Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метод видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Метод видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени"

и

004613151

Щербаков Дмитрий Николаевич

МЕТОД ВИДОСПЕЦИФИЧНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ОРТОПОКСВИРУСОВ НА ОСНОВЕ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

03.01.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

18 НОЯ 2010

Кольцово - 2010

004613151

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Щелкунов С.Н.

Официальные оппоненты

Ведущая организация

Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск).

Защита состоится 03 декабря 2010 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета при ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан 02 ноября 2010 г.

доктор биологических наук, Карпенко Л.И. доктор биологических наук, Тикунова Н.В.

Ученый секретарь диссертационного совета

Трошкова Г.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Группа патогенных для человека ортопоксвирусов принадлежит к роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae и включает в себя такие вирусы, как вирус натуральной оспы (VARV), вирус оспы обезьян (MPXV), вирус оспы коров (CPXV) и вирус осповакцины (VACV). Входящие в эту группу виды морфологически тождественны, близки антигенно и иммунологически и в то же время разительно отличаются друг от друга по спектру их патогенности, контагиозности вызываемой инфекции и другим показателям

В 1980 году, после многолетней борьбы, ВОЗ официально декларировала ликвидацию натуральной оспы. Это событие стало эпохальным. Впервые была полностью прекращена трансмиссия вируса Были уничтожены хранилища этого вируса во всех странах мира, за исключением России и США. Из-за прекращения вакцинации население всех стран мира в возрасте до 30 лет не имеет иммунитета ни против натуральной оспы, обусловливаемой VARV, ни против других ортопоксвирусных инфекций человека. А люди старшего возраста, ранее вакцинированные против оспы, имеют ослабленный иммунитет против ортопоксвирусных инфекций, и с каждым годом человечество становится все менее защищенным от них. По-видимому, именно поэтому в последние годы появляется все больше сообщений о вспышках заболеваний людей, вызванных зоонозными вирусами MPXV, CPXV и VACV-like в разных странах. Обсуждается возможность появления VARV-like вируса в результате естественной эволюции существующих зоонозных ортопоксвирусов, или применение VARV в качестве агента биотерроризма.

Для предупреждения угрозы перехода локальных вспышек ортопоксвирусных инфекций в распространенные эпидемии необходимо иметь быстрые и точные методы видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека. Существующие морфологические, биологические и серологические методы не подходят для целей быстрой видоспецифичной диагностики.

Наиболее подходящим методом для экспресс идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, может быть ПЦР в реальном времени. На основе этого метода создан ряд методик для родоспецифичной идентификации и

LS

дифференциации одного из видов ортопоксвирусов. Коммерчески доступной является тест-система для исследовательских целей для родоспецифичного выявления ортопоксвирусов с последующей дифференциацией анализом температуры плавления вируса натуральной оспы. Однако метод одновременной дифференциации УАЛУ, МРХУ, СРХУ и УАСУ в одной реакционной смеси до сих пор не создан.

На основе углубленного анализа современных данных о нуклеотидных последовательностях ортопоксвирусов, нами в данной работе выявлены видоспецифичные районы ДНК ортопоксвирусов и разработана простая и надежная методика одностадийной экспресс идентификации четырех видов ортопоксвирусов, патогенных для человека, основанная на применении мультиплексной полимеразной цепной реакции (МПЦР) в реальном времени. Цель и задачи исследования

Цель работы: Разработка одностадийного метода видоспецифичной идентификации четырех патогенных для человека ортопоксвирусов - вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины - на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• На основе компьютерного анализа геномных ДНК ортопоксвирусов выбрать олигонуклеотидные праймеры и гибридизационные зонды, обеспечивающие в мультиплексной ПЦР в реальном времени видоспецифичную детекцию ортопоксвирусных ДНК.

• Оптимизировать параметры МПЦР в реальном времени с учетом выбранных олигонуклеотидных праймеров и зондов.

• Для диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов сконструировать положительный контроль методики МПЦР в реальном времени на основе клонированных специфичных ДНК-ампликонов.

• Определить основные аналитические и диагностические характеристики разработанной методики видоспецифичной диагностики патогенных для человека ортопоксвирусов методом МПЦР в реальном времени.

Научная новизна и практическая значимость работы

1. Впервые осуществлен выбор олигонуклеотидных праймеров и гибридизационных зондов для детекции и дифференциации четырех патогенных для человека видов ортопоксвирусов: VARV, MPXV, CPXV и VACV.

2. Впервые разработан метод видоспецифичной экспресс диагностики вируса оспы коров на основе ПЦР в реальном времени, учитывающий все новейшие данные по структуре генома ортопоксвирусов и проверенный на ДНК 29 штаммов различных видов ортопоксвирусов.

3. Показана эффективность видоспецифичной экспресс диагностики вируса оспы коров на основе ПЦР в реальном времени при анализе клинического материала -легких, селезенки, печени и крови мышей, зараженных интраназально CPXV штамм GRI-90.

4. Впервые разработан метод видоспецифичной экспресс диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, использующий одностадийную МПЦР в реальном времени.

5. Показана эффективность использования МПЦР в реальном времени при анализе клинического материала: корочек с кожных поражений людей, болевших в 1970-1975 г. натуральной оспой; корочки с кожного поражения человека, образовавшейся после вакцинации штаммом ЛИВП VACV в 2000 г.; образцов легких, селезенки, печени и крови мышей, зараженных интраназально CPXV штамм GRI-90; образцов крови, селезенки, легких, печени, смыва рта и пустулы сурков, зараженных MPXV штамм CDC#v79-I-005.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод видоспецифичной детекции вируса оспы коров на основе ПЦР в реальном времени. Метод, в условиях проведенных экспериментов (на приборе Applied Biosystems 7500), имеет следующие характеристики:

аналитическая чувствительность, определенная при помощи

рекомбинантной плазмиды, содержащей видоспецифичный район CPXV: 6-60

копий/реакции.

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи препарата

полноразмерной ДНК CPXV: 2-20 копий/реакции.

• диагностическая чувствительность - 100 %;

• диагностическая и аналитическая специфичность - 100 %.

2. Метод, позволяющий в одну стадию мультиплексной полимеразной цепной реакции в реальном времени детектировать и дифференцировать четыре вида ортопоксвирусов, патогенных для человека: вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины. Метод, в условиях проведенных экспериментов, имеет следующие характеристики:

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи рекомбинантных плазмид, содержащих видоспецифичные районы OPV: VARV - 2-20 копий/реакции,

MPXV - 2-20 копий/реакции, CPXV - 5-50 копий/реакции, VACV - 7-70 копий/реакции.

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи препаратов полноразмерной ДНК OPV:

CPXV - 2-20 копий/реакции, VACV - 9-90 копий/реакции.

• диагностическая чувствительность - 100 %;

• диагностическая и аналитическая специфичность -100%. Апробация работы и публикации

По материалам диссертации опубликованы 1 статья в реферируемом научном журнале, получен патент РФ. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: International life sciences student's conference, Kyiv, Ukraine 2009 (Ukraine, Kiev, 2009); Актуальные проблемы природной очаговости болезней (Омск, 2009); Медицинская геномика и протеомика (Новосибирск, 2009). Вклад автора

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей и поиск видоспецифичных районов геномов VARV, MPXV, CPXV и VACV выполнен автором при участии Гавриловой Е.В. и Максютова P.A. Разработка метода диагностики и конструирование положительного контроля методики МПЦР на основе клонированных специфичных ДНК-ампликонов выполнены лично автором. Эксперимент по интраназальному заражению мышей проводился совместно с

Кочневой Г.В. и Гражданцевой A.A. Заражение сурков вирусом оспы обезьян и выделение препаратов вирусной ДНК проводилось в лаборатории 4-го уровня биобезопасности ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Булычевым J1.E. и Бодневым С.А. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы (170 ссылок). Работа изложена на 108 страницах, содержит 11 таблиц и 19 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Выбор олигонуклеотидных праймеров и гибридизационных зондов для видоспецифичной мультиплексной ПЦР в реальном времени

Задачей первого этапа работы являлся поиск олигонуклеотидных праймеров и гибридизационных олигонуклеотидных флуоресцентномеченых зондов для ПЦР в реальном времени, обеспечивающих амплификацию вирусных ДНК и видоспецифичную гибридизацию олигонуклеотидных зондов, формирующих флуоресцентный сигнал в ПЦР реальном времени, характерный для каждого вида ортопоксвируса. Для этого были выровнены ранее опубликованные последовательности ДНК 85 различных штаммов ортопоксвирусов: натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины, оспы верблюдов, эктромелии. На основании полученных данных были выявлены видоспецифичные районы геномов вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины.

Геном ортопоксвирусов состоит из высоко консервативной центральной области, занимающей около 50 % генома, и вариабельных концевых районов, состоящих из концевых инвертированных повторов (TIR - Terminal Inverted Repeats) и уникальной неповторяющейся последовательности.

В центральной части генома находится большая часть жизненно важных генов вируса. Вариабельные концевые районы содержат гены, несущественные для жизнеспособности вируса, но важные для проявления таких свойств вируса, как круг хозяев, вирулентность и др. Именно вариабельными концевыми районами генома определяются основные видоспецифичные отличия ортопоксвирусов. Наибольшее число уникальных видоспецифичных районов характерно для CPXV. Так, в левой

части генома CPXV-GRI-90, сразу за TIR, начинается последовательность, кодирующая 11 потенциальных ОРТ (с D6L по D14 и C2L, C3L) и не имеющая аналогов у VARV, MPXV, VACV. В правой части генома CPXV-GRI-90 наблюдается схожая картина.

Для вирусов натуральной оспы и оспы обезьян, как и для вируса осповакцины, не было найдено уникальных районов, отличия обнаруживались на уровне видоспецифичных делеций/инсерций, тем не менее, анализ таких областей позволил выявить потенциальные участки для видоспецифичной гибридизации олигонуклеотидных зондов.

На рисунке 1 представлена общая схема, иллюстрирующая локализацию выбранных видоспецифичных районов на геномной ДНК четырех патогенных для человека ортопоксвирусов. Как можно видеть на приведенной схеме, часть отобранных районов располагается в центральной консервативной, а часть в концевых вариабельных областях ортопоксвирусного генома.

Для каждого выбранного района, используя программу «Oligo», мы рассчитали олигонуклеотидные праймеры и гибридизационные зонды для ПЦР в реальном времени. Последовательности пар праймеров, районы генома, в которых они были выбраны, и флуоресцентные красители, которые были конъюгированы с олигонуклеотидными зондами, представлены в таблице 1.

Предполагаемые пары праймеров затем анализировали на наличие гомологии/комплементарности между собой и со всеми имеющимися известными последовательностями в базах данных NCBI, используя программу BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Отсутствие гомологии с другими видами ортопоксвирусов и родами поксвирусов, а также со всеми другими имеющимися последовательностями, являлось одним из критериев отбора олигонуклеотидов.

Разработка метода видоспецифичной детекции вируса оспы коров на основе ПЦР в реальном времени

За последние годы в странах Европы отмечается увеличение числа зарегистрированных случаев заболевания людей оспой коров.

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80т.п.н.

Ш М1Ь СРХУ-ОЫ ■ вивиивш мрху-га1 ■-панн-и

УАЯУ-1Ш 1-■-шввв ............. —мшашвяшш——шявшаяштшт46

v асу-сор ■■пвшшюм-1 ||и|иии1|—и11111и1иммя1—и—■■—■■—iе"

срху-йщ

мрху-га1 ^шяшшшявшшия—шшшв—вш—шя^швш—шша^шашаш—в—ш——шяаяшявша—вашшшяшшт*\гА

4 А31.

у асу-сор

срху-сш имиммии—им....................................................i—— и223

в7я|>

мрху-га! ■шнмяамтшмшшмш——.............. 1—штчтяяявшят—шшявш—и— 1196

А38ЯЬ

уалу-шб нммшнммя—яяяшяшшятшт—ншжм «мяв. .......«185

у су сор взр> виац.

Рисунок 1. Графическое выравнивание геномов вирусов оспы коров СРХУ-СШ, осповакцины УАСУ-СОР, натуральной оспы УЛКУ-ГМИ и оспы обезьян МРХУ-2А1. Стрелками обозначены направления и размер ОРТ, внутри которых проводили видоспецифичную ПЦР-амплификацию. Над стрелками приведены названия соответствующих ОРТ. Тонкими линиями обозначены районы делений в ДНК одних вирусов относительно других. Справа указана длина нуклеотидных последовательностей в т.п.н.

Таблица 1. Праймеры и зонды, использованные в ПЦР-анализе ДНК ортолоксвирусов__

Вирус Район генома Последовательность олнгояуклеотидов Флуорофор/ту шитель Название оллгонукл еотид я

СРХУ М1Ь 5'-ctattctatacagttgcattcacgactccat-3' гое/вн(21 СРХУ_М 1 Ь_7.опс1

5 '-aagagaagggaattgttagtgttg-3' СРХУ_М! Ь_иррег

5 '-tactttctttcagagataccatctactt-3' СРХУ_М 1 1__1о\уег

ми* 5 '-ccacaatcaggatclgtaaagcgagc-3' ЮЕ/ВНй1 СРХУ_М1Ъ_гопй

5 '-аааасШссасШссаШМ-З' СРХУОШ_иррег

СРХУ_ОШ_1оч>ег

УАСУ взя 5' -ttcttctactatatcggcggcaccat-3* Су5/ВН(23 УАС У_ВЗ !1 _гопс1

5'-aaacttggggagaatgatacaga-3' УАСУ_ВЗЯ_иррег

5 '-gtcttccagagaggtggttac<^3' УАСУ_ВЗК_1сшег

вюл Су5/вндз УА СУ_В 10И_гопй

S'-ggcaatggattcagggatatac-3' УАСУВЮЯиррег

5'чlШatgaataatccgccagttac-3' УА СУВ10Я_1оюег

МРХУ пь 5 '-ccgtgtatcagcatccattgtcgtag-3' тамка/вн02 МРХУ_РЗЬ_гоп<1

5 '-atagcatcagcatcagaatctgta-3' МРХУ_РЗ Ьиррег

5'-agaagcgagaagttaataaagctct-3' МРХУ_РЗ 1-_1о\уег

В7Н S'-tgaatgaatgcgatactgtatgtgtggg-3' ТАМ1Ы/ВНд2 МРХУ_В7В_гопй

5'-acgtgШaacaatgggígatg-3' МРХУ_В7«_иррег

5 '-aacatttccatgaatcgíagtcc-3' МРХУВ 7И_1стег

УАКУ АЗЬ 5 '-aagcgcgggaagШaatgcca-3' рам/вн<31 УАЯУ_АЗЬ_гоп(1

5'-ttgctggattagactatatgtgtctc-3' УАЯУ_АЗЬ_иррег

5'-accagaaactaattactacattcatcc-3' УАКУ_АЗ Ь_1о угег

А38Я S'-cgttgatggacaccacgШgttatta-3' ЕАМ/ВНО! УАНУ_А3811_гоп<1

5f-tctgtactatgtgttaaaagattctacaa-3' УАЛ У_А38Л_иррег

5 '-aatgtatctgttatagtcagcataccc-3' УАК У_А381{_иррег

Примечание.

* жирным курсивом выделены последовательности праймеров, использованные в конечном варианте МПЦР в реальном времени

В декабре 2008 - январе 2009 г. во Франции и Германии наблюдалась беспрецедентная вспышка оспы коров у людей. В то же время для СРХУ не существует быстрого метода для рутинной диагностики этого вируса. Таким образом, для целей эпидемиологического надзора и клинической диагностики является

актуальным разработка метода экспресс диагностики вируса оспы коров на основе ПЦР в реальном времени.

Для разработки метода видоспецифичной детекции CPXV были рассмотрены районы CPXV, включающие ОРТ - MIL и D11L в левой области вирусного генома (рисунок 1).

С целью экспериментального отбора праймеров и гибридизационных зондов, обеспечивающих видоспецифичное выявление CPXV, была проведена ПЦР в реальном времени на имеющемся ограниченном количестве ДНК штаммов различных ортопоксвирусов (таблица 2). Видоспецифичное возрастание уровня флуоресценции наблюдали при проведении ПЦР в реальном времени с олигонуклеотидными праймерами и соответствующим гибридизационным зондом, рассчитанными для ОРТ DHL.

Таблица 2. Список штаммов ортопоксвирусов, ДНК которых была использована

в работе

Вид Ортопоксвирусов Штамм Страна выделения Источник ДНК

Вирус осповакцины Elstree 3399 Нидерланды 1

Western Reserve США 1

Вирус оспы коров GRI-90 Россия 1

OPV-Claus Германия 3

Вирус оспы обезьян CDC# v79-I-005 Заир 2

CDC# V97-I-004 Заир 2

Вирус натуральной Ngami Танзания 1

оспы Congo-9 Конго 1

Butler Великобритания 1

6-5B Россия 1

Примечание.

1. Коллекция ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», штаммы получены из лаборатории С.С.Маренниковой (НИИ ВП РАМН, Москва).

2. Вирусы получены от Дж. Эспозито (Атланта, США).

3. Вирусные ДНК получены от Г. Мейера (Мюнхен, Германия).

Следующим шагом стало создание положительного контроля. Контрольные образцы необходимы для того, чтобы иметь возможность максимально полно контролировать работу и снизить долю ошибочных результатов. Имея данные о том, как прошла ПЦР в реальном времени в присутствии этих контролен, можно судить о том, насколько правильно она была поставлена.

fl(+) orí

Ampr

«i

tí,"

MCS

Hinâlll

ШИШ

pBluescript II SK (+)

3 kb

pUCori

MCS

BamHl

CP XV DNA 1 kb

lacZ'

Pr lac

Рисунок 2. Структура положительного контроля. Фрагмент генома в районе ОРТ D11L CPXV штамма GRI-90 (CPXV DNA) клонирован в векторную плазмиду pBluescript II SK(+). fl(+) orí (fl (+) ориджин репликации одноцепочечной ДНК), Атрг(ген устойчивости к ампициллину), pUC on (pUC ориджин репликации), Pr lac (lac промотор), lacZ' (кодирующая нуклеотидная последовательность а-фрагмента ß-галактозидазы), MCS (multiple cloning site - множественный сайт для клонирования).

Поскольку ПЦР является крайне чувствительной реакцией, важно осуществлять постоянный контроль за контаминацией реагентов и оборудования. Поэтому был сконструировать положительный контрольный образец (ПКО) для пары праймеров и гибридизационного зонда к ОРТ D11L вируса оспы коров. В качестве ПКО выступает рекомбинантная плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность видоспецифичного района, используемого для видовой идентификации CPXV.

Для конструирования рекомбинантной плазмиды провели расчет олигонуклеотидных праймеров с использованием компьютерной программы "Oligo" 6.31 на основе нуклеотидных последовательностей района ОРТ D11L штамма GRI-90 CPXV. Был проведен анализ на наличие специфических сайтов рестрикции в этой нуклеотидной последовательности. На основе выполненного анализа в праймеры для последующего клонирования заложили сайты рестрикции 7/mdIII и ВатШ.

С помощью ПЦР провели наработку фрагмента для клонирования видоспецифичного района ДНК вируса оспы коров. Полученный амплификационный продукт района ОРТ D11L штамма GRI-90 CPXV гидролизовали рестриктазами #i/zdIII и ВатШ с образованием "липких концов", после чего очищали его с помощью Gel Extraction Kit производства фирмы QIAGEN. Проводили лигирование полученного фрагмента и плазмидной ДНК pBluescript II SK (-) (pBSK). Структура положительного контроля схематически представлена на рисунке 2.

Продукты реакции лигирования использовали для трансформации компетентных клеток E.coli штамма Dh5aF'. Проводили высев на плотную селективную среду для отбора трансформантов. Из нескольких десятков колоний (на каждой чашке) отбирали несколько клонов для выделения плазмидной ДНК в аналитических количествах. Для подтверждения трансформации проводили рестрикционный анализ, ПЦР в реальном времени и секвенирование.

Определение характеристик метода проводили с использованием трех приборов: Real-Time PCR System 7500 ("Applied Biosystems", США), iQ 5 ("BioRad", США), Rotor-Gene 6000 («Corbett Research», Австралия). В работе использовались две различные Taq полимеразы: AmpliTaq Gold® DNA polymerase ("Applied Biosystems", США) (в комплекте с соответствующими реагентами) и Taq ДНК-полимераза («Fermentas», США). Проверку проводили с использованием панели ДНК (таблица 3).

Таблица 3. Список штаммов ортопоксвирусов, ДНК которых была использована в работе

Вид Штамм Источник ДНК

Вирус оспы коров ОШ-90 1

ОРУ-С1аиз 2

88-1дш§е 2

ОРУ-90/2 2

ОРУ-90/5 2

ОРУ-89/3 2

ОРУ-89/4 2

ОРУ-98/5 2

Вирус осповакцины ЛИВП 1

ЕкБи-ее 3399

'\Уез1егп Яевегуе 1

Вирус оспы обезьян СОС#У79-1-005

СОС#у97-1-004

Вирус натуральной оспы ^агш 1

6-58 1

ВиЙег 1

ВганМ28 1

1

Кдш-5 1

1пс11а-378 1

1п(Ка-71 1

13/62 1

М-Сауг-60 1

1п(1-4а 1

Вгаи1-131 1

Он^о-9 1

Вирус оспы мышей ЕсМС1/2 1

МР-2 2

Вирус оспы верблюдов СР-5 2 .

Примечание,

1. Коллекция ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», штаммы получены из лаборатории С .С.Маренниковой (НИИ ВП РАМН, Москва).

2. Вирусы получены от Дж. Эспозито (Атланта, США).

3. Вирусные ДНК получены от Г. Мейера (Мюнхен, Германия).

При определении аналитической специфичности положительный сигнал наблюдался только для образцов, содержащих ДНК СРХУ. Не было отмечено увеличение уровня флуоресценции при амплификации с ДНК неродственных поксвирусов - вирусов миксомы кролика и вируса оспы кур (род Ау1р0ху1гиз). Так же не было отмечено возрастание флуоресценции при амплификации на ДНК таких возбудителей, как вирусы простого герпеса 1 и 2 типа, вируса ветряной оспы (таблица 4). Такой результат был получен для всех использованных приборов и наборов реагентов. Таким образом, аналитическая специфичность разработанного нами метода в наших экспериментах составила 100 %.

Таблица 4. Список штаммов различных вирусов, ДНК которых была использована в работе

Вирус Штамм Источник ДНК (от кого получены)

вирус миксомы кролика Lausanne G. McFadden, Robarts Research Institute, London, Canada

вирус оспы кур FP9 M. Skinner, Institute of Animal Health, Newbury, UK

вирус простого герпеса I типа HF M.A. Суслопаров, ГНЦ ВБ "Вектор", Новосибирск, Россия

вирус простого герпеса II типа MS M.A. Суслопаров, ГНЦ ВБ "Вектор", Новосибирск, Россия

вирус ветряной оспы VZV №4 М.А. Суслопаров, ГНЦ ВБ "Вектор", Новосибирск, Россия

Для проверки диагностической специфичности были взяты 20 препаратов цельной крови здоровых людей. После выделения, препараты суммарной ДНК крови анализировали в разработанном нами методе. Ни один образец не дал положительного результата. Таким образом, диагностическая специфичность в наших экспериментах составила 100%.

Нами была проведена оценка аналитической чувствительности метода. Для этой цели использовали сконструированную рекомбинантную плазмиду. После измерения концентрации, были приготовлены 10 кратные разведения плазмиды, от 250 мкг/мл до 25 фг/мл (что соответствует от 6*10!3копий/мл до 6 х103копий/мл). Каждое разведение было повторено трижды. Минимальное количество плазмиды,

выявляемое на приборе iQ 5 ("BioRad", США), составило 6 копий в реакции. Для прибора Real-Time PCR System 7500 ("Applied Biosystems", США) минимальное выявляемое количество составило 6-60 копий в реакции. Однако, для прибора RotorGene 6000 («Corbett Research», Австралия) эта величина составила 60-600 копий в реакции.

Аналитическую чувствительность оценивали так же с помощью препарата ДНК вируса оспы коров штамма GRI-90, выделенного из очищенного в градиенте сахарозы вируса. Для вируса были определены физический титр при помощи электронной микроскопии, составивший 7,5х109 в.ч./мл, и биологический титр на монослое клеток Vero, составивший 2,8* 108 БОЕ/мл.

При помощи набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) из препаратов вирусов с известным физическим и биологическим титром была выделена ДНК. Для каждого npenäpaTa были приготовлены 10-кратные разведения в трех независимых повторах. Для вируса оспы коров штамм GRI-90 минимальное выявляемое количество вирусной ДНК составило 2-20 копий в реакции для прибора Real-Time PCR System 7500 ("Applied Biosystems", США) и iQ 5 ("BioRad", США), для прибора Rotor-Gene 6000 («Corbett Research», Австралия) эта величина составила 20-200 копий в реакции.

Диагностическую чувствительность разработанной процедуры оценивали на экспериментальных образцах оспы коров. Экспериментальные образцы были получены после интраназального заражения мышей препаратом CPXV, штамм GRI-90. У животных в течение 10 дней после инфицирования проводили забор крови, образцов печени, легких и селезенки. Во всех этих образцах на 3-10 дни эксперимента успешно был выявлен CPXV.

Разработка моноплексного варианта ПЦР в реальном времени

Для отбора праймеров и гибридизационных зондов, обеспечивающих видоспецифичное выявление OPV, патогенных для человека, первоначально была проведена проверка в моноплексном формате на имеющемся ограниченном количестве ДНК штаммов различных ортопоксвирусов (таблица 2).

Для вируса натуральной оспы были рассмотрены две ОРТ - A3L и A38R (рисунок 1). Хорошие результаты показала пара праймеров и соответствующий зонд, рассчитанные для ОРТ A38R (таблица 1 - олигонуклеотиды выделены курсивом).

Хотя ОРТ АЗ8Я находится в центральном консервативном районе ортопоксвирусного генома, большое число видоспецифичных нуклеотидных замен делает этот район пригодным для подбора олигонуклеотидов. При проведении ПЦР в реальном времени с парой праймеров и соответствующим зондом, рассчитанными для ОРТ АЗ 811, положительный сигнал наблюдался только для вируса натуральной оспы, все используемые штаммы УАКУ формировали положительный сигнал.

Осуществление дифференциации вируса осповакцины от других видов ортопоксвирусов осложняется тем, что у УАСУ практически нет протяженных видоспецифичных районов, различия, как правило, выявляются на уровне нескольких нуклеотидов. Однако в результате компьютерного анализа нами был найден район ОРТ В10И. Известно, что ОРТ В1(Ж кодирует белок семейства ЯСР, белки этого семейства участвуют в системе взаимодействия вирусных белков с клеточными компонентами, эти белки формируют видовые свойства вируса. Подобный район генома отсутствуют у МРХУ и УАЯУ, но присутствует у СРХУ, тем не менее, делеция порядка 1600 п.н. в геноме УАСУ по отношению к СРХУ делает этот район подходящим для поиска видоспецифичных праймеров и зонда. Для праймеров и гибридизационного зонда, рассчитанных для района В1011, были получены ожидаемые результаты. Увеличение уровня флуоресценции наблюдалось только для образцов ДНК вируса осповакцины.

Для вирусов оспы обезьян были рассмотрены ОРТ - РЗЬ и ОРТ - В7Я (рисунок 1) и рассчитаны для них олигонуклеотидные праймеры и соответствующие гибридизационные зонды. Лучшие результаты показали олигонуклеотиды, рассчитанные для ОРТ В7Л. Эта ОРТ входит в состав правого вариабельного участка вирусного генома. Оба штамма МРХУ были успешно идентифицированы, положительный сигнал отсутствовал при проведение ПЦР в реальном времени с штаммами УАЮ/, СРХУ, УАСУ. Пара праймеров и соответствующий гибридизационный зонд, рассчитанные для района В7Я, были отобраны для дальнейших работ.

Разработка мультиплексного варианта ПЦР в реальном времени

Для проведения мультиплексного ПЦР-анализа в реальном времени использовали одновременно все четыре пары праймеров и соответствующие

гибридизационные зонды (таблица 1). Была использована расширенная панель ДНК (таблица 3).

Для проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени 25 мкл реакционной смеси содержало 2.5 мкл lOxTaqMan® Buffer А, 200 мкМ dNTP, 5 мМ MgCI2, 4 пары праймеров каждый по 300 нМ, 4 зонда каждый по 250 нМ, 0,5 ед. AmpliTaq Gold® DNA polymerase, 1 мкл раствора анализируемой ДНК. ЛЦР с измерением интенсивности флуоресценции проводили по следующему алгоритму: 95 °С - 10 мин, далее 40 циклов: 95 "С - 15 сек, 58 "С - 1 мин.

Для каждой пары праймеров и соответствующего гибридизационкого зонда был сконструирован положительный контроль. Для пары праймеров и гибридизационного зонда, специфичного к ОРТ D11L CPXV, использовали рекомбинантную плазмиду, сконструированную ранее.

Конструирование рекомбинантных плазмид проводили по алгоритму, описанному ранее. Аналогично проводили анализ и отбор рекомбинантных плазмид.

Оценка специфичности метода МПЦР в реальном времени

Основной диагностической ценностью разрабатываемых ПЦР методик являются показатели чувствительности и специфичности. Что касается специфичности, то различают аналитическую и диагностическую специфичность. Аналитическая специфичность оценивается при проведении ПЦР на панели образцов ДНК различных возбудителей. Диагностическая специфичность определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа.

Аналитическую специфичность оценивали на панели образцов ДНК 29 штаммов 6 различных видов ортопоксвирусов (таблица 3). Различные штаммы VARV, MPXV, CPXV и VACV были успешно идентифицированы в МПЦР в реальном времени. Все результаты амплификации соответствовали ожидаемым. Не было отмечено увеличение уровня флуоресценции при амплификации с ДНК неродственных поксвирусов - вирусов миксомы кролика и вируса оспы кур (род Avipoxvirus). Так же не было отмечено возрастание флуоресценции при амплификации на ДНК таких возбудителей, как вирусы простого герпеса 1 и 2 типа, вируса ветряной оспы (таблица 4). Таким образом, аналитическая специфичность МПЦР в реальном времени в наших экспериментах составила 100 % (рисунок 3).

Rrt V» Cycle Ru V, Cycle

с помощью олигоиуклеотидных праймеров и зондов, рассчитанных для видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов (таблица 4). Анализировали амплификаты, полученные на ДНК 29 штаммов 6 видов ортопоксвирусов, патогенных для человека (таблица 5). Линии выше горизонтальной полосы соответствуют положительным результатам и отражают уровень накопления продуктов в ПЦР реакции характерных для каждого вида ортопоксвируса, ниже - отрицательным результатам для всех остальных видов ортопоксвирусов. Данные представлены для каждого канала, в котором идет детекция флуоресценции - регистрируется сигнал красителя FAM, конъюгированного с VARV-специфичным hybridization probe (A); TAMRA, конъюгированного с MPXV-специфичным hybridization probe (В); JOE, конъюгированного с CPXV-специфичным hybridization probe (С); Су5, конъюгированного с VACV-специфичным hybridization probe (D). Cycle Number - номер цикла ПЦР в реальном времени. Rn - значение сигнала флуоресценции, baseline - базовая линия.

Для проверки диагностической специфичности были взяты 20 препаратов цельной крови здоровых людей. После выделения, препараты суммарной ДНК крови анализировали в разработанной нами мультиплексной ПЦР в реальном времени. Ни один образец не дал положительного результата. Таким образом, диагностическая специфичность в наших экспериментах составила 100%.

Оценка чувствительности метода МПЦР в реальном времени

Показатель чувствительности любого лабораторного анализа является важнейшим универсальным критерием диагностической эффективности. Чувствительность также разделяют на аналитическую и диагностическую. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество ДНК или РНК, которое может быть определено данной тест-системой. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора, и оценивается в процентах.

Аналитическую чувствительность оценивали с помощью препаратов рекомбинантных плазмид, сконструированных ранее и препаратов ДНК, выделенных из очищенных в градиенте сахарозы СРХУ, штамм ОШ-90, и УАСУ, штамм ЛИВП. Определение аналитической чувствительности проводилось в два этапа. На первом этапе аналитическая чувствительность определялась для каждой пары праймеров и соответствующего гибридизационного зонда отдельно. На втором этапе проводили определение аналитической чувствительности для смеси праймеров и гибридизационных зондов. Для каждой из плазмид были приготовлены 10-кратные разведения в трех независимых повторах. На рисунке 4 представлены результаты проведения МПЦР в реальном времени для разведений плазмиды, содержащей последовательность вируса натуральной оспы, из которых следует, что минимальная концентрация плазмиды, надежно детектируемая в трех повторах, составляет 2-20 копий в реакции. Для МРХУ минимальное выявляемое количество плазмиды составило 2-20 копий в реакции, для СРХУ - 5-50 копий в реакции, для УАСУ - 7-70 копий в реакции (таблица 5).

реальном времени на рекомбинантной плазмиде, содержащей последовательность вируса натуральной оспы. Данные полученные для олигонуклеотидных праймеров и гибридизационного зонда, рассчитанных для района ОРТ A38R VARV Ивдия-1967. Группы кривых отражают сдвиг порогового цикла в зависимости от концентрации рекомбинантной плазмиды. Cycle Number -номер цикла ПЦР в реальном времени. Rn - значение сигнала флюоресценции, baseline - базовая линия.

Пошаговое определение аналитической чувствительности позволило нам оценить влияние изменения состава реакционной смеси на чувствительность системы. Основываясь на полученных результатах (таблице 5), можно утверждать, что присутствие в ПЦР смеси всех пар праймеров и соответствующих зондов не влияет на аналитическую чувствительность праймеров и флуоресцентных зондов.

Таблица 5. Минимально выявляемое количество ДНК.

Патоген Плазмидкая ДНК, моноплексньш формат, копнй/реакцни Плазмндная ДНК, мультиплексный формат, копий/реакции Геномная ДНК мультиплексный формат, копнй/реакцни

VARV 2-20 2-20 -

MPXV 2-20 2-20 -

CPXV 6-60 5-50 2-20

VACV 6-60 7-70 9-90

Аналитическую чувствительность оценивали так же с помощью препарата ДНК вирусов оспы коров и осповакцины, выделенных из очищенных в градиенте сахарозы CPXV штамма GRI-90 и VACV, штамм ЛИВП. Для вирусов были определены физический титр при помощи электронной микроскопии и биологический титр на монослое клеток Vero (таблица 5.4).

При помощи набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) из препаратов вирусов с известным физическим и биологическим титром была выделена ДНК. Для каждого препарата были приготовлены 10-кратные разведения в трех независимых повторах. Минимальная концентрация вирусной ДНК вируса осповакцины штамма ЛИВП, надежно детектируемая в трех повторах, составляет 9-90 копий в реакции. Для вируса оспы коров штамм GRI-90 минимальное выявляемое количество вирусной ДНК составило 2-20 копий в реакции (таблица 5).

Диагностическую чувствительность разработанной процедуры мультиплексной ПЦР в реальном времени определяли на препаратах ДНК VARV штаммов Aslam, India-387, Brazil-128, Nepal-89, India-164, Khateen, выделенных из корочек кожных поражений, полученных от больных оспой во время компании по искоренению натуральной оспы (1970-1975 гг.), и хранящихся в коллекции ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Увеличение уровня флуоресценции в мультиплексной ПЦР в реальном времени наблюдалось только для оптического канала, регистрирующего сигнал красителя FAM, что однозначно подтвердило наличие в этих образцах ДНК VARV. Также разработанным методом МПЦР в реальном времени была идентифицирована ДНК, выделенная из корочек с кожного поражения двух человек, образовавшихся после вакцинации штаммом ЛИВП VACV в 2000 г.

Диагностическая чувствительность была оценена на образцах ДНК, выделенных из крови, селезенки, легких, печени, смыва рта и пустулы сурков, зараженных MPXV штамм CDC#v79-I-005. Во всех образцах ДНК MPXV была успешно детектирована.

Кроме того, в сравнении с культуральным методом чувствительность была оценена на образцах ДНК, выделенных из крови, селезенки, легких и печени мышей, зараженных интраназально CPXV штамма GRI-90.

Концентрацию вируса в крови и органах мышей определяли титрованием на монослое клеток CV-1 методом бляшек с использованием 6-ти луночных планшетов.

Для проведения ПЦР в реальном времени из всех образцов была выделена ДНК. Выделение ДНК проводили с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN). Полученные таким образом образцы ДНК исследовали в ПЦР в реальном времени. При помощи МПЦР в реальном времени наличие CPXV при дозе заражения 103 БОЕ/мл удалось обнаружить в образцах крови, легких, печени и селезенки, культуральный метод позволил детектировать вирус только в образцах легких. Аналогичные результаты были получены для дозы заражения 105 БОЕ/мл, МПЦР в реальном времени выявлял CPXV в образцах крови, легких, печени и селезенки, культуральный метод только в образцах легких.

выводы

1. В результате сравнительного компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей геномных ДНК 85 штаммов шести видов ортопоксвирусов выявлены видоспецифичные районы VARV, MPXV, CPXV и VACV, перспективные для видоспецифичной ГЩР идентификации вирусных ДНК.

2. Впервые разработан метод видоспецифичной идентификации вируса оспы коров, на основе ПЦР в реальном времени. Определены основные аналитические характеристики этого метода, которые в условиях эксперимента (на приборе Applied Biosystems 7500) составили:

» аналитическая чувствительность, определенная при помощи рекомбинантной плазмиды, содержащей видоспецифичные районы CPXV: 220 копий/реакции.

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи препарата полноразмерной ДНК CPXV: 6-60 копий/реакции.

• диагностическая чувствительность - 100 %;

• аналитическая специфичность - 100%;

• диагностическая специфичность — 100%.

3. Впервые разработан метод одновременной видоспецифичной диагностики вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени. Определены основные аналитические характеристики этого метода, которые в условиях эксперимента составили:

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи рекомбинантных плазмид, содержащих видоспецифичные районы OPV: VARV - 2-20 копий/реакции,

MPXV - 2-20 копий/реакции, CPXV - 5-50 копий/реакции, VACV - 7-70 копий/реакции.

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи препаратов полноразмерной ДНК OPV:

CPXV - 2-20 копий/реакции, VACV - 9-90 копий/реакции.

• диагностическая чувствительность - 100 %;

• аналитическая специфичность -100 %;

• диагностическая специфичность - 100 %.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Gavrilova E.V., Shcherbakov D.N., Maksyutov R.A., Shchelkunbv S.N. Development of real-time PCR assay for specific detection of cowpox virus II Journal of Clinical Virology. - 2010. - V.49. - p. 37-40.

2. Щербаков Д.Н., Гаврилова E.B., Максютов P.A., Щелкунов C.H. Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для видоспецифичной экспресс-идентификации ортопоксвирусов на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени // Патент РФ, справка о приоритете № 2010117460 от 30.04.2010.

3. Scherbakov D.N., Gavrilova E.V., Maksutov R.A., Shchelkunov S.N. Real-time PCR Method for identification of cowpox virus // International life sciences students' conference, Kyiv, Ukraine, 19-23 august 2009, p. 91.

4. Щербаков Д.Н., Гаврилова E.B., Максютов P.A. Разработка метода видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе использования мультиплексной ПЦР в реальном времени II Биологическая безопасность в современном мире, Оболенск, Россия, 21-22 апреля 2009, с. 154-156.

5. Щербаков Д.Н., Гаврилова Е.В., Максютов P.A., Щелкунов С.Н. Видоспецифичная идентификация ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе метода мультиплексной ПЦР в реальном времени // Медицинская геномика и протеомика, Новосибирск, Россия, 9-13 сентября 2009, с. 112.

6. Щербаков Д.Н., Гаврилова Е.В., Максютов P.A., Щелку нов С.Н. Разработка ПЦР в реальном времени для детекции вируса оспы коров // Актуальные проблемы природной очаговости болезней, Омск, Россия, 24-25 ноября 2009, с. 186.

7. Щербаков Д.Н., Гаврилова Е.В., Максютов P.A. Видоспецифичная идентификация ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе метода мультиплексной ПЦР в реальном времени // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины, Ростов-на-Дону, Россия 1-4 октября 2009, с. 201203.

Список используемых сокращений

БОБ - бляшкообразующая единица

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

в.ч. - вирусная частица

МПЦР - мультиплексная полимеразная цепная реакция

ОРТ - открытая рамка трансляции

ПКО - положительный контрольный образец

п.н. — пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

CPXV - вирус оспы коров

MPXV - вирус оспы обезьян

TIR - обращенные (инвертированные) концевые повторы (Terminal Inverted Repeats) VACV - вирус осповакцины VARY - вирус натуральной оспы

Щербаков Дмитрий Николаевич Метод видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени.

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано в центре оперативной полиграфии ИП. Нестеров. П.Н. 630084 г. Новосибирск, ул. Кропоткина, 555

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щербаков, Дмитрий Николаевич

1. Список используемых сокращений.

2. Введение.б

3. Обзор литературы.

3.1. Патогенные для человека ортопоксвирусы.

3.1.1.Вирус оспы обезьян.

3.1.2.Вирус оспы коров.

3.1.3.Вирус осповакцины.

3.1.4.Вирус натуральной оспы.

3.2. Современные молекулярно-диагностические методы в диагностике ортопоксвирусных инфекций на основе ПЦР.

3.2.1.ПЦР в реальном времени.

3.2.1.1 .Использование интеркалирующих красителей.

3.2.1 ^.Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку ПЦР-продукта.

3.2.2. Мультиплексная ПЦР.

3.2.3.Практическая реализация мультиплексной ПЦР в реальном времени.

3.2.4. Место МПЦР в реальном времени в комплексе методов диагностики ортопоксвирусных инфекций человека.

4. Материалы и методы.

4.1. Материалы.

4.2. Препараты ДНК штаммов вирусов, использованные в работе.

4.3. Выделение ДНК вирусов оспы обезьян, оспы коров и осповакцины из инфицированной клеточной культуры.

4.4. Компьютерный анализ.

4.5. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля при помощи набора QIAquick фирмы «QIAGEN», Германия.

4.6. Секвенирование ДНК.

4.7. Трансформация с применением хлористого кальция.

4.8. Выделение плазмидной ДНК при помощи набора QIAprep Spin Miniprep фирмы «QIAGEN», Германия.

4.9. Выделение ДНК при помощи набора QIAamp DNA Mini Kit фирмы «QIAGEN», Германия.

4.10. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

4.11. Лигирование ДНК векторной плазмиды с встраиваемой ДНК амплификационного фрагмента.

4.12. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот в агарозном геле.

4.13. Проведение ПЦР в реальном времени.

4.14. Получение клинических образцов вируса оспы обезьян.

4.15. Получение клинических образцов вируса оспы коров.

5. Результаты и обсуждение.

5.1. Выбор олигонуклеотидных праймеров и гибридизационных зондов для видоспецифичной мультиплексной ПЦР в реальном времени.

5.2.Разработка метода видоспецифичной детекции вируса оспы коров на основе ПЦР в реальном времени.

5.3.Разработка моноплексного варианта ПЦР в реальном времени.

5.4.Разработка мультиплексного варианта ПЦР в реальном времени.

5.5. Оценка специфичности метода МПЦР в реальном времени.

5.5. Оценка чувствительности метода МПЦР в реальном времени.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Щербаков, Дмитрий Николаевич

7. Выводы

1. В результате сравнительного компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей геномных ДНК 85 штаммов шести видов ортопоксвирусов выявлены видоспецифичные районы VARV, MPXV, CPXV и VACV, перспективные для видоспецифичной ПЦР идентификации вирусных ДНК.

2. Впервые разработан метод видоспецифичной идентификации вируса оспы коров, на основе ПЦР в реальном времени. Определены основные аналитические характеристики этого метода, которые в условиях эксперимента (на приборе Applied Biosystems 7500) составили:

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи рекомбинантной плазмиды, содержащей видоспецифичные районы CPXV: 2-20 копий/реакции.

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи препарата полноразмерной ДНК CPXV: 6-60 копий/реакции.

• диагностическая чувствительность - 100 %;

• аналитическая специфичность - 100 %;

• диагностическая специфичность — 100 %.

3. Впервые разработан метод одновременной видоспецифичной диагностики вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени. Определены основные аналитические характеристики этого метода, которые в условиях эксперимента составили:

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи рекомбинантных плазмид, содержащих видоспецифичные районы OPV:

VARV - 2-20 копий/реакции, MPXV - 2-20 копий/реакции, CPXV - 5-50 копий/реакции, VACV - 7-70 копий/реакции.

• аналитическая чувствительность, определенная при помощи препаратов полноразмерной ДНК OPV:

CPXV - 2-20 копий/реакции, VACV - 9-90 копий/реакции.

• диагностическая чувствительность - 100 %;

• аналитическая специфичность - 100 %;

• диагностическая специфичность - 100 %.

6. Заключение

Группа патогенных для человека ортопоксвирусов принадлежит к роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae и включает в себя такие вирусы, как вирус натуральной оспы, вирус оспы обезьян, вирус оспы коров и вирус осповакцины. Благодаря усилиям мирового сообщества под эгидой Всемирной организации здравоохранения натуральная оспа была ликвидирована в 1977 г. (Маренникова и Щелкунов, 1998). В отличие от VARY, другие представители этой группы продолжают циркулировать в природной среде. В связи с этим, в последнее время вызывает беспокойство факт учащения сообщений о случаях заболевания человека, обусловленных этими ортопоксвирусами, прежде всего, вирусом оспы обезьян (Reed et al., 2004; Rimoin et al., 2010; Formenty et al., 2010), вирусом оспы коров (Campe et al., 2009; Ninove et al., 2009) и вирусами, близкими к вирусу осповакцины (Trindade et al., 2007; Singh et al., 2007; Trindade et al., 2006; Silva-Fernandes et al., 2009). Прекращение оспопрививания после ликвидации натуральной оспы стало причиной формирования прослойки людей, восприимчивых к OPV, причем с каждым годом эта прослойка растет. Глобальная восприимчивость населения к OPV стала причиной опасения использования VARV в качестве агента биотеррористических атак (Bray and Buller, 2004). Поэтому одним из важнейших направлений исследований является создание быстрого и надежного способа диагностики OPV, патогенных для человека.

Целью данного исследования было разработать метод видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции (МПЦР) в реальном времени.

Для достижения поставленной цели провели выравнивание всех известных на сегодняшний день нуклеотидных последовательностей полных геномов патогенных для человека ортопоксвирусов, а также последовательностей других изученных представителей рода ортопоксвирусов. На основе анализа этих последовательностей были отобраны видоспецифичные районы. Внутри каждого района были подобраны олигонуклеотидные праймеры и видоспецифичные гибридизационные зонды. В состав каждого зонда были включены флуоресцентные красители. Проведение ряда экспериментов позволило нам из 24 олигонуклеотидов (таблица 5.1) отобрать по одной паре и зонду для каждого вида изучаемых вирусов для проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени. Для проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени использовали одновременно все четыре пары праймеров и соотвествующие гибридизационные зонды, различные флуоресцентные красители, обеспечивающие отдельную регистрацию амплификации вирусной ДНК каждого из четырех видов ортопоксвирусов на определенной длине волны.

При разработке метода, в связи с участившимися вспышками оспы коров у людей в Германии и Франции (Campe et al., 2009; Nino ve et al., 2009), приобрела актуальность работа по созданию метода видоспецифичной диагностики вируса оспы на основе ПЦР в реальном времени. Для разработки методы было решено взять найденные ранее олигонуклеотидные праймеры и соответствующий гибридизационный зонд, специфичные к ОРТ D11L CPXV (таблица 5.1). Для того, чтобы иметь возможность максимально полно контролировать работу и снизить долю ошибочных результатов, был сконструирован положительный контрольный образец (ПКО) для пары праймеров и гибридизационного зонда к ОРТ D11L вируса оспы коров. В качестве ПКО выступает рекомбинантная плазмида pCPXV-DUL, содержащая нуклеотидную последовательность видоспецифичного района, используемого для видовой идентификации CPXV. Положительный контрольный образец также был необходим для использования в качестве стандартного образца при определении аналитической чувствительности разработанного метода.

Определение характеристик метода проводили с использованием трех приборов: Real-Time PCR System 7500 ("Applied Biosystems", США), iQ 5 ("BioRad", США), RotorGene 6000 («Corbett Research», Австралия). В работе использовали две различные Taq полимеразы: AmpliTaq Gold® DNA polymerase ("Applied Biosystems", США) (в комплекте с соответствующими реагентами) и Taq ДНК-полимераза («Fermentas», США). Проверку проводили с использованием панели ДНК (таблица 4.2).

Аналитическая специфичность разработанного нами метода в наших экспериментах составила 100 %.

Диагностическая специфичность, определенная на препаратах ДНК цельной крови здоровых людей, в наших экспериментах составила 100%.

Аналитическая чувствительность метода на рекомбинантной плазмиде составила для iQ 5 ("BioRad", США) 6 копий в реакции. Для прибора Real-Time PCR System 7500 ("Applied Biosystems", США) - 6-60 копий в реакции. Для прибора Rotor-Gene 6000 («Corbett Research», Австралия) эта величина составила 60-600 копий в реакции. Аналитическую чувствительность оценивали также с помощью препарата ДНК вируса оспы коров штамма GRI-90, выделенного из очищенного в градиенте сахарозы вируса. Для вируса были определены физический титр при помощи электронной микроскопии, составивший 7,5* 109 в.ч./мл, и биологический титр на монослое клеток Vero, составивший 2,8x108 БОЕ/мл. Для вируса оспы коров, штамм GRI-90, минимальное выявляемое

89 количество вирусной ДНК составило 2-20 копий в реакции для прибора Real-Time PCR System 7500 ("Applied Biosystems", США) и iQ 5 ("BioRad", США), для прибора RotorGene 6000 («Corbett Research», Австралия) эта величина составила 20-200 копий в реакции.

Диагностическую чувствительность разработанной процедуры оценивали на экспериментальных образцах вируса оспы коров. Экспериментальные образцы были получены после интраназального заражения мышей препаратом CPXV, штамм GRI-90. У животных в течение 10 дней после инфицирования проводили забор крови, образцов печени, легких и селезенки. Во всех этих образцах на 3-10 дни эксперимента успешно был выявлен CPXV.

Главной задачей нашего исследования была разработка метода видоспецифичной идентификации VARV, MPXV, CPXV и VACV, используя мультиплексный вариант ПЦР в реальном времени. Поэтому на следующем этапе работы нами были сконструированы ПКО, представляющие собой рекомбинантные плазмиды pVARV-A38R, pMPXV-B7R, pVACV-B10R, содержащие последовательности патогенных для человека OPV.

Аналитическую специфичность оценивали на панели образцов ДНК 29 штаммов 6 различных видов ортопоксвирусов (таблица 4.2). Различные штаммы VARV, MPXV, CPXV и VACV были успешно идентифицированы в МПЦР в реальном времени. Все результаты амплификации соответствовали ожидаемым. Не было отмечено увеличение уровня флуоресценции при амплификации с ДНК неродственных поксвирусов. Также не было отмечено возрастание флуоресценции при амплификации на ДНК таких возбудителей, как вирусы простого герпеса 1 и 2 типа, вирус ветряной оспы (таблица 4.3). Таким образом, аналитическая специфичность МПЦР в реальном времени в наших экспериментах составила 100 % (рисунок 5.15).

Для проверки диагностической специфичности были взяты 20 препаратов цельной крови здоровых людей. После выделения, препараты суммарной ДНК крови анализировали в разработанной нами мультиплексной ПЦР в реальном времени. Ни один образец не дал положительного результата. Таким образом, диагностическая специфичность в наших экспериментах составила 100%.

Аналитическую чувствительность оценивали с помощью препаратов рекомбинантных плазмид pVARV-A38R, pMPXV-B7R, pCPXV-DllL, pVACV-B10R и препаратов ДНК, выделенных из очищенных в градиенте сахарозы CPXV, штамм GRI-90, и VACV, штамм LIVP. Определение аналитической чувствительности проводили в два этапа. На первом этапе аналитическую чувствительность определяли для каждой пары праймеров и соответствующего гибридизационного зонда отдельно. На втором этапе проводили определение аналитической чувствительности для смеси праймеров и гибридизационных зондов. Для каждой из плазмид были приготовлены 10-кратные разведения в трех независимых повторах. Минимальная концентрация плазмиды, надежно детектируемая в трех повторах, составляет 2-20 копий в реакции. Для MPXV минимальное выявляемое количество плазмиды составило 2-20 копий в реакции, для CPXV - 5-50 копий в реакции, для VACV - 7-70 копий в реакции (таблица 5.5). Пошаговое определение аналитической чувствительности позволило нам оценить влияние изменения состава реакционной смеси на чувствительность системы. Основываясь на полученных результатах (таблица 5.5), можно утверждать, что присутствие в ПЦР смеси всех пар праймеров и соответствующих зондов не влияет на аналитическую чувствительность праймеров и флуоресцентных зондов.

Аналитическую чувствительность оценивали также с помощью препаратов ДНК вирусов оспы коров и осповакцины, выделенных из очищенных в градиенте сахарозы CPXV штамма GRI-90 и VACV, штамм LIVP. Для вирусов были определены физический титр при помощи электронной микроскопии и биологический титр на монослое клеток Vero (таблица 5.4). Минимальная концентрация вирусной ДНК VACV, надежно детектируемая в трех повторах, составляет 9-90 копий в реакции. Для вируса оспы коров, штамм GRI-90, минимальное выявляемое количество вирусной ДНК составило 2-20 копий в реакции (таблица 5.5).

Диагностическую чувствительность разработанной процедуры мультиплексной ПЦР в реальном времени определяли на препаратах ДНК VARV штаммов Aslam, India 387, Brazil 128, Nepal-89, India 164, Khateen, выделенных из корочек кожных поражений, полученных от больных оспой во время компании по искоренению натуральной оспы (1970-1975 гг.) и хранящихся в коллекции ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Увеличение уровня флуоресценции в мультиплексной ПЦР в реальном времени наблюдалось только для оптического * канала, регистрирующего сигнал красителя FAM, что однозначно подтвердило наличие в этих образцах ДНК VARV. Также разработанным методом МПЦР в реальном времени была идентифицирована ДНК, выделенная из корочек с кожного поражения двух человек, образовавшихся после вакцинации штаммом ЛИВП VACV в 2000 г.

Диагностическая чувствительность была оценена на образцах ДНК, выделенных из крови, селезенки, легких, печени, смыва рта и пустулы сурков, зараженных MPXV, штамм CDC#v79-I-005.

Во всех образцах была выявлена ДНК MPXV. Не наблюдалось увеличения уровня флуоресценции для оптических каналов, регистрирующих сигнал зондов, специфичных VARV, CPXV и VACV.

Кроме того, в сравнении с культуральным методом, чувствительность была оценена на образцах ДНК, выделенных из крови, селезенки, легких и печени мышей, зараженных интраназально CPXV штамма GRI-90. Вирус нарабатывали и анализировали в культуре клеток почки африканской зеленой мартышки CV-1. Очищенные препараты CPXV получали центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Образцы крови и органов были получены в динамике: каждые сутки до 14 дня эксперимента, а также на 17 и 22 сутки. ДНК CPXV была идентифицирована с 3 по 10 день в легких, селезенке, печени и крови животных, в то время как титрованием на культуре меток CV-1 CPXV выявляли только в легких. Ни в одном из этих анализов не наблюдали неспецифической детекции.

Таким образом, диагностическая чувствительность разработанного метода мультиплексной ПЦР в реальном времени в наших экспериментах составила 100 %.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щербаков, Дмитрий Николаевич, Кольцово

1. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. Методы. — Москва: Мир. — 1989. С. 368.

2. Костина Е.В., Гаврилова Е.В., Рябинин В.А., Щелкунов С. Н., Синяков А.Н. Методы ПЦР в реальном времени для идентификации патогенных для человека вирусов натуральной оспы и оспы обезьян. // Вопр. Вирусол. — 2009. — №6. С. 29 - 36.

3. Маниатис Т., Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. — Москва: Мир. 1984. - С. 480.

4. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. -Москва: КМК Scientific Press Ltd. 1998. - С. 386.

5. Маренникова С. С., Янова H. Н., Жукова O.A. Электронная микроскопия как метод диагностики при эпидемиологическом надзоре за поксвирусными инфекциями. // Журн. микробиол. 1990. -№ 8. - С.57-62.

6. Мацевич Г.Р., Радкж С.Н., Рыжов К.А., Анджапаридзе О.Г. Эволюция методов лабораторной диагностики ортопоксвирусных инфекций. // Вопр. вирусол. 1996. -Т. 41. -№ 5. - С. 195-197.

7. Онищенко Г.Г., Сандахчиев Л.С., Нетесов C.B., Щелкунов C.B. Биотерроризм как национальная и глобальная угроза. // Журн. микробиол. 2000. - Т. 6. - С. 83-85.

8. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Москва: Наука. - 2004. - С. 526.

9. Щелкунов С.Н. Ортопоксвирусный геном. // Молекул, биол. 1996. - Т. 30. -№ 1. -С. 5-32.

10. Aitichou M., Javorschi S., Ibrahim M.S. Two-color multiplex assay for the identification of orthopox viruses with real-time LUX- PCR. // Mol. Cell. Probes. 2005. - V. 19. - № 5. -P. 323-328.

11. Aitichou M., Saleh S., Kyusung P., Huggins J., O'Guinn M., Jährling P., Ibrahim S. Dualprobe real-time PCR assay for detection of variola or other orthopoxviruses with dried reagents. // J. Virol. Methods. 2008. - V.153. - P. 190-195.

12. Antoine G., Scheiflinger F., Dorner F., Falkner F.G. The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses. // Virology. — 1998. Vol. 244. - P. 365-396.

13. Baroudy B.M., Venkatesan S., Moss B. Structure and replication of vaccinia virus telomeres. // Cold. Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1983. - V. 47. - № 2. - P. 723-729.

14. Baxby D. Is cowpox misnamed? A review of 10 human cases. // Brit. Med. J. 1977. - V. l.-P. 1379-1381.

15. Baxby D., Bennett M., Getty B. Human cowpox 1969-93: a review based on 54 cases. // Br. J. Dermatol. 1994. -V. 131. - P. 598-607.

16. Blackford S., Roberts D.L., Thomas P.D. Cowpox infection causing a generalized eruption in a patient with atopic dermatitis. // Br. J. Dermatol. 1993. - V. 129. V.628-629.

17. Bonnekoh B., Falk K., Reckling K., Kenklies S., Nitsche A., Ghebremedhin B., Pokrywka A., Franke I., Thriene B., König W., Pauli G., Gollnick H. Cowpox infection transmitted from a domestic cat. // JDDG 2008. - V.6. - P. 210-213.

18. Bray M., Buller M. Looking back at smallpox. // Clin. Infect. Dis. 2004. - V. 38. - P. 882-889.

19. Breman J.G. Monkeypox: an emerging infection for humans? In: Scheid W.M., Craig W.A., Hughes J.M. (eds.). Emerging infections 4. Washington, DC: American Society for Microbiology Press. - 2000. - P. 45-67.95

20. Breman J.G., Kalisa-Ruti., Steniowski M.V., Zanotto E., Gromyko A.I., Arita I. Human Monkeypox, 1970-79. // Bull. World Health Organ. 1980. - V. 58. - P. 165-182.

21. Breman J.G., Henderson D.A. Poxvirus dilemmas monkeypox, smallpox and biological terrorism. // N. Engl. J. Med. - 1998. - V. 339. - P. 556.

22. Breman J.G., Henderson D.A. Current concepts: diagnosis and management of smallpox. // N. Engl. J. Med. 2002. - V. 346. - P. 1300-1308.

23. Campe H., Zimmermann P., Glos K., Bayer M., Bergemann H., Dreweck C., Graf P., Weber B.K., Meyer H., Btittner M., Busch U., Sing A. Cowpox virus transmission from pet rats to humans, Germany. // Emerg. Infect. Dis. 2009. -V. 15. - P. 777-780.

24. Carletti F., Bordi L., Castilletti C., Di Caro A., Falasca L., Gioia C. Cat-to-human orthopoxvirus transmission northeastern Italy. // Emerg. Infect. Dis. 2009. - V. 15. - P. 499-500.

25. Chao D.Y., Davis B.S., Chang G.J. Development of multiplex real-time reverse transcriptase PCR assays for detecting eight medically important flaviviruses in mosquitoes. // J. Clin. Microbiol. 2007. - V. 45. - P. 584-589.

26. Chang H.W., Watson J.C., Jacobs B.L. The E3L gene of Vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1992. - V. 89. - №11. - P. 4825-4829.

27. Claudy A.L., Gaudin O.G., Granouillet R. Pox virus infection in Darier's disease. // Clin. Exp. Dermatol. 1982. - V. 7. - P. 261-266.

28. Coras B., Essbauer S., Pfeffer M., Meyer H., Schroder J., Stolz W., Landthaler M., Vogt T. Cowpox and a cat. // Lancet. 2005. - V. 365. - P. 446.

29. Crouch A.C., Baxby D., McCracken C.M., Gaskella R. M., Bennett M. Serological evidence for the reservoir hosts of cowpox virus in British wildlife. // Epidemiol. Infect. -1995. -V. 115.-P. 185-191.

30. Damaso C.R., Reis S.A., Jesus D.M., Lima P.S., Moussatche N. A PCR-based assay for detection of emerging vaccinia-like viruses isolated in Brazil. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2007 - V. 57. - P. 39-46.

31. Damon I.K., Roth C.E., Chowdhary V. Discovery of monkeypox in Sudan. // N. Engl. J. Med. 2006. - V. 355. - № 9. - P. 962-963.

32. Didenko V.V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. //Biotechniques. -2001. Y.31. -№.5. - P. 1106-1121.

33. Dieffenbach C.W., Lowe T.M.J., Dveksler G.S. General conception for PCR primer design. // PCR Methods Appl. 1993. - V. 3. - P. S30-S37.

34. Douglass N.J., Richardson M., Dumbell K.R. Evidence for recent genetic variation in monkeypox viruses. // J. Gen. Virol. 1994. - V. 75. - P. 1303-1309.

35. Drumond B.P., Leite J.A., da Fonseca F.G., Bonjardima C.A., Ferreiraa P.C.P., Kroon E.G. Brazilian Vaccinia virus strains are genetically divergent and differ from the Lister vaccine strain. // Microb. Infect. 2008. - V. 10. - P. 185-197.

36. Dumbell K.R., Huq F. The virology of variola minor. Correlation of laboratory tests with the geographic distribution and human virulence of variola isolates. // Amer. J. Epidemiol. 1986. -V. 123.-P. 403-415.

37. Dumbell K.R., Huq F. Epidemiological implications of the typing of variola isolates. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1975. - V. 69. ~ P. 303-306.

38. Eis-Hiibinger A.M., Gerritzen A., Schneweis K.E., Pfeiff B., Pullmann H., Mayr A., Czerny C.P. Fatal cowpox-like virus infection transmitted by cat. // Lancet. 1990. — V. 336.-P. 880.

39. Elnifro E.M., Ashshi A.M., Cooper R.J., Klapper P.E. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. //Clin. Microbiol. Rev. 2000. - V. 13. - № 4. - P. 559-570.

40. Esposito J.J., Obijeski J.F., Nakano J. H. Orthopoxvirus DNA: strain differentiation by electrophoresis of restriction endonuclease fragmented virion DNA. // Virology. 1978. — V. 89.-P. 53-66.

41. Espy M.J., Cockerill F.R., Meyer R.F., Bowen M.D., Poland G.A., Hadfield T.L., Smith T.F. Detection of smallpox virus DNA by LightCycler PCR. // J. Clin. Microbiol. 2002. -V. 40.-№ 6.-P. 1985-1988.

42. Fenner F., Wittek R., Dumbell K.R. The Orthopoxviruses. San Diego, New York, Berkeley, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto: Academic Press, Inc. - 1989. - P. 432.

43. Fenner F., Henderson D.A., Arita I., Jezek Z., Ladnyi I.D. Smallpox and its eradication. World Health Organization, 1988.

44. Gallwitz S., Schutzbank T., Heberling R.L., Katler S.S., Galpin J.E. Smallpox: residual antibody after vaccination. // J. Clin. Microbiol. 2003. - V. 41. - P. 4068-4070.

45. Giulio D.B., Eckburg P.B. Human Monkeypox: an emerging zoonosis. // Lancet. Infect. Dis.-2004.-V. 4.-P. 15-25.

46. Goebel S. J., Johnson G. P., Perkus M. E., Davis S.W., Winslow J.P., Paoletti E. The complete DNA sequence of vaccinia virus. // Virology. 1990. - Vol. 179. - P. 247-266.

47. Haenssle H.A., Kiessling J., Kempf Y.A., Fuchs T., Neumann C., Emmert S. Orthopoxvirus infection transmitted by a domestic cat. // J. Am. Acad. Dermatol. 2006. -V. 54.-P. SI-4.

48. Heymann D.L., Szczeniowski M., Esteves K. Re-emergence of Monkeypox in Africa: a rewiew of the past six years. // Br. Med. Bull. 1998. - V. 54 - P. 693-702.

49. Honlinger B., Huemer H.P., Romani N., Czerny C-P., Eisendel K., Hopel R. Generalized cowpox infection probably transmitted from a rat. // Br. J. Dermatol. 2005. - V. 153. - P. 451-453.

50. Huemer II.P., Honlinger B., Hopfl R. A simple restriction fragment PCR approach for discrimination of humanpathogenic old world animal orthopoxvirus species. // Can. J. Microbiol. 2008. - V. 54. - P. 159-162.

51. Hutin Y.J., Williams R.J., Malfait P., Pebody R., Loparev V.N., Ropp S.L. Outbreak of human monkeypox, Democratic Republic of Congo, 1996 to 1997. // Emerg. Infect. Dis. -2001.-V. 7.-P. 434-438.

52. Ibrahim M.S., Esposito J.J., Jahrling P.B., Lofts R. S. The potential of 5' nuclease PCR for detecting a single-base polymorphism in orthopoxvirus. // Mol. Cell. Probes. 1997. -V. 11.-P. 143-147.

53. Ibrahim M.S., Lofts R.S., Jahrling P.B., Henchal E.A., Weedn V.W., Northrup M.A., Belgrader P. Real-time microchip PCR for detecting single-base differences in viral and humanDNA. //Anal. Chem. 1998. -V.70. - P. 2013-2017.

54. Ibrahim M.S., Kulesh D.A., Saleh S.S., Damon I.K., Esposito J.J., Schmaljohn A.L., Jahrling P.B. Real-time PCR assay to detect smallpox virus. // J. Clin. Microbiol. 2003. -V. 41. -№ 8. - P. 3835-3839.

55. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J. Optimization of PCRs. In PCR protocol. A Guide to Methods and Applications. San Diego: Academic Press. - 1990. - P. 3-13.

56. Jezek Z., Grab B., Szczeniowski M.Y., Paluku K.M., Mutombo M. Human Monkeypox: secondary attack rates. // Bull. World Health Organ. 1988. - V. 66. - P. 465-470.

57. Kaysser P., von Bomhard W., Dobrzykowski L., Meyer H. Genetic diversity of feline cowpox virus, Germany 2000-2008. //Vet. Microbiol. -2010. -V. 141. P. 282-288.

58. Kumar A., Yadav M.V., Chandra R., Garg S.K. Clinico-etiological features of a pox outbreak among buffaloes. // Ind. J. Med. Res. 1987. - Vol. 26. - P. 41-45.

59. Kurth A., Wibbelt, Gerber H, Petschaelis A, Pauli G, Nitsche A. Rat-to-elephant-to-human transmission of cowpox virus. // Emerg. Infect. Dis. 2008. - V. 14. - P. 670-671.

60. Laassri M., Chizhikov V., Mikheev M., Shchelkunov S., Chumakov K. Detection and discrimination of orthopoxviruses using microarrays of immobilized oligonucleotides. // J. Virol. Methods. 2003. - V. 112(1-2). - P. 67-78.

61. Lai S.M., Singh I.P. Buffalopox a review. // Trop. Anim. Hith. Prod. - 1997. - V. 9 - P. 107-112.

62. Li Y., Olson V.A., Laue T., Laker M.T., Damona I.K. Detection of monkeypox virus with real-time PCR assays. // J. Clin. Virol. 2006. - V. 36. - P. 194-203.

63. Li Y., Zhao H., Wilkins K., Hughes C.5 Damona I.K. Real-time PCR assay for the detection of monkeypox virus West African and Congo Basin strain DNA. // J. Virol. Meth. 2010. - V. 169. - P. 223-227.

64. Loparev V.N., Massung R.F., Esposito J. J., Meyer H. Detection and differentiation of old world orthopoxviruses: restriction fragment length polymorphism of the crmB gene region. //J. Clin. Microbiol. -2001. -V. 39. -№ 1. P. 94-100.

65. Loveless B.M., Mucker E.M., Hartmann C., Craw P.D., Huggins J., Kulesh D.A. Differentiation of Variola major and Variola minor variants by MGB-Eclipse probe melt curves and genotyping analysis. // Mol. Cell. Probes. 2009. - V. 23. - P. 166-170.

66. Mack T.M., Thomas D.B., Khan M.M. Epidemiology of smallpox in West Pakistan. II. Determinants of intravillage spread other than acquired immunity. // Am. J. Epidemiol. -1972.-V. 95.-P. 169-177.

67. Mackett M., Archard L.C. Conservation and variation in orthopoxvirus genome structure. // J. Gen. Virol. 1979. -V. 45. - P. 683-701.

68. Marennikova S.S., Shelukhina E.M., Efremova E.V. New outlook on the biology of cowpox virus. // Acta Virol. 1984. - V. 28. - P. 437-444.

69. Markoulatos P., Siafakas N., Moncany M. Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. // J. Clin. Lab. Anal. 2002. - V. 16. - P. 47-51.

70. Massung R. F., Liu L.I., Qi J., Knight J.C., Yuran T.E., Kerlavage A.R., Parsons J.M., Venter J.C., Esposito J.J. Analysis of the complete genome of smallpox variola major virus strain bangladesh-1975. //Virology. 1994. - Vol. 201. - P. 215-240.101

71. Mathew T. Virus study of pock diseases among buffaloes. // Indian. Pathol. Bacteriol. -1967.-V. 10.-P. 101-102.

72. Mathew Z., Mathew T., Choudhury P.G., Nayak R.L., Menon M.N. Buffalo pox and its control. A report from India. // Asian Livestock. 1978. - V. 3. - P. 9.

73. Meyer H., Hanns-Joachim R. Characterization of the gene encoding the A-type inclusion protein of camelpox virus and sequence comparison with other orthopoxviruses. // J. Gen. Virol. 1993. - V.74. - P. 1679-1684.

74. Meyer H., Pfeffer M., Rziha H.J. Sequence alterations within and downstream of the Atype inclusion protein genes allow differentiation of Orthopoxvirus species by polymerase chain reaction. // J. Gen. Virol. 1994. - V. 75. - P. 1975-1981.

75. Meyer H., Ropp S.L., Esposito J.J. Gene for A-type inclusion body protein is useful for a polymerase chain reaction assay to differentiate orthopoxviruses. // J. Virol. Methods. -1997.-V. 64.-P. 217-221.

76. Meyer H., Totmenin A., Gavrilova E., Shchelkunov S. Variola and camelpox virus-specific sequences are part of a single large open reading frame identified in two German cowpox virus strains. // Virus Res. 2005. - V. 108(1-2). - P. 39-43.

77. Michaeli D. Smallpox: A possible comeback. // IMAJ 2002. - V. 4. - P. 487-488.

78. Mutter G.L., Boynton K.A. PCR bias in amplification of androgen receptor alleles, a trinucleotide repeat marker used in clonality studies. // Nucleic. Acids. Res. 1995. - V. 23. — P. 1411-1418.

79. Nalca A., Rimoin A., Bavari S., Whitehouse C. Reemergence of monkeypox: prevalence, diagnostics, and countermeasures. // CID. -2005. V. 41. -P. 1765-1771.

80. Nedunchelliyan S., Reddy D.S., Venkataraman K.S. Buffalo pox infection in man. // Ind. J. Pub. Health. 1992. - V. 36. - P. 57.

81. Neubauer H., Pfeffer M., Meyer H. Specific detection of mousepox virus by polymerase chain reaction. //Lab. Anim. 1997. -V. 31. -№ 3. - P. 201-205.

82. Neubauer H., Reischl U., Ropp S., Esposito J.J., Wolf H., Meyer H. Specific detection of monkeypox virus by polymerase chain reaction. // J. Virol. Methods. 1998. - V. 74. - № 2.-P. 201-207.

83. Ninove L., Domart Y., Vervel C., Voinot C., Salez N., Raoult D., Meyer H., Capek I., Zandotti C., Charre R.N. Cowpox virus transmission from pet rats to humans, France. // Emerg. Infect. Dis. 2009. - V. 15. - P. 781-784.

84. Nitsche A., Ellerbrok H., Pauli G. Detection of orthopoxvirus DNA by real-time PCR and identification of variola virus DNA by melting analysis. // J. Clin. Microbiol. 2004. - V. 42. —№ 3. - P. 1207-1213.

85. Nitsche A., Steger B., Ellerbrok H., Pauli G. Detection of vaccinia virus DNA on the LightCycler by fluorescence melting curve analysis. // J. Virol. Methods. 2005. - V. 126. -P. 187-195.

86. Nitsche A., Stern D., Ellerbrok H., Pauli G. Detection of infectious poxvirus particles. // Emerg. Infect. Dis. 2006. - V. 12. - P. 1139-1141.

87. Nitsche A., Kurth A., Pauli G. Viremia in human Cowpox virus infection. // J. Clin. Virol. 2007. - V.40. - P. 160-162.

88. Oliveira D.C., Lencastre H. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. // Antimicrob. Agents. Chemother. 2002. - V. 46. P. 2155-2161.

89. Pahlitzsch R., Hammarin A., Widell A. A case of facial cellulitis and necrotizing lymphadenitis due to cowpox virus infection. // Clin. Infect. Diseases. 2006. - V. 43. - P. 737-742.

90. Panning M., Asper M., Kramme S., Schmitz H., Drosten C. Rapid detection and differentiation of human pathogenic orthopox viruses by a fluorescence resonance energy transfer real-time PCR assay. // Clin. Chem. 2004. - V. 50. - № 4. - P. 702-708.

91. Pelkonen P.M., Tarvainen K., Hynninen A., Kallio E.R.K., Henttonen H., Palva A., Vaheri A., Vapalahti O. Cowpox with severe generalized eruption, Finland. // Emerg. Infect. Dis. -2003.-V. 9. -№ 11.-P. 1458-1461.

92. Putkuri N., H. Piiparinen, A. Vaheri, O. Vapalahti. Detection of human orthopoxvirus infections and differentiation of smallpox virus with real-time PCR, // J. Med. Virol. -2009.-V. 81.-P. 146-152.

93. Qiagen, artus Orthopox LC PCR Kit RUO, http://www.qiagen.com/products/artus/artusorthopoxpcrkitruo.aspx.

94. Ramanan Ch., Ghorpade A., Kalra Kalra S., Mann S. Buffalopox. // Intern. J. Dermatol. -1996.-Vol. 35.-No. 2.-P. 128-130.

95. Resenchuk S.M., Blinov V.M. ALIGNMENT SERVICE: creation and processing of alignments of sequences of unlimited length. // Comput. Appl. Biosci. 1995. — V. 11. - №1.-P. 7-11.

96. Rivas C., Gil J., Melkova Z., Esteban M., Diaz-Guerra M. Vaccinia virus E3L protein is an inhibitor of the interferon (i.f.n)-induced 2-5 A synthetase enzyme. // Virology. 1998. - V. 243.-№2.-P. 406-414.

97. Ropp S.L., Jin Q.I., Knight J.C., Massung R.F., Esposito J.J. Polymerase chain reaction strategy for identification and differentiation of smallpox and other ortopoxviruses. // J. Clin. Microbiol. 1995. -V. 33. P. 2069-2076.

98. Rychlik W., Rychlik P. Oligo 6: Primer analysis software. Molecular biology insights: Connecticut - 2000.

99. Ryabinin V.A., Shundrin L.A., Kostina E.B., Laassri M., Chizhikov V., Shchelkunov S.N., Chumakov K., Sinyakov A.N. Microarray assay for detection and discrimination of Orthopoxvirus species. // J. Med. Virol. 2006. - V. 78(10). - P. 1325-1340.

100. Sale T.A., Melski J.W., Stratman E.J. Monkepox: an epidemiologic and clinical comparison of African and Us disease. // J. Am. Acad. Dermatol. 2006. - V. 55. - P. 478481.

101. Scaramozzino N., Ferrier-Rembert A., Favier A., Rothlisberger C., Richard S., Crance J., Meyer H., Garin D. Real-time PCR to identify variola virus or other human pathogenic orthopox viruses. // Clin. Chem. 2007. - V.53. - №4. - P. 606-613.

102. Schmidt M., Roth K.W., Meyer H., Seifried E., Hourfar M.K. Nucleic acid test screening of blood donors for orthopoxviruses can potentially prevent dispersion of viral agents in case of bioterrorism. // Transfusion. 2005. - V. 45. - P. 399-403.

103. Schroeder K., Nitsche A. Multicolour, multiplex real-time PCR assay for the detection of human-pathogenic poxviruses.// Mol. Cell. Probes. — 2009. V. 24. P. 1-4.

104. Schupp P., Pfeffer M., Meyer H., Burck G., Kolmel K., Neumann C. Cowpox virus in a 12-year-old boy: rapid identification by an orthopoxvirus-specific polymerase chain reaction. // Br. J. Dermatol. 2001. - V. 145. - P. 146-150.

105. Skottman T., Piiparinen H., Hyytiainen H., Myllys V., Skurnik M., Nikkari S. Simultaneous real-time PCR detection of Bacillus anthracis, Francisella tularensis and Yersiniapestis. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2007. - V. 26. - P. 207-211.

106. Shchelkunov S.N., Resenchuk S.M., Totmenin A.V., Blinov V.M., Marennikova S.S., Sandakhchiev L.S. Comparison of the genetic maps of variola and vaccinia viruses. // FEBS Lett. 1993. - V. 327. - P. 321-324.

107. Shchelkunov S.N., Totmenin A.V., Loparev V.N., Safronov P.F., Gutorov V.V., Chizhikov V.E., Knight J.C., Parsons J.M., Massung J.M., Esposito J.J. Alastrim smallpox variola minor virus genome DNA sequences. // Virology. 2000. — V. 266. - P. 361-386.

108. Shchelkunov S.N., Gavrilova E.V., Babkin I.V. Multiplex PCR detection and species differentiation of orthopoxviruses pathogenic to humans. // Mol. Cell. Probes. 2005. - V. 19.-P. 1-8.

109. Shchelkunov S.N., Marennikova S.S., Moyer R.W. Orthopoxviruses pathogenic for humans. New York: Springer Science + Business Media, Inc. - 2005. - P. 425.

110. Singh R.K., Hosamani M., Balamurugan V., Bhanuprakasha V., Rasoola T.J., Yadav M.P. Buffalopox: an emerging and re-emerging zoonosis. // Animal. Helth. Research. Reviews. -2007. V.8. — P. 105-114.

111. Spencer R.C., Lightfoot N.F. Preparedness and response to bioterrorism. // J. Infect. -2001.-V. 43.-P. 104-110.

112. Stewart A., Satterfield B., Cohen M., O'Neill K., Robison R. A quadruplex real-time PCR assay for the detection of Yersinia pestis and its plasmids. // J. Med. Microbiol. 2008. -V. 57.-P. 324-331.

113. Suzuki M.T., Giovannoni S.J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixtures of 16S rRNA genes by PCR. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 625-630.

114. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. //Nucleic Acids Research. 1997. -V. 24. - P. 4876-4882.

115. Trindade G.S., Emerson G.L., Carroll D.S., Kroon E.G., Damon I.K. Brazilian Vaccinia virus and their origins. // Emerg. Infect. Dis. 2007. - V. 13. - No. 7. - P. 965-972.

116. Tryland M., Myrmel H., Holtet L., Haukenes G., Traavik T. Clinical cowpox cases in Norway. // Scand. J. Infect. Dis. 1998a. -V. 30. - P. 301-303.

117. Tryland M., Sandvik T., Arnemo J.M., Stuve G., Olsvik G., Traavik T. Antibodies against orthopoxviruses in wild carnivores from Fennoscandia. // J. Wild. Dis. 1998b. - V. 34. -P. 443-450.

118. Tryland M., Sandvik T., Mehl R., Bennett M., Traavik T., Olsvik O. Serosurvey for orthopoxviruses in rodents and shrews from Norway. // J. Wild. Dis. 1998c. - V. 34. - P. 240-250.

119. Vorou R.M., Papavassiliou V.G., Pierroutsakos I.N. Cowpox virus infection: an emerging health threat. // Curr. Opin. Infect. Dis. 2008. - V. 21. - P. 153-156.

120. Wagner A., Blackstone N., Cartwright P., Dick M., Misof B., Snow P., Wagner G.P., Bartels J., Murtha M., Pendleton J. Surveys of gene families using polymerase chain reaction: PCR selection and PCR drift. // Syst. Biol. 1994. - V. 43. - P. 250-261.

121. Wang Y., Ma W.L., Mao X.M., Wu Q.H., Li L., Wang H.M., Xiao W.W., Zheng W.L. Design and preparation of oligonucleotide microarray for vaccinia virus detection. // Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. 2004. - V. 24(2). - P. 180-183.

122. Wenli M., Yan W., Hongmin W., Wenling Z. An oligonucleotide microarray for the detection of vaccinia virus. // Br. J. Biomed. Sci. 2004. - V. 61(3). - P. 142-145.

123. Wilson W.J., Erler A.M., Nasarabadi S.L., Skowronski E.W., Imbro P.M. A multiplexed PCR-coupled liquid bead array for the simultaneous detection of four biothreat agents. // Mol. Cell. Probes. 2005. - V.19. P. 137-144.

124. White D.O., Fenner F.J. Medical virology. San Diego, Academic Press. - 1994. - P. 584.

125. Wittwer C.T., Herrmann M.G., Gundry C.N., Elenitoba-Johnson K.S. Real-time multiplex PCR assays. // Methods. 2001. - V. 25. - P. 430-442.

126. Wolfs T.F., Wagenaar J.A., Niesters H.G., Osterhaus A.D. Rat-to-human transmission of cowpox infection. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - V. 8. - № 12. - P. 1495-1496.

127. Zdenek J., Fenner F. Human monkeypox. In: Monographs in Virology. Karger. - 1988. -P. 140.