Поиск генов-мишеней для видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах

Михеев, Максим Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поиск генов-мишеней для видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Поиск генов-мишеней для видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах"

На правахрукописи

Михеев Максим Вячеславович

ПОИСК ГЕНОВ-МИШЕНЕЙ ДЛЯ ВИДОСПЕЦИФИЧНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ОРТОПОКСВИРУСОВ НА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ МИКРОЧИПАХ

03.00.03 -молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Кольцово-2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Минздрава РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Щелкунов С.Н.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик РАМН Коненков В.И. кандидат биологических наук Серегин СВ.

Ведущая организация: НИИ медицинской генетики Томского научного центра

СО РАМН, г.Томск

Защита состоится «14» мая 2004 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Минздрава РФ по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцове Новосибирской области, 630559.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ.

Автореферат разослан «26» марта 2004 г.

диссертационного совета

Ученый секретарь

Малыгин Э.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАРАБОТЫ

Актуальность проблемы. Существование природного резервуара ортопоксвирусов, патогенных для человека, а также увеличение прослойки неиммунного к ортопоксвирусам населения, делает вероятным появление в природе эпидемически опасного для людей вируса, близкого к вирусу натуральной оспы по патогенности и контагиозности. Кроме того, вирус натуральной оспы рассматривается как потенциальный агент биотерроризма. Для своевременного принятия противоэпидемических, мер, в случае появления оспоподобного заболевания, необходимо располагать такими методами лабораторного исследования, которые бы давали возможность в короткие сроки расшифровать его этиологию.

Из методов лабораторной диагностики наибольшее значение имеют методы быстрой диагностики. В настоящее время значительно возросли требования, предъявляемые к диагностическим методам. Применяемые методы диагностики оспы должны обладать помимо быстроты ответа, высокой чувствительностью, гарантировать обнаружение вируса в материалах с малым его содержанием, а также обеспечивать дифференциацию близкородственных ортопоксвирусов.

С разработкой техники олигонуклеотидных микрочипов появился новый метод диагностики различных заболеваний и дифференциации видов, основанный на ПЦР с последующей идентификацией гибридизацией на олигонуклеотидных микрочипах. Этот метод, так же как ПЦР, имеет преимущество — возможность обнаружения следовых количеств исследуемого материала в образце. Но в отличие от метода ПЦР микрочиповая технология позволяет анализировать образцы по множеству локусов одновременно, что повышает надежность полученных результатов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была разработка вариантов метода видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, гибридизацией ПЦР-фрагментов вирусной ДНК на олигонуклеотидных микрочипах. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Подобрать метод выделения ДНК ортопоксвирусов из различных материалов, обеспечивающий эффективное проведение ПЦР на полученных образцах ДН1С

• Предложить мишени для создания олигонуклеотидного микрочипа на основании имеющихся в GeneBank нуклеотидных последовательностей генов ортопоксвирусов.

• Определить нуклеотидные последовательности генов хемокинсвязывающего белка и

интерферонсвязывающего белка ОПВ для имеющихся в нашей лаборатории штаммов ОПВ.

• Идентифицировать видоспецифичные отличия в нуклеотидных последовательностях секвенированных ортопоксвирусных генов.

• Проверить воспроизводимость результатов идентификации ОПВ на олигонуклеотидных микрочипах, разработанных совместно с ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва) и Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (Food and Drag Administration -FDA, США).

Научная новизна и практическая значимость работы. Предложен метод выделения. ДНК ортопоксвирусов из различных материалов, позволяющий выделять ортопоксвирус-ную ДНК в количествах, достаточных для проведения одной ПЦР при наличии в них 5-6 вирионов. Разработана и утверждена методика выделения ДНК из вируса натуральной оспы и вируса оспы обезьян в условиях лаборатории BSL-4.

Впервые определены нуклеотидные последовательности гена хемокинсвязывающего белка (vCCT) для 86 штаммов и генам^терферонсвязывающего б е я 58

штаммов шести видов ортопоксвирусов.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ [ БИБЛИОТЕКА СП«ер«у?г ¿а - з

q» J

170 тыс. пар нуклеотидов. Данные секвенирования депонированы в базе данных GenBank. В результате компьютерного анализа выявлены видоспецифичные замены, которые могут быть использованы в качестве мишени для диагностики и видовой идентификации ортопок-свирусов на олигонуклеотидном микрочипе.

Совместно с сотрудниками ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва), разработан олиго-нуклеотидный микрочип для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов по предложенному фрагменту гена СгтВ и на препаратах ДНК 59 штаммов вирусов натуральной оспы, оспы коров, оспы обезьян, оспы верблюдов, осповакцины доказана надежность и воспроизводимость разработанного метода.

Совместно с сотрудниками FDA (США) разработан и протестирован вариант олигонук-леотидного микрочипа для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов по гену хемо-кинсвязывающего белка на препаратах-ДНК 45 штаммов вирусов натуральной оспы, оспы коров, оспы обезьян, оспы верблюдов, осповакцины и оспы мышей (эктромелии).

Публикации и апробация работы. По материалы диссертации опубликовано 4 статьи. Результаты работы были представлены на международных конференциях: 3th Internetional conference on Bioinformatics ofgenome regulation and structure (Novosibirsk, Russia, 2002); The World of Microbes (Paris, France, 2002); XlVth International Poxvirus and Iridovirus Workshop (Lake Placid," New York, USA, 2002); 2nd - 5Л Meeting of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Geneva, Switzerland, 2001-2003).

• Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзо-pa литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы (159 ссылок) и одного приложения. Работа изложена на 152 страницах, содержит 20 рисунков, 17 таблиц.

Вклад автора. Секвенирование генов, хемокинсвязывающего (vCCI) и a/ß-интерферонсвязывающего белков большого набора штаммов ортопоксвирусов

выполнено лично автором Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ор-топоксвирусных генов vCCI, a/ß-IFNr и СгтВ выполнен лично автором. Автором лично проведен выбор метода выделения ДНК вируса натуральной оспы и других ортопоксвиру-сов в условиях лаборатории высокой физической защиты, разработана «Методика приготовления ДНК вируса натуральной оспы и вируса оспы обезьян», обеспечившая возможность выделения и выноса в биохимическую лабораторию с уровнем биобезопасности 2 препаратов ДНК вируса натуральной оспы. Создание олигонуклеотидного микрочипа для видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов гибридизацией с последовательностями гена СгтВ осуществлено сотрудниками Центра микрочипов ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва) при участии автора. Олигонуклеотидный микрочип для одновременной идентификации ортопоксвирусов и вируса ветряной оспы разработан сотрудниками лаборатории современных методов, FDA (США) при участии автора.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выбор метода выделения ДНК вируса натуральной оспы и другихортопоксвирусов

Как и все методы диагностики, основанные на ПЦР, разрабатываемые варианты метода диагностики ОПВ на олигонуклеотидных микрочипах, нуждается в эффективном и надежном методе выделения вирусной ДНК из микроколичеств вируссодержащих образцов. При этом препарат ДНК гарантированно не должен содержать даже следовые количества инфекционных вирионов, что особенно важно при работе с особоопасными вирусами натуральной оспы и оспы обезьян. Выделяемая вирусная ДНК должна быть пригодной лля ис-

пользования в качестве матрицы для проведения молекулярно-биологических процедур, в том числе и ПЦР.

Перед началом тестирования различных методов выделения ДНК на различных образцах был проведен их анализ. В результате сравнения метода Блина и Стаффорда, для краткости будем называть его далее методом А, и метода лизирования образцов в наборе "QIAamp Blood mini Kit" фирмы "QIAGEN"(CIIIA), были предложены две модификации метода Блина и Стаффорда Б и В. Метод Б - оптимизирован для выделения ДНК из оспин на ХАО РКЭ, а также из жидких образцов, таких как культуры клеток, кровь и другиел Метод В — оптимизирован для сухих образцов, таких как струпы, взятые от больных натуральной оспой или людей после вакцинации, высушенная капля крови и другие. Методы Б и В, в отличие от метода А, имеют другую схему лизирования образцов. Так, если в методе А после добавления протеиназы К и лизирующего буфера (ЛБ) образец инкубировали в течение 5-12 ч при 37°С, то в методе Б инкубировали в течение 10 мин при 56°С. В методе В использовали более сложную схему лизирования: сначала добавляли ЛБ, посте чего инкубировали в течение 10 мин при 85°С, затем добавляли протеиназу К и инкубировали в течение 1 ч при 56°С, повторно добавляли ЛБ и инкубировали 10 мин при 56°С. Лизирование в методе Б и В аналогично предложенному фирмой "QIAGEN" (США) в наборе "QiaAmp Blood mini kit" с протоколами для жидких и сухих образцов, соответственно. Кроме упомянутых отличий методы Б и В аналогичны и отличаются от метода А тем, что в них перед осаждением ДНК добавляется РНК-носитель для возможности выделять очень малые количества ДНК за счет эффекта соосаждения РНК и ДНК. В методах Б и В осаждение ведется равным объемом изопропанола, а не 2,5 объемами этанола, что позволяет выделять ДНК из большего объема исходного образца в одной пробирке.

На первом этапе исследований была проверена возможность выделения ДНК ортопок-свирусов из различных типов образцов. В проверке использовали методы А, Б и В, набор "QiaAmp Blood mini kit" фирмы "QIAGEN"(CI1IA), как представитель группы наборов с лизисом протеиназой К и очисткой с помощью сорбента, а также набор для выделения ДНК фирмы "Медиген", в котором очистка происходит также на сорбенте, но лизис проводится раствором с высокой концентрацией солей. При использовании набора "QiaAmp Blood mini kit" применяли оба протокола, для жидких и для сухих образцов. При тестировании использовали лабораторные образцы: оспины на ХАО РКЭ, монослой культуры клеток Vero, инфицированной ВОВ. Кроме этого один клинический образец - струп после вакцинации человека, и две имитации клинических образцов: человеческая кровь, смешанная с ВОВ, которая затем была высушена, и высушенная плазма крови с ВОВ.

Из приведенных исследуемых образцов была выделена ДНК различными методами, полученные результаты приведены в таблице 1. Как видно из таблицы, выделение ДНК мето-

Таблица 1. Результат выделения и ПЦР-амплификации ДНК ВОВ из различных образцов

Методы выделения Врем«, затрачиваемое ва выделение ДНК (ч) Оспины на ХАО РКЭ Инфицированная культура клеток струп после вакцинации человека Высушенная кровь с вирусом Высушенная плазма с вирусом

Набор "QIAamp Blood mini Kif* - для жидких образцов менее 1 + / - -

Набор "QUamp Blood mini Kit" - ллл сухих образцов 2 ♦ 4-V Г * 4-

Набор для выделения ДНК производств! Медиген менее 1 - ♦ 1 -

Вариант А 13 * + *

Вариант Б 1 + - -

Вармяет- В 2 + ♦ 1*

'+' клкозначает наличие или отсутствие ышянфмииромнмога фрапюл* I вожршмЛ ПЦР

Таблица 2. Результаты титрования вируса осповакцины штамм ЛИВП различными методами

Метол определения количеств» вируса Полученный титр

Титрование на ХАО РКЭ 2,0x109 ООЕ/мл

Титрование на монослое клеток Vero 1,5x109 БОЕ/мл

Подсчет при помощи электронной микроскопии 12,6x109 ч-о/мл

дом Бис использованием набора "QIAamp Blood mini Kit" с протоколом для жидких образцов, оптимизированные для выделения ДНК из жидких образцов, как и предполагалось, не могут быть применены к сухим образцам. Варианты этих методик, оптимизированные для сухих образцов, более сложны и требуют большего времени для выполнения, хотя и позволяют выделять ДНК из всех протестированных образцов. Вариант А метода Блина и Стаффорда в данном эксперименте по возможностям не отличается от В, хотя требует для выполнения 13 ч вместо 2 ч, необходимых при использовании метода В. Хуже всех себя проявил набор для выделения ДНК фирмы "Медиген": он позволил выделять ДНК только из инфицированных культур клеток, поэтому мы решили не использовать этот набор в дальнейших тестах.

Для того чтобы сравнить чувствительность различных методов, был получен очищенный в градиенте сахарозы вирус осповакцины штамм ЛИВП и оттитрован различными методами (Таблица 2). Как видно из таблицы, физический титр вируса, определённый методом ЭМ, более чем в шесть раз превосходит титр вируса, определенный на ХАО РКЭ и на культуре клеток. Это может быть объяснено возмож ностью множественного заражения, а также тем, что часть вирионов в препарате, по-видимому, нежизнеспособны. В дальнейшем при определении минимального количества вирионов, ДНК которых амплифици-руется после выделения одним из рассматриваемых способов, использовали именно, физический титр вируса.

Используя раствор вируса с известной концентрацией, были подготовлены аликвоты объемом 50 мкл, содержащие 1,2,3,4,5,6,10,20,30,40 и 50 вирионов. Из этих аликвот выделяли ДНК методами А, Б, В и используя набор "QIAamp Blood mini Kit" с применением обоих протоколов (см. выше). Полученный раствор, содержащий ДНК, высушивали в системе для сушки образцов SpeedVac («Eppendorf», Германия), после чего добавляли реакционную смесь для ПЦР с прайме-рами F4L-U и F4L-L, которые обеспечивают амплификацию фрагмента ДНК длиной в 0,4 т.п.н.

Тестирование набора "QIAamp Blood mini Kit" показало, что с его помощью можно детектировать вирусную ДНК, выделенную из 20 и более вирионов в 50 мкл исходного образца (Рис. 1А), причем протоколы для жидких и сухих образцов давали одинаковые результаты.

При выделении ДНК даже из 50 вирионов методом А ПЦР не давала положительных результатов. Целевой фрагмент удавалось обнаружить только, если перед осаждением ДНК добавляли 30-40 мкг РНК-

Рис. 1. Анализ методом ПЦР чувствительности различных способов выделения ДНК. 1,5% агароз-ный гель. Электрофореграмма. ПЦР амплификация ДНК ВОВ, выделенной с помощью набора "QIAamp Blood mini Kit" (А) и методами Б и В (Б) с праймерами к консервативному району генома ортопоксвирусов (фрагмент гена малой субъединицы (R2) рибонук-леотидредук-тазы). Цифры сверху соответствуют количеству вирио-нов (по результатам электронной микроскопии), из которого проводилось выделение ДНК. М - маркер длины фрагментов ДНК. Длина в т.п.н. показана справа.

носителя для соосаждения. В результате чувствительность этого метода составила 5-6 ви-рионов в 50 мкл исходного образца (Рис. 1Б), как и чувствительность вариантов Б и В.

Так как VARV и MPXV относятся к особо опасным вирусам 1-й группы патогенности, то при выделении ДНК из этих ортопоксвирусов необходимы повышенные меры безопасности. По правилам работы с патогенами 1-й группы все работы с инфекционным материалом должны проводиться в условиях лаборатории с уровнем биобезопасности 4 (Biosafety Level 4 - BSL4), а с инактивированным - могут проводиться в лаборатории с уровнем биобезопасности 2 (Biosafety Level 2 - BSL2). Перенос материала из лаборатории BSL4 в BSL2 должен осуществляться в вирус-инактивирующих условиях. Процедура выноса образцов из лаборатории BSL4 в BSL2 включает в себя инкубирование пробирок при 60°С в течение 1,5 ч для дезинфицирования внешней поверхности пробирок. Кроме этого, материал можно было выносить только в присутствии равного объема фенола. Так как длительная инкубация с фенолом плохо сказывается на качестве ДНК, был разработан новый метод выноса материала из лаборатории BSL4 в BSL2. Исходя из факта, что 3% раствор фенолаполно-стью инактивирует ортопоксвирусы (Бургасов, 1978), и то, что насыщенный водный раствор фенола при 20°С содержит 7% фенола, было предложено выносить материал в водной фазе после насыщения фенолом. Предположив, что в виде осадка ДНК более устойчива, было предложено осадить ДНК равным объемом изопропанола. Таким образом, в конечном растворе концентрация фенола будет составлять не менее 3,5%. С целью утверждения данной методики под контролем представителя из отдела биобезопасности ГНЦ ВБ «Вектор», 2.4 Мелёхиной Т.С., было проведено три серии модельных экспериментов, которые показали, что в таком растворе ортопоксвирусы полностью инактивированы. Для этого к 100 мкл ВОВ с концентрацией 107 БОЕ/мл добавляли 200 мкл тестируемого раствора и перемешивали в течение 15 с. После этого вирус осаждали центрифугированием, осадок растворяли в 100 мкл дистиллированной воды. При нанесении раствора обработанного вируса на монослой культуры клеток Vero, жизнеспособных вирионов обнаружено не было, о чем свидетельствовало отсутствие бляшек. В результате на выполнение утвержденной «Методики приготовления ДНК вируса натуральной оспы и оспы обезьян», с учетом времени необходимого для инактивации ортопоксвирусных вирионов, требуется 2,5-3,5 ч.

В завершение можно заметить, что используя, разработанные методики была выделена ДНК из 6 штаммов VAC, 18 штаммов CPXV, 1 штамма ECTV и 28 штаммов VARV, а также из 6 образцов струпов, полученных от больных оспой более 30 лет назад.

В итоге проведенной работы были выбраны методы выделения ДНК из различных типов образцов: Метод Б позволяет выделять ДНК из ХАО РКЭ и жидких образцов в течение 1 ч; Метод В оптимизирован для выделения ДНК из высушенных образцов, таких как высушенная кровь и струпы, полученные от больных оспой, на его выполнение требуется около 2 ч. Количества ДНК, выделенной из 6 вирионов, очищенного в градиенте сахарозы вируса VACV штамма ЛИВП, в образце объемом 50 мкл оказалось достаточным для надежного получения специфического ПЦР-продукта. Выполненные исследования позволили разработать и утвердить методику выделения ДНК вируса натуральной оспы и вируса оспы обезьян в условиях лаборатории BSL-4.~

2. Изучение гена СгтВ в качестве мишени для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов на олигонуклеотидном микрочипе

2.1. Компьютерный анализ последовательности гена СгтВ ортопоксвирусов

С целью определения района генома ортопоксвирусов пригодного для конструирования олигонуклеотидного микрочипа, был осуществлён поиск в международном банке данных

c/opvm-s

C/OPV91-1 C/OPV89-1 C/OPV90-1

—c/opvso-a

C/QPV90-2

-VIWR

v/coe

V/LB

-V/RPU

I-V/USSR

J T2j-V/TIA

цЧ-V/VEN

J_I-V/BP81

IM* V/BP3906 •Oj-CP/1 11 ПСР/SAU CP/5 CP/M9C CP/CMS CP/SOM

(GeneBank) гена, структура которого, известна для наибольшего числа штаммов. На момент поиска это был ген СгтВ, кодирующий один из белков, блокирующих цитокины хозяина. Белок СгтВ является гомологом клеточного рецептора фактора некроза опухолей. Структура этого гена была известна для 53 различных штаммов ортопоксвирусов, принадлежащих видам: VARV, CPXV, MPXV, VAC, CMLV.

В результате анализа построеной филогенетической дендрограммы (Рис. 2) для представителей всех выявленных вариантов последовательности обнаружили, что штаммы орто-поксвирусов четко кластеризуются в группы по их видовой принадлежности.

При выборе района, оптимального для идентификации ортопоксвирусов, с использованием выровненных нуклеотидных последовательностей (Рис. 3), руководствовались следующими требованиями:

Во-первых, внутри этого района должны присутствовать вариабельные участки, специфичные для каждого из видов ортопоксвиру-сов.

Во-вторых, этот район должен легко выделяться из генома методом ПЦР с праймерами, консервативными для всех видов ортопоксви-русов, то есть вариабельный участок должен быть фланкирован консервативными.

В-третьих, длина амплифицируемого фрагмента, используемого для гибридизации, должна быть не более 300 нуклеотидов. Мик-рочип разрабатывался в сотрудничестве с Институтом молекулярной биологии имени Эн-гельгардта РАН (г. Москва), где используют вариант микрочипа с гелевыми ячейками, внутри которых иммобилизованы олигонукле-отиды. При пробоподготовке, использовали флуоресцентно меченый праймер, что делало невозможным дальнейшую фрагментацию ДНК.

В результате анализа был выбран подходящий для диагностики участок с 145-го по 430-й нуклеотид. Так, его длина менее 300 нуклеотидов, он содержит вариабельные районы, фланкированные консервативными, а также содержит единственную замену, характерную сразу для всех CPXV и отличающую их от других ОПВ (см. рис. 3). Таким образом, в результате был осуществлён окончательный дизайн праймеров TNFRlf и TNFR3r (см. рис. 3).

Mja/C '"I Р—S/SOM „ S/M067 -S/HARV " —&/СНЮ-2 м smsH

II I М/С N GH

"J-nzn П-мгэб-

-IM г-M/BEN

1М IImniq ~j|Mvmp 4-»CV1

"1>imjb

i-WSL

0.01

Рис. 2. Филогенетическая дендрограмма, построенная по нуклеотядяой последовательности гена СгтВ. Каждая ветвь соответствует одному уникальному варианту последовательности, цифра в скобках указывает общее количество идентичных последовательностей. Цифрами в основаниях ветвей показаны результаты перестановочного анализа статистической значимости, полученного при анализе 1000 деревьев. Приведены только значения, превышающие 50. Шкала показывает размер единицы генетического расстояния.

Рис 3. Выровненные нуклеотндиые последовательности фрагмента гена СгтВ различных штаммов вирусов натуральпой оспы (VARV), оспы обезьян (VACV), оспы коров (CPXV), осповакцины (VAC), оспы кроликов (RPXV) и оспы верблюдов (CMLV). Все последовательности сравниваются с CPXV, штамм OPV8S. Точками обозначены идентичные нуклеотнды; тире обозначают делеции. Цифрами над последовательностями обозначены относительные номера нуклеотидов. Номерами 1-14 обозначены последовательности видоспецифичных зондов и их расположение относительно выровненных последовательностей. Приведены последовательности праймеров TNFRlf и TNFR3r. Выделенными блоками показаны замены характерные только для одного вида ортопоксвирусов. . • • ' • '

1 1 10

Í 4 « и 1»

* м ъ

1 I*

г < 11 Í3

•у 12 14

2.2. Разработка метода видовой идентификации ортопоксвирусов на MAGlChip

Используя выровненные нуклеотидные последовательности предложенного локуса гена СгтВ, совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии им. Энгель-гардта РАН (г. Москва) были рассчитаны 14 олигонуклеотидных зондов для пяти участков с видоспецифичными отличиями. На рис. 3 показано их расположение относительно выровненных последовательностей гена СгтВ различных штаммов ОПВ. На микрочипе зонды иммобилизовали в гелевые ячейки, расположенные в 5 колонках (Рис. 4), где каждая колонка представляет отдельный тестируемый участок амплифицируемого фрагмента вирусной ДНК. Внутри каждой колонки только один видоспе-цифичный зонд может формировать совершенный дуплекс с одноцепочечным меченным образцом, в то время как все другие зонды формируют несовершенные дуплексы. Так как энергия образования правильных дуплексов (AG) значительно меньше, чем энергия образования неправильных дуплексов, то количество образованных правильных дуплексов превосходит количество неправильных. Поэтому гелевые ячейки, в которых образовались совершенные гибридизационные дуплексы, имеют больший флуоресцентный сигнал в сравнении с ячейками с несовершенными дуплексами. При этом интенсивность флуоресценции гелевых ячеек должна рассматриваться внутри каждого столбца. В результате гибри-дизационные картины уникальны для всех тестируемых видов ОПВ, что позволяет проводить точную видовую идентификацию сравнением с исходными шаблонами (см. рис. 4).

На первом этапе проверки специфичности метода была проведена ПЦР-амплификация с имеющихся у нас препаратов ДНК 59 штаммов 6 различных видов ОПВ. При использовании праймеров TNFRlf и TNFR3r не образовывался ГЩР-амплификат только на ДНК вируса эктромелии, т.к. в его геноме выбранный для идентификации локус отсутствует [U86381, EMBL]. Праймеры также не давали ПЦР-продуктов при амплификации с ДНК, выделенной из крови здорового человека, клеточной ДНК, выделенной из неинфицированной культуры Vero, и ДНК неродственных поксвирусов - вирусов миксомы кролика, фибромы Шоупа (род Leporipoxvirus) и вируса оспы кур (род Avipoxvirus) (данные не приведены).

На следующем этапе получали флуоресцентно-меченную одноцепочечную ДНК, проведением ас-симетричной ПЦР с флуоресцентно-меченным праймером, концентрация которого в 10 раз выше

^ППЕШ ВЕПП®

Рис. 4. Гибриди ¡анионные картины, полученные на микрочипе для 5 видов ОПВ: А - VARV (1 -штамм Garcia-1966, 2 — штамм Semat); Б - MPXV (3 - Congo-8,4 -Zaire-96-I-16); В - CPXV (5 - ЕР-267, 6 - GRI-90); Г - VACV (7 -WR, 8 - CVI-78); Д - RPXV (9 -Utrecht, 10 - VACV, штамм EI-stree/Utrecht); E - CMLV (11 - СР-1, 12 - СР-1260). В левой колонке приведены разработанные гибри-дизационные шаблоны, номера олигонуклеотидов в ячейках, соответствуют номерам олигонук-леотидов, приведенных на рис. 3.

концентрации второго праймера. Одноцепочечную ДНК гибридизировали с микрочипом в течение 4 ч при 37°С. После отмывки дистиллированной водой и просушивания в струе СО2 гибридизационную картину регистрировали конфокальным микроскопом с CCD-камерой. На рис. 4 слева показаны гибридизационные шаблоны для всех тестируемых видов ОПВ, а справа - реальные картины гибридизации для двух различных штаммов каждого вида ОПВ. Идентификацию осуществляли сравнением полученной гибри-дизационной картины со всеми разработанными гибридизационными шаблонами, приведенными на рис. 4.

В результате были успешно идентифицированы все протестированные штаммы вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины и оспы верблюдов. Все результаты гибридизации соответствовали ожидаемым.

С целью проверки воспроизводимости результатов, 16 из 59 использованных образцов ортопоксвирусных ДНК амплифицировали и гибридизовали на разработанном микрочипе в четырех повторах. Ложноотрицательных или ложноположительных результатов зарегистрировано не было.

Для изучения возможности применения микрочипов в анализе клинических образцов были протестированы пробы ДНК, выделенные из кожных корочек больных натуральной оспой и хранящиеся в коллекции вируса натуральной оспы с 1975 г., а также из кожных корочек, полученных после вакцинации человека вирусом осповакцины в 2000 г. Кроме того, использовали ДНК, выделенную из оспин, образованных на ХАО различными штаммами ОПВ. Во всех случаях наличие естественных примесей в образцах не мешало точной видовой идентификации ОПВ.

В итоге проделанной работы, были рассчитаны 14 олигонуклеотидных зондов для пяти участков локуса гена СгтВ, с видоспецифичными отличиями и был сконструирован олигонуклеотидный микрочип. Специфичность метода была проверена на ДНК 59 штаммов 6-ти различных видов ОПВ. На 16 из 59 использованных образцов ортопоксви-русных ДНК была проверена воспроизводимость результатов гибридизацией на микрочипе в четырех повторах.

3. Изучение генахемокинсвязывающего (vCCI) белка в качестве мишени для видовой идентификации ортопоксвирусов на олигонуклеотидноммикрочипе

Как известно, одним из преимуществ использования микрочипов в диагностике является возможность анализировать образцы сразу по нескольким локусам, что повышает специфичность метода и снижает влияние единичных мутаций на общее определение. С целью увеличения количества локусов, по которым проводится анализ ортопоксвирусов, было решено провести секвенирование гена vCCI, продукт которого является молекулярным фактором вирулентности ортопоксвирусов и поэтому может иметь видоспеци-фичные отличия по нуклеотидной последовательности.

Белок vCCI (viral CC-chemokine inhibitor) имеет молекулярный вес 35 кДа, продуцируется на ранних этапах вирусной инфекции и секретируется из инфицированных клеток в растворимой форме в больших количествах. vCCI является уникальным вирусным белком, так как не имеет гомологии по аминокислотной последовательности с известными клеточными рецепторами хемокинов или какими-либо другими белками, представленными в базах данных. Показано, что vCCI ортопоксвирусов связывается с многочисленными СС-хемокинами с афинностью большей или аналогичной афинности связывания этих хемокинов с клеточными рецепторами.

3.1. Секвенирование и-компьютерный анализ последовательности гена vCCI ортопоксвирусов

Используя 18 нуклеотидных последовательностей гена белка vCCI разных видов ортопоксвирусов, доступных в базе данных GeneBank, рассчитали праймеры пригодные для амплификации фрагментов ДНК содержащих ген белка vCCI. Секвенирование проводили как с праймеров с которых ампли-фицировали фрагменты, так и с двух дополнительных праймеров. В результате се-квенирования были определены нуклео-тидные последовательности 86 штаммов ОПВ, из них 24 - VARV, 19 - MPXV, 23 -CPXV, 10 - VACV, и по 5 штаммов CMLV и ECTV. Суммарно определили 94,5 т.п.н. Данные секвенирования были депонированы в базе данных GenBank.

В основе метода кластеризации генов на филогенетической дендрограмме лежит зависимость от их нуклеотидной последовательности, и поэтому филогенетические дендрограммы могут быть использованы для первичного определения возможностей микрочипа, сконструированного на основе SNP для изучаемого района вирусного генома.

С целью построения филогенетических дендрограмм использовали, как полученные нами нуклеотидные последовательности, так и 40 полученных от J. J. Esposito (CDC, США) и 16 из базы данных GenBank.

Среди выровненных нуклеотидных последовательностей гена белка vCCI были удалены все повторяющиеся варианты. Для представителей всех выявленных генотипов белка vCCI был выполнен филогенетический анализ.

При анализе построенной филогенетической дендрограммы обнаружили, что штаммы ортопоксвирусов, за исключением CPXV, кластеризуются в группы по их видовому признаку (Рис. 5). Изоляты CPXV

можно условно разделить на две подгруппы, обозначенные нами CPXV1 и CPXV2 (см. рис. 5). Подгруппа CPXV1 эволюци-онно близка VACV, VARV и CMLV, в то время как CPXV2 близка к MPXV.

Штаммы VACV, хотя и объединены в одну группу, но эволюционно близки

Рис 5. Филогенетическая дендрограмма построенная по нуклеотидной последовательности гена белка уСС1. Каждая ветвь соответствует одному уникальному варианту последовательности, цифра в скобках указывает общее количество идентичных последовательностей. Цифрами в основаниях ветвей показаны результаты перестановочного анализа статистической значимости, полученного при анализе 1000 деревьев. Приведены только значения превышающие 50. Шкала показывает размер единицы генетического расстояния.

CPXV1. Штаммы C/GRI и C/RP кластеризуются со штаммами VACV.

Изученные штаммы VARV на филогенетическом дереве по гену vCCI образуют подгруппы, соответствующие географии их происхождения (см. рис. S). В принятой систематике штаммы VARV по биологическим свойствам делят на подтипы variola major и variola minor. Штаммы variola minor также подразделяют на африканские и латиноамериканские, именуемые alastrim.

Варианту S/CNG соответствует 17 из 22 африканских штаммов variola major и один индийский штамм 7124. Два штамма variola minor, выделенные в Сомали, отличаются от остальных штаммов этой подгруппы. Еще 2 африканских штамма variola major значительно отличаются от всех VARV и на дендрограмме (см. рис. S) образовали отдельную ветвь вместе с индийским штаммом S/IND67.

Среди 44 неафриканских штаммов VARV преобладают генотипы, обозначенные как S/IND378 и S/KUW. Генотип S/IND378 включает 23 штамма, a S/KUW -13. В геновари-ант S/KUW. кходят изоляты variola major, выделенные в районе от Пакистана до Сирии, за исключением одного штамма, выделенного в Индии и одного в Конго. Варианту S/IND378 соответствует большинство штаммов, происходящих из стран восточной Азии. Следует подчеркнуть, что к данному варианту относятся и изоляты из вспышки натуральной оспы в Москве, произошедшей в 1960 г. в результате завоза из Индии , а также штаммы, выделенные в Великобритании, Германии и США- Варианты S/BUT и S/BRA относятся к подтипу variola minor alastrim и образуют отдельную подгруппу по изучаемому гену.

Интересно заметить, что азиатские штаммы (подгруппы S/KUW, S/IND378, S/HIND и S/IND164), европейский variola minor (S/BUT) и латиноамериканские variola minor alasrtim (S/BRA) образуют единую ветвь на филогенетическом дереве, отличную от африканской подгруппы S/CNG, S/SOM и S/V771 (см. рис. S). Эти результаты, в частности, могут указывать на то, что латиноамериканские штаммы произошли от вируса натуральной оспы, завезенного на Американский континент европейцами, которые в свою очередь были заражены азиатскими вариантами VARV.

Для 6 изолятов VARV, для которых имелись струпы (накожные поражения больных оспой людей), определили нуклеотидные последовательности гена белка vCCI из ДНК, выделенной напрямую из струпов, и после 4 пассажей на культуре клеток Vero. Во всех случаях последовательности не изменились, что дает основания предположить что данный ген не изменяется при пассировании вируса in vitro.

Центрально-африканские изоляты MPXV по структуре изучаемого гена отличаются от западно-африканских M/LIB и M/BEN (см. рис. S). Эти результаты соответствуют полученным ранее данным по делению данного вида ортопоксвирусов на географические подтипы по результатам рестрикционного анализа (Esposito, Knight, 198S) и сравнения структуры гена ESL (Douglass et al., 1994).

Изученные штаммы вируса оспы верблюдов на дендрограмме гена vCCI разделились на две подгруппы: выделенные в Объединенных Арабских Эмиратах и изоляты из Ирана и Казахстана (см. рис. S).

Вычисленные внутривидовые генетические расстояния (<0,0038) показывают относительно высокую внутривидовую гомогенность всех изученных видов ортопоксвирусов по последовательностям гена vCCI, за исключением CPXV (0,0S87). CPXV настолько ге-терогенна, что нами предложено разделить эту группу на две подгруппы CPXV1 и CPXV2. Наиболее гетерогенная подгруппа CPXV2 имеет среднее генетическое расстояние внутри подгруппы равное 0,0360, и больше, чем расстояние между несколькими различными видами ОПВ. Высокий показатель генетических расстояний штаммов внутри группы отражает необычно большое разнообразие изолятов CPXV по структуре гена

уСС7. Полученные результаты согласуются с данными разных авторов, ранее неоднократно отмечавших большую гетерогенность изолятов СРХУ как по биологическим свойствам, так и по структуре генома.

Из значений генетических расстояний между группами, ортопоксвирусы можно расставить по степени уменьшения выделенности выявленных групп в следующем порядке: ЕСТУ (минимальное генетическое расстояние до других групп равно 0,0866); МРХУ (0,0821); СРХУ2 (0,0819); УАКУ (0,0324); СМЕУ (0,0204); СРХУ1 и УАСУ (по 0,0114).

Анализ выровненных нуклеотидных последовательностей гена белка vCCI позволил обнаружить «мозаичность» структуры этого гена при сравнении одних видов относительно других. На рис. 6 приведены некоторые варианты последовательностей гена белка уСС/о 5'- и 3' фланкирующими районами. Как видим, в 5'-концевой части гена белка vCCI (позиции 78-173, см. рис. 6) наблюдаются точечные видоспецифичные отличия от других сравниваемых видов для МРХУ, ЕСТУ и СМЕУ, в то время как для УАЯУ, СРХУ и УАСУ таких выраженных различий практически нет. Сегмент 174-260 характеризуется наибольшим консерватизмом во всей последовательности гена. Возможно, он является функционально важным доменом vCCI.

В районе 261-375 имеются множественные точечные отличия СРХУ2, МРХУ и ЕСТУ от других видов при высокой идентичности последовательностей между собой. Этот район взаимного совпадения последовательностей и отличия от других видов для СРХУ2 и МРХУ может быть продлен до позиции 427.

Район 375-467 характеризуется идентичностью последовательностей для СРХУ1, УАСУ и ЕСТУ (см. рис. 6). Затем следует район 468-512 с множественными мутационными отличиями ЕСТУ от других видов изученных ортопоксвирусов.

ЕСТУ имеет наибольшее число точечных видоспецифичных замен, что согласуется с ранее приведенными данными по степени выделенности групп. Эти замены выделены голубыми блоками на рис. 6. 14 из 28 таких замен расположено в районе между 468-м и 512-м нуклеотидами. Учитывая, что длина одного зонда обычно 15-30 нуклеотидов, такая высокая плотность замен делает неэффективным использование более четырех зондов для данного участка, но дифференциация на этих зондах будет осуществляется по двум и более точечным заменам, что уменьшает вероятность формирования неправильных дуплексов с другими видами ОПВ. Еще одним перспективным районом является район с делецией 950-го и 951-го нуклеотида потому что, короткие олигонуклеотиды при гибридизации не могут образовывать шпильки. В результате на основе структуры этого гена можно предложить 12 видоспецифичных зондов для всех ЕСТУ, на которых дифференциация осуществляется на основе однонуклеотидных замен. Кроме них можно разработать от 3 до 5 зондов с дифференциацией на основе нескольких нуклеотидов. Как можно было предположить из данных по степени генетической удаленности от других групп ОПВ, следующим по количеству видоспецифичных отличий идет МРХУ. МРХУ имеет 25 однонуклеотидных замен, одну делецию в 9 нуклеотидов, и вставку из 3 нуклеотидов. Эти отличия выделены зеленым цветом на рис. 6. На основе близко расположенных замен могут быть разработаны более надежные зонды с дифференциацией по нескольким нуклеотидам. Так у МРХУ имеется 4 пары в положениях: 113 и 115;382 и 383; 391 и 392; 734 и 735. Кроме этих 4 перспективных районов для зондов также перспективным является район с делецией с 297-го по 305-й нуклеотид, и с 3-х нуклеотид-ной вставкой, начинающейся с 915-го нуклеотида. Кроме того, что МРХУ могут быть легко дискриминированы от других ОПВ, их можно еще и разделить на центрально- и западно-африканские штаммы по однонуклеотидным заменам в положениях 380, 488, 596 и 945. Эти основания выделены серыми блоками.

С/НАМ I«] AAOTAQAAAATATA TfCTAATTT ATTGTATOCf AAOGAAGtASMtCATAMOAACAGt ААТСААТСААТЛ6САА1 С/ОГУ«<»8{21 .... . ... С С .........

v/uvr .............,,........с с............------ ------

у/ыа ..... ......с с.........

s/suh .......................с.с...................

S/CMGUt) .......................с с.........................

а/!ноэ?1<?э> .........................с с........................

s/mwti)» ..........................с с.........................

а/в»т{21 ........ . .ее.............

> 10« 11« 120 110 140 ISO 1«0 110 U0

TATATCCTCCTG^«C*TGiCAT^CCCT<^^GCCAaCTOCT*TOCCT<XXAiSTCTTC*GCAATCC---ТСЛТСС-----fCGTCTACtGAACAAUAAAACAAACATCATA

................ . . г АТТС , ТСЛТСС. . .С .........

. t ССАТСС..

ff бсжту

1SSCDII АТйЛЛАСАЛ---АТСОГССТ 20«00*> ЬСбвСЛСТТОСТАТССС

JOOMKi TCTGCCTA6TGGCA6CT9

212MX-IU lATOCCTACIACtcnC

?i«POXs ATA

V/LIV* V/LIS S/SOM «/CWCd«!

a/t«t>mtf)>. Аз/плнп»

>00 210 220 230 240 250 >60 >70 210 290 ЭОО ))0 320 Э30 940 350 3M J70 J»0 390

ГбСЗДТССАГСТТАГТАГВДДСТСАаиМССАЛбАСЗД^^

■ С . .........., . . T . A . С С . А ♦ A—-j С-----—" Т Д ,Т С f. С . . , . ТАД А С . — С , . . HW С ,, ._. Т

,Т I Т.. С ... А—--------—----TJ

Т | Т.. С А------------ п

N/BLM

..........в......А... А---..

А..Т.

? » Т

2МРОХ: tccmatcgatcttattatcaaactcac

36<фоя. ATGATAAMTTtSVCAATC

3&7СОМ ACTCTGA---АСА———•—C0AG-~—-ТСА6

4C7VM* TCCATTATTGGCGGAGC

427НК» CTCGGCGCGGCTC

4J2MR; CSCOOCTCTTA

Рис. 6. Выровненные нуклеотидные последовательности гена белка vCCI ортопоксвирусов с 5*- и З'-фланкирующими районами. Все последовательности сравниваются с CPXV штамма Наго-85. Точками обозначены идентичные нуклеотиды; тире обозначают делении. Цифрами над последовательностями обозначены относительные номера нуклеотидов, Двумя серыми блоками выделены старт* и стоп-кодоны трансляции. Блоками выделены замены характерные только для одного вида ортопоксвирусов. На рисунке приведены последовательности вндоспецифичпых зондов и их расположение относительно выровкениых последовательностей. В последовательностях зон« дов используются следующие сокращения: R - (А+С); W - (А+Т); Y - (С+Т); М - (С+А).

400 410 420 430 440 4&Ф 440 440 400 40« 400 410 »20 530 Ь40 5)0

быш*легттас11ТТСлссыАТстсста1<»тт^

.. .с. лл тс......т....* т , с .... т.......т . ..... , 1М, с . . ♦ ♦ т

зтто ■

а лет $/сч6(14)

«/|М>«7*<231. о/шмцз) %/вигт с?7йз>

СУ/8(41

1/кш>

"О? м

ИЗ

13Е

•(АУИКТСТСТАТС*АСАТС

Ш-Ё-

■|""?1:.......:»"::'1

н/вся

Н/П>|*1

&70УА1К ТСТССАСГСТООССССМб

АТСТАйССАЛСАЛб

&«0 «00 <10 МО «30 (40 «»О «40 «?0 ««О <90 100

СУМАМ (4| А&ЦЦА6АОМ)ССАСАТСААйАССа^ТССАДТАСТ^

с/ору|»-»(г!. ... т . а г .. .. — . .. ! .с............ ... л........ с

ГАСв$ТТССГА1

Шв

$/ВУТ(2) .... .. А . . . ....... .. Г..... ............... .....

?13РОХ{ АОАЛАйАСА«

410НК1 АСТАСПиКГСТААСА

±г

1»0МК АТОТбТ7ААСААСС.ТЛСАС "" 4ЭСМК. АСАТСТСТСЛССААТСА

140рощ ССТАТНОСАвКАТСГв «ООГОХ» СТТСА»бТСААвСАТСв

•40УАЯ1 ДАССААТССТСТСАТСТ

010 010 «90 «00 «10 »20 »30 »40 »30 «СО «ТО

.ТСйАТР^АСТСТАТТСАТСССА^ГТСЛИЖ^ТАООСТТМТССААСОА

пи

.Г, А » А

9/ЭиИ .........Т..........

*/СЖ2<1«1 ........Т........

в/1К037«(?3).........*........

1/ЮЖ(11| ...................

«/ЫГГЩ .....Т

С*/ИЗ» СР/5Ц)

е/к1. г:............

</4»0«(3) ,. Г ... И/«*Л ..........................

р. ,д У. Л - А 1 ♦ »«*«,, --- О ... _ ■

..... ........Т. А | «..А.... В.................А.. ЦЯ . . с7................ П .

... . Т А В -. А_^В_.____ * ВЯ__С ... - -И

•♦ЗСО*. СААОАТССАСССОАТЬАТ

»10УАА> АЛАТССТСТёТСТ&ААТААА »75Е?ГАй5т«ССТ6АСТАСС »74УАА. вЛТТТАСИСАС—-АСТАС(ЛЛ 100«УАА ССТиАСАСТАТАСТССй

««МОП* ТСЛАТТСАйСЛАЛАСГГЛТА »7СИХ»А1 ААААТН&АТбАСПСОСТ ««?УАА> ТСАС—АСТАСйААТТААЛ 1012УАЯ| АСТАТАСТССССТТТАСААА

»)У/АА-»1 ТСТСТСТОААТАЛЛТААСТС 11ЧОРОХ! бОСТТААТССА-ИССАТТ 9»«СОИ» ССАСАААСТААААААА6ТС

»Ь9МХГ САОАСАССОСЛССАС «24УАИ О"ТСТАГСТСАСАСТАТА

«42ЕАС: ОСАС--АССЛСАААТ7АЛА

М2УЛС. ССАС-—■АССЛССААТГЛЛЛ »5ЧУАС1 САСССЛС---ЛССАСйААТ ПООРОХ: ТСССОТТТИСААААСААА

Рис. 6. (окончание)

За MPXV по количеству видоспецифичных отличий идет VARV, имеющий 17 одно-нуклеотидных отличий и одну делецию в 6 нуклеотидов, которые на рис. 6 выделены красным цветом. 15 видоспецифичных нуклеотидов расположены удаленно друг от друга и не могут быть использованы в одном зонде, а 2 замены, расположенные в 857-й и 858-й позициях могут быть использованы в одном зонде. По замене в 523-м нуклеотиде среди VARV можно выделить африканские штаммы, кроме двух штаммов, имеющих последовательность, обозначенную как S/V6859. Штаммы, выделенные из района между Пакистаном и Сирией и имеющие генотип S/KUW, могут быть идентифицированы по замене в 242-м нуклеотиде. Штаммы S/SOM и S/V771 из Сомали имеют характерную замену в 563-м нуклеотиде. Штаммы variolla minor alastrim имеют отличительные замены в 641-ой и 911-ой позициях. Все изученные штаммы variolla minor имеют одну общую замену в 877-м нуклеотиде.

CMLV имеет только 6 видоспецифичных однонуклеотидных замен, выделенных сиреневым цветом на рис. 6. Причем две из них (в положениях 608 и 611) разделены только 2 нуклеотидами. Эта пара может быть использована в одном зонде. Кроме использования этих 6 видоспецифичных замен хотелось бы рассмотреть нуклеотиды в положении 479 и 485. Тимидин в 479-й позиции характерен для VARV и для CMLV, в то время как аденин в 485-й позиции характерен для MPXV и CMLV. Для идентификации VARV, CMLV и MPXV можно дополнительно добавить по одному зонду, содержащему одновременно видоспецифичные замены в положениях 479 и 485. Как и в случае MPXV и VARV, для CMLV существует возможность дифференциации различных изолятов в зависимости от региона их выделения. По однонуклеотидной замене в 167-м положении можно отличить изоляты, выделенные в Объединенных Арабских Эмиратах от выделенных в Иране и Казахстане.

Из оставшихся трех групп VACV, CPXV1 и CPXV2 только CPXV2 имеет одну видос-пепифичную замену, выделенную желтым цветом на рис. 6. Группы VACV и CPXV1 нельзя отличить друг от друга с использованием одной видоспецифичной замены, однако их можно различать по комбинации нескольких замен. Так, например, VACV можно отличить от других ОПВ по комбинации из трех замен в положениях 923,944 и 952.

В результате компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей ортопок-свирусного гена vCCI выявлены видоспецифичные отличия, которые могут быть использованы в качестве мишени при диагностике на олигонуклеотидном микрочипе.

3.2. Разработка метода идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе

Микрочип разрабатывали в сотрудничестве с исследователями лаборатории современных методов, FDA (США). При этом использовали коммерчески доступный вариант микрочипа с зондами, иммобилизированными на стекле. Так как при использовании этого типа микрочипа не требуется время на диффузию ДНК в гелевые ячейки, то время, необходимое на гибридизацию, составляет около 30 мин и с микрочипом данного типа можно гибридизовать образцы ДНК длиной до 1000 нуклеотидов.

Используя определенные нами нуклеотидные последовательности гена vCCI сотрудники FDA (США) рассчитали 48 олигонуклеотидных гибридизационных зондов для идентификации ОПВ (см. рис. 6) и сконструировали микрочип, схема которого представлена на рис. 7. В первом ряду помещены универсальные для всех ОПВ зонды, наличие гибридизационных сигналов в этом ряду показывает, что исследуемые образцы являются ортопоксвирусами. Во втором, третьем и четвертом ряду размещены видоспеци-фичные зонды для VARV, MPXV и CPXV2. Пятый ряд содержит три ячейки с зондами для CPXV1 и четыре для VACV. На рис. 6 показано расположение зондов относительно

выровненных последовательностей гена vCCI различных штаммов ОПВ. Также сотрудниками FDA были предложены гибридизационные зонды для идентификации вируса варицеллы зостер, которые на микрочипе расположены в шестом ряду. Так как на момент расчета зондов были известны последовательности гена vCCI для ограниченного набора штаммов, то данный микрочип содержал зонды только для идентификации VARV, MPXV, VACV, CPXV1 и CPXV2.

123436789 10

Все ОПВ <Эв«ев0«09». VARY ••••••••••

MPXV •••••••»to

'XV2

СР

СРХУ1 + УА'СУ «оааавв

утм »••ововеео

Рис. 7. Схематическое изображение расположения ячеек с олигонуклеотидами. Структуры олигонуклеотидных зондов приведены на рис. б.

Для проверки возможности идентификации ОПВ на микрочипе по гену vCCI была проведена ПЦР-амгошфикация с имеющихся у нас препаратов ДНК 45 штаммов 6-ти различных видов ортопоксвирусов. Пробирки с амплификационными фрагментами были закодированы. На следующем этапе сотрудники FDA (США) провели идентификацию фрагментов, не зная ДНК каких штаммов у них в наличии. Результаты были сопоставлены только после идентификации на микрочипе.

Некоторые варианты гибридизационных картин, полученных при тестировании микрочипа, приведены на рис. 8. У непатогенных для человека CMLV и ECTV картины гибридизации на микрочипе сильно отличались от гибридизационных шаблонов VARV, MPXV, VACV и CPXV (Рис. 9), у всех протестированных ОПВ была правильно определена видовая принадлежность.

Учитывая все вышесказанное, можно с уверенностью заключить, что использование этого района для диагностики ортопок-свирусов дает возможность различать различные виды ОПВ, что было продемонстрировано на разработанном микрочипе. Если к микрочипу добавить зонды, которые обсуждались в анализе выровненных оли-гонуклеотидных последовательностей для гена vCCI, то данный микрочип позволит различать штаммы MPXV, CMLV и VARV,

■•"•"Л г?т t:—~r • HWI д

H«tMlu< • • •• 6 M....IH' 7 •• 1

Рис 9. Наблюдаемые картины гибридизации ДНК А) СМЬУ; Б) ЕСТУ с гибри-дизационным микрочипом по гену уСС1. 1) СР/5; 2) СР/1; 3) СР/1269; 4) СР/1231; 5) Е/33221; 6) Е/4908; 7) Е/МР1; 8) Е/МР2

Рис. 8. Наблюдаемые картины гибридизации ДНК патогенных для человека ОПВ с гибридизационным микрочипом по гену vCCI. Картины получены для VARV штаммов Congo-2 (1), Ind-3A (2), 3) Kuw-5 (3); VACV штаммов Ebtree 3399 (4), COP (5), CVI-78 (6); CPXV2 штаммов Turk-74 (7) и Brighton (2); CPXV1 штаммов ЕР-1 (9), EP-2 (10) и ЕР-7 (11); MPXV штамма CDC# 77-666 (12); VZV штамма Oka (13), a также смесь VARV штамм Ind-3A и VZV штамм Oka (14).

выделенные из различных регионов. Для VARV по этому гену можно различать variolla minor и major. К недостаткам диагностики по данному району можно отнести сложность разделения VACV от некоторых штаммов CPXV.

4. Изучение структуры гена а/Аштерферонсвязывающего 6enKa(a/ß-IFNr) ортопоксвирусов'

С целью увеличения количества локусов, потенциально пригодных для видос-пецифичной диагностики ортопоксвирусов, в рамках данной работы было решено провести секвенирование и компьютерный анализ организации гена B19R (по номенклатуре VACV штамма Copenpagen), продукт которого является молекулярным фактором вирулентности ортопоксвирусов и поэтому может иметь видоспецифичные отличия по нуклеотидной последовательности.

Ген B19R кодирует секретеруемый на ранних стадиях инфекции белок, который функционирует как растворимый рецептор a/Jft-интерферона (а/Д-interferons receptor -a/ß-IFNr) и тем самым блокирует противовирусный клеточный ответ, индуцируемый a/^-интерфероном. После секретирования этот белок связывается как с уже инфицированными клетками, так и с неинфицированными, чем блокирует воздействие a/fi-интерферона на зараженные и незараженные клетки, тем самым подготавливая незара-женные клетки для последующего инфицирования.

Используя 15 нуклеотидных последовательностей гена белка a/ß-IFNr разных видов ортопоксвирусов, доступных в базе данных GeneBank, рассчитали праймеры пригодные для амплификации фрагментов ДНК содержащих ген белка a/ß-IFNr. Секвенирование проводили как с праймеров с которых амплифицировали фрагменты, так и с четырех дополнительных праймеров. В результате секвенирования были определены нуклеотидные последовательности 58 штаммов ОПВ, из них 19 - VARV, 5 - MPXV, 19 - CPXV, 8 -VACV, 5 - CMLV и 2 штамма ECTV. Суммарно определили 75,4 т п.н. Данные секвенирования были депонированы в базе данных GenBank.

С целью проведения анализа были выровнены нуклеотидные последовательности ор-топоксвирусного гена a/ß-IFNr как секвенированные нами, так и взятые из базы данных GenBank. Среди выровненных нуклеотидных последовательностей гена белка были удалены все повторяющиеся варианты. Для представителей всех, 37 выявленных генотипов белка был выполнен филогенетический анализ.

При анализе построенной филогенетической дендрограммы обнаружили, что штаммы ортопоксвирусов, за исключением CPXV, кластеризуются в группы по их видовому признаку (Рис. 10). Изоляты CPXV, как и в случае с геном vCCI, разделились на две подгруппы, обозначенные нами CPXV1 и CPXV2. Группа CPXV1 оказалась филогенетически ближе к VARV и CMLV, в то время как CPXV2 ближе к MPXV (см. рис. 10).

На филогенетической дендрограмме по гену a/ß-IFNr, в отличие от гена \СС1, штаммы VACV образуют отдельную группу, не пересекающуюся с CPXV. Из этого можно заключить, что на микрочипе с использованием зондов к данному району генома можно легко будет различать VACV от других ОПВ.

Изоляты MPXV и CMLV по гену a/ß-IFNr сохранили разделение по регионам выделения штамма, которое наблюдалось на дендрограмме по гену vCCI. Центрально-африканские изоляты MPXV по структуре изучаемого гена отличаются от западноафриканских M/LIB и M/BEN, a CMLV распадаются на две подгруппы: выделенные в Объединенных Арабских Эмиратах и изоляты из Ирана и Казахстана (см. рис. 10). В то же время различия VARV по гену не связаны с регионами происхождения

штаммов.

Анализ выровненных нуклсотидных последовательностей гена белка а/Р-КЫг позволил обнаружить «мозаичность» структуры этого гена при сравнении одних видов относительно других. На рис. 11 приведены все варианты последовательностей гена белка а/Р-ШНг и его окружения. Как видим, в 5"фланкирующем районе гена а/Р-1Р№г, выделенного серым блоком на рис. 11, наблюдаются точечные видоспе-цифичные отличия между различными видами ОПВ. Рассчитав зонды для этой области можно сконструировать микрочип, используя который можно будет различать все представленные виды ОПВ. На рис. 11 видоспецифичные замены, характерные для всех MPXV, выделены зеленым цветом, для ECTV - голубым, VARV - красным, CPXV2 - желтым. CMLV можно отличить от других ОПВ по комбинации замен в 44-м и 56-м нуклеотидах, кроме этого по 53-му нуклеотиду можно различать CMLV по регионам выделения штаммов. Замены в положениях 73, 88 и 92 характерны для всех VACV и для CPXV штамма GRI-90 (на рисунке не показан), который можно отличить от всех VACV по 48-му и 111-му положениям.

В начале гена а/р-ШИг • расположен консервативный район (175-370-й нуклеотид) в котором присутствуют единичные ви-доспецифичные замены. Наиболее интересен этот район тем, что он содержит единственную однонуклеотидную замену, ха-

Рис 10. Филогенетическая дендрограмма гена белка и/р-1ГМг. Каждая ветвь соответствует одному уникальному варианту последовательности, цифра в скобках указывает общее количество идентичных последовательностей. Цифрами в основаниях ветвей показаны результаты перестановочного анализа статистической значимости, полученного при анализе 1000 деревьев. Приведены только значения, превышающие 50. Шкала показывает размер единицы генетического расстояния.

рактерную сразу для всех VACV (373-й нуклеотид) и не встречающуюся у других видов ОПВ.

В районе 380-602 имеются множественные точечные отличия CPXV2, MPXV и VACV от других видов при высокой идентичности последовательностей между собой. Начиная с 503-го нуклеотида к ним присоединяется еще и ECTV. По району 500-526 можно идентифицировать все виды ОПВ. В этот район попадает одна видоспецифичная замена для MPXV (позиция 514), одна для CMLV (522), две для VARV (507 и 520). Остальные виды ОПВ можно идентифицировать по комбинации замен. Так, VACV можно идентифицировать по комбинации нуклеотидов в положениях 525-526, ECTV 500 и 520, a CPXV -методом исключения с учетом всех перечисленных замен.

3'-концевой район гена (602-1186) имеет высокую гомологию среди различных видов ОПВ с единичными видоспецифичными отличиями. З'-фланкирующий район гена (1187-1341) отличается высокой вариабельностью, и в нем присутствуют видоспеци-фичные отличия характерные только для CMLV, CPXV2 и ECTV.

1Б

c/m<j)

С/АМ«»> t/tfOi

ATAAT AT AT CC tATCCACCTACCAAAC7 ATAGTT CTAT TT---

• • rt*rCACGCTy>TiTATAfААДА -—CTCATATTATATAAtTATCTTAfiT ÜCC6-TATCATGAAAATGÄC<

. .6ТАТТТГГ С . T .... 16.. .ЛЛ-..

..«., е.. т . ...в а ... aas ............ в . i

, с . т «.....ал!...........5 . Я

■.....с . т......6 е.... aaS..........V в

—-• С т . ..ос. аа8......1.1

110

140

ко

iTGATCeiCC CT А TAT AT 7ТТСТАТСАТТА-

А А .......С.......ТСАТТА-

А А........С.......ТСАТТА'

ш.1

V/PAT V/Livr v/orv

У/ОМ

t/IWP«T(l0iA, СГ/12*0{}| .

.......- . А .A. «

......... А. А .С . А

........А А в

. . ..- . а » а

А А .

. А А.. ..А А . . А А

, ГСАГТА—

.........CTJ

ГЛвГТ-Т С . ТА гл1«т-т ,С ТА

г*5ттл7ТТтд глДгт т. .с 1 <&

T T | I « С . А~

TT II«9 m f

. А А..

, f-

. .ТСАТТАТСЛПА

i тсаттатсапа.

К/К1<1> |/HAV

-----, , Т Т I I 6 у ■.. А —

—f с ■ тт .."ас ... Аа-

H/»»«tJ)

Ч,., Г.Т

,АА__,

.....А* —

SM Ii« ко 210 240 {SO 2«0 tio г*0 }» 100 НО »го 130 НО 1«0 )?0 ЭОО

C/SHI3) ATА<ЛСА Т C6AAAATCAAA TCACACAATTCTTCAAtAAAA Т6АДА&АТ ACfCTAg САДСТAAAGACTCT ААА Т 1<СТТСААТСС АОСАТСТАТСТТТССАСССАС ААТСАСТAAT ATGGCTCCTATA <tfAüACCCATTCAOTGCAAACTCTCCTüCTАГТСААСАСАСТСТТТТATCGCA ГА6А ТAT »——А

С/|Г2(2| ............ ............................А.............................................................А6......С...С....... .............................................С.......АААОАТ

е/ВГОП) ...........................................А.................................................С........... АС .........................................................С........АААОАТ

......................... , ............. .................................................А О .

к с. с":

..А О... А .С ..С..., ..А «... А. С ..С... . А О ...А..С С..

V/MT v/vrvp V/M«

2/2SL

СГ/ШОШ er/mm i

, I I4rl

ТТ7УГГ

»0 40« «10 430 4)0 440 490 400 44 40» 4M 900 >10 920 »>0 940 9)0 вМ 170

C/tr)|]| AA0ACtATCTÜ8TTAAATq6«AIJWeTtAaAAAAaAATA^aACAACAaATTTCTAATA6ACCTCTTAAAAACaB

C/ttl(2l .....А........,.С.....«.*АА...«.....С.......CT-—-—-CT ..................................................СвА .. ОТ .............. в .в TT.................А... А............. С ....АС......

С/Ш|?| .... А.........С...,.».АЛЛ...*,....С.......CT——CT................................................ССА ...СОТ.................в в TT..................А....А............. С.....АС ......

......е т.....т...................................

v/uv»

V/AM» V/if£

..в...с.....

......CO.,

......Св..

......в

....с .

|7iio|7»[J|.....А||. i/tWMTUO) .....А I. 1..

CT/U«(i| .... А......

СГ/ЮЧ» ..А......

«>КН)> .....А.......

I/Ü51L-

. В й тт,

..4 ААА...С ..А С.... ..О ААА ..Р.. АС.

.. CT——СТ......

... CT------CT......

. СБА.. С6А

..в А^А.! в.... С......Ct—-—СТ..

..C.iy А ..8 ... С ...... CT——СТ.,

IgР 1

г- »

....... а г

. ССА,..

♦iWfii

M/a>ii»>

и/m . ,.

......в О....6.....

• с..............,.с е....с ....

. с т.... » .... ..С.Т.....У....■

Рнс. 11. Выровненные нуклеотидные последовательности гена белка a/ß-IFNr ортопоксвирусов с 5'- и З'-фланкирующнми районами. Псе последовательности сравниваются с CPXV штамма ЕР-3. Точками обозначены идентичные нуклеотяды; тире обозначают делеции. Цифрами над последовательностями обозначены относительные номера нуклеотидов. Двумя серыми блоками выделены старт- н стоп- кодо-ны трансляции. Блоками выделены замены характерные только для одного вида ортопоксвирусов.

, , > ,, s» \ ifo , , мо »10 ' • «о и») r ««» • «»o lui * «ю < ««о <«»o ,)м ?io 'мо do 7«o '»o m T?o

C/K'3<)> ТТСТТСЛТ GCATTOCA&AAATC T ATÇAACTластАСТСАТ*»АГAASTATOCAAT АШСТТATАСТСТССААТТATTTАССС ОААЛСАТТ AT ЛАТААТ ATААСТТССТAT АААСАТ ААТААДСАЛАТТ ААТ ATCTiATGATATTAAGTА ТТПАСАААС ÜGGAAAG6AATTААТТАУТСАТ AATCCAGCATTАСАА

С/КМ 13) ,,,.,.„ , ..v..... .v. ,«..л ....T.if' . ».....С-м...... Ct.» .................. ....................О. «г...........-Т.. ..»«•../.».. ..........*в . .

С/1НП) .....................................".................................................................

.....КС - .сл........, .............t ..тгд...т.т.......с . .. ir. . .....................

V/ »AT с

V/LIV» С .

. v/a»q .с . v/tu_,ç,

»/«OJ7t(»>.

, .а . с*

...

>.С А..

. С С... (Ч.-.С С ... С.....

• giiÇ,.

.... Аб . .....M .

зове

ГШ

>•0 190 100 010 120 ОМ 040 OSO 1*0 НО ООО >90 >00 tío »20 ОМ «40 SSO ом

«ThlKT^AG^TAe^ACTCTT ЛГГГГГ ftTTAC^SATCTT » Aft » rrjW-AflgTTt-lLAA¿rT ААТ ьегг А^ТССТAAAATCAACCTААС&ЛТAK^gAACCTGCCAATATААСАТ^САеТаГТСТСТСААСОТСАТ

с/ем PI

V/PAT V/1.IV» ,

v/mre

V/BM ■

»/moi?» Hi. »/mp«7(iO|L

...».......к.:.. :

H/t»*ÎJ» H/110

C/UIDI C/trîU)

Í/IHP) ..........

C/TCTLQl ......ACC..

V/»AT .... A .. С .

V/LIV» .... Д. ..С .

»/*« .... А V С..

»/molió«»'"..

тл

COA2tO(2J , СГЛтО) ,

.6.......А .

. T.....T .....

neo шо то

С/В»)IЭ) ССТТАСААСТАСАС7А6ТATTGCAti C/M2I2) С/М»(?»

Рис. 11. (окончанне)

Как упоминалось при анализе филогенетической дендрограммы (см. рис. 10), нуклеотид-ные последовательности гена a/B-IFNr различаются в зависимости от региона происхождения изолятов у МРХУ и СМЬУ. Штаммы МРХУ, выделенные в центральной Африке, можно отличить от западноафриканских штаммов по заменам в положениях 454 и 995. У СМЬУ штаммы, выделенные в Объединенных Арабских Эмиратах, отличаются от штаммов, выделенных в Иране и Казахстане, по положениям 53 и 856.

Таким образом, использование района гена a/B-IFNr для диагностики ортопоксвирусов дает возможность дифференцировать различные виды ОПВ. По структуре данного гена все виды ортопоксвивирусов филогенетически разделены, в отличие от гена vCCI, для которого некоторые штаммы СРХУ1 попадают в группу УАСУ.

Анализ структуры гена а/р-1К№ ортопоксвирусов выявил видоспецифичные различия, которые потенциально можно идентифицировать при гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе. После экспериментальной проверки данного генетического локуса в качестве мишени для нового варианта олигонуклеотидного микрочипа можно будет создать объединенный микрочип, обеспечивающий одновременный анализ по трем различным генам ортопоксвирусов: СгтВ, уСС! и а/р-1Ь№.

ВЫВОДЫ

1. Впервые определены нуклеотидные последовательности гена хемокинсвязывающего белка (уСС1) для 86 штаммов и гена а/(3-интерферонсвязывающего белка (о/р-П^г) для

58 штаммов шести видов ортопоксвирусов. Расшифрованные последовательности депонированы в базе данных ОепВапк.

2. В результате компьютерного анализа секвенированных генов уСС1 и а/р-Ц^г выявлены видоспецифичные различия, что позволяет использовать их в качестве мишени для диагностики и видовой идентификации ортопоксвирусов на олигонуклеотидном микрочипе. Впервые разработан олигонуклеотидный микрочип и показана возможность диагностики ортопоксвирусов по гену хемокинсвязывающего белка, специфичность которой проверена на препаратах ДНК 45 штаммов вирусов натуральной оспы, оспы коров, оспы обезьян, оспы верблюдов, осповакцины и оспы мышей (эктромелии).

3. Впервые разработан олигонуклеотидный микрочип для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов при использовании гена СгтВ в качестве мишени. На препаратах ДНК

59 штаммов вирусов натуральной оспы, оспы коров, оспы обезьян, оспы верблюдов, ос-повакцины доказана надежность и воспроизводимость разработанного метода.

4. В результате проведенного сравнения, предложен метод, позволяющий выделять орто-поксвирусную ДНК из инфицированных культур клеток, хорионаллантоисных оболочек куриных эмбрионов и корочек кожных поражений людей в количествах, достаточных для проведения ПЦР при наличии в исходных образцах 5-6 вирионов.

5. Разработана и утверждена методика выделения ДНК вирусов натуральной оспы и оспы обезьян в условиях лаборатории с уровнем био безопасности 4 (В8Ь-4) и передачи этой ДНК в лабораторию с уровнем биобезопасности 2 (В8Ь-2).

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Lapa S., Mikheev M., Shchelkunov S., Mikhailovich V., Sobolev A., Blinov V., Babkin I., Guskov A., Sokunova, Zasedatelev A., Sandakhchicv L., and Mirzabekov A. 2002. Species identification oforthopoxviruses on oligonucleotide microchip. J. Clin. Microbiol., V. 40, No 3, P. 753-757.

2. Михеев М.В., Лапа СА., Щелкунов С.Н., Чикова А.К., Михайлович В.М., Соболев А.Ю., Бабкин И.В., Грядунов Д.А., Булавкина М.А., Гуськов А.А., Сокунова Е.Б., Кочнева Г.В., Блинов В.М., Сандахчиев Л.С., Заседателев А.С., Мирзабеков А.Д. 2003. Видовая идентификация ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах. Вопр. Вирусологии, Т. 48, С. 4-9.

3. Laassri M., Chizhikov V., Mikheev M., Shchelkunov S., Chumakov К. 2003. Detection and discrimination of orthopoxviruses using microarrays of immobilized oligonucleotides. J. Virol. Methods, V. 112(1-2), P. 67-78.

4. Михеев М.В., Фещенко М.В., Щелкунов С.Н. 2004. Филогенетический анализ гена хемокинсвязывающего белка ортопоксвирусов. Мол. Генетика, Микробиол. Вирусология, № 1, С. 29-36.

Список докладов и сообщений, сделанных по теме диссертации:

1. Mikheev M.V., Feschenko M.V, Shchelkunov S.N. Comparative study ofthe Orthopoxvirus genes B19R and B29R. In: 3th Internetional conference on Bioinformatics of genome regulation,and structure, Novosibirsk, Russia. 2002, July 14-20, P. 13-15.

2. Shchelkunov S.N., Babkin I.V., Mikheev M.V., Gileva I.P., Ryazankin I A., Totmenin A.V., Nepomnyashchikh T.S., Feshchenko M.V., Shchelkunova G.A., Sandakhchiev L.S. (2002) Comparison of orthopoxviral virulence factors. In: The World of Microbes. Paris, France. 2002,27 July-1 August, Abstracts. V-493.

3. Babkin I.V., Mikheev M.V., Feshchenko M.V., Shchelkunov S.N. Phylogenetic analysis of conservative and variable orthopoxvirus genes. In: XTVth International Poxvirus and Iridovirus Workshop. Lake Placid, New York, 2002, Sept. 20-25, P. 96.

Подписано в печать 04.03.2004 Формат 60x84 1/16

Заказ № 35 Бумага офсетная, 80 гр/м1

Печл. 1 Тираж 100

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Институте катализа им. Г.К. Борескова СО РАН 630090,' Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

№ - 6 2 5 7

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Михеев, Максим Вячеславович

1. Список используемых сокращений.

2. Введение.

3. Обзор литературы.

3.1. Классические методы видовой идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека.

3.1.1. Морфологические методы.

3.1.2. Биологические методы.

3.1.3. Серологические методы.;.

3.2. Современные подходы к видоспецифичной идентификации вирусов.

3.2.1. Рестрикционный анализ вирусной ДНК.

3.2.2. Полимеразная цепная реакция.

3.2.3. Идентификация ортопоксвирусов с использованием полимеразной цепной реакции.

3.3. Олигонуклеотидные микрочипы.

3.3.1. Методы изготовления микрочипов.

3.3.2. Методы работы с микрочипами.

3.3.3. Практическое применение микрочипов в диагностических целях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск генов-мишеней для видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах"

Успехи кампании ликвидации оспы в мире, проводившейся Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) с 1958 года, привели к прерыванию трансмиссии вируса натуральной оспы (VARV) у людей. Последний случай оспы в мире был зарегистрирован 26 октября 1977 года. Последующие два года активного поиска не выявили новых очагов инфекции, и в \iae 1980 года ВОЗ объявила, что одержана победа над оспой.

Значение лабораторной диагностики в условиях, когда оспа искоренена, очень высоко. Это объясняется ниже перечисленными фактами.

Во-первых, в природе продолжают свободно циркулировать другие вирусы, относящиеся, как и вирус натуральной оспы, к роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae; в том числе патогенные для человека вирус оспы обезьян (MPXV), вирус оспы коров (CPXV), вирус оспы буйволов (BPXV) и непатогенные для человека вирусы эктромелии (оспы мышей) (ECTV), оспы верблюдов (CMLV) и некоторые другие (Bourke and Dumbell 1972; Маренникова и Щелкунов, 1998).

Во-вторых, в связи с прекращением вакцинации людей против оспы, у большинства людей отсутствует иммунитет к ортопоксвирусным заболеваниям. Это позволяет быстрее распространяться и изменяться в сторону большей патогенности в человеческой популяции ранее мало патогенным для человека ортопоксвирусам, типа CPXV и MPXV (Baxby and Bennett, 1997; Breman, 2000; Meyer et al., 1999; Mukinda et al, 1997). В настоящий момент известны примеры подтверждающие возможность такого развития событий: начавшаяся в 1996 г. в Конго и продолжающаяся до сих пор необычно массовая вспышка оспы обезьян среди людей (Mukinda et al, 1997, Hutin et al, 2001); а также известен случай завоза из Африки вируса оспы обезьян в США, когда был инфицирован им 71 человек (Update Weekly CDC, 2003).

В-третьих, известны случаи неправильной идентификации ортопоксвирусов. Например, поначалу вирус оспы обезьян не могли отличить от вируса натуральной оспы(Arita and Henderson, 1976; Marennikova, et al., 1972). Были случаи, когда герпесвирусные инфекции принимали за оспу обезьян (Jezek et al, 1988).

Кроме перечисленного выше вирус натуральной оспы рассматривается как потенциальное биологическое оружие (Spencer and Lightfoot, 2001; Breman and Henderson, 2002; Mahy, 2003; Mortimer, 2003), по этой причине в США ввели обязательную вакцинацию определенных групп людей (Cono et al., 2003).

Учитывая вышеизложенное, становится понятным, почему в эпидемиологической ситуации, сложившейся в настоящее время, необходимо располагать такими методами лабораторного исследования, которые бы давали возможность в короткие сроки расшифровать этиологию оспоподобного заболевания.

Появление метода амплификации фрагментов ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Bej et al, 1991) создало предпосылки к разработке вариантов процедур экспресс идентификации ортопоксвирусов. Данный метод позволяет проводить детекцию вирусов непосредственно в клинических материалах, для него не требуется какой-либо наработки тестируемого вируса, что особенно важно в случае высокопатогенных штаммов. В настоящее время описаны методы идентификации по генам геммаглютинина (Ropp et al., 1995), белка включения А-типа (Meyer et al., 1997) и белок модифицирующий ответ на цитокины белка (CrmB) (Loparev et al., 2001). Однако во всех работах при анализе расширенных выборок штаммов какого-либо вида ортопоксвирусов часто выявлялась их гетерогенность по спектруполучающихся субфрагментов, что вносило некоторую неоднозначность в трактовку получаемых результатов.

С разработкой техники олигонуклеотидных микрочипов появился новый метод диагностики различных заболеваний и дифференциации видов, основанный на ПЦР с последующей идентификацией гибридизацией на олигонуклеотидных микрочипах. Этот метод, так же как ПЦР, имеет преимущество - возможность обнаружения следовых количеств исследуемого материала в образце. Но в отличие от метода ПЦР микрочиповая технология позволяет анализировать образцы по множеству локусов одновременно, что повышает надежность полученных результатов. Ранее микрочипы для идентификации ортопоксвирусов не применялись.

Цели и задачи исследованияОсновной целью настоящего исследования была разработка вариантов метода видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, гибридизацией ПЦР-фрагментов вирусной ДНК на олигонуклеотидных микрочипах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:1) Подобрать метод выделения ДНК ортопоксвирусов из различных материалов, обеспечивающий эффективное проведение ПЦР на полученных образцах ДНК.

2) Предложить мишени для создания олигонуклеотидного микрочипа на основании имеющихся в вепеВапк нуклеотидных последовательностей генов ортопоксвирусов.

3) Определить нуклеотидные последовательности генов хемокинсвязывающего белка и а/р-интерферонсвязывающего белка ОПВ для имеющихся в нашей лаборатории штаммов ОПВ.

4) Идентифицировать видоспецифичные отличия в нуклеотидных последовательностях секвенированных ортопоксвирусных генов.

5) Проверить воспроизводимость результатов идентификации ОПВ наолигонуклеотидных микрочипах, разработанных совместно с ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва) и Управлением по контролю, за продуктами и лекарствами (Food and Drug Administration - FDA, США).

Научная новизна и практическая ценность работы1. Осуществлен выбор метода выделения ДНК вируса натуральной оспы и других ортопоксвирусов из инфицированных культур клеток, хорионаллантоисных оболочек развивающихся куриных эмбрионов и корочек кожных поражений людей.

2. Совместно с сотрудниками ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва) разработан и протестирован олигонуклеотидный микрочип для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов по фрагменту гена СгтВ.

3. Секвенирован ген хемокинсвязывающего белка для 86 штаммов ортопоксвирусов разных видов. На основании компьютерного анализа сделано заключение о возможности видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе.

4. Совместно с сотрудниками FDA (США) разработан и протестирован вариант олигонуклеотидного микрочипа для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов по гену хемокинсвязывающего белка.

5. Секвенирован ген ортопоксвирусного a/ß-интерферонсвязывающего белка для 58 штаммов 6-ти видов ортопоксвирусов. Проведенный компьютерный анализ позволил выявить видоспецифичные различия в структуре данного гена, перспективные для использования в технологии гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе.

Основные положения выносимые на защитуРазработан метод, позволяющий выделять ортопоксвирусную ДНК из инфицированных культур клеток, хорионаллантоисных оболочек куриных эмбрионов и корочек кожных поражений людей в количествах, достаточных для проведения одной ПЦР при наличии в них 5-6 вирионов.

Утверждена методика выделения ДНК из вируса оспы человека и вируса оспы обезьян в условиях лаборатории с биологической безопастностью 4-го уровня. Впервые определены нуклеотидные последовательности ортопоксвирусных генов хемокинсвязывающего белка 86 штаммов и a/p-интерферонсвязывающего белка 58 штаммов. Суммарно было определено 170 т.п.н. Данные секвенирования депонированы в базе данных GenBank.

Для генов СгтВ, хемокинсвязывающего белка и a/p-интерферонсвязывающего белка Выявлены видоспецифичные замены, которые могут быть использованы в качестве мишени для диагностики и видовой идентификации ортопоксвирусов на олигонуклеотидном микрочипе.

Совместно с сотрудниками ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва) и FDA (США), разработано 2 олигонуклеотидных микрочипа для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов.

Публикации по теме диссертацииLapa S., Mikheev М., Shchelkunov S., Mikhailovich V., Sobolev A., Blinov V., Babkin I., Guskov A., Sokunova, Zasedatelev A., Sandakhchiev L., and Mirzabekov A. 2002. Species identification of orthopoxviruses on oligonucleotide microchip. J. Clin. Microbiol., V. 40., N 3., P. 753-757.

Михеев M.B., JIana С.А., Щелкунов C.H., Чикова А.К., Михайлович В.М., Соболев А.Ю., Бабкин И.В., Грядунов Д.А., Булавкина М.А., Гуськов А.А., Сокунова Е.Б., Кочнева Г.В., Блинов В.М., Сандахчиев JI.C., Заседателев А.С., Мирзабеков А.Д. 2003. Видовая идентификация ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах. Вопр. Вирусологии, Т. 48., С. 4-9.Laassri М., Chizhikov V., Mikheev М., Shchelkunov S., Chumakov К. 2003. Detection and discrimination of orthopoxviruses using microarrays of immobilized oligonucleotides. J. Virol. Methods., V. 112(1-2)., P. 67-78.

Михеев M.B., Фещенко M.B., Щелкунов C.H. 2004. Филогенетический анализ гена хемокинсвязывающего белка ортопоксвирусов. Мол. Генетика, Микробиол. Вирусология, Т. 1., С. 29-36.Mikheev M.V., Feschenko M.V, Shchelkunov S.N. Comparative study of the Orthopoxvirus genes B19R and B29R. In: 3th Internetional conference on Bioinformatics of genome regulation and structure, July 14-20,2002, Novosibirsk, Russia. P. 13-15.Shchelkunov S.N., Babkin I.V., Mikheev M.V., Gileva I.P., Ryazankin I.A., Totmenin A.V., Nepomnyashchikh T.S., Feshchenko M.V., Shchelkunova G.A., Sandakhchiev L.S. (2002) Comparison of orthopoxviral virulence factors. In: The World of Microbes. Paris, France. 2002, 27 July-1 August, Abstracts. V-493.Babkin I.V., Mikheev M.V., Feshchenko M.V., Shchelkunov S.N. Phylogenetic analysis of conservative and variable orthopoxvirus genes. In: XlVth International Poxvirus and Iridovirus Workshop. Lake Placid, New York, 2002, Sept. 20-25, P. 96.

Вклад автора. Секвенирование генов хемокинсвязывающего (vCCI) и а/р-интерферонсвязывающего (a/fl-IFNr) белков большого набора штаммов ортопоксвирусов выполнено лично автором. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ортопоксвирусных генов vCCI, a/p-IFNr и СгтВ выполнен лично автором. Автором лично проведен выбор метода выделения ДНК вируса натуральной оспы и других ортопоксвирусов в условиях лаборатории высокой физической защиты, разработана «Методика приготовления ДНК вируса натуральной оспы и вируса оспы обезьян», обеспечившая возможность выделения и выноса в биохимическую лабораторию с уровнем биобезопасности 2 препаратов ДНК вируса натуральной оспы. Создание олигонуклеотидного микрочипа для видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов гибридизацией с последовательностями гена СгтВ осуществлено сотрудниками Центра микрочипов ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва) при участии автора. Олигонуклеотидный микрочип для одновременной идентификации ортопоксвирусов и вируса ветряной оспы разработан сотрудниками лаборатории современных методов, FDA (США) при участии автора.

3. Обзор литературы3.1. Классические методы видовой идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека3.1.1. Морфологические методыТяжесть клинического течения, высокая контагиозность заболевания (35-45%), эпидемический характер распространения, летальность, колебавшаяся от 1% в странах Африки и Южной Америки до 45% в странах азиатского субконтинента (Henderson, 1976), а также невозможность в ряде случаев отличить оспу только по клиническим признакам от везикулярных заболеваний, вызываемых вирусами группы герпеса и близкородственными ортопоксвирусами (Bourke and Dumbell 1972; Маренникова и Щелкунов, 1998), явились теми факторами, которые способствовали развитию системы лабораторной диагностики.

Лабораторная диагностика является одним из направлений вирусологии,V,базирующемся на ее успехах и достижениях. В середине XX столетия, лабораторной диагностики вирусных инфекций не существовало вообще и дискутировался вопрос ее необходимости. Это объяснялось тем, что вирусология еще 50-60 лет тому назад не располагала методами, которые бы были достаточно чувствительны и специфичны для индикации различных вирусов. Известным тормозом в развитии этого направления вирусологии являлось также отсутствие специфической противовирусной терапии, что снижало ценность лабораторного подтверждения диагноза заболевания. Между тем, существует много примеров, иллюстрирующих чрезвычайно большую роль, которую сыграла лабораторная диагностика. В странах, неэндемичных по оспе, дифференциальный диагноз кожных везикулярных болезней иногда представлял большие трудности. Поэтому значение своевременной диагностики сыграло огромную роль в быстрой локализации эпидемических очагов завозных вспышек натуральной оспы.

В связи с этим уже на ранних этапах развития вирусологии для целей лабораторной диагностики оспы применяли ряд приемов, позволявших в течение 24 часов после поступления материала в лабораторию, давать ответ о наличии или отсутствии в нем поксвирусов. Среди этих методов наиболее ранним был метод вирусоскопии - обнаружения в материале от подозрительных на оспу больных элементарных телец вируса, названных по имени их описавшего автора - тельца Пашена. Наибольшее признание в России на первых порах получил способ окрашивания вирионов методом серебрения, предложенный М.А. Морозовым (Морозов, 1924). Модифицированный Гиспеном (Gispen, 1952) вариант этого метода входил в число рекомендованных ВОЗ в 1969 году методов диагностики оспы (World Health Organization, 1969). Метод вирусоскопии, хотя и давал большой выигрыш во времени, вследствие простоты, доступности и быстроты получаемого ответа, но его эффективность зависела от вида исследуемого материала. При использовании пустулезной жидкости и, особенно, корок возможность обнаружения вируса, а главное, достоверность получаемых результатов значительно снижалась. Затруднительной является и дифференциация телец Пашена от несколько меньших по размеру телец Арагао - возбудителя ветряной оспы. Вследствие указанных недостатков метод вирусоскопии с начала 70 годов XX века практически не использовался.

Значительно более широкое применение для лабораторной диагностики оспы наихел метод электронной микроскопии (ЭМ). Вирусы были одними из первых биологических объектов, наблюдавшихся с помощью электронного микроскопа. В 1948 году во время эпидемии оспы в Нью-Йорке было показано, что с помощью ЭМ можно расшифровать этиологию кожных везикулярных заболеваний, вызванных покс- и герпес вирусами (Nagler and Rake, 1948). Однако только после разработки метода негативного контрастирования (Brenner and Home, 1959) ЭМ по существу стала использоваться в качестве диагностического метода. Использование этого метода стало возможным благодаря накоплению знаний о морфологии и размерах вирусных частиц. Идентификация ортопоксвирусов может легкобыть осуществлена по характерному строению вириона, имеющего овальную или кирпичеобразную форму и размеры 100-260x100-260x200-390 нм (Bourke and Dumbell 1972). Согласно последним данным, ортопоксвирусы имеют размеры 200x200x250 нм (Muller and Williamson, 1987; Virus Taxonomy, 2000). Существуют три главных структурных компонента поксвирусов: нуклеоид, латеральные тела, ассоциированные с нуклеоидом, и внешняя оболочка. Внешняя оболочка - двойная липопротеидная мембрана толщиной 5 нм. На ее поверхности находятся тубулярные структуры, располагающиеся хаотично. Нуклеоид зрелых частиц имеет двояковогнутую форму, в вогнутых изгибах располагаются латеральные тельца (Muller and Williamson, 1987; Virus Taxonomy, 2000). Морфология нуклеоида одинакова у всех ортопоксвирусов (Muller and Williamson, 1987). В технике негативного контрастирования используется натриевая соль фосфорно-вольфрамовой кислоты, которая проникая внутрь некоторых вирионов, например, в вирионы С-формы, делает видимой их внутреннюю структуру. У вирионов М-формы, не пропускающих внутрьГ ч.краски, негативное контрастирование подчеркивает особенности структуры их поверхности.

Использование ЭМ возможно на любой стадии заболевания, хотя в струпах, как правило, наблюдается больше вирионов, чем при исследовании везикулярной и пустулезной жидкостей, но они более разрушены (Long et al, 1970). Чувствительность этого метода находится в пределах 105 - 107 вирионов на мл (Macrae, 1967) и может быть повышена до 103,5 вирионов предварительной обработкой образца специфическими антителами (Маренникова и др., 1990). Помимо этого, добавление специфических антител позволяет осуществлять видовую дифференциацию ортопоксвирусов и значительно сокращается время, необходимое для просмотра, и повышается достоверность ответа (Marennikova et al., 1988; Маренникова и др., 1990). При сравнении трех методов - ЭМ, реакции преципитации в агаре и выделении вируса на куриных эмбрионах - для обследования различных материалов от 849 больных, наивысший процент положительных находок был при электронной микроскопии (Long et al, 1970; Nakano, 1973). Более высокая чувствительность ЭМ посравнению с выделением вируса на куриных эмбрионах может быть объяснена за счет того, что при ЭМ, в отличие от выделения вируса, было возможно выявление инактивированного вируса.

К дополнительным преимуществам данного метода можно отнести быстроту получаемого ответа: для проведения исследования требуется всего 1,5 — 2 часа. Кроме того эффективность ЭМ, в отличие от метода обнаружения вирусных частиц с использованием светового микроскопа, не зависит от характера материала для исследования (везикулярная, пустулезная жидкости, струпы, соскоб папул) (Мальцева, 1980).

В связи с тем, что диагностическая ценность метода ЭМ была подтверждена рядом исследователей, в 1971 году он стал обязательным диагностическим исследованием, проводимым сотрудничающими центрами ВОЗ в период программы глобальной ликвидации оспы и постэрадикационного эпиднадзора (Fenner and Nakano, 1988).

Сообщая о высокой чувствительности и надежности этого метода быстрой диагностики оспы, большинство исследователей отмечают ряд его недостатков. К числу последних следует отнести необходимость наличия громоздкого и дорогого оборудования, которое может позволить себе не всякая диагностическая лаборатория, и необходимость в высококвалифицированном персонале. При использовании метода ЭМ без обработки специфическими антителами,. отсутствует возможность проводить видовую дифференциацию ортопоксвирусов.

3.1.2. Биологические методыДаже тогда, когда наличие вируса было доказано при помощи выше описанных методов, выделение оспенного вируса оставалось наиболее важным методом диагностики оспы. Для выделения вируса рекомендовались различные процедуры, среди которых инокуляция взятого от больного материала чувствительным животным, инокуляция в культуры клеток и инокуляция в хорионаллантоисную оболочку развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ) (Маренникова и др., 1963, 1964). Выделение вируса как методподтверждения позволяет определить его видовую принадлежность начиная с самых ранних стадий инфекции и заканчивая отторжением последнего струпа. Так, известен случай выделения вируса на ХАО РКЭ, зараженных глоточным смывом, взятым на 3-й день болезни от больного, у которого оспа протекала без сыпи (Маренникова и др., 1963).

Спектр чувствительных к ортопоксвирусам тканевых культур практически не ограничен (ВахЬу, 1975; №капо, 1977; Маренникова и др., 1963, 1964). Для.их выделения могут быть использованы однослойные культуры различных первичных и перевиваемых клеток (почечные ткани обезьян, фибробласты эмбрионов человека, диплоидные и перевиваемые линии человека и др.). Метод основан на способности вирусов вызывать цитопатическое действие (ЦГТД). Как и выделение на куриных эмбрионах метод является одним из наиболее чувствительных. Метод выделения вируса из монослоя клеток позволяет получать положительные результаты при исследовании везикулярной, пустулезной жидкости и из струпов больного практически в 100% случаев (исключение составляли образцы, доставленные из жарких стран, для которых положительные результатыполучались в 94% случаев), а также выявлять вирус в образцах, содержащих его в малых количествах (Маренникова и др., 1963; Мальцева, 1980).

Одним из недостатков метода является трудность дифференциации близкородственных ортопоксвирусов. С этой целью был предложен ряд дополнительных приемов, в частности, неспособность вируса оспы обезьян, в отличие от' других ортопоксвирусов, активно репродуцироваться в перевиваемой линии клеток почек эмбриона свиньи применяли для идентификации этого вируса (Маренникова и др., 1971). Для дифференциации ортопоксвирусов в культуре клеток использовали различные маркеры: характер ЦПД, морфология и сроки появления бляшек, а также характер внутриклеточных включений (Маренникова и др., 1964; Гурвич и Маренникова, 1964). Значительно большие возможности дифференциации ОПВ дает метод, основанный на различии ЦПД при изменении температуры, при которой проводили инкубацию. Данный метод позволяет дифференцировать не только различные роды ОПВ, но и VARV minor от major (Гурвич и Маренникова, 1964).

Для дифференциации ортопоксвирусов использовали также различную чувствительность лабораторных животных к этим вирусам. Так, в частности, характер реакции при накожном заражении кроликов позволяет отличить вирус натуральной оспы от вируса осповакцины, оспы обезьян и оспы коров (Маренникова, 1962; Маренникова и Мальцева, 1964).

Общим недостатком всех биологических методов, включающих в себя выделение вируса на ХАО, культурах клеток и чувствительных животных, является получение положительных результатов в лучшем случае через 72 часа, а иногда, в случае необходимости подтвердить диагноз, через 6-7 суток (Гурвич и Маренникова, 1964). Это значительно снижало ценность такой лабораторной диагностики этой опасной инфекции.

3.1.3. Серологические методы Методами быстрой диагностики оспы, используемыми на ранних этапах, являются различные серологические реакции с целью обнаружения специфического комплекса антиген-антитело. Методы, основанные на этом принципе, получили название непрямых. Использование этих методов шло по двум направлениям: для обнаружения специфических антител в сыворотках больных и для выявления вирусных антигенов. Для обнаружения и количественной оценки антител применяли различные серологические реакции. Среди наиболее часто употребляемых, классических, - реакция нейтрализации вируса, при которой специфические антитела блокируют характерный эффект, вызываемый вирусом в соответствующей биологической системе. К таким реакциям относятся:- Реакция связывания комплемента (РСК), при которой комплекс антиген-антитело адсорбирует комплемент и тем самым задерживает гемолиз бараньих эритроцитов;- Реакция торможения гемагглютинации (РТГА), при которой антитела, соединяясь с вирусом, предотвращают агглютинацию эритроцитов кур, вызываемую рядом ортопоксвирусов. Этот метод позволяет в большинстве случаев дифференцировать натуральную оспу от осповакцины по значительно превосходящим титрам антигемагглютининов (АГА) (Маренникова и Щелкунов, 1998). В ходе наблюдений было установлено, что максимальные титры АГА отмечались, как правило, на 10-15 день болезни, после чего наблюдалось их постепенное снижение. Благодаря простоте и доступности этот метод использовали для серологических обследований людей и животных, в частности, в исследованиях по выявлению вирусов оспы обезьян и оспы коров (Jezek and Fenner, 1988). В 1981-1983 годах было проведено серологическое обследование населения ряда Африканских стран, в ходе которого производилась сравнительная оценка различных методов выявления антител к ортопоксвирусам. В этом исследовании было показано, что РТГА значительно уступает по чувствительности реакции нейтрализации и иммуноферментному анализу(ИФА), для которых в 15% и 19% случаев, соответственно, были обнаружены антитела при отрицательном результате в РТГА.

Методы РСК и РТГА не отвечали требованиям, предъявляемым к методам быстрой диагностики. Так, наличие антикомплементарных факторов в везикулярной, пустулезной жидкостях и суспензии корок от больного делало невозможным, в ряде случаев, использование РСК. Что касается РТГА, то этот тест не являлся, по существу, методом быстрой диагностики, так как имел диагностическую ценность только при обнаружении не менее, чем четырехкратного нарастания титра антигемагглютининов в сыворотках больного, полученных с интервалом не менее 5-7 дней (Мальцева, 1980).

Значительно более обнадеживающие результаты, по сравнению с РСК и РТГА, были получены при использовании для диагностики оспы реакции микропреципитации в агаре (РМПА) (Маренникова и Мальцева, 1961). Существует несколько модификаций.данного метода. Прямая постановка метода основана на образовании в агаровом геле зон преципитации при взаимодействии вирусного антигена со специфической сывороткой (Маренникова и Мальцева, 1961). Ранее его широко использовали в диагностической практике в комплексе с другими методами. Однако, несмотря на методическую простоту, его существенным недостатком, является его более низкая чувствительность, по которой он значительно уступает классическим методам диагностики оспы; кроме того, при использовании этого метода иногда получаются ложноположительные результаты.

Известно, что РМПА в ее обычной постановке не дает возможности четко дифференцировать наиболее важные с практической точки зрения ортопоксвирусы: вирусы натуральной оспы, оспы обезьян и осповакцины. Значительно более четкие результаты в РМПА были получены с серией антивидовых гипериммунных кроличьих сывороток. В этом тесте серологическая неидентичность вируса устанавливалась при неполном слиянии полос преципитации и образовании «шпор» (Рис. 1). Как видно на рис. 1, помимо антигенов, которые являются общими для исследуемых вирусов (слияние полос преципитации), каждыйиз них имеет специфические антигены, образующие «шпоры». Эти результаты послужили предпосылкой для возникновения двухступенчатой РМПА. а также РМПА с моноспецифичными сыворотками. Таким образом, появились модификации метода РМПА. которые с успехом использовали для выявления специфичных для вирусов натуральной оспы, оспы обезьян и осповакцины антигенов в течение 24 часов. Чувствительность данных методов не отличается от чувствительности обычной РМПА. внутригрупповая дифференциация близкородственных ОПВ возможна только, если концентрация вируса в исследуемом материале довольно высока и составляет не менее 104 ООЕ/мл (Мальцева, 1980).

Рис. 1. Реакция неполной антигенной идентичности вирусов натуральной оспы и осповакцины, выявляемая в РМПА. Верхняя лунка - гипериммунная антносповакцинная кроличья сыворотка. Левая лунка - вирус осповакцины (штамм ЭМ-63). Правая лунка - вирус натуральной оспы (штамм Harvey). Стрелкой показана «шпора» образующаяся при неполной преципитации (Мальцева, 1980).

В начале 70-х годов был разработан диагностический препарат для выявления поксвирусов в реакции непрямой гемагглютинации (PHI"А). Этот препарат состоял из бараньих эритроцитов, нагруженных специфическими lgG-антителами. Тестирование этого метода на материалах от больных, подозрительных на заболевание натуральной оспой, показала его высокую чувствительность и специфичность, значительно выше РМПА (Носков и др., 1972). Па основании этих наблюдений метод РИГА был внесен в «Инструкцию по лабораторной диагностике оспы». В ходе программы глобальной ликвидации оспы данныйметод был использован в качестве метода быстрого обнаружения оспенного антигена (Носков и др., 1972). Сравнение результатов, полученных в РНГА, с данными полученными методами выделения вируса на ХАО РКЭ и ЭМ, показало, что только в 70% случаев было получено совпадение результатов. Чувствительность этого теста, могла бы быть выше, если бы не сомнительные реакции, наблюдавшиеся в 18% случаев при исследовании струпов от больных с лабораторно подтвержденной оспенной инфекцией (Мальцева, 1980). Позже эти побочные реакции были эффективно устранены путем предварительной сорбции неспецифических гемагглютининов бараньими эритроцитами (Шелухина и др., 1986). Благодаря относительно высокой чувствительности и простоте этот тест может использоваться в полевых условиях, например, для диагностики оспы обезьян у людей в эндемических очагах инфекции.

Другим методом, использующимся для быстрой лабораторной диагностики ортопоксвирусных инфекций был, метод иммунофлуоресценции (ИФ) (Авакян и др., 1961). Метод основан на обнаружении комплекса антиген-антитело путем конъюгации молекулы антитела с флуоресцирующими красителями. Использование ИФ с диагностической целью для выявления антигенов ортопоксвирусов давал высокую эффективность при исследовании препаратов, взятых на ранних периодах заболевания (макуло-папулезной и везикулярной жидкостей). Чувствительность ИФ на этих стадиях не отличается от ЭМ, выше,.чем при РНГА и значительно выше, чем в РМПА. Исследования мазков пустулезной жидкости иикорок часто давал недостоверные результаты из-за наличия неспецифического свечения тканевого дебриса лейкоцитов. Применение приема предварительного накопления вируса в чувствительной культуре клеток, хотя и увеличивал время исследования до 16-20 часов по сравнению с 1,5 часа, необходимыми для исследования мазков, делало ИФ приемлемой для исследования материала, полученного на любой стадии заболевания (Гурвич и РойхеЛь, 1965). При этом чувствительность метода не отличалась от таковой для ЭМ и метода выделения вируса на ХАО РКЭ (Мальцева, 1980). Использование различных температурныхгрежимов при инкубации зараженных культур клеток не является достаточно надежным для дифференциации ортопоксвирусов, так как количество и состав очагов клеток с цитоплазматическим свечением и наличие многоядерных клеток в препаратах в значительной степени зависит от концентрации вируса в исследуемом материале (Мальцева,г1980). Проблема частично решалась при использовании моноспецифических антител, которые позволяют проводить дифференциацию близкородственных ортопоксвирусов (Мальцева, 1980). .

Использование пероксидазы в качестве ферментной метки антител позволило упростить метод ИФ. Этот вариант метода получил название иммуноферментного анализа (ИФА). Не отличаясь от ИФ по чувствительности и специфичности, метод обладает целым рядом преимуществ. ИФА легче стандартизировать, так как легко избежать использования специфических ферментных коньюгатов путем применения комплекса пероксидаза — антипероксидаза. Окрашенные препараты долго хранятся и возможно применение как световой, так и электронной микроскопии.В отличие от ИФ метод не давал неспецифического окрашивания лейкоцитов, хотя примесь крови в препаратах затрудняла интерпретацию результатов, так как эритроциты содержат эндогенные пероксидазы (МальцеваГ1980).

Модификация метода ИФА, использующая адсорбированные на пластинах антитела получила название твердофазного иммуноферментного анализа. Данный метод в отличие от ИФА и ИФ, при исследовании коррк от больных не давал отрицательных или сомнительных результатов. Что касается специфичности твердофазного ИФА, то при исследованиигматериалов от больных ветряной оспой и герпесом зостер ни в одном случае не были получены ложноположительные результаты. По чувствительности этот метод превосходит не только другие методы быстрой лабораторной диагностики оспы, но и самый чувствительный биологический метод — выделение вируса на куриных эмбрионах — так как в нем можно выявлять инактивированный вирус. К другим достоинствам метода относятся:методическая простота, минимальные количества требуемых реагентов, наличие автоматизированных систем для ИФА-анализа и быстрота получаемого ответа: менее 3,5 часов при наличии готовых тест-систем. Дальнейшее усовершенствование этого метода шдо в направлении создания возможности определения видовой принадлежности ортопоксвирусов. С этой целью используются моноспецифические сыворотки или моноклональные антитела к различным видам ортопоксвирусов (Мальцева, 1980).г3.2. Современные подходы. к видоспецифичной идентификации вирусовВ последнее время к традиционным микробиологическим и иммунологическим методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний добавились новые, основанные на использовании молекулярно-генетических технологий. Разработка молекулярных методов детекции видоспецифичных отличий основана на следующих основных принципах: ■ ' ■1. Комплементарность нуклеотидных оснований - аденин всегда гибридизуется с гуанином, а тимидин с цитозином;2. При нагревании происходит разъединение цепей ДНК (денатурация);3. При охлаждении происходит восстановление двухцепочечной структуры в соответствии с правилом комплементарное™ нуклеотидов;г4. Расщепление молекулы ДНК может быть достигнуто с помощью специальных бактериальных ферментов - эндонуклеаз, рестрицирующих молекулу ДНК в местах со строго определенной для каждой эндонуклеазы последовательностью нуклеотидов;г5. Искусственный ферментативный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro (ПЦР);6. Фрагменты ДНК в полиакриламидном или агарозном гелях легко разделяются под действием электрического тока; положение фрагментов ДНК при электрофорезе определяется размерами ДНК-фрагментов.

3.2.1. Рестрикционный анализ вирусной ДНКПервый метод идентификации поксвирусов на основе последовательности ДНК состоял в гидролизе ДНК рестриктазой и последующем электрофоретическом разделении образовавшихся фрагментов в агарозном геле. Хотя разные виды ортопоксвирусов по последовательности ДНК имеют высокий уровень гомологии, тем не менее их. можно различить по спектру фрагментов, генерируемых той или иной рестриктазой. (Esposito et al., 1978; Mackett and Archard, 1979; Esposito and Knight, 1985). Однако штаммы ортопоксвирусов, принадлежащие одному виду, могут существенно различаться по спектру рестрикционных фрагментов (Маренникова и др., 1996; Esposit and Knight, 1985), что осложняет использование данного метода для дифференциации ортопоксвирусов.гНедостатком такого анализа является необходимость осуществления препаративной наработки.и высокой очистки образца вируса, что существенно удлиняет время анализа по сравнению с другими методами диагностики^ Поэтому-данный подход не получил широкого — распространения при идентификации поксвирусов.

3.2.2. Полимеразная цепная реакцияПосле открытия в середине 80-х годов XX века принципа ПЦР появилась реальная возможность прямой детекции возбудителей инфекционных заболеваний (Mullis and Falona, 1987; Stoflet et. al, 1988; Шипулин и др., 1998).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro. Общая схема ПЦР приведена на рис. 2. Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом - ДНК-полимеразой, как и в клетках живых организмов. ДНКполимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не может начать синтез цепи ДНК "с нуля", ей необходима короткая "затравочная" цепь РНК или ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды (Mullís and Falona, "1987; Stoflet et. al, 1988).

Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтезагполимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами "затравочной" ДНК) в каждом из множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров "узнавать" строго определенный участок ДНК и связываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарности (Mullís and Falona, 1987; Stoflet et. al, 1988).

В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые "ограничивают" амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы. Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК' нужна цикличность реакции. Как правило, каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов (см. Рис. 2А):

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Михеев, Максим Вячеславович

7. Выводы

1) Впервые определены нуклеотидные последовательности гена хемокинсвязывающего белка (уСС1) для 86 штаммов и гена а/р-интерферонсвязывающего белка (а/р-1РМг) для

2) В результате компьютерного анализа секвенированных генов уСС1 и №№ выявлены видоспецифичные различия, что позволяет использовать их в качестве мишени для диагностики и видовой идентификации ортопоксвирусов на олигонуклеотидном микрочипе. Впервые разработан олигонуклеотидный микрочип и показана возможность диагностики ортопоксвирусов по гену хемокинсвязывающего белка, специфичность которой проверена на препаратах ДНК 45 штаммов вирусов натуральной оспы, оспы коров, оспы обезьян, оспы верблюдов, осповакцины и оспы мышей (эктромелии).

3) Впервые разработан олигонуклеотидный микрочип для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов при использовании гена СгтВ в качестве мишени,. На препаратах ДНК

59 штаммов вирусов натуральной оспы, оспы коров, оспы обезьян, оспы верблюдов, осповакцины доказана надежность и воспроизводимость разработанного метода.

4) В результате проведенного сравнения, предложен метод, позволяющий выделять ортопоксвирусную ДНК из инфицированных культур клеток, хорионаллантоисных оболочек куриных эмбрионов и корочек кожных поражений людей в количествах, достаточных для проведения ПЦР при наличии в исходных образцах 5-6 вирионов.

5) Разработана и утверждена методика выделения ДНК вирусов натуральной оспы и оспы обезьян в условиях лаборатории с уровнем биобезопасности 4 (В5Ь-4) и передачи этой ДНК в лабораторию с уровнем биобезопасности 2 (В5Ь-2).

6. Заключение

В связи с прекращением вакцинации людей против оспы у большинства людей отсутствует иммунитет к ортопоксвирусным заболеваниям. Это позволяет быстрее распространяться и изменяться в сторону большей патогенности в человеческой популяции ранее малопатогенным для человека ортопоксвирусам, таким как CPXV и MPXV (Baxby and Bennett, 1997; Breman, 2000; Meyer et al., 1999; Mukinda et al, 1997). Начавшаяся в 1996 г. в Конго и продолжающаяся до сих пор массовая вспышка оспы обезьян среди людей (Mukinda et al, 1997, Hutin et al, 2001) подтвердила возможность такого развития событий. Более того, в 2003г. зарегистрирована вспышка оспы обезьян среди людей в США (Update Weekly CDC, 2003) и оспы коров среди людей в Бразилии. Кроме всего перечисленного, вирус натуральной оспы рассматривается как потенциальное биологическое оружие (Spencer and Lightfoot, 2001; Breman and Henderson, 2002; Mahy, 2003; Mortimer, 2003).

Учитывая вышеизложенное, становится понятным, почему необходимо располагать такими методами лабораторной диагностики, которые бы обладая высокой чувствительностью, давали возможность в короткие сроки расшифровать этиологию оспоподобного заболевания.

Одним из таких методов, появившимся в последнее десятилетие, является метод диагностики различных заболеваний и дифференциации видов, основанный на идентификации посредством гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом. Область применения микрочипов быстро расширяется. В настоящее время микрочипы уже используются для диагностики вирусных и бактериальных инфекций, а.также в поиске наследственных болезней. Использование микрочипов позволяет быстро обнаруживать устойчивых к антибиотикам бактерий. С помощью микрочипов определяют уровень экспрессии генов. Данная работа посвящена разработке метода диагностики ортопоксвирусов гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе.

На пути к достижению этой цели были выбраны методы выделения ДНК из различных типов образцов: Метод Б позволяет выделять ДНК из ХАО РКЭ и жидких образцов в течение 1 ч; Метод В оптимизирован для выделения ДНК из высушенных образцов, таких как высушенная кровь и струпы, полученные от больных оспой, на его выполнение требуется около 2 ч. Количества ДНК, выделенной из 6 вирионов, очищенного в градиенте сахарозы вируса VACV штамма ЛИВП, в образце объемом 50 мкл оказалось достаточным, для надежного получения специфического ПЦР-продукта. Выполненные исследования позволили разработать и утвердить методику выделения ДНК вируса натуральной оспы и вируса оспы обезьян в условиях лаборатории BSL-4.

С целью определения района генома ортопоксвирусов, пригодного для конструирования олигонуклеотидного микрочипа, осуществили поиск в международном банке данных (GeneBank) гена, структура которого известна для наибольшего числа штаммов. На момент поиска это был ген СгтВ, структура которого была известна для 53 различных штаммов ортопоксвирусов, принадлежащих видам: VARV, CPXV, MPXV, VAC, CMLV. С помощью компьютерного анализа последовательности гена СгтВ ортопоксвирусов были выявлены видоспецифичные замены и выбран район для разработки олигонуклеотидного микрочипа.

Используя выровненные нуклеотидные последовательности предложенного локуса гена СгтВ, совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии имени Энгельгардта РАН (г. Москва), были рассчитаны 14 олигонуклеотидных зондов для пяти, участков с видоспецифичными отличиями и был сконструирован олигонуклеотидный микрочип. Специфичность метода была проверена на ДНК 59 штаммов 6-ти различных видов ОПВ. На 16 из 59 использованных образцов ортопоксвирусных ДНК была проверена воспроизводимость результатов гибридизацией на микрочипе в четырех повторах.

С целью увеличения количества локусов, по которым может проводиться идентификация ортопоксвирусов, проведено секвенирование ортопоксвирусных генов хемокинсвязывающего белка и a/p-интерферонсвязывающего белка. Для гена хемокинсвязывающего белка определены последовательности 86 штаммов ОПВ, из них 24 -VARV, 19 - MPXV, 23 - CPXV, 10 - VACV и по 5 штаммов CMLV и ECTV. Для гена а/ринтерферонсвязывающего белка определены последовательности 58 штаммов ОПВ, из них 19 - VARV, 5 - MPXV, 19- CPXV, 8 - VACV, 5 - CMLV и 2 штамма ECTV! Суммарно было, определено 170 т.п.н. Данные секвенирования депонированы в базе данных GenBank.

При проведении компьютерного анализа полученных данных секвенирования выявлены видоспецифичные отличия в нуклеотидных последовательностях генов vCCI и a/ß-IFNr, которые могут быть использованы в качестве мишени при диагностике на олигонуклеотидном микрочипе.

Совместно с сотрудниками FDA (США) по гену vCCI был разработан олигонуклеотидный микрочип, содержащий 48 олигонуклеотидных гибридизационных зондов для видоспецифичной идентификации ОПВ, а также 10 зондов для идентификации вируса варицеллы зостер. Проверка возможности идентификации ОПВ на микрочипе по гену vCCI была проведена на препаратах ДНК 45 штаммов шести различных видов ортопоксвирусов. У всех протестированных ОПВ была правильно определена видовая принадлежность.

Анализ структуры гена a/ß-IFNr ортопоксвирусов выявил видоспецифичные различия, которые потенциально можно идентифицировать при гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе. После экспериментальной проверки данного генетического локуса в качестве мишени для нового варианта олигонуклеотидного микрочипа можно будет создать объединенный микрочип, обеспечивающий одновременный анализ по трем различным генам ортопоксвирусов: CrmB, vCCI и a/ß-IFNr.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Михеев, Максим Вячеславович, Кольцово

1. Авакян A.A., Альтштейн А.Д., Кириллова Ф.М., Быковский А.Ф. 1961. Пути усовершенствования лабораторной диагностики оспы. Вопр. Вирусол., №2., с. 196-200.

2. Бабкин И.В., Петров H.A., Каблова Г.В., Петров B.C., Щелкунов С.Н., Сандахчиев JI.C. 1997. Изучение вариабельности генов A27L и A56R ортопоксвирусов. Докл. РАН., Т.357,№1, С. 117-122.

3. Бароян О.В., Серенко А.Ф. 1961. Вспышка оспы в Москве в 1959-1960 гг. // Журн. микробиол. № 4. С. 72-79.

4. Гаврилова Е.В., Бабкин И.В., Щелкунов С.Н. 2003. Мультиплексный ПЦР- анализ для видоспецифичной экспресс идентификации ортопоксвирусов. Молекурлярная генетика, микробиология и вирусология, Т. 1, С. 45-51.

5. Гурвич Э.Б., Маренникова С.С. 1964. Лабораторная диагностика оспы и сходных с ней вирусных заболеваний с помощью метода тканевых культур. Acta virol. V. 8, p. 435-442.

6. Гурвич Э.Б., Ройхель В.М. 1965. Возможности метода флуоресцирующих антител в диапюсике и дифференциальной диагностике оспы. Acta Virol., т.9, №2., с.165-171.

7. Иванов И.Б., Ершов Г.М., Барский В.Е., Бельговский А.И., Кирилов Е.В., Крейндлин Э.Я., Паринов C.B., Мологина Н.В., Мирзабеков А.Д. 1997. Диагностика генетических мутаций на олигонуклеотидных микрочипах. Мол. Биол., Т. 31., № 1., с. 159-167.

8. Мальцева H.H. 1980. Экспресс-диагностика заболеваний, вызванных ортопокс- и некоторыми герпес вирусами. Дис. Докт. Мед. Наук. 412с.

9. Маренникова С.С. 1962. Материалы по изучению возбудителя, лабораторной диагностике и экстренной профилактике натуральной оспы. Дис. Доктора мед. Наук. 431с.

10. Маренникова С.С., Гурвич Э.Б., Юмашева М.А. 1963. Лабораторная диагностика оспы и сходных с ней вирусных заболеваний с помощью метода тканевых культур. Acta virol., V. 7., р. 124-130.

11. Маренникова С.С., Гурвич Э.Б., Юмашева М.А. 1964. Лабораторная диагностика оспы и сходных с ней вирусных заболеваний с помощью метода тканевых культур. Acta virol. V. 8., p.135-142.

12. Маренникова С.С., Мальцева H.H. 1961. Использование реакции микропреципитации на стекле для лабораторной диагностики натуральной оспы. Вопр. вирусол. Вып.2. С.204-206.

13. Маренникова С.С., Мальцева H.H. 1964. Сравнительное изучение некоторых штаммов вируса вакцины. Сообщение II. Патогенность для лабораторных животных. Вопр. Вирусологии, Т. 3., С. 287-291.'

14. Маренникова С.С., Шелухина Э.М., Гурвич Э.Б. 1971. Идентификация вируса неотличимого от возбудителя натуральной оспы среди обезьян. Вопр. Вирусологии, № 4., с. 470-473.

15. Маренникова С.С., Шелухина-Э.М., Ефремова Е.В. 1984. Новый взгляд на биологию вируса оспы коров. Acta Virol., V. 57., С. 437-444.

16. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. 1998. Патогенные для человека ортопоксвирусы. Москва «КМК Scientific Press Ltd». 386с.

17. Маренникова С.С., Янова H.H., Жукова O.A. 1990. Электронная микроскопия как метод диагностики при эпидемиологическом надзоре за поксвирусными инфекциями. Ж. микробиол. Вып. 8. С. 57-62.

18. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. ,№01-19/52-17. Утв. Госкомсанэпиднадзором 22.06.95.

19. Морозов М.А. 1924. О тельцах Пашена. Врач. Дело., Вып.24-26., С.1449-1450.

20. Носков Ф.С., Маренникова С.С., Конникова P.E. и др. 1972., Применение реакции непрямой гемагглютинации для лабораторной диагностики натуральной оспы. Вопр. Вирусол., № 3., С. 347-351.

21. Певзнер П.А., Лысов Ю.П.; Храпко K.P., Белявский А. В., Флорентьев В. Л., Мирзабеков А.Д. 1991. Оптимальные чипы для мегабазного секвенирования ДНК. Мол. Биол., Т. 25., С. 552 561.

22. Приказ Минздрава РФ № 64 от 21.02.2000 г "Об Утверждении Номенклатуры Клинических Лабораторных Исследований"

23. Шелухина Э.М., Леви М.И., Мацевич Г.Р., Маренникова С.С., Хабахпашева Н.А. 1986.

24. Возможности реакции пассивной гемагглютинации как метода быстрого обнаружения ортопоксвирусов и антител к ним. Вопр. Вирусол., Вып. 6., С.756-750.

25. Шипулин Г. А., Саркисян К. А., Богословская Е. В., Шипулина О. Ю., Воробьева М. С. 1998. Место полимеразной цепной реакции в диагностике ВИЧ-инфекции. Эпидемиология и инфекционные болезни, №5, С. 59-63.

26. Щелкунов С.Н. 1996. Ортопоксвирусный геном: Обзор. Молекуляр. биол., Т.30, №1, С.5-32.

27. Arita I., Henderson D.A. 1976. Vondeypox and whitepox viruses in West and Central Africa. Bull. Wld. Hlth. Org., V. 53., P. 347-353.

28. Bavykin S. G., Akowski J. P., Zakhariev V. M., Barsky V.E., Perov A.N., Mirzabekov A.D. 2001. Portable system for microbial sample preparation and oligonucleotide microarray analysi. Appl. Environ. Microbiol., V. 67., P. 922-928.

29. Baxby D. 1975. Identification and interrelationship of the variola-vaccinia subgroup of poxviruses. Progr. Med. Virol., V. 19., p. 215-246.

30. Baxby D., Bennett M., 1997. Cowpox: a re-evaluation of the risks of human cowpox based on new epidemiological information. Arch. Virol., V. 13 (Suppl.). P. 1-12.

31. Bedson H.S., Dumbell K.R. 1964. Hybrids derived from the viruses of variola major and cowpox. J. Hygiene. V. 62., P. 147-158.

32. Bej A.K., Mahbubani M.H., Atlas R.M. 1991. Amplification of nucleic acids by polymerase chain reaction (PCR) and other methods and their applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., V. 26., P. 301-334.

33. Blanchard A.P., Kaiser R.J., Hood L.E. 1996. High-density oligonucleotide arrays. Biosens. Bioelectron., V. 11., P. 687-690.

34. Blin N, Stafford D.W. 1976. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes. Nucleic Acid Res., V. 3, 2303.

35. Bourke A.T.C., Dumbell K.R. 1972. An unusual poxvirus from Nigeria. Bull. Wld. Hlth. Org., V. 45., p. 621-623.

36. Bowtell D.D. 1999. Options available-from start to fmish-for obtaining expression data by microarray. Nat. Genet. Suppl., V. 21., P. 25-32.v 45. Breman J.G. 2000. Monkeypox: an emerging infection for humans? Eds W.M. Scheld et. al.,

37. Emerging infection 4., ASM Press., Washington D.C., P.45-67.

38. Breman J.G., Henderson D.A. 2002. Diagnosis and management of smallpox. N. Engl. J. Med., V. 346., P. 1300-1308.

39. Brenner S., Home R.W. 1959. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta, V. 34., P. 103-110.

40. Chizhikov V., Wagner M., Ivshina A., Hoshino Y., Kapikian A. Z., Chumakov K. 2002. Detection and genotyping of human group a rotaviruses by oligonucleotide microarray

41. W hybridization. J. Clin. Micr., V. 40., P. 2398 2407.

42. Cono J., Casey C.G., Bell D.M. 2003. Smallpox Vaccination and Adverse Reactions: Guidance for Clinicians. MMWR. V. 52(RR04), p. 1-28.

43. Cronin M.T., Fucini R.V., Kim S.M., Masino R.S., Wespi R.M., Miyada C.G. 1996. Cystic fibrosis mutation detection by hybridization to light-generated DNA probe arrays. Hum. Mutat., V. 7., P. 244-255.

44. Crowther J.R. 2002. The ELISA Guidebook. Methods in Molecular Biology, V. 149. New Jersey: Humana Press, pp. 446.

45. Diehl F., Beckmann B., Kellner N. Hauser N.C., Diehl S., Hoheisel J.D. 2002. Manufacturing DNA microarrays from unpurified PCR products. Nucleic Acid Res., V. 30., No. 16

46. Douglass N.J., Richardson V., Dumbell K.R. 1994. Evidence for recent genetic variation in monkeypox viruses. J. Gen. Virol., V. 75., P. 1303-1309.'

47. Dragon A.D., Spadoro J.P., Madej R. 1993. Quality Control of Polymerase Chain Reaction.

48. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. Washington: ASM Press; pp.160.

49. Duggan D.J., Bittner M., Chen Y., Meltzer P., Trent J.M. 1999 Expression profiling using cDNA microarrays. Nat. Genet. Suppl., V. 21., P. 10-14.

50. Dumbell K.R. Huq F. 1986. The virology of variola minor. Correlation of laboratory tests with ^ the geographic distribution and human virulence of variola isolates. Amer. J. Epidemiol., V.123., P. 403-415.

51. Esposito J.J., Knight J.C. 1985. Orthopoxvires DNA: A comparison of restriction profiles and maps. Virology., V. 143., №. 1., P. 230-251.

52. Esposito J.J., Obijeski J.F., Nakano J.H. 1978 Orthopoxvirus DNA: strain differentiation by electrophoresis of restriction endonuclease fragmented virion DNA. Virology., V. 89., P.53-66.

53. Fenner F. 1958. The biological characters of several strain of vaccinia, cowpox, and rabbitpox viruses. Virology., V. 5., P. 502-509.

54. Fenner F., Nakano J.H. 1988. Poxviridae.// Laboratory Diagnosis of Infection Diseases: Principles and Practices (E.H.Lennette, P. Halonen, F.A. Murphy, eds.). V.2. Viral, rickettsial and chlamydial diseases. Chapter 10. New York: Springer Verlag.

55. Fodde R., Losekoot M. 1994. Mutation derection by denaturating gradient gel electrophoresis (DGGE). Hum. Mutat., V. 2., P. 404-414.

56. Fodor S.P.A., Read J.L., Pirrung M.C., Stryer L., Lu A.T., Solas D. 1991. Light-directed spatially addressable parallel chemical synthesis. Science, V. 251., P. 767-773.

57. Fotin A.V., Drobyshev A.L., Proudnikov D.Y., Perov A.N., Mirzabekov A.D. 1998. Parallel thermodynamic analysis of duplexes on oligodeoxyribonucleotide microchips. Nucleic. Acids Res.,V. 6., P. 1515-1521.

58. Gillespie D., Spiegelman S. 1965. A quantitative assay for DNA-RNA hybrids with DNA immobilized on a membrane. J. Mol. Biol. V. 12., P. 829-842.

59. Gispen R. 1952. Silver impregnation of smallpox elementary bodies after treatment of xylol. Antonia v. Lecuwenhoek. J. Microbiol. Serol., V.19., P.157-165.

60. Goebel S.J., Johnson G.P., Perkus M.E., Davis S.W., Winslow J.P., Paoletti E. 1990 The complete DNA sequence of vaccinia virus. Virology., V. 179., P. 247-266.

61. Gunderson K.L., Huang X.C., Morris M.S., Lipshutz R.J., Lockhart D.J., Chee M.S. 1998. Mutation detection by ligation to complete n-mer DNA arrays. Genome Res., V. 8., P. 11421153.

62. Guschin D., Yershov G., Zaslavsky A. 1997. Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA, and protein microchips. Anal. Biochem., V. 250., P.203-211.

63. Hacia J.J., Edgemon K., Fang N., Mayer R.A., Sudano D., Hunt N., Collins F.S. 2000. Oligonucleotide microarray based detection of repetitive sequence changes. Hum. Mutat., V. 16., P. 354-363.

64. Hall T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.Nucl. Acids. Symp. Ser., V. 41., P. 95-98.

65. Head S. R., Rogers Y., Parikh K., Lan G., Anderson S., Goelet P., Boyce-Jacino M. T. 1997. Nested genetic bit analysis (N-GBA) for mutation detection in the p53 tumor suppressor gene. NAR., V. 25., P. 5065 5071.

66. Heller R. A., Schena M., Chai A., Shalon D., Bedilion T.,' Gilmore J., Woolley D. E., Davis R. W. 1997. Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 94, P. 2150-2155.

67. Henderson D.A., 1976. The eradication of smallpox. Scientific American., V. 235., №4., p.25-35.

68. Jeannmougin F., Thompson J.D., Gouy M., Higgins D.G., Gibson,T.J. 1998. Multiple sequence alignment with Clustal X. Trends Biochem. Sci., V. 23, P. 403-405.

69. Jezek Z., Fenner F. 1988. Human Monkeypox. // Monographs in Virology. V.17 (Melnick J.L., ed.) Basel-Munchen Paris-London-New York-New Delhi-Singapore-Tokyo-Sydney:1. Karger. 140 pp.

70. Jezek Z., Szczeniowski M., Paluku K.M., Mutombo M., Grab B. 1988. Human monkeypox: confusion with chickenpox. Acta .Tropica, V. 45., P. 297-307.

71. Kane M.D., Jatkoe T.A., Stump C.R., Lu J., Thomas J.D., Madore S.J. 2000. Assessment of the sensitivity and specificity of oligonucleotide (50mer) microarrays. Nucleic Acids Res. V.28., №. 22., P. 4552-4557.

72. Kumar S., Tamura K., Jakobsen I.B., Nei M. 2001. MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis software. Arizona State University Tempe. Arizona.

73. Li J., Chen S., Evans D.H. 2001. Typing and Subtyping Influenza Virus Using DNA Microarrays and Multiplex Reverse Transcriptase PCR. J. Clinical Microbiol., V. 39., P. 696704.

74. Lipshutz R.J., Fodor S.P.A., Gingeras T.R., Lockhart D.J. 1999. High density synthetic oligonucleotide arrays. Nat. Genet. Suppl., V. 21., P. 20-24.

75. Long G.W., Noble J., Murphy F.A., Herrmann K.L., Lourie B. 1970. Experience with electron microscopy in the differential diagnosis of smallpox. Appl. Microbiol., V. 20., P. 497 504.

76. Loparev V.N., Massung R.F., Esposito J.J., Meyer H. 2001. Detection and differentiation of old world orthopoxviruses: restriction fragment length polymorphism of the crmB gene region. J. Clin. Microbiol., V. 39., P. 94-100.

77. Lusso P. 2000. Chemokines and viruses: The Dearest enemies. Virology., V. 273., P. 228-240.

78. Mackett M., Archard L.C. 1979. Conservation and variation in orthopoxvirus genome structure. J. gen. Virol., V. 45., P. 683-701.

79. Macrae A.D. 1967. Laboratory diagnosis of smallpox. Mon. Bull. Min. Public Health Lab. Serv.,V. 26, P. 189-191.

80. Mahy B.W.J. 2003. An overview on the use of a viral pathogen as a bioterrorism agent: why smallpox? Antiviral Research, V. 57., P.l-5.

81. Marennikova S.S., Nagieva F.G., Matsevich G.R., Shelukhina E.V., Khabahpasheva N.A., Platonova G.M. 1988. Monoclonal antibodies to monkeypox virus: preparation and application. Acto Virol., V. 33., P. 246-253.

82. Marennikova S.S., Shelukhina E.M., Malceva N.N. et al. 1972. Isolation and properties of the casual agent of a new variola like disease (mankeypox) in man. Bull. Wld. Hlth. Org., V. 46., p. 599-611.

83. Marmur J., Doty P. 1961. Thermal renaturation of deoxyribonucleic acids. J. Mol. Biol. V. 3., P. 585-594.

84. Massung R.F., Liu L.I., Qi J., Knight J.C., Yuran T.E., Kerlavage A.R., Parsons J.M., Venter J.C., Esposito J.J. 1994. Analysis of the complete genome of smallpox variola major virus strain, Bangladesh-1975. Virology, V. 201., P. 215-240.

85. Matson R.S., Rampal J., Pentoney S.L., Anderson P.D., Coassin P. 1995. Biopolymer synthesis on polypropylene supports: oligonucleotide arrays. Anal. Biochem., V. 224., P. 110116.

86. Meyer H., Neubauer H., Pfeffer M. 2002. Amplification of 'variola virus-specific' sequences in German Cowpox virus isolates. Journal of Veterinary Medicine, V. 49., P. 17-19.

87. Meyer H., Pfeffer M., Rziha H.J. 1994. Sequence alteration within and downstream of the Atype inclusion protein genes allow differentiation of Orthopoxvirus species by polymerase chain reaction. J. gen. Virol. V. 75., P. 89-101.

88. Meyer H., Ropp S.L., Esposito J.J. 1997. Gene for A-type inclusion body protein is useful for a polymerase chain reaction assay to different ortholpoxviruses. J. Virol. Meth., V. 64., P. 217-221.

89. Meyer H., Schay C., Mahnel H., Pfeffer M. 1999 Characterization of orthopoxviruses isolated from man and animals in Germany. Arch Virol., V. 144., P. 491-501.

90. Milner N., Mir K.U., Southern E.M. 1997. Selecting effective-antisense reagents on combinatorial oligonucleotide arrays. Nat. Biotech." V. 15., P. 537-541.

91. Mortimer P.P. 2003. Can Postexposure Vaccination against Smallpox Succeed? Clinical Infectious Diseases, V. 36, P.622-629.

92. Mukinda V. В., Mwema G., Kilundu M., Heymann D.L., Khan A.S., Esposito J.J. 1997. Re-emergence of human monkeypox in Zaire in 1996. Lancet., V. 349., P. 1449-1450. .

93. Muller G., Williamson J.D. 1987. Poxviridae. / In: Animal virus structure. Perspectives in Medical Virology (Eds. Nermut M.V., Steven A.C.). Elsevier. Amsterdam-New York-Oxford., V. 3., P. 421-433.

94. Mullis K.B., Faloona, F. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods Enzymol., V. 155., P. 335-350.

95. Murray A. E., Lies D., Li G., Nealson K., Zhou J., Tiedje J. M. 2001. DNA/DNA hybridization to microarrays reveals gene-specific differences between closely related microbial genomes. PNAS, V. 98., P. 9853 9858:

96. Nagler F.P.O., Rake G. 1948. The use of electron microscope in diagnosis of variola, vaccinia and varicella. J. Bacteriol., V. 55.', №. 1., P.45-51.

97. Nakano J.H. 1973. Evaluation of virological laboratory methods for smallpox diagnosis. Bull. Wld. Hlth. Org., V. 48., P. 529-534.

98. Nakano J.H. 1977. Comparative diagnosis of poxvirus diseases. In: Kurstak E.(ed.) Comparative diagnosis of viral diseases. New York Acad. Press., V. 1. Human and related viruses., part 1., p. 287-339.

99. Nei, M., Kumar S. Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University.Press. - New York.-2000.-333 pp.

100. Neubauer H., Pfeffer M., Meyer H. 1997. Specific detection of mousepox virus by polymerase chain reaction. Laboratory Animals, V. 31., P. 201 -205.

101. Neubauer H., Reischl U., Ropp S., Esposito J.J., Wolf R, Meyer H. 1998. Specific detection of monkeypox virus by polymerase chain reaction. J. Virological Methods, V. 74., P. 201-207.

102. Newton C.R., Graham A. 1996. PCR. Oxford: Bios Scientific Publishers., p. 18.

103. Nygaard A. P., Hall. B. D. 1964. Formation and properties of RNA-DNA complexes. J. Mol. Biol. V. 9., P. 125-142.

104. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Sekya T. 1989. Detection of polymorphism of heman DNA by gel electorphoresis as single cell conformation polymorphism. Proc. Natl. Acad. Sci., V. 86., P. 2766-2770.

105. Parinov S., Barsky V., Yershov G., Kirillov E., Timofeev E., Belgovskiy A., Mirzabekov A. 1996. DNA sequencing by hybridization to microchip octa- and decanucleotides extended by stacked pentanucleotides. NAR., V. 24., P. 2998 3004.

106. Patel A.H., Gaffney D.F., Subak-Sharpe J.H., Stow N.D. 1990. DNA sequence of the gene encoding a major secreted protein of vaccinia virus, strain Lister. J. Gen. Virol., V. 71., P. 2013-2021.

107. Persing D.H, Cimino G.D. 1993. Amplification Product Inactivation Methods. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. Washington: ASM Press, pp.105.

108. Pilaski J., Rosen A., Darai G. 1986. Comparative analysis of the genomes of orthopoxviruses isolated from elephant, rhinoceros, and okapi by restriction enzym es., Brief report. Arch Virol., V. 88., P.135-142.

109. Pilaski J., Rosen-Wolff A. 1988. Poxvirus infection in zoo-kept mammals. Virus Diseases in Laboratory and Captive Animals. Darai, G. ed., P. 83-100

110. Porwollik S., Wong R. M., McClelland M. 2002. Evolutionary genomics of Salmonella: Gene acquisitions revealed by microarray analysis. PNAS, V. 99., P. 8956 8961.

111. Proudnikov D., Timofeev E., Mirzabekov A. 1998. Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manufacture of DNA and DNA oligonucleotide microchips. Anal. Biochem. V. 259., P. 34-41.

112. Pulford D. J., Meyer H., Ulaeto D. 2002. Orthologs of the vaccinia A13L and A36R virion membrane protein genes display diversity in species of the genus Orthopoxvirus. Arch. Virol., V. 147., №5, P. 995-1015.

113. Rampal J.B. 2001. DNA Arrays: Methods and Protocols. V. 170. New Jersey: Humana Press, pp. 264.

114. Ropp S.L., Jin Q., Knight J.C., Massung R.F., Esposito J.J. 1995. PCR strategy for identification and differentiation of smallpox and other orthopoxviruses. J. Clin. Microbiol., V. 33., P. 2069-2076.

115. Rychlik W., Rychlik P. Oligo 6: Primer analysis software. Molecular biology insights. -Connecticut-2000.

116. Schena M., Shalon D., Davis R.W., Brown P.O. 1995. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science, V. 270., P. 467-460.

117. Schena M.1999. DNA microarrays: A practical approach. New York: Oxford University Press, pp. 210.

118. Schroder S., Weber J., Pau H. 2001. 50 nucleotide long probes on microarrays enable high signal intensity and high specificity. Genomic Discovery.

119. Shchelkunov S.N., Massung R.F., Esposito J.J. 1995. Comparison of the genome DNA sequences of Bangladesh-1975 and India-1967 variola viruses. Virus Res., V.36,№1, P.107-118.

120. Shchelkunov S.N., Resenchuk S.M., Totmenin A.V.„ Blinov V.M., Marennikova S.S., Sandakhchiev L.S. 1993. Comparison of the genetic maps of variola and vaccinia viruses. FEBS Lett., V.327,№3, P.321-324.

121. Shchelkunov S.N., Totmenin A.V., Loparev V.N., Safronov P.F., Gutorov V.V., Chizhikov V.E., Knight J.C., Parsons J.M., Massung R.F., Esposito J.J. 2000. Alastrim smallpox varioia minor virus genome DNA sequences. Virology., V.266,№2, P.361-386.

122. Sosnowski R.G., Tu E., Butler W.F., O'Connell J.P., Heller M.J. 1997. Rapid determination of single base mismatch mutations in DNA hybrids by direct electric field control. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 94., P. 1119-1123.

123. Southern E.S., Mir K., Shchepinov M. 1999. Molecular interactions on microarrays. Nat. Genet. Suppl. V. 21., P. 5-9.

124. Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoreses. J. Mol. Biol., V. 98., P. 503-517.

125. Spencer R.C., Lightfoot N.F. 2001. Preparedness and response to bioterrorism.' J. Infect., V. 43., P. 104-110.

126. Stoflet E.S., Koeberl D.D., Sarkar G., Sommer S.S. 1988. Genomic amplification with transcript sequencing. Science, V. 239., P. 491-494.

127. Tinsley C.R., Perrin A., Borezee E., Nassif X. 2002. Neisseria microarrays. Methods Enzymol. V. 358., P. 188-207.

128. Update: Multistate Outbreak of Monkeypox — Illinois, Indiana, Kansas, Missouri, Ohio, and Wisconsin, 2003. CDC. MMWR. Weekly. V. 52., P. 642-646.

129. Virus Taxonomy. 2000. Academic press. Seventh report of the international committee on taxonomy of viruses, (ed. Van Regenmortel et al). P.137-157.

130. Volokhov D., Rasooly A., Chumakov K., Chizhikov V. 2002. Identification of listeria species by microarray-based assay. J. Clin. Micr., V. 40., P. 4720 4728.

131. Wallace R.B., Shaffer J., Murphy R.F., Bonner J., Hirose T., Itakura K. 1979. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucleic Acids Res. V. 6(11)., P. 3543-3557.

132. Wang D., Coscoy L., Zylberberg M., Avila P. C., Boushey H. A., Ganem D., DeRisi J. L. 2002. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. PNAS, V. 99., P. 15687 -15692.

133. Wang R., Beggs M. L., Robertson L. H., Cerniglia C. E. 2002. Design and evaluation of oligonucleotide-microarray method for the detection of human intestinal bacteria in fecal samples. FEMS Microbiol. Lett., V. 213., P. 175 182.

134. Watson J. D., Crick F. H. 1953. Molecular structure of nucleic acids: structure for deoxyribose nucleic acid. Nature V. 248., P. 737-738.

135. Watson J.D. 1968. The double helix. (Norton critical edition. 1980), London: W.W. Norton & Co., pp 298.

136. World Health Organization. 1969. Guide to the laboratory diagnosis of smallpox for smallpox eradication programmes. Geneva: WHO.

137. Yu J., Othman M.I., Faijo R., Zareparsi S., MacNee S.P., Yoshida S., Swaroop A. 2002. Evaluation and optimization of procedures for target labeling and hybridization of cDNA microarrays. Molecular Vision, V. 8., P. 130-137.

Информация о работе

Михеев, Максим Вячеславович
кандидата биологических наук
Кольцово, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Поиск генов-мишеней для видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Поиск генов-мишеней для видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на олигонуклеотидных микрочипах - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы