Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка специфических маркеров для изучения генетического полиморфизма токсигенных грибов рода Fusarium

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка специфических маркеров для изучения генетического полиморфизма токсигенных грибов рода Fusarium"

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ имени академиков М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

Стахеев Александр Александрович

РАЗРАБОТКА СПЕЦИФИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА ТОКСИГЕННЫХ ГРИБОВ

РОДА FUSARIUM

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

16 ПАЯ ДЛЗ

005058862

Москва 2013 г.

005058862

Работа выполнена в группе молекулярной диагностики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

Завриев Сергей Кириакович

доктор биологических наук, член-корр. РАСХН

Официальные оппоненты:

Морозов Сергей Юрьевич, доктор биологических наук, профессор

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Лебедев Юрий Борисович, доктор биологических наук

Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук (ИНБИ РАН)

Защита состоится « »_2013 года в_часов на заседании диссертационного совета

при Институте биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « »_2013 года

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор физико-математических наук В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фузариоз зерна является одним из наиболее опасных заболеваний сельскохозяйственных культур по всему миру, в том числе и в различных природно-географических зонах России (Levitin et al., 2000; Osborn and Stein, 2007). Заражение зерна фузариозом в отдельные годы способно охватывать обширные территории и приобретать характер эпифитотий. Представители рода Fusarium поражают широкий круг сельскохозяйственных растений: ячмень, пшеницу, рожь, овес, кукурузу, рис и др. По многим аспектам фузариоз представляет собой уникальное заболевание, которое чрезвычайно трудно для изучения. Одна из его характерных особенностей - специфическая этиология - участие в патогенном процессе комплекса различных видов. Следствием заражения являются существенное снижение количества и качества урожая и, как следствие, большой экономический ущерб: так, в США во второй половине 90-х годов XX в суммарные потери, причиненные фузариозом, составили порядка 1.5 млрд. долларов (Nganje et al., 2004).

Заражение зерна возбудителями фузариоза приводит к накоплению в нём вторичных токсических метаболитов грибов - микотоксинов (фузариотоксинов), таких как трихотецены, энниагины, монилиформин, зеараленон. Актуальность изучения и выявления токсигенных грибов и продуцируемых ими токсинов признана во всйм мире и связана с их чрезвычайно высокой опасностью для здоровья человека и животных (Гагкаева и др., 2011; Logrieco et al., 2002; Krnjaja et al., 2011). По данным ФАО, 25% произведенного в мире урожая зерновых культур ежегодно загрязнено микотоксинами. Подтверждением важности изучения и разработки методов борьбы с токсигенными возбудителями фузариоза злаковых являются принятые Европейским союзом правила, регулирующие методы отбора проб и анализов для обязательного контроля микотоксинов в продуктах питания и кормах (Commission regulation (ЕС) № 856/2005 of 6th June 2005).

Обеспечение контроля качества продуктов питания и сырья, используемого для их изготовления, а также биологическая безопасность в целом требуют постоянного мониторинга зараженности зерна возбудителями фузариоза и разработки эффективных методов борьбы с заболеванием. Эти методы должны быть основаны на интегративных подходах, учитывающих все аспекты заболевания, однако для их применения в первую очередь необходима точная и достоверная идентификация патогенов. Кроме того, на сегодняшний день очевидно, что продукция микотоксинов представителями рода Fusarium носит ярко выраженный видоспецифичный характер (Moss and Thrane, 2004; Glenn, 2007). Поэтому для оценки спектра токсинов, накопление которых возможно в анализируемой партии зерна, требуется точная информация о видовом составе патогенов, присутствующих в ней (Moretti, 2009). Для получения такой информации необходимо применение эффективных методов, позволяющих быстро и с высокой специфичностью определять видовую принадлежность штамма или изолята.

Род Fusarium является сложным в таксономическом отношении, а также с точки зрения видовой идентификации его представителей. За годы исследований возбудителей фузариоза было предложено порядка десяти таксономических систем, основанных на характеристиках высокоизменчивых морфологических структур. Все эти системы противоречивы и имеют

целый ряд недостатков, затрудняющих точную видовую идентификацию исследуемых штаммов (Nelson et al., 1983; Nelson, 1991; Leslie et al., 2001). Диагностика возбудителя непосредственно на зараженном растении зачастую в принципе невозможна, поскольку во многих случаях заболевание протекает бессимптомно (Parry et al., 1995). В настоящий момент важную роль в изучении разнообразия грибов рода Fusarium, а также в их видоспецифичной идентификации играют молекулярные методы, в первую очередь основанные на сравнении последовательностей нуклеотидов ДНК и полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Borman et al., 2008; Benali et al., 2011). Однако применение этих методов усложняется тем, что объем генетических данных для представителей рода Fusarium ограничен: в частности, выявлено лишь небольшое число локусов, для которых разработаны специфические SCAR-маркеры (амплифицированные регионы с охарактеризованной последовательностью нуклеотидов; Рагап and Michelmore, 1993), дающие возможность с высокой достоверностью определять видовую принадлежность гриба. В большинстве исследований, посвящйнных классификации и таксономической характеристике возбудителей фузариоза, проводился анализ последовательностей лишь 1-2 генов у небольшой выборки видов и штаммов. Этого явно недостаточно, чтобы сделать однозначные выводы по поводу степени родства и таксономической характеристики исследуемых грибов. Решить эти проблемы может применение метода MLST (мультилокусное секвенирование-типирование, Maiden et al., 1998), в основе которого лежит установление последовательностей нуклеотидов небольших фрагментов (как правило, около 500 нуклеотидов) ряда генов и последующем их сравнении у разных организмов. Существенным преимуществом этого метода является высокая воспроизводимость, а также простота стандартизации процедур секвенирования и анализа результатов, что упрощает обмен данными между исследователями, а также дает возможность оценивать новизну получаемых результатов и сравнивать их с полученными ранее.

При использовании метода MLST, так же как и многих других методов молекулярного типирования, а также при разработке ДНК-маркеров, важное значение имеет объём выборки исследуемых видов и штаммов. В этом заключается другая проблема большинства исследований рода Fusarium на данный момент. Выборки видов и штаммов, которые, как правило, подвергаются молекулярно-генетическому анализу, ограничены как по количеству, так и по географическому происхождению. В частности, необходимо отметить, что не было проведено ни одного обширного исследования разнообразия российской коллекции возбудителей фузариоза. Расширение филогенетической информации и изучение таксономии рода Fusarium, а также разработка систем идентификации возбудителей фузариоза требуют выявления новых маркеров, специфичных на меж- и внутривидовом уровне. Кроме того, изучение структуры генома представителей рода Fusarium необходимо для исследования функциональной активности отдельных генов, в частности ответственных за процессы патогенеза и синтеза токсинов.

Целями настоящей работы был анализ полиморфизма ряда важных в таксономическом и функциональном отношении генов, и выявление новых маркеров для филогенетических исследований, диагностики и идентификации токсигенных грибов рода Fusarium.

Объектами исследования были: культуры 90 штаммов 11 наиболее распространенных возбудителей фузариоза злаковых, опасных с точки зрения продуцируемых микотоксинов: Fusarium graminearum, F. culmorum, F. cereaüs, F. sporotrichioides, F. langsethiae, F. poae, F.

avenaceum, F. tricinctum, F. acuminatum, F. equiseti, F. solani коллекций Всероссийского института защиты растений (ВИЗР) и Всероссийского научно-исследовательского институга фитопатологии (ВНИИФ) Россельхозакадемии; 26 образцов зерна, предварительно охарактеризованного по степени зараженности возбудителями фузариоза и содержания основных микотоксинов: ДОН и Т-2; 24 образца, представляющих собой искусственно зараженные спорами гриба F. culmorum проростки пшеницы на ранних стадиях заражения.

Основные задачи работы:

•/ Провести MLST-анализ полиморфизма ДНК токсигенных грибов рода Fusarium и оценить степень меж- и внутривидовых различий.

S Проанализировать генетическое разнообразие исследуемых штаммов возбудителей фузариоза из всероссийских коллекций методами RAPD- и ISSR- анализа.

S Выявить новые SCAR - маркеры и разработать на их основе праймеры и зонды для специфической идентификации токсигенных грибов рода Fusarium, в том числе идентификации групп видов в соответствии со спектрами продуцируемых ими микотоксинов.

■S Протестировать специфичность разработанных праймеров и зондов на ДНК культур моноспоровых штаммов грибов и образцах зараженного зерна.

S Разработать соответствующие тест-системы для качественной и количественной (ПЦР-РВ) диагностики и идентификации исследуемых возбудителей фузариоза.

S Подготовить технический регламент для внедрения разработанных диагностических наборов в производство.

Научная новизна работы. В ходе работы впервые проведен MLST-анализ обширной выборки штаммов грибов рода Fusarium всероссийской коллекции, паразитирующих на злаковых культурах. Работа позволила уточнить видовую принадлежность исследованных штаммов, и охарактеризовать степень филогенетического родства между ними. В частности, впервые на территории России были идентифицированы штаммы вида F. torulosum, характеризующийся высокой изменчивостью, затрудняющей его идентификацию с помощью классических методов. В ходе исследования для некоторых видов впервые определены частичные последовательности ряда генов, таких как РНО, ß-tub, acll, CPR1, lys2, Esynl и обсуждена возможность их использования в качестве маркерных для идентификации и таксономической характеристики возбудителей фузариоза. Результаты мультилокусного исследования были также сопоставлены с данными, полученными с помощью RAPD- и ISSR-анапиза. Совокупность полученных результатов выявило однозначную корреляцию между степенью филогенетического родства видов грибов рода Fusarium и спектрами продуцируемых ими микотоксинов.

Сравнение последовательностей нуклеотидов исследованных генов позволило выявить в них ряд полиморфных участков, характерных на уровне отдельных видов. Эти участки были использованы в качестве SCAR-маркеров при подборе высокоспецифических праймеров. Разработанные праймеры и флуоресцентно-меченые зонды легли в основу тест-систем для детекции возбудителей фузариоза, в том числе групп близкородственных видов в соответствии со спектрами продуцируемых микотоксинов. Специфичность праймеров продемонстрирована в тестах с ДНК моноспоровых культур исследуемых видов и не вызывает сомнений. С помощью

метода ПЦР-РВ проведена количественная оценка содержания ДНК токсигенных грибов рода Fusarium в образцах заражённого зерна наиболее важных сельскохозяйственных культур различного географического происхождения. В тестах на ДНК, выделенной из искусственно зараженных проростков пшеницы, впервые показана возможность использования метода ПЦР-РВ для обнаружения и количественной оценки присутствия возбудителей фузариоза в растениях на ранних бессимптомных стадиях заражения.

Прастическая значимость работы. Выявленные в ходе исследования маркеры являются эффективными молекулярными инструментами для филогенетических исследований и идентификации грибов рода Fusarium, в том числе при исследовании изолятов, потенциально представляющих собой новые, до сих пор не описанные виды. Предложенные тест-системы на основе ПЦР обеспечивают быструю и строго специфическую диагностику зараженности растительного материала возбудителями фузариоза, а применение ПЦР-РВ позволяет также проводить количественную оценку содержания ДНК патогенов. Использование тестов, специфичных к группам видов со сходными спектрами продуцируемых микотоксинов, удобно для практического применения, поскольку позволяет сократить количество анализов, необходимых для диагностики заражённости зерна и продуктов его переработки возбудителями фузариоза. Диагностические наборы, созданные на основе разработанных тест-систем, в настоящее время внедрены в производство и применяются на практике - как в научно-исследовательских учреждениях, так и специалистами фитосанитарного контроля.

Внедрение результатов работы. На основе разработанных тест-систем созданы стандартные наборы для ПЦР-диагностики возбудителей фузариоза. В настоящее время наборы внедрены в производство на базе ЗАО «НПФ ДНК-технология»; их коммерческое распространение осуществляется ООО «АгроДиагностика».

Апробация работы и публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах и 1 методические указания.

Материалы диссертации были представлены на XXII, XXIII и XXV Зимних научных школах ИБХ РАН «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010, 2011, 2013); Втором междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010); Школе-конференции молодых ученых «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины-2011» (Москва, 2011); Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова» (Москва, 2011); 2-й школе-конференции РАСХН и ПАН «Adaptation to Climat Change in the Baltic Sea Region: contributions from Plant and Microbial Biotechnology» (Миккели, Финляндия, 2010); международном симпозиуме «Reduction of mycotoxins in production chains of EU and Russia: modern investigations and practical features» (Москва, 2011); VII международном симпозиуме «EU-Russia: cooperation in biotechnology, agriculture, forestry, fisheries & food» (Москва, 2012).

Структура и объём работы. Диссертация изложена на_страницах машинописного

текста и состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы (_наименований) и приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Общая стратегия исследований. Работа включала в себя 2 этапа. На первом этапе мы выбрали локусы для MLST-анализа, и сконструировали универсальные праймеры для их амплификации. Фрагменты ДНК анализируемых штаммов, амплифицированные с помощью разработанных праймеров, секвенировались, и последовательности нуклеотидов сравнивались между собой. Проведенный анализ позволил оценить степень межвидового полиморфизма анализируемых генов, и определить наиболее вариабельные из них. Также последовательности полученных фрагментов сопоставлялись с депонированными в GenBank NCBI, что дало возможность уточнить видовую принадлежность нескольких штаммов, ошибочно идентифицированных с помощью морфологического и культурального анализа. Были определены характерные для каждого вида устойчивые различия в последовательностях нуклеотидов, в дальнейшем использованные при подборе специфических праймеров. Кроме того, на данном этапе работы было проведено генотипирование исследуемых штаммов методами RAPD- и ISSR- анализа.

Задачей второго этапа была разработка специфических систем ПЦР-идентификации исследуемых видов. Праймеры подбирались к последовательностям вариабельных участков генов, которые были выявлены на первом этапе исследования. Специфичность сконструированных праймеров мы оценивали в тестах с ДНК моноспоровых культур. Наиболее эффективные пары праймеров были отобраны для разработки тест-систем, впоследствии адаптированных в формат ПЦР-РВ, для чего также подбирались флуоресцентно-меченые зонды типа TaqMan. Тест-системы были апробированы на образцах заражённого зерна, и искусственно зараженных проростках пшеницы на ранней бессимптомной стадии заболевания.

1. Анализ генетического полиморфизма штаммов Всероссийских коллекций

Выбор локусов для MLST-анализа и подбор универсальных праймеров. При проведении MLST-анализа, как правило, используются последовательности генов «домашнего хозяйства», главным образом кодирующие ферменты, ответственные за реакции основного метаболизма. Прежде всего, это связано с тем, что они присутствуют у всех организмов и характеризуются относительно низкой скоростью накопления мутаций, большинство из которых селективно нейтральны. Поэтому сравнение последовательностей нуклеотидов таких генов позволяет достаточно достоверно определять степень филогенетического родства между видами и популяции и осуществлять их классификацию.

Мы выбрали в качестве мишеней 8 генов, последовательности которых использовались в исследованиях рода Fusarium и близких к нему родов Cosmospora, Acremonium, Volutella', ген фактора элонгации трансляции 1 альфа (TEFla), ген бета-тубулина (ß - tub), ген фосфатпермеазы (РНО), ген большой субъединицы АТФ-цитратлиазы (acll), ген НАДФН-цитохром Р450 редукгазы (CPR1), ген стерол-14а-деметилазы (CYP51C), ген 2 субъединицы РНК-полимеразы II (RPB2), ген аминоадипат редукгазы (lys2). Для группы видов-продуцентов энниатинов использовался также ген энниатин-синтетазы (Esynl). Праймеры подбирались к консервативным участкам генов (во всех случаях это были экзоны), однако во фланкируемом ими участке желательно было присутствие более вариабельного интронного фрагмента. Подобрать такие праймеры удалось для всех генов, за исключением С PR!, CYP51C, и Esynl, у которых вся амплифицируемая последовательность была кодирующей. Для некоторых генов, например acll и РНО, для которых в GenBank депонировано лишь небольшое число

последовательностей, проводился дополнительный анализ аминокислотной последовательности кодируемого фермента. В этом случае подбор вырожденных праймеров осуществлялся к фрагментам нуклеотидной последовательности, кодирующим наиболее консервативные её участки, как это показано на рис. 1 для последовательностей большой субъединицы АТФ-цитратлиазы 5 видов грибов рода Fusarium:

ATPcl_F.floc_JX397 820 ATPcl_F.aven_JX397 808 ATPcl_F.tric_JX397818 ATPcl_F.acum_JX397816 ATPel F.lun AE90400

(12) тМШшэяШюШадпх&тпмяуг:?;

(12) m<fSSEi?ACTfJ;SAaEMVEHT2t5VI,líQFI,VK?í

иг) к мдаавииаяруц»FLVE

(12) к^ярЕлк.¥^дЕ!аекЕсаУЕН11а',авдгьУЕ?;

VPKFQDTE' »ГНч'СТГ ÍPKK.DTC 't-hi^DT

íphfqdie:

SrVIN'I

VntlKX ХУ1УХ S\IKt "НИ

I

5' - CAR CAR CAR GTN GAR CAY AC - 3'

ATPcl_F.floc_JX397820 ATPcl_F.aven_JX397808 ATPcl_F.tric_JX397818 ATPc1_F.acum_JX397816 ATPel F.lun AE90400

(109) IL KR'.' PS G VH13 V% VD FI T YÄVYVDCQFTYtE I' l L^IStrt

(109) LKi^TSGVn-iy'/IVDF*T Р&УАУУУDCggTTCLEIs £LVT IГ

(109) LKgv PSGVHSVLVDFIT KL Y AvYVDCQPTYLSI >;£ Ш1 ЮВДОЗДО

(109) ЬШ.'РЕдУН'хУЬУDFIT[&Y Av YVDCQFTYLEI" ГЬ'" IIH-L T'AV

(109) iKNVPSG^jyVLV&FI T KLYAVYV DCQFTY LS Г PI \ tcMU

г

5' - DAT YTC RAG RTA NTG RAA VTG RCA - 3'

Рисунок 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей большой субъединицы АТФ-цитратлиазы, депонированных в GenBank, с целью выявления консервативных участков (фрагменты, выбранные для работы, отмечены жирным шрифтом). Последовательности ДНК, кодирующие их, использовались для подбора универсальных праймеров (А - прямого, Б -обратного). F. floe - F. flociferum, F. aven - F. avenaceum, F. trie - F. íricinctum, F. acum - F. acuminatum, F. lun - F. lunatum.

Последовательности всех универсальных праймеров, использованных для секвенирования, приведены в таблице 1.

Таблица 1. Структуры и характеристики всех универсальных праймеров, использованных

при

Ген Наименование праймера 5'-3' последовательность T. Размер ампликона

TEFla FusTEF50F CGACTCTGGCAAGTCGACCAC 67 500

FusTEF590R CTCGGCTTTGAGCTTGTCAAG

ß-tub FusBTubF CAYCTTCAGACCGGTCAGTGC 67 600

FusBTubR GCAGAGCAGGTCAGGTAACGAC

PHO FusPHOF ATGATGGCYGCYGTCTTTGC 65 600

FusPHOR ACRATRATRATRTTTCCRACAGC

CYP51C C51CF AGCACMTTYGCCACTCTCTACG 62 450

C51CR TARTTCTCRCCHACRCAKCGATG

acll AcIlF GARCARCARGTNGARCAYAAC 65 500

AcllR DATYTCRAGRTANTGRAAYTGRCA

CPR1 CPR1F CTCTCACAACCCCTACATTGCCCCTAT 65 450

CPR1R CTTACCTGCCAYTCCTTYTSGTACATGA

RPB2 RPBF ACCATGGCTTCHTCAGGTTC 62 500

RPBR ACACCAACCATYTCACCAGG

Таблица 1 (продолжение)

Esynl EsynlF CCTCGYGATGTYCTCGAGATC 64 450

EsynlR CGTCKCTCCTTCAGAGTYGTGA

lys2 Lys2F GCCGGYAAGGGWATGCAG 63 500

Lys2R TGRGTCTTGAGGAACTTGGGC

Т, - температура отжига

Анализ отсеквенированных последовательностей. Сравнительный анализ отееквенированных нукпеотидных последовательностей с последовательностями, депонированными в GenBank, проводили с использованием программы BLAST на сайте NCBI. Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с помощью алгоритма Clustal W и путем построения филогенетических деревьев в программе MEGA 5.0 при помощи метода связывания ближайших соседей (Neighbour Joining, NJ). Попарные генетические расстояния определяли по 2-параметрической модели Кимуры (Kimura, 1980).

В результате сравнения отсеквенированных последовательностей с депонированными в GenBank первоначальная видовая идентификация была подтверждена для всех анализируемых штаммов, за исключением четырёх. Штаммы, 78101 и 96800, первоначально охарактеризованные как F. tricinctum, были идентифицированы как F. sporotrichioides и F. acuminatum соответственно. В обоих случаях причиной неверной изначальной морфологической идентификации было высокое морфологическое сходство видов F. tricinctum, F. acuminatum и F. sporotrichioides. Штаммы 90604 и ММ-0035, первоначально идентифицированные как F. avenaceum, по результатам MLST-анализа были охарактеризованы как F. torulosum. Для вида F. torulosum в GenBank депонировано небольшое количество последовательностей, поэтому сравнение проводилось главным образом по гену TEFla (Accession numbers JF803658 - 803661). Сравнение продуктов амплификации гена TEFla штаммов 90604 и ММ-0035 длиной 514 п.о. показало 100% соответствие последовательностям F. torulosum, представленным в GenBank. Этот вид обладает высокой изменчивостью и морфологически очень сходен с F. avenaceum, что существенно затрудняет его точную идентификацию. Вид F. torulosum, поражающий злаковые и плодовые культуры (Leslie and Summerell, 2006), ранее на территории России не отмечен, однако встречался на территории Норвегии и в Польше. Повторный морфологический анализ штамма 90604, проведенный нашими коллегами из ВИЗР, подтвердил идентификацию этого штамма как F. torulosum. Приведенные примеры показывают, что молекулярные методы идентификации, в частности с помощью предложенных маркеров позволяют дать более корректную и четкую таксономическую характеристику штамма, в то время как микробиологический анализ может приводить к ошибкам по причине морфологического сходства близкородственных видов.

Для некоторых видов фрагменты ряда генов были отсеквенированы впервые. Особо следует отметить расшифровку частичной структуры гена РНО для продуцентов энниатинов (виды F. avenaceum, F. acuminatum, F. tricinctum, F. torulosum). Для этой группы видов последовательности этого гена обладали высокой степенью полиморфизма даже на внутривидовом уровне (в частности, штаммы F. avenaceum были разделены 2 группы по наличию/отсутствию инсерции TGGGGAA в интроне). В дальнейшем полиморфизм последовательнорстей гена РНО был использовании при подборе праймеров, специфичных к виду F. cerealis, а также праймеров, впервые позволивших строго видоспецифично идентифицировать каждый из 4-х энниатинпродуцирующих видов. Кроме того, для F.

acuminatum и F. torulosum были определены частичные последовательности гена Esynl, кодирующего энниатин-синтазу - ключевой фермент синтеза энниатинов, важный не только в таксономическом, но и в функциональном значении при изучении механизмов токсигенности гриба. Полный перечень генов, отсеквенированных впервые, представлен в таблице 2.

Таблица 2. Перечень генов, впервые отсеквенированных в настоящей работе.

Ген Виды, для которых отсеквенирован впервые

TEFIa -

p-tub F. torulosum

РНО F. роае, F. avenaceum, F. tricinctum, F. acuminatum, F. torulosum

CYP51C F. acuminatum, /'. poae, F. torulosum

acll F. graminearum, F. culmorum, F. cerealis, F. langsethiae, F. poae, F. sporotrichioides

CPR1 F. acuminatum, F. tricinctum, F. graminearum, F. langsethiae

RPB2 -

Esynl F. acuminatum, F. torulosum

lys2 F. cerealis, F. torulosum

Наибольшую среднюю межвидовую вариабельность продемонстрировали последовательности гена РНО (50.4 % гомологичных нуклеотидов), наименьшую - гена В.РВ2 (85.2 %).

КАРЭ- и КБИ- анализ. В нашей работы мы также использовали 2 принципиально других метода генотипирования, основанных, в отличие от МЬБТ, на амплификации последовательностей ДНК неизвестной структуры. Это методы, в которых используются короткие праймеры либо произвольной последовательности (ЯАРО), либо последовательности, представляющей собой микросателлит (ВЗЯ). Праймеры связываются с с ДНК в участках близко расположенных (до 5000 п.о.; МюЬе1тоге е! а!., 1993) инвертированных повторов. При электрофоретическом разделении продуктов амплификации формируются специфические спектры фрагментов, представляющих собой анонимную, как правило, уникальную последовательность нуклеотидов.

После предварительного анализа для амплификации ДНК исследуемых возбудителей фузариоза нами были выбраны 3 коротких ЯАРО-праймера (ОРА-1: 5'-САООСССТТС-3'; ОРА-07: 5'-вААТСОССОТ-З'; ОРА-11: 5'-СААТСОСССТ-3'), и 2 ВЗЯ-праймера (В-1: 5'-САСАСАСАСАСАСТ-З'; 18-8: З'-ОАОАСАОАОАСАСО-З'). В спектрах амплификации этих праймеров удалось идентифицировать от 10 до 25 фрагментов, длиной от 200 до 2500 п.о., основная зона разделения - от 400 до 1500 п.о. Процент полиморфных фрагментов значительно варьировался в зависимости от вида и секции. Для оценки уровня полиморфизма данные были представлены в форме матрицы состояний бинарных признаков, где наличие или отсутствие продукта амплификации рассматривалось как состояние 1 или 0 соответственно. Генетические расстояния рассчитывали по методу Нея (Ие!, 1979). Расчет средних генетических расстояний в целом показал близость видов, характеризующихся сходными спектрами продуцируемых микотоксинов. Так, рассчитанное среднее генетическое расстояние между продуцентами трихотеценов типа В К &-аттеагит и си1тогит составило 0,65, а

между продуцентами энниатинов F. ауепасеит и Р. МстсШт - 0,54. В то же время, среднее генетическое расстояние между /Г graminearum и р. ачепасеит составило уже 0,913.

На рис.2 приведена электрофореграмма продуктов амплификации штаммов каждого из 12 анализируемых в работе видов с праймером ОРА-11. Программа амплификации была следующей: 93°С - 90 с, 93°С - 20 с, 64°С - 5 с, 67°С - 5 с (5 циклов); 93°С - 1 с, 64° - 5 с, 67°С -5 с (40 циклов).

Рисунок 2. Результаты амплификации геномной ДНК анализируемых видов рода Fusarium с праймером ОРА-11. 1 - F.graminearum 41806, 2 - F. culmorum 70505, 3 - F. cerealis 39295, 4 - F. sporotrichioides 74006, 5 - F. langsethiae 55201, 6 - F. poae 47401, 7 - F. avenaceum 74005, & - F. tricinctum 30141, 9- F. acuminatum 80550, 10 - F. torulosum 90604, 11 - F. solani HtiMi, 12 - F. equiseti 64414.

Стрелкой показан мономорфный фрагмент ОРА-11-1500, который присутствовал в спектрах амплификации всех исследуемых видов. Секвенирование этого фрагмента и его сравнение его последовательности с данными GenBank показали, что по-видимому, он соответствует некодирующим участкам хромосомы 2. Отсеквенированные последовательности RAPD-маркера депонированы в GenBank (Accession numbers JF728823-728856).

Последовательности фрагмента ОРА-П-1500 вместе с частично отсеквенированными последовательностями 8 генов были использованы для построения филогенетического дерева (Рис. 3). Топология дерева демонстрирует достаточно чёткое разделение исследуемых видов на группы соответствии со спектрами продуцируемых микотоксинов. При этом некоторые виды, относящиеся по существующей систематике рода к разным секциям, филогенетически расположены ближе друг к другу, чем виды, из одной секции. Наиболее очевидный пример -уже упомянутые виды F. tricinctum, F. sporotrichioides (секция Sporotrichiella), и F. acuminatum (секция Gibbosum). Полученные данные свидетельствуют о необходимости использования биохимических и молекулярно-генетических методов в классификации представителей рода Fusarium, и пересмотра многих положений современной систематики.

В целом, результаты MLST, RAPD и ISSR анализов достаточно хорошо коррелировали друг с другом, однако при применении двух последних методов (прежде всего это касается RAPD) часто возникают сложности, связанные со слабой воспроизводимостью результатов.

Это прежде всего связано с низкой температурой отжига праймеров и сильной зависимостью качества реакции от концентрации матрицы. С этих позиций MLST представляется наиболее надёжным, воспроизводимым, и удобным для практического применения методом генотипирования и молекулярного маркирования грибов рода Fusarium.

Favenaceum70585 Favenaceum74006 Fa venaceum 114003 - Favenaceum93401 f- Favenaceum109902 П- Favenaceuml 08701 | Favenaceum120015 I— Favenaceuml 08802 I- Favenaceum80310 L- Favenaceuml 14605 FavenaceumK0238 Favenaceum80212 Favenaceuml16504 Favenaceuml19913

j- Facuminatum59402

J- Facuminatum131802

|i- Facuminatum80550

'- Facuminatum96800

Ftricfnctum70624 Ftricinctum30141 tricinctum50010 Ftorulosum90604 FtorulosumMM0036

-c:

Секция Roseum

Секция Gibbosum

Секция Sporotrichiella Секция Gibbosum

■ Fculmorum58030

■ Fculmorum58801

- Fculmorum74007

- Fculmorum70506

- FculmorumK0245

- Fcerealis64722

- Fcerealis37032

- Fgraminearum41806

- Fgraminearum58030

- Fgraminearum70725

- FgraminearumG8-8

- Fgraminearum48702

- Fgraminearum58212

- F.sporotrichioides74006

- FsporotrichioidesKr-97-4-2

- Flangsethiae82901

- Flangsethiae56201

- Fsporotrichioides33100

- FsporotrichioidesC3-41

- Fpoae78105

- Fpoae61701

- Fpoae47401

Энниатины, монилиформин

Л

b о

§ ё я

v Трихотецены f (тип В)

£ о

у

- FsolaniHTiMi

Трихотецены (тип А)

Смешанный трихотеценовый хемотип (А + В)

Рисунок 2. Укоренённое консенсусное филогенетическое дерево, построенное на основе выравнивания последовательностей нуклеотидов 8 генов и одного продукта RAPD-анализа 11 видов грибов рода Fusarium (5000 п.о.)- Дерево укореняли по последовательности F. solani. 0.1 - эволюционное расстояние.

2. Разработка систем ПЦР-идентификацин возбудителей фузариоза

На втором этапе работы нашими целями были:

1. Разработка унифицированных систем идентификации токсигенных возбудителей фузариоза злаковых, которые позволили бы проводить анализ зараженности зерна с помощью минимизированного количества анализов.

2. Разработка видоспецифических систем для видоспецифичной идентификации грибов К сегеаИз, К ауепасеит, Р. МстсШт, К ЮгиЫит, которые невозможно однозначно идентифицировать с помощью имеющихся на сегодняшний день праймеров.

Подбор специфических праймеров и зондов. Для реализации первого подхода было решено объединить несколько видов в группы, каждая из которых определялась бы с помощью одной пары праймеров. Каждая группа включала несколько видов, характеризующихся сходными профилями продуцируемых микотоксинов. Всего было выделено 5 групп видов: продуценты трихотеценов типа А (К вроШгШоМеэ, Р. ¡а^еМае); продуценты трихотеценов типа В (Г. ягаттеагит, К Ытогит, К сегеаНз)-, смешанный хемотип А-В (К роае)\ трихотецен-непродуцирующие виды, для которых характерна продукция энниатинов и боверицина (К юепасеит, К Мстсшт, К аситтмит); а также вид К ¡оШ, для которого характерна продукция таких токсинов, как циклоспорин А, фуранотерпеноиды, фузариевая

кислота, монилиформин.

Основными задачами был подбор специфических праймеров и зондов на основе ЗСАК,-маркеров, выявленных в первой части исследования; экспериментальная проверка их специфичности; апробация разработанных систем на образцах зараженного растительного и семенного материала. Важным промежуточным этапом являлась оптимизация параметров ПЦР, в особенности количества циклов и температуры отжига праймеров, определяющих эффективность и специфичность реакции.

В качестве мишени при подборе специфических праймеров в первом случае был выбран ген 7,£F7a. Причинами такого выбора стали его достаточно высокая вариабельность (60.2 % гомологичных нуклеотидов), а также широкая представленность его последовательностей в йепВапк ЫСВ1. Кроме того, на сегодняшний день известно (Кгайшеп а а1., 2005), что степень полиморфизма последовательностей нуклеотидов фрагментов этого гена между видами коррелирует со спектром продуцируемых ими токсинов. Для подбора видоспецифичных праймеров использовались последовательности гена РНО, как обладающего наибольшей вариабельностью, в частности, для группы энниатинпродуцирующих видов.

Подбор праймеров осуществляли с учетом требований специфичности, наиболее

важными из которых были:

1. На З'-конце праймера как минимум два нуклеотида должны быть полностью гомологичными последовательностям ДНК детектируемого вида/группы видов.

2. Расчетная температура отжига праймеров должна находится в пределах 60°С-67°С.

3. Праймеры не должны формировать стабильных шпилечных структур и димеров.

На рис. 3 схематично представлены выравнивания участков гена TEFla, использованных для подбора праймеров, специфичных к группе продуцентов трихотеценов типа В {{F. graminearum; F. culmorum; F. cerealis). На рис. 4 представлены выравнивания участков гена РНО, использованные для подбора праймеров, специфичных к виду F. acuminatum. Места предполагаемого отжига праймеров подчёркнуты.

A Fgc210F

F.graminearum_48702 Try 'CgCGCGe^CeTTTTCCCfTTCGftAATft'rC'afr - > CCTCA

F.cerealis_39295 f'Tr-.TCgCGCGC-CeTTTTCCCTTTCGAAAcag' AYj~',l &'ICS CCTCft

F.culmorum_50901 IcayrCSCGCSC-CCTTTTCCgrTTCGAAACaT-pTr "ПАЙТСа !'

F.langsethiae_55201 iCCATC,8TGCS5-CCTTCTTCCcaTC0Arcc^CM'?;ni.|!lTCQ',TCTC&

F.sporotrichioides_7 4 0 0 6 гсСАТр^йСЙС-ССТТСТтСС^ТстасСС^саУД;сг-^трСС5С?СД

F.poae_47401 T V 'CGCT>> «С-СС AClTTCCCTi " iCCAlvftCj г;„ЙГСЙ<-"£С?№

F.solani_HTiMi CCwAT^SGCCTTGAjkTtOCACAJ' PAATTCCrCGfCG? RlTC -СТССЯ,

F. avenaceum_103100 Г ' Т. , -r--cr----I J тг

F. torulosum_90604 - T -» w;- у----• „ ___ , t

F. tricinctum_50010 Jf .V. | -П • ЙС- <S----flM№ttf---ft CCAi ЙАТ 1€S<

F. acuminatum 58901 >1\ Ti-- . 5C-G§1*----C" --- - т

F.graminearum_48702 F.cerealis_39295 F. culmorum__50901 F.langsethiae_55201 F.sporotrichioides_74006 F.torulosum_90604 F.tricinctum_50010 F.acuminatum_58 901 F.poae_61701 F. solani_HtiMi F.avenaceum 70585

® Fgc605R

' t ---- '"TGTCATCACATTCTCATACTAACATGG I -'

'9ШС----jGBTGTCATCACCTTCTCATACTAACACGArfATC.- :

Л||рс----jGBTGTCATCACATTCICATACTAACACGAf TATC. !

ATiat----|GTC . i'^^jfCfM™ bA :^|GCCAGCSA'

----fccciTcs еде- гс^сетд- ■ pact gacev

SSGlCTCAfA|CA?OirGCTTTCA^CS'iG-'P/, $|стг|с—:

■ ■CTCACA§TA^g;CGCTTiPCAKMfG" № ЩС m SeGiCTCACA|TA70i'GTATiCAiCA?G ^ Д?С «CTACCfCAGTCAC i .

KTCTC------" " III ИИ f I' llllj D'lH И lllfi/l| Ш

Ща|СТСАСА§САС|1®СС|таСА§р»0' 1AA А~ТС'ТПХ,. .

«Ос «S3 дае ;atg ;ats

«■is

Щв лтс

Рисунок 3. Выравнивания последовательностей нуклеотидов гена ТЕЕ1а, использованных для подбора праймеров Fgc210F (А) и Р§с605Я (Б), специфичных для продуцентов трихотеценов типа В. Места предполагаемого отжига праймеров подчёркнуты.

F.acuminatum_96800 F.acuminatum_131802 F.acuminatum_80550 F.tricinctum_50010 F.avenaceum_91205 F.torulosum_90604 F.graminearum_41806 F.sporotrichioides_33100 F.langsethiae_55201 F.acuminatum 59402

FacumPHOF

CGGgT' " GTCCTCCCTCGAGACTGCCfri С

~t.RCl F GTCCTCCCTCGAGACTSCQ3CGGACqr.T.'\.^aC. tar. Gi#1 .i, GTCCTCCCTCSAGACTGCCeCG - ICACTAJ , :

• ' ' iiri C' - lAA^^CGS-AGAiftCCAaASTTCCP <5Р0ГГ ГД GigTTCfCTCGJ GAC& £|jftAGwftCA< JWSTCft П--с«*гг.-д. тег, 6GGT cv<SftaC -

"reel • 7 ¡ИттстстГтет^сАЛ г- с/г

GbTl A. Сй£1СТ1 IJjMAGG/ С <A

Gt,gt„ "A, „CAfi i Ti I С AAGGft. « \ f,ii С A

«Си, и .e 'Г|ЙЙИТ ССЩСГ-асдстааиИ A

Рисунок 4 (А). Выравнивания последовательностей нуклеотидов гена Л7<9, использованных для подбора праймеров FacumPHOF (А) и FacumPHOR (Б), специфичных для вида F. acuminatum. Места предполагаемого отжига праймеров подчёркнуты.

Г. аситл.па1шп_96800 Г. аситл.па!:ит_80550 Г. асипипа^т_59402 Г. 1г1сл.пс1;ит_50010 Г.ауепасеит_91205 Г.Ъоги1озит_90604 Г.дгат1пеапдт_41806

Г. 5рогоЪг1сЬхо1с1е5_33100 Г. 1апдзе1:Ыае_55201 Р. аситл.па1:ит_131802

Рисунок 4. (Б).

Изначально для детекции каждого вида (группы видов) было сконструировано по 2 пары праймеров, с целью отбора наиболее эффективной из них. Наиболее важным параметром при отборе праймеров была их специфичность. Те пары праймеров, которые давали неспецифические перекрёстные реакции (прежде всего, с близкородственными видами), выбраковывались. Другой принципиальной характерисикой праймерных пар была их чувствительность.

На следующем этапе подбирались зонды для флуоресцентной детекции. От зонда не требуется столь строгой специфичности, как в случае праймеров, поэтому была возможность сконструировать универсальные зонды к консервативным участкам последовательностей нуклеотидов ДНК. В итоге, для работы было отобрано всего пять зондов типа ТаяМап - три к праймерным парам на ген ТЕР 1а, и два - к праймерам на ген РНО.

На рисунке 5 в качестве примера приведены выравнивания участков последовательностей нуклеотидов генов ТЕР1а, и РНО, использованных для подбора зондов Рэ1рР (Т) и БРНОТ соответственно.

ГасшпРИОК

■вир тсвостхстссассзжсзаас® ' ■

еШшЯр \rcggctactccacgaasaacii шшШШщЩ

Т сяс!стастсслсзллзаас ; л-д^еще т с

С,, -.мн^и 1 * - • > С 0= шшш

шивши т <Г'.; 1 С, л^дрр ШШШШШ^ШЩХШ

'.-■"--"•АОГ-ТТЛ' Г| VI | ||||а| л ГЧСЙТТСТ^ГС т.,

Ш ."'.••..*.■'•К.Г'"'.'.-'; Т 5КГАТЗ яре! "таст&атпгс Г сч/

Ш Ш г ЁтШИ лсщатсс ¡сяоеадСос С'1

В т; -а ,т т с 'САС&1АСь1С_ С'1

ИШЯШЙЯВ! :с5 , <' иййр ШШШ*

1к1рР(Т)

г.1апдзе1:Ыае_55201 ". : ^ссмвАтеетасееес?

Г.зрого1;г1сЬ1о1с1ез_74006 .6&ТССС?ССССС".?С. ГСС

?.роае_б170б . щсашемеЯёевсссгасгттг

Г. 1гл.сл.пс1:Ш11_50010 Г.асиш1па1ига_131802 Г.avenaceum_91205 Г.-Ьоги1озит 90604

Б грнот

' ДТ 'ЧАС: АЙСАСС Сг" ТЖ36С«АТСдТС1'ДАСЙ&ТССССВААЙ."Т С< ПаГК1Л:ШЫ:АС::-АТАСОСАвАТСаТСТТАСААТССССеАААС1

|рЯМ1 пЛГ.\с: С. -С АСССАбАТСбТСаТАСААТССССеАААС- [. <

Рисунок 5. Выравнивания последовательностей нуклеотидов гена ТЕР1а для подбора зонда Рз1рР (Т) (А) и гена РНО для подбора зонда РРНОТ (Б). Последовательность, соответствующая зонду, выделена жирным шрифтом.

В таблице 4 приведены структуры всех использованных в работе зондов и пары праймеров, которым они соответствуют.

Таблица 3. Структуры и характеристики специфических праймеров, использованных в работе.

Пара праймеров Объект(ы) Ген 5'-3' последовательность Т. Спец. Чувствительность, пг (ДНК)/реакцию Размер ампликона

Р§с210Р Fgc605R Р. ^ат ¡пеагит, Кси1тогит, Р.сегеаЬз ТЕР 1а СОСССТПТСССТТТСОААА ССАТОТТАОТАТОАОААТОТОАТОАСА 64 + ю- 410

Рэ180Р РБШОЯ Р.$рого1г\сЫо1(1г$, К кт&еМае ТЕР1а АСТТОССССКЮТАСТГТСААТС ОАТОАТОССКИОСССАТОТА 64 + 10" 330

ИрбОР Рр22011 К роае ТЕР 1а ААССОААТСТСААСТССССТТТ СОАОТСАТОЗАТСОАССОАААОТ 64 + ю-1 190

Ра1б5Р РаОЗОЯ Р.спепасеит, ЕгШпсШт, Р. ЮгиЬзит, КаситШШт ТЕР1а АОТСОСТТАТСГССАСТСООА АСТССАОТООСООООТААОАТА 64 + 10" 290

РБОШ Р50Ж Р.йокаи ТЕР1а ОТААОТСАААСССТСАТСССС САОСОАТСАСООСПТЮТСС 64 + 10" 300

РауРНОР РауРРКЖ Кауепасеит РНО СТТТАСТОТААОТТСТААСОТСАУОА ССАСАТСААСАСАСААССАТСАТ 65 + 10" 350

РОчсРНОР РйсРНОЯ Р.1пстс1ит РНО САОСООСАОАТАССААААОТ АТОАОССААТОАССГГСАОААТО 65 + 10" 350

РаситРНОР РаситРНОЯ р.аситШШт РНО ОТССТСССТСОАОАСТОСС ОТТСТТСТТСОТОСАОТАСССО 65 + 10" 350

РюгРНОР К1огРНСЖ Р. Юги1о$ит РНО ТТСААОТССТСССТСОАССО ССАССААССАОСАСТАССО 65 + 10" 350

РсегРНОР РсегРНОЯ Р.сегеаНя РНО СААОТСООТСОСТСАТТТОТТС АОАТАОАТТСАСАТОССААОААТАТО 60 + 10" 280

Т, - температура отжига; спец. - специфичность

Таблица 4. Структуры и характеристики всех зондов типа ТаяМап, использованных в работе.

Наименование Последовательность 5'—>3' Tm°c Пары праймеров

FgcP(T) BHQ1- GGGCTCA(FAMdT)ACCCCGCCACTCGA G 75 Fgc210F-Fgc605R

FsIpP(T) BHQ1- GGGCGCGCGA(FAMdT)CGAGGAAA 75 Fsl80F-Fsl390R; Fp60F-Fp220R

FatP(T) BIIQ1- GCGCTCCCA(FAMdT)CGATTCCCACGA 75 Fat65F-Fat335R

FPHOT BIIQl- ACGCAGACGT(FAMdT)CTTACAATCCC CCGAAA 75 FavPHOF-R; FtricPHOF-R; FacumPHOF-R; FtotPHOF-R

FceTPHOT BI1Q1- TGCACTGGAGA(FAMdT)TGTCAAATTG CCG 75 FcerPHOF-R

Экспериментальная проверка специфичности праймеров. Анализ специфичности разработанных праймеров проводился на образцах ДНК 90 моноспоровых штаммов грибов рода Fusarium.

Для стандартизации тест-систем необходимо было разработать универсальные программу амплификации и состав реакционной смеси (кроме специфических праймеров и зондов). Для всех пар праймеров разработать единую программу не удалось, и в итоге было решено остановиться на трёх программах амплификации:

1. Для всех праймеров к последовательностям гена TEFIa: 93°С - 90 с; 93°С - 20 с, 64°С -5 с, 67°С - 5 с (5 циклов); 93°С - 1 с, 64° - 5 с, 67°С - 5 с (40 циклов).

2. Для специфических праймеров к продуцентам энниатинов: 93°С - 90 с; 93°С - 1 с, 65° -10 с, 72°С - 10 с (40 циклов).

3. Для видоспецифических праймеров на вид F. cerealis: 93°С - 90 с; 93°С - 10 с, 60°С - 15 с, 72°С - 10 с (40 циклов).

В 18 мкл реакционной смеси содержалось 1.8 мкл 10-кратного буфера (750 мМ Tris-HCl, pH 8.8; 200 мМ сульфат аммония, 0.1% Твин-20; 0.5 мМ каждого dNTP, по 6.25 пмоль праймеров, 1.25 ед. Taq - полимеразы и 5 мкл раствора ДНК. Для проведения ПЦР-РВ также добавлялся зонд (3.5 пмоль). Помимо специфических праймеров, и тестируемой ДНК в реакционную смесь также добавлялся внутренний контроль (ВК). В качестве ВК использовалась плазмидная конструкция со вставкой размером 560 п.о., фланкированную инвертированными последовательностями, на которые отжигается праймер, используемый для амплификации. Концентрация плазмиды была подобрана таким образом, чтобы ПЦР с ДНК ВК не ингибировала амплификацию специфических фрагментов ДНК. Использование ВК необходимо для оценки возможного ингибирования ПЦР, и, как следствие, получения ложноотрицательных результатов.

На рис. 6 в качестве примеров приведены электрофореграммы результатов ПЦР ДНК исследуемых штаммов с парами праймеров Р§с210Р^с60511 и Р5180Р-Р5139(Ж.

- t 1«"' W -« -t»"'W"ti

U t 2 i 4 *"i ¥ 7 » V TO 11 12 П H IS 16 37

спец. фрагм.

спец. фрагм.'*'

> 1« го

t т ФШ т ~ *ш «» «* <т «

• а и: к •• si; й а. к. я & :» » » эi 32« м

sooW

М 35 36 37 38:! » 40 41 43 41 44 45 .4« 47:« » 50 51

ККГ*

спец.,^-фрагм.

М S* «Г .!

. 13 « « «6 • •

М &2 И » » М S?, 5i : 5e ев:.61 <Ц ta 8*. ¡35 № «в

w в» 7» n гг ТУ 1* ц лггт|)1»к«пкн

спец. фрагм.

t Я»: п гг п .74. 7S .. » П Т» ?9 : К'И 82 - 81 М <4"

вк—fc

спец. > ~ Фрагм."

Рисунок 6. Электрофореграмма результатов ПЦР ДНК 90 моноспоровых штаммов грибов рода Fusarium с парами праймеров Fgc210F-Fgc605R (А) и и Fsl80F-Fsl390R (Б). 1-6 - F. graminearum; 7-35 F. culmorum; 36-41 F. cerealis', 42-52 F. sporotrichioides; 53-54 F. langsethiae\ 55-58 F. acuminatum', 59-62 F. equiseti; 63 F. solani; 64-66 F. poae\ 67-85 F. avenaceum', 86-90 F. tricinctum. ВК - внутренний контроль, «спец.» - специфический продукт,«-» - отрицательный контроль (вода).

Аналогичные результаты получены для всех разработанных пар праймеров как при электрофоретическом анализе, так и в режиме ПЦР-РВ. Полоса в образце №89 при амплификации с парой праймеров Fsl80F-Fsl390R соответствует штамму 78101, который ранее был идентифицирован как F. sporotrichioides. По одному специфическому фрагменту для каждой пары праймеров было использовано для клонирования положительных контролей.

Оценка эффективности проведения ПЦР-РВ и наличия ингибиторов в смеси. Для

проверки отсутствия ингибирования специфической амплификации и расчета эффективности реакции проводили ПЦР-РВ с последовательных десятикратных разведений специфической геномной ДНК. Каждая концентрация (в диапазоне от 101 до 106 пг ДНК на реакцию) была взята в четырех повторностях. На рисунке 7 приведены стандартные графики зависимости значения Сч от количества копий специфической ДНК на реакцию для пар праймеров Р£с210Р-Рсс605Я и Г5180Р-Р5139(Ж.

f(x)=-3.13x+38.1 R2=0.997

Т"

f(x)=-2.91x+36,l

R2=0.992

2 3 4

Lg(CnHK,pc.

2 3 4 5

Lg(CДНК/реакцию, пг)

Рисунок 7. Стандартные графики зависимости Счот концентрации ДНК в пробе (1о§С). А -для пары праймеров Р$с210Р-Р§с605К; Б-для пары праймеров р5180Р-Рз!390К.

Чувствительность всех тест-систем составила порядка 10 пг специфической ДНК на реакцию, что составляет около 200 копий с учетом размера генома грибов рода Fusarium порядка 36 млн. п.о. Для всех остальных пар праймеров чувствительность была такой же, за исключением пары FtorPHOF-R, для которой максимальная чувствительность составила около 100 пг ДНК на реакцию. Эффективность реакции в зависимости от пары праймеров варьировала от 97 до 99%, что является высокими значениям эффективности для систем ПЦР-диагностики.

Анализ полевых образцов заражённого зерна. Для использования тест-системы в практике диагностики и идентификации возбудителей фузариоза была необходима её апробация на полевых образцах заражённого зерна. Исследованные образцы были предварительно охарактеризованы по трем показателям: зараженность каждым из исследуемых видов возбудителей фузариоза, а также и содержание в них наиболее распространенного микотоксина - дезоксиниваленола (ДОН) и наиболее токсичного - Т-2. Данные по содержанию в образцах ДОН и Т-2 были получены A.A. Буркиным и Г.П. Кононенко (ВНИИ Ветеринарной санитарии, гигиены и экологии, Москва) с помощь непрямого иммуноферментного анализа (indirect ELISA) с пределом детекции 40 пг на реакцию. Исследование проводилось с использованием 4-х пар праймеров, специфичных к продуцентам А-трихотеценов, В-трихотеценов, смешанному хемотипу (F. роае), а также продуцентам энниатинов. Для оценки воспроизводимости результатов, анализ каждого образца проводился в трех повторностях. Полученные значения Cq использовались для расчета приблизительной концентрации ДНК в пробах с учётом данных, полученных с помощью стандартных разведений (рис. 7). Рис. 8

иллюстрирует корреляцию между степенью зараженности образцов К grатшеатт и К си1тогит (А), а также Р. зрогоМсЫоШв и Л Ь^яеМае (Б), и содержанием ДНК этих видов, определённым с помощью ПЦР-анализа.

С 15

R2 = 0,5271

R = 0,0536

1,5 2

Logtcjvt«' пг>

2,5 3

LogtcnHK, nri

Рисунок 8. Корреляция между приблизительным содержаниям ДНК (log) грибов рода Fusarium и степенью заражённости зерна, охарактеризованной микробиологическими методами. А - для видов F. graminearum и F. culmorum (R2 = 0,5271), Б - для видов F. sporotrichioides и F. langsethiae (R2 = 0,0536).

Корреляция между двумя показателями была относительно высокой для видов F. graminearum и F. culmorum, в то время как для видов F. sporotrichioides и F. langsethiae значение R2 было низким. Эти результаты могут быть объяснены тем, что грибы F. graminearum и F. culmorum образуют обильное спороношение, которое хорошо заметно и дает возможность достаточно легко диагностировать наличие инфекции. В то же время, заражение видами F. sporotrichioides и F. langsethiae визуально может протекать без видимых симптомов, и определяется достаточно тяжело. То же самое можно сказать про виды F. avenaceum (R2 = 0,4234, данные не приводятся), который характеризуется наличием ярко выраженных симптомов заболевания, и «бессимптомного» F. роае (R2 = 0,1338, данные не приводятся). Эти результаты подчеркивают необходимость комплексного исследования зерна на зараженность возбудителями фузариоза с обязательным применением молекулярных методов диагностики, позволяющих определять латентные и бессимптомные инфекции.

Также значения концентраций ДНК патогенов в исследуемых образцах сопоставлялись с данными по содержанию в них микотоксинов ДОН и Т-2. Рис. 9 иллюстрирует корреляцию между количеством ДНК F. graminearum и F. culmorum и концентрацией ДОН (А), а также количеством ДНК F. sporotrichioides и F. langsethiae и концентрацией Т-2 токсина (Б).

Корреляция между концентрацией токсинов в образцах и количеством специфической ДНК была низкой (R2 = 0,0785 для ДОН и R2 = 0,0835 для Т-2). Эти результаты могут быть объяснены тем, что анализируемое зерно было собрано на северо-западе России, то есть в областях с холодными и влажными климатическими условиями. На сегодняшний день известно, что продукция микотоксина даже при существенном поражении в таком климате подавлена, вследствие чего его концентрации в образцах зерна низкие. Сходные результаты были получены, в частности, Sari in et al в 2006 г. в опытах с образцами зерна из северной Европы.

R = 0,0785

2,5 3

Lociicax«, «in

R = 0,0835

3 4 5

LOgtCAXK. nr)

Рисунок 9. Корреляция между приблизительным содержаниям ДНК (log) грибов рода Fusarium и концентрацией (log) токсинов: А - (ДНК F. graminearum и F. cuimorum)/ДОН (R2 = 0,0785), Б - (ДНК F. sporotrichioides и F. Iangsethiae)/Т-2 (R2 = 0,0835).

Синтез и накопление микотоксина зависит от таких факторов, как микрофлора зерна, температура, влажность и т.д. (Doohan et al., 2003). Вместе с тем, синтез и накопление микотоксина может начаться при изменении условий хранения зерна, воздействии биотических и абиотических стрессов, поэтому основным показателем, принимаемым во внимание при анализе зараженности зерна возбудителями фузариоза, должно быть содержание в пробе специфической ДНК патогена (Horevaj et al., 2011; Гагкаева и др., 2011).

Детекция F. cuimorum в проростках пшеницы на ранних стадиях заражения. С целью изучения возможности использования разработанных тест-систем в формате ПЦР-РВ в экспресс-диагностике возбудителей фузариоза совместно с сотрудниками лаборатории патофитофизиологии ВНИИФ Россельхозакадемии был проведен анализ искусственно зараженных грибом F. cuimorum проростков пшеницы. Целью исследования было установление возможности детекции гриба, который вызывает корневую гниль злаковых, в растительном материале на ранней стадии заражения, а также уровнем распространения болезни и сигналом ПЦР.

Для этой работы семена пшеницы сорта Энита инокулировали патогеном путем погружения их на 15 мин в суспензию спор, а затем дополнительно инокулировали нанесением 250 мкл суспензии в зону зародыша. В качестве отрицательного контроля использовали проростки из семян, обработанных дистиллированной водой. Каждая обработка включала 100 проростков. Для анализа с помощью ПЦР-РВ были взяты 3 серии образцов: незаражённые (контроль), а также образцы, содержащие 10, 50 и 100% заражённых проростков (далее обозначены как «заражение 10%, 50%, 100%»). Образцы отбирали на 3 и 7 дни после заражения.

В эксперименте кроме пары праймеров Fgc210F-Fgc605R использовался эндогенный внутренний контроль, служащий не только для оценки корректности ПЦР, но и для

нормировки количественных значений концентраций специфической ДНК в пробах. Внутренний контроль представлял собой пару праймеров

(F: 5 '-TCGGAGATAAGCCAGGTGGAC-3'; R: 5'-TGCTGACATACTGGAACATCTCG-3'), и зонд типа TaqMan (5 '-(BHQ l)-TAACATCCA(HEXdT)TGTCAGCTATAGGCCATCT-3'), меченый другим флуорофором (6-гекахлорокарбоксифлуоресцеин, HEX), подобранный к последовательностям фактора элонгации трансляции G пшеницы. С помощью такой системы возможно установление точного соотношения количества ДНК гриба и ДНК растения. В табл. 5 приведены результаты ПЦР-РВ со всеми сериями образцов на 3 и 7 день после заражения.

Таблица 5. Результаты ПЦР-анализа ДНК искусственно заражённых грибом F. culmorum проростков пшеницы. FAM - специфический образец, HEX - внутренний контроль, К+ -положительный контроль, К - - отрицательный контроль.___

3 день п/з Cq FAM Cq HEX 7 день п/з Cq FAM Cq HEX

Незараженный - +(27.5) Незараженный - + (27.3)

Заражение 10 % + (32.5) + (27.1) Заражение 10 % + (34.0) + (28.0)

Заражение 50 % + (34.7) + (27.4) Заражение 50 % + (26.6) + (27.6)

Заражение 100 % + (35.2) + (27.8) Заражение 100 % + (23.9) + (27.5)

К+ + (22.0) + (26.9) К + + (21.5) + (27.0)

К- - + (26.7) К- - + (26.9)

На рис. 10 продемонстрированы соотношения количеств ДНК гриба (пг) и пшеницы (нг) для разных образцов разных серий.

Рисунок 10. Соотношения количеств ДНК гриба и пшеницы дня трёх серий образцов. Левые столбики - 3 день после заражения, правые столбики - 7 день после заражения.

На 3 день после заражения количество ДНК практически постоянно везде вне зависимости от количества заражённых проростков. Возможное объяснение этому факту - то, что на 3 день интенсивный рост гриба ещё не начался и его количество остаётся неизменным практически везде. На 7 день после заражения видна чёткая корреляция между количеством заражённых проростков и интенсивностью сигнала ПЦР. Количество ДНК в серии «50%» выше, чем в серии «10%», почти на 3 порядка, в свою очередь, в серии «100%» выше, чем в серии «50%» десятикратно.

Проведённый опыт показал несомненные преимущества использования метода ПЦР, и, в частности, ПЦР-РВ для диагностики фузариозной инфекции на ранних, бессимптомных стадиях заражения. Методы фитопатологической экспертизы позволяют идентифицировать патоген лишь на 12-14 сутки после заражения. Разработанные тест-системы более эффективны и чувствительны, чем используемые на сегодняшний день классические методы, и имеют перспективы для использования в лабораториях и организациях, занимающихся фитосанитарным контролем и оценкой качества продуктов питания.

выводы

■ MLST-анализ последовательностей нуклеотидов ДНК широкого спектра видов токсигенных грибов рода Fusarium позволил выявить полиморфные участки ряда локусов, оптимальных для использования в качестве новых высокоспецифических маркеров.

■ Полученные данные позволили сконструировать оригинальные праймеры и зонды, обеспечивающие видоспецифическую ПЦР-идентификацию и диагностику исследуемых возбудителей фузариоза злаковых, а также детекцию групп видов, характеризующихся сходными профилями продуцируемых ими микотоксинов.

■ Охарактеризована и уточнена видовая принадлежность штаммов грибов рода Fusarium из всероссийских коллекций; впервые на территории России обнаружен токсигенный вид F. torulosum, трудно идентифицируемый традиционными методами.

■ Впервые установлены последовательности фрагментов генов PHO, b-tub, CYP51C, Esynl, CPR1, lys2, acll для ряда исследованных видов возбудителей фузариоза.

■ Созданы тест-системы для качественного и количественного ПЦР анализа зараженности зерна грибами рода Fusarium, которые легли в основу испытанных и внедренных в производство наборов для их ПЦР-диагностики и идентификации.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Stakheev A.A., Ryazantsev D.Yu., Gagkaeva T.Yu., Zavriev S.K. (2011). PCR detection of Fusarium fungi with similar profiles of the produced mycotoxins. Food Control. V. 22. p. 462-468.

2. Стахеев A.A., Рязанцев Д.Ю., Завриев C.K. (2011). Выявление новых генетических маркеров для таксономической характеристики и идентификации грибов рода Fusarium. Биоорганическая химия т. 37 , с. 662-671.

3. Гагкаева Т.Ю., Гаврилова О.П., Стахеев A.A., Рязанцев Д.Ю., Завриев С.К. (2012). Первое обнаружение в России гриба Fusarium torulosum. Микология и фитопатология, т. 46, с. 86-91.

4. Стахеев A.A., Хайрулина Д.Р., Рязанцев Д.Ю., Завриев С.К. (2013). Ген фосфатпермеазы как маркер для видоспецифической идентификации токсигенного гриба Fusarium cerealis. Биоорганическая химия т. 39, с. 175-183.

Методические указания:

1. Стахеев A.A., Рязанцев Д.Ю., Завриев С.К., Щербакова J1.A., Коломиец Т.М. Диагностика токсигенных возбудителей фузариоза зерна методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией результатов с использованием наборов производства ООО «Агродиагностика». Москва, 2012 (20 стр.).

Тезисы конференций:

1. Стахеев А.А., Рязанцев Д.Ю. Разработка систем диагностики и идентификации токсигенных грибов рода Fusarium методом полимеразной цепной реакции. XXII Зимняя молодёжная школа ИБХ РАН «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 8-11 февраля 2010 г., Москва, стр. 25.

2. Стахеев А.А., Рязанцев Д.Ю., Гаврилова О.П., Гагкаева Т.Ю., Завриев С.К. Диагностика токсигенных грибов рода Fusarium методом количественной ПЦР. Второй междисциплинарный микологический форум. 14-15 апреля 2010 г., Москва, стр. 209.

3. А.А. Stakheev, D.Y.Ryazantsev, T.Y. Gagkaeva, S.K. Zavriev. Real-time PCR-based assay for the detection of potential mycotoxin-producing Fusarium species. 2nd Workshop of PAS and RAAS on Plant Molecular Biotechnology. Adaptation to Climat Change in the Baltic Sea Region: contributions from Plant and Microbial Biotechnology. July 12-17, 2010, Mikkeli, Finland, p. 72.

4. Стахеев A.A., Рязанцев Д.Ю., Завриев С.К. Разработка диагностических наборов для детекции грибов-продуцентов микотоксинов на основе ПЦР «в реальном времени». VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагносгика-2010». 24-26 ноября 2010 г., Москва, т. II, стр. 32.

5. Стахеев А.А, Рязанцев Д.Ю., Завриев С.К. RAPD-анализ меж- и внутривидового полиморфизма генома токсигенных грибов рода Fusarium. XXIII Международная зимняя молодёжная научная школа ИБХ РАН «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 7-10 февраля 2011 г., Москва, стр. 163.

6. А.А. Stakheev, D.Yu. Ryazantsev, S.K. Zavriev. Effective real-time PCR-based techniques for the detection and identification of toxigenic Fusarium fungi. International workshop «Reduction of mycotoxins in production chains of EU and Russia: modern investigations and practical features». June 9-10,2011, Moscow, Russia, p. 94-96.

7. А.А. Стахеев, С.К. Завриев. Диагностика и идентификация токсин-продуцирующих возбудителей фузариоза зерна методом ПЦР в режиме реального времени. Школа-конференция молодых ученых «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины-2011». 29-30 сентября 2011 г., Москва, стр. 63.

8. А.А. Стахеев, С.К. Завриев. Изучение полиморфизма генома широкого спектра токсигенных грибов рода Fusarium. Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова». 14-17 ноября 2011 г., Москва-Пущино, стр. 62.

9. S. Zavriev, A. Stakheev. DNA technologies for the study of diversity and identification of toxigenic Fusarium fungi. VII International Symposium «EU-Russia: cooperation in biotechnology, agriculture, forestry, fisheries & food». 31 May - 1 June, 2012, Moscow, Russia, p. 41.

10. Стахеев A.A., Хайрулина Д.Р., Завриев С.К. Новые полиморфные маркеры в геноме токсигенных грибов рода Fusarium. XXV Международная зимняя молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», посвященная 30-летию Научно-образовательного центра ИБХ РАН. 1115 февраля 2013 г., Москва, стр. 107.

Подписано в печать: 23.04.2013 Объем: 1,0 п. л. Тираж: 100 экз. Заказ № 91 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стахеев, Александр Александрович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ имени академиков М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН

0420135715Z

СТАХЕЕВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

Разработка специфических маркеров для изучения генетического полиморфизма токсигенных грибов рода Fusarium

Специальность 03.01.03 - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ На соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель Доктор биологических наук, чл.-корр. РАСХН

Завриев Сергей Кириакович

Москва 2013 г.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3

ВВЕДЕНИЕ 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

1. Род Fusarium: общая характеристика 13

1.1. Основные признаки, характерные для представителей рода Fusarium 13

1.2. История исследований рода: основные достижения и проблемы 18

1.3. Характеристика микотоксинов, продуцируемых грибами рода Fusarium 23

2. Краткое описание видов, исследованных в настоящей работе 32

3. Методы, применяемые для диагностики и идентификации возбудителей фузариоза 43

3.1. Морфологический анализ и фитопатологическая экспертиза 43

3.2. Биохимические маркеры и детекция специфических метаболитов 45

3.3. ДНК-маркеры 47

4. ПЦР как диагностический метод 56

4.1. Общие принципы ПЦР 56

4.2. Основные характеристики и способы оптимизации реакции 58

4.3. Основные варианты метода ПЦР и их применение в диагностике и идентификации 64 возбудителей фузариоза

4.4. Особенности метода ПЦР в реальном времени 68 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 74

1. Реактивы, оборудование, штаммы грибов, образцы зерна 74

2. Методы выделения ДНК 78

3. Анализ последовательностей ДНК и белков; подбор праймеров 79

4. Проведение ПЦР 80

5. Детекция результатов ПЦР 81

6. Анализ результатов RAPD и ISSR 82

7. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР; разработка положительных контролен 82 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 84

1. Общая стратегия исследований 84

2. Анализ генетического разнообразия штаммов всероссийских коллекций 85

2.1. Выбор локусов для MLST-анализа и подбор универсальных праймеров 85

2.2. Анализ отсеквенированных последовательностей 88

2.3. RAPD- и ISSR- анализ 93

3. Разработка систем ПЦР-идентификации возбудителей фузариоза 99

3.1. Подбор специфических праймеров и зондов 99

3.2. Экспериментальная проверка специфичности праймеров 106

3.3. Оценка эффективности проведения ПЦР-РВ, наличия ингибиторов в смеси и 112 чувствительности реакции

3.4. Анализ полевых образцов заражённого зерна 113

3.5. Детекция F. culmorum в проростках пшеницы на ранних стадиях заражения. 1 '7

3.6. Сравнение разработанных тест-систем с описанными в литературе 120 ВЫВОДЫ 123 БЛАГОДАРНОСТИ 124 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 125 ПРИЛОЖЕНИЕ 139

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БОВ - боверицин

ВК - внутренний контроль

ДАС - диацетоксисцирпенол

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНК-ШК - ДНК-штрихкодирование

ДОН - дезоксиниваленол

ЗЕН - зеараленон

ИФА - иммуноферментный анализ К+ - положительный контроль К- - отрицательный контроль кДа - килодальтон МОН - монилиформин НЕО - неосоланин НИВ - ниваленол п.о. - пар оснований

ПДК - предельно допустимая концентрация

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная РНК

ТрМТ - трихотеценовые микотоксины

ФУМ - фумонизины

ЭНН - энниатины

ас 11 - ген большой субъединицы АТФ-цитратлиазы

AFLP - amplified fragment length polymorphism (полиморфизм длин фрагментов амплификации) /? - tub - ген бета-тубулина Cq - quantification cycle (пороговый цикл)

CPR1 - ген НАДФН-цитохром Р450 редуктазы CYP51C - ген стерол-14-а-деметилазы

ELISA - Enzyme-linked immuno sorbent assay (твердофазный иммуноферментный анализ) Esynl - ген энниатин-синтетазы

FLASH - Fluorescent Amplification based Specific Hybridization (ПЦР с

флуоресцентной детекцией результатов после окончания амплификации)

GFP - green fluorescent protein (зелёный флуоресцентный белок)

IGS - межгенный спейсер рибосомальной ДНК

ISSR - inter sequence simple repeats (межмикросателлитный анализ)

lys2 - ген аминоадипат редуктазы

MLST - multilocus sequence typing (мультилокусное секвенирование-типирование)

NCBI - National Center for Biotechnology Information PHO - ген фосфатпермеазы

RAPD - random amplification of polymorphic DNA (случайная амплификация полиморфной ДНК)

RPB2 - ген 2 субъединицы РНК-полимеразы II

RFLP - restriction fragment length polymorphism (полиморфизм длин фрагментов рестрикции)

SCAR - sequence characterized amplified region (амплифицированный регион с охарактеризованной последовательностью нуклеотидов) Та - annealing temperature (температура отжига) Tm - melting temperature (температура плавления) TEFla - ген фактора элонгации трансляции 1 альфа

ВВЕДЕНИЕ

Общая характеристика работы. Фузариоз зерна является одним из наиболее опасных заболеваний сельскохозяйственных культур по всему миру, в том числе и в различных природно-географических зонах России (Levitin et al., 2000; Bottalico and Perrone, 2002; Osborn and Stein, 2007). Заражение зерна фузариозом в отдельные годы способно охватывать обширные территории и приобретать характер эпифитотий. Представители рода Fusarium поражают широкий круг сельскохозяйственных растений: ячмень, пшеницу, рожь, овёс, кукурузу, рис и др. По многим аспектам фузариоз представляет собой уникальное заболевание, которое чрезвычайно трудно для изучения. Одна из его характерных особенностей - специфическая этиология - участие в патогенном процессе комплекса различных видов. Следствием заражения являются существенное снижение количества и качества урожая и, как следствие, большой экономический ущерб: так, в США во второй половине 90-х годов XX в суммарные потери, причинённые фузариозом, составили порядка 1.5 млрд. долларов (Nganje et al., 2004). Кроме того, заражение зерна возбудителями фузариоза приводит к накоплению в нём вторичных токсических метаболитов грибов - микотоксинов (фузариотоксинов). Актуальность изучения и выявления токсигенных грибов и продуцируемых ими токсинов признана во всём мире и связана с их чрезвычайно высокой угрозой для здоровья человека и животных (Гагкаева и др., 2011; Nelson et al., 1994; Krnjaja et al., 2011). Примером опасности, которую представляют фузариотоксины, может служить вспышка алиментарно-токсической алейкии (ATA), вызвавшая гибель тысяч людей на Урале и в Поволжье в 40-х годах XX в (Саркисов, 1954). Причиной эпидемии стало потребление в пищу перезимовавшего в поле зерна, зараженного продуцентами фузариотоксинов (Гагкаева и др., 2011). На сегодняшний день подтверждением важности изучения и разработки методов борьбы с токсигенными возбудителями фузариоза злаковых являются принятые Европейским союзом правила,

регулирующие методы отбора проб и анализов для обязательного контроля микотоксинов в продуктах питания и кормах (Commission regulation (ЕС) № 856/2005 of 6th June 2005). Существенное внимание проблеме заражённости зерна и его загрязнению микотоксинами уделяют такие организации, как ФАО, ВОЗ, Всемирная экологическая организация (ЮНЕП) и многие другие. Важно также отметить, что помимо токсичных соединений представители рода Fusarium продуцируют целый ряд метаболитов, имеющих важное хозяйственное и медицинское значение. В частности, это циклоспорин (Rodriguez et al., 2006), применяющийся как иммуносупрессор, или гиббереллины (Troncoso et al., 2010) -гормоны, регулирующие рост и процессы развития растений. Всё вышесказанное подчёркивает актуальность изучения разнообразия, физиологии и генетики представителей рода Fusarium как объектов, имеющих важное научное и прикладное значение, и играющих существенную роль в природных сообществах во всех регионах планеты.

Обеспечение контроля качества продуктов питания и сырья, используемого для их изготовления, а также биологическая безопасность в целом требуют постоянного мониторинга зараженности зерна возбудителями фузариоза и разработки эффективных методов борьбы с заболеванием. Эти методы должны быть основаны на интегративных подходах, учитывающих все аспекты заболевания, однако для их применения в первую очередь необходима точная и достоверная идентификация патогенов. Важно также отметить тот факт, что продукция микотоксинов представителями рода Fusarium носит ярко выраженный видоспецифичный характер (Moss and Thrane, 2004; Glenn, 2007), поэтому для оценки спектра токсинов, накопление которых возможно в анализируемой партии зерна, требуется точная информация о видовом составе патогенов, присутствующих в ней (Moretti, 2009). Для получения такой информации необходимо применение эффективных методов, позволяющих быстро и с высокой специфичностью определять видовую принадлежность штамма или изолята.

Род Fusarium является сложным в таксономическом отношении, а также с точки зрения видовой идентификации его представителей. Виды, относящиеся к нему, отличаются друг от друга по типу спороношения - для них характерны как микро-, так и макроконидии, по наличию или отсутствию половой стадии в цикле развития, а также по типу спаривания (Leslie and Summereil, 2006). Всего за годы исследований рода Fusarium было предложено порядка 10 его таксономических систем, основанных на характеристиках высокоизменчивых морфологических структур. Все эти системы противоречивы и имеют целый ряд недостатков, затрудняющих точную видовую идентификацию исследуемых штаммов (Nelson et al., 1983; Nelson, 1991; Leslie et al., 2001). Диагностика возбудителя непосредственно на зараженном растении зачастую в принципе невозможна, поскольку во многих случаях заболевание протекает бессимптомно (Parry et al., 1995).

В настоящий момент важную роль в изучении разнообразия грибов рода Fusarium, а также в их видоспецифичной идентификации играют молекулярные технологии (Ward et al., 2004; Benali et al., 2011). С этих позиций особенно актуальными представляются подходы, основанные либо на сравнении спектров специфических метаболитов грибов (в частности, токсинов) (Frsivad et al., 2008; Ricci et al., 2009; Zain, 2010), либо на анализе полиморфизма геномных и митохондриальных ДНК. Слабой стороной первого подхода является то, что отсутствие токсина не означает отсутствия их продуцента, поскольку синтез токсина может начаться при изменении условий хранения, под воздействием биотических и абиотических стрессов (Doohan et al., 2003). Наиболее специфичными для детекции возбудителей фузариоза являются методы с использованием ДНК-маркеров, в первую очередь основанные на полимеразной цепной реакции (ПНР), позволяющие идентифицировать вид по характерной последовательности нуклеотидов его ДНК. В последние годы применение молекулярных методов позволило уточнить таксономический статус изолятов грибов рода Fusarium различного происхождения (O'Donnell et al., 2000; Yli-

Mattila et al., 2002; Obanor et al., 2010; Harrow et al., 2010), а также выделить целый ряд новых видов возбудителей фузариоза (Aoki and O'Donnell, 1999; O'Donnell et al., 2000; O'Donnell et al., 2004; Scott and Chakraborty, 2006; Kulik et al., 2011; Yli-Mattila et al., 2011). Кроме того, был разработан целый спектр тест-систем, обеспечивающих быструю и высокочувствительную детекцию патогенов как в чистой культуре, так и в растительном материале (Рязанцев и др., 2008; Turner et al., 1998; Nicholson et al., 2003; Nicholson et al., 2004; Niessen et al., 2004; Llorens et al., 2006; Quarta et al., 2006; Kulik, 2008; Fernändez-Ortuno et al., 2011; Faria et al., 2012).

Тем не менее, на сегодняшний день объём генетических данных для представителей рода Fusarium ограничен: в частности, выявлено лишь небольшое число локусов, для которых разработаны специфические SCAR-маркеры (sequence characterized amplified region; Paran and Michelmore, 1993), дающие возможность с высокой достоверностью определять видовую принадлежность гриба (Niessen and Vogel, 1998; Kristensen et al., 2005). Существенным недостатком практически всех описанных диагностических систем является то, что они не были протестированы на широкой видовой выборке моноспоровых культур различного географического происхождения, поэтому их абсолютная специфичность может быть поставлена под сомнение. Большинство исследований, посвященных классификации и таксономической характеристике возбудителей фузариоза, проводилось с использованием последовательностей 1 -2 генов, чего явно недостаточно, чтобы сделать однозначные выводы по поводу степени родства тех или иных штаммов или видов. Решить эти проблемы может применение метода MLST (multilocus sequence typing, Maiden et al., 1998), в основе которого лежит установление последовательностей нуклеотидов небольших фрагментов (как правило, около 500 нуклеотидов) ряда генов и последующее их сравнение у разных организмов. У этого метода есть ряд существенных преимуществ, в частности, высокая разрешающая способность, а также тот факт, что процедуру секвенирования легче стандартизовать, чем многие

другие методы, применяющиеся для типирования. Это упрощает обмен данными между исследователями, а также дает возможность оценивать новизну получаемых результатов и сравнивать их с полученными ранее.

Для оценки достоверности метода MLST, также как и многих других методов молекулярного типирования, важное значение имеет объём выборки исследуемых видов и штаммов. В этом заключается другая проблема большинства исследований рода Fusarium на данный момент. Выборки видов и штаммов, которые, как правило, подвергаются молекулярно-генетическому анализу, ограничены как по количеству, так и по географическому происхождению. В частности, необходимо отметить, что не было проведено ни одного обширного исследования разнообразия российской коллекции возбудителей фузариоза. Расширение филогенетической информации и изучение таксономии рода Fusarium, а также разработка систем идентификации возбудителей фузариоза требуют выявления новых ДНК-маркеров, специфичных на меж- и внутривидовом уровне (Nalim et al., 2009). Кроме того, изучение структуры генома представителей рода Fusarium необходимо для исследования функциональной активности отдельных генов, в частности ответственных за процессы патогенеза и синтеза токсинов.

Целями настоящей работы были анализ полиморфизма ряда важных в таксономическом и функциональном отношении генов, и выявление новых маркеров для филогенетических исследований, диагностики и идентификации токсигенных грибов рода Fusarium.

Объектами исследования были: культуры 90 штаммов 11 наиболее распространенных и опасных с точки зрения токсигенности возбудителей фузариоза злаковых: Fusarium graminearum, F. culmorum, F. cerealis, F. sporotrichioides, F. langsethiae, F. poae, F. avenaceum, F. tricinctum, F. acuminatum, F. equiseti, F. solani из коллекций Всероссийского института защиты растений (ВИЗР) и Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии

(ВНИИФ) Россельхозакадемии; 26 образцов зерна, предварительно охарактеризованного по степени заражённости возбудителями фузариоза и содержания основных микотоксинов: ДОН и Т-2; 24 образца, представляющих собой искусственно заражённые спорами гриба F. culmorum проростки пшеницы на разных стадиях заражения.

В ходе исследования предстояло решить следующие задачи:

> Провести MLST-анализ полиморфизма ДНК токсигенных грибов рода Fusarium и оценить степень меж- и внутривидовых различий.

> Провести оценку генетического разнообразия исследуемых штаммов возбудителей фузариоза из всероссийских коллекций методами RAPD- и ISSR-анализа.

> Выявить новые SCAR- маркеры и разработать на их основе праймеры и зонды для специфической идентификации токсигенных грибов рода Fusarium, в том числе идентификации групп видов в соответствии со спектрами продуцируемых ими микотоксинов.

> Протестировать специфичность разработанных праймеров и зондов на ДНК культур моноспоровых штаммов грибов и образцах заражённого зерна.

> Разработать соответствующие тест-системы для качественной и количественной (ПЦР-РВ) диагностики и идентификации исследуемых возбудителей фузариоза.

У Подготовить технический регламент для внедрения разработанных диагностических наборов в производство.

Научная новизна работы. В ходе работы впервые проведён MLST-анализ обширной выборки штаммов грибов рода Fusarium всероссийских коллекций, паразитирующих на злаковых культурах. Работа позволила уточнить видовую принадлежность исследованных штаммов, и охарактеризовать степень филогенетического родства между ними. В частности, впервые на территории России были идентифицированы штаммы вида F. torulosum, характеризующегося

высокой изменчивостью, затрудняющей его идентификацию с помощью классических методов. В ходе исследования для некоторых видов впервые определены частичные структуры ряда генов, таких как PHO, b-tub, acl, esynl, CPRl, lys2 и обсуждена возможность их использования в качестве маркерных для идентификации и таксономической характеристики возбудителей фузариоза. Результаты мультилокусного исследования были также сопоставлены с данными, полученными методами RAPD и ISSR. Совокупность полученных результатов выявило однозначную корреляцию между степенью филогенетического родства видов грибов рода Fusarium и спектрами продуцируемых ими микотоксинов, что противоречит некоторым принятым на сегодняшний день положениям систематики рода Fusarium. В частности, показано, что вид F. tricinctum, который принято относить к секции Sporotrichiella, по результатам проведённых исследований составил одну группу с видами F. avenaceum (секция Roseum) и F. acuminatum (секция Gibbosum), для которых характерной является продукция энниатинов и монилиформина.

Сравнение последовательностей нуклеотидов исследованных ге