Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Изучение антипатогенной активности гриба Fusarium sambucinum AF-967

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение антипатогенной активности гриба Fusarium sambucinum AF-967"

На правах рукописи

'1

\

ДОРОФЕЕВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ АНТИ ПАТОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ГРИБА

FUSARIUM SAMBUCINUM AF-967

Специальность 06.01.11 - Защита растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2002

■ Диссертация выполнена в лаборатории патофитофизиологии Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии

Научные руководители:

Артеменко Е. Н.

- кандидат биологических наук

- доктор биологических наук, профессор Шкаликов В. А.

Официальные оппоненты:

- академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор Соколов М. С.

- кандидат биологических наук Павлова В. В.

Ведущая организация: Центральный НИИ агрохимического обслуживания сельского хозяйства (ЦИНАО).

Защита диссертации состоится "_"_2002 г.

в_часов на заседании диссертационного совета К. 120.66.01 при

Всероссийском научно-исследовательском институте фитопатологии по адресу 1430г Московская обл., Одиниоас^'й р-он, Б. В язем ы.

Сдисс • ; ■ • • '"н>~л отеке института

Авт - . 2002 г.

Ученый сек^ ;^,.. Диссертационного совета кандидат биологических наук

Яковлева И. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Биологические методы борьбы с рядом опасных вредителей и болезней растений достаточно высокоэффективны, относительно безвредны для человека, сельскохозяйственных животных и окружающей среды. Их основу составляет использование в качестве биопрепаратов живых организмов или продуктов их жизнедеятельности. Значительное место в ряду биологических средств защиты растений принадлежит микроскопическим грибам. Наиболее широко применяются препараты на основе спор грибов-антагонистов, хотя при неблагоприятных для развития погодных условиях их активность снижается. Поэтому для повышения эффективности обработок предпочтительнее использовать активные метаболиты грибов, так как их биологическая активность в меньшей степени зависит от указанных обстоятельств, что делает их более удобными для применения.

В 1995 году на кафедре фитопатологии МСХА ирн участии сотрудников кафедры микробиологии был выделен штамм Fusarium sambuciimm, получивший название AF-967 (Афанди, 1995). Этот гриб проявлял антагонистическую активность в отношении некоторых возбудителей корневых гнилей (Зубейру, 1997). Эффективность применения спор гриба-антагониста против ряда почвенных патогенов была показана в полевых и лабораторных исследованиях на пшенице, ячмене, люпине, огурце, кормовой свекле и других культурах (Шкаликов, 1995; Зубейру, 1997; Моисеева, 1999; Хашем, 2000). Однако природа антипатогенной активности этого биоагента оставалась невыясненной: ограничивалось ли его действие конкуренцией за источники питания и местообитание в ризосфере и ризоплане растений или он продуцировал вещества, подавляющие рост патогенов и/или индуцирующие защитные реакции растений. Решение этих вопросов может помочь в отборе активных изолятов Fusarium sambucinum AF-967 и предложить более эффективный способ нх применения.

Цель и задачи исследований. Цель исследований состояла ia выделении и изучении антипатогенной активности фракций метаболитов гриба Fusarium sambucinum AF-967 по отношению к возбудителю фузариозной корневой гнили Fusarium culmorum, а также в установлении возможного характера их действия на патоген.

В рамках общей проблемы решали следующие задачи:

1. Изучение трофических потребностей F. sambucinum AF-967, включающее определение отггимальных источников азота и углерода к их соотношение.

2. Разработка питательных сред для наработки биомассы и спор F. sambucinum AF-967 в глубинной культуре, центральная

НАУЧНАЯ I... .Л;;' ¡ОТГЧД Моек, сельск.мо ■. .уожл»'" км. К. А. л

И HB. №..д.

3. Изучение возможности сушки и длительного хранения конидий F, sambucinum AF-967.

4. Выбор метода экстракции антнпатогенных метаболитов из мицелия F. sambucinum AF-967.

5. Оценка ант и патогенной активности фракций метаболитов F. sambucinum AF-967 на различных стадиях его онтогенеза - от прорастания спор до лгаиса мицелия.

6. Изучение возможного механизма воздействия активной фракции метаболитов F, sambucinum AF-967 на патоген н клетки растения-хозяина в условиях суспензионной культуры.

Научная новизна. Впервые установлено, что непатогенный штамм F. sambucinum AF-967 продуцирует вещества, не обладающие антигрибной активностью, но индуцирующие защитные реакции проростков пшеницы по отношению к F. culmorum. Исследовано их действие in vitro на F. culmorum и другие патогены, входящие в комплекс возбудителей корневых гнилей. Установлено их сенсибилизирующее действие на клетки различных по устойчивости к патогену сортов пшеницы в суспензионной культуре.

Практическая ценность работы. Разработаны условия глубинного культивирования F. sambucinum AF-967 я метод наиболее полного извлечения из биомассы активных метаболитов, определены их эффективные концентрации. Оптимизированы условия хранения конидий F. sambucinum AF-967 в течение длительного времени без потери жизнеспособности, что расширяет возможности заблаговременной наработки и применения спор гриба. Оценена перспективность применения метаболитов гриба для повышения эффективности действия биопрепаратов на основе F. sambucinum AF-967.

Апробация, Основные положения диссертации были доложены на конференции, посвященной 40-летию ВНИИФ в 1999 г., а также на конференции молодых ученых в ТСХА в 2000 г.

Публикаиии. По материалам диссертационной работы опубликовано 4 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 глав), выводов и списка литературы.

Материал изложен на 107 стр. машинописного текста, содержит 25 таблиц и 3 рисунка. Список литературы включает 193 работы, из которых 99 на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Обзор литерату ры. Рассмотрены вопросы распространения и вредоносностн грибов рода Fusarium, возбудителей корневых гнилей и фузариоза колоса. Освещены вопросы биологической защиты растений от

фузариозной инфекции, в том числе и применения непатогенных штаммов фузариев, а также обсуждены возможные механизмы их действия.

Глава 2. Объект и методы исследования. Исследования проводили в 1999 - 2001 гг. в лаборатории патофитофизиологии Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии.

Объект исследования - непатогенный гриб ршагшт эатЪистит, штамм АР-967. На агаризованных средах гриб образовывал слизистые колонии оранжевого цвета, без воздушного мицелия. Культуру гриба поддерживали при +24°С на агаризованной среде Чапека.

Глубинное культивирование осуществляли в колбах вместимостью 750 мл, содержащих 100мл среды, на ротационной качалке при 220 об/мин и +26°С. Инокулюм выращивали на среде Райстрика в течение 24 ч и вносили в различные среды в количестве 7-10% от объема среды. Через 2, 4 и 8 суток мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрацией через капроновый фильтр и затем сушили до постоянного веса при -Н05°С. Концентрацию конидий в фильтрате культуральной жидкости (ФКЖ) определяли в камере Горяева.

Прорастаемость спор Р. ватЬистит АР-967 оценивали после 8 ч инкубации при +26°С во влажной камере в термостате при подсчете не менее 500 конидий,

Антипатогенную активность продуктов жизнедеятельности гриба Ршапит ватЬисшит АР-967 исследовали в вегетационных опытах на ннтактных проростках яровой пшеницы сорта Люба с использованием искусственного инфекционного фона Р. си1тогцш (МО4 спор/мл, вносили по 3 мл/вазон объемом 25 мл). В качестве эталона использовали конидии гриба АР-967 в концентрации НО7 спор/мл. Через 10 суток после посева учитывали пораженность растений корневыми гнилями, степень развития болезни, биологическую эффективность обработок, длину проростков и корней и их сухую массу. Для математической обработки результатов использовали программный комплекс статистической обработки экспериментальных данных "ЭТНАХ".

Были исследованы экссудаты прорастающих конидий, нативные ФКЖ и различные экстракты из мицелия и конидий.

Экссудаты получали, проращивая конидии в жидкой среде в концентрации 1 млн/мл на ротационной качалке при +26°С в период от 0 до 7 часов. Экссудаты и ФКЖ освобождали от конидий последовательно центрифугированием, фильтрацией через фильтр вР/А и через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

Для экстракции внутриклеточных метаболитов мицелий в растворителе разрушали в гомогенизаторе (Бот! отш-пихег), затем в ультразвуковом дезинтеграторе, после чего встряхивали на ротационном

шейкере. Экстракт очищали от остатков мицелия фильтрацией через стеклянный пористый фильтр №1 с вложенным фильтром GF/A. Органические растворители удаляли из экстракта, используя роторный вакуумный испаритель. По этой схеме были получены метанольные, этанольные и метанольно-хлороформные экстракты,

Высокомолекулярные метаболиты экстрагировали на холоду IM KCl в 0,05М фосфатном буфере (pH 6,0). Экстракт отделяли от остатков мицелия и насыщали (NH4)2S04. Выпавший белковый осадок отделяли центрифугированием, обессоливали гель-фильтрацией на сефадексе Г-50 (грубый) и лнофильно высушивали.

В каждом опыте исходная концентрация экстрактов приравнивалась к 0,1 г сухого мнцелия/мл и испытывалась в 4-6 десятичных разведениях.

Активность экстрактов in vitro оценивали по их влиянию на прорастаемость конидий патогенов, скорость роста колоний на агаризованной среде Чапека, а также методом диффузии в агар. В качестве тест-объектов использовали Bipolaris sorokiniana, Alternaria altemata, Fusarium cuimorum и другие патогенные фузарии.

Суспензионную культуру клеток пшеницы выращивали па среде Мурасиге-Скуга па ротационной качалке при 220 об/мин и +26°С в темноте. Концентрацию клеток определяли при помощи камеры Фукса-Розенталя. Степень развития патогена в инфицированной культуре клеток оценивали по содержанию эргостерола, который определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Автор выражает глубокую признательность и благодарит за доверие, оказанное ему научными руководителями к.б.н. Артеменко Е, Н. н д.б.н., профессором Шкаликовым В. А.; за постоянную помощь и поддержку -к.б.н. Девяткину Г. А.; за ценные советы при написании диссертации - к,б.н. Макеева А. М. и к.б.н. Щербакову Л. А.; за проявленное терпение и понимание - Дубкову Е. А., а также всех сотрудников лаборатории патофитофнздалопш ВНИИФ за поддержку и ненссякающий интерес к работе во время проведения исследований и при ее оформлении.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 3. Трофические потребности гриба Fusarium sambucinum AF-967.

Известно, что вегетативный рост и спороношенне грибов могут эффективно регулироваться источниками питания. На первом этапе исследований необходимо было выяснить потребности Fusarium sambucinum AF-967 в основных элементах питания и разработать оптимальную среду для глубинного культивирования. Вначале провели отбор минеральной основы -базальной среды, на фоне которой можно было бы изучать влияние

различных веществ на рост и развитие гриба. С этой целью были оценены питательные среды Чапека, Миро, Парка, Бклай и Райстрика, которые характеризуются наиболее контрастным качественным и количественным составом источников углерода, азота и минеральных компонентов. При культивировавии гриба на этих средах наиболее интенсивный вегетативный рост был отмечен на среде Райстрика на 2-е сутки и максимальная концентрация спор на 8-е сутки. Наиболее ранняя н интенсивная споруляция была отмечена на среде Чапека (на 2-е - 4-е сутки культивирования), по накоплению биомассы среда Чапека на этом этапе уступала лишь среде Райстрика, Учитывая эти показатели, для оптимизации уровня спороношения и выхода биомассы в качестве основы была выбрана среда Чапека, а для получения инокулюма во всех опытах использовали среду Райстрика.

В любой питательной среде наиболее значительную роль играют источники углерода и азота. Для выявления их влияния на рост и спороношение Р. эатЬистит АР-967 мы проводили последовательную замену сахарозы и №N03 в среде Чапека на эквимолярные количества других веществ. В качестве источников углерода были использованы вещества, относящиеся к различным химическим группам: моносахариды, дисахариды, трисахариды, полисахариды н полиспирты. Установили, что максимальный вегетативный рост гриба обеспечивала сахароза, в то время как фруктоза была наиболее эффективной для спороношения. Оптимальный срок культивирования в обоих случаях составил 4 суток. Наибольшую сбалансированность по накоплению мицелия и спор обеспечивали мальтоза, рафиноза и маннит.

Изучение влияния источников азота на рост и спороношение Р. эатЬистит АР-967 проводили путем замены ТЧаЫОз на другие формы неорганического или органического азота. Кроме того, была проведена опенка суммарного влияния органического и минерального азота на рост и спороношение гриба. Как показали результаты опытов, для вегетативного роста гриба предпочтительнее органические формы азота в виде дрожжевого автолизата, пептона или соевой муки, тогда как значительное повышение споруляции отмечено лишь в варианте с соевой мукой. Комбинированный источник азота (ЫаК03 + пептон) также стимулировал рост мицелия и споруляцию, но уступал по этим показателям соевой муке.

Дальнейшую оптимизацию сред культивирования гриба проводили на фоне соевой муки, обеспечивающей как высокий уровень спороношения, так и активный рост мицелия. В качестве источников углерода, кроме мальтозы, рафинозы и маннита, были использованы пивное сусло и меласса (табл. 1).

Таблица 1.

Динамика роста и спороношення Fusarium sambucinum AF-967 на средах, _ содержащих перспективные источники углерода*_

Источник углерода Биомасса**, г/л Конидии, млрд, шг/л

сутки культивирования

2-е 4-е 8-е 2-е 4-е 8-е

Фруктоза 2,426 3,108 4,158 10,3 15,5 19,4

Мальтоза 2,412 3,573 4,098 15,9 23,4 30,8

Манннт 1,803 2,384 2,321 12,4 20,3 18,3

Пивное сусло 3,191 4,083 4,294 21,9 32,5 33,5

Меласса 8,341 7,099 0,824 20,6 21,1 24,0

НСР05 0,886 6,1

*На фоне соевой муки (источник азота);

** В биомассе значительная примесь остатков соевой муки.

Анализ полученных результатов показал, что пивное сусло а меласса наиболее благоприятны для спороношення гриба и значительно превосходят по данному параметру чистые сахара и маннит. Максимальное количество биомассы накапливалось на среде с мелассой на 2-е - 4-е сутки культивирования, а через 8 суток основная масса мицелия лизировала, В других вариантах гриб находился в стадии активного роста до конца эксперимента.

Однако в этих опытах результаты по динамике роста гриба весьма условны, так как в биомассе содержалась значительная примесь соевой муки, которую очень сложно отделить. Поэтому для накопления мицелия Р. эатЬистшп АР-967 в качестве источников азота и углерода целесообразнее использовать соответственно пептон и мелассу. Оптимизацию их количественного соотношения проводили по схеме, в которой максимальные

б

концентрации компонентов соответствовали концентрации углерода и азота в среде Чапека. Учет количества биомассы и интенсивности спороношения был проведен в 2-х суточной культуре. Оптимальными для роста мицелия оказались: максимальная концентрация мелассы (60 г/л) и минимальная пептона (0,8 г/л). Максимальную споруляцию гриба обеспечивали средняя концентрация мелассы (40 г/л) и минимальная пептона (0,8 г/л) (табл. 2).

Таблица 2,

Влияние соотношения концентраций источников азота и углерода на рост и _спороношение Ршапиго ьатЬистит АР-967_

Концентрация пептона, г/л Концентрация мелассы, г/л

60 40 20

Биомасса, г/л

2,3 7,01 5,34 3,42

1,5 6,09 4,79 2,81

0,8 7,74 3,93 2,25

НСР05 1,09

Конидии, млрд. шт/л

2,3 9,2 9,9 7,3

1,5 10,0 10,8 5,5

0,8 7,3 19,0 13,3

НСР05 2,8

Таким образом, проведенные исследования трофических потребностей фиба Р. ватЬисишт АР-967 позволили разработать достаточно эффективные и сбалансированные питательные среды для наработки мицелнальной массы и спор. Среда, отобранная для наработки биомассы Р. ЕатЬшлпит АР-967, содержала мелассу (60 г/л), пептон (0,8 г/л) и минеральную основу среды Чапека. Оптимальный срок культивирования гриба составил 2-е суток. Среда

для массового получения конидий содержала пивное сусло (150 мл/л), соевую муку (4,7 г/л) и минеральную основу среды Чапека. В этом случае оптимальный срок культивирования составлял 4 суток.

Поскольку в лабораторных условиях при пересевах нередки случаи снижения или утраты каких-либо биологических свойств грибных культур, мы изучили возможности длительного сохранения спор гриба F. sambucinum AF-967 на инертных субстратах. Образцы конидий, полученные с двух подобранных сред, высушивали конвективным способом при комнатной температуре на целите С-22 и перлите и закладывали на хранение при +4°С. Результаты предварительных опытов показали, что после 12 месяцев хранения прорасгаемость спор, полученных на мелассо-пептонной среде, составляла 80-90%, а на среде, содержащей сусло и соевую муку, была существенно ниже (45-60%). Причем споры сохраняли более высокую жизнеспособность на перлите, чем на целнте.

Для более детального исследования жизнеспособности спор при длительном хранении мы использовали конидии гриба F. sambucinum AF-967, полученные с мелассо-пептонной среды, и перлит в качестве сорбента. Результаты показали, что при хранении конидий на перлите в течение 8 месяцев нх прорасгаемость изменялась незначительно, что открывает возможности предварительной наработки спорового материала и его хранения в течение длительного времени без потери жизнеспособности (рис.

С 0,0 -I-1----—1-----П-------:.........1............1

0 1 2 3 4 5 6 8 Срок хранения, мес.

100,0

о

g 60,0

0

1 40-° Я 20,0

о

Q.

Рис. 1. Влияние сроков хранения конидий гриба Fusarium sambucinum AF-967 на перлите на их жизнеспособность

Глава 4. Изучение а нти патоген ной активности метаболитов Fusarium sambucinum AF-967. В диссертации представлены данные о влиянии натнвных ФОС, экссудатов прорастающих спор н различных экстрактов из конидий и мицелия Fusarium sambucmum AF-967 на развитие проростков яровой пшеницы и пораженность их корневыми гнилями (возбудитель Fusarium culmorum). Все материалы испытывали в нескольких концентрациях, а результаты представлены в 14 таблицах. Для удобства сравнения атгипатогенной активности исследуемых фракций метаболитов гриба в автореферате приведены только значения минимальных действующих концентраций и их биологической эффективности (табл. 3).

В первую очередь была проведена оценка антипатогенной активности метанольного экстракта мицелия Fusarium sambucmum AF-967, в который могли входить как высоко-, так и низкомолекулярные метаболиты. Результаты показали, что метанольные экстракты как свежего, так и лиофильно высушенного двухсуточного мицелия F. sambucinum AF-967 проявляли хорошо выраженный защитный эффект, снижая проявления заболевания практически на 70%.

Вслед за фазой прорастания спор начинается период активного роста (первичного метаболизма) гриба, который характеризуется образованием метаболитов de novo, в то время как выделение экзометаболитов обычно приурочено к стадии вторичного метаболизма, наступающей после окончания роста. Поскольку пик роста F. sambucinum AF-967 приходился на вторые сутки, экстракцию его метаболитов проводили из двухсуточного мицелия (рис. 2). Учитывая большое разнообразие грибных метаболитов, различающихся по химической природе и молекулярной массе, для их выделения из мицелия не пользован и ряд экстрагентов, каждый из которых извлекал определенную группу веществ, близких по полярности, но неоднородных по составу (табл. 3).

В литературе имеются сведения об участии высокомолекулярных соединений микроорганизмов во взаимоотношениях с растениями (Морозова и др, 1990; Duijiff et al., 1994; Феофилова и др., 1996; Nihei et al., 1998). Известно, что белки, пептиды, гликопротеины и полисахариды, выделенные из грибов или других микроорганизмов, могут как индуцировать защитные реакции растения, так и служить фактором патогенеза. Поэтому на следующем этапе исследований было проведено извлечение высокомолекулярных метаболитов из двухсуточного мицелия гриба и дана оценка их действия на пораженность пшеницы корневыми гнилями. Анализ полученных данных показал, что высокомолекулярная фракция мицелия Fusarium sambucinum AF-967 обнаружила более сильный защитный эффект по сравненшо с метаболитами, экстрагируемыми метанолом, проявляя биологическую эффективность на уровне -90% (табл. 3).

Таблица 3.

Биологическая эффективность фракций метаболитов Fusarium sambucinum AF-967

Фаза развития гриба Вариант Минимальные действующие концентрации С,%

к и о О н И & ° э С £ я 2 я а Я 5 о, о с М Эталон (живые споры АР-967) НО5 спор/мл 48,8

Метанольный экстракт непроросших спор 1-Ю5 спор/мл 45,1

Метанольный экстракт проросших спор МО6 спор/мл 35,0

Эксудаты прорастающих спор М0Й спор/мл 59,3

Максимальный рост мицелия (2-х суточная культура) Метанольный экстракт мицелия 0,001 г/мл* 69,9

Высоко молекуляр ны е метаболиты мицелия 0,001 г/мл 89,7

Метанольно-хлороформный экстракт мицелия 0,1 г/мл 0

Этанол ьный экстракт мицелия 0,1 г/мл 59,0

Фильтрат культуральной жидкости Нативный ФКЖ 17,6

Лизис мицелия 9 суточный фильтрат культуральной жидкости Нативный ФКЖ 60,0

"концентрация рассчитана на 1 г сухого мицелия.

Лиофильное высушивание полученного экстракта не влияло на эффективность действия метаболитов, что позволяло нарабатывать и хранить

большое количество экстракта для проведения экспериментальной работы и, соответственно, существенно снижать период подготовительных работ.

Метанольно-хлороформный экстракт не содержал метаболитов гриба, обладающих а нти патоген ной активностью, так как в вегетационных опытах распространение и развитие корневых гнилей (возб, Fusarium culmorum) в вариантах с предпосевной обработкой семян данными метаболитами оставались на уровне инфицированного контроля.

По имеющимся в литературе данным известно, что определенные метаболиты фитопатогенных грибов могут содержать вещества, индуцирующие устойчивость растений к болезням. В частности, из мицелия Phytophthora infestans и Fusarium culmorum был получен липоглнкопротеидный комплекс, являющийся неспецифическим индуктором защитных реакций растений (Метлицкий и др., 1978; Озереиковская и др., 1986; Морозова Г. Р. и др., 1990). Выделенный по описанному методу этанольиый экстракт мицелия AF-967 содержал вещества, которые проявляли антипатогенное действие, однако их активность была значительно ниже, чем у фракции высокомолекулярных метаболитов (табл. 3).

Как упоминалось ранее, максимум роста гриба приходился на 2-е сутки, а интенсивность лизиса мицелия в период с 4 по 14 сутки находилась в прямой зависимости от времени культивировання (рис. 2).

S

ч

г §

£ и

[4 у 12 -10 8 б 4 2

4 8 II

время культивирования, сут

14

-Г 100

- 90

- 80 |

-- 70 С V

- 60 ä 5

-- 50 ьГ

-- 40 ¡с з

- 30 о X о

-- 20 о с и

-- 10

Рис. 2. Динамика накопления мицелия и спор Fusarium sambucinum AF-967 на мснассо-пепшнноП среде

Ki Сух, масса мицелия

•Сиорокошеиис

Дня проведения вегетационных опытов были отобраны ФКЖ двух сроков: 2-е сутки - фаза активного роста мицелия - и 9-е сутки - стадия лизиса 50% мицелия и накопления вторичных метаболитов. Отсутствие антипатогенной активности у фильтрата культуральной жидкости на 2-е сутки роста гриба AF-967 говорит о том, что на стадии интенсивного роста биомассы гриб накапливал в мицелии активные метаболиты, практически не выделяя их в культуральную среду (табл. 3). Кроме того, в культуральной жидкости на этой стадии развития гриба могли оставаться элементы питания, представляющие собой хороший субстрат для роста и развития патогенов.

В девятисуточной культуре питательная среда утилизировалась без остатка. В результате интенсивного лизиса происходило разрушение клеточных оболочек с последующим выходом в культуральную жидкость различных метаболитов, обладающих антипатогенной активностью. Биологическая эффективность ФКЖ составила 60 %, что несколько выше действия живых спор гриба (45%), но ниже эффективности высокомолекулярных метаболитов.

Анализируя результаты исследований, можно отметить, что гриб F. sambucinum AF-967 на всех стадиях своего развития содержал метаболиты, проявляющие антипатогенное действие по отношению к возбудителю корневых гнилей. Все они не оказывали существенного влияния на развитие проростков пшеницы. Наиболее высокую антипатогенную активность проявили высокомолекулярные метаболиты мицелия, которые снижали распространение корневой гнили на 85-95%, в зависимости от метода выделения и хранения фракции. Метанольный экстракт мицелия несколько уступал фракции высокомолекулярных метаболитов по эффективности (70%). Еще менее активными были сшгртовый экстракт мицелия, экссудаты прорастающих спор и девятисуточный фильтрат культуральной жидкости, биологическая эффективность которых достигала 60%, Метанольный экстракт непроросших спор действовал на уровне эталона, а метанольно-хлороформный экстракт мицелия и двухсуточный фильтрат культуральной жидкости антипатогенной активности не проявляли. Совершенно очевидно, что из всех исследованных фракций наиболее достойной внимания с точки зрения изучения природы защитного действия F. sambucinum AF-967 была высокомолекулярная фракция мицелия, которой и были посвящены дальнейшие исследования.

Глава 5. Исследования высокомолекулярной фракции метаболитов мицелия Fusarium sambucinum AF-967. Значительная антипатогенная активность высокомолекулярной фракции метаболитов мицелия свидетельствовала о том, что механизм защитного действия непатогенного гриба F. sambucinum AF-967 не ограничивается конкурентными взаимоотношениями с патогеном, а включает также

биосинтез веществ, снижающих проявление корневых гнилей. Таким эффектом могли обладать антибиотические вещества, поскольку среди известных антигрибных антибиотиков есть высокомолекулярные вещества, в том числе и пептидной природы (БилаЙ, 1961; Шемякин и др., 1961; Кожыбски и др., 1969; Nihei et al„ 1998). В связи с этим необходимо было выяснить, обладает ли данная фракция метаболитов гриба антибиотическими свойствами. Для решения этой задачи в качестве тест-объектов использовали не только Fusarium culmorum, применявшийся в вегетационных опытах, но и Bipolaris sorokiniana, Alternaría alternata, а также различные виды рода Fusarium: F. sambucinum (патогенный), F. graminearum, F. oxysporum, F. gibbosum, F, poae, F. avenaccum и F. sporotrichiella. Эти патогены входят в комплекс возбудителей корневых гнилей пшеницы. Проверка активности высокомолекулярной фракции мицелия F. sambucinum AF-967 методом диффузии в агар показала, что ни одна из использованных концентраций метаболитов не вызывала образования зоны подавления иди золы задержки роста патогенов в газоне. Кроме того, прорастаемость конидий патогенов, суспендированных в растворах этих метаболитов, не снижалась относительно контроля, что свидетельствовало об отсутствии антибиотической активности данной фракции.

Однако, при сравнении скорости роста колоний патогенов на агаризованной среде Чапека выяснилось, что эти же метаболиты способны задерживать линейный рост патогенов (табл. 4).

Колонии патогенов на среде Чапека с высокомолекулярными метаболитами были значительно плотнее контрольных, края их более четкими и слегка приподнятыми. При микроскопическом обследовании отмечено некоторое уменьшение растяжения гиф и усиление их ветвления. Возможно, что общая масса мицелия не снижалась под действием метаболитов. Таким образом, несмотря на обнаруженную in vitro рост-ингибируюшую активность фракции высокомолекулярных метаболитов, можно сделать предположение, что её эффективность in vivo не связана с действием непосредственно на патоген. Это предположение подтверждает и разница в минимальных концентрациях фракции, действующих на F. culmorum in vitro (110 г/мл) и in vivo (M0"J г/мл), т.е. эффективные в вегетационных опытах концентрации метаболитов не ограничивали рост патогена in vitro. Следовательно, высокая эффективность этих метаболитов в вегетационных опытах могла быть связана с их опосредованным действием на патоген через растение, т.е. с индукцией защитных реакций растений.

Таблица 4.

Оценка влияния высокомолекулярной фракции мицелия Р. затЬистшп _АР-967 на линейный рост патогенов_

Патоген Угнетение (-)роста патогена (в % от контроля) при концентрации метаболитов, эквивалентной

0,01 г сухого мицелия/мл 0,001 г сухого мицелия/мл

Bipolaris sorokiniana -57,6 -19,2

Alternaría alterna ta -33,4 0

Fusarium culmonim -28,3 0

F. sambucinum -30,3 +7Д

F. gramineamm -8,8 -11,5

F. oxysporum +12,4 +3,0

F. gíbbosum -72,8 42

F. poae -24,5 -6,3

F. avenaceum -55,6 -1,4

F. sporotrichiella -11,8 +17,9

{+) - стимуляция роста патогена

Для проверки данного предположения были проведены опыты на суспензионной культуре клеток пшеницы двух сортов, различающихся по устойчивости к фузариозам. Были смоделированы условия вегетационного опыта с предварительной обработкой клеток в течение суток раствором высокомолекулярной фракции мицелия АР-967, соответствующим 0,001 г сухой массы мицелия/мл. Затем клетки переносили на свежую питательную среду, не содержащую метаболитов, и культивировали в течение 2 и 5 суток

на инфекционном фоне. Во втором варианте эксперимента метаболиты вносили одновременно с патогеном. Воздействие патогена на клетки пшеницы и защитное влияние метаболитов Fusarium sambucinum AF-967 оценивали по изменению концентрации клеток и росту патогена в суспензии, О росте гриба в смешанной культуре растительных клеток и патогена судили по содержанию в этой смеси эргостерола, являющегося неотъемлемым компонентом грибных клеток и отсутствующего в растительных. Как показали результаты, внесение метаболита одновременно с инокуляцией клеток пшеницы патогеном не дало положительных результатов, так как концентрация клеток в этом варианте была на уровне инфицированного контроля (без метаболитов). Предварительная обработка клеток в двухсуточной культуре вызывала задержку роста патогена и сохраняла концентрацию клеток устойчивого сорта Фронтана на уровне неинфнцированного контроля, а у восприимчивого сорта Безостая I уменьшала гибель клеток с 60 до 40%. После пяти суток совместного культивирования с патогеном разница по вариантам нивелировалась.

Можно констатировать, что предварительная обработка растительных клеток высокомолекулярными метаболитами мицелия F. sambucinum AF-967 индуцировала их устойчивость к патогену, в то время как внесение метаболитов одновременно с патогеном способствовало усилению роста последнего (табл. 5).

В следующем опыте использовал» клетки трех сортов пшеницы, добавив сред невосприимчивый сорт Даха. Как и в первом случае, предобработка клеток метаболитами вызывала их кратковременную сенсибилизацию, особенно высокую у относительно устойчивых сортов Фронтана и Даха, концентрация клеток которых оставалась на уровне не инфицированного контроля, а рост патогена был подавлен. На восприимчивом сорте Безостая 1 защитное действие метаболитов было значительно менее выраженным (табл. 6).

Таким образом, опыты с суспензионной культурой клеток пшеницы показали, что высокомолекулярные метаболиты F, sambucmiim AF-967 способны активизировать защитные реакции растения при предварительной обработке. Вероятно, в этом случае метаболиты поступали в клетки заблаговременно, вызывая их сенсибилизацию до контакта с патогеном.

Таблица 5.

Влияние различных способов внесения высокомолекулярных метаболитов в суспензионную культуру клеток пшеницы на их антипатогенную активность

Сорт Вариант 2-е сутки культивирования

концентрация клеток Общее содержание эргостерола,

тыс. шт/мл %от контроля мкг %от контроля

— Контроль Р. си1шошш — — 43,5 100

Безостая I (воспр.) Контроль неинфицированный 58,0 100 — —

Контроль инфицированный 20,9 36,0 88,0 202

Клетки + метаболиты + патоген 28,7 49,6 129,5 298

Предобработка клеток + патоген 34,8 60,1 80,3 185

Фронтана (отн. уст.) Контроль неинфицированный 59,1 100 — —

Контроль инфицированный 19,9 33,4 52,6 121

Клетки + метаболиты + патоген 17,9 30,4 66,4 153

Предобработка клеток + патоген 57,7 97,7 11,6 27

Таблица 6.

Оценка антипатогенной активности фракции высокомолекулярных метаболитов при предварительной обработке ими клеток пшеницы различных генотипов

Сорт Вариант 2-е сутки культивирования

концентрация клеток Общее содержание эргостерола

тыс. шт/мл "/а ОТ контроля мкг %от контроля

— Контроль Р. си!тотт — 26,3 100

Безостая I (воспр.) Контроль неинфшшрованный 53,3 100 — —

Контроль инфицированный 17,2 32,2 48,6 185

Предобработка клеток + патоген 29,1 54,6 42,8 163

Даха (ср. устойч.) Контроль не инфицированный 29,6 100 -— ___

Контроль инфицированный 15,3 51,7 35,5 135

Предобработка клеток + патоген 30,4 102 7,9 30

Фронтана (отн, уст.) Контроль неннф шифрованный 47,2 100 —

Контроль инфицированный 30,0 63,3 30,2 115

Предобработка клеток + патоген 42,4 89,8 5,8 22

выводы

1. Изучены потребности Fusarium sambucinum AF-967 в источниках азота и углерода для роста и спороношения в глубинной культуре. Максимальный рост биомассы обеспечивало сочетание сахарозы с органическими источниками азота (пептон, дрожжевой автолизат и др.). Наибольшее спороношение было получено на среде с соевой муки с мальтозой, фруктозой и маннитом.

2. Разработаны ферментационные среды для массового получения мицелия (на основе мелассы и пептона) и спор (с неохмелённым пивным суслом и соевой мукой) гриба Fusarium sambucinum AF-967, С этими средами хорошо сочеталась среда Райстрика, используемая в качестве посевной, так как она обеспечивала быстрое получение необходимых количеств жидкого инокулюма,

3. Определена динамика роста и спороношения Fusarium sambucinum AF-967 на подобранных средах. Максимум биомассы образовывался на мелассо-пептошюй среде на 2-е сутки культивирования, после чего начинался ее лизис. Спороношение на этой среде имело два пика; на 2-е и более высокий на 14-е сутки культивирования. Наибольший рост и спороношение на сусло-соевой среде отмечали на 4-е сутки кул ьти в нрова и ия.

4. Показана возможность длительного (8 месяцев) сохранения жизнеспособности конидий Fusarium sambucinum AF-967 при + 4-5°С на перлите. Мелассо-пептонная среда способствовала более длительному сохранению спор без снижения прорастаемости.

5. Установлено, что антагонистическое действие гриба Fusarium sambucinum AF-967 основано не только на конкурентных отношениях антагониста и патогена, но и на биосинтезе метаболитов с анти патоген ной активностью, которые обнаружены на всех этапах онтогенеза от прорастания спор до лизиса мицелия. Они содержались в молодом, интенсивно растущем мицелии и в образующихся на нем конидиях, В окружающую среду активные метаболиты выделялись в момент прорастания конидий и в период разрушения (лизиса) мицелия.

6. Анти патогенные метаболиты Fusarium sambucinum AF-967 наиболее полно извлекались из молодого мицелия экстракцией IM KCl в 0,05М фосфатном буфере (pH 6,0). Действующее начало осаждалось при насыщении экстракта сульфатом аммония и сохраняло активность после лиофнльной сушки.

7. В вегетационных опытах предпосевная обработка семян пшеницы фракцией высокомолекулярных метаболитов показывала более

высокую биологическую эффективность в подавлении Fusarium culmorum, чем при обработке семян спорами Fusarium sambucinum AF-967. In vitro эта фракция ограничивала рост колоний Bipolatis sorokiniana и некоторых патогенных фузариев, в концентрациях, на порядок превышающих действующие в вегетационных опытах,

8. Установлено, что в суспензионной культуре клеток пшеницы антипатогенное действие метаболитов Fusarium sambucinum AF-967 обнаруживалось только при предварительном их внесении в суспензию клеток (с последующей сменой питательной среды перед инокуляцией патогеном). При одновременном внесении инокулюма патогена и метаболитов в суспензионную культуру последние не угнетали рост патогена и не защищали клетки пшеницы. По-виднмому, антипатогенные метаболиты Fusarium sambucinum AF-967 лишь опосредованно воздействовали на патоген, индуцируя защитные реакции растения.

9. В условиях суспензионной культуры индукция защитных реакций метаболитами Fusarium sambucinum AF-967 была более высокой у клеток сортов пшеницы с относительной и средней устойчивостью к фузариозам, чем у клеток восприимчивого сорта.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Дорофеев Д. А., Девяткина Г. А., Артсменко Е. Н. Трофические потребности гриба Fusarium sp, (AF-967) // Известия ТСХА. - 2001. - Вып. 1. -С, 134-140.

2. Дорофеев Д. А. Наработка и хранение грибного антагониста для защиты зерновых злаков отфузариоза// Arpo XXI, -2001. -№ 6, - С. П.

3. Дорофеев Д. А., Артеме и ко Е. Н., Девяткина Г. А. Действие метаболитов нспатогенного фузарля на пораженность пшеницы фузариозной корневой гнилью //Arpo XXI,- 2001. -№ 10, - С, 12-13.

4. Дорофеев Д. А., Артеменко Е. Н„ Девяткина Г. А. Оптимизация метода определения Fusarium spp. по содержанию эргостерола // Доклады РАСХН. -2002. -№!.- С. 13-15.

Отпечатано с готового оригинал-макета Объем _Зак. 2SS_Тираж /0О

АПО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дорофеев, Дмитрий Александрович

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Грибы рода Fusarium, распространение и вредоносность.

1.2. Биологическая защита растений.

1.2.1. Бактериальные средства защиты растений.

1.2.2. Использование грибов в защите растений.

1.2.3. Использование непатогенных штаммов грибов рода Fusarium.

Глава II. Объекты и методы исследований.

2.1. Объект исследований.

2.2. Культивирование гриба.

2.3. Определение прорастаемости конидий Fusarium sambucinum AF-967.

2.4. Хранение конидий F. sambucinum AF-967 на инертных субстратах.

2.5. Получение экссудатов и метанольного экстракта из прорастающих спор F. sambucinum AF

2.6. Получение биомассы и фильтрата культуральной жидкости

F. sambucinum AF-967.

2.7. Экстракция биомассы F. sambucinum AF-967 метанолом.

2.8. Экстракция лиофилизированного мицелия

F. sambucinum AF-967 метанолом.

2.9. Выделение фракции высокомолекулярных метаболитов мицелия F. sambucinum AF

2.10. Получение метанольно-хлороформного экстракта лиофилизированного мицелия F. sambucinum AF-967.

2.11. Получение этанольного экстракта мицелия F. sambucinum AF

2.12. Вегетационные опыты.

2.13. Определение биологической активности экстрактов

F. sambucinum AF-967 in vitro.

2.14. Получение каллусных и суспензионных культур клеток пшеницы

2.15. Оценка защитного действия лиофилизированной фракции высокомолекулярных метаболитов мицелия F. sambucinum AF-967 in vitro.

2.16. Метод определения эргостерола в растительных тканях.

Глава III. Изучение трофических потребностей гриба

Fusarium sambucinum AF

3.1. Изучение возможности хранения конидий гриба

F. sambucinum AF-967 на инертных субстратах.

Глава IV. Изучение антипатогенной активности метаболитов

Fusarium sambucinum AF

4.1. Разработка метода проращивания конидий F. sambucinum AFв жидкой среде.

4.2. Оценка активности метаболитов F. sambucinum AFна стадии прорастания спор.

4.3. Изучение антипатогенной активности метаболитов

F. sambucinum AF-967 на стадии активного роста биомассы.

4.3.1. Оценка антипатогенной активности метанольного экстракта мицелия F. sambucinum AF

4.3.2. Оценка антипатогенной активности высокомолекулярных метаболитов мицелия F. sambucinum AF

4.3.3. Оценка антипатогенной активности метанольнохлороформного экстракта мицелия F. sambucinum AF

4.3.4. Оценка антипатогенной активности этанольного экстракта мицелия F. sambucinum AF

4.3.5. Оценка антипатогенной активности фильтратов культуральной жидкости F. sambucinum AF

Глава V. Исследование высокомолекулярной фракции метаболитов мицелия Fusarium sambucinum AF

5.1. Исследование активности высокомолекулярных метаболитов in vitro.

5.2. Изучение биологической активности фракции высокомолекулярных метаболитов в суспензионной культуре клеток пшеницы.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Изучение антипатогенной активности гриба Fusarium sambucinum AF-967"

Развитие аграрного сектора в мировой практике в последние десятилетия обеспечивается жесткой концентрацией и специализацией сельскохозяйственного производства, возделыванием сортов интенсивного типа и активным использованием мощных техногенных факторов - удобрений, техники, фитосанитарных препаратов. В практике защиты растений предпочтение имеют химические методы борьбы с вредными организмами. Однако вследствие широкого применения пестицидов может сложиться неблагоприятная экологическая ситуация - накопление остаточных количеств, загрязнение грунтовых вод, неблагоприятное воздействие на полезные организмы, распространение резистентных форм возбудителей болезней, вредителей, сорняков и т.д. Кроме того, интенсификация возделывания сельскохозяйственных культур привела к усилению процессов разрушения природных механизмов саморегуляции агроэкосистем и способствовала появлению новых, более агрессивных биотипов вредных организмов.

Проблемы охраны окружающей среды стали стержневым вопросом, определяющим направленность исследований по защите растений не только в нашей стране, но и за рубежом. В настоящее время четко проявляются две основные тенденции в построении систем земледелия, предусматривающие либо высокоинтенсивные или индустриальные технологии с применением широкого спектра химических средств, либо альтернативные системы защиты растений, которые базируются на использовании биологических агентов и ограниченном применении химических средств.

Биологические методы борьбы с рядом опасных вредителей и болезней растений достаточно высокоэффективны, относительно безвредны для человека, сельскохозяйственных животных и окружающей среды. Их основу составляет использование в качестве биопрепаратов разнообразных организмов или продуктов их жизнедеятельности. Значительное место в ряду биологических средств защиты растений принадлежит микроскопическим грибам. Наиболее широко применяются препараты на основе спор грибов-антагонистов, хотя при неблагоприятных для их развития погодных условиях их активность снижается. В связи с этим для повышения эффективности обработок предпочтительнее использовать активные метаболиты грибов, так как их биологическая активность не зависит от указанных обстоятельств, что делает их более удобными для применения в практике защиты растений.

В 1995 году на кафедре фитопатологии МСХА при участии сотрудников кафедры микробиологии из ризосферы яровой пшеницы был выделен штамм Fusarium sambucinum AF-967, не проявивший патогенных свойств на зерновых культурах (Афанди, 1995). Этот гриб in vitro проявлял антагонистическую активность в отношении некоторых возбудителей корневых гнилей (Афанди и др., 1995; Алзума, 1997). С 1995 г. на кафедре фитопатологии МСХА проводилось изучение биологических особенностей гриба F. sambucinum AF-967 и возможностей его применения для защиты зерновых и овощных культур от корневых гнилей. Эффективность применения спор гриба-антагониста была показана в полевых и лабораторных опытах на пшенице, ячмене, люпине, огурце, кормовой свекле и других культурах (Шкаликов, 1995; Зубейру, 1997; Моисеева, 1999; Хашем, 2000). Однако механизм антипатогенного действия этого штамма остался невыясненным.

Цель и задачи исследований. Цель исследований состояла в изучении антипатогенного действия фракций метаболитов гриба Fusarium sambucinum AF-967 по отношению к возбудителю фузариозной корневой гнили Fusarium culmorum, а также в установлении характера действия метаболитов на патоген.

В рамках общей проблемы решали следующие задачи:

- Изучение трофических потребностей F. sambucinum AF-967, включающее определение оптимальных источников азота и углерода и их соотношение.

-Разработка питательных сред для наработки биомассы и спор F. sambucinum AF-967 в глубинной культуре.

- Изучение возможности сушки и длительного хранения конидий F. sambucinum AF-967.

- Выбор метода экстракции антипатогенных метаболитов из мицелия F. sambucinum AF-967.

- Оценка антипатогенной активности фракций метаболитов F. sambucinum AF-967 на различных стадиях его онтогенеза - от прорастания спор до лизиса мицелия.

- Изучение возможного механизма воздействия активной фракции метаболитов F. sambucinum AF-967 на патоген и клетки растения-хозяина в условиях суспензионной культуры.

Научная новизна. Впервые установлено, что непатогенный штамм F. sambucinum AF-967 на разных стадиях своего развития продуцирует вещества индуцирующие защитные реакции проростков пшеницы по отношению к F. culmorum. Исследовано их действие in vitro на другие патогены, входящие в комплекс возбудителей корневых гнилей. Установлено их сенсибилизирующее действие на клетки различных по устойчивости к патогену сортов пшеницы в суспензионной культуре.

Практическая ценность работы. Разработаны условия глубинного культивирования F. sambucinum AF-967 и метод наиболее полного извлечения из биомассы активных метаболитов, определены их эффективные концентрации. Оптимизированы условия хранения конидий F. sambucinum AF-967 в течение длительного времени без потери жизнеспособности, что расширяет возможности заблаговременной наработки и применения спор гриба. Оценена возможность применения метаболитов гриба для повышения эффективности действия биопрепаратов на основе F. sambucinum AF-967.

Апробация. Основные положения диссертации были доложены на конференции, посвященной 40-летию ВНИИФ в 1999 г., а также на конференции молодых ученых в ТСХА в 2000 г.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 4 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (5 глав), выводов и списка литературы.

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Дорофеев, Дмитрий Александрович

ВЫВОДЫ

1. Изучены потребности Fusarium sambucinum AF-967 в источниках азота и углерода для роста и спороношения в глубинной культуре. Максимальный рост биомассы обеспечивало сочетание сахарозы с органическими источниками азота (пептон, дрожжевой автолизат и др.). Для спороношения оптимальным было сочетание в среде соевой муки с мальтозой, фруктозой и маннитом.

2. Разработаны ферментационные среды для массового получения мицелия (на основе мелассы и пептона) и спор (с неохмелённым пивным суслом и соевой мукой) гриба Fusarium sambucinum AF-967. С этими средами хорошо сочеталась среда Райстрика, используемая в качестве посевной, так как она обеспечивала быстрое получение необходимых количеств жидкого инокулюма.

3. Определена динамика роста и спороношения Fusarium sambucinum AF-967 на подобранных средах. На мелассо-пептонной среде максимум биомассы образовывался на 2-е сутки культивирования, после чего начинался ее лизис. Спороношение на этой среде имело два пика: на 2-е и более высокий на 14-е сутки культивирования. На сусло-соевой среде максимумы роста и спороношения соответствовали 4-м суткам культивирования.

4. Показана возможность длительного сохранения жизнеспособности конидий Fusarium sambucinum AF-967 при + 4-5°С на перлите. Мелассо-пептонная среда способствовала более длительному сохранению спор без снижения прорастаемости.

5. Установлено, что антагонистическое действие гриба Fusarium sambucinum AF-967 основано не только на конкурентных отношениях антагониста и патогена, но и на биосинтезе метаболитов с антипатогенной активностью.

6. Метаболиты с антипатогенной активностью обнаружены на всех этапах онтогенеза Fusarium sambucinum AF-967 от прорастания спор до лизиса мицелия. Они содержались в молодом, интенсивно растущем мицелии и в образующихся на нем конидиях. В окружающую среду активные метаболиты выделялись в момент прорастания конидий и в период разрушения (лизиса) мицелия.

7. Антипатогенные метаболиты Fusarium sambucinum AF-967 наиболее полно извлекались из молодого мицелия экстракцией 1М КС1 в 0,05М фосфатном буфере (рН 6,0). Действующее начало осаждалось при насыщении экстракта сульфатом аммония и сохраняло активность после лиофильной сушки.

8. В вегетационных опытах предпосевная обработка семян пшеницы фракцией высокомолекулярных метаболитов показывала более высокую биологическую эффективность, чем при обработке семян спорами Fusarium sambucinum AF-967.

9. Фракция высокомолекулярных метаболитов in vitro ограничивала рост колоний Bipolaris sorokiniana и некоторых патогенных фузариев, в концентрациях, на порядок превышающих действующие в вегетационных опытах.

10. Установлено, что в суспензионной культуре клеток пшеницы антипатогенное действие метаболитов Fusarium sambucinum AF-967 обнаруживалось только при предварительном их внесении в суспензию клеток, с последующей сменой питательной среды перед инокуляцией патогеном. При одновременном внесении инокулюма патогена и метаболитов в суспензионную культуру, последние не угнетали рост патогена и не защищали клетки пшеницы. По-видимому, антипатогенные метаболиты Fusarium sambucinum AF-967 могли лишь косвенным путем воздействовать на патоген, индуцируя защитные реакции растения.

11. В условиях суспензионной культуры, индукция защитных реакций метаболитами Fusarium sambucinum AF-967 была более высокой у клеток сортов пшеницы с относительной и средней устойчивостью к фузариозам, чем у клеток восприимчивого сорта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предыдущие исследования гриба Fusarium sambucinum AF-967 позволяют заключить, что гриб в почве может проявлять антагонистическую активность посредством конкуренции с патогенами за субстрат и место обитания, так как обладает достаточно высокой скоростью роста и интенсивным спороношением (Афанди и др., 1995; Алзума и др., 1997; Мунир и Алзума, 1997). Результаты наших исследований по изучению трофических потребностей гриба показали, что рост и спороношение антагониста ограничены в отсутствие пептидных субстратов. Это, по-видимому, объясняет повышенную активность антагониста при использовании его со стромом (Афанди и др., 1995; Шкаликов и др., 1995; Алзума и др., 1997; Моисеева, 1999).

Проведенное нами исследование антипатогенной активности фильтратов культуральной жидкости и экстрактов из конидий и мицелия на всех этапах онтогенеза Fusarium sambucinum AF-967, от прорастания конидий до лизиса мицелия, выявило способность гриба продуцировать вещества, подавляющие в вегетационных опытах развитие Fusarium culmorum, одного из наиболее вредоносных возбудителей корневых гнилей зерновых культур. Было установлено, что эти вещества содержатся как в конидиях, так и в молодом, активно растущем мицелии и выделяются в окружающую среду при прорастании спор гриба и разрушении (лизисе) его мицелия. Следовательно, при предпосевной обработке семян спорами F. sambucinum AF-967, метаболиты конидий могут проникать в зерно и при его прорастании, когда растение наиболее доступно для инфекции, обеспечивая защитный эффект. В период вегетации это действие может быть усилено за счет поступления метаболитов из разрушающегося мицелия и молодых прорастающих спор.

Однако эффективность препаратов на основе живых организмов в значительной степени зависит от условий внешней среды: наличия питательного субстрата, влажности, температуры, состава местной микрофлоры. Даже в том случае, когда механизмы защитного действия биоагента включают биосинтез активных метаболитов, эффект от его применения может быть нестабильным, поскольку биосинтез в этом случае протекает в неконтролируемых условиях. Использование биопрепаратов на основе заранее наработанных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов позволяет стабилизировать эффективность их действия.

Биосинтез непатогенными фузариями метаболитов, снижающих пораженность растений различными заболеваниями, довольно широко распространен в природе, а некоторые из этих веществ обладают антибиотической активностью (Logrieco et al., 1994; Nihei et al., 1998). Другие штаммы продуцировали метаболиты, которые не оказывали прямого токсического воздействия на патоген in vitro, но индуцировали защитные реакции растений (Oyarzum et al., 1994; Gullino, Migheli et al., 1995; Larkin and Fravel, 1996; Blok et al., 1997).

Химическая природа индукторов устойчивости, продуцируемых непатогенными штаммами Fusarium spp., а также характер защитных реакций растений, вызываемых ими, изучены пока очень слабо.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Дорофеев, Дмитрий Александрович, Б. Вязёмы

1. Алзума М. 3., Шильникова В. К., Шкаликов В. А. Антагонистические свойства Fusarium sp. (AF-967) // Изв. ТСХА. 1997. - № 2. - С. 109-113.

2. Андресон Р. К., Бойко Т. Ф., Галимзянова Н. Ф., Мелентьев А. И. Микробиологические процессы в ризосфере яровой пшеницы при обработке семян штаммами бацилл антагонистов почвенных фитопатогенов // С.-х. биол. Серия Биол. раст. - 1994. - № 5. - С. 91-95.

3. Афанди М. А., Шкаликов В. А., Шильникова В. К., Сизова Т. П. Гриб-антагонист в ризосфере яровой пшеницы // Защита и карантин растений. -1995. -№3.- С. 19.

4. Ашмарина Л. Ф., Дашкевич В. С., Дашкевич Н. Ю., Рудакова В. В., Шушаро А. И. Испытывается новый биопрепарат // Защита и карантин растений. -2000.- №6. -С. 41.

5. Бегунов И. И., Ярошенко В. А., Вяткина Г. Г. Оценка эффективности биопрепаратов против септориоза озимой пшеницы // Экологиз. с.-х. пр-ва Сев. -Кавказ, региона: Тез. докладов участников семин. -совещ., Анапа, 2629 июля, 1995. Москва. - 1995. - С. 42-43.

6. Беккер 3. Э. Физиология и биохимия грибов. М.: МГУ, 1988. - 230 с.

7. Бенкен А. А., Магила А. С., Хацкевич Л.К., Гришечкина С. Д. Корневая гниль зерновых культур в Литве в севооборотах с разным уровнем зернового насыщения // Микология и фитопатология. 1992. - Т. 26. - Вып. 5. - С. 388-393.

8. Бенкен А. А., Хацкевич Л. К. Оценка устойчивости растений к почвенным фитопатогенам // Микология и фитопатология. 1980. - Т. 14. - Вып. 6. - С. 531-538.

9. Бенкен А. А., Хацкевич Л. К., Нестеров А. Н. Проблема корневой гнили злаков // Микология и фитопатология. 1987. - Т. 21. - Вып. 6. - С. 566-573.

10. Билай В. И. Методы экспериментальной микологии. Киев: Наукова Думка, 1973.-242 с.

11. Билай В. И. Микроскопические грибы продуценты антибиотиков. - Киев: Изд-во Академии Наук УССР, 1961. - 184 с.

12. Билай В. И. Основы общей микологии. Киев: Вища Школа, 1974. - 396 с.

13. Билай В. И. Фузарии. Киев: Наукова Думка, 1977. - 442 с.

14. Боровая В. П. Использование ризоплана с поливинилпирролидом для предпосевной обработки семян озимой пшеницы // Агрохимия. 1997. - № 10.-С. 43-44.

15. Боровков А. В., Берестецкий О. А. Фитотоксические метаболиты грибов рода Fusarium Fr. // Микология и фитопатология. 1983. - Т. 17. - Вып. 4. -С. 349-358.

16. Воронин А. М., Кочетков В. В. Биологические препараты на основе псевдомонад // Агро XXI. 2000. - № 3. - С. 3-5.

17. Бутенко Р. Г., Хромова Л. М., Седнина Г. В. Методические указания по получению вариантных клеточных линий и растений у различных сортов картофеля. М.: ВАСХНИЛ, 1984. - 28 с.

18. Васютин А. С., Будынков Н. И., Рудаков О. Л. Корневые гнили -опаснейшие болезни зерновых // Зерновые культуры. 1996. - № 2. - С. 1920.

19. Горленко М. В., Афанасьева М. М. Почвенные микроскопические грибы и актиномицеты антагонисты Helmintosporium sorokiniamim Sacc. // Микология и фитопатология. - 1977. - Т. 11. - Вып. 6. - С. 492-498.

20. Горобей И. М., Ашмарина Л. Ф. Эффективность биологических средств защиты ячменя от болезней // Матер, конференции мол. ученых, посвящ. 26-летию СО РАСХН. Новосибирск, 1996. - С. 6-7.

21. Горобей И. М., Ахметгареева А. Ш. Изучение эффективности биопрепарата на основе бактерий рода Pseudomonas против болезней яровой пшеницы // Матер, конференции мол. ученых, посвящ. 26-летию СО РАСХН. -Новосибирск, 1996. С. 7-8.

22. Громовых Т. И., Гукасян В. М., Голованова Т. И., Шмарловская С. В. Trichoderma harzianum Rifai Aggr. как фактор повышения устойчивости томатов к возбудителю корневой гнили // Микология и фитопатология. -1998. Т. 32. - Вып. 2. - С. 73-78.

23. Денщиков М. Т. Отходы пищевой промышленности и их использование. -М.: Колос, 1963.-256 с.

24. Дорофеев Д. А., Артеменко Е. Н., Девяткина Г. А. Оптимизация метода определения биомассы Fusarium spp. по содержанию эргостерола // Доклады Россельхозакадемии. 2002. -№ 1. - С. 13-15.

25. Жалиева JI. Д. Биопрепараты для защиты озимой пшеницы от фузариозной инфекции // Экол. безопас. и беспестицид, технол. получ. растениевод, продукции: Матер. Всерос. науч. -произв. совещ., Краснодар, 24-26 авт., 1994. Ч. 2. Пущино, 1994. - С. 19-20.

26. Захарова Т. И., Чумаков А. Е. Вредоносность основных грибных болезней зерновых культур // Микология и фитопатология. 1986. - Т. 20. - Вып. 2. -С. 143-153.

27. Иващенко В. Г., Назаровская Л. А. Источники инфекции фузариоза колоса злаковых культур в Краснодарском крае // Защита и карантин растений. -1998. № 11.-С. 30-31.

28. Иващенко В. Г., Сотченко Е. Ф., Шипилова Н. П. Фузариоз початков кукурузы // Микология и фитопатология. 2000. - Т. 34. - Вып. 6. - С. 63-70.

29. Иващенко В. Г., Шипилова Н. П., Кирцидели И. Ю. Экологический мониторинг возбудителей фузариоза семян зерновых культур на северозападе России // Микология и фитопатология. 1997. - Т. 31. — Вып. 2. - С. 64-70.

30. Иващенко В. Г, Шипилова Н. П., Левитин М. М. Видовой состав грибов рода Fusarium на злаках в Азиатской части России // Микология и фитопатология. 2000. - Т. 34. - Вып. 4. - С. 54-58.

31. Иващенко В. Г, Шипилова Н. П., Нефедова Л. И, Гагкаева Т. Ю, Назаровская JL А, Хлопунова Л. Б. Биоэкологические и фитосанитарные аспекты исследования фузариоза колоса // Микология и фитопатология. -1997.-Т. 31.-Вып. 2.-С. 58-63.

32. Изотова Т. Е, Карпачева Н. С., Полях Г. И, Матюшин М. С., Шаламова А. А. Опыт комплексного изучения биологического препарата "Ризоплан" // 75 лет Тат. НИИ с.х. Матер. Науч. -практ. конф., Казань, 1995: Тез. докл. -Казань, 1996.-С. 119-121.

33. Казначеев М. Н. Биопрепараты на службе урожая // Защита и карантин растений. 2000. - № 7. - С. 14.

34. Калинина Р. Т. Определение патогенности и наличия фитотоксинов у грибов рода Fusarium возбудителей корневой гнили озимой пшеницы // Микология и фитопатология. - 1980. - Т. 14. - Вып. 1. - С. 51-56.

35. Калько Г. В, Воробьев Н. И., Лагутина Т. М, Новикова И. И. Ингибирование микробами-антагонистами фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum в торфогрунте // Микология и фитопатология. 2001. - Т. 35. -Вып. З.-С. 66-75.

36. Кожыбски Т, Ковшык-Гиндифер 3., Курылович В. Антибиотики: происхождение, природа и свойства. Варшава: Польское государственное медицинское издательство, 1969. - Т. 2. - 1343 с.

37. Коломбет Л. В, Жиглецова С. К, Дербышев В. В., Ежов Д. В., Косарева Н. И, Быстрова Е. В. Микофунгицид препарат на основе Trichoderma viride для борьбы с болезнями растений // Прикладная биохимия и микробиология. -2001.-Т. 37. - № 1.-С. 110-114.

38. Котляров В. В. Устойчивость сортов пшеницы к фузариозу и методы ее определения // Селекция и семеноводство. 1986. - № 6. - С. 51-54.

39. Левитин М. М., Иващенко В. Г., Шипилова Н. П. Фузариоз колоса пшенцы // Микология и фитопатология. 1990. - Т. 24. - Вып. 5. - С. 446-453.

40. Левитин М. М., Гагкаева Т. Ю. Сравнительный анализ популяций Fusarium graminearum Schwabe, выделенных с разных органов озимой пшеницы // Микология и фитопатология. 1991. - Т. 25. - Вып. 1. - С. 73-79.

41. Лексущенкова Л. И., Алеева Л. А., Бондаренко А. Ф. Биологическая защита злаков от корневых гнилей // Актуал. проблемы науки в с.-х. пр-ве: Тезисы докладов науч.-практ. конф., Иваново., 11-12 апреля, 1995. Иваново. -1995.-С. 126.

42. Максимова Н. И., Мацкявичене Е. В. Взаимоотношения гриба Phytophthora infestans и клеток картофеля в суспензионной культуре при совместном выращивании // Физиология растений. 1996. - Т. 43. - № 2. - С. 285-290.

43. Матевосян Г. Л., Кудашов А. А., Езаов А. К., Сотник В. Г., Павлюшин В. А. Эффективность различных сроков применения микробиологических препаратов и регуляторов роста при выращивании томата в защищенном грунте // Агрохимия. 2001. - № 2. - С. 61-69.

44. Мелентьев А. И., Галимзянова Н. Ф. Влияние метаболитов бацилл-антагонистов на прорастание спор и развитие грибов-возбудителей обыкновенной корневой гнили // Прикладная биохимия и микробиология. -1999. Т. 35. - № 3. - С. 353-357.

45. Метлицкий Л. В., Озерецковская О. Л., Дорожкин Н. А., Иванюк В. Г., Чалова Л. И., Юрганова Л. А., Барамидзе В. Г. Индуцирование устойчивости картофеля к паразитарным грибам // Прикладная биохимия и микробиология. 1978. - Т. 14. - Вып. 2. - С. 262-270.

46. Методические указания по диагностике, учету и оценке вредоносности пирикуляриоза риса // ВНИИФ / Отв. ред. Кирюхина Р. И. М.:ВАСХНИЛ, 1988.-40 С.

47. Миронова Г. В. Биологические методы защиты яровой пшеницы от листовой инфекции // Вестн. Омск. гос. аграр. университета. 1998. - № 4. - С. 46-47.

48. Монастырский О. А. Мониторинг токсинообразующих грибов зерновых злаков // Агрохимия. 2001. - № 8. - С. 79-87.

49. Мунир А. X., Алзума М. 3. Влияние Fusarium sp. AF-967 на ризоценозы ячменя и пшеницы // Изв. ТСХА. 1997. - № 4. - С. 113 -119.

50. Муромцев Г. С., Черняева И. И. Использование микробиологических факторов для защиты растений от корневых инфекций // Вестн. с.-х. науки. -1988.-№7.-С. 29-35.

51. Никонорова А. К. Особенности взаимодействия Bacillus subtilis с Helmintosporium sativum Pam., King et Bakke // Микология и фитопатология. 1996. - Т. 30. - Вып. 5-6. - С. 69-74.

52. Новикова И. И., Иващенко В. Г., Калько Г. В., Бойкова И. В., Назаровская Л.

53. A., Литвиненко А. И. Испытание новых биопрепаратов в борьбе с фузариозом колоса // Микология и фитопатология. 1994. - Т. 28. - Вып. 1. -С. 70-75.

54. Новожилов К. В., Левитин М. М. Направление исследований для решения проблемы фузариоза колоса зерновых культур // Вестник сельскохозяйственной науки. 1990. - № 10 . - С. 64-67.

55. Павлова Т. В., Измалкова А. Г. Фузариоз колоса пшеницы в Краснодарском крае // Защита и карантин растений. 1995. - № 11. - С. 28-29.

56. Павловская Ж. И., Михайлова Р. В., Лобанок А. Г., Мороз И. В., Кобзарова

57. B. С. Антагонистические свойства Trichoderma lignorum (TODE) harz от 534 и gliocladium catenulatum Gilman et Abbot 453 в отношении Fusarium sambucinum Fuckel // Микология и фитопатология. 1998. - Т. 32. - Вып. 3. -С. 41-46.

58. Парфенова Т. А., Алексеева Т. П. Токсическое влияние фильтрата культуральной жидкости грибов рода Fusarium на семена пшеницы // Микология и фитопатология. 1995. - Т. 29. - Вып. 1. - С. 78-82.

59. Покровский Н. П., Нугманова Т. А., Кабаргина М. В. Исследование биологической активности новых стимуляторов роста, полученных путем культивирования эндофитных грибов. М.: НПП ПВОН "Биоин", 1999. - 6 с.

60. Помелов А. В. Эффективность биологического препарата ризоплан на ячмене // Почва, биол. раст. и агротехн. их воздел.: Тез. докл. науч. конф., Киров, 1997. Киров. - 1997. - С. 44-47.

61. Попов Ю. В. Корневая гниль яровой пшеницы в Кустанайской области // Микология и фитопатология. 1982. - Т. 16. - Вып. 3. - С. 263-266.

62. Райлло А. И. Грибы рода Фузариум. М.: Сельхозгиз, 1950. - 415 с.

63. Сидоров И. А., Есауленко Е. А. Фузариоз колоса пшеницы // Защита и карантин растений. 2000. - № 9. - С. 24-25.

64. Сидоров И. А., Есауленко Е. А., Анпилогова JL К., Соколов М. С. Сравнительная характеристика вредоносности различных форм возбудителя фузариоза колоса пшеницы // Агрохимия. 1998. - № 5. - С. 86-90.

65. Сидорова С. Ф., Рябчикова В. В., Берестецкая JI. И. Особенности патогенного комплекса возбудителей корневых гнилей зерновых культур в условиях Воронежской области // Микология и фитопатология. 1992. - Т. 26.-Вып. 6.-С. 493-501.

66. Соколов М. С., Пикушова Э. А., Левашова Г. И. Традиционные и новые приемы защиты озимой пшеницы от болезней, поражающих корневую систему и основание стебля пшеницы // Агрохимия. 1998. - № 1. - С. 84-93.

67. Терехов В. И., Бессмельцев В. И., Анпилогова Л. К., Глебов Е. И., Есауленко Е. А. Прогноз вредоносности фузариоза зерна озимой пшеницы // Доклады РАСХН.- 1998.-№ 1.-С. 11-12.

68. Феофилова Е. П., Немцев Д. В., Терешина В. М., Козлов В. П. Полиамидосахариды мицелиальных грибов: новые биотехнологии и перспективы практического использования (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - Т. 32. - № 5. - С. 483-492.

69. Хацкевич Л. К., Бенкен А. А. Роль научно-методического подхода в изучении корневой гнили зерновых культур // Микология и фитопатология. 1994. - Т. 28. - Вып. 5. - С. 65-69.

70. Хацкевич Л. К., Нестеров А. Н. Патогенный комплекс возбудителей корневой гнили яровой пшеницы на Южном Урале // Микология и фитопатология. 1994. - Т. 28. - Вып. 6. - С. 71-75.

71. Цветкова Н. А., Федорова Ф. А. Этиология корневой гнили озимой пшеницы в Московской области // Вестник сельскохозяйственной науки. 1990. - № 12.-С. 97-100.

72. Чумаков А. Е., Власов Ю. Н., Бушкова Л. Н., Сидорова С. Ф., Гуськова Л. А. Инфекционные фоны в фитопатологии. М.: Колос, 1979. - 208 с.

73. Чкаников Д. И. Использование различий химического состава фитопатогенных грибов и растений при изучении их взаимоотношений // Физиология растений. 1996. - Т. 43. -№ 5. - С.671-678.

74. Шамрай С. Н. Паразитические свойства возбудителей корневой гнили ярового ячменя на Украине // Микология и фитопатология. 1988. - Т. 22. -Вып. 5.-С. 463-466.

75. Шемякин М. М, Хохлов А. С, Колосов М. Н, Бергельсон JI. Д, Антонов В. К. Химия антибиотиков. М.: Издательство АН СССР, 1961. - Т. 2. - 1551 с.

76. Alabouvette С, Couteaudier Y. Biological control of Fusarium wilts with nonpathogenic Fusaria // Biological control of plant diseases. Plenum Press, New York, 1992. - P. 415-426.

77. Arras G., Arru S. Mechanism of action of some microbial antagonists fungal pathogens // Annals of microbiology and enzimology. 1997. - V. 48. - № 1. - P. 97-120.

78. Asaka O., Shoda M. Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off of tomato with Bacillus subtilis RB14 // Appl. And Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - № 11. -P. 4081-4085.

79. Attitalla I. H., Quintanilla P., Brishammar S. Induced resistance in tomato plants against Fusarium wilt invoked by Fusarium sp., salicylic acid and Phytophthora cryptogea // Acta phytopathol. et entomol. hung. 1998. - V. 33. - № 1-2. - P. 89-95.

80. Biles C. L., Martyn R. D. Local and systemic resistance induced in watermelons by formae speciales of Fusarium oxysporum// Phytopathology. 1989. - V. 79. -P. 856-860.

81. Blok W. J., Zwankhuisen M. J., Bollen G. J. Biological control of Fusarium oxysporum f.sp. asparagi by applying non-pathogenic isolates of Fusarium oxysporum // Biocontrol Sci. And Technol. 1997. - Y. 7. - № 4. - P. 527-541.

82. Booth C. The genus Fusarium. Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, UK, 1971.-237 p.

83. Chakrabotry A., Gupta P. K. S. Factors affecting cross protection of Fusarium wilt of pigeon pea by soilborne nonpathogenic fungi // Phytoparasitica. 1995. -V. 23.-№4.-P. 323-334.

84. Chao W. L., Nelson E. В., Harman G. E., Hoch H. C. Colonization of the rhizosphere by biological control agents applied to seeds // Phytopathology. -1986.-V. 76.-P. 60-65.

85. Cook R. J., Weller D. M., Thomashow L. S. Potential for biological control of root pathogens with Pseudomonas species introduced into the rhizosphere // Phytoparasitica. 1998. -V. 26. - № 3. - P. 251-252.

86. Deacon J. W. Significance of ecology in the development of control agents against soil-borne plant pathogens // Biocontrol science and technology. 1991. -У. l.-P. 5-20.

87. Dhingra O. D., Sinclair J. B. Basic plant pathology methods. Boca Ration, Florida: CRC Press, Inc., 1986. - 355 p.

88. Duffy В. K., Ownley В. H., Weller D. M. Soil chemical and physical properties associated with suppression of take-all of wheat by Trichoderma koningii // Phytopathology. 1997. - V. 87. - № 11. - P. 1118-1124.

89. Elad J., Barak R., Chet J., Henis J. Ultrastructural studies of the interaction between Trichoderma spp. and plant pathogenic fungi // Phytopathology Z. -1983.-V. 107,-№2.-P. 168-175.

90. Ferrata M., Ambra V. D. Morphological aspects of Trichoderma harzianum parasitism on Sclerotium rolfsii // Riv. Patol. Veg. 1985. - V. 21. - № 2. - P. 53-59.

91. Fravel D. R., Larkin R. P. Biocontrol of Fusarium wilt of hydroponically-grown basil (Fusarium oxysporum f. sp. basilici) using F. oxysporum CS-20 // Phytopathology. 1999. - V. 89. - № 6. - S26. Publication № P-1999-0181-AMA.

92. Giessler L. J., Yuen G. Y. A non-fluorescent Pseudomonas sp. antagonistic to brown patch: Abstr. APS Annu. Meet., Albuquerque, N. M., Aug. 6-10, 1994 // Phytopathology. 1994. - V. 84. - № 10. - P. 1113.

93. Griffin G. J. Carbon and nitrogen requirements for macroconidial germination of Fusarium solani: dependence on conidial density // Canadian journal of microbiology. 1970. - V. 16. - № 8. - P. 733-740.

94. Griffin G. J. Fusarium oxysporum and Aspergillus flavus spore germination in the rhizosphere of peanut // Phytopathology. 1969. - V. 59. - P. 1214-1218.

95. Gullino M. L., Mezzalama M., Migheli Q., Giuria V. Risk analysis for antagonistic Fusarium spp.: Abstr. APS Annu. Meet., Pittsburgh, Pa, Aug. 12-16, 1995//Phytopathology. 1995.-V. 85.-№ 10.-P. 1117.

96. Gullino M. L., Migheli Q., Mezzalama M. Risk analysis in the release of biological control agents. Antagonistic Fusarium oxysporum as a case study // Plant Disease.- 1995. V. 79.-№ 12.-P. 1193-1201.

97. Handelsman J., Stabb E. V. Biocontrol of soilborne plant pathogens // Plant Cell. 1996. - V. 8. -№ 10. - P. 1855-1869.

98. Hadar J., Chet J., Henis J. Biological control of Rhizoctonia solani damping-off with wheat bran culture of Trichoderma harzianum // Phytopathology. 1979. -V. 69.-P. 64.

99. Hillocks R. J. Cross protection between strains of Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum and its effect on vascular resistance mechanisms // J. Phytopathology. 1986. - V. 117.-P. 216-225.

100. Huang Y., Wong P. T. W. Effect of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia and soil on the control of crown rot in wheat // Plant and soil. 1998. - V. 203. - № 1. -P. 103-108.

101. Hyill D. J., Peng G. Evaluation of AtEze for suppression of Fusarium wilt of chrysanthemum: Abstr. Saskatchewan-Alberta Reg. Meet., Can. Phytopathol. Soc., 1998 // Hybridoma. 1999. - V. 18. - № 1. - P. 194-195.

102. Ilan C., Jacob I. Biological control of fungal pathogens // Appl. Biochem. And Biotechnol. A. 1994. -V. 48. -№ 1. - P. 37-43.

103. Joffe A. Z. Fusarium species: their biology and toxicology. USA: John Wiley & Sons, Inc., 1986.-590 p.

104. Keel С. J. Bacterial antagonists of plant pathogens in the rhizosphere: Mechanisms and prospects: New Approaches Biol. Contr. Soil-Borne Diseases: Workshop, Copenhagen, 30 June 4 July, 1991 // JOBC/WPRS Bulletin. - 1992. -V. 15. -№ l.-P. 93-99.

105. Kilic O., Griffin G. J. Effect of dsRNA-containing and dsRNA-free hypovirulent isolates of Fusarium oxysporum on severity of Fusarium seedling disease of soybean in naturally infected soil // Plant and soil. 1998. - V. 201. -№ l.-p. 123-135.

106. Ко W. H., Lockwood J. Z. Soil fungistasis: relation to fungal spore nutrition // Phytopathology. 1967. - V. 57. - № 8. - P. 894-901.

107. Korsten L. Biological control potential against Colletotrichum gloeosporioides // Phytoparasitica. 1998. - V. 26. - № 4. - P. 356.

108. Kulichova R. Ucinnost' biopreparatu trichonitrin proti rhynchosporovej skvrnitosti jacmena jarneho // Ochr. rostlin. 1997. - V. 33. - № 3. - P. 213-219.

109. Kumar A. S. Evaluation of biological control agents against red rot (Colletotrichum falkatum) of sugarcane // Ann. Appl. Biol. 1998. - V. 132. -Suppl.-P. 72-73.

110. Landa В. В., Hervas A., Bettiol W., Jimenez-Diaz R. M. Antagonistic activity of bacteria from the chickpea rhizosphere against Fusarium oxysporum f. sp. ciceris // Phytoparasitica. 1997. - V. 25. - № 4. - P. 305-318.

111. Larkin R. P., Fravel D. R. Ecological characteristics of biological control of Fusarium wilt of tomato using nonpathogenic Fusarium spp. // Phytopathology. -1996. -V. 86.-№ 11.-S9.

112. Larkin R. P., Fravel D. R. Efficacy of biological control of Fusarium wilt of tomato under varying environmental conditions // Phytopathology. 1997. - V. 87. - № 6. - S56, Publication № P-1997-0398-AMA.

113. Larkin R. P., Fravel D. R. Mechanism of action and dose-response relationships governing biological control of Fusarium wilt of tomato by nonpathogenic Fusarium spp. // Phytopathology. 1999. - V. 89. - № 12. - P. 1152-1161.

114. Larkin R. P., Hopkins D. L., Martin F. N. Biological control of Fusarium wilt of watermelon using non-pathogenic isolates Fusarium oxysporum: Abstr. APS Annu. Meet., Pittsburgh, Pa, Aug. 12-16, 1995 // Phytopathology. 1995. - V. 85.- № 10.-P. 1167.

115. Larkin R. P., Hopkins D. L., Martin F. N. Suppression of Fusarium wilt of watermelon by nonpathogenic Fusarium oxysporum and other microorganisms recovered from disease-suppressive soil // Phytopathology. 1996. - V. 86. - № 8.-P. 812-819.

116. Lewis J. A., Papavizas G. C. Application of Trichoderma and Gliocladium in alginate pellets for control of Rhizoctonia damping-off // Plant Pathology. 1987. -V. 36.-№4.-P. 438-446.

117. Lewis J. A., Papavizas G. C. Chlamidospore formation by Trichoderma spp. in natural substrates // Canadian journal of microbiology. 1984. - V. 30. - P. 1-7.

118. Lewis J. A., Papavizas G. C. Germiability changes in hyphae of Rhizoctonia solani induced by germling preparations of Trichoderma and Gliocladium // Phytopathology. 1987. - V. 77. - № 5. - P. 699-703.

119. Lewis J. A., Papavizas G. C. Proliferation of Trichoderma and Gliocladium from alginate pellets in natural soil and reduction of Rhizoctonia solani inoculum // Phytopathology. 1984. - V. 74. - № 7. - P. 836 (A 372).

120. Lewis J. A., Papavizas G. C., Lumsden R. D. A new formulation system for the application of biocontrol fungi to soil // Biocontrol science and technology. -1991.-№ 1.-P. 59-69.

121. Logrieco A., Mule G., Bottalico A. Antagonistic activity in Fusarium acuminatum// J. Phytopathol. 1994. - V. 140. -№ 3. - P. 193-200.

122. Magie R. O. Fusarium disease of gladioli controlled by inoculation of corms with non-pathogenic Fusaria // Proc. Fla. State Hort. Soc. 1980. - V. 93. - P. 172-175.

123. Mandeel Q., Baker R. Mechanisms involved in biological control of Fusarium wilt of cucumber with strains of nonpathogenic Fusarium oxysporum // Phytopathology. 1991. - V. 81. - P. 462-469.

124. Marchant R. The carbon metabolism and swelling of Fusarium culmorum conidia // Journal of general microbiology. 1967. - У. 48. - P. 65-77.

125. Marchant R., White M. F. Spore swelling and germination in Fusarium culmorum // Journal of general microbiology. 1966. - V. 42. - № 2. - P. 237244.

126. Maurhofer M., Keel C., Haas D., Defago G. Influence of plant species on disease suppression by Pseudomonas fluorescens strain CHAO with enhanced antibiotic production // Plant pathol. 1995. - V. 44. - № 1. - P. 40-50.

127. Michalikovi A., Michrina J. Ucinnost' biopreparatov v ochrane jacmena jarneho proti fuzariozam // Ochr. rostl. 1997. - V. 33. - № 1. - P. 33-48.

128. Miedaner Т., Perkowski J., Geiger H. H. Genetic basis of resistance to Fusarium head blight and mycotoxin content in winter rye // Fusarium -mycotoxins, taxonomy and pathogenicity. Elsevier Science Publishers В. V., 1995.-P. 124.

129. Miller J. D.,Young J. C., Trenholm H. L. Fusarium toxins in field corn. I. Time course of fungal growth and production of deoxynivalenol and other mycotoxins // Can. J. Bot. 1983. - V. 61. - P. 3080-3087.

130. Muller P., Rudolph K. Induzierte resistenz durch bakterielle lipopolysaccharide (LPS): 50 Dtsch. Pflanzenschutztag., Munster, 23-26 Sept., 1996 // Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt. Berlin-Dahlem. 1996. - № 321. - P. 287.

131. Nihei К., Iton Н., Hashimoto К., Miyairi К., Okuno Т. Antifungal ciclodepsipeptides W493A and B, from Fusarium sp.; isolation and structural determination // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 1998. - V. 62. -№5.-P. 858-863.

132. Nihei К., Iton H., Hashimoto К., Miyairi К., Okuno Т. Antifungal ciclodepsipeptides W493A and B, from Fusarium sp.: Isolation and structural determination // Biosci., Biotechnol. and Biochem. 1998. - V. 62. - № 5. - P. 858-863.

133. Ogawa K., Komada H. Biological control of Fusarium wilt of sweet potato by non-pathogenic Fusarium oxysporum // Ann. Phytopath. Soc. Japan. 1984. - V. 50.-P. 1-9.

134. Ogawa K., Komada H. Induction of systemic resistance against Fusarium wilt of sweet potato by non-pathogenic Fusarium oxysporum // Ann. Phytopath. Soc. Japan. 1986. - V. 52. - P. 15-21.

135. Oyarzun P. J., Postma J., Luttikholt A. J. G., Hoogland A. E. Biological control of foot and root rot in pea caused by Fusarium solani with nonpathogenic Fusarium oxysporum isolates // Can. J. Bot. 1994. - V. 72. - № 6. - P. 843-852.

136. Papavizas G. C. Survival of Trichoderma harzianum in soil and in pea and bean rhizospheres // Phytopathology. 1982. - V. 72. - № 7. - P. 121-125.

137. Papavizas G. C. Trichoderma and Gliocladium: Biology, ecology, and potential for biocontrol // Ann. Rev. Phytopathol. 1985. - V. 23. - P. 23.

138. Park C.-S., Paulitz Т. C., Baker R. Biocontrol of Fusarium wilt of cucumber resulting from interactions between Pseudomonas putida and nonpathogenic isolates of Fusarium oxysporum // Phytopathology. 1988. - V. 78. - № 2. - P. 190-194.

139. Parry D. W., Jenkinson P., McLeod L. Fusarium ear blight (scab) in small grain cereals a review // Plant pathology. - 1995. - V. 44. - № 2. - P. 207-238.

140. Postma J., Luttikholt A. J. G. Colonization of carnation stems by a nonpathogenic isolate of Fusarium oxysporum and its effect on Fusarium oxysporum f. sp. dianthi // Can. J. Bot. 1996. - V. 74. - № 11. - P. 1841-1851.

141. Punja Z. K. Compararive efficacy of bacteria, fungi, and yeasts as biological control agents for diseases of vegetable crops // Can. J. Plant Pathol. 1997. - V. 19. -№ 3. -P. 315-323.

142. Purss G. S. Pathogenic specialization in Fusarium graminearum // Austr. J. Agr. Res. 1971. - V. 22. -№ 4. - P. 553-561.

143. Ragazzi A., Danti S., Turco E. Colletotrichum spp.: Controllo biologico con antagonisti fungini // Riv. agr. subtrop. e trop. 1996. - V. 90. - № 1. - P. 85-93.

144. Rankin L., Paulitz Т. C. Evaluation of rhizosphere bacteria for biological control of Pythium root rot of greenhouse cucumbers in hydroponic culture // Plant Disease. 1994. -V. 78. -№ 5. - P. 447-451.

145. Seitz L. M., Bechtel D. B. Chemical, physical and microscopical studies of scab-infected hard red winter wheat // J. Agric. Food Chem. 1985. - V. 33. - № 3.-P. 373-377.

146. Shearer C. A. Fungal competition // Can. J. Bot. 1995. - V. 73 (Suppl. 1). -S1259-S1264.

147. Schneider R. W. Effects of nonpathogenic strains of Fusarium oxysporum on celery root infection by F. oxysporum f. sp. apii and a novel use of the Lineweaver-Burk double reciprocal plot technique // Phytopathology. 1984. - V. 74.-P. 646-653.

148. Silva-Hanlin D. M. W., Menezes M. Potencial antagonico de especies de Trichoderma no controle de Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum, о agentecausal da murcha do algodoeiro // Arq. biol. e tecnol. 1997. - V. 40. - № 4. - P. 927-940.

149. Sivan A., Ucko O. Biological control of Fusarium crown rot of tomato by Trichoderma harzianum under field condition // Plant disease. 1987. - V. 71. -№7.-P. 587-92.

150. Steiner U. Biologische verfahren zur bekampfung der Fusarienwelke bei cyclamen: 51 Dtsch. Pflanzenschutztag., Halle/Saale, 5-8 Okt., 1998 // Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt. Berlin-Dahlem. 1998. -№ 357. - P. 357.

151. Swadling I. R., Jeffries P. Antagonistic properties of two bacterial biocontrol agents of grey mould disease // Biocontr. Sci. And Technol. 1998. - V. 8. - № 3. - P. 439-448.

152. Wells H. D. Trichoderma as biocontrol agent // In "Biocontrol of plant diseases". USA: CRC Press, Inc., 1988. -V. 1. - Chapter 5. - P. 72-81.

153. Wells H. D., Beil D. K., Javorski C. A. Efficacy of Trichoderma harzianum as a biocontrol for Scleroyium rolfsii // Phytopathology. 1972. - V. - 62. - P. 442.107

154. Yates E., Meredith F., Bacon C. W., Jaworski A. J. Fusarium moniliforme production of fumonisin Bi suppresed by Trichoderma viride // Phytopathology. -1999. V. 89. - S88. Publication № P-1999-0629-AMA.

155. Zhangliang C., Yaping W., Yiqiang L. Isolation, purification and characterization of antifungal protein from antagonistic bacteria // 15 Int. Bot. Congr., Yokogama, Aug. 28 Sept. 3, 1993: Abstr. - Yokogama, 1993. - P. 192.