Разработка систем идентификации грибов - возбудителей экономически значимых болезней зерновых культур методом ПЦР

Абрамова, Светлана Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка систем идентификации грибов - возбудителей экономически значимых болезней зерновых культур методом ПЦР
ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Разработка систем идентификации грибов - возбудителей экономически значимых болезней зерновых культур методом ПЦР"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи

Щг

Абрамова Светлана Леонидовна

РАЗРАБОТКА СИСТЕМ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГРИБОВ -ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЭКОНОМИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ ПЦР

Специальность 03.02.12 - микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 ? ОКГ 2013

Москва-2013

005535215

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии Россельхозакадемии

Научный руководитель:

член-корреспондент Россельхозакадемии, доктор биологических наук, профессор Завриев Сергей Кириакович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Еланский Сергей Николаевич

доктор биологических наук, профессор Бабаков Алексей Владимирович

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится 15 ноября 2013 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет, ауд. 389. Т/факс: (495) 939-39-70.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » октября 2013 г.

Ученый секретарь _,

диссертационного совета, м. А. Гусаковская

кандидат биологических наук у '

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Болезни сельскохозяйственных растений, вызываемые грибами, наносят существенный ущерб урожаю и приводят к экономическим потерям (Eyal, 1999; Санин и др., 2010). Применение интенсивных технологий при возделывании зерновых культур зачастую приводит к ухудшению фитосанитарной ситуации не только с наиболее распространенными и вредоносными грибами, такими как Septoria tritici и Stagonospora nodorum и возбудителями корневых гнилей и фузариоза колоса из рода Fusarium (Иващенко и др., 2004; Санин и др., 2010), но также способствует расширению ареала и увеличению вредоносности возбудителей ржавчины Puccinia striiformis и Р. graminis (Назарова и др., 2008).

Для своевременного применения средств защиты растений от болезней и контроля зараженности зерна фитопатогенными грибами на разных стадиях его производства и переработки необходима их детекция и точная идентификация (Kristensen et al., 2005; Lievens et al., 2005). В полевых условиях предварительный диагноз болезней, вызываемых фитопатогенными грибами, ставят по проявлению симптомов заболевания, а точную идентификацию возбудителя проводят в лаборатории главным образом по морфологии спор и другим морфолого-культуральным признакам патогена с применением методов микроскопии и культивирования на питательных средах. Однако, морфологические характеристики спор у близкородственных видов микромицетов могут совпадать, а внутри одного вида значительно варьировать. Кроме того, симптомы болезни могут проявляться нетипично или заболевание может проходить в скрытой форме (Пыжикова, 1984; Иващенко и др., 2004; Shcherbakova, 2007). В связи с этим применение более чувствительных методов является актуальным и востребованным в диагностике фитопатогенов.

В последние годы для идентификации и детекции фитопатогенных микроорганизмов все чаще применяется метод ПЦР. Он превосходит традиционные методы по специфичности, чувствительности, быстроте проведения анализа, производительности, и служит их существенным дополнением. Кроме того, его применение не требует глубоких знаний биологии и морфологии исследуемых микромицетов (McCartney et al., 2003; Lievens et al., 2005).

использовать вариабельность анализируемых последовательностей нуклеотидов. Это обеспечивает высокую специфичность диагностическим системам, создаваемым на их основе.

Среди методов, основанных на полимеразной цепной реакции, одним из наиболее адаптированных для практического применения является метод ПЦР с детекцией результатов в формате FLASH (качественная флуоресцентно-гибридизационная полимеразная цепная реакция). Использование флуорогенных зондов повышает чувствительность метода. Детекцию флуоресценции проводят сразу после окончания амплификации, что существенно ускоряет процесс получения результатов, по сравнению с электрофорезом в геле. Кроме того, при соблюдении правил работы исключается возможность контаминации рабочей зоны продуктами амплификации, а программное обеспечение облегчает сбор и хранение информации о проводимых тестах. Наличие внутреннего контроля (ВК) прохождения реакции повышает надежность метода и позволяет контролировать появление ложноотрицательных результатов.

Метод FLASH-ПЦР ранее был применен для создания систем диагностики фитопатогенных вирусов, бактерий, нематод и грибов, в том числе и карантинных (Кулинич и др., 2008; Рязанцев, 2009; Рязанцев и Завриев, 2009).

Цель и задачи исследований. Целью настоящей диссертационной работы являлась разработка праймеров и зондов для идентификации грибов -возбудителей септориоза (Septoria tritici, Stagonospora nodorum), фузариозов (Fusarium graminearum, F. culmorum, F. sporotrichioides, F. avenaceum, F. tricinctum, F. poae, F. langsethiae), желтой (Puccinia striiformis) и стеблевой (P. graminis) ржавчины зерновых культур. Основные задачи:

1. Выявить в геноме исследуемых грибов локусы, наиболее перспективные для их идентификации.

2. Разработать праймеры для идентификации и диагностики исследуемых видов.

3. Оптимизировать условия ПЦР с разработанными праймерами и проверить их специфичность на изолятах исследуемых видов грибов, собранных на территории РФ.

4. Разработать зонды и оптимизировать условия ПЦР для диагностики возбудителей септориоза и фузариоза в формате FLASH.

Научная новизна исследований. Разработаны высокоспецифичные праймеры для основанной на ПЦР идентификации и диагностики одиннадцати

видов экономически значимых грибных патогенов зерновых кулыур. Для девяти из них сконструированы зонды и создана система детекции с помощью ПЦР в формате FLASH, что позволило сократить время анализов и обеспечить надежную и точную идентификацию фитопатогенов.

Практическая значимость исследований. Разработанные праймеры и зонды стали основой для создания и внедрения в производство на базе ЗАО «НПФ ДНК-Технология» коммерческих наборов для идентификации и детекции возбудителей септориоза и фузариозов методом ПЦР в формате FLASH, а, впоследствии, и для наборов в формате ПЦР в реальном времени. Праймеры для идентификации возбудителей ржавчины подобраны с учетом требований к системам детекции в формате FLASH и могут быть использованы для разработки таких систем.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Россия, 2008) и на семинаре «Школа молодых ученых и аспирантов по молекулярной биологии - NOVA» (Финляндия, 2008).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Объем работы составляет 105 страниц. В диссертации содержится 9 таблиц и 31 рисунок. Список литературы содержит 154 источника, из них 132 иностранных авторов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В этой главе рассмотрено современное состояние в области биологии и эпидемиологии возбудителей ряда грибных патогенов зерновых культур. Подробно описаны имеющиеся в литературе данные о распространенности и вредоносности исследуемых видов грибов. Обсуждены различные методы диагностики грибных патогенов и требования, которым должны соответствовать диагностические системы, разработанные на основе метода ПЦР. Особое внимание уделено анализу существующих систем ПЦР-детекции и идентификации грибных фитопатогенов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. В работе использованы изоляты грибов S. tritici и S. nodorum, предоставленные к.б.н. старшим научным сотрудником Отдела

микологии и иммунитета ВНИИ фитопатологии Россельхозакадемии (ВНИИФ) Е. В. Пахолковой. Листья пшеницы с симптомами септориоза и пикнидами грибов S. tritici и S. nodorum были предоставлены д.б.н., заведующим Лабораторией микологи и фитопатологии им. А. А. Ячевского ВНИИ защиты растений Россельхозакадемии (ВИЗР) А. П. Дмитриевым.

Часть изолятов грибов рода Fusarium были предоставлена к.б.н., ведущим научным сотрудником Лаборатории микологии и фитопатологии им. А. А. Ячевского ВИЗР Т. Ю. Гагкаевой, а другая часть - к.б.н. старшим научным сотрудником Отдела микологии и иммунитета ВНИИФ Н. С. Жемчужиной.

Изоляты грибов рода Puccinia, выделенные из растений пшеницы, были взяты из Государственной коллекцией фитопатогенных микроорганизмов ВНИИФ.

Выделение ДНК. Для выделения ДНК из грибов рода Septoria, Stagonospora и Fusarium небольшое количество мицелия (приблизительно 25 мг) 5-7-дневной культуры помещали в 1,5 мл пробирки с 50 мкл стерильной дистиллированной воды. Гомогенизировали мицелий в пробирке пестиком. Выделение ДНК проводили с помощью набора «Проба-ГС», следуя протоколу фирмы производителя (ЗАО «НПФ ДНК-технология», Россия).

Для выделения ДНК из грибов рода Puccinia споры каждого изолята в количестве приблизительно 25 мг измельчали на гомогенизаторе TissueLyser LT («QIAGEN», Германия) в течение 15 минут с помощью шариков Tungsten Carbide Beads (3 мм) в режиме встряхивания пробирок с частотой 30 Гц. После этого из полученной мицелиальной массы выделяли ДНК с использованием набора «Проба-ГС», следуя протоколу фирмы производителя.

Подбор праймеров и зондов. Выравнивание последовательностей нуклеотидов, депонированных в ГенБанке, проводили с применением программы AlignX пакета Vector NTI Suite 8,0 (алгоритм ClustalW). Анализ нуклеотидных последовательностей для подбора олигонуклеотидов осуществляли с помощью программы Oligo 6,71.

Праймеры подбирали длиной 18-25 п.н. с температурой плавления 6871°С таким образом, чтобы фланкируемая ими нуклеотидная последовательность составляла около 350-400 п.н. При использовании в ПНР реакции внутреннего контроля (ВК), длина ампликона которого составляла 560 п.н., разница в длинах ампликонов специфического продукта и ВК обеспечивала их четкое разделение при проведении электрофоретического анализа.

Видоспецифичность сконструированных праймеров предварительно

проверяли с помощью программы BLAST, имеющейся на сайте National Center for Biotechnology Information (http://blast.nchi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Для создания зонда типа «молекулярный маячок» выбирали последовательность нуклеотидов внутри специфического ампликона, общую для нескольких исследуемых видов в пределах рода, длиной около 25 п.н. и с температурой плавления в пределах 79-81°С, которая рассчитывалась с помощью программы Oligo 6,71. Эта последовательность нуклеотидов входила в состав петли зонда, а в некоторых случаях частично и в состав стебля. Чтобы зонд принял форму шпильки к центральной его части, комплементарной участку амплифицируемой ДНК, с 5'- и З'-концов, с учетом данных программы mfold 3,2 (http://mfold.rna.albanv.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form). добавляли нуклеотиды С и G, комплементарное спаривание которых образовывало стебель структуры зонда.

Проведение ПЦР. ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» ТП4-ПЦР-01 (ЗАО «НПФ ДНК-технология», Россия). Для видов рода Septoria, Stagonospora и Fusarium реакционная смесь объемом 35 мкл содержала 3,5 мкл 10х буфера (750 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 200 мМ сульфат аммония, 0,1% Твин-20), 1 мМ каждого dNTP, по 12,5 пмоль праймеров, 2,5 ед. Тад-полимеразы и 5 мкл раствора ДНК (как правило, около 3-5 нг ДНК на реакцию). При проведении ПЦР с ВК в указанную реакционную смесь добавляли 0,002 пг плазмиды ВК и по 12,5 пмоль праймеров для ВК. Преимущественная амплификация специфического продукта происходила за счет оптимизации концентрации матрицы ВК в реакционной смеси. Для проведения ПЦР в формате FLASH, в реакционную смесь добавляли зонд для ВК (3,5 пмоль) и специфичный зонд (3,5 или 7 пмоль). Для определения фоновой флуоресценции использовалась та же реакционная смесь, только без добавления Тад-полимсразы.

Для снижения уровня неспецифического отжига праймеров до начала реакции амплификации компоненты смеси пространственно разделяли слоем парафина, при этом нижняя часть смеси содержала праймеры, зонд, буфер и dNTPs, а верхняя - 7а^-полимеразу и ДНК.

Для работы с ДНК грибов рода Puccinia реакционная смесь так же была объемом 35 мкл и содержала 3,5 мкл 10х буфера, 1 мМ каждого dNTP, по 12,5 пмоль праймеров, 2,5 ед. 7а^-полимеразы и 5 мкл раствора ДНК (около 3-5 нг ДНК на реакцию).

Специфичность праймеров для видов S. tritici, S. nodorum, F. graminearum, F. culmorum, F. sporotrichioides, F poae, F. avenaceum, F. tricinctum, F langsethiae проверяли по оптимизированной программе: (93°C - 90 сек) - 1

цикл; (93°С - 20 сек, 64°С, 67°С или 70°С - 10 сек) - 5 циклов; (93°С - 1 сек, или 70°С - 10 сек) — 40 циклов. Оптимальными считались ираймеры, с которыми при температуре отжига 64°С происходила специфичная амплификация ПЦР-продукта, и которые не теряли своей эффективности при температуре отжига 67°С. Эффективность ПЦР оценивали по интенсивности свечения полос в геле после электрофореза продуктов амплификации. FLASH-ПЦР для перечисленных выше видов проводили по программе: (93°С - 90 сек) -1 цикл; (93°С - 20 сек, 64°С - 5 сек, 67°С - 5 сек) - 5 циклов; (93°С - 1 сек, 64°С - 5 сек, 67°С - 5 сек) - 40 циклов.

Температуру отжига праймеров для амплификации специфических фрагментов ДНК видов P. graminis, P. striiformis подбирали в рамках программы: (93°С - 130 сек) - 1 цикл, (93°С - 15 сек, 60°С-67 °С - 10 сек, 72°С -15 сек ) - 40 циклов, (72°С - 190 сек) - 1 цикл.

Анализ продуктов ПЦР методом электрофореза в агарозном геле. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2,5% агарозном геле в трис-ацетатном буфере (40 мМ трис(гидроксиметил)аминометана, 20 мМ ледяной уксусной кислоты и 1 мМ EDTA) при постоянном напряжении 10 В/см. Гели окрашивали раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл, Маниатис и др., 1984) и фотографировали в ультрафиолетовом свете. Для определения молекулярного веса амплифицированных фрагментов использовали ДНК маркер 100-1000 п.н. с шагом 100 п.н. GeneRuler («Fermentas», Литва).

Анализ продуктов ПЦР в формате FLASH. Регистрацию уровня флуоресценции в реакционной смеси проводили после окончания ПЦР с помощью детектора «Джин» (НПФ «ЗАО ДНК-технология», Россия). При амплификации специфических ПЦР-продукгов флуоресцентное излучение детектировалось от красителя FAM (длины волны возбуждения/излучения 470/514 нм), а о результатах амплификации с ВК судили по флуоресценции красителя HEX (длина волн возбуждения/излучения 532/580 нм). Уровень флуоресценции в фоновых пробирках принимался за единицу, а величина специфического сигнала и сигнала ВК рассчитывалась программой в единицах фона: сигнал «ВК» больше 2,5 принимался за положительный (+); сигнал «Специфики» больше 2,1 регистрировался как положительный (+), менее 1,75 -отрицательный (-), а между 1,75 и 2,5 - сомнительный (?); при значениях сигнала «ВК» и «Специфики» меньше 1,75 результат считался недостоверным. Обсчет данных происходил автоматически по прилагаемой к флуориметру программе, после чего результаты анализа выводились в виде гистограмм и таблицы на монитор компьютера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Подбор праймеров для идентификации видов >£. Мйа и Я. пос!огит и проверка их видоспецифичности

В качестве мишеней для разработки видоспецифичных праймеров к 5. Ыйс1 и 5. пойогит были выбраны гены рРНК и р-тубулина {(¡-ШЬ). При выравнивании депонированных в ГенБанке последовательностей нуклеотидов этих генов по алгоритму О^а^ и анализа их в программе 0%о 6,71 были выявлены полиморфные и/или консервативные локусы, которые по своим параметрам подходили для подбора праймеров и зондов. Для гена /З-ШЬ, гомология последовательностей которого для двух видов составляла 65 %, были подобраны две пары праймеров на каждый вид (табл. 1).

Таблица 1. Праймеры, подобранные для идентификации видов ЫНс1 и

S. nodorum методом ПЦР

Об Назва Амп ли кон, п.н.

Вид ласть гено ма ниє Последовательность (5і—>3') Tm

S. tritici StTubr TTGAAGATGTCGTCCACCTTCGT1 70.6 220

S. nodorum SnTubr TCTCAAGATGTCCGCCACCTTC' 71.0 220

S. tritici, S. nodorum P-tub STubf TTCGACCCCAAGAAATGATGG1 71.5 -

S. tritici STtubFs AACATGATGGCCGCCAGC2 69.3 210

S. tritici STtubRs GAAGGTGGACGACATCTTCAAT2 65.4

S. nodorum SNtubFs CAAGAACATGATGGCTGCCTCT2 68.9 210

S. nodorum SNtubRs AGGTGGCGGACATCTTGAGA2 67.2

S. tritici StITSFl TCCGACCTCCAACCCTTTGTG1 71.6 240

S. nodorum SnITSFl TATCCACCCTTGTCTTTTGCGG' 71.2 230

S. tritici StITSf2 ACCTCCAACCCTTTGTGAACACA2 70.4 230

S. nodorum SnITSQ GTATAGCGCAAGCTGATGAGCAG2 69.5 260

S. tritici, S. nodorum рРНК SITSR GCAATGTGCGTTCAAAGATTCG1,2 70.4 -

S. tritici STitsFs CTCCAACCCTTTGTGAACACA3 65.3 230

S. nodorum SNitsFs TATAGCGCAAGCTGATGAGCAG3 65.6 260

S. tritici, S. nodorum SitsRs GCAATGTGCGTTCAAAGATTC3 65.5 -

Примечания: Здесь и далее в таблицах 1, 2, 3 - пары праймеров. Жирным шрифтом

выделены праймеры, выбранные для разработки системы идентификации в формате FLASH. Tm рассчитана по программе Oligo 6,71.

Для региона рРНК были подобраны три пары праймеров на каждый вид

(табл. 1), в которых прямые видоспецифичные праймеры были гомологичны нуклеотидным последовательностям внутреннего транскрибируемого спейсера (Internal transcribed spacer 1, ITS1), а обратные праймеры, общие для двух видов, - 5,8S рРНК. Гомология нуклеотидных последовательностей ITS1 региона для обоих видов составляла 39%, a 5,8S — 94%.

Сконструированные праймеры были протестированы на изолятах видов S. tritici и S. nodorum из разных регионов России с помощью оптимизированной программы ПЦР (см. методы). При этом пары праймеров, дававшие перекрестную реакцию с ДНК другого вида, выбраковывались.

Из всех разработанных и протестированных пар праймеров для дальнейшей работы по подбору зонда и перевода системы в формат FLASH были выбраны StitsFs, SnitsFs и SitsRs.

Подбор и проверка ПЦР-зонда для флуоресцентной детекции видов S. tritici и S. nodorum

Для детекции продуктов ПЦР в формате FLASH, к консервативной области 5,8S рРНК амплифицируемого фрагмента был подобран общий для двух видов зонд SNitsT, сконструированный по типу «молекулярного маячка»: 5' - (BHQ1) CGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGCG (FAM) - 3', где подчеркиванием отмечена часть зонда, комплементарная последовательности матричной ДНК. Два не подчеркнутых нуклеотида были добавлены для стабилизации стебля и придания зонду характерной вторичной структуры.

При тестировании зонда SNitsT с праймерами для S. tritici, специфичный сигнал флуоресценции был зафиксирован лишь в образце 7 без перекрестной реакции с ДНК других видов (рис. 1А). С праймерами для S. nodorum флуоресценция наблюдалась только в образцах, содержащих ДНК изолятов вида S. nodorum (образцы 3, 4, 5 и 6, рис. 1Б). Значения флуоресценции зонда SNitsT в этих вариантах превышали значения фоновой флуоресценции в 2,1 раза и выше — такие показатели в протоколе детекции результатов ПЦР в формате FLASH фиксировались как достоверно положительные. Следует отметить, что при проведении ПЦР праймеры, специфичные к видам S. tritici и S. nodorum, не давали перекрестной реакции с ДНК пикнидиального гриба, отнесенного по результатам морфологического анализа к роду Phoma.

Во всех вариантах значения флуоресценции зонда ВК превышали в 2.5 раза уровень его фоновой флуоресценции, что свидетельствовало об отсутствии ингибирования ПЦР. В вариантах, где наблюдалось образование специфичного продукта ПЦР, сигнал ВК был меньше в несколько раз, по сравнению с вариантами, в которых образование специфического продукта не происходило.

о, ю О

6 ЩИа?1 ; а

7 ГШ -к ■■ •■

18,8

МК 21,1 ■■21,1 18,5

122,6

119,7

фон ЧЩ

О 5 10 15 20 Флуоресценция

А.

1 2

6 7 -к

фон фон

I 1,35., 11,32

»I 5,2Ы

8Я5-

ттг

11.32

120,9 ■ 21,6

117,4

19,3

I 16,2 ■■ 18,1

115,5

¡20,2

10 15 20 25 Флуоресценция

Б.

500 пн-— 200 пн-

М В.

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Рис. 1. Результаты тестирования зонда БЫквТ методом РЬА8Н-ПЦР с праймерами для 1гШсл (А) и 51. по^огит (Б) и анализ полученных продуктов методом электрофореза (В)

Черные столбцы - сигнал в результате специфической реакции, серые — ВК. Значения флуоресценции указаны справа от столбцов (А, Б). Образцы № 1-7, -к (А) соответствуют дорожкам № 1-7, 15 (В), а образцы № 1-7, -к (Б) - дорожкам № 8-14, 16 (В): 1, 2, 8, 9 -пикнидиальный гриб рода РИота; 3, 4, 10, 11 -5. пос1огит изолят В 1/13; 5, 6, 12, 13 - 5. пойогит В-28/ КГЗ; 7, 14 - & 1гШЫ В-35/ЧИ-1; 15, 16 - отрицательный контроль. М -маркер молекулярного веса для ДНК 100-1000 п.н. с шагом 100 п.н. ПЦР-продукт длиной 560 п.н. - ВК

В результате анализа продуктов РЬА8Н-ПЦР в образце 7 (рис. 1А), а также в образцах 3, 4, 5, 6 (рис. 1Б) методом электрофореза в 2,5 % геле было показано наличие амплифицированных фрагментов ДНК длиной около 250 п.н. на дорожках 7 и 10, 11, 12, 13, соответственно (рис. 1В). Продукт амплификации ВК длиной приблизительно 560 п.н. в этих образцах присутствовал в следовых количествах.

Таким образом, для идентификации видов 5. 1гШс1 и 5. пойогит разработаны праймеры и зонд, которые могут послужить основой для создания стандартных наборов для диагностики.

Подбор праймеров для идентификации видов К ^гаттеагшп,

F. culmorum, F. tricinctum, F. avenaceum, F. sporotrichioides, F. poae, F. langsethiae и проверка их видоспецифичности

Для разработки наиболее эффективных праймеров для идентификации исследованных в настоящей работе видов рода Fusarium в качестве целевой ДНК матрицы был выбран ген фактора элонгации трансляции 1-альфа (tefla), кодирующий белок, вовлеченный в процесс регуляции трансляции. Ген tefla широко используется в филогенетических исследованиях фузариевых грибов, поскольку его нуклеотидные последовательности высокоинформативны на уровне вида и неортологические его копии не были обнаружены для видов рода Fusarium. Кроме того, на основе последовательностей данного гена была создана база данных FusariumID, которую используют для идентификации видов этого рода, сравнивая полученные с помощью универсальных праймеров последовательности с депонированными в ней. Таким образом, нуклеотидная последовательность гена tefla у видов рода Fusarium хорошо изучена (Geiser et al., 2004). Кроме того, ген tefla представлен в геноме единственной копией (Kristensen et al., 2005, 2007).

Гомология нуклеотидных последовательностей гена tefla, заимствованных из ГенБанка, у видов F. graminearum, F. culmorum, F. tricinctum, F. avenaceum, F. sporotrichioides, F. poae и F. langsethiae составляла около 53%. Полиморфные для данных видов области гена tefla были использованы в качестве З'-участков при конструировании праймеров (табл. 2).

Праймеры для видов F. graminerum и F. culmorum фланкировали участок гена tefla длиной около 340 п.н., внутри которого также были подобраны праймеры для видов F. avenaceum и F. tricinctum, ограничившие регион длиной 240 п.н. Для видов F. poae, F. langsethiae, F. sporotrichioides при анализе нуклеотидных последовательностей гена tefla были выявлены полиморфные сайты, фланкирующие участок длиной около 330 п.н., к которым для этих видов были подобраны прямые и обратные праймеры.

Локусы, гомологичные праймерам и зондам, были соотнесены со структурой гена tefla. На основании этого было показано, что прямые праймеры для видов F. graminearum, F. culmorum, F. tricinctum, F. avenaceum гомологичны к участку интрона 2, обратные праймеры для этих видов - экзона 4, а зонды гомологичны области экзона 3. Прямые праймеры для видов F. роае, F. sporotrichioides, F. langsethiae локализованы на участках интрона 1, а обратные праймеры и зонд гомологичны к областям интрона 2 гена tefla (рис. 2). Таким образом, большая часть олигонуклеотидов была подобрана нами к нуклеотидным последовательностям интронов.

Таблица 2. Праймеры, подобранные для молекулярной идентификации видов рода Fusarium____

Вид Название Последовательность (5'—>3') Tm Am пли KOH, п.н.

F. graminearum fGtefF GGCTTTGTCGTAATTTTTTTCCC 69 340

fGtefR GACCGGGAGCGTCTGATAGC 69.1

GRMtR2 CGGGAGCGTCTGATAGCCA 68.9

F. culmorum fCtefF CGGCTTTGTCGTAATTTTTCTGG 70.6 340

fCtefR GTGACCGGGAGCGTCTGATAGT 70.2

CULtR2 CGGGAGCGTCTGATAGTCG 65.9

F. tricinctum fTtefF CACCCTGTCGCGCACTACA 68 240

fTtefR TGTTAGCATGATGCAAGCATGATA 68.5

F. avenaceum fAtefF TTACCACACTGTCGCGCACTAT 68.1 240

fAtefR TTAGCATGATGAAGGCATGGTG 68.3

F. sporotrichioides fStefF GCGGGGTAGTTTCAATCATCATT 69.6 330

ffitefR TGGATGTGTGGGAAGGGCAA 71.1

fStefR2 AAATGGATGTGTGGGAAGGGC 70.5

F. poae fPtefF CTTTGACATGGCGGGGTAGAC 69.1 320

fPtefR CGCGCCCAAAGAAATGCAA 72.4

F. langsethiae fLtefF CGGGGTAGTTTCAATCGTCATC 68.4 320

fLtefR GTAAATGGCTATGTGGGAAGGAA 67.7

ЭКЗОН1

интрон1

fLtefF —3» fStefF—> fPtefF—

экзон 2

интрон 2

FuSPLp

fGtefF—> fCtefF — fAtefF -fTtefF -

ЭКЗОН 3

- fLtefR

- fStefR2

- fPtefR

FuATCGp

■интрон 3|

ЭКЗОН 4

GRMtR2 <— CUUR2 -fAtefR - fTtefR

100 ПН

Рис. 2. Схематическое изображение гена tefla грибов рода Fusarium с указанием локализации праймеров и зондов, сконструированных для идентификации исследуемых видов

Для того чтобы оценить эффективность подобранных пар праймеров их

тестировали с ДНК изолята того вида, к которому они были подобраны, а затем проверяли специфичность праймеров, проводя тестирование на ДНК изолятов всех других видов рода Fusarium. Для проведения ПЦР использовали оптимизированную универсальную программу с температурами отжига 64оС/67оС/70°С: (93°С - 90 сек) - 1 цикл; (93°С - 20 сек, 64°С/67°С/70°С - 10 сек) - 5 циклов; (93°С - 1 сек, 64°С/67°С/70°С - 10 сек) - 40 циклов. Праймеры, Праймеры, дававшие помимо амплификации целевого продукта перекрестную реакцию с ДНК изолятов других видов, выбраковывались.

Например, при проведении ПЦР с праймерами fGtefF и fGtefR для вида F. graminearum, наряду с образованием ПЦР-фрагментов с ДНК изолятов вида F. graminearum длиной около 350 п.н., наблюдалась перекрестная реакция с ДНК изолята 46504 вида F. culmorum с образованием ампликона той же длины (данные не приводятся). При тестировании комбинации праймеров fGtefF и GRMtR2 с ДНК изолятов вида F. graminearum были получены фрагменты ожидаемой длины (рис. 3), а с изолятами остальных шести видов перекрестной реакции не наблюдалось. Именно такая пара праймеров отбиралась для разработки тест-системы. При этом учитывалось образование ПЦР-фрагментов ВК длиной около 560 п.н., что указывало на отсутствие ингибирования реакции в исследуемых образцах.

М 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами ґОіеА7 и ГО1еЖ2 для вида К атіпеагит

Изоляты К атіпеагит (дорожки 1 - 4), К сиїтогит (5 - 7), Е ярогоіїісіїіоісіез (8-10), К МстсЫт (11, 13 - 15), К роае (16 - 20), К ауепасеит (12, 21 - 25): 1 - изолят 48900, 2 — 41806, 3 — С.8-8, 4 - 41807, 5 - 61916, 6 - 46504, 7 - 37031, 8 - 33100, 9 - 4700, 10 - 2у-1,11 -50202, 12 -Т48301, П-Ш-Ж, 14-60602, 15-Т52304,16-33, 17-40101, 18-55202, 19 - 47401, 20 - 61701, 21 - А7194, 22 - А7225, 23 - А7244, 24 - А7192, 25 - А7196, 26 -отрицательный контроль. М — маркер молекулярного веса для ДНК 100-1000 п.н. с шагом 100 п.н. ПЦР-фрагмент длиной 560 п.н. - ВК. Температура отжига праймеров 67°С

При тестировании праймеров fAtefF и fAtefR для вида F. avenaceum, с ДНК изолятов этого вида, а также с ДНК изолята Т48301 вида F. tricinctum, были получены ПЦР-подукты длиной около 240 п.н. По результатам повторного анализа морфологических признаков изолят Т48301 был отнесен к виду F. avenaceum. Несмотря на то, что виды F. avenaceum и F. tricinctum согласно существующей в настоящее время систематике фузариевых грибов относятся к разным секциям, существует мнение о близкородственности двух этих видов грибов и ошибочности размещения вида F. tricinctum в секцию Sporotrichiella (Marasas et al., 1984; Turner et al., 1998). Эти результаты наглядно демонстрируют неоспоримое преимущество разработанного подхода для четкой видовой идентификации исследованных видов возбудителей фузариозов.

В результате анализа из всех подобранных к исследуемым видам рода Fusarium пар праймеров были отобраны только по одной (указаны в таблице 2 жирным шрифтом), а именно те из них, которые позволяли получать специфичные продукты при проведении ПЦР по оптимизированной программе и не давали соответствующие ампликоны с ДНК других видов грибов.

Кроме того, нами были протестированы изоляты грибов рода Fusarium, выделенные из растений ячменя из разных регионов России, которые на основании морфологии колоний и конидий (Билай В.И. и др., 1990) были отнесены к виду F. sporotrichioides. ПЦР-анализ исследованных изолятов с разработанными нами праймерами, специфичными к данному виду, выявил принадлежность десяти из тринадцати изолятов к виду F. sporotrichioides. Видовую принадлежность трех изолятов уточняли, используя наборы разработанных нами праймеров, специфичных к F. graminearum, F. culmorum, F. poae, F. avenaceum, F. tricinctum и F. langsethiae. В результате два изолята были идентифицированы как F. tricinctum, и один как F. culmorum.

Таким образом, из приведенных выше данных можно сделать вывод о возможности применения разработанных нами праймеров не только в диагностических целях, но и, при необходимости, для определения или уточнения видовой принадлежности изолятов грибов рода Fusarium.

Подбор и проверка ПЦР-зондов для флуоресцентной детекции видов

рода Fusarium

Для регистрации результатов ПЦР в формате FLASH на область гена tefla, фланкированную видоспецифичными праймерами, для грибов F. graminearum, F. culmorum, F. tricinctum и F. avenaceum был разработан общий зонд FuATCGp типа «молекулярный маячок»: 5' - (BHQ1) CCGAGCAATAGGAAGCCGCCGAGCTCGG (FAM) - 3' (подчеркиванием

выделены нуклеотиды, комплементарные матричной ДНК). Пять не подчеркнутых нуклеотидов добавлены для стабилизации стебля и придания зонду характерной вторичной структуры.

Эффективность зонда FuATCGp проверяли с парами праймеров (см. табл. 2) для видов F. graminearum, F. culmorum, F. tricinctum и F. avenaceum на изолятах семи исследуемых видов (рис. 4). Как видно из рисунка, оптимальный уровень флуоресценции зонда FuATCGp, выше уровня фоновой флуоресценции в 2,1 раза и больше, наблюдался при концентрации зонда равной 7 пмоль. Уровень же фоновой флуоресценции этого зонда оказался равен 70,5 ед., то есть не превышал предельно допустимого значения в 150 ед. Следует подчеркнуть, что во всех вариантах ПЦР проходила специфично.

26 27

Tli Tit...........

-О.Э1

■0,62,:™.........

Т 1

Швйш

■ a.&.ivv-...

Флуоресцен ция

29 ■■ 0,68 "10 6

■■0 71 10 3

mm 0.78 .............■■■№■.............................. а 1 0.5

32 ■■0,71

— 0.&L—....................................... шммштамишж 10,9

35 ^

— 0,71 шшшяшмтштшт ю.З ®я Ю.З

* 0,62 ■

9.73

®55Э 12,2 5®и 12.8 шш, 12.4 шш 12,2

12,8 12,9

12,8 12,8

фон !Я!8:§3 фон BUS ^

Флуоресценция

фон фон

Щ5® ■«0,91 ■ 0,82 ; ■ О т75 .

■■0,91 - 0,82 ■ 0,68

■ 0,71

■ Ot78

■ 0,71 ■0,81 ;

■ 0r72

■ Q,7Z ■0.71

■ 0,71

■ 0.62

г 12,2 ша 12,8 я 1 2,4 s 12,2 9

шя 12,8

шиша Ю.6 шш 10,3 зййшй 1 0,5 йшшз 10,7 10,9

' 12,8 s 12,8

* 10,3 s 10,3

! 8;§§ i 1 ;8§

1 6 8 Ю Флуоресценция

Б.

Флуоресценция

в.

г.

4 6 8 10 Флуоресценция

— 0.91

^0,82

—

— 0.82

фон фон

fgy

" 15,71 ■ 15,78

lfl7i?ii ыш-

lAïÎisï ■О ,72

В 8:83 ЯШ

S 12,8 ? 12.8

4 6 8 10 12 14 16 18 Флуоресцен ци я

шэ 10,3 ща 10,3 3 9,73

6 8 10 12 14 Флуоресцен ция

Рис. 4. Результаты детекции флуоресценции продуктов FLASH-ПЦР с праймерами для видов F. graminearum (A), F. culmorum (Б), F. tricinctum (В) и F. avenaceum (Г) Номера образцов соответствуют изолятам видов F. graminearum (1-5), F. culmorum (6-10), F. sporotrichioides (11-15), F. tricinctum (16, 18-24), F. poae (25-29), F. avenaceum (17, 3034), F. langsethiae (35-38): 1 — G.8-8, 2 - 41807, 3 - 41806, 4 - 48900, 5 - 2903/1, 6- 37031, 7 —61916, 8 —46504, 9 —g.255, 10 — 70517, 11 — 33100, 12 —2y-l, 13 — 47000, 14 — 61501, 15 — 143201, 16 — T50202/1, 17 — T48301, 18 — Fin-2/1, 19 — 60602/1, 20 — T52304, 21 — 60602/2, 22 — 50202, 23 — Fin-2/2, 24 — 33, 25 — 40101, 26 — 55202, 27 — 47401, 28 — 61701, 29 — A7194, 30 — A7225, 31 — A7244, 32 — A7192, 33 — A7196, 34 — 1280/9822-219-1 F, 35 — 1406/TMW1091, 36 — 54, 37 — 55201, «-» -отрицательный контроль, «фон» - пробирки, по которым измеряли уровень фоновой флуоресценции. По оси X - интенсивность флуоресценции относительно фона; черные столбцы - специфический сигнал, серые - ВК

На участок гена tefla, фланкируемый праймерами для видов F.

sporotrichioides, F. poae и F. langsethiae, был подобран общий зонд FuSPLp 5' -(BHQ1) GCGCGATCGAGGAAAATGAGACCAACGCGC (FAM) - 3' (подчеркиванием выделены нуклеотиды, комплементарные матричной ДНК). Четыре не подчеркнутых нуклеотида добавлены для стабилизации стебля и придания зонду характерной вторичной структуры.

Тестирование зонда FuSPLp с праймерами, специфичными к видам F. sporotrichioides, F. poae, F. langsethiae (рис. 5), и ДНК изолятов семи видов грибов рода Fusarium методом FLASH-ПЦР показало, что фоновый уровень флуоресценции не превышал максимального значения и был равен 50,5 ед. при оптимальной концентрации зонда в реакционной смеси 3,5 пмоль. При этом, образование продуктов реакции проходило строго специфично без перекрестной реакции с ДНК изолятов других видов.

1 И—ІІІІІИІІІІІГІ............................................ 10.7 22

2 |Ш 3 99 23 —, 1 2.8

3 _рО,7 - 9 17 24 Wm0#2. - ---.,2,4

4 ІИШЛЯ-—--- 7-І 25 !S» 0,7-5 - - -12.2

5 mm О,за . . ' 12 41 26 ..»• 0,72 ----- —— — . Ю.9

6 —0,78- ----- -да ' 27 РИПЯ1 12.8

7 Г " " 9 76 28 ~0'82 • 12,S

8 —0,72- 82 ' 29 «я»»«»™««—10.6

9 I-0.7 . ' , 10.s ЗО МД———м—ю.з

10 9 7 31 ДД-——— 10,5

u'uu 13'85 ?2 1 °'7

10 12 ........................................Ж.....Ж........1 Ц.Ь - 14.74 33 -Ю.З

О 13 Г5 14-7 fi —О/2

14 ШШЩІДіиШШШШ Ь У 1279 ia «■"oVl "'¡Я 10.8

15 и_..___.ни 13.7 ?? аUXJ а.з

■ о.о • 37 ШШ^Уж

_____________________.

17 ™ 0,72...... „- ■ - ........................т 12 _ iiijTTo

18 —0.7 8 06

19 —-0,87 - - 112

20 рШібЬ» - - ті 10 5'

21 1 о 9

: 9.3

МІйшшішшшшшишшіш 9,73

фон JM 8:і§.....

фон И 1 ;Bg

2 4 6 8 10 12 14 16 флуоресцен

Флуоресценция

10 ция

8.99 9.17

8 Ю Флуоресценция

1 0,8

я 12,3 І 10,3

- 1ППТ 9,73

щ.

фон Я 8 нк фон ■ 1 ;8§

S 12,8

Флуоресцен ция

Б.

"Ьи^о^х^«^^^^^ ___

— 0,7 8ВШ 1 1 ,3

—■0.79 ......................... шшшшшшзщ

ш® 1 1,2 я 10,5 — 10,8

4 6 8 10 Флуоресценция

фон фон

ьааи

ШШш

' 10,7 ад 10.9

ш.2%,8

—9,71

PfT" 9.71

■ ..........

■

я 1

4 6 8 10 Флуоресцен ция

в.

Рис. 5. Результаты детекции флуоресценции продуктов FLASH-ПЦР с праймерами для видов F. sporotrichioides (A), F. роае (Б), F. langsethiae (В)

Номера образцов соответствуют изолятам видов F. graminearum (1-5), F. culmorum (6-10), F. sporotrichioides (11-15), F. tricinctum (16, 18-24), F. poae (25-29), F. avenaceum (17, 3034), F. langsethiae (35-38): 1 — G.8-8, 2 - 41807, 3 - 41806, 4 - 48900, 5 - 2903/1, 6- 37031, 7 —61916, 8 —46504, 9 —g.255,10 — 70517, 11 —33100, 12 —2y-l, 13 — 47000, 14 — 61501, 15 — 143201, 16 — T50202/1, 17 — T48301, 18 — Fin-2/1, 19 — 60602/1, 20 — T52304, 21 — 60602/2, 22 — 50202, 23 — Fin-2/2, 24 — 33, 25 — 40101, 26 — 55202, 27 — 47401, 28 — 61701, 29 — A7194, 30 —A7225, 31—A7244, 32 — A7192, 33 —A7196, 34 — 1280/9822-219-1F, 35 — 1406/TMW1091, 36 — 54, 37 — 55201, «-» -отрицательный контроль, «фон» - пробирки, по которым измеряли уровень фоновой флуоресценции. По оси X - интенсивность флуоресценции относительно фона; черные столбцы - специфический сигнал, серые - ВК

Разработанные нами видоспецифичные праймеры и зонды были использованы при создании наборов для идентификации возбудителей септориоза и фузариоза методом ПЦР с детекцией результатов в формате FLASH и в реальном времени (www.agrodiagnostica.ru).

Подбор праймеров для идентификации видов Р. graminis и P. striiformis и проверка их видоспецифичности В результате выравнивания и анализа нуклеотидных последовательностей региона рРНК для видов P. graminis и P. striiformis были разработаны две пары праймеров (табл. 3).

Анализ структуры рРНК показал, что прямые праймеры первой пары были подобраны на участок ITS1, обратные - на участок ITS2 рРНК. Было установлено, что прямые праймеры второй пары гомологичны участку ITS2, а общий для двух видов обратный праймер — 28S рРНК.

Оптимизацию программы ПЦР проводили за счет варьирования

температуры отжига в интервале 60°С — 67°С с использованием ДНК нескольких изолятов трех видов. Так, для праймеров рз180Т и рв602г первой пары при температуре отжига 67°С амплификация проходила специфично с ДНК изолятов вида Р. з^и/огт^я, а длина амплифицированного фрагмента соответствовала теоретически рассчитанной и составляла приблизительно 420 п.н. При тестировании пары праймеров pg98f и pg475r для Р. gramims оптимальная температуре отжига соответствовала 62°С: при этой температуре отжига реакция проходила специфично только с ДНК изолятов Р. §?аттз с образованием ПЦР-продукта ожидаемой длины (около 370 п.н.). ПЦР с праймерами 2рз578:(2 и psg753r для Р. з1ги/огт1з при температуре отжига 67°С проходила с образованием неспецифичного продукта. Амплификация с праймерами 2pg493f и 2psg753r для Р. graminis при температуре отжига 67°С также была неспецифичной. Таким образом, в результате анализа полученных данных, для дальнейшей работы была отобрана пара праймеров ре!80Т — Рб602г, специфичных для Р. зКи/огт1з, и пара pg98f— pg475r - для Р. graminis.

Таблица 3. Прайм еры, разработанные для ПЦР-идентификации видов Р. graminis и Р. з1ги/огт1з

Вид Название Последовательность (5'—>3') Тт Ампли кон, п.н.

Р. з1ги/огт1з рз180Г ССААТТСАСТАСАССТААСТТСТ1 60.6 420

рв602г ТААСАТСССАСТАТТССТААА1 58.6

2ps578f аттттатсатсасатсааооатт2 60.4 175

2psg753r ТАОТАЛСООСОАОТОААОАО2 60.4

Р. graminis pg98f ССТССАСТСТСТТАТАААССАА1 59.1 370

рё475г С ААСАТССА АТАААСАААТТАТТА1 60.0

2pg493f ООАТОТгеАОТОТТОСТАТААТТАТ2 62.6 260

2psg753r ТАОТААСООСОАОТОААОАО2 60.4

После оптимизации условий ПЦР, отобранные пары видоспецифичных праймеров, были протестированы на большем числе изолятов видов Р. з^и/огт^я, Р. £?ат1тз и Р. 1гШста, собранных в основных регионах возделывания пшеницы в России. Так, с праймерами р$180Г и р$602г для Р. з1ги/огт1з при температуре отжига 67°С амплификация проходила строго

специфично только с изолятами этого вида (рис. 6) с образованием ПЦР-продукта ожидаемой длины (450 п.н.).

500 эоо пн-^8 ПН-IS

/ ни 2 3 4 5 6 7 8 3 10 ,11 12 13 14 1S 16 17

500 300 гсн-ЯЕ пи 43 - - -

1Є 19 20 21 22 23 24 2Ь 26 27 28 29 30 31

Рис. 6. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами для P. striiformis Номера дорожек соответствуют номерам изолятов видов P. triticina (1-11), P. striiformis (1219, 26), P. graminis (20-25, 27-30): 1 - 591-6, 2 - 605-5, 3-610-1,4- 625-3, 5 - 615-1, 6 - 6273, 7 - 621-4, 8 - 729-1, 9 - 730-1, 10 - 732-5, 11 - 737-5, 12 - 13-86, 13 - 12-05, 14 - 11-86, 15 -2-04, 16 - 40-04, 17 - 41-01, 18 - 3-02-08, 19 - 5-06-08, 20 - 104-86, 21 - 134-86, 22 - 146-86, 23 - 210-86, 24 - 400-01-2, 25 - 225-87, 26 - 49-87, 27 - 300-20, 28 - 507-04, 29 - 300-1, 30 -735-3, 31- отрицательный контроль. М — маркер молекулярного веса для ДНК 100-1000 п.н. с шагом 100 п.н.

ПЦР с праймерами pg98f и pg475r, специфичными для P. graminis, при температуре отжига 62°С проходила с образованием продукта длиной около 370 п.н. только с ДНК изолятов P. graminis (рис. 7).

Рис. 7. Электрофореграмма продуктов с праймерами для Р. graminis Номера дорожек соответствуют номерам изолятов видов Р. їгНісіпа (1-11),/! ¡ігН/огтія (12-19, 26), Р. ёгатш5 (20-25, 27-30): 1 - 591-6, 2 - 605-5, 3 - 610-1, 4 - 625-3, 5 - 615-1, 6 -627-3, 7-621-4, 8-729-1, 9-730-1, 10-732-5, 11-737-5, 12- 13-86, 13- 12-05, 14- 11-86, 15 - 2-04, 16 - 40-04, 17 - 41-01, 18 - 3-02-08, 19 - 5-06-08, 20 - 104-86, 21 - 134-86, 22 - 14686, 23 - 210-86, 24 - 400-01-2, 25 - 225-87, 26 - 49-87, 27 - 300-20, 28 - 507-04, 29 - 300-1, 30 - 735-3, 31- отрицательный контроль. М — маркер молекулярного веса для ДНК 100-1000 п.н. с шагом 100 п.н.

Таким образом, продемонстрировано, что в предложенной нами системе прямые и обратные пары праймеров амплифицируют полиморфные участки только соответствующих видоспецифических последовательностей нуклеотидов ДНК P. striiformis и P. graminis, что обеспечивает четкость и надежность получаемых результатов при диагностике и видовой идентификации этих патогенов. При необходимости возможен перевод системы в формат FLASH-ПЦР и ПЦР в реальном времени.

ВЫВОДЫ

1. В результате выравнивания и анализа нуклеотидных последовательностей генов возбудителей септориоза, фузариозов и ржавчины зерновых культур были выявлены полиморфные участки, использованные для разработки видоспецифичных праймеров.

2. Разработанные праймеры позволяют проводить высокочувствительную видовую диагностику всех исследованных видов грибов методом ПЦР

3. Для возбудителей септориоза и фузариозов сконструированы зонды, позволяющие проводить детекцию результатов ПЦР и в формате FLASH, что существенно сокращает время анализа и снижает риск контаминации рабочей зоны продуктами амплификации.

4. На основе сконструированных праймеров и зондов тест-системы для диагностики исследованных возбудителей септориоза и фузариозов внедрены в производство на базе ЗАО «НПФ ДНК-Технология».

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется применение разработанных систем идентификации для уточнения результатов диагностики, проводимой по симптомам в полевых условиях, для проверки видовой принадлежности выделяемых в чистую культуру изолятов грибов, а также для изучения патогенеза указанных видов.

2. Возможность перевода систем детекции возбудителей септориоза и фузариозов в формат ПЦР в реальном времени может быть использована при необходимости количественного определения патогена в образце, например при сравнении толерантных и восприимчивых сортов.

3. Описанные для разработок тест-систем методические подходы могут быть использованы для создания аналогичных ПЦР диагностикумов и на другие фитопатогены.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Абрамова, С. Л. Диагностика фитопатогенных грибов Septoria tritici и Stagonospora nodorum методом FLASH-ПЦР / С. Л. Абрамова, Д. Ю. Рязанцев, Т. М. Воинова, С. К. Завриев // Биоорганическая химия. - 2008. -T.34.-No. 1.-С. 107-113.

2. Абрамова, С. Л. Видовая идентификация изолятов из полевых образцов грибов рода Fusarium / С. Л. Абрамова, Д. Ю. Рязанцев, А. А. Стахеев, С. К. Завриев // Вестник РАСХН. - 2011. - № 2. - С. 56-57.

3. Абрамова, С. Л. Идентификация возбудителей ржавчины пшеницы методом полимеразной цепной реакции / С. Л. Абрамова, А. И. Жемчужина, Н. С. Жемчужина, Д. Ю. Рязанцев, С. К. Завриев // Вестник РАСХН.-2011,-№5.-С. 15-17.

4. Рязанцев, Д. Ю. Диагностика токсигенных грибов рода Fusarium методом FLASH-ПЦР / Д. Ю. Рязанцев, С. Л. Абрамова, С. В. Евстратова, Т. Ю. Гагкаева, С. К. Завриев // Биоорганическая химия. - 2008. - Т. 34. - No. 6. -С. 799-807.

5. Рязанцев, Д. Ю. ДНК-технологии для диагностики и идентификации токсигенных патогенов зерна и продуктов его переработки / Д. Ю. Рязанцев, С. Л. Абрамова, С. В. Евстратова, Т. Ю. Гагкаева, С. К. Завриев // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: Материалы международной научно-практической конференции, 11-13 марта 2008 г., Москва. С. 364365.

6. Рязанцев, Д. Ю. Детекция токсигенных грибов рода Fusarium / Д. Ю. Рязанцев, С. Л. Абрамова, С. В. Евстратова, Т. Ю. Гагкаева, С. К. Завриев // 50 лет на страже продовольственной безопасности страны: сб. трудов. -Большие Вяземы: ГНУ ВНИИФ, 2008. - С. 250-257.

Заказ № 19-а/10/2013 Подписано в печать 11.10.2013 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1.2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай:zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Абрамова, Светлана Леонидовна, Москва

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии Россельхозакадемии

На правах рукописи

Абрамова Светлана Леонидовна

Специальность 03.02.12 - микология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: член-корреспондент Россельхозакадемии, доктор биологических наук, профессор Завриев С. К.

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ................................................ 4

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................... 5

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................ 9

1.1 ПЦР в диагностике фитопатогенов.......................................... 9

1.1.1 Требования к характеристикам диагностических систем,

основанным на методе ПЦР....................................................... 9

1.1.2 Возможные ошибки и ограничения в применении метода

ПЦР для диагностики фитопатогенов....................................... 16

1.2 Метод ПЦР с детекцией результатов в формате FLASH......... 18

1.3 Краткая характеристика биологических свойств и

вредоносности грибов, являющихся объектами

исследования, и трудности их идентификации....................... 22

1.4 Системы идентификации исследуемых видов, основанные

на методе ПЦР............................................................................. 28

1.4.1 ПЦР-системы для идентификации видов S. tritici и S.

nodorum........................................................................................ 28

1.4.2 ПЦР-системы для идентификации видов F. graminearum, F.

culmorum, F. sporo trie hi о ides, F. avenaceum, F. tricinctum, F.

poae, F. langsethiae...................................................................... 31

1.4.3 ПЦР-системы для идентификации видов P. striiformis и P.

graminis......................................................................................................................................................................36

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................................................38

2.1 Материалы......................................................................................................................................................................38

2.2 Методы..................................................................................................................................................................................43

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................... 49

3.1 Разработка системы идентификации видов tritici и S.

nodorum........................................................................................ 49

3.1.1 Подбор праймеров для идентификации видов S. tritici и S.

nodorum и проверка их видоспецифичности........................... 4q

3.1.2 Подбор и проверка ПЦР-зонда для флуоресцентной

детекции видов S. tritici и S. nodorum....................................... ^

3.2 Разработка системы идентификации грибов рода Fusarium....................................................................................... ^^

3.2.1 Подбор праймеров для идентификации видов F. graminearum, F. culmorum, F. tricinctum, F. avenaceum, F. sporotrichioides, F. poae, F. langsethiae и проверка их видоспецифичности.................................................................... ^^

3.2.2 Подбор и проверка ПЦР-зондов для флуоресцентной детекции видов рода Fusarium.................................................. ^

3.3 Подбор праймеров для идентификации видов Р. graminis и

Р. striiformis и проверка их видоспецифичности..................... ^

ВЫВОДЫ........................................................................................................ 84

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.................................................... 85

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ........................................................................................... 86

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................. g?

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Та - температура отжига олигонуклеотида.

Тш — температура плавления олигонуклеотида.

ITS — Internal transcribed spacer (внутренний транскрибируемый

спейсер).

tefla - Tranclation elongation factor 1-alpha (фактор элонгации трансляции 1-альфа). рРНК - рибосомальная РНК. /3-tub — ген р-тубулина.

ГенБанк — база данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). п.н. - пар нуклеотидов.

dNTPs - deoxyribonucleotides (дезоксинуклеотидтрифосфаты). ВК — внутренний контроль.

FLASH — Fluorescent Amplification-based Specific Hybridization (качественная флуоресцентно-гибридизационная полимеразная цепная реакция).

К- - отрицательный контроль. К+ - положительный контроль.

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы для идентификации и детекции фитопатогенных микроорганизмов все чаще применяется метод ПЦР. Он превосходит

традиционные методы по специфичности, чувствительности, быстроте проведения анализа, производительности, и служит их существенным дополнением. Кроме того, его применение не требует глубоких знаний биологии и морфологии исследуемых микромицетов (McCartney et al., 2003; Lievens et al., 2005).

Усовершенствование методов секвенирования и создание электронных баз данных, хранящих информацию о структуре геномов различных фитопатогенов (Geiser et al., 2004; Geer et al., 2010), дает возможность при разработке видоспецифичных праймеров наиболее полно учитывать и использовать вариабельность анализируемых последовательностей нуклеотидов. Это обеспечивает высокую специфичность диагностическим системам, создаваемым на их основе.

1. Выявить в геноме исследуемых грибов локусы, наиболее перспективные для их идентификации.

2. Разработать праймеры для идентификации и диагностики исследуемых видов.

Научная новизна исследований. Разработаны высокоспецифичные праймеры для основанной на ПЦР идентификации и диагностики одиннадцати видов экономически значимых грибных патогенов зерновых культур. Для девяти из них сконструированы зонды и создана система детекции с помощью ПЦР в формате FLASH, что позволило сократить время анализов и обеспечить надежную и точную идентификацию фитопатогенов.

использованы для разработки таких систем.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ПЦР в диагностике фитопатогенов

Со времени разработки в 1980-х годах, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) стал основным методом молекулярной диагностики фитопатогенов (КтгепБеп е1 а1., 2005; Ыеуеш е! а1., 2005). Тем не менее, хотя метод ПЦР широко используется в академических исследованиях, применение его в сельскохозяйственной практике все еще ограничено. Существует необходимость в разработке коммерчески доступных тест-систем для диагностики методом ПЦР карантинных объектов, а также экономически значимых фитопатогенов для принятия своевременных решений о проведении защитных мероприятий. Однако, до применения на практике, разработанные системы детекции должны быть приведены в соответствие с различными требованиями.

1.1.1 Требования к характеристикам диагностических систем, основанным на методе ПЦР

При разработке систем диагностически фитопатогенов на основе метода ПЦР для необходимо учитывать факторы, касающиеся специфичности, чувствительности и производительности диагностической системы. Кроме того, важны такие факторы, как быстрота проведения анализа, достоверность и воспроизводимость получаемых результатов (Глеуеш, ТЬошша, 2005).

Специфичность. Применение любого метода диагностики рассчитано на специфичное определение патогена. Одним из существенных преимуществ молекулярных методов диагностики, по-сравнению с традиционными, является возможность различать близкородственные организмы. Для молекулярной диагностики фитопатогенов в качестве мишеней часто используются консервативные гены, нуклеотидные последовательности которых у близкородственных микроорганизмов

зачастую отличаются лишь несколькими нуклеотидными заменами (single-nucleotide polymorphism, SNP). Однако, высокая специфичность методов детекции нуклеиновых кислот, с использованием ПЦР-праймеров и (или) гибридизационных зондов, позволяет выявлять полиморфизм, связанный с этими незначительными различиями (Ward et al., 2004). Это особенно важно для различения близкородственных патогенов.

Очевидно, что специфичность методов детекции нуклеиновых кислот определяется выбором целевой нуклеотидной последовательности. Существует два подхода в выборе гена-мишени. Наиболее распространенный, заключается в выборе такого консервативного гена, для которого известна нуклеотидная последовательность, и который обладает достаточным полиморфизмом. В настоящее время, наиболее часто для диагностики грибов используется рибосомальная РНК (рРНК). Ее интенсивное использование в филогенетических исследованиях привело к накоплению в электронных базах данных нуклеотидных последовательностей этого региона генома для многих видов микроорганизмов (Atkins, Clark, 2004). Это дает возможность проводить более полное сравнение последовательностей и выявлять диагностические регионы, обладающие требуемым уровнем полиморфизма. Кроме того, высокая копийность генов рРНК в любом геноме обеспечивает высокую чувствительность ПЦР при диагностике фитопатогенов. В геноме грибов каждая копия рРНК представлена тремя генами, разделенными внутренними транскрибируемыми регионами (internal transcribed spacers, ITS), которые имеют особое значение для успешной идентификации возбудителей болезней растений. Регионы ITS содержат консервативные и вариабельные области, что позволяет проводить классификацию грибов на разных таксономических уровнях, иногда даже на внутривидовом уровне (Atkins et al., 2003). Тем не менее, нуклеотидные последовательности рРНК не всегда обладают достаточным уровнем вариабельности для различения отдельных видов (Tooley et al., 1996).

Поэтому, альтернативно или в дополнение к системам, основанным на различении ITS-регионов, интенсивно исследуется возможность использования генов «домашнего хозяйства», включая гены бета-тубулина (Fraaije et al., 1999), актина (Weiland, Sundsbak, 2000), и фактора элонгации трансляции 1-альфа (O'Donnell et al., 1998).

Другой подход в выборе целевой нуклеотидной последовательности для детекции фитопатогенов основан на скрининге произвольных частей генома и выявлении среди них последовательностей, потенциально пригодных для диагностических целей. Это достигается при использовании ряда методов, включая метод произвольно амплифицированной полиморфной ДНК (random amplified polymorphic DNA, RAPD) (Williams et al., 1990) и его аналог - метод полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (amplified fragment length polymorphism, AFLP) (Vos et al., 1995). Однако, локализация полученной таким образом нуклеотидной последовательности в геноме остается неизвестной. Для подтверждения специфичности выявленного фрагмента ДНК необходимо не только сравнение его последовательности с геномами других организмов, но и массовый скрининг коллекции близкородственных видов и видов, занимающих ту же экологическую нишу, что и исследуемый (Schaad, Frederick, 2002).

Чувствительность. Высокочувствительная детекция патогена до заражения растений или до развития симптомов болезни важна для предотвращения их инфицирования или сдерживания развития и распространения заболевания а, следовательно, и для уменьшения экономических потерь. Диагностические процедуры должны обладать достаточно высокой чувствительностью. До открытия методов амплификации нуклеиновых кислот, в частности ПЦР, для обнаружения конкретного организма использовались методы, основанные на применении специфичных гибридизационных зондов. Однако, из-за низкой

чувствительности такие методы зачастую приводили к получению «ложноотрицательных» результатов (Ward et al., 2004). Благодаря высокой чувствительности метод ПЦР дает возможность детекции даже следовых количеств ДНК патогена (Ward et al., 2004). Однако, высокая чувствительность метода может приводить к получению «ложноположительного» результата. Поэтому, для обеспечения достоверности получаемых результатов необходимо строгое соблюдение правил постановки реакции, использование контролей, ограждение образцов и реактивов от возможной ДНК-контаминации через аэрозоли, а также наличие отдельных зон для процедур пробоподготовки и анализа продуктов ПЦР (Kwok, Higushi, 1989).

На практике, для принятия решений о проведении мер по защите урожая, методы более чувствительные, чем традиционная ПЦР, вряд ли потребуются, поскольку пороговый уровень инфекции может быть легко детектирован с помощью ПЦР. Однако, для обнаружения карантинных организмов могут потребоваться молекулярные методы, обладающие более высокой чувствительностью.

Мулътиплексность. Большинство молекулярных диагностических систем, используемых в фитопатологии, разработаны для определения лишь одного целевого патогена. Поскольку возделываемые культуры зачастую поражаются несколькими патогенами одновременно, разработка мультиплексных тестов, способных детектировать несколько микроорганизмов, стала бы существенным достижением. Первые стратегии применения мультиплексной ПЦР задействовали несколько наборов праймеров в одной реакции. Однако, разработка воспроизводимой мультиплексной системы с возможностью различать несколько ампликонов при гель-эле�

Информация о работе

Абрамова, Светлана Леонидовна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.12

Диссертация

Разработка систем идентификации грибов - возбудителей экономически значимых болезней зерновых культур методом ПЦР - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы