Kutzler M.A., Weiner D.B. DNA vaccines: ready for prime time? // Nature Reviews Genetics. 2008. - V. 9. - P. 776-788.

77. Lai C.F., Gong S.C., Esteban M. The purified 14-kilodalton envelope protein of vaccinia virus produced in Escherichia coli induces virus immunity in animals. // J. Virol. — 1991. -V. 65.-P. 5631-5635.

78. Lane J.M., Ruben F.L., Neff J.M., Millar J.D. Complications of smallpox vaccination, 1968: results often statewide surveys. // J. Infect. Dis. 1970. - V. 122. - P. 303-309.

79. Lee M.S., Roos J.M., McGuigan L.C., Smith K.A., Cormier N. Cohen L.K., Roberts B.E., Payne L.G. Molecular attenuation of vaccinia virus: mutant generation and animal characterization. // J. Virol. 1992. - V. 66. -№ 5. - P. 2617-2630.

80. Legrand F.A., Verardi P.IL, Jones L.A., Chan K.S., Peng Y., Yilma T.D. Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes. // J. Virol. 2004. - V. 78. - № 6. - P. 2770-2779.

81. Levine R.S., Peterson A.T., Yorita K.L., Carroll D., Damon I.K., Reynolds M.G. Ecological niche and geographic distribution of human monkeypox in Africa. // PLoS One. — 2007. — V. 2. № 1. — P. 176.

82. Lewis-Jones S. Zoonotic poxvirus infections in humans. // Curr. Opin. Infect. Dis. 2004. -V. 17.-P. 81-89.

83. Lipford G.B., Bauer M., Blank C., Reiter R., Wagner H., Heeg K. CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen: a new class of vaccine adjuvants. // Eur. J. Immunol. 1997. - V. 27. - P. 2340-2344.

84. Lorenzen N. and LaPatra S.E. DNA vaccines for aquacultured fish. // Rev. Sci. Tech. -2005.-V. 24.-P. 201-213

85. Maksyutov A.Z., Zagrebelnaya E.S. ADEPT: a computer program for prediction of protein antigenic determinants. // Comput. Appl. Biosci. 1993. - V. 9. - № 3. - P. 291-297.

86. Massung R.F., Liu L.I., Qi J., Knight J.C., Yuran T.E., Kerlavage A.R., Parsons J.M., Venter J.C., Esposito J.J. Analysis of the complete genome of smallpox variola major virus strain Bangladesh-1975. // Virology. 1994. - V. 201. -№ 2. - P. 215-240.

87. A.V. Enhanced T-cell immunogenicity of plasmid DNAvaccines boosted1 by recombinant modified vaccinia virus Ankara in humans. //Nat. Med. 2003. - V. 9. - P. 729-735

88. Michaeli D. Smallpox: a possible comeback. // Isr. Med: Assoc. J. 2002. - V. 4. - № 7. -P. 487-488.

89. Monath T.P., Caldwell J.R., Mundt W., Fusco J., Johnson C.S., Buller M., Liu J., Gardner

90. Moore R.A., Nicholls P.K., Santos E.B., Gough G.W., Stanley M.A. Absence of canine oral papillomavirus DNA following prophylactic LI particle-mediated immunotherapeutic delivery vaccination. // J. Gen. Virol. 2002. - V. 83. - P. 2299-2301.

91. Mossman K., Upton C., Buller R.M;, McFadden G. Species specificity of ectromelia virus and vaccinia virus interferon-gamma binding proteins. // Virology. — 1995. V. 208. — № 2.-P. 762-769.

92. Murphy F.A., Osburn B.I. Adventitious agents and smallpox vaccine in strategic national stockpile. //Emerg. Infect. Dis.-2005.-V. 11.-P. 1086-1089.

93. Ninove L., Domart Y., Vervel C., Voinot C., Salez N., Raoult D., Meyer H., Capek I., Zandotti C., Charrel R.N. Cowpox virus transmission from pet rats to humans, France. // Emerg. Infect. Dis.-2009. V. 15.-P. 781-784.

94. Otero M., Calarota S.A., Dai A., De Groot A.S., Boyer J.D., Weiner D.B. Efficacy of novel plasmid DNA encoding vaccinia antigens in improving current smallpox vaccination strategy. // Vaccine. 2006. - V. 24. - P. 4461-4470.

95. Pan C.H., Chen H.W., Huang H.W., Tao M.H. Protective mechanisms induced by a Japanese encephalitis virus DNA vaccine: requirement for antibody but not CD8(+) cytotoxic T-cell responses. //J. Virol. -2001. -V. 75. P. 11457- 11463.

96. Parker S., Nuara A., Buller R.M., Schultz D.A. Human monkeypox: an emerging zoonotic disease. // Future Microbiol. 2007. - V. 2. - P. 17-34.

97. Pelkonen P.M., Tarvainen K., Hynninen A., Kallio E.R.K., Henttonen H., Palva A., Vaheri A., Vapalahti O. Cowpox with severe generalized eruption, Finland. // Emerg. Infect. Dis. -2003.- V. 9.-P. 1458-1461.

98. Peterson D.O., Beifuss K.K., Morley K.L. Context-Dependent Gene expression: cis-acting negative effects of specific prokaryotic plasmid sequences on eukaryotic genes. // Molec. Cell Biol. 1987. - V. 7. - P. 1563-1567.

99. Poland G.A., Grabenstein J.D., NefT J.M. The US smallpox vaccination program: a review of a large modern era smallpox vaccination implementation program. // Vaccine. 2005. -V. 23.-№2078-2081.

100. Powell K. DNA vaccines back in the saddle again? // Nat. Biotechnol. - 2004. - V. 22. -P. 799-801

101. Price B.M., Liner A.L., Park S., Leppla S.H., Mateczun A., Galloway D.R. Protection against anthrax lethal toxin challenge by genetic immunization with a plasmid encoding the lethal factor protein. // Infect. Immun. 2001. - V. 69. - P. 4509- 4515.

102. Piitz M.M., Midgley C.M., Law M., Smith G.L. Quantification of antibody responses against multiple antigens of the two infectious forms of vaccinia virus provides a benchmark for smallpox vaccination. // Nat. Med. 2006. - V. 12. - P. 1310-1315.

103. Putnak R., Fuller J., VanderZanden L., Innis B.L., Vaughn D.W. Vaccination of rhesus macaques against dengue-2 virus with a plasmid DNA vaccine encoding the viral premembrane and envelope genes. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2003. - V. 68. - P. 469476.

104. Rao A.R. Smallpox. Bombay: The Kothari Book Depot. 1972. - 220 p.

105. Ravanello M.P., Hruby D.E. Characterization of the vaccinia virus L1R myristylprotein as a component of the intracellular virion envelope. // J. Gen. Virol. 1994. — V. 75. - P. 1479-1483.

106. Rodriguez J.F., Paez E., Esteban M. A 14,000-Mr envelope protein of vaccinia virus is involved in cell fusion and forms covalently linked trimers. // J. Virol. 1987. - V. 61. -P. 395-404.

107. Rosenthal S.R., Merchlinsky M., Kleppinger C., Goldenthal K.L. Developing new smallpox vaccines. // Emerg. Infect. Dis. 2001. - V. 7. - P. 920-926.

108. Rychlik W., Rychlik P. Oligo 6: Primer analysis software. Molecular biology insights. -Connecticut - 2000.

109. Sakhatskyy P., Wang S., Chou T.H., Lu S. Immunogenicity and protection efficacy of monovalent and polyvalent poxvirus vaccines that include the D8 antigen. // Virology. — 2006.-V. 355.-P. 164-174.

110. Sanderson C.M., Frischknecht F., Way M., Hollinshead M., Smith G.L. Roles of vaccinia virus EEV-specific proteins in intracellular actin tail formation and low pH-induced cell-cell fusion. // J. Gen. Virol. 1998. - V. 79. - P. 1415-1425.

111. Sato Y., Roman M., Tighe H., Lee D., Corr M., Nguyen M.D., Silverman G.J., Lotz M., Carson D.A., Raz E. Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization. // Science. 1996. - V. 273. - P. 352-354.

112. Shchelkunov S.N., Resenchuk S.M., Totmenin A.V., Blinov V.M., Marennikova S.S., Sandakhchiev L.S. Comparison of the genetic maps of variola and vaccinia viruses. // FEBS Lett. 1993. - V. 327. -№ 3. - P. 321-324.

113. Shchelkunov S.N., Marennikova S.S., Moyer R.W. Orthopoxviruses pathogenic for humans. New York: Springer. 2005. - 425 p.

114. Shchelkunov S.N. How long ago did smallpox virus emerge? // Arch. Virol. 2009. - V. 154. -№ 12. - P. 1865-1871.

115. Spencer R.C., Lightfoot N.F. Preparedness and response to bioterrorism. // J. Infect. -2001.-V. 43.-P. 104-110.

116. Stephenson J. Monkeypox outbreak a reminder of emerging infections vulnerabilities. // J. Am. Med. Assoc. 2003. - V. 290. - P. 23-24.

117. Stewart K.J., Telfer S., Bown K.J., White M.I. Cowpox infection: not yet consigned to history. // Br. J. Plast. Surg. 2000. - V. 53. -№ 4. - P. 348-350.

118. Stickl H.A. Smallpox vaccination and its consequences: first experiences with the highly attenuated smallpox vaccine "MVA". // Prev. Med. 1974. -V. 3. -№ 1. - P. 97-101.

119. Takeshita S., Takeshita F., Haddad D.E., Ishii K.J., Klinman D.M. CpG oligodeoxynucleotides induce murine macrophages to up-regulate chemokine mRNA expression. // Cell. Immunol. 2000. - V. 206. - 101-106.

120. Tang D.C., De Vit M., Johnston S.A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. // Nature. 1992. - V. 365. - P. 152-154.

121. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. // Nucleic Acids Research. 1997. - V. 24. - P. 4876-4882.

122. Torres C.A., Iwasaki A., Barber B.H., Robinson H.L. Differential dependence on target site tissue for gene gun and intramuscular DNA immunizations. // J. Immunol. 1997. - V. 158.-P. 4529-4532.

123. Trindade G.S., Guedes M.I., Drumond B.P., Mota B.E.F., Abrahao J.S., Lobato Z.I.P. Zoonotic vaccinia virus: clinical and immunological characteristics in a naturally infected patient. // Clin. Infect. Diseases. 2009. - V. 48. - P. 37-40.

124. Tryland M., Myrmel H., Holtet L., Ilaukenes G., Traavik T. Clinical cowpox cases in Norway. // Scand. J. Infect. Dis. 1998. -V. 30. - P. 301-303.

125. Ulmer J.B., Wahren B., Liu M.A. G ene-based vaccines: recent technical and clinical advances. // Trends Mol. Med. 2006. -V. 12. -№ 5. - P. 216-222.

126. Vijaysri S., Jentarra G., Heck M.C., Mercer A.A., Mclnnes C.J., Jacobs B.L. Vaccinia viruses with mutations in the E3L gene as potential replicationcompetent, attenuated vaccines: intra-nasal vaccination. // Vaccine. 2008. - V. 26. - № 5. - 664-676.

127. Webster R.G., Fynan E.F., Santoro J.C., Robinson H. Protection of ferrets against influenza challenge with a DNA vaccine to the haemagglutinin. // Vaccine. 1994. - V. 12.-P. 1495-1498.

128. Williams J.A., Carnes A.E., Hodgson C.P. Plasmid DNA Vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. // Biotechnol. Adv. 2009. - V. 27. - № 4. - P. 353-370

129. Wolffe E.J., Isaacs S.N., Moss B. Deletion of the vaccinia virus B5R gene encoding a 42-kilodalton membrane glycoprotein inhibits extracellular virus envelope formation and dissemination. // J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 4732^1741.

130. Wolffe E.J., Vijaya S., Moss B. A myristylated membrane protein encoded by the vaccinia virus L1R open reading frame is the target of potent neutralizing monoclonal antibodies. // Virology. 1995. - V. 211. - № 1. - P. 53-63.

131. Wyatt L.S., Earl P.L., Eller L.A., Moss B. Highly attenuated smallpox vaccine protects mice with and without immune deficiencies against pathogenic vaccinia virus challenge. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004. - V. 101. - P. 4590-4595.

132. Zhu W., Fang Q., Zhuang K.,Wang H., Yu W., Zhou J., Liu L., Tien P., Zhang L., Chen Z. The attenuation of vaccinia Tian Tan strain by the removal of the viral M1L-K2L genes. // J. Virol. Methods. 2007. - V. 144. - P. 17-26.

Информация о работе
  • Максютов, Ринат Амирович
  • кандидата биологических наук
  • Кольцово, 2010
  • ВАК 03.01.03
Диссертация
Экспериментальная ДНК-вакцина против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Экспериментальная ДНК-вакцина против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы