Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЗАЩИТЫ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ ОТ ФУЗАРИОЗА КОЛОСА

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЗАЩИТЫ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ ОТ ФУЗАРИОЗА КОЛОСА"



На правах рукописи

Мохамсд Хашем Мохамсд Ахмед

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЗАЩИТЫ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ ОТ ФУЗАРИОЗА КОЛОСА

Специальности: 06. 01. 11 - Защита растений 03. 00. 07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2000

„ ^ '

- • / ^, , /V '

Работа выполнена в Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева на кафедрах фитопатологии и микробиологии

Научные руководители — доктор биологических наук, профессор В. А. Шкаликов; доктор биологических наук, профессор В. К. Шнлышкова

Официальные оппоненты - доктор биологических наук В. В. Мазин; кандидат биологических наук И. Н. Скворцова

Ведущее предприятие - Центральный НИИ агрохимического обслуживания (ЦИНАО)

Защита диссертации состоится « £ » .(Моу(Л- 2000 г в ^"Ъ.. ч на заседании диссертационного совета Д 120 35 09 в Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева

Адрес 127550, Москва, Тимирязевская ул , 49

Ученый совет МСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА

Автореферат разослан « Р> » ииЛ- 2000 г

Ученый секретарь диссертационного совета -

профессор В. В. Исаичев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы: Биологический метод борьбы - наиболее перспективная альтернатива химическим приемам защиты растений. В частности, это относится к предупреждению и борьбе со "злаковым фузариумом" Fusarium graminearum Schwabe, поражающим в период цветения и налива зерна колос пшеницы. Борьба с F. graminearum затрудняется тем, что он способен существовать в сапротрофной и паратрофной формах, н имеет особую половую стадию (Gibberella zeae), способен использовать в качестве источников литания разнообразные органические соединения (Билай, 1977). Все эти особенности обусловливают его высокую пластичность и высокую метаболическую активность в различных условиях окружающей среды и в конечном итоге определяют широту его распространения во всем мире.

В последние десятилетия биологический метод все больше привлекает внимание исследователей, хотя занимает еще небольшое место в комплексе мер борьбы с почвенными патогенами. Этот метод позволяет избирательно воздействовать на численность популяции и активность паразитов, безопасен для человека и вызывает минимальные нарушения структуры биоценозов (Сидорова 1980; Linderman et al.,1983; Великанов с соавт., 1988).

В обычные по эпифитотийности годы патогенные, среднепатогенные и непатогенные штаммы в популяциях агробиоценозов соотносятся как 1:3:1 (Клечковская с соавт., 1996). Однако в последние годы ситуация изменилась: резко возросла вредоносность F. graminearum. Причинами распространения фузариоза колоса и зерна в период созревания и уборки, очевидно, ■ стало отсутствие специфических фунгицидов, подавляющих возбудителей фузариоза, снижение доли сортов пшеницы, устойчивых к фузариозу, а также погодные условия и перенасыщение севооборотов зерновыми культурами. Вместе с тем возрастающее антропогенное воздействие на окружающую среду диктует необходимость вместо химических средств защиты растений использовать биопрепараты, работающие в природных условиях: они более избирательны, менее стойки и опасны для человека, вызывают минимальные нарушения структуры биоценозов и в то же время не менее активны чем химические.

F. graminearum, вызывающий фузариоз колоса и зерна пшеницы, активно продуцирует крайне опасные для здоровья человека и животных фузариотоксины, в частности дезоксиниваленол и его ацетильное производное. Последнее может достигать 4,0 мкг/растение (Сидоров с соавт., 1996). Его роли в патогенезе, специфике и интенсивности токсиногенности штаммов, создании устойчивых сортов растений и другим вопросам посвящено большое количество работ (Львова с соавт., 1990; 1997; Чкаников с соавт, 1997; Монастырский с соавт., 1997; Терехов с соавт., 1998).

Цель работы: Изучение возможности применения биоагентов Fusarium sp. (AF - 967), Trichoderma Hgnorum и Ьппрчмищ ■"т'тчнт мчрргт» Д> - 760

це: ггрллу-'ая

НАУ . . 1 С -ЛГ .ОТЕКА Man:, j -.«адэмии

* • « •'• • Л'зева

и строма в защите яровой пшеницы от основного возбудителя фузарноза колоса — Fusarium graminearum

В соответствии с поставленной целью предусматривалось решить следующие задачи

- Изучить морфолого-культурапьные признаки штаммов патогена Г graminearum, изолятов - антагонистов F sp (AF - 967), Т hgnorum, их скорость роста на питательных средах, распространение фитопдтогснов и их антагонистов на семенах пшеницы,

- Определить антагонистическую активность F sp (AF - 967) к F graminearum и выживаемость гриба F sp (AF - 967) в дерново-подзолистой почве;

- Установить биохимическую природу метаболитов F sp (Ab - 967), антагонистических в отношении F graminearum,

- Оценить токсиногенность штаммов F graminearum,

- Определить микопаразитическую активность Trichoderma Iignorum в отношении F graminearum,

- Определить влияние биоагентов [F sp (AF - 967) и Т Iignorum], биологически активных веществ (Ф — 760, Ф - 1153 и строма) на возбудителя фузариоза колоса F graminearum в лабораторных и полевых условиях

Научная новизна: Впервые изучено влияние биоагентов [Fusarium sp (AF - 967) и Trichoderma Iignorum] и биоцидов (Ф - 760, Ф - 1153 и стромом) на Fusarium graminearum - возбудителя фузариоза колоса пшеницы Биоагенты и сочетание биоцидов существенно снижали степень развития болезни и повышали урожай пшеницы Впервые в длительном (свыше 8-ми месяцев) опыте установлена сохраняемость гриба на внесенном высоком (105 КОЕ/г) уровне в течение 3-х зимних месяцев и постепенное последующее снижение в летний период, независимо от присутствия других грибов Результаты опыта дают основание считать, что гриб может рассматриваться потенциальным интродуцентом в почву Впервые сделана попытка определить природу фитотоксических метаболитов Fusarium sp (AF - 967) в отношении F graminearum при последовательном разделении культурального фильтрата на высокомолекулярную и низкомолекулярную фракции при разных pH (pH 4 0, 6 0, 8 6) с последующей экстракцией этилацетатом и лиофилизацией водного экстракта Отсутствие фитотоксичности у полученных фракций и экстрактов, возможно, связано с тем, что фитотоксичные метаболиты образуются грибом-антагонистом только в присутствии соответствующей мишени

Практическая ценность работы: Результаты исследований указывают на возможность применения биоагентов F sp (AF - 967), Т Iignorum и сочетаний биологически активных веществ (Ф - 760 и строма) в защите пшеницы от фузариоза колоса Оздоравливающее влияние обработок проявляется в период созревания семян новой репродукции и после их хранения в неблагоприятных температурных условиях (при низких

температурах). Это показано при использовании модифицированного экспресс - метода Вейцонга (Weizhong et al., 1997)

Апробация работы: Основные положения диссертации доложены на ; июньской и декабрьской конференциях МСХА им. К. А. Тимирязева в 1999 г.

Публикации: По материалам диссертации опубликованы 5 работ.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (7 глав), выводов и списка литературы. Материал изложен на 126 стр. машинописного текста, содержит 22 таблицы и 30 рисунков. Список литературы включает 172 наименований, в том числе 89 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе 1 дан обзор литературы по рассматриваемой проблеме,

В главе 2 обсуждаются объекты и методы исследований. Исследованы 15 штаммов Fusarium graminearum, выделенных из зерна пшеницы, пораженной фузариозом колоса в годы эпифитотий и в обычные, годы (предоставлены сотрудниками лаборатории микологии ВНИИ зерна), а также 8 штаммов Trichoderma lignorum, выделенные из почв Удмуртии и Московской области (кафедра фитопатологии), и 6 изолятов Fusarium sp. (AF-967), проявивших высокую эффективность на растениях пшеницы, пораженных корневыми гнилями.

Все культуры выращивали на картофельно-глюкозном агаре (КГА) (Стройкой с соавт., 1987), pH 4...7. Для подавления сапротрофных бактерий в среду вносили 1 % стрептомицина (Хохряков, 1979) и молочную или лимонную кислоту (Билай, 1982). Признаки культур оценивали визуально и под микроскопом. Конидии измеряли окуляр — микрометром (Кирай с соавт., 1974). Грибы идентифицировали с помощью определителей (Билай, 1955; 1970; Литвинов, 1967; Rifai, 1969; Helgard, 1980;). Для определения интенсивности спороношения использовали счетную камеру Горяева.

Токсиногенность штаммов F. graminearum определяли по содержанию 4-дезоксиниваленола (ДОН) и его ацетильного производного (АсДОН) в фильтратах культуральной жидкости после 7 суток инкубации на роторной качалке при 220 об/мин и 26 °С, на среде с сахарозой и глицерином.

Методом двойных культур (Hamang, 1977) оценивали антагонистическую активность Fusarium sp. (AF-967) к F. graminearum. Для определения природы метаболитов, обусловливающих антагонистический эффект F. sp. (AF - 967) получали последовательно его культурапьный фильтрат на 5-е сутки, затем осаждали высокомолекулярные компоненты, центрифугировали, из над осадочной жидкости получали этилацетатную и водную фракции и изучали их свойства (рис. 1).

При определении микопаразитической активности Trichoderma lignorum в отношении F. graminearum степень микопаразитизма классифицировали по 4

классам : 0 - нет мнкопаразитизма, (проверяемые организмы стыкуются), + -наблюдается слабый микопаразитизм (5 25 % колонии Я дгагшпсагит охвачены мицелием Т. И^огит), ++ -наблюдается сильный микопаразитизм (25.. 50 % колонии Р ¡ггалипеагшп занято мицелием Т Ьцпогит) и +++ -наблюдается очень сильный микопаразитизм (50 100 % колонии Р угатшеагит оплетены мицелием Т Ь^огиш)

Рис I. Схема изучения фунгитоксических свойств культурального фильтрата гриба Ривапиш 5р (АР - 967) Примечание: ЭА — этилацетатные экстракты, В - водные экстракты, Н - рН 6,0, Щ - рН 8,6, К - рН 4,0

Взаимодействие Р {^апипеапнп с биоцидом (стромом) и небиоцидами (Ф-760 и Ф-1153), изучали в лабораторных условиях на КГА в чашках Петри (оценивали рост изолятов Р цгагтипеагит н их спорулирующую способность)

Выживаемость Р ер (АР - 967) определяли 8 дерново - подзолистой почве отдельно и в сочетании с другими грибами в лабораторных условиях с января 1999 г до августа 1999 г. Грибы вносили в виде суспензии спор в концентрации 106 клеток в 1мл Анализ проводили ежемесячно, определяя КОЕ в 1 г почвы (Теппер с соавт, 1993)

Полевые опыты проводили в 1998...1999 гг на станции защиты растений МСХА; лабораторные - на кафедрах микробиологии и фитопатологии МСХА им. Тимирязева. Почва дерново • подзолистая, легко суглинистая на моренном суглинке, характеризуется средним плодородием; рН 5,5. Содержание гумуса - 3...3.5 % от массы пахотного слоя, подвижных форм (мг/100г почвы): легко гидролизуемого азота (по Тюрину и Кононовой) 4,7...4,9; РзО} (по Кирсанову) 25...30; К20 (по Масловой) 12...17.

Площадь делянок 2 м2, повтори ость 4-кратная, размещение вариантов рендомизированное. Подготовку почвы, расчет доз и внесение удобрений проводили по общепринятой методике для данной зоны. Пшеницу выращивали на одном и том же участке в монокультуре. На каждый 1 м2 высевали 600 всхожих семян.

Схема опыта: 1- контроль (без инокуляции); 2 - обработка посевов Р. ^гапипеапип, штамм 21; 3 - обработка посевов Р. ¡»гаттеагит, шт. 20; 4-обработка р. gFam¡neanml 21 + Р. ер. (А1>967); 5 - обработка Р. ^т'теагит 20 + Р. ер. (АР-967); б - обработка посевов Р. ^пипеагит 21 + Т. Г^погит; 7 -обработка Р. ¿гапипеагит 20 + Т. Ндоогит; 8 - обработка Р. {»гагтпеагит 21 + тнлт-премнум; 9 - обработка Р. ^гшпеагит 20 + тнлт-премиум; 10 -обработка посевов Р. вгаштеагиш 21 + Ф-760 + стром; 11 - обработка Р. вгалипеапип 20 + Ф - 760 + стром; 12- обработка Р. (ггапипеагит 21 + Ф - 760; 13 - обработка Р. ¿гапипеагит 20 + Ф - 760.

Посевы яровой пшеницы (сорт Энита) заражали штаммами Р. {ггапипеагшп в фазу цветения. Титр суспензии 106 спор/мл, норма расхода -25мл/м*. Через 2 дня посевы инокулировалн в соответствии с вариантами опыта: суспензией Р. зр. (АР -967) и Т. (¡¡рюгит (по 10б спор/мл), растворами Ф • 760, Ф - 760 + стром в концентрации, соответственно 1,4 и 5 %, при норме расхода жидкости 25 мл/ м2. Урожай учитывали методом пробного снопа в г/м2, определяли длину и количество колосков в колосе, массу 1000 семян, общую массу зерна с учетной делянки всех вариантов. При определении последействия биологически активных веществ и биоагентов на уровень пораженностн семян возбудителем фузариоза колоса, использовали модифицированную методику й а1 (1997).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морофолого-культуральным признакам всех изученных культур Р. ер. (АР - 967), Р. вгатшеагаш и Т. Ндаогат посвящена глава 3, в которой представлены характеристики всех 29 штаммов (и изолятов).

В главе 4 рассматривается скорость роста грибов как показатель заселения субстрата, распространения в выживаемости в природе.

По скорости роста рассматриваемые грибы всех родов в плане репродуктивной стратегии относятся к г-стратегам, однако по отношению друг к другу, особенно в первые часы их роста Р. $р. (АР - 967) отнесен к к-

стратегам (Звягинцев, 1987) Это наблюдалось как на питательных средах, так и при распространении грибов по семенам пшеницы

При оценке выживаемости грибов в дерново-подзолистой почве было установлено, что количество внесенного F. sp (AF - 967) во всех вариантах (в момент внесения инокулюма) колебалось в пределах 5 10 10 КОЕ / г почвы. Общая тенденция дпя этого гриба во всех вариантах - сохранение внесенного уровня в течение января ..марта; начиная с апреля постепенное снижение в летние месяцы, независимо от присутствия других грибов К летним месяцам несколько увеличилась, в июле достигла максимума численность грибов рода Pénicillium (рис 2) Динамика развития грибов в вариантах, где с F. sp (AF - 967) были внесены F. graminearum (разные штаммы) почти повторяла закономерности варианта, где интродуцирован был только гриб F. sp Особенно это касалось грибов Pénicillium sp, количество которых летом при наименьших численностях фузариумов (и патогенных и непатогенного) резко увеличивалось О доминировании грибов рода Pénicillium в сообществе микромицетов (до 90 % обилия) пишет В Ю. Шахназарова (2000) Судя по нашим данным, пенициллиумы достаточно агрессивны в отношении фузариумов, особенно фузариума. используемого нами в качестве антагониста корневых гнилей и фузариоза колоса Подавления развития грибов рода F graminearum (штаммы 20 и 21) и Bipolaris sorokiniana биоагентом F. sp (AF - 967) также не было отмечено

Совсем иная картина наблюдалась при внесении Т lignorum совместно с биоагентом с F sp (AF - 9*67) и высокоинфекционными фитопатогенами Т lignorum сохраняется в течение всего периода инкубации на высоком уровне, причем численность ее периодически резко возрастает, достигая к апрелю и к августу 25000...27000 КОЕ / г почвы.

Рис 2. Динамика развития Р хр (АН - 967) в нестерильной почве

К тому же мо*но отметить, что Т Ь^погшп доминирует в почве, подавляя развитие всех других гриЬов, и что особенно с;чд>ег отчет п. -

■ Fap(AFS67) BFspp « Р spp О другие гриб

1

(|

пенициллов, проявлявших антагонистические свойства по: отношению к фузариумам. Они тоже не выдержали агрессии со стороны триходермы. Это еще раз подтверждает, что триходерма - одна из лучших биоинтродуцентов. К сожалению, однако, она также снижает и уровень F. sp. (AF - 967).

Вместе с тем наиболее важный вывод из этого опыта - то, что Fusarium sp. (AF - 967) сохраняется в почве на достаточно высоком уровне (несколько снижается, правда) в течение 3...4 мес. Это дает основание считать, что гриб может рассматриваться как потенциальный интродуцент в почву. И хотя в этом опыте не проявилось антагонистической активности F. sp. в отношении грибов-возбудителей гнилей и фузариоза, очевидно, это можно объяснить тем, что он в большей степени корнеобитаемый патоген, чем почвенный.

В главе 5 дана характеристика взаимодействия биоагентов (Fusarium sp. и Т. lignorum) с возбудителем фузариоза колоса Fusarium graminearum.

Первичная оценка штаммов F. graminearum (табл. 1) показала, что самыми сильными продуцентами (по суммарной концентрации) ДОН и АсДОН, являются штаммы F20 из Канады и F24 из Краснодарского края, они продуцировали значительно больше микотоксинов, чем другие штаммы, выделенные не в эпифитотийные годы. Все штаммы F. graminearum подразделены на 3 группы по токсиногенности (табл. 1)

Таблица 1

Токсиногенность штаммов Fusarium graminearum

Штаммы Биомасса гриба, г/л Концентрация, мг/л Сумма токсинов мг/г гриба

дои Ас ДОН Сумма ДОН+ АсДОН

F. gram. 20 6.8 41.8 438.7 480.5 70.7

F. gram. 24 9.7 38.8 398.1 436.9 45.0

F. gram. 25 12.8 9.8 323.1 332.9 26.0

F. gram. 19 13.1 32.3 247.7 280.0 21.4

F. gram. 1 8.2 13.5 2.06.4 219.9 26.8

F. gram. 23 10.0 7.5 190.7 198.2 . 19.8

F. gram. 3 7.3 5.9 96.9 102.8 14.1

F. gram. 21 8.9 0.0 30.7 30.7 3.4

F. gram. 2 11.8 0.3 9.6 9.9 0.8

F. gram. 22 10.4 0.4 3.2 3.6 0.3

F. gram. 4 11.1 0.0 2.6 2.6 0.2

F. gram. 5 6.8 0.0 2.3 2.3 0.3

F. gram. 26 6.9 0.0 2.1 2.1 0.3

1. Самые сильные (мг/г): F20 (70.7), F24 (45); 2. Средней токсиногенности: F25 (26), F19 (21.4), Fl (26.8), F23 (19.8), F3 (14.1); 3. Слабой токсиногенности: F21 (3.4), F2 (0.8), F22 (0.3), F5 (0.3), F26 (0.3), F4 (0.2).

Следует заметить, что АсДОН накапливалось значительно больше, чем

ДОН.

При изучении взаимодействия Т. lignorum и F. graminearum методом встречных культур наиболее сильным. микопаразитическим эффектом характеризовался штамм триходермы Т8. В пяти случаях мицелий фузариумов (штаммы F3, F21, F22, F25, F26) полностью был покрыт мицелием триходермы, в 4-х наполовину (Fl, F2, F4, F20), в остальных эффект паразитизма был незначительным. Способность паразитирования Т. lignorum на гифах F. graminearum на 10-е сутки показана в табл. 2.

Менее сильным микопаразитическим эффектом обладали штаммы триходермы Т13, Т14 и Т9, ещё меньше остальные. Наиболее сильно был угнетен триходермой штамм средней токсиногенности F3 (полностью на нем паразитировали два штамма Т8 и Т13 и наполовину - четыре Т7, TI 1, Т12 и Т14). На рис. 3 показана степень антагонистического действия Т. lignorum в отношении F. graminearum. Последние стадии гибели гриба F. graminearum под действием Т. lignorum видны на рис. 4, 5.

Таблица 2

Микопаразитизм штаммов Trichoderma lignorum в отношении Fusarium graminearum на 10-е сутки

Штаммы Tr 7 Tr 8 Tr 9 Tr 10 Tr 11 Tr 12 Tr 13 Tr 14

F. gram. 1 0 + + + + + + + + +

F. gram. 2 + + + + + + + + + +

F. gram. 3 + + + + + + 0 + + + + + + + +

F. gram. 4 + + + + + + + + 0 0 + + + + + +

F. gram. 5 + + + + + + + + + + + +

F. gram. 19 + + + + + 0 + +

F. gram. 20 + + + + + + + + + + + 4- + + + + +

F. gram. 21 + + + + + 0 + 0 + + +

F. gram. 22 + + + + + + + + + + + + + + +

F. gram. 23 0 + + + + + + + +

F. gram. 24 + + + + + + + + + +

F. gram. 25 + + + + + + + + -H- +

F. gram. 26 + + + + + + + + 0 + + + +

Примечание: +++ - сильный микопаразитизм (штамм триходермы полностью покрывает штаммы фузариума) ++ - штаммы фузариума покрыты наполовину;

+- - незначительный микопаразитизм; 0- микопаразитизма нет - колонии грибов смыкаются при встрече.

Сильный продуцент микотоксинов F20 оказался менее стойким к триходерме, чем F24 (штамм из Краснодарского края). Поскольку штаммы фузариумов разной степени токсиногенности (F20, F22, F5, F2, F25, F24 и F6) испытывали достаточно сильное угнетение со стороны различных штаммов триходермы, можно предполагать, что штаммовые особенности как биоагента так и биомишени, играют важную роль во взаимодействии, их необходимо учитывать при создании биопрепарата. Возможно следует принять путь создания мультибнопрепарата на основе ассоциации живых культур биоагента, поскольку это обеспечит ему более широкие адаптационные возможности в природных условиях, чем монокультура.

Во встречных культурах на КГА на 7-е сутки установлено, что штаммы F. graminearum развиваются быстрее, чем F. sp. (AF -967). Что касается антагонистического влияния разных изолятов F, sp, на штаммы F. graminearum на 7-е сутки, можно сделать заключение, что наибольшей активностью характеризовался исходный изолят F. sp. а в отношении практически всех штаммов F. graminearum - размер зоны подавления варьировал в пределах 2,7...4,7мм. Изоляты F. sp. d, F. sp. e, и F. sp. f были либо индифферентны по отношению к ряду F. graminearum (F. gr.3, 4, 20, 1, 2, 5, 23), либо занимали среднее положение (табл. 3).

Таблица 3

Антагонистическая активность изолятов гриба Fusarium sp.(AF - 967) по отношению к штаммам Fusarium graminearum (средний размер зоны подавления на 7-е сутки, мм)

Штаммы F. sp. а F. sp .b F. sp .c F. sp. d F. sp. Б F. sp.f

F. gram. 1 3,3 2,0 2,0 2,3 0,0 1,3

F. gram. 2 3,7 2,7 3,3 1,7 0,0 1,7

F. gram. 3 3,3 1,3 1,3 0,0 1,0 1,7

F. gram. 4 2,7 1,0 0,0 0,0 1,3 1,0

F. gram. 5 3,7 2,0 2,0 1,7 0,0 1,3

F. gram. 19 3,3 1,0 1,7 2,6 1,7 2,0

F. gram. 20 2,7 1,3 3,0 0,0 1,7 0,0

F. gram. 21 4,7 1,7 2,3 1,7 2,0 1,7

F. gram. 22 2,7 1,7 1,7 1,3 1.7 2,0

F. gram. 23 3,7 2,0 2,3 2,3 0,0 1,7

F. gram. 24 3,3 1,3 1,0 2,0 1.0 1,0

F. gram. 25 2,7 2,3 1,7 1,7 2,0 2,0

F. gram. 26 4,3 2,7 1,7 2,7 1,3 1,0

Поскольку доминирующую роль во всех случаях играли штаммовые особенности микопартнеров, надо полагать, что интродуцкруемые популяции антагониста, в первую очередь, должны быть гетерогенными, поскольку они практически заново устанавливают трофические связи в уже сложившихся

экосистемах и должны обладать высокой конкурентной и адаптивной способностями, чтобы занять соответствующую экологическую нишу.

Рис. 3. Характер взаимодействия Trichoderma lignorum и Fusarium graminearum: О - отсутствие взаимовлияния, + - слабый микопаразитизм, ++ - сильный микопаразитизм, +++ - очень сильный микопаразитизм

Рис. 4. Микопаразитизм Т. Нцпогит на гифах Р. цгаттеагит. Четко видно, что гифы Т. Ицпогшп оплетают гифы Р. gramineaгum (х 400)

Рис 5 Гифы Т hgnorum полностью лизируют гифы F graminearum, оплетая его мицетий (х 1200)

В главе 6 обсуждаются результаты выявления природы фунгитоксических метаболитов F sp (AF - 967) в отношении F graminearum

Поскольку грибы на питательных средах могут выделять экстрацеллюлярные вещества высокомолекулярной и низкомолеку ирные природы сначала была проведена их проверка на фунгитоксичность

Результаты были отрицательными Далее ми применили схему (put I) выделения возможного активного вещества из к vn,iyp ыьного фильтр rra (К'Ф)

Согласно этой схеме КФ - жидкость бчедно-ро юного цвета (рН 7,5 ) был разделен на 4 образца по 250 мл в каждый Первый обр-пен - контроль был тиофилизирован до сухою остатка Второй - до во шли 6и 11С. I m pli 60 (раствор розово-желтого цвета), третий подшелачивыи lu NaOH до рН .4 6 (раствор светло-фиолетового цвета), четвертый - подкисляли 6н MCI до рН 4 0 (раствор желтого цвета) Все образцы жстрагировали угил.тст поч в соотношении 1 1 Кочбы с образцами инкубировали на качалке IX ч мри 4 С Затем этил шетатный спои отделяли от водною делительном воронком (водный слои бесцветен) Для удаления остаточной влаги добавляти в koiôv прокаленный безводный N'a SOj Водные остатки (В) шофилишрои lui H 16 нодения и ростом i рибов проводили ежедневно в течение 5 суток

В результате ис-u-e ювании установлено что суммарный шофинпаг к\ 1ьгурального фильграга гриба fusarium ьр и суммарная фракция •ысокомо 1екупярных веществ к> ¡ьтлралыюго филырата ipnt>a Fusanum чр ij vhi истатнческои актннноеню ut. i бпа^али >1илаиотагная и во тая J ,ин|,ии к\ 1ьтуральнчю ifnibipira ipn6i Fusariurn sp при рН 5 0 S,6 и о 0 ij мнистатнческой актинноеп к) не i oiaia.ni

' toAHo предпочагаи чго жеграцел-цолярные i^iiterBi i fp uvioiuue n\ пи интима при iotmuiiium п гмнированин ipn<>i I iciiium чр и 1 ¡1 mine mi il ьылелчкггея ю то при кшоч bwhmiucimiiiii mi\ грибоп u i о m nui щ инд\пир\1 ir t че-i toiMiiMiil imitait m

В главе 7 рассматриваются опыты совместного применения F. sp., Т. lignorum и биологически активных веществ в отношении F. graminearum. Изучаемые штаммы F. graminearum на питательных средах, содержащих различные биологически активные вещества, вели себя по-разному. Наименьшей скоростью роста на средах с Ф-760 отличался изолят F. graminearum 19. Скорость роста гриба во все дни учета в 1,6 раза была меньше, чем штаммов F. graminearum (4,20,21,24).

Учёт спорулирующей способности штаммов F. graminearum на средах с биологически активными веществами (табл. 4) свидетельствует о значительном снижении спорообразования у всех штаммов. На средах, со стромом и Ф - 760 количество спор у всех штаммов было в 3...5 раз меньше, чем в контроле. Препарат Ф - 1153 оказывал меньшее влияние на спорообразование. Логично предположить, что защитный эффект при использовании биологически активных веществ (стром, Ф - 760 и Ф - 1153) против фузариоза колоса может быть усилен способностью этих веществ индуцировать устойчивость стимулирующим воздействием на иммунную систему растений.

Таблица 4

Влияние биологически активных веществ на спорообразование (число спор в мл) Fusarium graminearum (на 14-е сутки)

Штаммы Контроль Стром 50 г/л Ф-1153 14 г/л Ф-760 14 г/л

F. gram. 4 15.8xl05 5.4 xlO5 11.0 xlO5 4.1 xlO5

F. gram. 19 6.3 xlO5 2.5 xlO5 3.7x105 2.4 xlO5

F. gram. 21 27.5 xlO5 5.3 xlO5 . 11.0 xlO1 4.6x10''

F. gram. 24 21.0 xlO5 5.1 xlO5 12.6xl05 4.5x105

F. gram. 20 13.2 xlO5 4.3 xlO5 9.0 xlO5 4.3 x)05

Обнаруженные свойства препаратов, возможно, непосредственно найдут отражение в практической стороне защиты зерновых культур от вредоносной болезни.

Б полевых опытах реакция штаммов Р. gramiлearum 20 н 21 на биопрепараты [Т. ^погит н Р. б р. (АР- 967)] была примерно одинаковой'. Снижение пораженное™ растений фузариозом колоса в вариантах с штаммами Р. gгam¡nearum 20 и Р. graminearum 21 от обработки зараженных колосьев суспензиями спор грибов-антагонистов ТпсЬос1егта ^погит и Р. Бр. (АР- 967), составляло соответственно, 6,5...10,2 % и 2,0...4,4 %. Равная эффективность в снижении пораженное™ фузариозом колоса (штамм 20) получена от применения биологически активных веществ Ф - 760 и Ф - 760 + стром. Различия в пораженности больных растений в сравнении с контрольным вариантом (заражение без обработки биоагентами) составили 5,5...7,2 %. В вариантах со штаммом Р. £гаггппеагит 21 эти показатели примерно в 2 раза были больше (14,1...16,6 %). Следует отметить, что полученная эффективность в защите яровой пшеницы от фузариоза колоса от

использования биоагентов и биологически активных веществ несколько ниже, чем от применения пестицида (тилт-премиум), однако достигаемая при этом защита окружающей среды от загрязнения несомненна. Применение биологически активных веществ и биопрепаратов наряду с улучшением фитосанитарного состояния посевов способствовало / улучшению структурных элементов и общей продуктивности растений яровой пшеницы. В вариантах опыта, где посевы обрабатывали суспензий спор Р. $р.(АР -967),Т. Н^огит и стром + Ф — 760 показатели продуктивности количество колосков в колосе, масса 1000 семян и урожай достоверно превышали аналогичные показатели варианта с заражением.

Применение фунгицида не снимает полностью проблемы фузариоза колоса, хотя степень зараженности посевов болезнью была несколько меньше, чем в вариантах с биопрепаратами и биологически активными веществами. Продуктивность была выше по сравнению с контролем на 34,5...34,9 (табл. 5, 6).

Таблица 5

Эффективность применения биологически активных веществ и биопрепаратов в защите яровой пшеницы (сорт Энита) от фузариоза колоса (штамм Р.дгаттеагшп-20) в мелкоделяночных полевых опытах.

Варианты опыта Степень развития болезни % Длина колоса, см Количество колосков в колосе Масса 1000 семян, г Урожай, г/мг Прибавка урожая

г/м2 %

Контроль (без заражения) 11,6 8,3 15,7 35,4 301,0 - -

Контроль (с заражением) Р. gr. штамм 20 27,0 7,9 14,4 32,4 287,0 0,0 | 0,0

Я 0Г.2О + К.эр. (ДР-967) 22,6 8,7 15,1 33,6 396,0 109,0 38.0

И. gг.20 + Т. Пкпогит 16,8 8,7 16,1 33,7 388,0 101,0 35,2

ег.20 + Ф-760 21,5 7,9 14,4 33,0 340,0 53,0 18,5

Р. ^.20 + стром + Ф-760 19,8 8,5 15,2 34,5 344,0 57,0 20,0

К ёг.20 + ТИЛТ премиум 5,4 8,6 16,0 35,3 387,0 100,0 34,9

НСР (0.05) 3,13 0,56 0,74 1,63 14,95 23,5 |5,72

Данные этих опытов позволяют считать штамм Р. ^агшпеагит 21 более агрессивным по сравнению со штаммом р. §гагшпеагит 20. Обработка посевов яровой пшеницы в период цветения суспензиями спор Р. эр. (АР -760) и Т. Н^огит, а также биологически активными веществами Ф - 760 и Ф -760 + стром существенно снижала пораженность посевов фузариозом колоса (до 16,6 %) по сравнению с контролем (с заражением). При этом продуктивность растений увеличивалась на 18,5...38 %.

Таблица 6

Эффективность применения биологически активных веществ и биопрепаратов в защите яровой пшеницы (сорт Энита) от фузариоза колоса (штамм Р.®гаттеагит-21) в мелкоделяночных полевых опытах.

Варианты Опыта Степень развития болезни % Длина колоса, см Количество колосков в колосе Масса 1000 семян, г Урожай, Г/м2 Прибавка урожая

т/и1 %

Контроль (без заражения ) 11,6 8,3 15,7 35,9 301,0 - ■ -

Контроль (с заражением^ иггамм 21 33,7 7,8 13,5 31,6 250,0 0,0 0,0

Р^г. 21 + Г.5р. (АР-967) 31,7 8,9 15,2 32,9 319,0 69,0 27,6

К ¡рт. 21 + Т. Прпогит 27,2 8,6 14,7 35,6 324,0 74,0 29,6

Р.ЕГ.21 + Ф-760 19,6 8,3 15,0 32,3 310,0 60,0 24,0

l - .gr. 21 +■ стром + Ф-760 17,1 8,5 15,3 34,1 316,0 66,0 26,5

^.21 + ТИЛТ премиум И,0 8,2 15,1 33,5 336,0 86,0 34,5

НСР (0.05) 3,13 0,54 1,08 2,29 19,63 18,8 8,18

При оценке последействия биологически активных вешеств и биоагентов на уровень пораженности семян новой, репродукции возбудителем фузариоза колоса, проведенной в лабораторных условиях по методу Вейцонга (\Veizhong е1 а1, 1997) в нашей модификации, было проведено

тестирование степени пораженности семян пшеницы новой репродукции штаммами F. graminearum 20 и 21. Степень пораженности мы разделили на 3 условных класса, к которым и соотносили результаты опыта. Наибольшей степенью пораженности характеризовался класс III (51...100 %), класс II включал 11...50 % пораженных семян, класс I всего от 0 до 10 %,

В контроле (без заражения F. graminearum) [и в I классе] в случае заражения штаммами . 21 (табл. 7) и 20 (табл. 8) в основном, преобладали здоровые семена. Практически не было пораженных семян и при обработке фунгицидом (тилт-премиум) после обработки возбудителями фузариоза.

Данные, представленные в табл. 7 показывают, что обработка посевов антагонистами F. sp. (AF - 967), Т. lignorum, биологически активными веществами и фунгицидом после заражения F. graminearum (21) снижала пораженность поверхности семян во всех вариантах опыта.

В табл. 7 и 8 показано, что искусственная инокуляция пшеницы в фазе цветения штаммом F. graminearum 20 и штаммом 21 вызывала увеличение степени пораженности семян новой репродукции возбудителем фузариоза колоса. В зависимости от условно принятого класса пораженности по отношению к числу пораженных семян контроля число пораженных семян увеличивалось в 1,3... 3,0 раза.

Таблица 7

Влияние обработки посевов грибами - антагонистами, биологически активными веществами и фунгицидом на степень пораженности семян F. graminearum (штамм 21)

Варианты опыта Здоровые семена, % Пораженные семена, %

0...10% класс I И...50% класс II 51...100% класс III

Контроль (без заражения) 70 5 15 10

F. gram. 21 (i) 40 15 20 25

i + F. sp. (AF-967) 65 10 16 9

i + T. lignorum 75 7 12 6

i + тилт - премиум 77 4 11 8

i + стром + Ф-760 65 8 16 11

i + Ф-760 60 9 17 14

Таблица 8

Влияние обработки посевов грибами — антагонистами, биологически активными веществами и фунгицидом на степень пораженности семян , Р.$ггагшпеагит (штамм 20)

Варианты опыта Здоровые семена, % Пораженные семена, %

0...10% класс I 11...50% класс II 51.„100% класс III

Контроль (без заражения) 70 5 15 10

Б. вгат. 20 (И) 47 10 13 30

и + Р. ер. (АР-967) 60 9 20 11

и + Т. Н^догит 65 6 19 10

и + тилт- премиум 62 7 19 12

¡Н- стром + Ф-760 60 7 20 13

¡¡ + Ф-760 59 9 17 15

Итак, этот опыт показал, что применение биоагентов и биологически активных веществ оказывает оздоравлнвающее влияние на растение не только в период их созревания, но и на семена новой репродукции.

Проверка этого эффекта экспресс-методом Вейцонга дает возможность отобрать лучшие биоагенты и их сочетания для рекомендации в практику.

При определении всхожести семян установлено, что обработка посевов антагонистами Р. яр. (АР- 967) и Т. Н^огит, а также . биологически активными веществами после заражения посевов Т. (дгаттеагит (21 и 20) существенно повышала процент всхожести семян (табл. 9).

Самый высокий процент всхожести был получен при обработке Т. Н{>погшп (95 %) в случае заражения Р. дгатшсагат (штамм 21) и фунгицидом (95 %)в случае заражения Р. |*гагтпеагит (штамм 20). Наименьшая всхожесть (88,3 %) получена в варианте с применением Ф - 760. Практически различий между вариантами опыта не выявлено. Средняя масса надземной части всходов существенно превышала соответствующий показатель контрольного варианта с заражением Г. $*гагтпеагит (штаммы 20 и 21).

Таблица 9

Влияние последействия антагонистов, биологически активных веществ и фунгицида используемых в защите от возбудителей фузариоза колоса, на всхожесть семян и среднюю массу надземной части всходов

Р. £^агшпеагит(21) Р йгаттеагит(20)

Варианты опыта Всхожесть Средняя масса надземной Всхожесть Средняя масса надземной

(%) части всходов, г/10 шт (%) части всходов, г/10 шт.

Контроль (без заражения) 98,0 2,5 98,0 2,8

И. дришпеагит (контроль с 75,8 2,0 86,5 2,5

заражением )

+ И. эр (АР-967) 94,2 2.1 90.0 2,6

+ Т. 11£»ПОГиЛ1 95,0 2.4 92.5 2,8

+ тилт — премиум 93,3 2.3 95,0 3,0

+ Стром + Ф-760 92,5 2,1 89,6 2,6

+ Ф-760 88,3 2,1 88,3 2.5

НСР 0,05 6.0 0,24 6,25 0,27

ВЫВОДЫ

1 Приведена характеристика морфолого-культуральных признаков и структур (микро- и макроконидии, хламидоспоры) популяций 15-ти штаммов И. {^апипеагшп, 6-ти изолятов Ризалит эр (АР - 967) и 8-ми -ТпсЬос1егта П^огит.

2. Дана оценка скорости роста грибов на питательных средах и распространения фятопатогенов и их антагонистов на семенах пшеницы В плане репродуктивной стратегии Р. ер (АР - 967) отнесен к к-стратегам по сравнению с г-стратегами - грибами других родов и видов

3 Интродуцируемый в почву Р эр (АР - 967) сохраняется на высоком уровне в течение 3 мес Это позволяет рассматривать его как потенциальный интродуцент.

4 Установлено, что штаммы Р ртттеагит различны по степени токсиногенности Наибольшее количество 4-дезоксиниваленола (ДОН) и его ацетильного производного (АсДОН) синтезировали штаммы, выделенные из зерна, выращенного в Канаде и Краснодарском крае в годы эпифитотии

5. Для Т. Н^огиш в отношении грибов Р. ^агшпеагшп обнаружено 3 вида микопаразитизма: слабый, сильный и очень сильный микопаразитизм. Штамм триходермы Т8 характеризовался наиболее сильным микопаразитическим эффектом и наиболее широкий спектром действия.

6. Среди изолятов Р. эр. (АР — 967) наибольшую антагонистическую активность в отношении Р. £хагтпеагит проявил исходный изолят "а". На 7-е сутки инкубации размер зоны подавления варьировал в пределах 2,7...4,7 мм практически для всех штаммов патогена.

7. При выявлении природы фунгитоксических метаболитов Р. ер. (АР - 967) в отношении Р. . (*гаттеагит оказалось, что суммарный лиофилизат культурапьного фильтрата (КФ) гриба Р. $р. (АР - 967) и суммарная фракция высокомолекулярных веществ КФ этого гриба фунгистатической активностью не обладала. Не обнаружена фунгистатическая активность и у этилацетатной и водной фракции КФ гриба Р. ер. при рН 4,0, рН 6,0 и рН 8,6. По видимому, экстрацеллюлярные вещества, образующие зоны антагонизма при совместном культивировании Р. эр. и Р. ¿ггатшеагшп выделяются только при взаимодействии этих грибов и индуцируются метаболитами последнего. -.-'-'

8. При изучении взаимодействия биологически активных веществ (строма, Ф - 760, Ф - 1153) с возбудителем фузариоза колоса Р. {^гагтпеагит в лабораторных условиях установлено, что стром и Ф-1153 обладали небольшим фунгитоксическим эффектом, снижая скорость роста гриба на ; 20...25 %. Стром и Ф -760 ингибировали процесс спорообразования Р. ' ¡уаггипеагит (количество спор у всех штаммов снижалось в 3...5 раз).

9. Биологически активные вещества и биопрепараты обеспечивали защиту яровой пшеницы от фузариоза колоса (снижение зараженности составляло до 10,2 %) и прибавку урожая на 38 %. Наилучший эффект получен от применения Т. П^огит, Р. ер. (АР - 967) и тилт-премиума (фунгицида).

Ю.Обработка посевов биологически активными веществами и биопрепаратами оказывала оздоравливающее влияние на растения не только в период их онтогенеза, но и на семена новой репродукции. Показатели всхожести и массы надземной части растений соответствующих вариантов превосходили показатели контрольного варианта с заражением Р. ¡^гагтпеагит: 88,3 ...95,0 % против 75,8 % в зараженном контроле.

11 .Наибольший эффект снижения пораженное™ посевов яровой пшеницы фузариозом колоса достигнут при обработке посевов в период цветения суспензиями спор Т. Кропил, Р. 5р. (АР - 967), сочетанием строма и Ф -760 и особенно при применении фунгицида тилт-премиума. Однако преимуществом биоагентов и биологически активных веществ перед фунгицидом является их биологическая природа.

По теме диссертации опубликованы следующие работы

1 Хашем М, Шильникова В К, Шкаликов В. А, Соколова Г Д , Львова JI. С Взаимодействие некоторых биоагентов с возбудителем фузариоза колоса// Известия ТСХА, 1999, вып, 4, с 116 122

2 Хашем М Влияние биологически активных веществ на рост и споруляцию изолятов Fusarium grammearum// Деп Рукопись, объем 4 стр", № 116/28 вс -1999.

3 Хашем М. Биологические связи гриба Fusarium grammearum Schwabe с Fusarium sp (FA - 967) и Trichoderma lignorum// Деп Рукопись, объем 6 стр,№ 116/29 вс-1999

4 Хашем М Использование биометода в защите пшеницы от фузариоза колоса//Науч конф декабрь 1999, М , изд МСХА

5 Чернышов Р В, Хашем М Антагонизм гриба Trichoderma lignorum к Fusarium grammearum// В сб студ научн работ, вып 5, М, изд МСХА, 1999, с 76 79

Объем 1,25печ. л._Зак. 32Р_Тираж 100 экз.

Типография Издательства МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул., 44