Разработка метода видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе использования мультиплексной ПЦР

Гаврилова, Елена Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка метода видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе использования мультиплексной ПЦР
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка метода видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе использования мультиплексной ПЦР"

На правах рукописи

0030580ЭВ

Гаврилова Елена Васильевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВИДОСПЕЦИФИЧНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОРТОПОКСВИРУСОВ, ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА, НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР

03 00 03 —молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 2007

003058098

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Щелкунов С Н

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Беклемишев А Б кандидат биологических наук Тикунова Н В

Ведущая организация

Институт химичесхой биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ)

СО РАН (Новосибирск)

Защита состоится 18 мая 2007 года в 11 00 часов на заседании диссертационного совета при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел (8-383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан 12 апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Род Orthopoxvirus семейства Poxviridae включает такие патогенные для человека виды, как вирусы натуральной оспы (VARV), оспы обезьян (MPXV), оспы коров (CPXV) и осповакцины (VACV)

Вирус натуральной оспы вызывает острое инфекционное заболевание с характерными кожными поражениями. По общепринятой классификации штаммы вируса натуральной оспы разделяют на два эпидемиологических типа-вирусы большой оспы (variola major) с летальностью от 5 до 40% и вирусы малой оспы (variola minor) с меньшей летальностью Штаммы малой оспы в Америке принято называть alastrim

Вирус оспы обезьян вызывает заболевание, по характеру клинического течения напоминающее тип натуральной оспы, преобладавшей на Африканском континенте, и имеет невысокий уровень летальности Оспа коров у человека в основном протекает доброкачественно и характеризуется развитием единичных местных поражений

Ранее, массовая вакцинация против натуральной оспы позволяла защищать не только от VARV, но и от других близкородственных ей видов Полное прекращение вакцинации и связанное с этим снижение уровня коллективного иммунитета к оспе повлияло на восприимчивость к MPXV и CPXV, о чем свидетельствуют участившиеся вспышки инфицирования людей этими вирусами Кроме этого необходимо еще учесть такой фактор, как возможность использования возбудителя натуральной оспы в качестве агента биологического оружия Готовность к развитию событий по такому "сценарию" требует разносторонней подготовки Одним из основных элементов такой подготовки является разработка и совершенствование методов лабораторной диагностики ортопоксвирусов Как известно, выявление случаев оспы почти автоматически влечет за собой целый ряд противоэпидемических мер, поэтому важно не просто дать ответ имеется или отсутствует ортопоксвирус, но и с максимально

возможной точностью определить, каким видом ортопоксвируса вызвано данное экзантемное заболевание

На сегодняшний день из средств обнаружения оспенных вирусов на российском рынке имеются производимые ГУЛ НПО «Вирион» (г Томск) диагностикумьг ИФА-диагностикум для определения антител к ортопоксвирусам (ФС 42-3530-98), ИФА-диагностикум для выявления антигена к ортопоксвирусам (ФС 42-3478-98), сыворотка диагностическая оспенная сухая, иммуноглобулин диагностический оспенный люминесцирующий сухой Перечисленные диагностикумы обеспечивают только родовое обнаружение оспенных вирусов Поэтому остается актуальным поиск новых подходов для выявления и дифференциации патогенных для человека ортопоксвирусов

Привлекательным способом решения проблемы видовой идентификации ортопоксвирусов является использование мультиплексной ПЦР Являясь современным экспресс методом диагностики вирусных инфекций, МПЦР может позволить не только детектировать, но и дифференцировать исследуемые вирусы Данный подход также является экономически оправданным по сравнению с другими разработанными методиками на основе ПЦР. Ранее мультиплексная ПЦР для диагностики ортопоксвирусов не применялась Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлась разработка одностадийного метода видоспецифичной диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов - вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины - на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи*

• Подобрать олигонуклеотидные праймеры для мультиплексного ПЦР, обеспечивающие видоспецифичную амплификацию ортопоксвирусных ДНК и образующих в МПЦР продукты разной длины, характерные для каждого вида ортопоксвируса.

• Оптимизировать параметры МПЦР с выбранными олигонуклеотидами

• Сконструировать положительный контроль методики МПЦР диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов на основе клонированных специфичных ДНК-ампликонов

• Определить основные аналитические и диагностические характеристики разрабатываемой методики видоспецифичной диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов методом МПЦР.

Научная новизна и практическая значимость работы

Обнаружена новая, ранее неизвестная открытая рамка трансляции "VARV-подобного" района ортопоксвирусов у некоторых штаммов CPXV Проведено определение нуклеотидной последовательности и компьютерный анализ данной ОРТ у двух штаммов CPXV- OPV-91/1 и ЕР-2

Впервые осуществлен выбор олигонуклеотидных праймеров для детекции и дифференциации четырех патогенных для человека видов ортопоксвирусов VARV, MPXV, CPXV и VACV

Разработан метод видоспецифичной экспресс диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, использующий одностадийный анализ МПЦР, учитывающий все новейшие данные по структуре генома ортопоксвирусов и проверенный на ДНК 59 штаммов различных видов ортопоксвирусов

Показана эффективность использования МПЦР при анализе клинического материала - корочек с кожных поражений людей, болевших в 1970-1975 г натуральной оспой и оспой обезьян, и корочки с кожного поражения человека, образовавшейся после вакцинации штаммом ЛИВП VACV в 2000 г.

По результатам исследования разработана нормативно-техническая документация на метод видоспецифичной экспресс диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов - VARV, MPXV, CPXV и VACV на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции

• Лабораторный регламент на производство тест-системы для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины

методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ЛР № 00105664012-06),

• Технические условия на производство тест-системы для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ТУ 4354-00105664012-06),

• Инструкция по применению тест-системы для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной полимеразной цепной реакции

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод, позволяющий в одну стадию мультиплексной полимеразной цепной реакции детектировать и дифференцировать все четыре вида ортопоксвирусов, патогенных для человека вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины Метод, в условиях проведенных экспериментов, имеет следующие характеристики.

• аналитическая чувствительность - 101 в ч в мл исходного образца,

• диагностическая чувствительность - 100 %,

• диагностическая и аналитическая специфичность - 100 %

2 Данные по определению нуклеотидной последовательности новой, ранее неизвестной открытой рамки трансляции в "УАЯУ-подобном" районе генома двух штаммов СРХУ. ОРУ-91/1 и ЕР-2

3 Пакет нормативных документов:

• Лабораторный регламент на производство тест-системы для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ЛР № 00105664012-06),

По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в реферируемых научных журналах, получен патент РФ Результаты работы были представлены на международных конференциях Xllth International Poxvirus and Indovirus Symposium (Montpellier, France, 2000), 2nd Meeting of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Switzerland, Geneva, 2001), International Congress "Progressive scientific technologies for human health" (Feodosia, Ukraine,

2003), XVth International Poxvirus and Indovirus Conference (Oxford, England,

2004), Biological Medical Defense Conference 2004 (Munich, Germany, 2004), II Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, Россия, 2005), Third World Congress on Chemical, Biological and Radiological Terrorism (Dubrovnik, Croatia, 2005)

Вклад автора

Поиск и компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей видоспецифичных районов геномов VARV, MPXV, CPXV и VACV выполнен автором при участии И В Бабкина. Секвенирование "VARV-подобного" района генома двух штаммов CPXV CPV-OPV-91/1 и CPV-EP-2 выполнено лично автором Разработка метода диагностики и конструирование положительного контроля методики МПЦР на основе клонированных специфичных ДНК-ампликонов выполнены лично автором Разработка нормативно-технической документации на метод видоспецифичной экспресс диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов - VARV, MPXV, CPXV, VACV на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции выполнено лично автором Выделение препаратов ДНК вируса натуральной оспы проводилось в лаборатории 4-го уровня биобезопасности ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» И.В Бабкиным, М В Михеевым и И Н Бабкиной

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания Материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы (181 ссылка) Работа изложена на 118 страницах, содержит 11 таблиц и 31 рисунок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Выбор олигонуклеотидных праймеров для мультиплексного ПЦР Задачей первого этапа работы являлся расчет олигонуклеотидных праймеров для мультиплексного ПЦР, обеспечивающих видоспецифичную амплификацию вирусных ДНК и образующих в ПЦР продукты разной длины, характерные для каждого вида ортопоксвируса Для этого провели сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей геномов VARV, MPXV, CPXV и VACV, выявили геномные районы с видоспецифичными различиями

На рисунке 1 представлена общая схема, иллюстрирующая локализацию выбранных районов на геномной ДНК четырех патогенных для человека ортопоксвирусов Для каждого выбранного уникального района, используя программу «Oligo», рассчитали олигонуклеотидные праймеры для ПЦР С помощью этой же программы были подобраны оптимальные условия амплификации для каждой пары праймеров Предполагаемые пары праймеров затем анализировали на наличие гомологии/комплементарности между собой и со всеми имеющимися известными последовательностями в базах данных NCBI, используя программу BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) Отсутствие гомологии с другими видами ортопоксвирусов и родами поксвирусов, а также со всеми другими имеющимися последовательностями являлось одним из критериев отбора олигонуклеотидов В результате путем подбора из серии 33 пар праймеров были выбраны определенные пары для МПЦР (таблица 1)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80гпн

D4LD6L D7LD8L C2LC3L G4L

CPXV-GR1 ............-7,

J3L D1L C10L

MPXV-ZAI ■ —S->—^^^„„„„„^^„„„^„^^^^^^^^^^^^^ЗЗ

C8L

VARV-IND i-»-■нв-шмааам^тша—46

C15LC14LCI3LC12L C9LC6LC5L F4L

VACV-COP ■мшнт-»-ммЬвмммнннмшмнмнвмнвм 58

CPXV-GRI яяшш—шшшшшшш—яшя—шшшшшштштшшшшшш ^ —151

MPXV-ZAI ■внмншнннншнншмвм^нввннннш^ 134

A25L A26L A27L

VARV-IND ананаанваяввшян1аввва1нннн^нввшан11^^

H5R

VACV-COP шяшшшштшттш—я^———тшштшя^авяштшшшвшшшаштшшшшшшшшяштшш1шиаяшшв1ш 136

CPXV-GRI ' N1RN2R 223

MPXV-ZAI B10RB11RB12R ~ 196 VARV-IND шммнммммннв-мншмшм-■■■■■■■■——»—■ —-. ISS

A37R

VACV-COP —■ i-—->-a-.-шштттяттттт 191

Рисунок 1 Графическое выравнивание геномов вирусов оспы коров CPXV-GRI, осповакцины VACV-COP, натуральной оспы VARV-IND и оспы обезьян MPXV-ZAI Стрелками обозначены направления и размер ОРТ, внутри которых проводили видоспецифичную ПЦР-амплификацию Над стрелками приведены названия соответствующих ОРТ Тонкими линиями обозначены районы делеций в ДНК одних вирусов относительно других Справа указана длина нуклеотидных последовательностей в т п н

Таблица 1 Праймеры, использованные в ПЦР-анализе ДНК ортопоксвирусов

Вирус Район генома Последовательность олигонуклеотидов Длина фрагмента (пн)

CPXV D4L 5'- ggatacaaagtttataaatgtcgg- 3' 5'-tggtaagtatacctatcgttcgat-3' 785

D6L-D7L 5 '-tagacgcgattccgatagcagtctt-3' 5 '-ttgggccatgcaacagttcgt-3' 1267

D7L-D8L 5 '-tagacgcgattccgatagcagtctt-3' 5 '-tcggtaattaattctttatcatagttgcca- 3' 827

K1R 5'-ttcataaggcataatgatagtaatggcc-3' 5'-tgttttagatggtcacgtccatacaaa-3' 809

B9R* 5 '-atcagatggaattatctctcacccg-3' S '-gataafttgatccatctcgtccacc-3' 421

B9R 5 '-ttgctatccataggtttccaactttc-3' 5'-cccgaatggttaacagatatggaa-3* 437

C2L-C3L 5'-ttattaccaaccatgaacgcgatag-3' 5 '-cctccgcatttatgttgataggagt-3' 756

I2R S'-gtcagccctatattaggggagtac-3' 5 '-gatagttgttgtccgtcgtcttat-3' 333

B19R 5 '-ggtggtcaaaacggtacgaa-3' 5 '-ccattcgcgagtgtacacatta-3' 540

VACV A37R 5 *-cgattggtaacatcgtttacaaacg-3' 5 '-ccgtcaatgtttactctccggc-3' 958

C12L-C15L 5'-ccaatttgttaagtatgaatacggggtaca-3' 5 '-cccatctcccggtattatgcttgtat-3' 703

C15L S '-aatcatggagcagctggttctacagc-3' 5 '-cccatctcccggtattatgcttgtat-3' 913

C5L-C6L 5 '-taggaaaaaaaattatctatctacatcatcacgt-3' S '-ctaatgcgatagagaaaatagctccagaa-3' 689

C9L 5 '-tatactcgacaactttaggatctctattgcc-3' 5 '-aatagaacagattagacgtgctggtgaa-3' 647

C9L 5 '-aattcatcatcccaattataatattcacc-3' 5 '-tgcaaatccattatatgagtatgatgR-3' 396

C9L 5 '-cataatatttattaggttatcatcattgtcatta-3' S'-aagatactctatgatagttgtaaaacatttaacatc-3' 1125

C9L i '-ggtgtagtcgtaatcgtaalcgtctaatt-3' S '-aagatactctatgatagttgtaaaacatttaacatc-3' 492

H5R 5 '-ccaatcagatagactgttgttatggtctt-3' 5 '-gccgactccaggagatggagaa-3' 1247

H5R S'-actgaaaaaaattctccatctcctg-3' S'-aggaattcatcgaacgtagttttaga-3' 1262

H5R 5 '-aaaaaattctccatctcctggagtc-3' 5 '-catttatcggtcttgtaattatttgtgt-3' 1339

MPXV ESR 5'-atgttgalattaataatcgtattgtggtt-3' 5 '-aaagtcaatacactcttaaagaltctcaa-3' SSI (ЗА)" 832 (ЦА)

E5R 5'-aatcatgtatacctgttcgtatgcct-3' 5 '-aaagtcaatacactcttaaagattctcaa-3' 96

E5R S'-aaactcattgagacattgaaactagga-3' 5 '-aaagtcaatacactcttaaagattctcaa-3' . 360 (ЗА) 619 (ЦА)

N1R-N2R 5 '-tagcgagttgaaggagttctcgg-3' 5' -cctaaattatcagtctcattcaaatattgc-3' 644

J3L-D1L 5 '-tatcaaagttacgcatgccgtgg-3' 5'-cctatcaaaacttccattagaaattagRg-3' 512

VARV B10R-B11R 5'-caccaatggacatttcttatgttattaatg-3' 5'-gccaacgttatcatatattRgagacg-3' 449 (major) 1081 (minor)

B10R-B11R 5'-cgtcactgagtttacagatagcggtt-3' 5'-gccaacgttatcatatattggagacg-3' 356 (major) 982 (minor)

B10R-B12R 5'-ttctcttgaacaaggcatcaaaaaat-3' 5'-acgtgtatactaattccaaaggtttatttc-3' 680 (major) 1308 (minor)

B10R-B12R 5'-ggatctgatttggaagcgtatttcatgtgt-3' 5'-tattgtcaatactgacgagattgtcgctgg-3' 981 (major) 1608 (minor)

B12R 5 '-catccgatattattgtaaccacaatg-3' 5 '-cccaacatttctaaatctcctcgt-3' 200

A25L-A27L 5 '-gatttcacgttccagattacgttt-3' 5'-aagaagcaagagattgcgttaaga-3' 453

Orthopoxvirus F4L J '-cgttggaaaacgtgagtccgg-3' 5 '-tctacggatttcagatggccaUg-3' 294

F4L 5'-cgttggaaaacgtgagtccgg-3' 5 '-attggcgttttttgcagccag-3' 386

Примечание

* жирным курсивом выделены последовательности праймеров, использованные в конечном варианте МПЦР

** Западно-Африканские (ЗА) и Центрально-Африканские (ЦА) изоляты МРХУ

Для выявления наличия ортопоксвирусной ДНК и дискриминации ее от ДНК других родов поксвирусов в исследуемых образцах, были рассчитаны родоспецифичные праймеры к району гена ОРТ Р4Ь УАСУ. Последовательность данного гена имеет значимую гомологию только с последовательностями ДНК ортопоксвирусов (рисунок 2) Проверка данной пары праймеров в ПЦР показала отсутствие продуктов амплификации с ДНК вирусов миксомы кролика, фибромы Шоупа (род ЬеропрохУ1гш), вируса оспы кур (род Ау1рохуниз) (рисунок 3)

VACV-COP VARV-IND MPXV-ZAI96 CPXV-GKI

F4Lip

í ' -свттеаимсвтаегссев- з '

GTTCGTTGGAAAACGTGAGTCCGGGCATTAGGCCACGCTTTTTAAGCCAA 50

GOATPOX-PELLOR T T T A T С AT T T T A 1 G A G T T А Т А А А

GOATPOX-GZO-LKV I T T A T С AT T T T A 1 G A G T T А т А А А

SHEEPPOX-A T T T A T С AT T T T A 1 G A G T с А т А А А G

SHEEPPOX-NISKHI T T T A I С AT T T T A 1 G A G T с А т А А А G

SHEEPPOX-TU-V02127 T T I A T С AT T T T A i G A G T с А т А А А G

5«INEPOX-17077-99 A A T T A С AT T T T T 1 T A с А т т А

LOMPY-L»-1959 T 7 T A t С AT T T T A 1 S A G T с А т А А А

LUMPY-NI-2490 T T T A T С AT T T A 1 G « A G T с А т А А А

LOMPY-NW-LW T T T A T С AT T T " f A 1 G A G T с А т А А А

YABA AC T T A A T T T T T 1 T A с с Т т А А А G

FIBROMA A I AC T TTT T T С T A G 1 G T G T с т т А G

MYXOHA A T С AC CTTT T TOT A 1 G G G Б T с с т А G

jj4How 3 ' -вттихавтиастшеватст-! •

248 ACTATACATTTCCGAATGAATGTTTTCAAÎGGCCATCTGAAATCCGTAGAAAC 300

~ Рисунок 2 Сравнение нуклеотидной последовательности гена, кодирующего малую субъединицу рибонуклеотидредуктазы - ОРТ F4L VACV штамм Copenhagen (EMBL М35027) (VACV-COP) с соответствующими районами геномов различных поксвирусов Род Orthopoxvirus VARV, штамм India-1967 (EMBL Х69198) (VARV-IND), MPXV, штамм Zaire-96-1-16 (EMBL AF380138) (MPXV-ZAIQ6), CPXV, штамм GRI-90 (EMBL X94355) (CPXV-GR1) Род Capnpoxvirus Goatpox virus, штаммов Pellor (EMBL- AY077835) (GOATPOX-PELLOR), G20-LKV (EMBL AY077836) (GOATPOX-G20-LKV), Sheeppox vmis, штаммов A (EMBL AY077833) (SHEEPPOX-A), N1SKHT (EMBL AY077834) (SHEEPPOX-NISKHI), TU-V02127 (EMBL AY077832) (SHbEPPOX-TU-V02127), Lumpy skin disease virus, штаммов Neethlmg vaccine LW 1959 (EMBL AF409138) (LUMPY-LW-1959), Neethlmg 2490 (EMBL AF325528) (LUMPY-NI-2490), Neethlmg Warmbaths LW (EMBL AF409137) (LUMPY-NW-LW) Род Yatapoxvims Yaba-like disease virus (EMBL AJ293568) (YABA) Род Suipoxvirus Swmepox virus, штамм 17077-99 (EMBL AF410153) (SWINEPOX-17077-99), Род Leporipoxvirus Rabbit fibroma virus, штамм Kasza (EMBL AF170722) (FIBROMA), Myxoma virus, штамм Lausanne (EMBL AFI 70726) (MYXOMA) Идентичные нуклеотиды в сравниваемых последовательностях вирусных геномов по отношению к последовательности ОРТ F4L VACV-COP обозначены точками, делеции - прочерком Цифры слева и справа от нуклеотидной последовательности ОРТ F4L VACV-COP обозначают положение нуклеотидов в анализируемом сегменте ДНК Полужирным курсивом приведены последовательности олигонуклеотидных праймеров F4Lup и F4Llow для родоспецифичной ПЦР-амшшфикации ортопоксвирусов

Рисунок.}. Результат элехтрофоретичесхого разделения я 2.5 % геле ягароаы фрагментов ДМ К, полученных после ПЦР при использовании вяигонуклеотадных прайме ров, рассчитанных на консервативный родоспецифичный ]>айс>н ОРТF4L VACV I Пирус м иксом hi кроликоп, штамм l.ausanne, 7 Вирус фибромы Шоупа, штамм Kasza; 3 Вирус оспы птиц, штамм FP9; 4. CPXV, штамм ЕР-2; 5. CPXV, штамм GRI-40, 6. VACV, штамм ЛИВП; 7. VACV, штамм Western Reserve, Я. VARV, штамм India, у. VARV, штамм Butler, 10 MPXV, штамм CDC-V-70-1-1B1; N MPXV, штамм CDC-V-79-J-04; ОКО -отрицательный контрольный образец, М ДНК-маркер, длина я пи показана справа

Затем осуществляли проверку видоспеци фичной амплификации, используя две пары праймерон, одна из которых была родос п е ни фи ч ной, а вторая подбиралась индивидуально для каждого вида ортолоксвируса.

В случае MPXV' были выбраны олигенуклеотиды, рассчитанные для района ОРТ E5R. В данном районе у MPXV имеются несколько коротких видоспецйфИчиых делеций. Такая особенность структуры генома MPXV позволила создать видоснецифичную пару прайм еров для штаммов MPXV (рисунок 4). Рассчитанные олигонуклеотиды обеспечивают надежную видоснецифичную ПЦР-амшшфикацию с вирусной ДНК и позволяют дифференцировать изоляты MPXV на Западно-Африканские (ЗА) и Центрально-Африканские (ЦА). Так, при проведении ПЦР с данной нарой праймерои образуются ГТЦР-продукты: 581 п.н. для ЗА изолятов, и 832 п.н. для ЦА изолятов MPXV (рисунок 5).

E5Rup ESRlow

KPXV-ZAI96 KPXV-ÍAI79 MPXV-CON MPXV-OSA MPXV-COP MPXV-SL MPXV-tlB MPXV-tfRA MPXV-DEN CPXV-GRI CPXV-8RT CPXV-IAR CPXV-TÜR VARV-IND VARV-GAR VARV-BSH VARV-SOM VARV-BAR VACV-COP VACV-KR VACV-ANK VACV-US VACV-TT VACV-RP ECTV-MOS ECTV-MH

З'-лтатталтА------------------------ттллхялтсвтлттвтеат-т-З'

1 TATGTTGATA--------------------------TTAATAATCGTATTGTGGT-TA 31

-------------------------- л

TTAACAAAAGTGAATATATAT----G T

TTAACAAAAGTGAATATATAT----G TA GG G G

TTAACAAAAGTGAATATATATAT—G T

TTAACAAAAGTGAATATATAT----G T

TTAACAAAAGTGAATATATATAT—G T

TTAACAAAAGTGAATATATAT----G T

TTAACAAAAGTGAATATATATAT—G T

TTAACAAAAGTGAATATATAT----G T

TTAACAAAAGTGAATATATATAT"G T

TTAACAAAAGTGAATATATATAT ATG T

TTAACAAAAGTGAATATATATAT—G T

3' -AMOCTTAe------------------------ЛХЛ.ТТСТСХСЛ TAJLCraAAA - i '

191 TTTGAGAATC------------------------TTTAAGAGTGTATTGACTTTG 834

------------------------------------------------c

-----------------------------с

------------------------------------------------С

------------------------------------------------c

CGTTACATATTATTGGTAAGAATC С С

CTCTACATATCATTGGTAAGAATC CC С

CGCTGCATATTATTGGTAAGAATC С С

CGCTGCATATTATTGGTAAGAATC С С CGCT&CATATTATTGOTAAAAATC С , , ,С

CGCTACATATTATTGGTAAAAATC С С

CGCTACATATTATTGGTAAGAATC С С

Рисунок 4 Сравнение нуклеотидной последовательности ОРТ E5R MPXV штамм Zaire-96-I-16 (EMBL AF380138) (MPXV-ZAI96) с соответствующими районами геномов MPXV, штаммы Zaire-1979-00S (EMBL DQ011155) (MPXV-ZAI79), Congo-2003-358 (EMBL DQ011154) (MPXV-CON), USA-2003-039 (EMBL DQ011157) (MPXV-USA), COP-58 (EMBL AY753185) (MPXV-COP), Sierra Leone (EMBL AY741551) (MPXV-SL), Libena-1970-184 (EMBL DQ011156) (MPXV-LIB), MPXV-WRA3R7-61 (EMBL AY603973) (MPXV-WRA), Denmark (EMBL M95534) (MPXV-DEN), CPXV, штаммы GRI-90 (EMBL X94355) (CPXV-GRI), Bnghton Red (EMBL AF482758) (CPXV-BRT), Larkrn (EMBL U32635) (CPXV-LAR), Turkmenia (EMBL U32633) (CPXV-TUR), VARV, штаммы India-1967 (EMBL X69198) (VARV-IND), Gareia-1966 (EMBL Y16780) (VARV-GAR), Bangladesh-1975 (EMBL L22579) (VARV-BSH), Somalia-1977 (EMBL- M95533) (VARV-SOM), Harvey (EMBL M95532) (VARV-HAR), VACV, штаммы Copenhagen (EMBL M35027) (VACV-COP), WR (Western Resérve) (EMBL AY243312) (VACV-WR), Ankara (EMBL U94848) (VACV-ANK), Lister (EMBL AY678276) (VACV-LIS), Tian Tan (EMBL AF095689) (VACV-TT), Rabbitpox virus (EMBL AY484669) (VACV-RP), ECTV, штаммы Moscow (EMBL AFO12825) (ECTV-MOS), Mili Hill (EMBL U32632) (ECTV-MH) Идентичные нуклеотиды в сравниваемых последовательностях вирусных геномов по отношению к последовательности ОРТ E5R MPXV-ZAI96 обозначены точками, делеции - прочерком Цифры слева и справа от нуклеотидной последовательности ОРТ E5R MPXV-ZA196 обозначают положение нуклеотидов в анализируемом сегменте ДНК Полужирным курсивом приведены последовательности олигонуклеотидных праймеров E5Rup и E5Rlow для ПЦР-амплификации, специфичной для MPXV

Рисунок 5. Результат элеюрофоретического разделения в 2 5 % геле агарозы фрагментов ДИК, полученных после ПЦР при использовании о л и га ну к л сот ид пых праймерои, рассчитанных для района ОРТ E5R MPXV-Zaire, од повременно с пряй мерами для родос не цифичнОЙ идентификации оргопокс вирусов- Анализировали амнлификаты, полученные ла ДНК разных штаммов MPXV:

I MPXV, штамм Congo-8, 2 MPXV, штамм Zairc-96. 3. MPXV, штамм CDC# v79-1-005; 4 MPXV, штамм CDC# v70-l-187, 5 MPXV, штамм СЕКТ« v97-l-004; 6. MPXV, штамм CDC# v78-l-3945, ОКО - отрицательный контрольный образец; М. ДНК маркер, длина в пм. показана справа.

Для группы вирусов оспы коров, несмотря на высокую гетерогенность этого вида, хорошие результаты продемонстрировали олигонуклеотиды, рассчитанные для ОРТ B9R и при проведении амплификации на ДИК CPXV дающие фрагмент 421 п.н. (рисунок 6). Последовательность ОРТ B9R является уникальной для CPXV и ¡te имеет гомологии с последовательностями VARV, МРXV и VACV. Рассчитанная пара лраймеров детектировала все имеющиеся шгаммы CPXV и дифференцировала CPXV от других патогенных для человека ортоноксвирусо».

Рисунок 6. Результат электрофореткческого

разделения в 2.5% геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после ГИДР при использовании олигонуклеотидных гтраймерок, рассчитанных для района ОРТ B9R CPXV-GRJÍ, одновременно с нраймерями для родоеиецифичной идентификации ортопохевнрусоп, Анлли трои:),>,1 аыяяифнхяты, полученные на ДНК разных штаммов CPXV: 1 ЕР-1, 2 Turk; 3. Ham-85, 4 GRI-90; 5 Puma-73, ОКО - отрицательный контрольный образец; М. ДНК-маркер, длина п П.Н. показана справа

Осуществление дифференциации вируса ошовакцины от Других нидоа орган о кс в и русо в осложняется тем, что у VACV нет протяженных видоспецифичных районов. Для большинства районов различия с другими видами о ртоно кс вирусов идут на уровне нескольких нуклеотидов. При ггроиедении амплификации для группы вирусов осиовакциНЫ наиболее результативной о клалась пара прайм еров, рассчитанная для района ОРТ C9L, дающая продукт длиной 492 п.н. (рисунок 7). Данный район имеет самый низкий показатель гомологии, полученный при сравнении всех секвенировйнных районов ДНК вирусов осповакцины, натуральной оспы и оспы коров и составляет всего 69 %.

м к, г з 4 ■ :>. -. ^л,,.? s; > i« око м

' .. ' ■■■ WM. .."..,■■ ,,-у&г ■-... ..V:

^.МШШ^m ".....

* t, ■■ ■ • ■■■■■ - - ■„■ :

" '■ "... ■"'■ "i, , ">. ■ ■■ ■■■ ■■ ■ ' TV '

РЙ' г" fsjs '^¡í'-éiftS

:«¿Sыт ^ .в» ,

Л-ы. ; ' ■ ' '' - V ' " " ":' ■' . -V:.' " Л" - - ' ■ ' <М'

■ ï - " •'■^ÉaS ' i Ч«Е?> ' ■-i-

Щ \ " - • ■ ' . ■ _ L , H " ,, 1 '.„ ■ . /

; «I ■ ■

Рисунок 7. Результат эле ктрофоретичес кого разделения в 2,5 % геле а га розы фрагментов ДНК, нолученных в результате ПЦР при использовании олигонуклеотидных праимеров, рассчитанных для района ОН' С VACV-Cop, одновременно с и размерам и для родос пецнфнч ной идентификации ортоноксвирусов Анализировали амплификаты, полученные па ДНК разных штаммов VACV:

I LIVP; 2. КМ-63, 3. CVU78; 4 El st г ее 6664, 5, Patwadanger; 6. Chambón St-Yves Menard, 7. tilslree 3399; 8. Western Reserve; 9. 13P-J, 10 Utrecht; ОКО - отрицательный контрольный образец, M ДНК-маркер., длин» в и м показана справа

В случае видовой дифференциации VARV ранее считалось, что в правой концевой части генома ортопоксвируеов содержится VARV-специфичный сегмент ДНК длиной 2068 п.н., содержащий ОРТ B10R и ОРТ BlIR VARV-IND. Кроме того, в данном сегменте находится участок 627 п.н,, специфичный для

вирусов Variola minor (а I asi r im). Такая особенность генома позволяет дифференцировать подвиды вируса натуральной оспы.

В качестве примера результаты амплификации с парой прайм еров, рассчитанной в данном районе, представлены на рисунке 8. Выбранные олигонуклеотиды в реакции ПЦР формировали фрагменты 356 п.н. для VARV-major и 982 п.н. для VARV-minor (a tas trim) (таблица 1), обеспечивали детекцию ДНК имеющихся штаммов VARV и дифференциацию VARV от других видов oprroí 10 кс в прусов.

Рисунок 8. Результат »:ieK] рофоретнческого разделения : 2.5 % геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после ГИДР при использовании онигонуклеотидных прайм еров, рассчитанных для района ОРТ В10R-B f [ R VARV-IND, одновременно с и рай мерам и дня родос пешфич ной идентификации ортонокс виру сов. Анализировали ямплификатм, полученные на ДНК разных штаммов V Д RV;

I. Ngami; 2. lud-За, 3 Kuw-5; 4. 12-62, 5. 6-58; 6 M-Abr-60, 7. Congo-9, 8. M-Sur-60; 9.

Butler, 10 M-Sok-60; II. Brazil-128; 12. India-164, 13 Aslam; ОКО - отрицательный контрольный образец; М ДНК маркер, длина в п н. показана справа

Для проведения мультиплексного ГЩР-анализа (МГ11ДР) использовали одновременно все пять пар праймеров, одна из которых является родоспсцифичной и при амплификации дает продукт длиной 294 п.н. Остальные пары праймеров являются видоепецифичными и при амплификации дают продукты соответствующей длины (рисунок 9). Как видим, все ортопоксвирусы, патогенные для человека, образуют характеристичные по размеру фрагменты

ДНК. В случае СРХУ, на ДНК некоторых штаммов в МПЦР анализе образуются два ПНР-фрагмента, длиной 421 п.н. (характерной для СРХУ) и 492 п.н. (характерной для УАСУ) (рисунок 9, таблица 1), на ДНК остальных штаммов С!1 XV образуется одни ПЦР-фрагмент, длиной 421 п.н. (характерной для СРХУ).

Ml 2 J 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 U 15 li ПОКОМ

Рисунок 9. Результат :э.']скфофоретического разделения я 2.5 % геле агарозы фрагментов ДИК, полученных после ПЦР при использовании 4 нар олш онуклеотидных праймеров для видсюпецифичной и одной пары - для родоснецифичной идентификации ортоноксвирусов

I VACV, штамм Copenhagen; 2 VACV, штамм LIVP; 3. VACV, штамм BP-1, 4. CPXV, штамм Puma -73; 5. CPXV, штамм GRI-ЭД, 6 CPXV, штамм Turk men io, 7 CPXV, штамм Hum-85; 8. CPXV, штамм EP-], 9. MPXV, штамм Zaire-96-1-16; 10. MPXV, штамм Congo-8, 11. VACV, штамм Chambon St-Yvcs; 12 VACV, штамм tiM-63; 13. VACV, штамм Western Reserve; 14 VACV, штамм Utrecht; 15 VARV, штамм ind-3a; 1й. VARV, штамм Butler, 17. ECTV, штамм MP-1; ОКО - отрицательный контрольный образец; M. ДНК-маркер, длина в п.н. показана справа.

Таким образом, при проведении анализа результатов дифференциации ортопоксвирусов МПЦР, если образуется два П[ (Р-фрагмента длинной 421 п.н. и 492 п.н. или одни 421 п.н., то ДНК исследуемого штамма вируса дифференцируется как CPXV. Если образуется один I [ЦР-фрагмент длинной 492 п.н., то ДНК исследуемого штамма вируса дифференцируется как VACV.

Использование нескольких нар праймеров в единой смеси потребовало оптимизации критических параметров реакции МПЦР, в результате которой выяснили, что оптимальным является использования 200 мкМ каждого dNTP с

2.0 Mivf MgCli Что касается праймеров, то оптимальные концентрации, при которых амплификация участков генома ортопоксвирусов осуществляется с одинаковой эффективностью, составила — 0.1 мкМ для родоснецифичны х праймеров, 0.2 мкМ для видоспецифичиых праймеров к CPXV, VACV, VARV и 0.6 мкМ для ви дошецифичных праймеров к MPXV.

Исследование ДНК VARV-специфичного района генома CPXV Определив оптимальные параметры МПЦР с выбранными олигонуклеотидами, мы провели скрининг имеющейся коллекции ДНК различных штаммов ортопоксвирусов. Выяснили, что при анализе ДНК некоторых штаммов CPXV (ЕР-2, OPV 91/1, OPV 89/1, OPV 89/5), предоставленных Dr. Meyer 11., образовывались 11ЦР продукты, характерные для вируса натуральной оспы (рисунок 10). В ранее расшифрованных геномах двух штаммов CPXV GR1-90 и Brighton "VARV-СП ецифичный" район ДНК, использованный нами для ПЦР-диагностики VARV, отсутствует. Поэтому возникла необходимость выяснить организацию генома я этом районе для штаммов CPXV, дающих положительный V A R V - епс цнфи чны й ответ при использовании разработанного нами первого варианта МПЦР.

1001Ю

э<хю JSOO 21100 1400

ниш

TJO son

НО

Рисунок 10 Результат электрофоретичеекога разделения н 2.5 % геле асарозы фрагментов ДНК, полученных после ПЦР при использовании олнгонуклеотидньи праймеров, рассчитанных для района ОРТ BiOR-BHR VARV-IND, одновременно с прайм срам и для родос пецифич ной идентификации ортопоксвирусов

I. CPXV, штамм OPV-9I/1: 2. CPXV, штамм OPV-89/1, 3. CPXV, штамм OPV-89/5, 4 CPXV, штамм ЕР-2, 5 CPXV, штамм CPV-GR1; 6 CPXV, штамм CPV-Puma; 7 CPXV, штамм ВР-1;8. CPXV, штамм OPV-90/4, 9. VARV, штамм Itid3a, 10. VARV, штамм Ngami;l I VARV, штамм Buller, 12 VARV, штамм Brai.il-¡28; M. ДНК маркер, длина в ri.il. показана справа

На первом этапе рассчитали ол и гону клеоти дн ы е праймеры на консервативные, фланкирующие VАКУ-спенифичную вставку районы ОРТ В9Я, ОРТ ШЗК УАНЛ/-ШО. Результат амплификации в длинном ПЦР (ДПДР) показал, что штаммы вируса оспы коров ЕР-2 и ОРУ 91/! имеют наиболее протяженный участок генома по сравнению с другими представителями ортопоксвирусов (рисунок 11).

НЮ»

ÍWO МП

люа

JflW 1МЧ ЗИМ t.WO 1«Ю 750

да

Рисунок 11. Результат электрофоретнчеекого разделения в 0.7 % геле агарозы фрагметггов ДНК, полученных после 1.PCR, при использовании прайме ров, рассчитанных дли районов ШОК, Й13К VAR.-1ND фланкирующих VAftY-специфичную область VARV штамма Индия 1. VARV, штамм Ind3a, 2 VARV, штамм A slam; 3. VARV, штамм Brazil-128, 4 VARV, нп-амм Bia/il-131; 5. CPXV, штамм ЕР-2; (, CPXV, штамм OPV 91/1; 7. CMLV, штамм CP-1260, 8 CMLV, штамм CP-5, 9 CPXV, штамм GRJ-90; 10. CPXV, штамм Puma; 11 VACV, штамм WR, 12. VACV, штамм Elstree33-39; 13. MPXV, штамм CDC#V79-I-005; 14 MPXV, штамм CDC# V70-M87; M. ДНК маркер, длина в п.н. Показана справа.

Затем провели определение нуклеотидной последовательности данного района у двух штаммов CPXV ЕР-2 и OPV 91/1. Оказалось, что данный участок содержит протяженную непрерывную ОРТ длинной 5679 п.н. для штамма ЕР-2 и 5676 п.н. для штамма OPV 91/1. Секвенированные последовательности вирусного генома были депонированы в Международном банке данных EM13L под номерами AY519982 и AY519984, соответственно. ОРТ были названы B7.5R-ÉP-2 и B7.5R-OPV-91-1 в соответствии с номенклатурой, принятой для роференс штамма CP XV-ORI-90. Выяснилось, что короткие ОРТ таких ортопоксвирусов как VARV-India-1967 B10R и BUR и ОРТ VARV-Garcia-1966 H10R, i ¡1 1R и H12R, а также ОРТ вируса оспы верблюдов ш тамма CMS 182R, UÍ3R и 184R являются фрагментами более крупной расшифрованной нами последовательности гена B7.5R (рисунок 12} и имеют степень гомологии с

Г' "' -' ■' . ин

М.....1.....2 " J 4 Л. 7 8 9 10 И 12 13 14 М

" ■ Í; С"-"' ' ^

' А -i

■ ж ш «f ** ш

ШЛ '■''feC-.''--'' ' ■' ■ ' "Ч" ' IB

' '■■■'■ ' . ' . ■. . T?.

CPXV-EP-2

CPXV-91-1

VARV-IND

CMLV-CMS

CPXV-BRT

MPXV-ZAI

VACV-COP

5BR

B9R

A9R

' B10R BUR' —>

H10R H11R —> —> H12R

180R1181R —>

1$2R

133R

184R -> ->

185R 186R -> -

V192

vl93

V19i

B7R¿BR

261FT- iS2R ->

I ■ • • • ■ -f—

Рисунок 12 Графическое выравнивание районов вирусного генома CPXV, штаммы ЕР-2 (CPXV-EP-2), 91-1 (CPXV-91-1), GRI-90 (CPXV-GR1), Bnghton Red (CPXV-BRT), VARV, штаммы India-1967 (VARV-IND), Garcia-1966 (VARV-GAR), CMLV, штамм CMS (CMLV-CMS), MPXV, штамм Zaire-96-I-16 (MPXV-ZAI), VACV, штамм Copenhagen (VACV-COP), ECTV, штамм Moscow (ECTV-MOS) Стрелками обозначены направление и размер ОРТ Над стрелками приведены названия соответствующих ОРТ (ОРТ CPXV-EP-2, CPXV-91-1 обозначены в соответствии с названиями ОРТ CPXV-GRI) Прерывистыми линиями обозначены районы делеций в ДНК одних вирусов относительно других Уникальная видоспецифичная вставка в нуклеотидной последовательности ECTV-MOS (102 п н) обозначена черным прямоугольником

соответствующими районами данной ОРТ более 90%. Ранее эти районы для VARV считались уникальным» и использовалась при разработке молекулярных методов диагностики ортоп оке вирусов. На основании полученных данных секвенировапия, мы подобрали новые олигонуклеотидные праймеры для VAH.V. Н серии экспериментов установили новый оптимальный состав реакционной смеси с учетом новых олигонуклеотидов для VARV. Новый вариант МПЦР-анализа обеспечивал надежную одновременную детекцию и дифференциацию патогенных для человека VARV, MPXV, CPXV и VACV (рисунок 13) и был проверен на ДНК 59 штаммов 5 различных видов оргопоксвирусов.

Рисунок 13. Результат электрофоретического разделения в 2.5 % геле нгарозы фрагментов ДНК, полученных после ПЦР при использовании 4 пар олигонуклеотидных праймеров для видоспецифичной и одной нары - для родоеленифичной идентификации оргопоксвирусов

I. УАСУ, штамм ЫУР; 2. УАСУ, штамм Р<иша(1ап£ег, 3. УАСУ, штамм СУ1-78; 4. СРХУ, штамм ОРУ-91/1; 5, СРХУ, штамм 081-90; 6. СРХУ, штамм 1.Р-5; 7 СРХУ, штамм ЕР-'/, 8 СРХУ, штамм ОРУ-98/5; 9 УАЯУ, штамм Ы-За; 10 УАКУ, штамм Ви(!ег; П. МРХУ, штамм СЕО у79-1-005, 12. МРХУ, штамм СЕО у?8-]-3945, и. ЕСГУ, штамм Л1Р-1; ОКО -отрицательный контрольный образец; М. ДНК-маркер, длила й п.н. показана справа.

Конструирование положительного контрольного образца для разработанной методики видоспецифичкои диагностики о ртол оке вирусов

Для того чтобы иметь возможность максимально полно контролировать работу и снизить долю ошибочных результатов, необходимо иметь положительные и отрицательные контрольные образцы. Поэтому ¡¡а следующем этапе работы мы сконструировали положительный контрольный образец для разработанной методики МПЦР диагностики ортоп оке вирусов. ПКО содержит смесь 6 рекомбинантных плазм ид пых ДНК, пять из которых несут вставки, содержащие нуклеотидные последовательности видоспецифичных районов, используемых для видовой идентификации ортоп оке вирусов. Шестая ре комбинат пая плач ми да несет вставку, содержащую нуклеотидную последовательность района ОРТ Р41, УАСУ, используемого для родоспецифичной идентификации ортопоксвнрусов. Амплификация со смесью олигонуклеотидных праймеров для МПЦР на смеси ДНК шести полученных рекомбинантных плазмид покачала, что образуются ПЦР продукты, соответствующие расчетной длине для каждого вида ортопокевируеа и родо специфично го фрагмента ортопоксвнрусов {рисунок 14). Таким образом, смесь полученных рекомбинантных плазм ид можно использовать как положительный контрольный образец для разработанной методики видоспецифичной диагностики ортопоксвнрусов.

¡ЙЙ^

. ■ . , ж. л

н 5 % II п ¡3 ОКО м

Рисунок 14 Результат электрофоре™ чес ко га разделения в 2.5% гепе агарвоы фрагментов ДИК, полученных после ПЦР при использовании олигануклеотидных праймеров подобранных для яидоспецифичной и родоспецифичной идентификации ортопоксвнрусов на ДНК рекомбинантных плазмид и на ДНК разных штаммов ортолоксвирусов.

1.8 pBSK/VARV, VARV, штамм Ind-За, соответственно, с олигонуклеотидами рассчитанными для района ОРТ B11R-B13R VARV-IND,

2.9 pBSK/F4L, VACV, штамм WR, соответственно, с олигонуклеотидами рассчитанными на консервативный родоспецифичный район ОРТ F4L VACV-COP,

3, 10 pBSK/CPXV, CPXV, штамм GRI-90, соответственно, с олигонуклеотидами рассчитанными для района ОРТ B9R CPXV-GRI-90,

4, 11 pBSK/VACV, VACV, штамм WR, соответственно, с олигонуклеотидами рассчитанными для района ОРТ C9L VACV-COP,

5, 12 pBSK/MPXV-ЗА, MPXV, штамм CDC# V70-I-187, соответственно, с олигонуклеотидами рассчитанными для района ОРТ E5R MPXV-ZAI,

6, 13 pBSK/MPXV-ЦА, MPXV, штамм CDC# v79-I-005, соответственно, с олигонуклеотидами рассчитанными для района ОРТ E5R MPXV-ZAI,

ПКО — положительный контрольный образец (смесь 6 рекомбинантных плазмид pBSK/F4L,

pBSK/VARV, pBSK/MPXV-ЗА, pBSK/MPXV-ЦА, pBSK/CPXV, pBSK/VACV со смесью 5 пар

олигонуклеотидов для родоспецифичной и видоспецифичной идентификации

ортопоксвирусов - см по тексту),

ОКО - отрицательный контрольный образец,

М ДНК-маркер, длина в п н показана справа

Оценка чувствительности и специфичности метода МПЦР Диагностическую ценность разработанной методики определяли по таким характеристикам, как чувствительность и специфичность, которые, в свою очередь, делятся на аналитическую и диагностическую

Аналитическая специфичность оценивается при проведении ПЦР на панели образцов ДНК различных возбудителей Мы провели оценку разработанного метода МПЦР диагностики патогенных для человека ортопоксвирусов на панели образцов ДНК 59 штаммов 5 различных видов ортопоксвирусов, включая непатогенный для человека ECTV (таблица 2).

Таблица 2. Список штаммов Ортопоксвирусов, ДНК которых была использована в

мультиплексном ПИ Р-анализе

Вид Ортопоксвирусов Штамм Страна выделения Источник штамма или ДНК

Вирус осповакцины Подвид вируса осповакцины вирус оспы буйволов оспы кроликов ливп Россия 1

линп' Россия 1

ЕМ-63 Россия 1

CVI-78 Нидерланды 1

Elstree 3399 Нидерланды 1

Eistree 6664 Нидерланды 1

Patwadanger Индия 1

Chambon St-Yves Menard Франция 1

Western Reserve США 1

BP-1 Индия 1

Utrecht Германия 3

Вирус оспы коров GRI-90 Россия 1

Puma M-73 Россия 1

Ham-85 Германия 1

TypK-74 Туркмения 1

EP-1 Германия 1

EP-2 Германия 1

EP-3 Германия 1

EP-4 Германия 1

EP-5 Австрия 1

EP-6 Нидерланды 1

EP-7 Нидерлайды 1

EP-8 Германия 1

EP-267 Германия 1

OPV 89/3 Германия

OPV 89/4 Германия 3

OPV 90/1 Германия 3

OPV 90/5 Германия

OPV 91/1 Германия 3

OPV 98/5 Германия

OPV 89/1 Германия

OPV 89/5 Германия 3

OPV 91/3 Германия 3

Вирус оспы обезьян Zaire 96-1-16 Конго 2

Congo-8 Заир 2

CDOt V79-I-005 Заир 2

CDC# V97-I-004 Заир 2

CDC# V70-I-187 Либерия 2

CDC# V78-I-3945 Бенин 2

Zaire 1028" Заир 1

Вирус натуральной Ngami Танзания 1

оспы Kuw-5 Кувейт 1

Ind-3a Индия 1

12/62 Танзания 1

Congo-2 Конго 1

Congo-9 Конго 1

Semat Танзания 1

Butler Великобритания 1

M-Abr-60 Россия 1

M-Sok-60 Россия 1

M-Sur-60 Россия 1

Aslam"" Пакистан 1

India 164 Индия 1

India 387"" Индия 1

Brazil 128"" Бразилия 1

Nepal-89""" Непал 1

Khateen"" Пакистан 1

Вирус эктромелии MP-1 Германия

MP-2 Германия

4908 Нидерланды 3

33221 Нидерланды 3

Примечание

1 Коллекция ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», штаммы получены из лаборатории С С

Маренниковой (НИИ ВП РАМН, Москва)

2 Вирусы получены от Дж Эспозито (Атланта, США)

3 Вирусные ДНК получены от Г Мейера (Мюнхен, Германия)

* ДНК вируса осповакцины, выделенная из корочки, образовавшейся после вакцинации штаммом ЛИВП УАСУ

*" ДНК вируса оспы обезьян, выделенная из корочки больного оспой обезьян

ДНК вирусов натуральной оспы, выделенная из корочек больных оспой

Различные штаммы УАЯУ, МРХУ, СРХУ и УАСУ выли успешно идентифицированы в МПЦР. Все результаты амплификации соответствовали ожидаемым Подтверждающее определение нуклеотидной последовательности амплификационных продуктов, полученных в МПЦР на ДНК двух штаммов каждого вида УАЛУ, МРХУ, СРХУ и УАСУ показало, что последовательности нарабатываемых амплификационных продуктов идентичны

последовательностям диагностируемых ортопоксвирусов Для штаммов ЕСТУ в МПЦР выявляли только родоспецифичный фрагмент ДНК Используемая смесь пар праймеров не давала ПЦР продуктов при амплификации с ДНК неродственных поксвирусов - вирусов миксомы кролика и фибромы Шоупа (род Ьеропрохугих), вируса оспы кур (род Ачгрохтгнз) Также используемая смесь пар праймеров не давала ПЦР продуктов при амплификации на ДНК таких возбудителей как вирусы простого герпеса 1 и 2 типа, вируса ветряной оспы (таблица 3), Таким образом, аналитическая специфичность МПЦР в наших экспериментах составила 100 %

Таблица 3. Список штаммов различных вирусов, ДНК которых была использована в мультиплексном ПЦР-анализе__

Вирус Штамм Источник ДНК (от кого получены)

вирус миксомы кролика Lausanne G McFadden, Robarts Research Institute, London, Canada

вирус фибромы Шоупа Kasza D Evans, University of Guelph, Guelph, Canada

вирус оспы кур FP9 M Skinner, Institute of Animal Health, Newbury, UK

вирус простого герпеса I типа HF MA Суслопаров, ГНЦ ВБ "Вектор", Новосибирск, Россия

вирус простого герпеса II типа MS М А Суслопаров, ГНЦ ВБ "Вектор", Новосибирск, Россия

вирус ветряной оспы VZV №4 МА Суслопаров, ГНЦ ВБ "Вектор", Новосибирск, Россия

Диагностическая специфичность определяется процентным выражением частоты истинно отрицательных результатов теста у лиц, не страдающих данной болезнью Диагностическую специфичность оценивали на препаратах крови здоровых людей (цельная кровь и сыворотка крови человека) На ДНК, выделенной из 35 клинических образцов крови человека, неспецифические фрагменты в ПЦР не формировались Таким образом, диагностическая специфичность МПЦР в наших экспериментах составила 100 %

Аналитическая чувствительность применительно к ПЦР представляет собой то минимальное количество ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой Аналитическую чувствительность оценивали с помощью препарата ДНК вируса оспы коров, выделенного из очищенного в градиенте сахарозы СРХУ штамма СМ-90 с известным физическим и биологическим титром (таблица 4) С помощью МПЦР анализа мы провели серию с 2-кратным разведением препарата ДНК вируса оспы коров Каждое разведение проводили в трех повторах Предел детекции составил 103 в ч. в мл исходного образца или 33 БОЕ/мл Данный показатель отвечает требованиям, предъявляемым для диагностических тест систем согласно МУ 1 3 1794-03, в соответствии с которыми аналитическая чувствительность тест-систем для выявления ДНК (РНК) микроорганизмов методом ПЦР должна составлять 1 х 102- 1 х 104 м к (геномных эквивалентов)/мл

Таблица 4 Результаты титрования вируса оспы коров штамм СШ-90 различными методами_

Метод определения количества вируса Полученный титр

Титрование на монослое клеток Vero 3x10'БОЕ/мл

Подсчет при помощи электронной микроскопии 9х109вч/мл

Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора и оценивается в процентах Диагностическую чувствительность определяли в сравнении с культуральным методом на клиническом материале (корочки кожных поражений), полученном от людей, болевших в 1970-1975 г. натуральной оспой и оспой обезьян При использовании культурального метода ортопоксвирусы были выделены в пяти образцах из семи (таблица 5) Один из изолятов ранее ошибочно был отнесен к УАЯУ. При МПЦР-анализе материала клинических образцов во всех случаях была обнаружена и идентифицирована ДНК ортопоксвирусов Также разработанным методом МПЦР была идентифицирована ДНК, выделенная из корочки с кожного поражения человека, образовавшейся после вакцинации штаммом ЛИВП УАСУ в 2000 г Таким образом, диагностическая чувствительность МПЦР в наших экспериментах составила 100 %

Таблица 5 МПЦР-иденТифнкация VARV и MPXV из корочек кожных поражений больных людей

Вид вируса, изолят Форма хранения материала Титр исходного материала ООЕ/мг" МПЦР-идентификация

VARV, Aslam корочки 1 5x103 Родовая и видовая идентификация произведена

VARV, India 387 корочки 0 8х103 Родовая и видовая идентификация произведена

VARV, Brazil 128 корочки 5-10 Родовая и видовая идентификация произведена

VARV, Nepal-89 Корочки Вирус не выделен Родовая и видовая идентификация произведена

VARV, India 164 корочки Вирус не выделен Родовая и видовая идентификация произведена

VARV, Khateen корочки 5-10 Родовая и видовая идентификация произведена

MPXV, Zaire 1028 корочки Вирус выделен на 2-м пассаже Родовая и видовая идентификация произведена

Примечание

* Определен титрованием гомогената корочки на хорионаллантоисной мембране куриных эмбрионов

По результатам исследования разработана и зарегистрирована в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» нормативно-техническая документация на метод видоспецифичной экспресс диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов -УА11У, МРХУ, СРХУ и УАСУ на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции-

выводы

Показано, что некоторые штаммы вируса оспы коров в составе своего генома содержат протяженную последовательность ДНК (около 6 т п н ), сегменты которой имеются в геномах вирусов натуральной оспы и оспы верблюдов и которая отсутствует в ДНК вирусов оспы обезьян, осповакцины и многих штаммов вируса оспы коров В результате секвенирования этого района ДНК штаммов ЕР-2 и ОРУ 91/1 вируса оспы коров впервые обнаружена ранее неизвестная для изученных ортопоксвирусов открытая рамка трансляции размером 5679 и 5676 п н, соответственно.

Впервые разработан метод видоспецифичной экспресс диагностики вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины, использующий одностадийный анализ мультиплексной ПЦР, учитывающий все новейшие данные по структуре генома ортопоксвирусов и проверенный на ДНК 59 штаммов различных видов ортопоксвирусов Сконструирован положительный контрольный образец, состоящий из шести гибридных плазмид, и показана возможность его применения в разработанной методике МПЦР диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов

Определены основные аналитические характеристики разработанной методики МПЦР диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов, которые в условиях эксперимента составили

• аналитическая чувствительность - 103 в ч /мл,

• диагностическая чувствительность — 100 %,

• аналитическая специфичность -100%,

• диагностическая специфичность - 100 %

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гаврилова Е.В , Бабкин И В , Щелкунов С Н Мультиплексный ПЦР-анализ для видоспецифичной экспресс идентификации ортопоксвирусов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология - 2003. - № 1 - С. 45-51.

2. Shchelkunov S N, Gavrilova Е V, Babkin I.V. Multiplex PCR detection and species differentiation of orthopoxviruses pathogenic to humans // Molecular and Cellular Probes -2005 -V. 19.-P. 1-8.

3 Meyer H , Totmenin A V, Gavrilova E V, Shchelkunov S.N Variola and camelpox virus-specific sequences are part of a single large open reading frame identified in two German cowpox virus strains. // Virus Research - 2005 - V 108.-P 39-43

4 Gavrilova E.V , Shchelkunov S N Differential PCR diagnostic of smallpox, monkeypox, and cowpox viruses pathogenic for humans In. Proceedings of the Third World Congress on Chemical, Biological and Radiological Terrorism, Dubrovnik, 17-23 September 2005, Croatia -2006 -P 302-306.

5. Гаврилова E В, Щелкунов С H, Бабкин И В Способ и набор для видоспецифичной экспресс-идентификации ортопоксвирусов. // Патент РФ № 2230791 от 20 06 2004

6. Babkin I V., Gavrilova Е V, Shchelkunov S N Species-specific differentiation of orthopoxviruses using polymerase chain reaction // Xllth International Poxvirus and Iridovirus Symposium, Montpellier, France, September 2-6,2000, P. 34.

7 Meyer H, Totmenin A , Gavrilova E , Shchelkunov S Sequences considered to be variola and camelpox virus-specific are part of a large open reading frame identified m two German cowpox virus strains // In XVth International Poxvirus and Iridovirus Conference, Keble College, Oxford, England Sept 3-8, 2004 P. 111.

8 Meyer H, Totmenin A , Gavrilova E, Shchelkunov S Sequences considered to be variola and camelpox virus-specific are part of a large open reading frame

identified in two German cowpox virus strain // Biological Medical Defense Conference 2004 Munich, Germany. October 20-21, 2004. P 99.

9 Gavnlova E.V., Babkin I V, Shchelkunov S N Multiplex PCR detection and species differentiation of orthopoxviruses pathogenic to humans // Всероссийская конференция "Фундаментальные науки-медицине", Новосибирск, 4-8 сентября, 2005, С 84

10 Гаврилова ЕВ, Щелкунов СН. Метод видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции // В кн II Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность» Москва, 20-21 окт 2005. С 105

11 Гаврилова Е В, Щелкунов С.Н Метод видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции // Российская научно-практическая конференция "Генодиагностика инфекционных болезней" Новосибирск, октябрь, 2005, С. 97-98

Гаврилоеа Елена Васильевна РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВИДОСПЕЦИФИЧНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОРТОПОКСВИРУСОВ, ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА, НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР

Автореф дисс на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 05 04 2007 Заказ № 34 Формат 60x90/16 Уел печ л 1 Тираж 100 экз Типография Института катализа им Г К Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гаврилова, Елена Васильевна

1. Список используемых сокращений

2. Введение

3. Обзор литературы

3.1. Краткая характеристика ортопоксвирусных инфекций человека

3.1.1. Вирус осповакцины

3.1.2. Вирус оспы коров

3.1.3. Вирус оспы обезьян

3.1.4. Вирус натуральной оспы

3.2. Современные молекулярно-диагностические методы в диагностике 19 ортопоксвирусных инфекций на основе ПЦР

3.2.1. ПДРФ анализ

3.2.2. Олигонуклеотидные микрочипы

3.2.3. ПЦР в реальном времени

3.3. Мультиплексная ПЦР

3.3.1. Применение метода МПЦР в диагностике вирусных нейроинфекций

3.3.2. Применение метода МПЦР в диагностике респираторно-вирусных 35 инфекций

3.3.3. Применение метода МПЦР в диагностике урогенитальных инфекций

3.3.4. Применение метода МПЦР в NAT-скрининге донорской крови

3.3.5. Перспективы применения метода МПЦР в диагностике ортопоксвирусных 43 инфекций человека

4. Материалы и методы

4.1. Материалы

4.2. Выделение ДНК вирусов оспы коров или осповакцины из инфицированной 46 клеточной культуры

4.3. Компьютерный анализ

4.4. Амплификация ДНК

4.5. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля при помощи набора QIAquick 48 фирмы «QIAGEN», Германия

4.6. Секвенирование ДНК

4.7. Приготовление компетентных клеток E.coli

4.8. Трансформация компетентных клеток E.coli

4.9. Выделение плазмидной ДНК в препаративном варианте

4.10. Выделение плазмидной ДНК в аналитическом варианте

4.11. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции

4.12. Лигирование

4.13. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот в агарозном геле

5. Результаты и обсуждения

5.1. Выбор олигонуклеотидных праймеров для мультиплексного ПЦР

5.2. Исследование ДНК VARV-специфичного района генома CPXV

5.3. Конструирование положительного контрольного образца для разработанной 81 методики видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов

5.4. Оценка специфичности метода МПЦР

5.5. Оценка чувствительности метода МПЦР

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка метода видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе использования мультиплексной ПЦР"

Оспа обезьян у человека по характеру клинического течения напоминает тип натуральной оспы, преобладавшей на Африканском континенте, и регистрируется, в основном, в Центральной и Западной Африке. Летальные случаи, а также случаи передачи инфекции от человека к человеку, наблюдались главным образом среди невакцинированного населения.

Оспа коров у человека, в основном, протекает доброкачественно и характеризуется развитием единичных местных поражений. У иммунодефицитных людей может приобретать генерализованную форму с летальным исходом. Заболевание регистрируется в большинстве стран Европы и некоторых странах восточной Азии и Латинской Америки. Источником инфекции для человека являются грызуны (основной природный резервуар вируса) или домашние животные (промежуточный хозяин).

Широкомасштабные мероприятия, предпринятые мировым сообществом под эгидой Всемирной организации здравоохранения по вакцинопрофилактике населения Земного шара против натуральной оспы, привели к ликвидации этого заболевания на планете (Маренникова и Щелкунов, 1998). В настоящее время коллекции вирусов натуральной оспы поддерживаются только в двух сотрудничающих центрах ВОЗ: в ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово, Россия) и в Центре по контролю и профилактике заболеваний (CDC, Атланта, США). Врезультате повсеместного прекращения после 1980 года иммунизации против VARV доля населения, чувствительного к VARV и другим ортопоксвирусам, постоянно увеличивается. Об этом свидетельствует участившиеся вспышки инфицирования людей такими вирусами, как вирус оспы обезьян и вирус оспы коров (Stephenson, 2003; LewisJones, 2004). Кроме того, VARV рассматривают как возможный агент биотеррористических атак (Онищенко и др., 2000; Spencer and Lightfoot, 2001; Breman and Henderson, 2002).

Потенциальное увеличение опасности ортопоксвирусных инфекций для человека привело к необходимости разработки эффективных методов быстрой диагностики и идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека. Используемые биологические и серологические методы оказываются недостаточно эффективными для детекции и экспресс-диагностики в том плане, что биологический анализ длителен (3-6 суток) и сопряжен с необходимостью работы с опасными вирусами. Серологические методы позволяют идентифицировать, как правило, только родовую принадлежность вирусов, и их чувствительность не всегда достаточна при анализе клинических образцов. Это обстоятельство делает актуальным разработку комплекса методов современной экспресс диагностики патогенных для человека ортопоксвирусов.

Появление метода амплификации фрагментов ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) создало предпосылки к разработке вариантов процедур экспресс идентификации ортопоксвирусов. В настоящее время описано применение ПЦР для детекции ортопоксвирусов с использованием единых олигонуклеотидных праймеров к району генов, кодирующих гемагглютинин, белок тел включения типа А и гомолог рецептора фактора некроза опухолей (Ropp el al., 1995; Meyer el al., 1997; Loparev el al, 2001). Во всех этих работах полученные после ПЦР фрагменты ДНК гидролизовали определенными рестриктазами и разделяли электрофорезом, что позволяло по картине расположения субфрагментов осуществлять видовую идентификацию ортопоксвирусов. Однако при анализе достаточно большого набора изолятов какого-либо вида ортопоксвирусов, выявлялась их гетерогенность по спектру получающихся субфрагментов, что вносило неоднозначность в трактовку получаемых результатов.

На основе полученных в нашем отделе и других лабораториях данных о геномных последовательностях ортопоксвирусов, возникла возможность выявления видоспецифичных районов ДНК этих вирусов и разработки простой и надежной методики одностадийной экспресс идентификации четырех видов ортопоксвирусов, патогенных для человека, основанной на применении мультиплексной полимеразной цепной реакции (МПЦР).

Цели и задачи исследования.

Цель работы: Разработка одностадийного метода видоспецифичной диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов - вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины - на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции.

Основные задачи исследования:1. Подобрать олигонуклеотидные праймеры для мультиплексного ПЦР, обеспечивающие видоспепифичную амплификацию ортопоксвирусных ДНК и образующих в МПЦР продукты разной длины, характерные для каждого вида ортопоксвируса.

2. Оптимизировать параметры МПЦР с выбранными олигонуклеотидами.

3. Сконструировать положительный контроль методики МПЦР диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов на основе клонированных специфичных ДНК-ампликонов.

4. Определить основные аналитические и диагностические характеристики разрабатываемой методики видоспецифичной диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов методом МПЦР.

Научная новизна и практическая ценность работы.

1. Обнаружена новая ранее неизвестная открытая рамка трансляции "VARV-подобного" района ортопоксвирусов у некоторых штаммов CPXV. Проведено определение нуклеотидной последовательности и компьютерный анализ данной ОРТ у двух штаммов CPXV: OPV-91/1 и ЕР-2.

2. Впервые осуществлен выбор олигонуклеотидных праймеров для детекции и дифференциации четырех патогенных для человека видов ортопоксвирусов VARV, MPXV, CPXV и VACV.

3. Разработан метод видоспецифичной экспресс диагностики ортопоксвирусов патогенных для человека, использующий одностадийный анализ МПЦР, учитывающий все новейшие данные по структуре генома ортопоксвирусов и проверенный на ДНК 59 штаммов различных видов ортопоксвирусов.

4. Показана эффективность использования МПЦР при анализе клинического материала - корочек с кожных поражений людей, болевших в 1970-1975 г. натуральной оспой, оспой обезьян и корочки с кожного поражения человека, образовавшейся после вакцинации штаммом ЛИВП VACV в 2000 г.

5. По результатам исследования разработана нормативно-техническая документация на метод видоспецифичной экспресс диагностики четырех патогенных длячеловека ортопоксвирусов - VARV, MPXV, CPXV, VACV на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции.• Лабораторный регламент на производство тест-системы для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (J1P № 00105664012-06);• Технические условия на производство тест-системы для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ТУ 4354-00105664012-06);• Инструкция по применению тест-системы для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной полимеразной цепной реакции;Вклад автора.

Поиск и компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей видоспецифичных районов геномов VARV, MPXV, CPXV и VACV выполнен автором при участии И.В. Бабкина. Секвенирование "VARV-подобного" района генома двух штаммов CPXV: CPV-OPV-91/1 и CPV-EP-2 выполнено лично автором. Разработка метода диагностики и конструирование положительного контроля методики МПЦР на основе клонированных специфичных ДНК-ампликонов выполнены лично автором. Разработка нормативно-технической документации на метод видоспецифичной экспресс диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов - VARV, MPXV, CPXV, VACV на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции выполнено лично автором. Выделение препаратов ДНК вируса натуральной оспы проводилось в лаборатории 4-го уровня биобезопасности ГНЦ ВБ «Вектор» И.В. Бабкиным, М.В. Михеевым и И.Н. Бабкиной.

Апробация работы.

По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в реферируемых научных журналах, получен патент РФ. Результаты работы были представлены на международных конференциях: Xllth International Poxvirus and Iridovirus Symposium (Montpellier, France, 2000), 2nd Meeting of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Switzerland, Geneva, 2001), International Congress "Progressive scientific technologies for human health" (Feodosia, Ukraine, 2003), XVth International Poxvirus and Iridovirus Conference (Oxford, England, 2004), Biological Medical Defense Conference 2004 (Munich, Germany, 2004), II Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва,Россия, 2005), Third World Congress on Chemical, Biological and Radiological Terrorism (Dubrovnik, Croatia, 2005).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Метод, позволяющий в одну стадию мультиплексной полимеразной цепной реакции детектировать и дифференцировать все четыре вида ортопоксвирусов, патогенных для человека: вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины. Метод, в условиях проведенных экспериментов, имеет следующиеY ЯПЯТСТРПИГТИ vu •—j-----.j------—.• аналитическая чувствительность -10 в.ч. в мл исходного образца;• диагностическая чувствительность - 100 %;• диагностическая и аналитическая специфичность - 100 %.

2. Данные по определению нуклеотидной последовательности новой, ранее неизвестной открытой рамки трансляции в "VARV-подобном" районе генома двух штаммов CPXV: OPV-91/1 и ЕР-2.

3. Пакет нормативных документов:• Лабораторный регламент на производство тест-системы для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (J1P № 00105664012-06);• Технические условия на производство тест-системы для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ТУ 4354-00105664012-06);• Инструкция по применению тест-системы для выявления ДНК вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины методом мультиплексной полимеразной цепной реакции;3. Обзор литературы3.1 Краткая характеристика ортопоксвирусных инфекций человекаРод Orthopoxvirus семейства Poxviridae в соответствии с современной классификацией включает 9 видов вирусов: вирус натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины, оспы верблюдов, оспы мышей, поксвирус енотов, татера поксвирус, поксвирус полевки (Virus Taxonomy, 2000). Четыре из них, такие как: вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, и осповакцины являются патогенными для человека. Поксвирусы являются самыми крупными вирусами позвоночных, вирионы которых, после фиксации и окраски препаратов, можно увидеть в световой микроскоп. Вирионы ортопоксвирусов обычно кирпичеобразной формы и имеют размеры 220-450x140-260х140-260 нм (Virus Taxonomy, 2000). Геном поксвирусов представлен линейной двухцепочечной ДНК с ковалентно замкнутыми концами, называемыми шпильками или теломерами (Мареникова и Щелкунов, 1998). Размер ДНК ортопоксвирусов варьирует от 175 до 230 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) в зависимости от вида и штамма вируса. Ортопоксвирусный геном кодирует около 200 полипептидов. Гены у данных вирусов подразделяются по времени экспрессии на ранние, промежуточные, поздние, а также экспрессируемые в течение всего цикла развития вируса — ранне-поздние (Moss, 1990). Ранняя транскрипция происходит сразу после вхождения вириона в клетку и осуществляется вирион-ассоциированной РНК-полимеразой. В инфицированных клетках, жизненный цикл поксвирусов проходит в цитоплазме (Moss, 1992). Вирусы передаются воздушно-капельным, воздушно-пылевым или контактно-бытовым путями. В организм вирусы проникают через слизистые оболочки рта, носа, глотки, а также через кожу при наличии микроскопических нарушений ее целостности. Затем, по лимфатическим путям он проникает в регионарные лимфоузлы, где происходит его репликация, после чего вирус появляется в свободных макрофагах лимфоидной системы. Дальнейшее распространение вируса по организму происходит преимущественно по лимфатической системе, а также в результате кратковременной первичной веримии (при воздушно-капельном пути передачи, первичная веримия происходит в клетках слизистой оболочки верхних и нижних отделов дыхательных путей). Накопившийся и освободившийся вирус попадает в кровоток (вторичная веримия) и с ним в кожу, почки, ЦНС и другие органы. Вирусы обладают значительной устойчивостью во внешней среде. Иммунологически патогенные для человека ортопоксвирусы близки друг к другу, в тоже время по контагиозности, патогенности, и другим показателям вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины разительно отличаются друг от друга.

3.1.1. Вирус осповакциныВирус осповакцины является прототипным видом рода Orthopoxvirus. Он наиболее хорошо изучен среди всех представителей этого рода. Свое название получил от variola vaccinae (от латинского слова vacca - корова). Длительная, сложная и во многом недостаточно ясная история получения штаммов вируса осповакцины, и их использования для прививок, привела к достаточно неожиданным результатам. После появления метода культивирования вирусов на куриных эмбрионах, расширившего возможности их изучения, удалось показать, что вирус, выделенный от людей больных оспой коров, существенно отличается по ряду важных свойств от использовавшегося для прививок вируса осповакцины. С этого времени вирус оспы коров и вирус осповакцины стали рассматриваться как самостоятельные виды рода ортопоксвирусов (Маренникова и Щелкунов, 1998).

Природный резервуар вируса осповакцины не известен, однако это не помешало широчайшему и повсеместному его применению в виде оспенной вакцины для борьбы с оспой и ее ликвидации. Многие ученые уверены, что природного резервуара не существует вообще и вирус существует только как лабораторный штамм.

По современной классификации, вирус осповакцины включает в себя два подвида -вирус оспы буйволов и вирус оспы кроликов (Virus Taxonomy, 2000).

После провозглашения ВОЗ о глобальной ликвидации оспы, массовая вакцинация против данного заболевания с 1980 года была прекращена. Одной из основных причин отмены противооспенной вакцинации являлись наличия поствакцинальных осложнений, в ходе которых иногда погибали здоровые до прививки люди.

К осложнениям относятся: генерализованная и прогрессирующая вакцины, вакцинальная экзема, поствакцинальный энцефалит, серозный менингит, обострение соматических заболеваний.

После отмены вакцинации к настоящему времени сформировалась большая прослойка людей, восприимчивых к VARV, что может привести к тяжелым эпидемиологическим последствиям в связи с часто рассматриваемой в последнее время угрозы использования VARV в качестве биологического оружия (Онищенко и др., 2000; Spencer and Lightfoot, 2001; Breman and Henderson, 2002). Осознание потенциальной угрозы привело многих исследователей к активизации исследований по разработке противооспенных вакцин нового поколения (Wiser et al., 2007), а также разработке противовирусных препаратов (De Clercq, 2001; De Clercq, 2002; Bray and Roy, 2004; Stittelaar et al., 2006) для обеспечения незамедлительного лечения или защиты против патогенных для человека ортопоксвирусов (VARY, MPXV и др.).

3.1.2. Вирус оспы коровОспа коров - зоонозная инфекция. Предполагают, что естественным хозяином для CPXV является широкий круг представителей отряда грызунов. С 1970-х годов в различных частях Европы и бывшего Советского Союза было выделено множество штаммов вируса оспы коров от коров (Dekking, 1964), домашних кошек (Bennet et al., 1986), белых крыс (Marennikova et al., 1978), многих видов экзотических животных в зоопарках и пипках (Marennikova et а!., 1977; Baxby et al., 1982). Их удалось выделить не только от больных животных с генерализованной сыпью и гнойничковыми поражениями кожи, но и от внешне здоровых грызунов (Marennikova et al., 1978). У последних установлено постинфекционное вирусоносительство с выделением вируса во внешнюю среду, что наблюдается как при бессимптомной инфекции (при инфицировании малыми дозами), так и у реконвалесцентов после перенесенного заболевания. Данное обстоятельство, несомненно, способствует выживанию вируса в природной среде (Маренникова и Щелкунов, 1998).

Оспа коров - инфекционное заболевание с инкубационным периодом 3-6 дней. В большинстве случаев заболевание у человека протекает в виде местных поражений на кистях рук, предплечьях и лице. Значительно реже наблюдается развитие оспин на слизистых оболочках рта, зева, носа, глотки, на конъюнктиве глаза (Маренникова и Щелкунов, 1998). Заболевание выражается в появлении на коже плотных папул медно-красного цвета величиной с рисовое зерно, которые проходят стадию везикулы, пустулы и стадию образования корок (Маренникова и Щелкунов, 1998). Корочки отпадают на 3-4 неделе заболевания. Иногда болезнь сопровождается лимфангоитом, лимфаденитом, а также повышением температуры тела и общим недомоганием. Особенно тяжело коровья оспа протекает у лиц, страдающих различными кожными заболеваниями (экземой, экссудативным диатезом и др.) (Ладный, 1976). В этих случаях заболевание может протекать в форме тяжелого генерализованного процесса (Bjornberg and Bjornberg, 1956; Жукова, 1993). Сначала оспенные элементы появляются на руках, а затем через 4-20 дней сыпь появляется на лице, туловище и ногах. Иногда у таких больных заболевание может закончиться летальным исходом (Eis-Htibinger et al., 1990; Czerny et al., 1991). Из осложнений коровьей оспы следует отметить энцефалит, кератит, абсцессы, флегмоны.

Передача оспы коров от человека к человеку наблюдается очень редко и происходит только при тесном контакте с больным. Имеются данные о передаче инфекции от грызунов (белых крыс) (Wolfs et al., 2002) и кошачьих (домашние кошки)(Czerny et al, 1991; Жукова, 1993; Stolz et al., 1996; Stewart et al, 2000; Feuerstein-Kadgien and Korn, 2003).

При дифференциальном диагнозе коровьей оспы у людей следует иметь в виду ветряную и натуральную оспу, импетиго, пемфигус, пустулезную форму сифилиса, заболевания, вызванные парапоксвирусами (узелки доильщиц) (таблица 1).

Лечение симптоматическое. В тяжелых случаях может применяться специфическое лечение (введение противооспенного гаммаглобулина).

Циркуляция випуся оспы коров в природе в диких и домашних животных, ка фоке общего падения иммунитета к VARV, может привести к увеличению случаев оспы коров, что особенно опасно в связи с возможным развитием генерализованной инфекции у лиц, страдающих экссудативным диатезом, экземой и другими заболеваниями кожных покровов, а также лиц, с нарушениями иммунной системы (иммунодефицитами).

Таблица 1. Этиологические инфекционные агенты экзантемы с папуловезикулезными (А) и макулопапулезными поражениями (В) (Breman, 2000; Богданов, 2005) АПапуловезикулезные поражения Заболевание Инфекционный агентВетреная оспа, опоясывающий лишай Varicella-zoster virusНетипичная корь Measles virusВакцинальная экзема, генерализованная Vaccinia virusвакцина Оспа обезьян человека Monkeypox virusОспа коров человека Cowpox virusГерпетическая экзема Herpes simplex virusЗаболевание рука-нога-рот Coxsackieviruse A-16Фрамбезия - пустулезная форма сифилиса Treponema pertenueЭпидемическая пузырчатка StaphylococcusКонтагиозное импетиго Staphylococcus aureus и StreptococcusЛекарственная экзантема НетКрапивница НетВ Макулопапулезные поражения Заболевание Инфекционный агентИнфекционная эритема Parvovirus В19Корь Measles virusКраснуха Rubella virusИнфекционный мононуклеоз HHV (Epstein-Barr)Скарлатина Streptococcus pyogenesВнезапная экзантема-БиЬкит Herpes virus - 6Слизисто-кожный лимфоузелковый синдром (синдром Кавасаки) Этиология неизвестнаЛекарственная экзантема Нет3.1.3. Вирус оспы обезьянОспа обезьян - зоонозная инфекция, циркулирующая в тропических лесах Центральной и Западной Африки. Инфекционным агентом является вирус оспы обезьян.

Вирус оспы обезьян так назван потому, что впервые был выделен от обезьян во время нескольких вспышек оспоподобного заболевания между 1958-1968 г. в зоопарках и в лабораториях нескольких стран. В 1970 г. была впервые подтверждена возможность инфекции этим вирусом человека (Ladnyi el al, 1972; Marennikova et al, 1972). С момента открытия оспы обезьян у человека случаи этого заботтеияния у людей регулярно регистрировали в Африке (Breman, 2000; Hutin et al., 2001; Meyer et al., 2002; Learned et al., 2005; Damon et al, 2006). В 2003 году вспышка оспы обезьян у людей была впервые зафиксирована вне африканского континента - в США (CDC, 2003а). Клинические признаки оспы обезьян сходны с таковыми натуральной оспы, преобладавшей на Африканском континенте: головная боль, слабость, боли в мышцах, характерная сыпь. Инкубационный период длится 10-14 дней. Отличительной особенностью от натуральной оспы являются лимфадениты, которые наблюдаются у более 85 % заболевших (Маренникова и Щелкунов, 1998). Летальность при оспе обезьян, установленная по результатам изучения 300 случаев в ходе специального проекта ВОЗ (1981-1986) составила 9.8 %, что сравнимо с VARV major (Shchelkunov et al., 2005).MPXV, являясь зоонозом, широко представлен в природном резервуаре, что является угрозой для человека во время вероятного контакта людей с животным. Основываясь на филогенетическом анализе нуклеотидных последовательностей различных штаммов MPXV, последние делятся на две группы: штаммы, циркулирующие в Центральной Африке и штаммы, циркулирующие в Западной Африке (Zdenek and Fenner, 1988; Douglass et al., 1994; Likos et al., 2005; Shchelkunov et al, 2005). Из 418 случаев оспы обезьян зарегистрированных в период 1970-1995 г., 388 (92.8 %) отметили в Демократической Республике Конго. Смертельные случаи были зарегистрированы только в странах Центральной Африки (Zdenek and Fenner, 1988; Breman, 2000; Hutin et al, 2001; Meyer et al, 2002). Считается, что штаммы, циркулирующие в Западной Африке являются более аттенуированными по сравнению с центральноафриканскими (Chen et al, 2004; Likos et al, 2005; Shchelkunov et al, 2005). На примере вспышки оспы обезьян в США в 2003 году, было доказано, что вирус оспы обезьян, завезенный с инфицированными грызунами из Ганы, относился к группе Западно-Африканских штаммов (Reed et al., 2004). Именно это объясняет отсутствие смертельных случаев среди 73 человек, перенесших оспу обезьян во время данной вспышки. Вероятно, завоз в какие-либо страны центральноафриканского варианта MPXV может привести к вспышкам инфекционногозаболевания среди людей с более тяжелыми последствиями. Поэтому необходимо осуществлять тщательный контроль всех животных, вывозимых из Африки на другие континенты, на зараженность их ортопоксвирусами.

Вирус оспы обезьян циркулирует среди различных видов дикоживущих грызунов и приматов, обитающих преимущественно в зоне влажных тропических лесов Центральной и Западной Африки. К настоящему времени имеются свидетельства, подтверждающие, что некоторые виды белок и обезьян играют роль в циркуляции вируса оспы обезьян и являются источником первичного заражения вследствие прямого контакта с ними человека (Shchelkunov et al., 2005). В 2003 году во время вспышки оспы обезьян в США, также были открыты ранее неизвестные источники вируса оспы обезьян - животные рода Cynomys sp. и Cricetomys emini (CDC, 2003a). Источником заражения оспой обезьян может явиться и больной этой инфекцией человек (Shchelkunov et al., 2005).

Ранее считалось, что оспа обезьян с гораздо меньшей эффективностью передается от человека к человеку, чем натуральная оспа. Однако, постепенное накопление данных, приводит к необходимости пересмотреть представления о ней, как о малоконтагиозной инфекции. Так, во время вспышки оспы обезьян в провинции Восточный Касаи количество заболевших в результате передачи инфекции от человека к человеку составило 73 % (Weekly Epidemiological Record, 1997). При этом число генераций в цепи передачи инфекций от человека к человеку достигало 8. Основной особенностью вспышки оспы обезьян в Конго в 2003 году также являлась передача инфекции от человека к человеку, с наличием, как предполагают, 7 генераций (Learned et al., 2005). Проведенный в центре ВОЗ анализ нуклеотидных последовательностей видоспецифических участков ДНК (в частности гена, кодирующего TNF рецептор) не выявил существенных отличий штаммов вируса оспы обезьян 1996 г. от ранее выделенных (Mukinda et al., 1997). Видимо основной причиной изменения ситуации является снижение уровня коллективного иммунитета к оспе после полного прекращения вакцинации в 1980 г. Так, все инфицированные во время вспышки в Конго в 2003 г. были младше 18 лет (Learned et al., 2005).

Множество инфекций, приводящих к образованию папуловезикулезной и макулопапулезной сыпи могут иметь сходство с оспой обезьян (таблица 1). Наиболее часто ошибочно диагностируют атипичные или тяжелые случаи ветряной оспы (varicella-zoster virus).

3.1.4. Вирус натуральной оспыВирус натуральной оспы является строгим антропонозом. По общепринятой классификации штаммы вируса натуральной оспы разделяют на два эпидемиологических типа: вирусы большой оспы (variola major) с летальностью во время вспышки заболевания натуральной оспы от 5 до 40% и вирусы малой оспы (variola minor) с меньшей летальностью. Малую оспу в Южной Америке принято называть alastrim в отличие от Африки, где за ней сохранилось наименование variola minor (Fenner et al., 1989; Virus Taxonomy, 2000).

Клинические проявления большой оспы многообразны. Инфекция может протекать в виде оспенной пурпуры - это острая форма заболевания, приводящая к смерти в течение нескольких дней. Встречаются доброкачественные варианты течения болезни в форме вариолоида или оспы без сыпи. Всего различают пять клинических форм натуральной оспы: дискретная, сливная, геморрагическая, вариолоид и натуральная оспа без сыпи (Методические рекомендации, 2006). Такое разнообразие форм течения натуральной оспы, полагают, связано с состоянием иммунитета человека в момент заражения. Инкубационный период у большинства больных равен 7-9 дням. Далее наступает продромальный период (до появления температуры), который, как правило, сохраняется 1 -3 дня и сопровождается головной болью, слабостью, бессонницей, тошнотой, болями в мышцах и суставах. Далее следует лихорадочный период. На 3-4 сутки от начала лихорадки появляются папулезные высыпания (истинная сыпь - основное клиническое проявление оспы), которые проходят стадию папулы, везикулы, пустулы и стадиюобразования корок. Оспа относится к высококонтагиозным болезням. Для variola major инфекционность в среднем составляла для восприимчивых лиц при тесном контакте 58.4% (Маренникова и Щелкунов, 1998). По материалам программы ликвидации оспы установлено, что в среднем один больной заражал пять человек, хотя нередко эта цифра могла быть значительно больше. Вакцинация против оспы резко снижает восприимчивость к инфекции. В этом случае заразительность уменьшается до 3.8 %.

Клиническая диагностика оспы при типичных формах: дискретной, сливной, гемоппягической с наличием сыпи ставится при динамическом наблюдении за больным и процессе развития сыпи. Крайне затруднен диагноз при вариолоиде и оспе без сыпи (Методические рекомендации, 2006).

Ранее, вариолоид часто принимался за ветряную оспу, acne vulgaris, импетиго, и другие инфекционные заболевания (таблица 1). К этому добавляется и то обстоятельство, что современное поколение врачей-инфекционистов не встречалось с оспой, и знают о ней лишь из учебников и руководств. Все это может привести к тому, что в результате неправильно установленного первоначального диагноза своевременно не будет принят необходимый комплекс противоэпидемических мероприятий, и инфекция начнет свободно распространяться. В связи с этим особое значение приобретают методы лабораторного диагноза, позволяющие дать ответ вне зависимости от клинического опыта врача. Применяемые на современном этапе методы диагностики оспы должны обладать помимо быстроты ответа высокой чувствительностью, гарантирующей обнаружение вируса в материалах с малым его содержанием, что нередко встречается при атипичном течении оспы, дающей лишь единичные кожные элементы. Наряду с этим, лабораторная диагностика должна располагать приемами, обеспечивающими надежную дифференциацию вируса оспы от некоторых сходных с ней заболеваний, и в том числе осложнений после вакцинации. Как известно, выявление случаев оспы почти автоматически влечет за собой целый ряд противоэпидемических мер, поэтому важно не просто дать ответ, имеется или отсутствует оспенный вирус, но и с максимально возможной широтой дать ответ каким вирусом вызвано данное экзантемное заболевание. Это особенно актуально, в свете рассматриваемой возможности применения VARV как потенциального оружия биотеррористов.

Появление метода амплификации фрагментов ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) создало предпосылки к разработке вариантов процедур экспресс идентификации ортопоксвирусов. Данный метод позволяет проводить детекцию вирусов непосредственно в клинических материалах без предварительного этапа наработки. Являясь простым, быстрым и точным методом, ПЦР-диагностика ортопоксвирусныхинфекций в настоящее время получила широкое развитие (Ropp et al., 1995; Ibrahim et al., 1997; Meyer et al, 1997; Loparev et al, 2001; Lapa et al., 2002; Михеев и др., 2003; Ibrahim et al, 2003; Olson et al., 2004; Ryabinin et al., 2006).

3.2. Современные молекулярно-диагностические методы в диагностике ортопоксвирусных инфекций на основе ПЦР3.2.1. ГГДРФ анализMeyer et al. (1994) для дифференциации ортопоксвирусов (вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, оспы верблюдов, осповакцины, оспы мышей) разработали метод на основе ПЦР в районе гена, кодирующего белок тел включения типа A (ATI), с последующим гидролизом амплификационных продуктов эндонуклеазой рестрикции. В результате ПЦР с одной парой олигонуклеотидных праймеров получали фрагменты ДНК, имеющие размер, свойственный каждому виду ортопоксвирусов (благодаря наличию видоспецифичных делеций в данном районе генома этих вирусов), кроме вируса оспы коров, электрофореграммы которого отличались у различных штаммов. На следующем этапе ампликоны гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Bglll, и полученные спектры субфрагментов были специфичны для каждого изученного вида. Однако для разных изолятов вируса оспы коров наблюдали различия в получаемом спектре рестрикционных фрагментов. В дальнейшем, эта пара праймеров была использована для исследования в ПЦР более широкого спектра штаммов и видов ортопоксвирусов, включая поксвирус енотов, поксвирус полевки и поксвирус скунсов (Meyer et al., 1997). Наблюдался выраженный полиморфизм длин амплификационных фрагментов, за исключением поксвируса енотов, для которого ампликон не был получен. При этом выявили полиморфизм длин между различными штаммами внутри таких видов как вирус оспы обезьян (1517 и 1067 п.н.) и вирус оспы коров (1673 и 1701 п.н.). Кроме того, из-за протяженных делеций в гене, кодирующего ATI, данным методом невозможно было амплифицировать ДНК высокоаттенуированного штамма MVA и штамма Copenhagen вируса осповакцины. Последующий гидролиз амплификационных продуктов эндонуклеазой рестрикции Xbal позволял получить отличающиеся профили субфрагментов для каждого исследуемого вида ортопоксвирусов. Однако, при этом, также наблюдали различия рестрикционных профилей для разных изолятов вируса оспы коров.

В силу своей вариабельности ген, кодирующий ATI является привлекательным кандидатом для разработки видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов, что еще раз было продемонстрировано в следующем исследовании (Neubauer et al., 1997) по созданиюметода, позволяющего идентифицировать вирус эктромелии. Проанализировав в ПЦР при использовании специфической пары праймеров 20 штаммов пяти различных видов ортопоксвирусов, амплификацию наблюдали только для штаммов вируса эктромелии. Для дополнительной надежности ПЦР-продукт длиной Ибп.н. гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Hindll.

В работе (Neubauer et al., 1998), также на основе гена, кодирующего ATI, была рассчитана пара праймеров для видоспецифичной детекции вируса оспы обезьян. 19 штаммов вируса оспы обезьян были идентифицированы амплификацией продукта длиной 601 п.н., специфичность которого подтверждали гидролизом эндонуклеазой рестрикции BglU на три субфрагмента. Для остальных изученных видов ортопоксвирусов амплификацию в такой реакции ПЦР не наблюдали.

Полноразмерный ген, кодирующий белок тел включений типа А, среди ортопоксвирусов содержат лишь вирусы оспы коров и эктромелии (оспы мышей), а другие виды (вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы верблюдов и осповакцины) содержат укороченные формы данного гена как результат специфичных для каждого вида делеций. Такая гипервариабельность гена может мешать эффективной и аккуратной ПЦР диагностике на основе его последовательности. Так, например, Meyer et al. (1997) показали, во-первых, невозможность идентификации некоторых штаммов ортопоксвирусов (VACV) и во вторых, гетерогенность в образующихся ПЦР-продуктах внутри одного вида некоторых ортопоксвирусов (MPXV и CPXV).

В работе (Ropp et al., 1995) был предложен метод идентификации ортопоксвирусов на основе ПЦР с использованием двух пар праймеров в районе гена, кодирующего гемагглютинин и последующим гидролизом амплификационных продуктов эндонуклеазами рестрикции. По длине получаемых ПЦР-амплификационных продуктов ортопоксвирусы делили на две группы: группу, содержащую вирусы оспы енотов, оспы скунсов, оспы полевок и группу, содержащую вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины, оспы верблюдов, эктромелии, оспы песчанок. Затем, полученные ампликоны гидролизовали эндонуклеазами рестрикции Rsa\ для первой группы, Taql - для второй и по спектру получаемых субфрагментов проводили видовую дифференциацию перечисленных ортопоксвирусов. Однако штаммы вируса оспы коров давали чрезвычайно полиморфную картину распределения фрагментов.

Авторы также предприняли попытку разработать метод видоспецифичного определения ортопоксвирусов на основе ПЦР без этапа гидролиза. Были предложены новые видоспецифичные наборы праймеров и подобраны условия амплификации, однако оказалось, что для однозначного разделения вирусов на виды необходимо использованиевысокоочищенных препаратов ДНК, а также подбор специфических условий проведения реакций и концентраций реагентов для каждого вида вируса отдельно. Это чрезвычайно затрудняет постановку такого метода анализа.

Ьорагеу е/ а1. (2001) разработали метод на основе гена, кодирующего сгтВ, позволяющий идентифицировать ДНК вирусов натуральной оспы, осповакцины, оспы коров, оспы обезьян, оспы верблюдов, оспы мышей и татерапокс. Полиморфизм длин амплифицируемых продуктов с ДНК вируса эктромелии (380 п.н.), вируса осповакцины (1201-1212 п.н.) и всех остальных исследуемых ортопоксвирусов (1291-1369 п.н.) позволил дифференцировать вирусы эктромелии, осповакцины от остальных видов без дополнительных манипуляций. Последующий гидролиз эндонуклеазой рестрикции МаШ позволил специфически дифференцировать все изученные виды ортопоксвирусов. При этом для вируса оспы коров было выявлено семь различных картин рестрикции, что указывает на возможность неоднозначного трактования результатов выполненного анализа.

Как видим, на основе ПЦР с последующим гидролизом эндонуклеазами рестрикции разработано несколько методов, позволяющих осуществлять видовую идентификацию ортопоксвирусов. Однако при анализе значительного количества штаммов некоторых видов ортопоксвирусов (наиболее часто - вируса оспы коров), наблюдалась гетерогенность в рестрикционных профилях, что значительно усложняло анализ и трактовку результатов. Например, как уже говорилось выше, в работе (Ьорагеу е/ а1, 2001) для вируса оспы коров было выявлено семь различных картин рестрикции и нет никаких гарантий, что следующий исследуемый изолят вируса оспы коров не будет обладать своим уникальным спектром субфрагментов. Это ставит под сомнение возможность использования данного метода для надежной ДНК-диагностики ортопоксвирусов. Еще одним недостатком является наличие стадии гидролиза ПЦР-продуктов, что значительно удлиняет время анализа по сравнению с методами, основанными на обычном ПЦР. При этом время проведения анализа является одной из важных характеристик тест-системы.

3.2.2. Олигонуклеотидные микрочипыОлигонуклеотидные микрочипы - метод, основанный на ПЦР и последующей идентификации гибридизацией ДНК-ампликонов со специфичными олигонуклеотидами, фиксированными на подложке в определенном порядке. Этот метод, так же как ПЦР, позволяет обнаружить следовые количества исследуемого материала в образце.

В работах (Lapa et al., 2002; Михеев и др., 2003) впервые был разработан способ видоспецифичной детекции патогенных для человека ортопоксвирусов на основе гибридизации флуоресцентно меченого образца амплифицированной ДНК с олигонуклеотидными зондами иммобилизированными на микрочипе. Микрочип состоял из 15 олигонуклеотидных зондов, которые выявляли видоспецифичные участки в гене, кодирующем сппВ, кодирующего вирусный аналог рецептора фактора некроза опухолей. Для получения избытка одноцепочечного флуоресцентно меченого продукта, для последующей гибридизации, использовали ассиметпичный ПЦР с флуоресцентно меченым праймером в концентрации в 10 раз больше концентрации второго праймера. Было проанализировано ДНК 59 штаммов вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины, оспы верблюдов и эктромелии. Только ДНК вируса оспы мышей не детектировалась этим методом из-за отсутствия в геноме данного вируса исследуемого района.

В следующем исследовании Laassri et al. (2003) был разработан метод на основе олигонуклеотидных микрочипов к гену C23L/B29R ортопоксвирусов, позволяющий детектировать и дискриминировать ДНК четырех патогенных для человека ортопоксвирусов. Микрочип состоял из 57 олигонуклеотидных зондов, при этом несколько уникальных зондов длиной 13-21 нуклеотид были специфичны каждому виду вируса, включая вирус ветряной оспы. ПЦР-продукт длиной приблизительно ИООп.н. флуоресцентно метили Су5-модифицированными dNTPs. Один из праймеров содержал биотин на 5'-конце, что позволило разделить цепи ДНК с помощью магнитных шариков со стрептовидином для последующей гибридизации. Было проанализировано 49 образцов ДНК различных штаммов ортопоксвирусов и 2 образца ДНК вируса ветряной оспы. Специфичность метода составила 100 %.

В других работах также были предложены способы, позволяющие детектировать ДНК вируса осповакцины с помощью олигонуклеотидных микрочипов с высокой чувствительностью и специфичностью (Wang et al., 2004; Wenli et al., 2004).

В исследовании (Fitzgibbon and Sagripanti, 2006) авторы разработали метод на основе олигонуклеотидных микрочипов, позволяющий дифференцировать ДНК альфавирусов на пять видов, включая вирус Венесуэльского энцефалита лошадей и ортопоксвирусов на четыре вида, включая вирус натуральной оспы. Для диагностики ортопоксвирусов использовали праймеры к генам, кодирующим тимидинкиназу и гемагглютинин. При выравнивании нуклеотидных последовательностей генов для расчета праймеров и олигонуклеотидных зондов использовали 11 штаммов различных ортопоксвирусов, что не может гарантировать надежность и специфичностьпредложенного метода. Всего один образец ДНК ортопоксвирусов (вирус осповакцины штамм MVA) был проанализирован данным методом, что также является существенным недостатком этой работы.

В статье Ryabinin et al. (2006) был предложен метод на основе олигонуклеотидных микрочипов, позволяющий одновременно детектировать и идентифицировать ДНК шести видов ортопоксвирусов (вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, оспы верблюдов, осповакцины и эктромелии). Были рассчитаны олигонуклеотидные зонды к генам C23L/B29R и B19R ортопоксвирусов для видоспетщфичной диагностики, а также для увеличения специфичности метода к генам ОРТЗ1 вируса ветряной оспы, US4 и US5, вирусов простого герпеса 1-го и 2-го типов, соответственно. Асимметричный ПЦР с последующим химическим мечением одноцепочечной ДНК красителем СуЗ использовали для получения избытка одноцепочечного флуоресцентно меченого ПЦР-продукта для гибридизации с олигонуклеотидными зондами. Было проанализировано ДНК 55 образцов различных видов ортопоксвирусов, двух изолятов вируса ветряной оспы, двух и трех изолятов вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов, соответственно. Все вирусы были безошибочно идентифицированы.

Одним из преимуществ методики микрочипов над обычным методом ПЦР-идентификации ортопоксвирусов является возможность проводить анализ по множеству локусов одновременно, что повышает надежность метода. Однако к настоящему моменту нет ни одного коммерчески доступного диагностического набора для обнаружения ДНК ортопоксвирусов на основе методики микрочипов.

3.2.3. ПЦР в реальном времениВ работе (Ibrahim et al., 1997) впервые был использован метод ПЦР в реальном времени для детекции и дифференциации ДНК ортопоксвирусов. Реакция проводилась в одной пробирке с использованием пары праймеров к гену, кодирующему гемагглютинин ортопоксвирусов и двух олигонуклеотидных зондов, специфичных вирусу осповакцины и вирусу оспы обезьян и меченных различными флуоресцентными красителями в 5'-положении и одинаковым гасителем флуоресценции и фосфатной группой в 3'-положении. Метод основан на 5'—»3' экзонуклеазной активности AmpliTaq ДНК-полимеразы, благодаря которой, происходит расщепление гибридизованной пробы и высвобождение флуоресцентной метки, свечение которой может быть детектировано. Использование специфических зондов позволило дифференцировать вирусы осповакцины и оспы обезьян на основе однонуклеотидного полиморфизма, исключив при этом стадию анализа ПЦР-продуктов методом электрофореза.

В своей следующей работе Ibrahim et al. (2003) на основе TaqMan ПЦР в реальном времени, и используя ген, кодирующий гемагглютинин в качестве мишени, разработали метод для детекции ДНК вируса натуральной оспы. Олигонуклеотидный зонд, используемый в данной работе был специфичен ДНК VARV и не выявлял другие виды ортопоксвирусов из-за значительного количества нуклеотидных замен (4-5 для разных видов), что позволило однозначно дискриминировать ДНК вируса натуральной оспы. Были проанализированы ДНК 73 изолятов различных вирусов, в том числе 48 различных изолятов випуса натупальной оспы. Специфичность составила 95.7-98.3 % иi v а - - - - ч xчувствительность 96.1-99.5 %.

Главные преимущества LUX-метода по отношению к другим методам ПЦР в реальном времени заключаются, во-первых, в использовании только одного флуоресцентного красителя для анализируемого района ДНК вируса, что значительно уменьшает стоимость олигонуклеотидного зонда, во-вторых, в более легком дизайне праймеров для мультиплексного анализа и, в-третьих, в том, что он позволяет очень надежно проводить анализ кривой температуры плавления ПЦР-продуктов.

В работе (Fedorko et al., 2005) сравнивали методы для быстрой детекции вируса осповакцины: shell vial culture assay (SVA), direct fluorescent antibody assay (DFA) и метод на основе LightCycler ПЦР в реальном времени. Праймеры и олигонуклеотидные зонды к консервативному гену, кодирующему ДНК-полимеразу - E9L позволяли детектировать ДНК всех ортопоксвирусов без дифференциации по видам. Из 47 проанализированных клинических образцов вируса осповакцины, 100 % были положительны методом ПЦР, 89 % положительны SVA и 40 % положительны DFA.

Для диагностики вируса оспы обезьян в ходе вспышки в США в 2003 году были разработаны два метода на основе ПЦР в реальном времени (Li et al., 2006). Первый метод, основанный на TaqMan ПЦР в реальном времени, используя ген, кодирующий ДНК-полимеразу - E9L в качестве мишени, позволил детектировать все ортопоксвирусы за исключением вируса натуральной оспы. Второй метод был основан на TaqMan 3'-minor groove binder ПЦР в реальном времени, использовал ген B6R и специфически детектировал вирус оспы обезьян. Были проанализированы 13 клинических образцоввируса оспы обезьян, панель различных ортопоксвирусных ДНК, включая 48 штаммов вируса натуральной оспы и ДНК бактерий. Оба метода показали 100% специфичность. Используя два различных гена-мишени, эти методы вместе представляют надежный и чувствительный способ для быстрой диагностики инфекции, обусловленной вирусом оспы обезьян.

Независимо от предыдущей работы, Kulesh et al. (2004) предложили альтернативные методы на основе TaqMan 3'-minor groove binder ПЦР в реальном времени для специфической диагностики ДНК вируса оспы обезьян, которые били испытаны на образцах, полученных от 52 грызунов во время вспышки оспы обезьян в США в 2003 году. Праймеры и олигонуклеотидные зонды, рассчитанные к генам F3L и N3R, обеспечивали детекцию ДНК вируса оспы обезьян, не выявляя при этом ДНК других ортопоксвирусов. Была проанализирована панель, включающая ДНК 17 изолягов вируса оспы обезьян, 25 изолятов вируса натуральной оспы и других вирусов (осповакцины, оспы верблюдов, оспы коров, герпеса и др.), и показана 100 % специфичность.

В исследовании (Fedele et al., 2006) на основе TaqMan 3'-minor groove binder ПЦР в реальном времени был предложен метод, использующий ген, кодирующий crmB в качестве мишени, позволяющий детектировать ДНК ортопоксвирусов и одновременно дифференцировать ДНК вируса натуральной оспы. Три олигонуклеотидных зонда независимо детектировали ортопоксвирусную ДНК, ДНК вируса натуральной оспы и внутренний контроль.

Метод ПЦР в реальном времени характеризуется быстротой, воспроизводимостью, надежностью, возможностью проводить количественное измерение ДНК в образце, и на его основе были разработаны различные модификации методов для детекции ДНК ортопоксвирусов (см. выше). Однако до сих пор с его помощью не было предложено ни одного способа, позволяющего выявлять и дифференцировать между собой все патогенные для человека виды ортопоксвирусов (вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины). Каждая описанная методика позволяет детектировать ДНК ортопоксвирусов и дифференцировать только один из указанных выше видов вирусов, при этом методики, специфичной вирусу оспы коров, разработано не было. Отсутствие возможности дифференцировать все патогенные для человека ортопоксвирусы в одной пробирке приводит к невозможности гарантировано идентифицировать изолят ортопоксвируса неизвестного происхождения с помощью метода ПЦР в реальном времени. Но, безусловно, описанные выше методы могут использоваться как подтверждающие.

3.3. Мультиплексная ПЦРОдним из способов решения проблемы одновременной видовой идентификации ортопоксвирусов является использование мультиплексной ПЦР (МПЦР). Ранее мультиплексная ПЦР для диагностики ортопоксвирусов не применялась.

Мультиплексная полимеразная цепная реакция - вариант ПЦР в которой, в реакционной смеси одновременно присутствует смесь нескольких пар праймеров, специфичных в отношении разных генетических локусов, что позволяет проводить одновременную ямпттигЬикяпию соотиетгттгюшиу участков ДНК-матрицы. ЭтоА * -А- - ^---»---- J - ГТ ^ ^становится возможным, если оптимальные условия проведения реакции близки для всех пар используемых праймеров. Используемые праймеры должны позволять амплификацию уникальных районов ДНК как в индивидуальных парах праймеров, так и в комбинации нескольких пар. Кроме того, метод должен позволять выявлять каждый амплификационный продукт отдельно из смеси всех образующихся продуктов амплификации. Эффективность МПЦР оценивается по выходу всех продуктов МПЦР после завершения реакции. Как и в любой другой химической реакции, выход продуктов МПЦР можно увеличить путем оптимизации критических параметров реакции. Однако действие многих компонентов в МПЦР взаимозависимо, поэтому изменение свойств одного из компонентов, как правило, влечет за собой необходимость в оптимизации свойств и других.

Одним из наиболее критических компонентов для специфичности МПЦР, как и для любой другой ПЦР, являются олигонуклеотидные праймеры. В большинстве случаев длина праймеров должна быть в пределах 18-30 п.н. вС-состав праймеров, который определяет температуру плавления (Тт) гибрида, образованного праймерами и матрицей, должен находиться в пределах 35-65 % и по возможности быть одинаковым у всех пар праймеров, используемых в реакции (Henegariu е/ а1, 1997; Е1ш&о е/ а1, 2000). Недопустима самокомплементарность праймеров, особенно в их З'-концевых областях. Ее наличие способствует амплификации димеров праймеров, а протяженная самокомплементарность делает праймеры нефункциональными. Для исключения отжига праймеров в неспецифических местах анализируемых последовательностей необходимо подтвердить с помощью компьютерного анализа отсутствие в них дополнительных мест посадки, что особенно важно при анализе больших геномов - в нашем случае геном ортопоксвирусов, имеющий длину около 200 т.п.н., и генома человека при совместном выделении ДНК из клинических образцов. В связи со спецификой МПЦР - использование нескольких пар праймеров в одной пробирке, необходимо проверить гомологию праймеров между собой. И в идеале, подобрать одинаковую амплификационнуюэффективность праймеров относительно своих генетических локусов. В ряде работ было показано, что амплификационная эффективность праймеров является критической в предпочтительной амплификации одной нуклеотидной последовательности относительно другой (Walsh et al., 1992; Suzuki and Giovannoni, 1996). На такое известное явление в МПЦР влияют два класса процессов: ПЦР-дрифт и ПЦР-селекция (Wagner et al., 1994; Polz and Cavanaugh, 1998). ПЦР-дрифт предполагают, является причиной стохастических взаимодействий ПЦР реагентов во время ранних циклов реакции, когда амплификация в основном зависит от геномной ДНК. Так, низкая концентрация геномной ДНК в образце, может влиять на стохастическую флуктуацию при взаимодействии ПЦР реагентов, особенно на отжиг праймеров. ПЦР-дрифт может являться результатом ошибки пипетирования, вариаций в температурном профиле различных лунок амплификатора, неодинаковой скорости изменения температуры в приборе для амплификации (Wagner et al., 1994; Polz and Cavanaugh, 1998).

ПЦР-селекция - механизм, при котором предпочтительная амплификация одной нуклеотидной последовательности относительно другой происходит благодаря свойствам самой нуклеотидной последовательности, окружающих ее последовательностей, а также ее целостности. Данными свойствами являются: различный GC состав образцов, влияющий на легкость денатурации; различная доступность искомой последовательности внутри генома, вследствие возможных вторичных структур; высокая эффективность связывания GC-богатых праймеров (Wagner et al., 1994; Polz and Cavanaugh, 1998).

Стандартные концентрации праймеров в реакционной смеси составляют 0.11.0 мкМ, хотя в большинстве случаев хорошие результаты получаются при их концентрациях 0.2-0.5 мкМ (Патрушев, 2004). При этом необходимо иметь в виду, что чем больше концентрация праймеров в реакционной смеси, тем выше вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР. В этой связи концентрации для конкретных праймеров должны быть определены эмпирически. При этом если мультиплексная реакция ставится впервые, то важно использовать одинаковые концентрации праймеров. С помощью полученного результата можно предположить, какие начальные изменения нужно сделать.

Другим важнейшим компонентом реакционной смеси при проведении МПЦР является термостабильная ДНК-полимераза. При проведении обычной ПЦР (с одной парой праймеров) в пробы объемом 25-100 мкл обычно добавляют 0.5-2.5 е.а. фермента (Патрушев, 2004). Вообще, чем выше концентрация фермента в пробе, тем больше вероятность образования неспецифических продуктов. В то же время, амплификация, осуществляемая Taq-ДНК-полимеразой, происходит по дистрибутивному механизму, т.е.в процесс синтеза особенно длинных цепей ДНК фермент, начавший синтез, редко его заканчивает. Происходит диссоциация комплекса фермент-(продукт-матрица), и синтез продолжает новая молекула фермента. Исходя из этого, для получения продуктов ПЦР большой длины необходимо повышать концентрацию фермента в пробе вплоть до 10 е.а. на 50 мкл реакционной смеси (Патрушев, 2004). Дополнительным фактором, необходимым для увеличения концентрации фермента в МПЦР, является одновременная амплификация нескольких нуклеотидных последовательностей в одной реакции. Многие яитопы сообщают, что оптимальным является использование 1.25-4.0 е.а. на 50 мкл реакционной смеси (Нег^апи е( а1, 1997; Рап е1 а1., 1998; Огбс1аЫ е( а1, 1999; ЕЫАго е1 а1,2000; Оиегеёа е1 а1,2000; МагкоиЫов е( а1, 2001 и др.).

Концентрация ионов М§2+ должна превышать концентрацию дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (ёЫТРв) в реакционной смеси на 0.5-3.0 мМ (Патрушев, 2004). Такой избыток необходим потому, что основным источником фосфатных групп во время ПЦР являются сШТРв, а ионы М§2+ образуют с ними растворимый комплекс. В то же время ионы М§2+ взаимодействуют еще и с матричной ДНК, праймерами, самой ДНК-полимеразой и являются абсолютно необходимыми для функционирования любых ферментов матричного синтеза нуклеиновых кислот. Их концентрация влияет на процесс отжига праймеров, температуру плавления двойной спирали нуклеиновых кислот, активность и точность функционирования ДНКполимеразы (Гшш а1, 1990; Патрушев, 2004). В этой связи требуется точное2+определение оптимальной концентрации ионов Mg в реакционной смеси для каждого сочетания праймеров и матрицы. Непе£агш е1 а1. (1997), проверив различные комбинации•у,концентраций сЮТРб и М£ пришли к выводу, что оптимальным является использование 200 мкМ каждого <11ЯТР с 1.5-2.0 мМ М§СЬ. Так же, данными авторами было показано, что раствор со смесью ёЫТРв чувствителен к разморозке/заморозке. После 3-5 таких циклов при проведении с ним МПЦР, продукты часто становились практически невидимыми. Для монолокусного ПЦР такой зависимости замечено не было (Henegariu а1., 1997). Примеры других критических компонентов и параметров МПЦР приведены на схеме 1.

Оптимизация МПЦР может оказаться трудной. Многие компоненты реакции, которые не влияют на проведение монолокусной ПЦР, могут влиять на МПЦР. Так, использование в МПЦР горячего старта, является одним из основных факторов, улучшающим качество реакции. Тщательная оценка чувствительности и специфичности метода, используя стандартизованные препараты ДНК/РНК, параллельно с монолокусной ПЦР, может позволить разработать точный, простой метод для диагностики несколькихЭтап 3. Монолокусный ПЦР: - амплификация всех локусов индивидуально при одинаковых условиях, используя 1х буфер для ПЦР без адъювантов.1Этап 4. Мультиплексный ПЦР: - 0.1-0.4 мкМ каждого праймера - смесь праймеров одинаковой концентрации, используя условия ПЦР с Этапа 3.

Этап 5В. Длинные ПЦР-продукты плохо синтезируются:-а) увеличить время элонгации; -б) увеличить температуры отжига и/или элонгации;-в) увеличить концентрацию праймеров для данного локуса; -г) уменьшить концентрацию буфера с 1х до 0.7-0.8х, но оставляя концентрацию MgCl2 в пределах 1.52 мМ;-д) комбинировать выше перечисленныеЭтап 5Б. Короткие ПЦР-продукты плохо синтезируются-а) увеличить концентрацию буфера с 1х до 1.4-2.Ох;-б) уменьшить температуры отжига и/или элонгации;-в) увеличить концентрацию праймеров для данного локуса;-г) комбинировать выше перечисленныепункты.

Этап 5Д. Если ничего из вышеперечисленного не работает -а) использовать адъюванты: попробовать БСА (0.1-0.8 мкг/мкл) -б) использовать адъюванты: попробовать 5 % ДМСО или глицерол -в) перепроверить праймеры на взаимодействие друг с другом -г) заменить все растворы, использовать свежий (ШТРв.пункты.

Этап 5Г. Синтезируются неспецифические продукты: -а) если длинные, то увеличить концентрацию буфера с 1х до 1.4-2.Ох; -б) если короткие, то уменьшить концентрацию буфера с 1х до 0.7-0.9х; -в) постепенно увеличить температуру отжига;-г) уменьшить количество ДНКматрицы и фермента;-д) увеличить концентрацию MgCl2 до 3,6, 9 и 12 мМ, но оставляя концентрациюкаждого ёЫТР равной 200 мкМ;-е) комбинировать выше перечисленныепункты.

Схема 1. Анализ критических компонентов и параметров МПЦРинфекционных агентов в одном образце одновременно. Так как число инфекционных агентов, детектируемых методом ПЦР, постоянно увеличивается, то для практического использования становиться привлекательным возможность детекции нескольких патогенов одновременно, особенно тех, которые имеют одинаковую или похожую клиническую картину проявления инфекции, и/или имеют одинаковые эпидемиологические особенности. Благодаря своим возможностям, в последнее время МГТЦР нашла широкое применение в молекулярной клинической диагностике инфекционных агентов.

3.3.1. Применение метода МПЦР в диагностике вирусных нейроинфекцийИзвестно около 100 вирусов поражающих центральную нервную систему и приводящих к различным неврологическим заболеваниям (Whitley and Gnann, 2002). Клинически вирусные неврологические заболевания делятся на острые (энцефалит, слабый паралич, асептический менингит и постинфекционный энцефало-миелит) и хронические. Острые заболевания вызываются группой Herpesviridae, Picornaviridae (энтеровирусы), Paramyxoviridae, некоторыми представителями семейства Rhabdoviridae, Togaviridae, Flaviviridae и Bunyaviridae. Хронические неврологические заболевания вызываются представителем семейства Paramyxoviridae - вирусом кори, Papovaviridae -JC и ВК вирусами.

Лечение вирусных энцефалитов различной природы имеет много сходных черт, ввиду общности их патогенетических механизмов, и в то же время различается в зависимости от этиологического агента, вызвавшего заболевание. Этиотропная терапия вирусных поражений нервной системы ограничена группой нейроинфекций, вызываемых вирусами герпеса. Это наиболее распространенные и самые тяжелые нейроинфекции. Герпесный энцефалит (ГЭ) - наиболее распространенная причина острых спорадических энцефалитов как в США, так и в Европе. Ежегодно около 2000 случаев регистрируется в США. Около 90% случаев герпесных энцефалитов у взрослых - результат инфекции ВПГ-1 (вирус простого герпеса первого типа) (DeBiasi and Tyler, 2004; Kennedy, 2004).

Лечение нейроинфекций герпесной природы в настоящее время имеет высокую эффективность. Для лечения герпетических инфекций широко используется ацикловир, который назначают при малейшем подозрении на герпетическую природу энцефалита. Лечение цитомегаловирусных поражений головного мозга проводится ганцикловиром и фоскарнетом (Kennedy and Chaudhury, 2002; Kennedy, 2004). Назначение адекватной терапии требует от врача быстрой дифференциальной диагностики сходных по клиническим проявлениям заболеваний.

Референс стандартом для ГЭ является выделение ВПГ из мозговой ткани после биопсии. Ответы посевов получают через 1-2 дня (Soong et al., 1991). Культивирование вирусов из спинномозговой жидкости (СМЖ) в большинстве случаев не эффективно. Кроме того, культивирование вирусов из СМЖ не эффективно для большинства других вирусов, поражающих ЦНС. Исключение составляют представители группы энтеровирусов (Read et al., 1997).

Поиск быстрых, чувствительных, специфичных тестов для диагностики нейроинфек"пий является одной из наиболее острых проблем клинической нейровирусологии. Новая молекулярная диагностическая технология, такая как полимеразная цепная реакция, революционизировала диагностику вирусных инфекций ЦНС. По чувствительности и специфичности она равноценна выделению вируса из мозговой ткани после биопсии, но при этом не имеет риска осложнений, сопутствующих биопсии мозга. Более того, биопсия мозга сейчас редко применяется в связи с приходом диагностики спинномозговой жидкости методом ПЦР, но, тем не менее, может быть принята во внимание в том случае, если имеются серьезные диагностические сомнения (Kennedy, 2004). Клинические особенности ГЭ, определенные с помощью ПЦР, в основном совпадают с теми, которые были ранее определены для заболеваний, выявленных с помощью выделения вируса после биопсии. При этом в исследованиях методом ПЦР у около 15-20% пациентов идентифицируется средняя или нетипичные формы ГЭ, что принятыми классическими методами (выделение вируса после биопсии мозга) не распознавалось (Landry, 1995).

Широкий спектр потенциально нейроинвазивных вирусов и ограниченный объем основных важных клинических образцов - тканей мозга и спинномозговой жидкости -привел к необходимости использования ПЦР-анализа, допускающего выявление множественных патогенов в ПЦР, одновременно в одном клиническом образце.

Так в Великобритании Read and Kurtz провели исследование 1683 клинических образцов СМЖ на наличие четырех основных агентов, вызывающих вирусные менингиты и энцефалиты - ВПГ-1, ВПГ-2, VZV и энтеровирусы. Результаты исследования дали положительный результат в 138 (8.2%) случаях (энтеровирусы - 51 образец, ВПГ-1 - 25 образцов, ВПГ-2 - 33 образца, VZV - 28 образцов) и подтвердили важность тестирования более чем одного вируса у пациентов с менингитами и энцефалитами (Read and Kurtz, 1999).

В настоящее время, различными группами исследователей разработаны методики, использующие наборы праймеров для одновременной детекции ВПГ-1 и ВПГ-2, VZV, цитомегаловируса, вируса Эпштейн-Барра, вируса герпеса 6-го типа в различныхкомбинациях (Cassinotti et al., 1996; Read et al., 1997; Casas et al., 1999; Read and Kurtz, 1999).

Группа исследователей в Финляндии, используя ПЦР, детектировала различные вирусы в клиническом образце спинномозговой жидкости около 3 тыс. пациентов, которые имели заболевания ЦНС, включающие энцефалит, менингит и миелит. Они обнаружили довольно интересные данные о том, что в имеющихся клинических образцах VZV детектировался наиболее часто - 29 %, ВПГ и энтеровирусы в 11 % случаев каждый, и в 7% случаев - вирус гриппа A (Koskiniemi el al., 2001). Если рассмотреть простую пропорцию этих случаев, то можно увидеть, что индикация VZV недооценивается, а ВПГ переоценивается. Эти исследования методом ПЦР требуют дальнейшей доработки, но показывают актуальность и необходимость использования ПЦР-анализа на различные патогены одновременно. Тем не менее, детекция ВПГ при вирусных энцефалитах остается критической, т.к. имеются способы эффективного его лечения.

Кроме выявления роли и влияния различных этиологических агентов на характер течения заболеваний ЦНС, использование мультиплексного подхода необходимо при клинической диагностике ВИЧ-пациентов с заболеваниями ЦНС вследствие множественного инфицирования герпесвирусами, вызывающих неврологические симптомы у этих групп людей (Quereda et al., 2000).

3.3.2. Применение метода МПЦР в диагностике респираторно-вирусных инфекцийВ настоящее время насчитывается более 140 различных возбудителей респираторных вирусных инфекций, часто называемых острыми респираторными вирусными инфекциями - ОРВИ (таблица 2). К наиболее распространенным относятся представители семейства Paramyxoviridae: респираторно-синцитиальные вирусы типа А и В, вирусы парагриппа типа 1, 2, 3 и 4, метопневмовирус; семейства Orthomyxoviridae: вирусы гриппа А и В; в меньшей степени представители семейства Adenoviridae, Coronaviridae, Picornaviridae (Гендон, 2001). Эти возбудители вызывают клинически сопоставимую симптоматику в виде повышенной температуры и одним или более симптомами, такими как озноб, головная боль, общее недомогание, а также определенные поражения дыхательной системы, которые могут включать ринит, фарингит, тонзиллит, ларинготрахеит, бронхит, иногда конъюнктивит. При этих заболеваниях у детей, пожилых и иммунодефицитных людей могут возникать осложнения типа бактериального синусита, отита, пневмонии и бронхиолита с явлениями крупа (Евстропов, 2001).

Таблица 2. Основные возбудители ОРВИ человека (Евстропов, 2001)Вирусы Клинические проявленияСемейство Orthomyxoviridae: вирусы гриппа человека ГриппСемейство Paramyxoviridae: респираторно-синцитиальный вирус вирусы парагриппа метоппевмовирус Ларингиты, фарингиты, бронхиты, ларинготрахеобронхит (ложный круп) у детей. Заболевания нижних отделов дыхательных путей у новорожденных и детей раннего возрастаСемейство Coronaviridae: респираторные коронавирусы Поражение верхних дыхательных путей с сильным насморкомСемейство Picornaviridae: риновирусы вирусы Коксаки вирусы ECHO Риниты, синуситы, бронхиты, бронхиолиты. Поражения верхних дыхательных путей, эпидемическая плевродиния, ОРЗ, пневмонииСемейство Adenoviridae: аденовирусы человека ОРЗ, поражения нижних отделов дыхательных путей, фарингоконьюнктивитыИз четырех доступных в настоящее время препаратов для лечения вируса гриппа (два ингибитора нейроминидазы: занамивир и оселтамивир, два ингибитора ионного канала М2: римантадин и амантадин), только ингибиторы нейроминидазы имеют активность против вируса гриппа В, что указывает на необходимость дифференциальной диагностики этиологического агента заболевания (Kamps ei al., 2006). Кроме вышесказанного, быстрая дифференциальная диагностика вируса гриппа играет важную роль в контроле над распространением инфекции от пациента к пациенту и от клинициста к больным из группы риска внутри больницы (WHO, 2005).

Вирусы парагриппа типа 1, 2, 3 и 4 вызывают главным образом респираторные заболевания у детей младше 5 лет. При этом после респираторно-синцитиального вируса, вирусы парагиппа являются вторыми по патогенности у детей этого возраста. В США этиологическим агентом одной трети инфекций приводящих к тяжелым заболеваниямнижних отделов дыхательных путей являются вирусы парагриппа 1 и 3 типа (Denny and Clyde, 1986; Glezen et al, 1984; Henrickson, 2003). Около 10-25% случаев заболеваний нижних отделов дыхательных путей развивается в круп (в зависимости от возраста) и до 50 % случаев крупа вызываются вирусом парагриппа типа 1 (Denny et al, 1983; Marx et al., 1997).

Респираторно-синцитиальный вирус (PCB) - основной этиологический агент вызывающий тяжелые инфекции нижних отделов дыхательных путей. Наиболее серьезно заболевание протекает у детей r возпясте до года, вызывая бронхиолит и пневмонию, что сопровождается высокой смертностью. У 20 % заболевших детей возникают отиты. Дети, имеющие респираторную вирусную инфекцию, вызванную PCB, предрасположены в дальнейшем к развитию хронических респираторных заболеваний, в частности, астмы.

В связи со сходством клинической картины респираторных инфекций, вызываемых различными вирусами, для определения того, какой именно возбудитель вызвал инфекцию, необходима лабораторная диагностика. В настоящее время известны следующие лабораторные методы, доступные для диагностики респираторных вирусов: культуральный, серологический, микроскопический (включая электронную микроскопию), непрямые и прямые иммунофлуоресцентные методы, иммуноферментный анализ, исследование активности ферментов (нейраминидазный тест), и амплификация нуклеиновых кислот.

Культуральный метод признан золотым стандартом, однако требует специализированных лабораторий и является достаточно медленным трудоемким процессом, так как результат анализа можно получить не раньше, чем на 14-й день исследования (Betts, 1995; Liolios et al, 2001).

Серологические методы, как правило, не очень информативны в случае острой инфекции. При определении нарастания уровня специфических антител результаты теста получают на 10 - 14-й день болезни, это слишком поздно, чтобы иметь значение для лечения в острой стадии заболевания. Кроме того, от 10 до 30 % пациентов с подтверждённой респираторной вирусной инфекцией являются серонегативными.

Существенное развитие получили методики для экспресс-анализа вирусного антигена, которые включают в себя иммуноферментный анализ (ИФА) и иммунофлюоресценцию (ИФ). Эти методы широко используются, и основными их преимуществами являются относительные дешевизна и простота. Однако, из-за недостаточной чувствительности и специфичности иногда требуется подтверждение культуральными методами (Fan and Henrickson, 1996). Сочетание экспресс-анализа, а именно ИФ, и культурального метода обеспечивает высокий процент положительныхрезультатов. Хотя, было показано, что некоторое число образцов остается отрицательным в плане выявления инфекционного агента (Tantivanich el al., 1995; Ellis el al, 1997). Для преодоления таких недостатков, широкое развитие получили молекулярно-биологические методы, основанные на детекции нуклеиновой кислоты возбудителя в клиническом образце. В связи со сходством клинической картины респираторных инфекций, вызываемых различными вирусами, разработка молекулярных методов одновременной детекции нескольких возбудителей имеет преимущества перед монодетекцией, как в экономическом плане, так и в легкости исполнения, Кроме того, возможность детекции нескольких этиологических агентов в одном образце улучшает эффективность лечения (пример, антивирусная терапия гриппа типов А и В). В настоящее время разработан набор молекулярных методик определения различных этиологических агентов респираторно-вирусных инфекций одновременно в одном образце (Echevarría et al., 1998; Stockton el al., 1998; Grodahl et al., 1999; Kehl et ai, 2001; Syrmis et al., 2004; Bellau-Pujol et al., 2005). Самой широко распространённой молекулярной коммерческой методикой является Hexaplex на основе мультиплексной ПЦР (Fan et al., 1998; Liolios et al., 2001) для определения семи разных наиболее распространённых респираторных вирусов: парагриппа типов 1, 2, 3; гриппа типов А и В и респираторно-синцитиального вируса типов А и В. Метод обеспечивает одновременную быструю детекцию и идентификацию вирусов в клинических образцах (назальные смывы). Метод был оценен на 109 клинических образцах в сравнении с культуральным методом и показал 100 % чувствительность и 98 % специфичность. В нескольких работах показано преимущество данного метода перед культуральным и ИФ (Kehl et al., 2001; Liolios et al., 2001; Legoff et al., 2005). В настоящее время, к сожалению, существует значительный разрыв между возможностями диагностики респираторных вирусных инфекций, предоставляемыми современными методами молекулярной биологии, и уровнем реализации этих возможностей в практических лабораториях. Применение таких методов, возможно, уменьшило бы риск внутрибольничной передачи инфекции среди людей с высоким риском заболевания, уменьшило бы использование антибиотикотерапии и улучшило эффективность лечения как результат использования соответствующей направленной терапии согласно поставленному диагнозу инфекции специфическим вирусом.

3.3.3. Применение метода МПЦР в диагностике урогенитальных инфекцийЦенность современных подходов к диагностике вирусных инфекций, передающихся половым путем, особенно четко прослеживается в случае диагностики вируса папилломы человека (ВПЧ).

На сегодняшний день ВПЧ-инфекция является одной из наиболее распространенных и важных инфекций, передаваемых половым путем (ИППП). ВПЧ инфицирует пролиферирующие эпителиальные клетки базального слоя эпителия и отличается высоким тропизмом именно к этому типу клеток. После инфицирования ВПЧ в клетках эпидермиса нарушается нормальный процесс дифференцировки. Эпидемиологические и вирусологические исследования плоскоклеточных раков шейки матки показали, что в 95 % случаев в клетках обнаруживается ДНК ВПЧ. ВПЧ-инфекция с одинаковой частотой пппажает и мужчин, и жентттин. В то же ипемя наиболее сепьезные- ■ г - j > - 1 1поражения она вызывает у женщин: по данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется 600 тыс. случаев рака шейки матки, и, несмотря на проводимое лечение, 45-50 % больных от него умирают. В целом же, как оказалось, до 80-90 % случаев инфицирования ВПЧ заканчиваются спонтанным выздоровлением, однако в 10% случаев развивается персистирующая инфекция, которая и запускает механизмы злокачественной трансформации эпителиальных клеток.

Во всем мире рак шейки матки занимает третье место среди злокачественных новообразований у женщин (Ries et ai, 2001; Burd, 2003). Связь между папилломавирусной инфекцией и развитием рака шейки матки впервые была продемонстрирована в 1980-х годах немецким вирусологом Harold zur Hausen. С этого времени связь между ВПЧ и раком шейки матки надежно установлена. В настоящее время известно более 200 типов ВПЧ, из них хорошо охарактеризованы 85 (Burd, 2003). ВПЧ делят на высокоонкогенный и низкоонкогенный тип. Четыре типа ВПЧ, которые наиболее часто встречаются при исследовании злокачественных клеток - это ВПЧ 16, 18, 31 и 45 типа. 16 тип встречается в 50 % случаев плоскоклеточных раков шейки матки США и Европы (Harro et al., 2001). Предполагается, что инфекция ВПЧ происходит в раннем возрасте, далее может персистировать и, в совокупности с другими факторами, способствовать перерождению клеток в предраковые, а затем и в раковые. Очевидно, что ранняя детекция и типирование вируса папилломы человека в клиническом образце и последующее раннее лечение имеет значение для предотвращения дальнейшего перерождения клеток (Spitzer, 1998).

Различают клиническую, субклиническую и латентную форму заболевания ВПЧ (Кулаков и др., 1999).

Лабораторная диагностика ВПЧ-инфекции проводится на основании цитологического, гистологического исследования биоптатов, определения антител к ВПЧ, обнаружения ДНК ВПЧ. Весьма важным также является обследование больного на наличие сопутствующих ИППП. Известно, что опухолевая трансформация возникает сбольшей вероятностью при взаимодействии ВПЧ с другими канцерогенными или инфекционными агентами (вирус простого герпеса 2-го типа, цитомегаловирусы, С. trachomatis).

Цитологический метод позволяет диагностировать только клиническую и субклиническую формы инфекций, чувствительность метода - 50-80 %, что может быть отчасти компенсировано повторением теста через короткие промежутки времени, что в свою очередь увеличивает стоимость диагностического исследования (Кулаков и др., 1999), Кольпоскопия используется с целью подтверждения или исключения существования предракового поражения. По данным Gross and Barasso (1997) кольпоскопию можно рассматривать не как диагностический метод, а как исследование, позволяющее оценить размеры поражения и его локализацию на границе плоского и цилиндрического эпителия.

Латентная (бессимптомная) форма заболевания не может быть диагностирована кольпоскопически, цитологически и гистологически. Однако присутствие ВПЧ в биоптатах шейки матки при латентной форме инфекции можно определить по наличию ДНК вируса. Для этой цели чаще всего применяются метод ПЦР и метод на основе гибридизации в растворе (Hybrid Capture).

Метод типирования ВПЧ с помощью ПЦР позволяет идентифицировать отдельные типы ВПЧ и имеет большую диагностическую значимость, особенно если на фоне ВПЧ-инфекции уже имеется картина дисплазии эпителия шейки матки, что позволяет говорить о степени канцерогенного риска (Киселев и Киселев, 2003). Важность выявления ДНК ВПЧ и типирования вируса обусловлена тем, что у 15-28 % женщин с наличием ДНК ВПЧ "высокого риска" (при нормальной цитологии) в течение 2-х лет развивается сквамозная интраэпителиальная неоплазия, а у женщин с отсутствием ДНК ВПЧ заболевания развивается лишь в 1 -3 % случаев (Молочков и др., 2005).

В настоящее время созданы наборы реагентов, предназначенные для одновременного обнаружения ДНК ВПЧ различных типов (Vandenvelde et al, 1990; Soler et al., 1991; Pizzighella et ai, 1995; Clavel et al., 1998). Так, например, Zimmermann et al. разработали методику консенсусной мультиплексной ПЦР, позволяющей детектировать более чем 40 типов ВПЧ и дифференцировать ВПЧ высокоонкогенных типов 16, 18 и низкоонкогенных 6, 11. Данная методика позволяет быстро выявить ВПЧ ассоциированную природу ИППП, а также одновременно дифференцировать высокоонкогенный и низкоонкогенный тип ВПЧ (Zimmermann et al, 1996).

Основное преимущество мультиплексной ПЦР - возможность одновременной детекции нескольких патогенов в одной реакции - нашло применение для обследованияроссийская. государственнаябиблиотекабольных на наличие сопутствующих ИПГТГТ. Лечение таких пациентов требует специальных подходов (Молочков и др., 2005). Разработаны варианты МПЦР для детекции различных урогенитальных инфекций одновременно (Mitrani-Rosenbaum et al., 1994; Morse et al., 1997; Beyrer et al., 1998).

Использование молекулярных методов детекции значительно улучшило качество диагностики ВПЧ-инфекций. При использовании цитологического метода и ПЦР-тестирования комплексно, особенно у больных с сомнительными цитологическими данными, значительно увеличилась чувствительность и специфичность диагностики.

Кроме того, типирование ВПЧ (выявление низкоонкогенных и высокоонкогенных типов) снижает стоимость ведения пациентов за счет сокращения обследований пациентов с ВПЧ-инфекцией, обусловленной низкоонкогенными типами ВПЧ.

3.3.4. Применение метода МПЦР в NAT-скрининге донорской кровиСвойство метода ПЦР, позволяющее проводить прямое обнаружение инфекционного агента в любой биотической среде, дало возможность использовать его в скрининге донорской крови человека на маркеры ВИЧ, ВГС и ВГВ. Необходимость его применения в службе крови связана с неизбежными ограничениями обязательных обследований крови доноров методом ИФА на серологические маркеры гемотрансмиссивных инфекций: антиген ВИЧ р24 и антитела к ВИЧ, HBs-антиген, антитела к вирусу гепатита С. Ограничения основаны на невозможности детекции вирусов в период ранней инфекции, в период так называемого "иммунологического окна". В 1999 г. в США при поддержке FDA был введен новый метод скрининга донорской крови на основе амплификации нуклеиновых кислот (NAT). Данная технология использовала тестирование образцов в минипулах (16-24 донаций). За три года применения NAT-тестирования образцов донорской крови в минипулах, среди ИФА-отрицательных образцов выявили: 12 положительных образцов на ВИЧ-1 среди 37164054 единиц донорской крови или 1 на 3.1 млн. донаций; 170 положительных образцов на ВГС среди 39721404 единиц донорской крови или 1 на 230 тыс. донаций (Stramer et al., 2004). Последующее обследование доноров, положительных на ВГС, показало, что серо конверсия произошла в среднем через 35 дней после того, как была сдана донорская кровь.

С той или иной частотой, в разных странах выявляют доноров с веримией, но без серологических признаков гемотрансмиссивной инфекции. Применение амплифицирующих методов позволит уменьшить период "иммунологического окна". Так авторы нескольких исследований предполагают, что использование NAT для ВИЧ-1уменьшило данный период до 6-11 дней (Chuansumrit et al., 1996; Morandi et al., 1998; Gallarda and Dragon, 2000), для ВГС с 50-60 дней до 11 дней (Giachetti et al., 2002; Stramer et al., 2004). ИФА - скрининг донорской крови на маркеры ВИЧ, ВГС и ВГВ является обязательным во всем мире, а в странах Европы, США, Канаде, Японии, Австралии, Новой Зеландии, Сингапуре и Гонконге плазма и кровь дополнительно подвергается NAT - скринингу с целью выбраковки донаций, полученных от доноров, находящихся в периоде "иммунологического окна". В настоящее время разработаны различные методики NAT детекции ВИЧ, RFC и ВГВ донорской кпопи. Системы имеют как одиночный -детектируют один тип вируса, так и мультиплексный формат. Детекция нескольких вирусных агентов одновременно имеет значительные преимущества, как во времени, необходимом для скрининга миллионов образцов донорской крови, так и в стоимости этого скрининга по сравнению с методиками выявления одного вирусного агента. Giachetti et al. не выявили отличий в уровне детекции ВИЧ и ВГС при проведении сравнения скрининга донорской крови моновариантном и мультиплексным вариантом метода ПЦР-диагностики (Giachetti et ai, 2002). На основе мультиплексного ПЦР разработаны и являются коммерчески доступными, как полностью автоматизированные (роботизированные) NAT системы скрининга донорской крови, позволяющие за короткое время, с высокой чувствительностью и специфичностью проверить большое количество образцов на ВИЧ, ВГС и ВГВ (Meng et al., 2001), так и менее дорогие и зависящие от приборного обеспечения системы, позволяющие провести анализ на месте (Dineva et al., 2005). В мире ежегодно выполняется около 90 миллионов донаций крови и ее компонентов, из них в России - 3.7 млн. Методами амплификации нуклеиновых кислот обследуется около половины донаций на планете; Россия пока относится ко второй половине. В настоящее время Росздравнадзор зарегистрировал документ "Универсальные технологии генотестирования крови и других клинических материалов на патогены" (ФС-2006/093;10.05.06). Данная технология защищена патентами (Патенты РФ №2134871; №2164532; №2208645). Центр крови Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации приложил максимум усилий, чтобы опыт NAT-геноскринирования донорской крови и основные международные достижения стали доступны для службы крови России, издав научно-методическое руководство "Генамплификационное (NAT) тестирование крови и других материалов на патогены и мутации" и российско-немецкий сборник "NAT-минипул-гено-скринирование крови на основе международных стандартов ВОЗ - гарантия вирусной и бактериальной безопасности реципиентов" (Бур и др., 2003).

3.3.5. Перспективы применения МПЦР в диагностике ортопоксвирусных инфекцийчеловекаНа протяжении многих десятилетий объектом пристального внимания научных и практических учреждений остается проблема индикации и дифференциации вирусов группы оспы. В природе поддерживаются близкие родственники вируса натуральной оспы - вирусы оспы обезьян и оспы коров. Массовая вакцинация против натуральной оспы позволяла защитить не только от VARV, но и от близкородственных ей видов -MPXV, CPXV. VACV (Маренникова и ТТТелкунов, 1998). После прекращения массовой вакцинации против натуральной оспы в 1980 г. образовалась прослойка людей, чувствительных к данным вирусам. Об этом свидетельствуют участившиеся вспышки инфицирования людей такими вирусами, как вирус оспы обезьян и вирус оспы коров (Stephenson, 2003; Lewis-Jones, 2004). Кроме того, VARV рассматривают как возможный агент биотеррористических атак (Онищенко и др., 2000; Spencer and Lightfoot, 2001; Breman and Henderson, 2002). Проблема биомониторинга при угрозе террористических актов определяет необходимость разработки высокочувствительных и специфичных (селективных) методов индикации патогенов и создания на основе этих методов совершенных средств, пригодных для организации необходимых защитных мероприятий. Ранняя диагностика первых случаев инфекций позволит своевременно провести противоэпидемические мероприятия - карантин, госпитализацию, вакцинацию и пр.

Используемые биологические и серологические методы оказываются недостаточно эффективными для индикации и экспресс-диагностики ортопоксвирусов (Мацевич и др., 1996; Маренникова и Щелкунов, 1998). Биологический анализ длителен (3-6 суток) и сопряжен с необходимостью работы с опасными вирусами. Серологические методы позволяют идентифицировать, как правило, только родовую принадлежность вирусов и их чувствительность не всегда достаточна при анализе клинических образцов (Мацевич и др., 1996). Методы генетического анализа могут рассматриваться в качестве одного из наиболее эффективных путей диагностики вирусных инфекций. Было показано (Esposito et al., 1978; Mackett and Archard, 1979), что рестрикционным анализом вирусных ДНК можно с достаточно высокой надежностью осуществлять видовую идентификацию ортопоксвирусов. Однако для этого необходимо нарабатывать препарат вируса и проводить его очистку, что требует специального оборудования и занимает много времени.

Также было описано применение монолокусной ПЦР для детекции ортопоксвирусов с использованием единых олигонуклеотидных праймеров к району генов, кодирующих гемагглютинин (Ropp et al., 1995), белок тел включения типа A (Meyerе1 а1., 1997) и гомолог рецептора фактора некроза опухолей (Ьорагеу е/ а1., 2001). Однако использование этих методов при анализе достаточно большого набора изолятов ортопоксвирусов выявляли неоднозначность в трактовке получаемых результатов. Разработанные в настоящее время методы на основе ПЦР в реальном времени не позволяют проводить одновременную дифференциацию четырех патогенных для человека видов ортопоксвирусов, что особенно важно при определении эпидемиологической значимости выделенного штамма ортопоксвируса. Кроме того, приведенные в литературе данные не позволяют дать оценку чувствительности, специфичности и воспроизводимости использованных вариантов ПЦР, возможности создания на их основе диагностического набора для детекции и дифференциации патогенных для человека ортопоксвирусов.

Все вышесказанное говорит о необходимости разработки простого метода детекции и дифференциации патогенных для человека ортопоксвирусов. Наиболее привлекательным решением такой задачи является применение МПЦР, позволяющей проводить детекцию нескольких патогенов одновременно. Ранее для диагностики ортопоксвирусов МПЦР не применялась. Разработка метода видовой идентификации ортопоксвирусов на основе МПЦР может позволить в короткий срок (4-6 часов) с высокой чувствительностью и специфичностью выявить и дифференцировать возбудителей ортопоксвирусных инфекций практически в любом исследуемом материале. Кроме того, применение МПЦР для детекции и дифференциации патогенных для человека ортопоксвирусов имеет значительные преимущества в стоимости анализа, по сравнению с другими разработанными методиками на основе ПЦР.

На основании вышеизложенного очевидна необходимость конструирования нового диагностического набора для МПЦР детекции и дифференциации патогенных для человека ортопоксвирусов.

4. Материалы и методы4.1. МатериалыВ работе использовали следующие материалы:Реактивы производства "Реахим" (Россия): соляная кислота, хлорид натрия, натрия гидроокись, фенол, хлороформ, спирт этиловый, изоамиловый спирт, изопропиловый спирт, ледяная уксусная кислота. Степень очистки реактивов - не ниже хч.

Реактивы производства "Sigma" (США): агароза, ацетат калия, бромистый этидий, 2-меркаптоэтанол, хлористый рубидий, трисгидроксиметиламинометан (Трис), этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), морфолинпропансульфокислота (MOPS), бакто-агар, бакто-триптон, дрожжевой экстракт. Степень очистки - для использования в молекулярной биологии.

Реактивы производства "Serva" (Германия): додецилсульфат натрия (SDS), низкомолекулярный РНК-носитель. Степень очистки - для использования в молекулярной биологии.

Реактивы производства "Applied Biosystems" (США): набор для проведения секвенирующей реакции "Big Dye v.l.", набор для получения длинных ПЦР-фрагментов "Gene Amp XL PCR Kit", воск AmpliWaxPCRGems50.

Набор производства "Qiagen" (Германия) "QIAquick" для элюции ДНК из геля.

Реактивы производства "СибЭнзим" (Россия): dNTPs, маркеры молекулярных весов ДНК lkb и 100b, Taq-ДНК-полимераза, протеиназа К, эндонуклеазы рестрикции, ДНК-лигаза фага Т4.

Олигонуклеотидные праймеры:Для амплификации и секвенирования использовали олигонуклеотиды, синтезированные в лаборатории медицинской химии (ИХБФМ СО РАН), на автоматическом синтезаторе ABI-394 DNA/RNA synthesizer ("Applied Biosystems", США) и очищенные ВЭЖХ на колонке С-18 Nucleosil ("Sigma", США).

Буферные растворы: ТЕх 1 (Трис-НС110 мМ; ЭДТА 1 мМ рН 8.0)ТАЕх 1 (Трис-НС140 мМ; СН3СООН 40 мМ; ЭДТА 2 мМ; рН 8.0) Лизирующий раствор (ЛР) (Трис-НС1 100 мМ; ЭДТА 100 мМ; NaCl 100 мМ; SDS 1 %; рН 8.0)RF-1 (RbCl 100 мМ; МпС12х4Н20 50 мМ; СаС12х2Н20 10 мМ; ацетат калия 30 мМ;Глицерин -15 % (вес/объем); рН 5.8)RF-2 (RbCl 10 мМ; MOPS 10 мМ; CaCl2x2H20 75 мМ; Глицерин - 15%(вес/объем); pH 6.8). Стерилизовали фильтрацией через нитроцеллюлозный фильтр с порами 0.2 мкм.

Агаризованная среда (LB-бульон + 1.8 % агара). Стерилизуется автоклавированием. Штаммы Escherichia coli и плазмиды:В работе использовали штаммы E.coli XL 1-Blue {supE44 hsdR17 recAl endAl gyrA96 thi relAl lac [F'proAB+ lacfZAM15 TnlO (Tef)]} из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор», а также плазмиду pBluescript II SK+ «Stratagene», США.

4.3. Компьютерный анализНуклеотидные последовательности ДНК различных ортопоксвирусов: натуральной оспы, штаммов India-1967 (Shchelkunov et al, 1993), Bangladesh-1975 (Massung et al., 1994), Garcia-1966 (Shchelkunov et al., 2000); оспы обезьян, штамм Zaire-1996 (Shchelkunov et al., 2001); оспы коров, штамм GRI-90 (Shchelkunov et al., 1998); осповакцины, штаммов Copenhagen (Goebel et al, 1990), Ankara (Antoine et al, 1998), Tian-tan (EMBL: AF 095689) выравнивали с помощью программ Aligment Service (Resenchuk and Blinov, 1995), ClustalX 1.81 (Thompson et al, 1997), Vector NTI 9.0.0. ("InforMax", США). Выявление видоспецифических отличий осуществляли просмотром выровненных нуклеотидных поеледовагел ьностей.

Праймеры рассчитывали по выровненным нуклеотидным последовательностям с помощью программы "Oligo" 6.31 (Rychlik and Rychlik, 2000).

Компьютерный анализ хроматограмм после секвенирования осуществляли с помощью программы Sequencher V 4.0.5 ("Gene Codes", США).

Анализ специфических сайтов рестрикции в нуклеотидных последовательностях ортопоксвирусов, патогенных для человека, проводили с помощью программы Vector NTI 9.0.0. ("InforMax", США).

4.10. Выделение плазмидной ДНК в аналитическом вариантеДНК выделяли из 5 мл ночной культуры по методике выделения ДНК в препаративном варианте при пропорциональном уменьшении объемов всех растворов без стадии обработки LiCl.

4.13. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот в агарозном геле(Маниатис и др., 1984)Электрофоретический анализ фрагментов ДНК проводили в горизонтальных пластинах при напряжении 6 В/см в течение 1 часа, используя 1.0-2.5 % агарозу в буфере ТАЕ. Гель окрашивали бромистым этидием (0.5 мкг/мл) и фотографировали при помощи системы визуализации изображений Image Station 440CF («Kodak», США).

5. Результаты и обсуждение5.1. Выбор олигонуклеотидных праймеров для мультиплексного ПЦРЗадачей первого этапа работы являлся расчет олигонуклеотидных праймеров для мультиплексного ПЦР, обеспечивающих видоспецифичную амплификацию вирусных ДНК и образующих в ПЦР продукты разной длины, характерные для каждого вида ортопоксвируса. Для этого, были выровнены ранее опубликованные последовательностиnui/- «погтпттттг tv тптп»»»1лп лптлплту'лпттг«гллп» ттотлгпо ттт ттлп прттт т ттттоитлоу 1 « у 'шшл luiuitiivil/u i/pi wuu> nui j uviiui^ miuiuiuuu niuiu i / w /(Shchelkunov et al., 1993), Bangladesh-1975 (Massung et ai, 1994), Garcia-1966 (Shchelkunov et al., 2000); оспы обезьян, штамм Zaire-1996 (Shchelkunov et al, 2001); оспы коров, штамм GRI-90 (Shchelkunov et al, 1998); осповакцины, штаммов Copenhagen (Goebel et al, 1990), Ankara (Antoine et al, 1998), Tian-tan (EMBL: AF 095689). На основании полученных данных были выявлены уникальные видоспецифичные районы геномов вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины.

Геном ортопоксвирусов состоит из высоко консервативной центральной области, занимающей около 50 % генома, и вариабельных концевых районов, состоящих из концевых инвертированных повторов (TIR - Terminal Inverted Repeats) и уникальной неповторяющейся последовательности. Общая схема организации генома ортопоксвирусов приведена на рисунке 1.

В центральной части генома находится большая часть жизненно важных генов вируса. Вариабельные концевые районы содержат гены, несущественные для жизнеспособности вируса, но важные для проявления таких свойств вируса как круг хозяев, вирулентность и др. Именно вариабельными концевыми районами генома определяются основные видоспецифичные отличия ортопоксвирусов. Так, в левой части генома CPXV-GRI-90, сразу за TIR, начинается последовательность, кодирующая 11 потенциальных ОРТ (с D6L по D14 и C2L, C3L) и не имеющая аналога у VARV, MPXV, VACV. В правой части генома CPXV-GRI-90 наблюдается схожая картина. Имеются уникальные для CPXV последовательности включающие ОРТ B9R, KIR, K2R.

У вируса осповакцины нет протяженных видоспецифичных районов. Для большинства районов различия с другими видами ортопоксвирусов идут на уровне 1-2 нуклеотидов. Наиболее видоспецифичным является район ОРТ C9L VACV-COP, гомология которого с другими ортопоксвирусами составляет всего 69 % (Shchelkunov et al., 1998). Это самый низкий показатель, полученный при сравнении всех секвенированных районов ДНК вирусов осповакцины, натуральной оспы и оспы коров.

Вариабельный Центральным консервативный Вариабельный левый конец генома район правый конец геномаTerminal hairpin Г loop<CTIUTIUc>Рисунок 1. Общая схема организации генома ортопоксвирусов. T1R (Terminal Inverted Repeats) - концевой инвертированный повтор. Terminal harping loop - обращенная концевая шпилька - последовательность около 100 не полностью спарен шх нуклеотидов, ковалентно замыкающая цепи геномной ДНК (Baroudy el al., 1983).

Что касается вирусов натуральной оспы и оспы обезьян, то для данных вирусов не было найдено уникальных районов, отличия обнаруживались на уровне видоспецифичных делеций/инсерций, тем не менее, анализ таких областей позволил выявить потенциальные участки для видоспецифичной амплификации вирусных ДНК.

На рисунке 2 представлена общая схема, иллюстрирующая локализацию выбранных видоспецифичных районов на геномной ДНК четырех патогенных для человека ортопоксвирусов. Как можно видеть на приведенной схеме, часть районов располагается в центральной консегтатияной, я часть r конттелых ияпиябепьныу об пястяхЛ Л Л > 4 .1"Для каждого выбранного уникального района, используя программу «Oligo», мы рассчитали олигонуклеотидные праймеры для ПЦР. С помощью этой же программы были подобраны оптимальные условия амплификации для каждой пары праймеров. Последовательности пар праймеров, районы генома в которых они были выбраны и соответствующие им расчетные длины амплификационных продуктов представлены в таблице 3. Учитывая ограниченность числа известных геномных последовательностей и наличие внутривидовой гетерогенности ортопоксвирусов по структуре ДНК (Esposito and Knight, 1985; Ropp et al., 1995; Meyer et al., 1997; Loparev et al, 2001), для некоторых районов геномной ДНК ортопоксвирусов были рассчитаны разные комбинации олигонуклеотидных праймеров (рисунок 2, таблица 3).

Предполагаемые пары праймеров затем анализировали на наличие гомологии/комплементарности между собой и со всеми имеющимися известными последовательностями в базах данных NCBI, используя программу BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Отсутствие гомологии с другими видами ортопоксвирусов и родами поксвирусов, а также со всеми другими имеющимися последовательностями являлось одним из критериев отбора олигонуклеотидов.

Рассчитанные олигонуклеотидные праймеры первоначально были испытаны на имеющемся ограниченном количестве ДНК штаммов различных ортопоксвирусов: натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины, оспы мышей (эктромелии).

На первом этапе, для определения наличия ортопоксвирусной ДНК и дискриминации от других родов поксвирусов в исследуемых образцах, были рассчитаны праймеры к району гена, кодирующего малую субъединицу рибонуклеотидредуктазы (ОРТ F4L VACV), являющегося высоко консервативным для ортопоксвирусов и имеющего множественные отличия по нуклеотидной последовательности от аналогичного гена других родов поксвирусов (рисунок 3)О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80т.п.н.

1000900700600500400300200100Рисунок 4. Результат электрофоретического разделения в 2.5 % геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после ПЦР при использовании олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных на консервативный родоспецифичный район ОРТ F4L VACV: 1. Вирус миксомы кроликов, штамм Lausanne; 2. Вирус фибромы Шоупа, штамм Kasza; 3. Вирус оспы кур, штамм FP9; 4. CPXV, штамм ЕР-2; 5. CPXV, штамм GRI-90; 6. VACV, штамм ЛИВП; 7. VACV, штамм Western Reserve; 8. VARV, штамм Ind3a; 9. VARV, штамм Butler; 10. MPXV, штамм CDC-V-70-I-187; 11. MPXV, штамм CDC-V-79-I-04; ОКО -отрицательный контрольный образец; М. ДНК-маркер, длина в п.и. показана справа.

Затем осуществляли проверку видоспецифичной амплификации, используя две пары праймеров, одна из которых была родоспецифичной, а вторая подбиралась индивидуально для каждого вида ортопоксвируса.

В случае вируса оспы коров, для видоспецифичной дифференциации от других видов ортопоксвирусов были рассмотрены уникальные для CPXV районы, включающие ОРТ - KIR, B9R, находящиеся в правой области вирусного генома (рисунок 2), и ОРТ -D6L-D8L, C2L,C3L в левой области вирусного генома (рисунок 2). Также были рассмотрены ОРТ B19R, I2R, которые в случае вирусов натуральной оспы, оспы обезьян и осповакцины раздроблены или делетированы (рисунок 2).

При проведении амплификации с олигонуклеотидными праймерами, рассчитанными для ОРТ B19R и I2R, не удалось добиться дифференциации вируса оспы коров от других видов ортопоксвирусов. Данная пара праймеров также выявляла некоторые штаммы вируса осповакцины. Олигонуклеотидные праймеры, рассчитанные для ОРТ D6L-D8L и K1R, при ПЦР давали специфичные фрагменты для CPXV (таблица 3) и не давали фрагменты на ДНК других видов ортопоксвирусов. Однако при проведении ПЦР на ДНК имеющихся штаммов CPXV рассчитанные пары праймеров не позволяли выявить все изученные штаммы вируса оспы коров. Так, например, не детектировались штаммы CPXV-GRI-90, CPXV-TUR, CPXV-EP-2 в случае пары праймеров, рассчитанной для ОРТ D6L-D7L (таблица 3), и CPXV-TUR и CPXV-PUM в случае пары праймеров, рассчитанной для ОРТ K1R (таблица 3).E5RupE5RlowKPXV-ZAI9 6 mpxv-ZAI79 mpxv-con mpxv-USA mpxv-COP mpxv-sl mpxv-lib MPXV-KRA MPXV-DEN cpxv-GRI cpxv-brt cpxv-lar cpxv-tur varv-ind varv-gar varv-bsh varv-som varv-har vacv-cop vacv-wr vacv-ank vacv-lis vacv-tt vacv-rp ectv-mos ectv-mh5 ' -A TG TTGA TA---------------------1 tatgttgata---------------------.ttaacaaaagtgaatatatat----g.ttaacaaaagtgaatatatat----g.ttaacaaaagtgaatatatat----g.ttaacaaaagtgaatatatat----g.ttaacaaaagtgaatatatatat—g.ttaacaaaagtgaatatatatat—g.ttaacaaaagtgaatatatatat—g.ttaacaaaagtgaatatatatat—g.ttaacaaaagtgaatatatatat—g.ttaacaaaagtgaatatatat----g.ttaacaaaagtgaatatatatat — g.ttaacaaaagtgaatatatat----g.ttaacaaaagtgaatatatatat—g.ttaacaaaagtgaatatatat----g.ttaacaaaagtgaatatatatat—g.ttaacaaaagtgaatatatatatatg.ttaacaaaagtgaatatatatat—gTTAATAATCGTATTGTGGT-T-3 'ttaataatcgtattgtggt-ta 31. ta.gg.g.g. ta.gg.g.g. ta. GG.g.g. T.• T..T.-T..t..T.• t..T.■ T..T.• T.• T.-T.

3 ' -AACTCTTAG------------------------AAATTCTCACATAACTGAAA-5 '7 97 tttgagaatc------------------------tttaagagtgtattgactttg 834.----------------------------------c..----------------------------------c.,----------------------------------c..----------------------------------c..----------------------------------c..----------------------------------c.. cgttacatattattggtaagaatc. с.с.. ctctacatatcattggtaagaatc. cc.с.. ctctacatatcattggtaagaatc. cc.с.. ctctacatatcattggtaagaatc. cc.с..cgctgcatattattggtaagaatc.с.с.. cgctgcatattattggtaagaatc. с.с.. cgctgcatattattggtaagaatc. с.с.. cgctgcatattattggtaagaatc. с.с..cgctgcatattattggtaagaatc.с.с..cgctacatattattggtaaaaatc.с.с.. cgctacat attattggtaaaaatc. с.с..cgctacatattattggtaaaaatc.с.с.. cgct acatattattggtaaaaatc. с.с.. cgctacatattattggtaagaatc. с.с..cgctacatattattggtaagaatc.с.с..cgctacatattattggtaagaatc.с.с..cgctacatattattggtaagaatc.с.с.

СТ\ ОРисунок 5. Сравнение нуклеотидной последовательности ОРТ E5R MPXV штамм Zaire-96-I-16 (EMBL: AF380138) (MPXV-ZAI96) с соответствующими районами геномов MPXV, штаммы Zaire-1979-005 (EMBL: DQ011155) (MPXV-ZAI79), Congo-2003-358 (EMBL: DQ011154) (MPXV-CON), USA-2003-039 (EMBL: DQ011157) (MPXV-USA), COP-58 (EMBL: AY753185) (MPXV-COP), Sierra Leone (EMBL: AY741551) (MPXV-SL), Liberia-1970-184 (EMBL: DQ011156) (MPXV-LIB), MPXV-WRAIR7-61 (EMBL: AY603973) (MPXV-WRA), Denmark (EMBL: M95534) (MPXV-DEN); CPXV, штаммы GRI-90 (EMBL: X94355) (CPXV-GRI), Brighton Red (EMBL: AF482758) (CPXV-BRT), Larkin (EMBL: U32635) (CPXV-LAR), Turkmenia (EMBL: U32633) (CPXV-TUR); VARV, штаммы India-1967 (EMBL: X69198) (VARV-IND), Garcia-1966 (EMBL: Y16780) (VARV-GAR), Bangladesh-1975 (EMBL: L22579) (VARV-BSH), Somalia-1977 (EMBL: M95533) (VARV-SOM), Harvey (EMBL: M95532) (VARV-HAR); VACV, штаммы Copenhagen (EMBL: M35027) (VACV-COP), WR (Western Reserve) (EMBL: AY243312) (VACV-WR), Ankara (EMBL: U94848) (VACV-ANK), Lister (EMBL: AY678276) (VACV-LIS), Tian Tan (EMBL: AF095689) (VACV-TT), Rabbitpox virus (EMBL: AY484669) (VACV-RP); ECTV, штаммы Moscow (EMBL: AFO12825) (ECTV-MOS), Mili Hill (EMBL: U32632) (ECTV-MH). Идентичные нуклеотиды в сравниваемых последовательностях вирусных геномов по отношению к последовательности ОРТ E5R MPXV-ZAI96 обозначены точками, делеции - прочерком. Цифры слева и справа от нуклеотидной последовательности ОРТ E5R MPXV-ZAI96 обозначают положение нуклеотидов в анализируемом сегменте ДНК. Полужирным курсивом приведены последовательности олигонуклеотидных праймеров E5Rup и E5Rlow для ПЦР-амплификации, специфичной для MPXV.

15001000 vuu 800600 500400 300Рисунок 6. Результат электрофоретического разделения в 2.5 % геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после ПЦР при использовании олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для района ОРТ E5R MPXV-Zaire, одновременно с праймерами для родоспецифичной идентификации ортопоксвирусов. Анализировали амплификаты, полученные на ДНК разных штаммов MPXV:1. MPXV, штамм Congo-8; 2. MPXV. штамм Zaire-96; 3. MPXV, штамм CDC# v79-I-005; 4. MPXV, штамм CDC# v70-I-187; 5. MPXV, штамм CDC# v97-I-004; 6. MPXV, штамм CDC# v78-I-3945; ОКО - отрицательный контрольный образец; М. ДНК маркер, длина в п.н. показана справа.

Уникальность районов генома CPXV, для которых рассчитывали олигонуклеотидные праймеры, и отсутствие результата амплификации на ДНК некоторых штаммов вируса оспы коров, может быть объяснено высокой внутривидовой гетерогенностью вируса оспы коров (Маренникова и др., 1996).

Олигонуклеотиды, рассчитанные для ОРТ B9R (рисунок 7) и при проведении амплификации на ДНК CPXV дающие фрагмент 421 п.н., детектировали все имеющиеся штаммы CPXV (рисунок 8, таблица 3), дифференцировали CPXV от других патогенных для человека ортопоксвирусов и были выбраны для дальнейшей работы.

Осуществление дифференциации вируса осповакцины от других видов ортопоксвирусов осложняется тем, что у VACV нет протяженных видоспецифичных районов, различия выявляются на уровне нескольких нуклеотидов. В основном, для поиска видоспецифичных олигонуклеотидных праймеров к ДНК VACV были взяты районы ОРТ II5R и C9L. Известно, что ОРТ H5R VACV кодирует транскрипционный фактор VLTF-4 (Kovacs and Moss, 1996). Данный фактор поздней транскрипции имеет существенные отличия между разными видами ортопоксвирусов (Щелкунов, 1996). Наличие инсерций в последовательности нуклеотидов ОРТ H5R у VACV относительноB9Rup5' -ATCAGATGGAATTATCTCTCACCCG-3 'CPXV-gri 1 gttatcagatggaattatctctcacccgaatggttaacagatatggaatggaa 53cpxv-brt.t.с.cpxv-91-1.t.g.c.cpxv-ep-2.t.g.c.ест v-mos a. at. t. at.с—.a.a.t—. tt. t.a.a. ata. аса. tB9Rlow•43 ' -CCACCTGCTCTACCTAG TTTAATAG-5 '361 cataaatggacgcatttatgttatcggtggacgagatggatcaaattatctaa 427. G.. G.. G..t.

Рисунок 7. Сравнение нуклеотидной последовательности ОРТ B9R CPXV штамм GRI-90 (EMBL: Х94355) (CPXV-GRI) с соответствующими районами геномов CPXV, штаммы Brighton Red (EMBL: AF482758) (CPXV-BRT), 91-1 (EMBL: AY519984) (CPXV-91-1), EP-2 (EMBL: AY519982) (CPXV-EP-2); ECTV, штамм Moscow (EMBL: AFO12825) (ECTV-MOS). Идентичные нуклеотиды в сравниваемых последовательностях вирусных геномов по отношению к последовательности ОРТ B9R CPXV-GRI обозначены точками, делеции -прочерком. Цифры слева и справа от нуклеотидной последовательности ОРТ B9R CPXV-GRI обозначают положение нуклеотидов в анализируемом сегменте ДНК. Полужирным курсивом приведены последовательности олигонуклеотидных праймеров B9Rup и B9Rlow для ПЦР-амплификации, специфичной для CPXV.

1 2 У 4 5 ОКОМ1000 900 800600 500 400 300200 100Рисунок 8. Результат электрофоретического разделения в 2.5 % геле агарозы фрагментов ДНК, полученных после ПЦР при использовании олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для района ОРТ B9R CPXV-GRI, одновременно с праймерами для родоспецифичной идентификации ортопоксвирусов. Анализировали амплификаты, полученные на ДНК разных штаммов CPXV:

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гаврилова, Елена Васильевна

7. Выводы

Показано, что некоторые штаммы вируса оспы коров в составе своего генома содержат протяженную последовательность ДНК (около 6 т.п.н.), сегменты которой имеются в геномах вирусов натуральной оспы и оспы верблюдов и которая отсутствует в ДНК вирусов оспы обезьян, осповакцины и многих штаммов вируса оспы коров. В результате секвенирования этого района ДНК штаммов ЕР-2 и ОРУ 91/1 вируса оспы коров впервые обнаружена ранее неизвестная для изученных ортопоксвирусов открытая рамка трансляции размером 5679 и 5676 п.н., соответственно.

Сконструирован положительный контрольный образец, состоящий из шести гибридных плазмид, и показана возможность его применения в разработанной методике МПЦР диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов. Определены основные аналитические характеристики разработанной методики МПЦР диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов, которые в условиях эксперимента составили:

• аналитическая чувствительность - 103 в.ч./мл;

• диагностическая чувствительность - 100 %;

• аналитическая специфичность - 100 %;

• диагностическая специфичность - 100 %.

6. Заключение

Род Orthopoxvirus семейства Poxviridae включает такие патогенные для человека виды как вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины. Массовая вакцинация против натуральной оспы, позволяла защитить людей не только от VARV, но и от близкородственных ей видов MPXV и CPXV (Маренникова и Щелкунов, 1998). Прекращение массовой вакцинации против натуральной оспы после 1980 г. привело к постепенному образованию прослойки людей, чувствительных к данным вирусам. Об этом свидетельствует участившиеся вспышки инфицирования людей такими вирусами как MPXV и CPXV (Lewis-Jones, 2004; Stephenson, 2003). Кроме того, VARV рассматривают как возможный агент биотеррористических атак, которые могут иметь фатальный исход большого масштаба (Breman and Henderson, 2002; Spencer and Lightfoot, 2001; Онищенко и др., 2000). Поэтому разработка быстрых высокочувствительных методов видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, с каждым годом приобретает все большее значение.

На сегодняшний день из средств обнаружения оспенных вирусов на российском рынке имеются производимые ГУП НПО «Вирион» (г. Томск) диагностикумы: ИФА-диагностикум для определения антител к ортопоксвирусам (ФС 42-3530-98), ИФА-диагностикум для выявления антигена к ортопоксвирусам (ФС 42-3478-98), сыворотка диагностическая оспенная сухая, иммуноглобулин диагностический оспенный люминесцирующий сухой. Специфичность обнаружения - родовая. Перечисленные диагностикумы дают родовое обнаружение оспенных вирусов, не являются экспрессными или пригодными в полевых условиях. Поэтому остается актуальным поиск новых подходов для выявления и дифференциации патогенных для человека ортопоксвирусов.

Одним из современных экспресс методов диагностики вирусных инфекций является МПЦР. Данный метод может позволить не только типировать, но и дифференцировать исследуемые вирусы, проводя анализ в одной пробирке. По сравнению с монодетекцией, данный подход сокращает время, затраченное на диагностику, а также является экономически оправданным.

Поэтому целью данного исследования было разработать молекулярный метод видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции (МПЦР).

Для достижения этой цели на первом этапе работы провели углубленный сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК VARV, MPXV, CPXV и VACV, выявили геномные районы с видоспецифичными различиями, рассчитали олигонуклеотидные праймеры для мультиплексного ПЦР, потенциально обеспечивающие видоспецифичную амплификацию вирусных ДНК и образующие в ПЦР продукты разной длины, характерные для каждого вида ортопоксвируса. Учитывая ограниченность числа известных геномных последовательностей и наличие внутривидовой гетерогенности ортопоксвирусов по структуре ДНК, нами были рассчитаны разные комбинации олигонуклеотидных праймеров для каждого выбранного района вирусных геномов и проверены экспериментально на образцах ДНК набора штаммов разных видов ортопоксвирусов. В результате многочисленных экспериментов путем подбора из серии 33 пар праймеров (таблица 3) были выбраны определенные пары праймеров для МПЦР. Для выявления наличия ортопоксвирусной ДНК и дискриминации ее от ДНК других родов поксвирусов, в исследуемых образцах были рассчитаны олигонуклеотиды к району гена, кодирующего малую субъединицу рибонуклеотид редуктазы (ОРТ F4L). Для проведения мультиплексного ПЦР-анализа использовали одновременно все пять пар праймеров, одна из которых является родоспецифичной и при амплификации формирует продукт длиной 294 п.н. Остальные пары праймеров являются видоспецифичными и при амплификации дают продукты соответствующей длины.

В серии экспериментов были установлены оптимальные параметры МПЦР с выбранными олигонуклеотидами, после чего провели скрининг имеющейся коллекции ДНК различных штаммов ортопоксвирусов. Выяснили, что при анализе ДНК некоторых штаммов CPXV (ЕР-2, OPV 91/1, OPV 89/1, OPV 89/5), предоставленных Dr. Meyer H., образовывались ПЦР продукты, характерные для вируса натуральной оспы. В ранее расшифрованных геномах двух штаммов CPXV GRI-90 (Shchelkunov et al., 1998) и Brighton (Hu et al., 1994) "VARV-специфичный" район ДНК, использованный нами для ПЦР-диагностики VARV, отсутствует. Поэтому возникла необходимость выяснить организацию генома в этом районе для штаммов CPXV, дающих положительный VARV-специфичный ответ при использовании разработанного нами первого варианта МПЦР. На первом этапе рассчитали олигонуклеотидные праймеры на консервативные, фланкирующие VARV-специфичную вставку районы ОРТ B9R, ОРТ B13R VARV-IND. Результат амплификации в длинном ПЦР (ДПЦР) показал, что штаммы вируса оспы коров ЕР-2 и OPV 91/1 имеют наиболее протяженный участок генома по сравнению с другими представителями ортопоксвирусов (рисунок 15). Затем провели определение нуклеотидной последовательности данного района у двух штаммов CPXV ЕР-2 и OPV 91/1. Оказалось, что данный участок содержит протяженную непрерывную ОРТ длиной 5679 п.н. для штамма ЕР-2 и 5676 п.н. для штамма OPV 91/1. Секвенированные последовательности вирусного генома были депонированы в Международном банке данных EMBL под номерами AY519982 и AY519984, соответственно. ОРТ были названы

B7.5R-EP-2 и B7.5R-OPV-91-1 в соответствии с номенклатурой, принятой для референс штамма CPXV-GRI-90. Выяснилось, что короткие ОРТ таких ортопоксвирусов как VARV-India-1967 B10R и B11R и ОРТ VARV-Garcia-1966 H10R, H11R и H12R, а также ОРТ вируса оспы верблюдов штамма CMS 182R, 183R и 184R являются фрагментами более крупной расшифрованной нами последовательности гена B7.5R и имеют степень гомологии с соответствующими районами данной ОРТ более 90 %. Ранее эти районы для VARV считались уникальными и использовались при разработке молекулярных методов диагностики ортопоксвирусов. На основании полученных данных секвенирования, мы подобрали новые олигонуклеотидные праймеры для VARV. В серии экспериментов установили новый оптимальный состав реакционной смеси с учетом новых олигонуклеотидов для VARV. Новый вариант МПЦР-анализа обеспечивал надежную одновременную детекцию и дифференциацию патогенных для человека VARV, MPXV, CPXV и VACV и был проверен на 59 штаммах 5 различных видов ортопоксвирусов.

Для того чтобы иметь возможность максимально полно контролировать работу и снизить долю ошибочных результатов, необходимо иметь положительные и отрицательные контрольные образцы. Поэтому на следующем этапе работы мы сконструировали положительный контрольный образец для разработанной методики МПЦР диагностики ортопоксвирусов. ПКО содержит смесь 6 рекомбинантных плазмидных ДНК, пять из которых несут вставки, содержащие нуклеотидные последовательности видоспецифичных районов, используемых для видовой идентификации ортопоксвирусов. Шестая рекомбинантная плазмида несет вставку, содержащую нуклеотидную последовательность района ОРТ F4L VACV, используемого для родоспецифичной идентификации ортопоксвирусов. Амплификация со смесью олигонуклеотидных праймеров для МПЦР на смеси ДНК шести полученных рекомбинантных плазмид показала, что образуются ПЦР продукты, соответствующие расчетной длине для каждого вида ортопоксвируса и родоспецифичного фрагмента ортопоксвирусов. Таким образом, смесь полученных рекомбинантных плазмид можно использовать как положительный контрольный образец для разработанной методики видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов.

Диагностическую ценность разработанной методики определяли по таким характеристикам, как чувствительность и специфичность, которые, в свою очередь, делятся на аналитическую и диагностическую.

Аналитическая специфичность оценивается при проведении ПЦР на панели образцов ДНК различных возбудителей. Мы провели оценку разработанного метода МПЦР диагностики патогенных для человека ортопоксвирусов на панели образцов ДНК

59 штаммов 5 различных видов ортопоксвирусов, включая непатогенный для человека ECTV (таблица 5). Различные штаммы VARV, MPXV, CPXV и VACV, включая клинический материал (корочки кожных поражений), полученный от людей, болевших в 1970-1975 г. натуральной оспой, были успешно идентифицированы в МПЦР. Все результаты амплификации соответствовали ожидаемым. Подтверждающее определение нуклеотидной последовательности амплификационных продуктов, полученных в МПЦР на ДНК двух штаммов каждого вида VARV, MPXV, CPXV и VACV показало, что последовательности нарабатываемых амплификационных продуктов идентичны последовательностям диагностируемых ортопоксвирусов. Для штаммов ECTV в МПЦР выявляли только родоспецифичный фрагмент ДНК. Используемая смесь пар праймеров не давала ПЦР продуктов при амплификации с ДНК неродственных поксвирусов - вирусов миксомы кролика и фибромы Шоупа (род Leporipoxvirus), вируса оспы кур (род Avipoxvirus). Также используемая смесь пар праймеров не давала ПЦР продуктов при амплификации на ДНК таких возбудителей как вирусы простого герпеса 1 и 2 типа, вируса ветряной оспы (таблица 9). Таким образом, аналитическая специфичность МПЦР в наших экспериментах составила 100 %.

Диагностическая специфичность определяется процентным выражением частоты истинно отрицательных результатов теста у лиц, не страдающих данной болезнью. Диагностическую специфичность оценивали на препаратах крови здоровых людей (цельная кровь и сыворотка крови человека). На ДНК, выделенной из 35 клинических образцов крови человека, неспецифические фрагменты в ПЦР не формировались. Таким образом, диагностическая специфичность МПЦР в наших экспериментах составила 100 %.

Аналитическая чувствительность применительно к ПЦР представляет собой то минимальное количество ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Аналитическую чувствительность оценивали с помощью препарата ДНК вируса оспы коров, выделенного из очищенного в градиенте сахарозы CPXV штамма GRI-90 с известным физическим и биологическим титром (таблица 10). С помощью МПЦР анализа мы провели серию с 2-кратным разведением препарата ДНК вируса оспы коров. Каждое разведение проводили в трех повторах. Предел детекции составил 103в.ч. в мл исходного образца (рисунок 31) или 33 БОЕ/мл. Данный показатель отвечает требованиям, предъявляемым для диагностических тест систем согласно МУ 1.3.1794-03, в соответствии с которыми аналитическая чувствительность тест-систем для выявления ДНК (РНК) микроорганизмов методом ПЦР должна составлять 1 х 102 - 1 х 104 м.к. (геномных эквивалентов)/мл.

Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора и оценивается в процентах. Диагностическую чувствительность определяли в сравнении с культуральным методом на клиническом материале (корочки кожных поражений), полученном от людей, болевших в 1970-1975 г. натуральной оспой и оспой обезьян. При использовании культурального метода ортопоксвирусы были выделены в пяти образцах из семи (таблица 11). Один из изолятов ранее ошибочно был отнесен к УАЯУ. При МПЦР-анализе материала клинических образцов во всех случаях была обнаружена и идентифицирована ДНК ортопоксвирусов. Также разработанным методом МПЦР была идентифицирована ДНК, выделенная из корочки с кожного поражения человека, образовавшейся после вакцинации штаммом ЛИВП УАСУ в 2000 г. Таким образом, диагностическая чувствительность МПЦР в наших экспериментах составила 100 %.

По результатам исследования разработана и зарегистрирована в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» нормативно-техническая документация на метод видоспецифичной экспресс диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов - УАЯУ, МРХУ, СРХУ и УАСУ на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции:

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гаврилова, Елена Васильевна, Кольцово

1. Богданов Ю.М. Вирусные экзантемы в детском возрасте. http://medafami.ru/php/content.php?m4)up=2&id=5766. 2005.

2. Гендон Ю.З. Этиология острых респираторных заболеваний. // Бюллетень "Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики". 2001. - Т. 17. - № 5. http://medi.rU/doc/15Ы 703.htm.

3. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. Методы. Москва: Мир. - 1989. - С. 368.

4. Евстропов А.Н. Возбудители острых респираторных вирусных инфекций человека. // Клиническая антимикробная химиотерапия. 2001. - Т. 3. - № 1 -2.

5. Жукова O.A. Современные ортопоксвирусные заболевания человека, диагностика и экология возбудителей. // Москва: Дисс. канд. 1993. - С. 147.

6. Киселев В.И., Киселев О.И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. Санкт Петербург, Москва: Роза мира. - 2003.

7. Кулаков В.И., Аполихина И.А., Прилепская В.Н., Гус А.И., Сухих Г.Т. Современные подходы к диагностике папилломавирусной инфекции гениталий у женщин и их значение для скрининга рака шейки матки. // Практическая гинекология. 1999. - Т 1. - № 2. - С. 4-7.

8. Ладный И.Д. Инструкция по профилактике заболевания коровьей оспой. 1976. - С. 7.

9. Маниатис Т., Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир. - 1984. - С. 480.

10. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. -Москва: КМК Scientific Press Ltd. 1998. - С. 386.

11. Мацевич Г.Р., Радюк С.Н., Рыжов К.А., Анджапаридзе О.Г. Эволюция методов лабораторной диагностики ортопоксвирусных инфекций. // Вопр. вирусол. 1996. -Т. 41. -№ 5. - С. 195-197.

12. Методические рекомендации. Натуральная оспа (клиника, лечение, иммунопрофилактика). Москва: ФМБА. - 2006. - С. 60.

13. Методические указания (МУ 1.3.1794-03) "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I II групп патогенности" - 2003. - С. 43.

14. Молочков В.А., Кисилев В.И., Рудых И.В., Щербо С.Н. Папилломавирусная инфекция: клиника-диагностика-лечение. Пособие для врачей. Москва: Студия "Мирада Вива". - 2005. - С. 32.

15. Онищенко Г.Г., Сандахчиев Л.С., Нетесов C.B., Щелкунов C.B. Биотерроризм как национальная и глобальная угроза. // Журн. микробиол. 2000. - Т. 6. - С. 83-85.

16. Патент РФ №2134871 "Способ подготовки биологического материала для ПЦР генамплификационной диагностики" от 2.12.1999

17. Патент РФ №2164532 "Способы и наборы реагентов для генамплификационной диагностики методами ПЦР и РНК-ПЦР " от 27.03.2001.

18. Патент РФ №2208645 "Способ определения бактериальной контаминации крови" от 20.07.2003.

19. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Москва: Наука. - 2004. - С. 526.

20. Федоров H.A., Ёлов A.A., Суханов Ю.С., Жибурт Е.Б. Генамплификационное (NAT) тестирование крови и других материалов на патогены и мутации. Москва: Полиграфсервис. - 2003. - С. 210.

21. Щелкунов С.Н. Ортопоксвирусный геном. // Молекул, биол. 1996. - Т. 30. - № 1. -С. 5-32.

22. Adcock P.M., Stout G.G., Hauck M.A., Marshall G.S. Effect of rapid viral diagnosis on the management of children hospitalized with lower respiratory tract infection. // Pediatr. Infect. Dis. J. 1997. - V. 16. - P. 842-846.

23. Aitichou M., Javorschi S., Ibrahim M.S. Two-color multiplex assay for the identification of orthopox viruses with real-time LUX- PCR. // Mol. Cell. Probes. 2005. - V. 19. - № 5. -P. 323-328.

24. Antoine G., Scheiflinger F., Dorner F., Falkner F.G. The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses. // Virology. -1998. V. 244. - № 2. - P. 365-396.

25. Baroudy B.M., Venkatesan S., Moss B. Structure and replication of vaccinia virus telomeres. // Cold. Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1983. - V. 47. - № 2. - P. 723-729.

26. Baxby D., Ashton D.G., Jones D.M., Thomsett L.R. An outbreak of cowpox in captive cheetahs: virological and epidemiological studies. // J. Hyg. (Lond). 1982. - V. 89. - P. 365-372.

27. Bennett M., Gaskell C.J., Gaskell R.M., Baxby. D., Gruffydd-Jones T.J. Poxvirus infection in the domestic cat: some clinical and epidemiological observations. // Vet. Rec. 1986. -V. 11814.-№22.-P. 387-390.

28. Betts R.F. Influenza virus. In: Mandell G.L., Benett J.E., Dolin R. (eds.). Principles and practice of infectious diseases. 4th ed. New York: Churchill Livingstone. - 1995. - P. 1546-1567.

29. Bjornberg R., Bjornberg A. Secondary exanthema with cowpox. // Svenska Lakartidningen. 1956. - V. 53. - № 11. - P. 655-662.

30. Bray M. Pathogenesis and potential antiviral therapy of complications of smallpox vaccination. // Antiviral Res. 2003. - V. 58. - P. 101-114.

31. Bray M., Roy C.J. Antiviral prophylaxis of smallpox. // J. Antimicrob. Chemother. 2004. -V. 54.-P. 1-5.

32. Breman J.G. Monkeypox: an emerging infection for humans? In: Scheld W.M., Craig W.A., Hughes J.M. (eds.). Emerging infections 4. Washington, DC: American Society for Microbiology Press. - 2000. - P. 45-67.

33. Breman J.G., Henderson D.A. Current concepts: diagnosis and management of smallpox. // N. Engl. J. Med. -2002. -V. 346. P. 1300-1308.

34. Burd E.M. Human Papillomavirus and Cervical Cancer. // Clin. Microbiol. Rev. 2003. -V. 16.-№ l.-P. 1-17.

35. Casas I., Pozo F., Trallero G., Echevarria J.M., Tenorio A. Viral diagnosis of neurological infection by RT multiplex PCR: a search for entero- and herpesviruses in a prospective study. // J. Med. Virol. 1999. - V. 57. - P. 145-151.

36. Cassinotti P., Mietz H., Siegl G. Suitability and clinical application of a multiplex nested PCR assay for the diagnosis of herpes simplex virus infections. // J. Med. Virol. 1996. -V. 50.-P. 75-81.

37. CDC 2005. Centers for Disease Control. Prevention and Control of Influenza Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR 2005; 54 (RR08): 1-40. http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr5408al.htm

38. CDC. Update: multistate outbreak of monkeypox in Illinois, Kansas, Missouri, Ohio, and Wisconsin, 2003. // MMWR Morb. Mortal Wkly Rep. 2003a. - V. 52. - P. 642-646.

39. Chuansumrit A., Varavithya W., Isarangkura P., Sirinavin S., Chiewsilp P., Tanprasert S., Hathirat P. Transfusion-transmitted AIDS with blood negative for anti-HIV and HIV-antigen.//Vox. Sang.- 1996.-V. 71.-P. 64-65.

40. Clavel C., Rihet S., Masure M., Chypre C., Boulanger J.C., Quereux C., Birembaut P. DNA-EIA to detect high and low risk HPV genotypes in cervical lesions with E6/E7 primer mediated multiplex PCR. // J. Clin. Pathol. 1998. - V. 51. - P. 38-43.

41. Czerny C.P., Eis-Hübinger A.M., Mayr A., Schneweis K.E., Pfeiff B. Animal poxviruses transmitted from cat to man: current event with lethal end. //J. Vet. Med. 1991. - V. 1338.-P. 421-431.

42. Damon I.K., Roth C.E., Chowdhary V. Discovery of monkeypox in Sudan. // N. Engl. J. Med. 2006. - V. 355. - № 9. - P. 962-963.

43. De Clercq E. Cidofovir in the therapy and short-term prophylaxis of poxvirus infections. // Trends Pharmacol Sci. 2002. - V. 23. - № 10 - P. 456-458.

44. De Clercq E. Vaccinia Virus Inhibitors as a Paradigm for the Chemotherapy of Poxvirus Infections. // Clin. Microbiol. Rev. 2001. - V. 14. - №. 2. - P. 382-397.

45. DeBiasi R.L., Tyler K.L. Molecular methods for diagnosis of viral encephalitis. // Clin. Microbiol. Rev. 2004. - V. 17. - № 4. - P. 903-925.

46. Dekking F. Cowpox and vaccinia. In: J.van der Hoeden (eds.). Zoonosis. Amsterdam: Elsevier.- 1964.-P. 411-418.

47. Denny F.H., Murphy T.F., Clyde W.A., Collier A.M., Henderson F.W. Croup: an 11-year study in a pediatric practice. // Pediatrics. 1983. - V. 71. - P. 871-876.

48. Denny F.W., Clyde W.A. Acute lower respiratory infections in nonhospitalized children. // J. Pediatr. 1986. -V. 108. - P. 635-646.

49. Dineva M.A., Candotti D., Fletcher-Brown F., Allain J.-P., Lee H. Simultaneous Visual Detection of Multiple Viral Amplicons by Dipstick Assay. // J. Clin. Microbiol. 2005. -V. 43.-№.8. -P. 4015-4021.

50. Dixon C.W. Smallpox. London: J.& A. Churchill Ltd. - 1962. - P. 511.

51. Douglass N.J., Richardson M., Dumbell K.R. Evidence for recent genetic variation in monkeypox viruses. // J. Gen. Virol. 1994. - V. 75. - P. 1303-1309.

52. Dumbell K.R., Huq F. The virology of variola minor. Correlation of laboratory tests with the geographic distribution and human virulence of variola isolates. // Amer. J. Epidemiol. 1986.-V. 123.-P. 403-415.

53. Eis-Hübinger A.M., Gerritzen A., Schneweis K.E., Pfeiff B., Pullmann H., Mayr A., Czerny C.P. Fatal cowpox-like virus infection transmitted by cat. // Lancet. 1990. - V. 336.-P. 880.

54. Ellis J.S., Fleming D.M., Zambon M.C. Multiplex reverse transcription-PCR for surveillance of influenza A and B viruses in England and Wales in 1995 and 1996. // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - P. 2076-2082.

55. Elnifro E.M., Ashshi A.M., Cooper R.J., Klapper P.E. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. //Clin. Microbiol. Rev. 2000. - V. 13. - № 4. - P. 559-570.

56. Esposito J.J., Knight J.C. Orthopoxvirus DNA: a comparison of restriction profiles and maps.//Virology.-1985.-V. 143.-№ l.-P. 230-251.

57. Esposito J.J., Obijeski J.F., Nakano J. H. Orthopoxvirus DNA: strain differentiation by electrophoresis of restriction endonuclease fragmented virion DNA. // Virology. 1978. -V. 89. - P. 53-66.

58. Espy M.J., Cockerill F.R., Meyer R.F., Bowen M.D., Poland G.A., Hadfield T.L., Smith T.F. Detection of smallpox virus DNA by LightCycler PCR. // J. Clin. Microbiol. 2002. -V. 40,-№6.-P. 1985-1988.

59. Fan J., Henrickson K.J. Rapid diagnosis of human parainfluenza virus tipe 1 by by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction-enzyme hybridization assay. // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34. - P. 1914-1917.

60. Fedorko D.P., Preuss J.C., Fahle G.A., Li L., Fischer S.H., Hohman, P., Cohen J.I. Comparison of methods for detection of Vaccinia virus in patient specimens. // J. Clin. Microbiol. 2005. - V. 43. - № 9. - P. 4602-4606.

61. Fenner F., Wittek R., Dumbell K.R. The Orthopoxviruses. San Diego, New York, Berkeley, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto: Academic Press, Inc. - 1989. - P. 432.

62. Feuerstein-Kadgien B., Korn K. Images in clinical medicine. Cowpox infection. // N. Engl. J. Med. 2003. - V. 348 -№ 5. - P. 415.

63. Gallarda J.L., Dragon E. Blood screening by nucleic acid amplification technology: current issues, future challenges. // Mol. Diagn. 2000. - V. 5. - P. 11-22.

64. Glezen W.P., Frank A.L., Taber L.H., Kasel J.A. Parainfluenza virus type 3: seasonality and risk of infection and reinfection in young children. // J. Infect. Dis. 1984. - V. 150. -P. 851-857.

65. Goebel S.J., Johnson G.P., Perkus M.E., Davis S.W., Winslow J.P., Paoletti E. The complete DNA sequence of vaccinia virus. // Virology. 1990. - V. 179. - № 1. - P. 247266.

66. Gross G.E., Barasso R. Human papillomavirus infection: a clinical atlas. Wiesbaden: Ullstein Mosby GmbH and Co. KG. - 1997.

67. Henegariu O., Heerema N.A., Dlouhy S.R., Vance G.H., Vogt P.H. Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. // Bio-Techniques. 1997. - V. 23. - P. 504-511.

68. Henrickson K.J. Parainfluenza Viruses. // Clin. Microbiol. Rev. 2003. - V. 16. - № 2. -P. 242-264.

69. Hu F.Q., Smith C.A., Pickup D.J. Cowpox virus contains two copies of an early gene encoding a soluble secreted form of the type II TNF receptor. // Virology. 1994. - V. 204. - № 1. - P. 343-356.

70. Hutin Y.J., Williams R.J., Malfait P., Pebody R., Loparev V.N., Ropp S.L. Outbreak of human monkeypox, Democratic Republic of Congo, 1996 to 1997. // Emerg. Infect. Dis. -2001.-V. 7.-P. 434-438.

71. Ibrahim M.S., Esposito J.J., Jahrling P.B., Lofts R. S. The potential of 5' nuclease PCR for detecting a single-base polymorphism in orthopoxvirus. // Mol. Cell. Probes. 1997. -V. 11.-P. 143-147.

72. Ibrahim M.S., Kulesh D.A., Saleh S.S., Damon I.K., Esposito J.J., Schmaljohn A.L., Jahrling P.B. Real-time PCR assay to detect smallpox vims. // J. Clin. Microbiol. 2003. -V. 41. -№ 8. - P. 3835-3839.

73. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J. Optimization of PCRs. In PCR protocol. A Guide to Methods and Applications. San Diego: Academic Press. - 1990. - P. 3-13.

74. Jerrard D.A., Hanna J.R., Schindelheim G.L. Cerebrospinal fluid. // J. Emerg. Med. 2001. -V.21.-P. 171-178.

75. Kamps B.S, Hoffmann C., Preiser W. Influenza Report. Paris, Cagliari, Wuppertal, Sevilla: Flying publisher. - 2006. - P. 225.

76. Kehl S.C., Henrickson K.J., Hua W., Fan J. Evaluation of the hexaplex assay for detection of respiratory viruses in children. // J. Clin. Microbiol. 2001. -V. 39. - № 5. - P. 16961701.

77. Kennedy P. Viral encephalitis: causes, differential diagnosis, and management. // J. Neural. Neurosurg. Psychiatry. 2004. - V. 75. - P. 10-15.

78. Kennedy P., Chaudhury A. Diagnosis and treatment of viral encephalitis. // Postgrad. Med. J.-2002.-V. 78.-P. 575-583.

79. Kovacs G.R., Moss B. The vaccinia virus H5R gene encodes late gene transcription factor 4: purification, cloning and overexpression. // J. Virol. 1996. -V. 70. - № 10. - P. 67966802.

80. Laassri M., Chizhikov V., Mikheev M., Shchelkunov S., Chumakov K. Detection and discrimination of orthopoxviruses using microarrays of immobilized oligonucleotides. // J. Virol. Methods. 2003. - V. 112(1-2). - P. 67-78.

81. Ladnyi I.D., Ziegler P., Kima A. A human infection caused by monkeypox virus in Basankusu Territory, Democratic Republic of the Congo. // Bull. W.H.O. 1972. - V. 46. - P. 593-597.

82. Landry M.L. False-positive polymerase chain reaction results in the diagnosis of herpes simplex encephalitis. // J. Infect. Dis. 1995. - V. 172. -№ 6. - P. 1641-1643.

83. Lewis-Jones S. Zoonotic poxvirus infections in humans. // Curr. Opin. Infect. Dis. 2004. -V. 17.-№2.-P. 81-89.

84. Li Y., Olson V.A., Laue T., Laker M.T., Damona I.K. Detection of monkeypox virus with real-time PCR assays. // J. Clin. Virol. 2006. - V. 36. - P. 194-203.

85. Loparev V.N., Massung R.F., Esposito J.J., Meyer H. Detection and differentiation of old world orthopoxviruses: restriction fragment length polymorphism of the crmB gene region. // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - № 1. - P. 94-100.

86. Mackett M., Archard L.C. Conservation and variation in orthopoxvirus genome structure. // J. Gen. Virol. 1979. - V. 45. - P. 683-701.

87. Marennikova S.S., Ladnyj I.D., Ogorodinikova Z.I., Shelukhina E.M., Maltseva N.N. Identification and study of a poxvirus isolated from wild rodents in Turkmenia. // Arch. Virol. 1978. - V. 56. -№ 1-2. - P. 7-14.

88. Marennikova S.S., Maltseva N.N., Korneeva V.I., Garanina N. Outbreak of pox disease among carnivora (felidae) and edentate. // J. Infect. Dis. 1977. - V. 135. - P. 358-366.

89. Marennikova S.S., Shelukhina E.M., Fimina V.A. Pox infection in white rats. // Lab. Anim. 1978. -V. 12.-№ l.-P. 33-36.

90. Marennikova S.S., Shelukhina E.M., Maltseva N.N., Cimiskjan K.L., Macevic G.R. Isolation and properties of the casual agent of a new variola-like disease (monkeypox) in man. // Bull. W.H.O. 1972. - V. 46. - P. 599-611.

91. Marx A., Torok T.J., Holman R.C., Clarke M.J., Anderson L.J. Pediatric hospitalizations for croup (laryngotracheobronchitis): biennial increases associated with human parainfluenza virus 1 epidemics. // J. Infect. Dis. 1997. - V. 176. - P. 1423-1427.

92. Massung R.F., Liu L.I., Qi J., Knight J.C., Yuran T.E., Kerlavage A.R., Parsons J.M., Venter J.C., Esposito J.J. Analysis of the complete genome of smallpox variola major virus strain Bangladesh-1975. // Virology. 1994. - V. 201. -№ 2. - P. 215-240.

93. Meyer H., Neubauer H., Pfeffer M. Amplification of 'Variola virus-specific' sequences in German Cowpox virus isolates. // J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health. 2002. -V. 49.-P. 17-19.

94. Meyer H., Pfeffer M., Rziha H.J. Sequence alterations within and downstream of the Atype inclusion protein genes allow differentiation of Orthopoxvirus species by polymerase chain reaction. // J. Gen. Virol. 1994. - V. 75. - P. 1975-1981.

95. Meyer H., Ropp S.L., Esposito J.J. Gene for A-type inclusion body protein is useful for a polymerase chain reaction assay to differentiate orthopoxviruses. // J. Virol. Methods. -1997.-V. 64.-P. 217-221.

96. Meyer H., Totmenin A., Gavrilova E., Shchelkunov S. Variola and camelpox virus-specific sequences are part of a single large open reading frame identified in two German cowpox virus strains. // Virus Res. 2005. - V. 108(1-2). - P. 39-43.

97. Moss B. Molecular biology of poxviruses. Recombinant Poxviruses. Boca Ration: CRC Press.-1992.-P. 45-80.

98. Moss B. Regulation of vaccinia virus transcription. // Annu. Rev. Biochem. 1990. - V. 59.-P. 661-688.

99. Mukinda V.B.K., Mwema G., Kilundu M., Heymann D.L., Khan A.S., Esposito J.J. Re-emergence of human monkeypox in Zaire in 1996. Monkeypox Epidemiologic Working Group. // Lancet. 1997. - V. 349. - P. 1449-1450.

100. Neubauer H., Pfeffer M., Meyer H. Specific detection of mousepox virus by polymerase chain reaction. // Lab. Anim. 1997. - V. 31. - № 3. - P. 201-205.

101. Neubauer H., Reischl U., Ropp S., Esposito J.J., Wolf H.,Meyer H. Specific detection of monkeypox virus by polymerase chain reaction. // J. Virol. Methods. 1998. - V. 74. - № 2.-P. 201-207.

102. Nitsche A., Ellerbrok H., Pauli G. Detection of orthopoxvirus DNA by real-time PCR and identification of variola virus DNA by melting analysis. // J. Clin. Microbiol. 2004. - V. 42. -№ 3. - P. 1207-1213.

103. Nitsche A., Steger B., Ellerbrok H., Pauli G. Detection of vaccinia virus DNA on the LightCycler by fluorescence melting curve analysis. // J. Virol. Methods. 2005. - V. 126. -P. 187-195.

104. Panning M., Asper M., Kramme S., Schmitz H., Drosten C. Rapid detection and differentiation of human pathogenic orthopox viruses by a fluorescence resonance energy transfer real-time PCR assay. // Clin. Chem. 2004. - V. 50. - № 4. - P. 702-708.

105. Pelkonen P.M., Tarvainen K., Hynninen A., Kallio E.R.K., Henttonen H., Palva A., Vaheri A., Vapalahti O. Cowpox with severe generalized eruption, Finland. // Emerg. Infect. Dis. -2003.-V. 9.-№11.-P. 1458-1461.

106. Pizzighella S., Pisoni G., Bevilacqua F., Vaona A. Simultaneous polymerase chain reaction detection and restriction typing for the diagnosis of human genital papillomavirus infection. // J. Virol. Methods. 1995. - V. 55. - P. 245-256.

107. Polz M.F., Cavanaugh C.M. Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - № 10. - P. 3724-3730.

108. Read S.J., Jeffery K.J.M., Bangham C.R.M. Aseptic Meningitis and Encephalitis: the role of PCR in the diagnostic laboratory. // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. -№ 3. - P. 691696.

109. Read S.J., Kurtz J.B. Laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system by using a single multiplex PCR screening assay. // J. Clin. Microbiol. -1999.-V. 37.-P. 1352-1355.

110. Resenchuk S.M., Blinov V.M. ALIGNMENT SERVICE: creation and processing of alignments of sequences of unlimited length. // Comput. Appl. Biosci. 1995. - V. 11. - № l.-P. 7-11.

111. Ries L.A.G., Eisner M.P., Kosary C.L., Hankey B.F., Miller B.A., Glegg L., Edwards B.K. SEER cancer statistics review 1973-1998. National Cancer Institute, Bethesda, Md. -2001.

112. Ropp S.L., Jin Q.I., Knight J.C., Massung R.F., Esposito J.J. Polymerase chain reaction strategy for identification and differentiation of smallpox and other ortopoxviruses. // J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33. P. 2069-2076.

113. Ryabinin V.A., Shundrin L.A., Kostina E.B., Laassri M., Chizhikov V., Shchelkunov S.N., Chumakov K., Sinyakov A.N. Microarray assay for detection and discrimination of Orthopoxvirus species. // J. Med. Virol. 2006. - V. 78(10). - P. 1325-1340.

114. Rychlik W., Rychlik P. Oligo 6: Primer analysis software. Molecular biology insights. -Connecticut - 2000.

115. Schmidt M., Roth K.W., Meyer H., Seifried E., Hourfar M.K. Nucleic acid test screening of blood donors for orthopoxviruses can potentially prevent dispersion of viral agents in case of bioterrorism. // Transfusion. 2005. - V. 45. - P. 399-403.

116. Shchelkunov S.N., Marennikova S.S., Moyer R.W. Orthopoxviruses pathogenic for humans. New York: Springer Science + Business Media, Inc. - 2005. - P. 425.

117. Shchelkunov S.N., Resenchuk S.M., Totmenin A.V., Blinov V.M., Marennikova S.S., Sandakhchiev L.S. Comparison of the genetic maps of variola and vaccinia viruses. // FEBS Lett. 1993. - V. 327. - № 3. - P. 321-324.

118. Spencer R.C., Lightfoot N.F. Preparedness and response to bioterrorism. // J. Infect. -2001.-V. 43.-P. 104-110.

119. Spitzer M. Cervical screening adjuncts: recent advances. // Am. J. Obstet. Gynecol. 1998. -V. 179.-P. 544-556.

120. Stephenson J. Monkeypox outbreak a reminder of emerging infections vulnerabilities. // J. Am. Med. Assoc. 2003. - V. 290. № 1. - P. 23-24.

121. Stewart K.J., Telfer S., Bown K.J., White M.I. Cowpox infection: not yet consigned to history. // Br. J. Plast. Surg. 2000. - V. 53. - № 4. - P. 348-350.

122. Stockton J., Ellis J.S., Saville M., Clewley J.P., Zambon M.C. Multiplex PCR for typing and subtyping Influenza and Respiratory Syncytial Viruses. // J. Clin. Microbiol. 1998. -V. 36.-№ 10.-P. 2990-2995.

123. Stolz W., Gotz A., Thomas P., Ruzicka T., Suss R., Landthaler M., Mahnel H., Czerny C.P. Characteristic but unfamiliar the cowpox infection, transmitted by a domestic cat. // Dermatology. 1996. - V. 193. -№ 2. - P. 140-143.

124. Suzuki M.T., Giovannoni S.J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixtures of 16S rRNA genes by PCR. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 625—630.

125. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. // Nucleic Acids Research. 1997. - V. 24. - P. 4876-4882.

126. Vandenvelde C., Verstraete M., Van Beers D. Fast multiplex polymerase chain reaction on boiled clinical samples for rapid viral diagnosis. // J. Virol. Methods. 1990. - V. 30. - P. 215-227.

127. Wagner A., Blackstone N., Cartwright P., Dick M., Misof B., Snow P., Wagner G.P., Bartels J., Murtha M., Pendleton J. Surveys of gene families using polymerase chain reaction: PCR selection and PCR drift. // Syst. Biol. 1994. - V. 43. - P. 250-261.

128. Walsh P.S., Erlich H.A., Higuchi R. Preferential PCR amplification of alleles: mechanisms and solutions. // PCR Methods and Applications. 1992. - V. 1. - P. 241-250.

129. Wang Y., Ma W.L., Mao X.M., Wu Q.H., Li L., Wang H.M., Xiao W.W., Zheng W.L. Design and preparation of oligonucleotide microarray for vaccinia virus detection. // Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. 2004. - V. 24(2). - P. 180-183.

130. Weekly Epidemiological Record. Human monkeypox in Kasai Oriental, Zaire (1996-1997). 1997.-V. 72.-№15.-P. 101-104.

131. Wenli M., Yan W., Hongmin W., Wenling Z. An oligonucleotide microarray for the detection of vaccinia virus. // Br. J. Biomed. Sci. 2004. - V. 61(3). - P. 142-145.

132. Whitley R.J., Gnann J.W. Viral encephalitis: familiar infections and emerging pathogens. // Lancet. 2002. - V. 359. - P. 507-513.

133. WHO recommendations on the use of rapid testing for influenza diagnosis. http://www.who.int/csr/disease/avian influenza/guidelines/RapidTestlnfluenza web.pdf*. Geneva: World Health Organisation. 2005.

134. Wiser I., Balicer R.D., Cohen D. An update on smallpox vaccine candidates and their role in bioterrorism related vaccination strategies. // Vaccine. 2007. - V. 25. - P. 976-984.

135. Wolfs T.F., Wagenaar J.A., Niesters H.G., Osterhaus A.D. Rat-to-Human Transmission of Cowpox Infection. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - V. 8. - № 12. - P. 1495-1496.

136. Zdenek J., Fenner F. Human monkeypox. In: Monographs in Virology. Karger. - 1988. -P. 140.

137. Zimmermann K., Schogl D., Plaimauer B., Mannhalter J.W. Quantitative multiple competitive PCR of HIV-1 DNA in a single reaction tube. // BioTechniques. 1996. - V. 21.-P. 480-484.

Информация о работе

Гаврилова, Елена Васильевна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Разработка метода видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе использования мультиплексной ПЦР - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы