Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-биологические особенности сибирских штаммов грибов рода Fusarium, распространенных на зерне пшеницы

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Эколого-биологические особенности сибирских штаммов грибов рода Fusarium, распространенных на зерне пшеницы"

На правах рукописи

л

САВИЦКАЯ АННА ГЕННАДЬЕВНА

ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

СИБИРСКИХ ШТАММОВ FUSARIUM, РАСПРОСТРАНЕННЫХ НА ЗЕРНЕ ПШЕНИЦЫ

03.02.08 - экология (биология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 ч ДПР 2013

Тюмень - 2013

005057521

Работа выполнена в Сибирском государственном технологическом университете на кафедре Химической технологии древесины и биотехнологии

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент,

Литовка Юлия Александровна

Официальные оппоненты: Петухова Галина Александровна,

доктор биологических наук, профессор Тюменского государственного университета

Прудникова Светлана Владиславна,

кандидат биологических наук, доцент Сибирского федерального университета

Ведущая организация: Новосибирский государственный аграрный

университет

Защита состоится «26» марта 2013 г. в 10со часов на заседании диссертационного совета Д 220.064.02 в Тюменской государственной сельскохозяйственной академии по адресу:

625003, г. Тюмень, ул. Республики, 7

Тел./факс: (3452) 46-87-77, E-mail: dissTGSHA@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тюменской государственной сельскохозяйственной академии

Автореферат разослан «22» февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат с.-х. наук

Литвиненко Наталья Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Грибы рода Fusarium широко распространены в природе, большинство из них являются факультативными паразитами, ведущими сапрофитный образ жизни, переходящих к различной степени паразитизма при определённых условиях. Действие видов рода Fusarium на растения определяется совокупностью их патогенных свойств, которые значительно варьируют у различных видов и популяций внутри вида в силу высокого уровня природного полиморфизма, обусловленного генетической изменчивостью и наличием различных типов вегетативной совместимости, приводящей к клональ-ной структуре популяций. Наличие внутривидового полиморфизма у фитопато-генных грибов и почвенно-климатические условия региона способствуют отбору экологически пластичных и высоко патогенных популяций, которые занимают доминирующее положение в структуре фитопатогенного комплекса и вытесняют виды рода Fusarium, обладающих случайной или низкой степенью встречаемости и слабо выраженными патогенными свойствами. Изучение внутривидовой изменчивости дает возможность оценить инфекционный фон наиболее стабильных токсигенных видов, прогнозировать возможные эпифиготии фу-зариоза и проводить направленный отбор эффективных фунгицидов.

Фитопатогенные штаммы рода Fusarium представляют практический интерес для современной биотехнологии как продуценты биологически активных веществ - селективных факторов отбора устойчивых сортов в клеточной селекции зерновых и конструирования высокоспецифичных маркеров для их обнаружения, а также служат тест-объектами для создания биологических средств защиты растений. Таким образом, всестороннее исследование этой группы грибов в условиях конкретного почвенно-климатического региона является актуальным как с теоретической, так и практической точки зрения.

Цель исследования: изучение эколого-биологических особенностей сибирских штаммов Fusarium, распространенных на зерне районированных сортов пшеницы.

Задачи исследования:

1. Изучить видовой состав и частоту встречаемости грибов рода Fusarium на семенах пшеницы.

2. Оценить фитопатогенные свойства видов рода Fusarium и гетерогенность их популяций по этому признаку.

3. Изучить внутривидовую изменчивость сибирских штаммов рода Fusarium и их вегетативную совместимость.

4. Охарактеризовать чувствительность видов рода Fusarium к биологическим фунгицидам в лабораторных и полевых условиях.

5. Определить возможность использования фитотоксичных штаммов рода Fusarium для отбора устойчивых сортов в клеточной селекции зерновых и конструирования видоспецифичных маркеров.

Основные защищаемые положения:

1. Вид Fusarium sporotrichioides является наиболее типичным представителем рода Fusarium в зерне пшеницы, районированных для Сибири сортов.

2. Популяционная структура видов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum представляет собой мозаику клонов с различными типами вегетативной совместимости, морфолого-культуральными особенностями, фитопато-генными свойствами и восприимчивости к действию, биологических фунгицидов.

3. Живые культуры или биологические активные вещества отдельных штаммов рода Fusarium могут быть использованы в практических целях, для отбора устойчивых сортов в клеточной селекции зерновых и конструирования видоспецифичных маркеров для обнаружения чувствительных клеток-мишеней.

Научная новизна. Впервые был изучен видовой состав и определена частота встречаемости видов рода Fusarium на зерне пшеницы районированных для Сибири сортов. Исследованы внутривидовые особенности видов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum по совокупности морфолого-культуральных свойств, фитопатогенности, вегетативным реакциям и резистентности к биологическим фунгицидам, исследованы взаимоотношения фи-топатогенных штаммов с растениями и почвенной микрофлорой. Впервые сибирские штаммы рода Fusarium и бактерий Salmonella были использованы в качестве объектов селекции высокоспецифичных олигонуклеотидов для создания видоспецифичных маркеров.

Практическая значимость. Составлен перечень видов грибов рода Fusarium, распространенных на сортах пшеницы, рекомендованных для выращивания в условиях Сибири; выявлен вид, представляющий потенциальную опасность для развития заболеваний в благоприятных условиях. Установлен диапазон чувствительности видов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum к действию метаболитов микроорганизмов-антагонистов. Подобраны концентрации метаболитов штамма Fusarium sporotrichioides для получения устойчивых к ним каллусных культур пшеницы. Подобраны условия для проведения селекции аптамеров к клеткам Fusarium oxysporum и Salmonella для создания видоспецифичных маркеров.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на конференциях различного уровня: Международной конференции «Современные разработки методов диагностики заболеваний человека» (Оттава, Канада, 2011); 4-й Канадской химической конференции-выставке «Химия и здоровье» (Монреаль, Канада, 2011); Международной научной конференции «Фитосанитарная безопасность экосистем» (Новосибирск, 2010); Конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний» (Красноярск, 2011); XIV Международной конференции «Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии и Казахстана» (Красноярск, 2011); Всероссийской конференции «Химико-лесной комплекс - проблемы и решения» (Красноярск, 2009-2010); Международной конференции «13th Tetrahedron Symposium Asia Edition» (Тай-пей, Тайвань, 2012). Научно-практическом семинаре «Молекулярно-генетические методы исследования на современном этапе» (Красноярск, 2011), а также на расширенном семинаре кафедры химической технологии и биотехнологии Сибирского государственного технологического университета (Красноярск, 2012).

Работа выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации для обучения и прохождения научной стажировки в зарубежных высших учебных заведениях и научных центрах на 2010/2011 учебный год по приоритетным направлениям развития науки, технологии и техники в Российской Федерации; при финансовой поддержке РФФИ «Красноярский краевой фонд поддержки научной деятельности».

Публикации. По результатам исследований опубликовано 14 работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, семи глав, заключения, библиографического списка из 148 наименований, из которых 78 - на иностранном языке. Объем работы составляет 184 страницы машинописного текста, включая 82 иллюстрации и 16 таблиц. Приложение состоит из 52 таблиц, 10 рисунков.

Место проведения работы. Основная часть работы выполнена на кафедре химической технологии древесины и биотехнологии Сибирского государственного технологического университета; исследования по созданию аптамеров и оценке вегетативных реакций выполнены на кафедре химии Университета г. Оттава (Канада); эксперименты по клеточной селекции зерновых - на базе Красноярского НИИСХ Россельхозакадемии; селекция аптамеров к бактериям Salmonella - на базе НИИ молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития.

Личный вклад автора. Основная работа по получению материала, обобщению результатов и формулированию выводов выполнена автором лично. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю Ю.А. Литовке и консультанту Т.В. Рязановой; сотрудникам лаборатории оценки селекционного материала Красноярского НИИСХ Н.В. Зобовой, С.Ю. Луговцо-вой, Н.А. Нешумаевой, В.Ю. Ступко, Т.В. Осиповой, А.В. Сидорову; сотрудникам кафедры химии Университета г. Оттава М. Berezovsky, D. Mucharemagic, А. Chechik, сотрудникам НИИ молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития А.С. Замай, О.С. Ко-ловской.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Обоснована актуальность темы диссертации, сформулирована цель и задачи исследования, приведена общая характеристика работы.

1 Обзор литературы

В первой главе диссертации рассмотрены история и современное состояние таксономии грибов рода Fusarium\ классические и современные методы идентификации; представлены особенности генетического аппарата, обзор баз данных сиквенсов Fusarium sp. и перспективные способы определения грибов с помощью специфичных маркеров-аптамеров; изложены эколого-биологические особенности данной группы грибов и генетические аспекты образования вегета-

тивно совместимых (несовместимых) групп; рассмотрен видовой состав, ареал возбудителей фузариоза злаковых культур и вызываемые ими заболевания.

2 Материалы и методы исследований

Объектом исследования служили 117 штаммов грибов рода Fusarium, выделенных из семян пшеницы районированных для Сибири сортов и селекционных линий (всего 18 наименований), а также микроорганизмы-антагонисты: штамм 19/97-М Streptomyces lateritius (ВКПМ Ас-1637, 2002), МГ 99/9 Tricho-derma asperellum и МГ 99/1 Trichoderma harzianum, характеризующиеся высокой антагонистической активностью в отношении грибов рода Fusarium, выделенных из ризосферы и сеянцев хвойных растений в ранее проведенных исследованиях (Громовых Т.И., Литовка Ю.А., Садыкова B.C., 2005). Выделение грибов проводили из семян пшеницы, ризосферы и почвы Мининского опытно-производственного хозяйства согласно общепринятым методам на селективные питательные среды (Нетрусов А.И., 2005; Nelson P.E., 1983). Видовую принадлежность моноспоровых культур определяли по таксономической системе П. Нельсона, корректируя современные изменения таксономии по руководству Лесли (Leslie J.F., 2006). Видовую принадлежность F.sporotrichioides подтверждали молекулярно-генетическим методами.

Фитотоксичность метаболитов оценивали путем их биотестирования на семенах, проростках и вегетирующих растениях (Билай В.И., 1982). Фитопато-генные свойства оценивали по модифицированной методике Челковского-Манки (Гагкаева Т.Ю., 2009). Вегетативные реакции изучали путем сращивания nit мутантов, полученных на средах с различными источниками азота (Leslie J.F., 2006; Дьяков Ю.Т., 1995). Индукцию каллусов незрелых зародышей пшеницы осуществляли на среде введения (2,4Д - 1мг/л, ИУК - 2 мг/л), пролиферацию каллусных культур - на среде Мурасиге-Скуга с различной концентрацией метаболитов грибов рода Fusarium (Шахмеятов И.Ф., 2001). Чувствительность Fusarium к метаболитам микроорганизмов-антагонистов изучали с использованием методов перпендикулярных штрихов, агаровых блочков и лунок (Егоров Н.С., 2004). Гиперпаразитизм и микопаразитизм определяли методами перпендикулярных высевов и культивированием на часовых стеклах (Алимова Ф.К., 2006) Подбор аптамеров к клеткам штамма гриба рода Fusarium и бактериям Salmonella осуществляли на основе методики Cell-SELEX (Berezovsky М., 2008).

Полевые испытания биопрепаратов «латерин» и «триходермин» проводили в селекционных севооборотах Красноярского НИИСХ на территории Емель-яновского района Красноярского края (56 10'с.ш., 92°42'в.д.). Биопрепарат «латерин» получали путем глубинного культивирования штамма 19/97-М Streptomyces lateritius, предпосевную обработку семян осуществляли погружением семян в культуральную жидкость в течение 24 часов. Препарат «триходермин» получали твердофазным культивированием штамма МГ 99/9 Trichoderma asperellum на измельченном растительном субстрате в течение 7 суток; препарат вносили в почву вместе с семенным материалом (Кобылянский В.Д., 1981). Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программ MS Excel, Snedecor, STATISTICA 6.0; результаты считали статистически достоверными при р<0,05.

3 Оценка фитосанитарного состояния зерна сортов пшеницы, рекомендованных для возделывания в условиях Сибири

Исследование микофлоры семян 18 районированных для Сибири сортов и селекционных линий пшеницы показало, что все партии семенного материала были контаминированы смешанной внутрисеменной инфекцией в пределах 2370%, максимальный уровень зараженности отмечен на сорте «Омский корунд» (70%), минимальный - у сортов «Ветлужанка», «Чагытай» и «Геракл» (23-25%)

(рис. 1). В начальный период наблюдения па зерновках активнее развивались представители темноокрашенных грибов из родов Bipolaris, Alternaria, реже, Aspergillus, суммарная доля которых в большинстве случаев превысила 50%, позднее - грибы рода Fusarium, процентное содержание которых составило 13-47% от общего количества микроорга-аптткм»жштт. шк*ттмш»т ОНтЯ НИЗМОВ, У 53% ИЗуЧвННЫХ СОртов инфицированность семян Рисунок 1 - Лабораторная всхожесть и уровень Fusarium составила более 10%, зараженности семян пшеницы исследуемых сортов а у 40% зараженных проростков были отмечены симптомы гниения корневой системы. Максимальная представленность грибов рода Fusarium отмечена на семенах пшеницы сортов «Юната» (47%), «ОмГАУ» (44%) и «Минуса» (40%) (рис. 2).

Со0Í пшеницы

Омский корунд

ЕЭГ Us.1l II UH

OUti'fM

OPenklllluni

Рисунок 2 - Процентное соотношение представителей микрофлоры семян некоторых исследуемых сортов пшеницы

Всего из семенного материала было выделено 117 чистых культур грибов рода Fusarium, идентификация которых позволила их отнести к 8 видам из 5 секций. Представители рода обнаружены на всех изучаемых сортах; максимально представлен в исследуемом материале вид Fusarium sporotrichioides (36,8%), вторым по частоте встречаемости является вид Fusarium oxysporum (17,1%) (табл. 1).

Таблица 1 - Перечень видов рода Fusarium, выделенных из зерна пшеницы

№ п/п Вид Доля вида от количества Fusarium, % Сорта, на которых обнаружены виды

I секция Sporotrichiella

1. Fusarium sporotrichioides Sherb. 36,8 Авиада, Аннет, Ветлужанка, Геракл, Минуса, Новосибирская 15, Омский корунд, Таежная нива, Тулун-ская-12, Юната, К1629, К64-2, К174-1

2. Fusarium poae (Peck) Wollenw 8,6 Минуса, К64-2

II секция Roseum

3. Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc. 10,3 Таежная нива, Тулунская 12

III секция Discolor

4 Fusarium culmorum (Smith) Sacc. 6,0 Ветлужанка, К174-1

5 Fusarium sambucimtm sensu lato 7,7 Минуса, Омская-32

IV секция Elegans

6. Fusarium oxysporum Schlecht. Emend. Snyd. & Hans. 17,1 Ветлужанка, Новосибирская 15, ОмГАУ - 90, Омский корунд, Тулунская 12, Чагытай, К1629

V секция Arthrosporiella

7. Fusarium diversisporum Sherb. 5,1 Юната, Бурятская остистая

8. Fusarium semiteclum Berk. &Rav. 8,6 Мана-2, Омская-32

Поскольку одним из лимитирующих факторов развития грибов является температура, особенно в климатических условиях Сибири, провели оценку радиальной скорости роста при различных температурных режимах (10; 20; 30±1°С). Установлено, что большинство исследуемых культур предпочитают температуру 20-30°С, средняя радиальная скорость внутри вида при этих температурных показателях существенно не различается и находится пределах 2,25,6°С. Снижение температуры до 10±1°С существенно замедляет ростовые процессы, средняя скорость роста составляет 0,7-1,3 мм/сут. Группу быстрорастущих видов составили F.sporotrichioides, F.poae и F.oxysporum.

Для дальнейшей работы были отобраны штаммы F.sporotrichioides и F.oxysporum, как наиболее распространенные виды не только на зерне пшеницы, но и в других экологических нишах, включая почву, ризосферу и ризоплану сеянцев хвойных в лесных питомниках Сибири, согласно данным ранее проведенных нами исследований.

седьмые сутки культивирования; 44% - обладали ростостимулирующим действием либо не оказывали достоверного влияния на проростки на седьмые сутки, однако с увеличением срока культивирования на токсигенной среде фитотокси-ческая активность возрастала и находилась в пределах 65-97% (рис. 5).

Ii

S с

С а

ä 5

110 100

90

120 100

2 группа

8 Ч

I!

и X

¡1 §

7 14 21 28 35 42 В(1 СМЯ К V JI. i Шпф ШШ1Я, (.уткп

Время I,v „.T1,,:ln,,j„.,,,„„. (V пл!

Рисунок 5 - Динамика фитотоксической активности моноспоровых культур штамма Z 3-06 Fusarium sporotrichioides

£ ;

Л

1.? 1

0,5 О

Фитопатогенность живых моноспоровых культур также была неоднородной: 27% снижали длину проростков пшеницы в пределах 68-75%, что достоверно не отличается от показателя природного изолята; 73% штаммов оказало более выраженное действие -уменьшение длины проростков в пределах 84-98%, у 55% культур некротические поражения проростков составили 1,8-2,6 балла, что превысило показатель природного изолята в среднем в 1,8 раз (рис. 6).

Исследование ростовых процессов пшеницы на искусственном инфекционном фоне показало, что штамм 23-06 Р.зрого1г1сЫо1с1е8 оказывает ин-гибирующее действие на показатели грунтовой всхожести и биометрические показатели ве-гетирующих растений: накопление сырой биомассы стебля и корня уменьшилось в среднем на 43% и 38% соответственно; длина надземной и корневой части - на 17% и 43%; площадь ассимиляционной пластины — на 46,5%. Замедление ростовых процессов сказалось на количественных показателях изучаемых групп микроорганизмов, что свидетельствует об ином характернее формирования прикорневой микрофлоры и количественных перестройках микроорганизмов из различных физиологических групп, по сравнению с контролем (рис. 7). Аналогичные исследования по оценке фитопатогенных свойств были проведены со штаммами

Моноспоровые культуры □ среднее мм «некроз, баллы

Рисунок 6 - Фитопатогенные свойства моноспоровых культур штамма Z3-06 Fusarium sporotrichioides

вида Ь". охуярогит, что позволило выявить внутривидовые и внутриштаммовые различия в отношении семян и проростков чувствительных объектов.

ю го зо

я контроль с 23-06

«КОНТРОЛЬ ИВ-06

■ нОЖРО«ь »73-05

Рисунок 7 - Динамика численности микроорганизмов, усваивающих минеральный формы азота (А), аммонифицирующих бактерий (Б), азотфиксирующих бактерий (В) и микромицетов (Г) в ризосфере пшеницы на искуссвтенном инфекционном фоне

Сравнивая фитопатогенные свойства изученных видов, можно заключить, что метаболиты F.sporotrichioides оказывают более выраженное действие на ростовые процессы - 54,5% изученных штаммов ингибируют развитие тест-объектов на 80-100%, тогда как у штаммов F.oxysporym значения фитотоксической активности не превышают 80%; фитопатогенные свойства живых культур F.sporotrichioides также характеризуются более сильным проявлением - снижение длины проростков в среднем на 77,6%, некротические поражения интенсивностью не менее 0,6 балла.

В целом, в ходе проведенного исследования показаны внутривидовые различия по фитопатогенным свойствам у представителей вида F.sporotrichioides и F.oxysporum, которые при моноконидиальном рассеве способны выщеплять линии, отличные от природного изолята по степени фитотоксичности и фитопатогенности. Метаболиты, содержащие смесь биологически активных веществ, и живые культуры грибов оказывают ингибирующее влияние на развитие семян, проростков и вегетирующих растений, а значит, в благоприятных условиях представляют потенциальную опасность для восприимчивых растений.

5 Вегетативные реакции сибирских штаммов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum

Исследование вегетативной совместимости проводили на мутантных штаммах двух фенотипов NitM и nitl видов F.sporotrichioides и F.oxysporum пу-

тем их парного сращивания. Выделение хлорат-устойчивых мутантных секторов осуществляли на минимальной среде с КСЮ3, дальнейшее фенотипирова-ние проводили на средах с различными соединениями азота: NitM мутантные штаммы утилизируют нитрит, но не гипоксантин; nitl - нитрит и гипоксантин; nit3 - гипоксантин, но не нитрит. Из 124 хлорат устойчивых секторов F.oxysporum было получено 48,4% nit мутантов, которые в дальнейшем были разделены по фенотипам: NitM - 18,3%, nitl - 43,4%, nit3 - 38,3%. Из 26 хлорат-устойчивых секторов F.sporotrichioides было получено 19% nit мутантов.

В результате сращивания NitM и nitl мутантов F.oxysporum выявлены следующее распределение вегетативных реакций: 58,5% - вегетативная совместимость (анастомоз); 1,4% - нейтральная реакция; 40,1% - вегетативная несовместимость (37,1%- бордюр, 0,7% - барраж, 2,3% - мелдинг реакция) (рис. 8).

F

І 40

f

і

F. sporotrichioides

I

нейтральная реакция і реакции

Рисунок 8 - Вегетативные реакции при сращивании лг'миутантов Fusarium oxysporum и Fusarium sporotrichioides

Оценка вегетативных реакций nit мутантов F.oxysporum, полученных из природных штаммов с различным ареалом (семена, ризосфера злаковых и хвойных растений), показала, что в 75% случаев при сближении двух колоний формировался бордюр, в остальных случаях - мелдинг реакция. Сращивание NitM и nitl мутантов F.sporotrichioides в 65,5% случаях выявило реакции вегетативной совместимости и 35,5% нейтральные реакции.

Наличие вегетативной несовместимости обеспечивает генетическую изоляцию комплекса адаптивных к паразитированию генов, в связи с чем, большое разнообразие вегетативно несовместимых групп, как правило, присутствует у менее патогенных штаммов.

Проведённые исследования позволили выявить наличие вегетативно несовместимых групп только среди сибирских штаммов F.oxysporum, которые характеризуются менее выраженными фитопатогенными свойствами по сравнению с F.sporotrichioides, среди штаммов которых вегетативно несовместимых групп обнаружено не было.

6 Чувствительность сибирских штаммов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum к биоконтрольным микроорганизмам

Исследование чувствительности штаммов F.sporotrichioides к потенциальным биоконтрольным культурам МГ 99/9 Т. asperellum, МГ 99/1 T.harzianum и 19/97-М S.lateritius выявило их внутривидовую гетерогенность.

терий, грибов, токсинов, включая микотоксины (Aguado С., 2008), о селекции аптамеров в отношении клеток Fusarium данных в литературе не обнаружено.

Селекция аптамеров в течение 10 раундов для F.oxysporum, при различных температурных условиях (4; 25 и 37±1°С), показала, что оптимальная температура отбора - 25±1°С, при этом максимум связывания наблюдается на третьем раунде отбора (рис. 10).

Дальнейший отбор аптамеров заключался в проведении трех раундов непрерывной негативной селекции с клетками грибов отличных родов (Pénicillium, Alternaria), а также с клетками грибов рода Fusarium, отличного вида, и к мертвым клеткам исходного штамма F.oxysporum. В результате проведения негативной селекции был отобран пул после пятого раунда отбора, показавший максимальное связывание с клетками гриба - 59,6%. Для подтверждения достоверности специфичности аптамеров провели их инкубацию с клетками вида F.equiseti, процент связывания аптамеров с которыми не превышал 0,42% и был на уровне связывания клеток с исходной ДНК-библиотекой - 0,41%.

В целом, в результате проведения процедуры селекции олигонуклеотидов к клеткам штамма F. oxysporum получен пул аптамеров, характеризующийся относительно высокой специфичностью к клеткам-мишеням, который был секве-нирован на отдельные клоны для дальнейшего исследования эффективности их связывания с клетками F.oxysporum и возможного влияния на их биологические свойства.

Ряунд селекции

Рисунок 10 - Процент связывания аптамеров с клетками Fusarium oxysporum штамма в зависмимости от температурного режима и раунда селекции

ВЫВОДЫ

1. Грибы рода Fusarium являются типичными представителями микоф-лоры зерна пшеницы районированных для Сибири сортов; частота их встречаемости находится в пределах 14-47%. Качественный состав представлен 8 видами: Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc., Fusarium culmorum (Smith) Sacc., Fusarium diversisporum Sherb., Fusarium oxysporum Schlecht. Emend. Snyd. & Hans., Fusarium poae (Peck) Wollenw, Fusarium sambucinum sensu lato, Fusarium semitectum Berk. &Rav, Fusarium sporotrichioides Sherb.

2. Вид F.sporotrichioides является наиболее типичным представителем микофлоры семян пшеницы и характеризуется выраженными фитопатогенными свойствами. Метаболиты, содержащие смесь биологически активных веществ и живые культуры оказывают достоверное ингибирующее влияние на развитие семян, проростков и вегетирующих растений.

3. Популяции видов F.sporotrichioides и F.oxysporum гетерогенны и характеризуются высокой степенью полиморфизма: при моноконидиальном рас-

севе выщепляются линии, отличные от природного изолята по морфолого-культуральным, фитопатогенным свойствам и восприимчивости к действию биологических фунгицидов. Выявлено наличие вегетативно несовместимых групп среди сибирских штаммов F.oxysporum, что свидетельствует об определенной генетической изолированности их друг от друга.

4. Виды F.sporotrichioides и F.oxysporum обладают различной чувствительностью к метаболитам грибов рода Trichoderma и актиномицета Streptomy-ces lateritius (ВКПМ Ас-1637), в ряде случаев проявляя в их отношении гиперпаразитическую активность. В полевых условиях предпосевная обработка семян Streptomyces lateritius способствует увеличению показателей структуры урожая пшеницы и снижению численности грибов рода Fusarium в прикорневой зоне растений, улучшая, таким образом, фитосанитарное состояние растений.

5. Показана возможность использования различных концентраций метаболитов вида F.sporotrichioides для получения жизнеспособных каллусных культур пшеницы как селективного фактора отбора устойчивых форм растений в искусственных условиях. А также возможность селекции олигонуклеотидов к клеткам F.oxysporum и получения специфичного пула аптамеров для создания видоспецифичного маркера.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Голованова, Т.И. Взаимоотношения пшеницы с микроскопическими грибами ZZ Т.И. Голованова, Ю.А. Литовка, Е.В. Долинская, Е.А. Сич-карук, А.Ф. Валиулина, О.П. Схиладзе, А.Г. Савицкая ZZ Вестник КрасГАУ. 2010. №9. С. 90-96.

2. Литовка, Ю.А. Внутривидовая изменчивость F.oxysporum, распространенного в лесных питомниках Южной Сибири. Материалы микологического междисциплинарного форума с международным участием ZZ Ю.А. Литовка, А.Г. Савицкая, Т.А. Шалаева Z Иммунопатология, аллергология, инфектология. Москва, 2010. № 1. С. 9-10.

3. Литовка, Ю.А. Проблемы применения растительных отходов для получения биологических препаратов зашиты растений ZZ Ю.А. Литовка, А.Г. Савицкая. Т.В. Рязанова, H.A. Нешумаева Z Химия растительного сырья. 2011. №3. С. 167-172.

4. Литовка, Ю.А. Видовой состав и фитотоксичные свойства микро-мицетов рода Fusarium, распространенных в лесных питомниках Средней и южной Сибири ZZ Ю.А. Литовка, Т.В. Рязанова, А.Г. Савицкая Z Хвойные бореальные зоны. 2011. Вып. XXIX. № 3-4. С. 233-237.

5. Литовка, Ю.А. Биологический контроль сибирских штаммов грибов рода Fusarium в лабораторных и полевых условиях ZZ Ю.А. Литовка, А.Г. Савицкая. Т.В. Рязанова, Н.В. Зобова Z Вестник КрасГАУ. 2011. № 11. С. 97-102.

6. Савицкая, А.Г. Оценка устойчивости к биоконтрольным агентам штаммов рода Fusarium, распространенных в агроценозах Средней Сибири ZZ А.Г.

Савицкая. Ю.А. Литовка ZZ Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии, Казахстана и Болгарии: Мат. XIV Междунар. науч,-практ. конф. Красноярск, 2011. Часть 1. С. 298-291.

7. Савицкая, А.Г. Клеточная селекция злаковых на устойчивость к токсинам грибов рода Fusarium, распространенных в агроценозах Сибири ZZ А.Г Савицкая. Н.В. Зобова, Ю.А. Литовка ZZ Фитосанитарная безопасность агроэкоси-стем: Мат. Междунар. науч. конф. Z Новосибирск, 2010. С. 150-152.

8. Литовка, Ю.А Оценка фитопатогенности и устойчивости к биоконтрольным агентам штаммов рода Fusarium, распространенных в агроценозах Средней Сибири ZZ Ю.А. Литовка, А.Г. Савицкая ZZ Фитосанитарная безопасность агроэкосистем: Мат. Междунар. науч. конф. Z Новосибирск, 2010. С. 220223.

9. Савицкая, А.Г. Видовой состав и фитопатогенные свойства сибирских штаммов рода Fusarium ZZ А.Г. Савицкая. Ю.А. Литовка ZI Междунар. интернет-конф. «Растения и микроорганизмы»: Сб.тр. Казань, 2011. С. 162-165.

10. Савицкая, А.Г. Клеточная селекция злаковых на устойчивость к мико-токсинам сибирских штаммов грибов рода Fusarium ZZ А.Г. Савицкая. Ю.А. Литовка, Н.В. Зобова Z Растения и микроорганизмы: Сб.тр. I Междунар. интернет-конф. Казань, 2011. С. 113-115.

11. Савицкая, А.Г. Фитотоксическая активность сибирских штаммов рода Fusarium и перспективы их использования дл клеточной селекции зерновых ZZ А.Г. Савицкая. О.В. Бормина Z Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: Мат. Всеросс. науч.-практ. конф. Красноярск, 2009. Т. 1. С. 292-297.

12. Савицкая, А.Г. Клеточная селекция злаковых на устойчивость к мико-токсинам грибов рода Fusarium, распространенных в агроценозах Сибири ZZ А.Г. Савицкая. Ю.А. Литовка Z Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: Мат. Всеросс. науч.-практ. конф. Красноярск, 2010. Т. 2. С. 48-50.

13. Литовка, Ю.А. Изучение реакций вегетативной совместимости сибирских штаммов Fusarium oxysporum ZZ Ю.А. Литовка, А.Г. Савицкая Z Современная микология в России: Тез. докл. III съезда микологов России. Москва, 2012 С. 292.

14. Савицкая, А.Г. Получение аптамеров в качестве высокочувствительных маркеров для обнаружения клеток Fusarium oxysporum ZZ А.Г. Савицкая. Ю.А. Литовка, Т.В. Рязанова, М.В. Березовский, A.B. Чечик ZZ Современная микология в России: Тез. докл. III съезда микологов России. Москва, 2012. С. 307.

Подписано в печать 16.01.2013 г. Тираж 120 экз. Печать трафаретная. Заказ 059. Отпечатано в печатном цехе «Ризограф» Тюменского Аграрного Академического Союза 625003, г. Тюмень, ул. Республики, 7

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савицкая, Анна Геннадьевна, Красноярск

Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи 04201360692 ^^

Савицкая Анна Геннадьевна

ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СИБИРСКИХ ШТАММОВ ГРИБОВ РОДА FUSARIUM, РАСПРОСТРАНЕННЫХ НА ЗЕРНЕ ПШЕНИЦЫ

03.02.08 - экология (биология)

Диссертация на соискании ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н., доцент Литовка Ю.А.

Красноярск - 2013

Содержание

Введение 6

1 Обзор литературы 10

1.1 Систематическое положение грибов рода Fusarium 10

1.1.1 Краткий обзор таксономических систем рода

Fusarium 10

1.1.2 Молекулярная диагностика грибов рода Fusarium 15

1.1.3 Использование аптамеров в качестве высокоспецифичных детекторов для определения представителей рода

Fusarium 18

1.2 Биология грибов рода Fusarium 20

1.2.1 Морфологические особенности грибов рода Fusarium 20

1.2.2 Вегетативная совместимость и несовместимость грибов рода Fusarium 24

1.2.3 Факторы патогенности грибов рода Fusarium 31

1.3 Видовой состав и ареал возбудителей фузариоза злаковых культур 39

1.3.1 Заболевания злаковых растений, вызываемые фитопа-

тогенными грибами рода Fusarium 39

1.3.2 Заболевания людей, вызываемые фитопатогенными

грибами рода Fusarium 41

1.3.3 Географическое распространение и вредоносность возбудителей фузариоза злаковых культур 42

2 Объекты и методы исследования 45

2.1 Характеристика объектов исследования 45

2.2 Состав и подготовка питательных сред 48

2.3 Методы исследования 50 2.3.1 Выделение и идентификация микромицетов рода

Fusarium 50

2.3.2. Проведение генотипирования штаммов Fusarium с применением видоспецифичных праймеров 52

2.3.3 Оценка фитопатогенных свойств грибов рода Fusarium на семенах, проростках и вегетирующих растениях 54

2.3.4 Изучение реакций вегетативной совместимости (несовместимости) 56

2.3.5 Оценка чувствительности грибов рода Fusarium к биологическим фунгицидам в лабораторных и полевых условиях 58

2.3.6 Клеточная селекция зерновых растений на устойчивость к микоторсинам грибов рода Fusarium 61

2.3.7 Селекция специфичных аптамеров к штамму БЗ смл Fusarium oxysporum, бактериям Salmonella Enteritidis и

Salmonella Typhimurium 62

Глава 3 Оценка фитосанитарного состояния зерна сортов пшеницы, рекомендованных для возделывания в условиях Сибири 68

3.1 Частота встречаемости грибов рода Fusarium в семенном материале 68

3.2 Видовой состав грибов рода Fusarium, распространенных на семенах пшеницы 74 Глава 4 Фитопатогенные свойства сибирских штаммов

Fusarium sporotrichioid.es и Fusarium oxysporum, выделенных из зерна пшеницы 87 4.1 Фитопатогенные свойства сибирских штаммов Fusarium sporotrichioides 87 4.1.1 Фитоксические свойста биологически активных веществ Fusarium sporotrichioides 87

4.1.2 Фитопатогенные свойства штаммов Fusarium sporotrichioides 94

4.1.3 Влияние метаболитов штамма Z 3-06 Fusarium sporotrichioides на вегетирующие растения пшеницы и формирование микробоценоза ризосферы 97

4.1.4 Фитопатогенные свойства моноспоровых культур

штамма Z 3-06 Fusarium sporotrichioides 103

4.2 Фитопатогенные свойства сибирских штаммов

Fusarium oxysporum 108

4.2.1 Фитоксические свойста биологически активных веществ Fusarium oxysporum 108

4.2.2 Фитопатогенные свойства штаммов Fusarium

oxysporum 113

4.2.3 Фитопатогенные свойства моноспоровых культур

штамма S 1.1 Fusarium oxysporum 115

Глава 5 Вегетативные реакции сибирских штаммов

Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum 120

5.1 Характеристика культурально-морфологических свойств моноспоровых культур Fusarium sporotrichioides и

Fusarium oxysporum 120

5.2 Характеристика реакций вегетативной совместимости

Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum 124

Глава 6 Чувствительность сибирских штаммов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum к микроорганизмам -антагонистам 131

6.1 Оценка чувствительности штаммов и моноспоровых культур Fusarium sporotrichioides к биоконтрольным микроорганизмам 131 6.20ценка чувствительности штаммов и моноспоровых 140

145

культур Fusarium oxysporum к биоконтрольным микроорганизмам

6.3 Биологический контроль возбудителей фузариоза в полевых условиях Глава 7 Возможности практического применения фитопа-тогенных штаммов рода Fusarium 149

7.1 Оценка возможности получения растений - регенеран-тов, устойчивых к биологически активным веществам грибов рода Fusarium 149

7.2 Изучение возможности получения аптамеров в качестве высокочувствительных маркеров для обнаружения

Fusarium oxysporum 156

Заключение 164

Выводы 167

Библиографический список 169

Приложение

Введение

Грибы рода Fusarium широко распространены в природе, большинство из них является факультативными паразитами, ведущими сапрофитный образ жизни, но при определённых условиях переходящих к различной степени паразитизма. Многие представители этого рода являются причиной массовых заболеваний растений в агроценозах.

Действие видов рода Fusarium на растения определяется совокупностью их патогенных свойств, которые значительно варьируют у различных видов и популяций внутри вида в силу высоко уровня природного полиморфизма, обусловленного генетической изменчивостью и наличием различных типов вегетативной совместимости, приводящей к клональной структуре популяций. Наличие внутривидового полиморфизма у фитопатогенных грибов и почвенно-климатические условия региона способствуют отбору экологически пластичных и высоко патогенных популяций, которые занимают доминирующее положение в структуре фитопатогенного комплекса и вытесняют виды рода Fusarium, обладающих случайной или низкой степенью встречаемости и слабо выраженными патогенными свойствами.

Изучение внутривидовой изменчивости дает возможность оценить инфекционный фон наиболее стабильных токсигенных видов, прогнозировать возможные эпифитотии фузариоза и проводить направленный отбор наиболее эффективных фунгицидов к токсигенным и агрессивным штаммам.

Грибы рода Fusarium продуцируют широкий спектр биологически активных веществ, из которых наиболее важными считаются микотоксины, являющиеся причиной многих заболеваний растений, способствуют утомлению почвы вследствие накопления высокотоксичных видов, а также способны вызывать отравления у человека и животных, особенностью которых является пролонгированное действие и возможность возникновения заболеваний различной степени тяжести.

Токсигенные штаммы рода Fusarium представляют интерес не только как возбудители заболеваний растений и животных, они могут найти применение в современной биотехнологии в качестве тест-объектов для создания биопрепаратов защиты растений; отбора устойчивых сортов в клеточной селекции зерновых и конструирования высокоспецифичных маркеров для обнаружения фитопатогенов. Таким образом, всестороннее исследование этой группы грибов является актуальным как с теоретической, так и практической точки зрения, особенно в условиях конкретного почвенно-климатического региона.

В Сибири исследование видового состава и ареала грибов рода Fusarium на злаковых растениях было проведено Платоновой Ю.В. (2007), однако автором не рассматривалась непосредственно микофлора семян пшеницы и не оценивались биологические особенности выделенных штаммов.

В связи с чем, целью исследования было изучить эколого-биологические особенности сибирских штаммов грибов рода Fusarium, распространенных на зерне пшеницы районированных сортов.

В задачи исследования входило:

1. Изучить видовой состав и частоту встречаемости грибов рода Fusarium на семенах пшеницы;

2. Оценить фитопатогенные свойства видов рода Fusarium и гетерогенность их популяций по этому признаку;

3. Изучить внутривидовую изменчивость сибирских штаммов рода Fusarium и их вегетативную совместимость;

4. Охарактеризовать чувствительность видов рода Fusarium к биологическим фунгицидам в лабораторных и полевых условиях;

5. Определить возможность использования фитотоксичных штаммов рода Fusarium для отбора устойчивых сортов в клеточной селекции зерновых и конструирования видоспецифичных маркеров.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вид Fusarium sporotrichioides является наиболее типичным представителем рода Fusarium в зерне пшеницы, районированных для Сибири сортов.

2. Популяционная структура видов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum представляет собой мозаику клонов с различными типами вегетативной совместимости, морфолого-культуральными особенностями, фитопатогенными свойствами и восприимчивости к действию биологических фунгицидов.

3. Живые культуры или биологические активные вещества отдельных штаммов рода Fusarium могут быть использованы в практических целях для отбора устойчивых сортов в клеточной селекции зерновых и конструирования видоспецифичных маркеров для обнаружения чувствительных клеток-мишеней.

Научная новизна

Впервые был изучен видовой состав и определена частота встречаемости видов рода Fusarium на зерне пшеницы районированных для Сибири сортов. Исследованы внутривидовые особенности видов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum по совокупности морфолого-культуральных свойств, фитопатогенности, вегетативным реакциям и резистентности к биологическим фунгицидам, исследованы взаимоотношения фитопатогенных штаммов с растениями и почвенной микрофлорой. Впервые сибирские штаммы рода Fusarium и бактерий Salmonella были использованы в качестве объектов селекции высокоспецифичных олигонуклеотидов для создания видоспецифичных маркеров.

Практическая значимость

Составлен перечень видов грибов рода Fusarium, распространенных на сортах пшеницы, рекомендованных для выращивания в условиях Сибири; выявлен вид, представляющий потенциальную опасность для развития заболеваний в благоприятных условиях. Установлен диапазон чувствительности видов Fusa-

rium sporotrichioides и Fusarium oxysporum к действию метаболитов микроорганизмов-антагонистов. Подобраны концентрации метаболитов штамма Fusarium sporotrichioides для получения устойчивых к ним каллусных культур пшеницы. Подобраны условия для проведения селекции аптамеров к клеткам штамма Fusarium oxysporum и Salmonella для создания видоспецифичных маркеров.

Апробация

Результаты исследования были представлены на конференциях различного уровня: Международной конференции «Современные разработки методов диагностики заболеваний человека» (Оттава, Канада, 2011); 4-й Канадской химической конференции-выставке «Химия и здоровье» (Монреаль, Канада, 2011); Международной научной конференции «Фитосанитарная безопасность экосистем» (Новосибирск, 2010); Конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний» (Красноярск, 2011); XIV Международной конференции «Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии и Казахстана» (Красноярск, 2011); Всероссийской конференции «Химико-лесной комплекс - проблемы и решения» (Красноярск, 2009-2010); Международной конференции «13th Tetrahedron Symposium Asia Edition» (Тайпей, Тайвань, 2012). Научно-практическом семинаре «Молекулярно-генетические методы исследования на современном этапе» (Красноярск, 2011), а также на расширенном семинаре кафедры химической технологии и биотехнологии Сибирского государственного технологического университета (Красноярск, 2012).

Работа выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации для обучения и прохождения научной стажировки в зарубежных высших учебных заведениях и научных центрах на 2010/2011 учебный год по приоритетным направлениям развития науки, технологии и техники в Российской Федерации; при финансовой поддержке РФФИ «Красноярский краевой фонд поддержки научной деятельности».

Обзор литературы

1.1 Систематическое положение грибов рода Fusarium

Род Fusarium принадлежит к отделу Ascomycota, класс Ascomycetes, отдел Hypocreales, его телеоморфы по большей части классифицируют в род Gibberella и для небольшого числа представителей в рода Hemanectria и Albonectria [4, 5, 112].

1.1.1 Краткий обзор таксономических систем рода Fusarium

Род Fusarium был впервые описан Г.Ф. Линком (Link) в 1809 году. Начальная классификация рода основывалась на способности видов образовывать макроконидии изогнутой формы. Однако в ходе совершенствования методических подходов, используемых для идентификации рода, признаки были пересмотрены и уточнены. Так, в 1935 году, Г.В. Волленвебер и O.A. Ре-инкинг (Wollenweber & Reinking) публикуют монументальный труд по таксономии Fusarium, включающий в себя материалы 40 лет исследований, который становится базовым стандартом для идентификации грибов этого рода [4, 112]. Все последующие работы по таксономии Fusarium основываются на данной систематике с различными вариациями и дополнениями.

Г.В. Волленвебер и O.A. Реинкинг объединили приблизительно 1000 видов Fusarium и систематизировали их в 16 секций: Arachnites, Arthrosporiella, Discolor, Elegans, Eupionnotes, Gibbosum, Lateritium, Liseola, Macroconia, Martiella, Pseudomicrocera, Roseum, Spicarioides, Sporotrichiella, Submicrocera и Ventricosum, которые включали 65 видов, 55 разновидностей и 22 формы. Так же они объединили 77 синонимов для Fusarium avenaceum (Fr) Sacc. alone и 133 синонима для F. lateritium Nees и их телеоморфы.

При разделении на секции они использовали такие характеристики как наличие или отсутствие макроконидий; форму макроконидий; форму базаль-ных клеток макроконидий; форму микроконидий; наличие или отсутствие хламидоспор; локализацию и взаимное расположение хламидоспор.

Они разделили секции на виды, вариации и формы на основе следующих признаков: цвет стромы; наличие или отсутствие склероциев; число септ в макроконидии; продольные и поперечные размеры макроконидии. Однако характеристики, которые использовали немецкие исследователи для разделения видов, вариаций и форм не являются стабильными и могут быстро изменяться при росте на различных средах и под влиянием условий культивирования. Кроме того, часть использованных ими в работе культур были не моноспоровыми, так же большинство вариаций и форм были кулыуральными мутантами видов Fusarium, а некоторые виды были определены на основе одной-двух культур [4, 5, 112].

Дальнейшее изучение рода Fusarium продолжил В. Герлах (Gerlach), который работал в лаборатории у Г.В. Волленвебера в Берлине. Он занимался изучением и определением новых видов Fusarium совместно с X. Нирен-бергом (Nirenberg). В. Герлах и X. Ниренберг выращивали культуры на восьми различных средах при одинаковых условиях. Выделение новых таксономических единиц основывалось уже на характеристиках моноспоровой культуры [93].

В России первым значительным трудом по систематике рода Fusarium ■ являлась монография А.И. Райло «Грибы рода Fusarium», написанная в 1939 году. А.И. Райло занималась изучением морфологических характеристик, используемых в таксономии. В результате проведенных исследований она предположила, что при разделении видов основной характеристикой является форма апикальной клетки; при разделении подвидов и вариаций - наличие и форма конидий, длина апикальной части клетки, количество септ; при разделении форм - культуральные характеристики, такие как пигмент, наличие склероциев и способ образования спор [5, 51].

Значительный вклад в изучение культуральных различий в таксономии Fusarium внесла В.И. Билай. Изучая неоднородность индивидуальных изоля-тов, и устанавливая степень изменчивости для некоторых видов, она провела анализ основных характеристик, используемых в таксономии Fusarium. Так

же она занималась изучением видовых характеристик моноспоровых изоля-тов в культуре, частично уделяя внимание эффектам температуры, влажности, продолжительности периода роста и состава среды. Ее результаты показали, что степень изменчивости была значительнее, чем предполагалось, в описании большинства видов. На основании этих данных она переработала таксономию вида, в результате род Fusarium включал 31 вид и 29 вариаций. Эта система широко применялась и до сих пор актуальна в России и странах СНГ, но не нашла применения в других странах [3, 4, 5].

Абрахам Йоффе (Joffe) начал свою работу по изучению Fusarium в России в 1940-х годах и позднее иммигрировал в Израиль, где продолжил свою работу. Он исследовал большое число изолятов, выделенных из почвы, поврежденных фузариозом растений и семян. Его система представляла собой пересмотр секций и видов Г.В. Волленвебер и O.A. Реинкинг с добавлением некоторых наименований из таксономии X. Герлаха, и включала в себя 13 секций, 33 вида и 14 вариаций [112].

В 1940-х годах В.К. Снайдер и Г.Н. Хансен (Snyder and Hansen) опубликовали результаты своих исследований по таксономии Fusarium. Их система основывалась преимущественно на морфологии макроконидий, а так же на тщательном изучении отличий и сходства среди видов рода Fusarium. Проведя обширный анализ моноспоровых культур при идентичных условиях культивирования, они получили материал о значительной изменчивости таких признаков как длина и форма конидий, вид и интенсивность пигментации, наличие/отсутствии спородохий и склероциев среди субкультур. На основании полученных данных они пересмотрели классификацию Г.В. Воллен-вебера и O.A. Реинкинга и предложили в секции Elegans оставить только один вид - F.oxysporum [5, 7].

В последующих публикациях (1941-1945 гг.) В.К. Снайдер и Г.Н. Хан- . сен уменьшают общее количество видов до 9, а их классификаци