Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация возбудителей неонатальных инфекций и заболеваний, имеющих схожую с натуральной оспой клиническую картину, с помощью биологических микрочипов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация возбудителей неонатальных инфекций и заболеваний, имеющих схожую с натуральной оспой клиническую картину, с помощью биологических микрочипов"

На правах рукописи

003452227 Мызникова Анна Игоревна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ НЕОНАТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ЗАБОЛЕВАНИЙ, ИМЕЮЩИХ СХОЖУЮ С НАТУРАЛЬНОЙ ОСПОЙ КЛИНИЧЕСКУЮ КАРТИНУ, С ПОМОЩЬЮ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОЧИПОВ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

003452227

Диссертация выполнена в Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН в лаборатории биологических микрочипов.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Михайлович Владимир Михайлович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дегтярева Марина Васильевна

доктор биологических наук, профессор Чуриков Николай Андреевич Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита диссертации состоится "24" октября 2008 г. в_часов на заседании совета по

защите докторских и кандидатских диссертаций Д 501.001.76 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова, по адресу 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан "_" сентября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук -""""^Г? ^—V - И.А. Крашенинников

I,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. К настоящему времени известны 4 основных вида вирусов, принадлежащих роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae, способных вызвать заболевания человека различной степени тяжести. Наиболее опасным представителем данной таксономической группы является вирус натуральной оспы (variola major), обязательная вакцинация против которого была отменена в 1979 году после завершения международной программы по его искоренению.

Доминирующая часть населения сейчас не обладает устойчивостью к этому опасному возбудителю, и риск возникновения эпидемии при наличии даже спорадических случаев заболевания натуральной оспой весьма велик. Потенциальная возможность возникновения заболевания должна быть учтена по ряду причин: а) живые штаммы возбудителя до сих пор сохраняются в двух официально зарегистрированных коллекциях; б) на территории США был создан прецедент применения инфекционных агентов в качестве биологического оружия; в) возможность образования новых естественных резервуаров инфекции не отрицается.

Схожую с натуральной оспой клиническую картину на ранних стадиях заболевания вызывают все патогенные для человека вирусы, принадлежащие роду Orthopoxvirus, а также вирусы простого герпеса первого (HSV-1) и второго типа (HSV-2) и вирус ветряной оспы (VZV).

Быстрый и надежный метод идентификации вирусов рода Orthopoxvirus, а также HSV-1, HSV-2 и VZV позволит выявить инфекционного агента уже на ранней стадии развития заболевания, назначить адекватное лечение и предупредить распространение инфекции.

В настоящее время актуальной проблемой в перинатологии и неонатапогии является экстренная диагностика внутриутробных инфекций, являющихся причиной ранней детской смертности, соматических и психоневрологических отклонений в развитии детского организма в

постнеонатальном периоде. Основными возбудителями опасных внутриутробных и неонатальных заболеваний являются: цитомегаловирус (CMV), вирусы простого герпеса первого и второго типа, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis. Развитие герпетической и цитомегаловирусной инфекции у новорожденных усиливается в присутствии вируса гепатита В (HBV) или в случае сочетания с различными другими возбудителями при микст инфекциях.

Своевременное применение соответствующей этиотропной и иммунопатогенетической терапии позволяет существенно снизить риск неблагоприятных исходов. Быстрый и надежный метод идентификации вышеперечисленных возбудителей позволит своевременно выявить патогенный агент у новорожденного и провести направленную терапию.

Биологический микрочип (биочип) - одна из прогрессивных современных разработок, являющаяся надежным инструментом для проведения молекулярно-биологических исследований и клинической лабораторной диагностики. Применение биочипов позволяет анализировать нескольких генетических мишеней одновременно.

Настоящее исследование посвящено разработке следующих методов идентификации возбудителей с помощью технологии биологических микрочипов: а) метода идентификации возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину на основе гибридизации на биологическом микрочипе (Герпокс), б) метода одновременной идентификации HSV-J, HSV-2, CMV, HBV на основе гибридизации на биологическом микрочипе (Нео-1), в) метода одновременной идентификации на биологическом микрочипе HSV-1, HSV-2, CMV, М. hominis, U. Urealyticum, С. trachomatis на основе ПЦР на биологическом микрочипе (Нео-2).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было создание методов на основе биологических микрочипов для идентификации возбудителей неонатальных инфекций и заболеваний, имеющих схожую с натуральной оспой клиническую картину. Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач:

1. Разработать метод на основе биологического микрочипа для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, VZV и вирусов рода Orthopoxvirus.

2. Разработать метод на основе биологического микрочипа для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, CMV и HBV.

3. Разработать метод на основе биологического микрочипа для идентификации HSV-1, HSV-2, CMV, С. trachomatis, М. hominis, U. urealyticum.

4. Провести апробацию разработанных методов и сравнить результаты с результатами классических методов.

Научная новизна работы.

Впервые разработан метод на основе гибридизации на биологическом микрочипе, позволяющий одновременно выявлять HSV-1, HSV-2, VZV и вирусы рода Orthopoxvirus (Герпокс).

Впервые разработаны методы на основе биологических микрочипов, позволяющие проводить одновременно идентификацию основных возбудителей неонатальных инфекций:

1. Метод идентификации HSV-1, HSV-2, CMV и HBV на основе гибридизации на биологическом микрочипе (Нео-1).

2. Метод идентификации HSV-1, HSV-2, CMV, С. trachomatis, М. hominis, U. Urealyticum на основе ПЦР на биологическом микрочипе (Нео-2).

Практическая значимость работы.

Разработанный метод Герпокс для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, VZV и вирусов рода Orthopoxvirus позволяет быстро выявлять эпидемически опасные агенты, что делает возможным своевременное применение противоэпидемических мер.

Метод для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2.CMV и HB V на основе биологического микрочипа (Нео-1) и метод для одновременной идентификации HSV-], HSV-2, CMV,M. hominis, U. urealyticum, C. trachomatis на основе биологического микрочипа (Нео-2) могут применяться в клиниках для выявления опасных инфекционных агентов у новорожденных детей, а также для обследования беременных женщин. Выбор в применении Нео-1 или Нео-2 должен быть обусловлен требованиями целесообразности (необходимая скорость анализа, технические возможности лаборатории, масштабы исследований и др.).

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины (Москва, 2006), на XX Зимней международной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008), на XII Конгрессе педиатров России (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 106 источников. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста и содержит 28 рисунков и 13 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Часть 1. Метод одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, VZV и вирусов рода Orthopoxvirus на основе гибридизации на биологическом микпочипе (Герпокс).

Разработанный метод включает в себя следующие стадии анализа: двухстадийную мультиплексную ПЦР, гибридизацию, регистрацию и интерпретацию результатов. Время анализа - 6 часов.

Выбор генов-мишеней для конструирования праймеров осуществлялся на основе литературных данных, базы данных NCBI (USA) и анализа нуклеотидных последовательностей генов с помощью специализированных программ. Одним из основных критериев при выборе генов-мишеней была высококонсервативная нуклеотидная последовательность гена у различных штаммов одного вида вируса.

Для идентификации вирусов рода Orthopoxvirus был выбран ген сгтВ, кодирующий один из белков, блокирующих цитокины хозяина, для идентификации HSV-1, HSV-2, VZV - pol ген, кодирующий фермент ДНК-полимеразу.

Праймеры для проведения двухстадийной мультиплексной ПЦР и олигонуклеотидные зонды конструировались по специальному алгоритму при помощи программ «Oligo 6» (Molecular Biology Insights, США) и 01igoAnalyzer3.0

(http://www.idtdna.eom/analvzer/Applications/01igoAnalyzer//default.aspx) (см. диссертацию).

На первой стадии мультиплексной ПЦР проводили предварительную амплификацию в пробирке с помощью праймеров, представленных в таблице 1. Накопление специфичных ПЦР-продуктов первой стадии оценивали методом электрофореза.

На второй стадии проводили амплификацию внутренних фрагментов ПЦР - продуктов, полученных на первой стадии (см. табл.1). Вторую стадию проводили методом асимметричной мультиплексной ПЦР для получения

одноцелочечного флуоресцентно меченого продукта, необходимого для гибридизации с олигонуклеотидными зондами.

Таблица 1

Последовательности праймеров, использованных для проведения мультиплексной ПЦР

(Герп оке)

Название вируса Праймер Нуклсотидная последовательность 5' -> 3*

1-я стадия ПЦР

Orthopoxvirus (родоспецифичный) TNFlfl GCTTCCAGATTATGTGATAGCAAGACTA

Orthopoxvirus (родоспецифичный) TNFR3rl TCCGGATACTCCGTATCCTATTCC

HSV-1, HSV-2 polhn CGCATCATCTACGGGGACACGGACTC

HSV-1.HSV-2 polhrl GGAGGTGCGGTTGATAAACGCGCAG

VZV polvn GGTTTGCAACTGCAACACGACCGCTTGGT

VZV polvrl GTGCGCTCAATAACCTCAACGCGAAAGC

2-я стадия ПЦР

Orthopoxvirus (родоспецифичный) TNFlf2 CCAGATTATGTGATAGCAAGACTA

Orthopoxvirus (родоспецифичный) TNF3r2* GGATACTCCGTATCCTATTCC

HSV-1, IISV-2 polhf2 CTCCATATTTGTGCTGTGCCG

HSV-1, IISV-2 po!hr2* CAGATCCACGCCCTTGATGA

VZV polvf2 GTTATTACTTTACTTGGCATGTCC

VZV polvr2* CTTGTCTCCATTTAACGTTGCATC

*- флуоресцентно меченные 1МВ-504 праймеры

Номера последовательностей, представленных в ОепВапк и соответствующих данным праймерам, и нуклеотидные позиции в геноме для всех праймеров приведены в диссертационной работе.

В процессе работы проведена стандартная оптимизация условий мультиплексной ПЦР на первой и второй стадии (проверка специфичной работы каждой пары праймеров, выбор оптимальных условий температурно-временного режима в условиях мультиплексной ПЦР, проверка независимой работы каждой пары праймеров в условиях мультиплексной ПЦР).

Описание работы гибридизацонного биочипа для идентификации HSV-1, HSV-2, VZV и вирусов рода Orthopoxvirus.

Разработанный биологический микрочип содержит 30 дискриминирующих олигонуклеотидных зондов (Табл. 2), каждый из которых иммобилизован в соответствующей ячейке микрочипа (см. рис. 1).

Таблица 2

Список иммобилизованных олигонуклеотидных зондов для Герпокс

метода

№ зонда на микро-чипе' Нуклеотидная последовательность Специфичность

5'-»3' зонда2

HSV-2

А2 GCGCTGTTCCTCCCCCC HSV-2

A3 CCCGATCAAGCTCGAGT HSV-2

А4 GCGAAAAAACGTTCACC HSV-2

А5 CTGCTGCTCATCGCCAA HSV-2

А6 CATCTGCGGGGGCAAGAT HSV-2

А7 CGTCATCTGCGGGGGC HSV-2

HSV-1

В2 GCGCTGTTTCTGCCCCC HSV-1

ВЗ CCCCATCAAACTCGAGT HSV-1

В4 GCGAAAAGACGTTCACC HSV-1

В5 CTGCTGCTGATCGCCAA HSV-1

В6 CATCTACGGGGGTAAGAT HSV-1

B7 CGTCATCTACGGGGGT HSV-1

VZV

G1 AAGGGTGGCAGTTCATG VZV

F1 ACGGCATCTGTCAATAT VZV

Е1 GGATACCGCTTGTGGC VZV

OPV

G3 AGACTAA(CmACACAATGTAC Cam3, Mon, Tat, Vac, Var

F3 AGACTAA(C/T)ACACGATGTAC Rab, Vac

ЕЗ AGACTAA(C/T)ACAAACACACA Cow

G4 CATTTACCCGCTTGTC Cam, Cow, Rab, Vac, Var

F4 CATTTACAGGCTTGTCT Mon

Е4 CATTTACCCACTTGTCT Tat

G5 GGAAGATGCAATAGTAAT Var

F5 GGAAGATGCGATAGTAAT Cam, Cow

Е5 GGAAGATGTGATAGTAAT Mon, Tat

D5 GGAAGACGCGATCGT Rab, Vac,

G6 ATTGTCTTCTTAAAG G A Var

F6 ATTGTCTTCTCAAAGGA Cow, Mon, Rab, Tat Vac

Еб ATTGTATTCTCAAAGGA Cam

G7 TGT(A/G)TTTCCCAAACAAA Cam, Cow, Rab, Tat Vac,

Var

F7 TGT(A/G)TTTCTAAAACAAA Mon

обозначение олигонуклеотидов соответствует их расположению на рис.1

2 Принятые в таблице сокращения: OPV - Orthopoxvirus, Cam - вирус оспы верблюдов, Cow - вирус оспы коров, Моп - вирус оспы обезьян, Rab -вирус оспы кроликов, Tat - вирус оспы песчанок, Vac -вирус осповакцины, Var -вирус натуральной оспы.

Зонды В2-В7 комплементарны к участкам гена pol HSV-1, зонды А2-А7 комплементарны к соответствующим участкам гена pol HSV-2. Pol ген у HSV-1 и HSV-2 имеет высоко консервативные нуклеотидные последовательности, однако, в базе GenBank представлена нуклеотидная последовательность pol гена HSV-1 с Per. № NCBI АВ231455, которая не имеет комплементарных участков с зондами В2 и В5 (таб. 1). В связи с этим, для каждого типа HSV было сконструировано по шесть олигонуклеотидных зондов, что обеспечивает возможность наиболее точно определять тип HSV вируса.

Зонды Gl, Fl, Е1 комплементарны к амплифицированному участку гена pol VZV{ см. таб. 1).

Зонды, расположенные в прямоугольнике G3D3D7G7, комплементарны пяти участкам фрагмента гена crmB Orthopoxvirus. Каждый зонд обладает специфичностью к 1-6 видам Orthopoxvirus (см. таб. 2 и рис.1).

В результате, после проведения гибридизации каждый идентифицируемый возбудитель обладает уникальным гибридизационным профилем (рис.1).

На рис. 1 представлены гибридизационные профили, полученные после проведения гибридизации ПЦР - продуктов, полученных с различных ДНК образцов, а также диаграммы интенсивности флуоресценции.

1 2 3 4 5 6 7 А ••••••

В С О Е Р

а

А1

12 3 1 5 6 7

А В С

О Е •

р • о •

В1

1 2 3 4 5 6 7

В

с о Е

Р

в • • • • •

С1

Рис.1 Профили гибридизации Н5У-2, вируса натуральной оспы (А1,В1,С1) и диаграммы интенсивности флуоресценции (А2,В2,С2). Последовательности иммобилизованных олигонуклеотидных зондов представлены в табл. 2. Интенсивность флуоресценции каждой ячейки внутри чипа была нормирована на максимальный флуоресцентный сигнал. А1 - гибридзационный профиль #5У-2. В1- гибридизационный профиль С1 - гибридизационный профиль вируса натуральной оспы.

Для проведения оценки чувствительности метода была приготовлена серия разведений образца ДНК вируса НБУ-! и ДНК вируса оспы обезьян. Концентрация вирионов была предварительно определена методом микроскопии (ГНЦ ВБ «Вектор»), Количество образца, соответствующее 102 вирусных частиц, требовалось для получения детектируемой флуоресцентной гибридизационной картины.

Для определения воспроизводимости метода по 2 образца ДНК HSV-1, HSV-2, VZV и 8 образцов различных видов Orthopoxvirus были проанализированы разработанной системой четырежды. В пределах данной выборки настоящий эксперимент показал полную воспроизводимость результатов.

Флуоресцентный сигнал от ячеек микрочипа регистрировали с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного камерой ПЗС. Результаты интерпретировали как визуально, так и с применением программного обеспечения Image Ware («Биочип-ИМБ», Россия).

Апробация метода Герпокс.

С помощью Герпокс метода было проанализировано 73 музейных образца ДНК, любезно предоставленных лабораториями ортопоксвирусов и герпесвирусов ГНЦ ВБ «Вектор»: 48 образцов ДНК Orthopoxvirus, 10 образцов ДНК HSVи 15 образцов ДНК VZV.

Результаты анализа всех образцов методом Герпокс полностью совпали с результатами анализа классическими методами (культура клеток Vero, культивирование на куриных эмбрионах).

Часть 2. Метод одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, CMV и HBVна основе гибридизации на биологическом микрочипе (Нео-1).

Разработанный метод включает в себя следующие стадии анализа: двухстадийную мультиплексную ПЦР, гибридизацию, регистрацию и интерпретацию результатов. Время анализа - 6 часов.

Выбор генов-мишеней для конструирования праймеров осуществлялся по алгоритму аналогичному методу Герпокс.

Для идентификации HSV-1, HSV-2, CMV был выбран pol ген, кодирующий ДНК- полимеразу, для идентификации вируса гепатита В - X ген, кодирующий белок X, который контролирует активность протеосом.

Праймеры и олигонуклеотидные зонды конструировались аналогично методу Герпокс.

В процессе работы проведена стандартная оптимизация условий мультиплексной ПЦР.

Первую и вторую стадию мультиплексной ПЦР в методе К'ео-1 проводили аналогично методу Герпокс с использованием праймеров, представленных в табл. 3.

Таблица 3

Последовательности праймеров, использованных для проведения

мультиплексной ПЦР (Нео-1)

Название вируса Праймер Нуклеотиднан последовательность 5' —> 3'

1 стадия

Н5У-1,ШУ-2; СМУ. Нгр_П стс «тс слс ттт ссс лес СТО ТАС сс

Н5\'-1,Н8\'-2, СМУ 1 Нгр г'/ Игр г* ТТТ ТСС ССА ССА САТ ССА ССС ССТ Т

НВУ НВУ П ТСС АТС ССТ ССТ АСС СТС те

НВУ НВУ г1 втв САС Л ОС ТСА АС С САА СТС

2 стадия

Н5У-1,Н5У-2; СМУ Нгр_Г2 ССС ССТ САТ СТА ССС ССА САС ССА С

НВУ НВУ 12 СТС ССС ТСв ССС СТС ААТ с

НВУ НВУ г2* ССС ССА САТ САС ААС ССА С

1 праймер Нгр_г использовался как на первой, так и на второй стадии мультиплексной ПЦР. На второй стадии мультиплексной ПЦР Нгр_г содержал флуоресцентную метку.

*- флуоресцентно меченные красителем 1МБ-504 праймеры

Номера последовательностей, представленных в СепВапк соответствующих данным праймерам, и нуклеотидные позиции в геноме для всех праймеров приведены в диссертационной работе.

Описание работы гибридизацонного биочипа для идентификации ШУ-], ЖУ-2, СМУ и НВУ.

Разработанный биологический микрочип содержит 17 дискриминирующих олигонуклеотидных зондов (см. табл.4), каждый из которых иммобилизован в соответствующей ячейки микрочипа (см. рис 2).

Таблица 4

Список иммобилизованных олигонуклеотидных зондов для Нео-1 системы. _

№ зонда на микрочипе Нуклеотидная последовательность 5'—>3' Специфичность зонда

Зонды для идентификации HSV

1 CCATATTTGTGCTGTG HSV-1

2 TTTGTGCTGTGCCG HSV-1

3 GCTGACGGCCATGG HSV-1

4 CCCCATCAAACTCGAG HSV-1

5 CCATTTTCGTTTTGTG HSV-2

6 TTCGTTTTGTGCCG HSV-2

7 CCTGGTGGCCATGG HSV-2

8 CCGATCAAGCTCGAG HSV-2

9 CAAGAAAAAGTACATCGG HSV

10 GAGCCACATCTCGCG HSV

И TACATCGGCGTCATCT HSV

Зонды для идентификации CMV

12 AAGAAACGTTACATCGG CMV

13 CGCACTACGTGACGG CMV

14 TACATCGGCAAAGTGG CMV

Зонды для идентификации HBV

15 GCTGAATCCCGCGG HBV

16 TCCCGCGGACGACC HBV

17 CCCTTCTCCGTCTGCCGT HBV

' обозначение олигонуклеотидов соответствует их расположению на

рис.2.

Зонды 1-4 комплементарны к участкам гена pol HSV-], зонды 5-8 комплементарны к участкам гена pol HSV-2, зонды 9-11 комплементарны участкам гена pol как HSV-1, так и HSV-2, зонды 12-14 комплементарны к участкам гена pol CMV, зонды 15-17 комплементарны к участкам гена X HB V.

Несмотря на то, что вирусы простого герпеса, цитомегаловируса, и вируса гепатита В имеют в выбранных генах-мишенях высококонсервативные нуклеотидные последовательности, необходимо учитывать возможную вариабильность различных штаммов перечисленных выше вирусов. Для исключения возможности получения ложноотрицательного результата, для идентификации каждого возбудителя

было сконструировано несколько олигонуклеотидных зондов на биологическом микрочипе.

Таким образом, после прохождения гибридизации, каждый возбудитель имеет свой гибридизационпый профиль. На рис 2. представлена схема биочипа (рис.2А) и примеры гибридизационных профилей.

С D

Рис.2 Схема биочипа для идентификации HSV-1, HSV-2, CMVvi HB V и примеры полученных гибридизационных профилей. А - схема биочипа; В -гибридизационпый профиль HSV-2, С - гибридизационный профиль HBV, D - гибридизционный профиль CMV.

Для проведения оценки чувствительности метода была приготовлена серия разведений образца ДНК вируса HSV-1. Концентрация вирионов была предварительно определена методом микроскопии (ГНЦ ВБ «Вектор»), Для получения детектируемой флуоресцентной гибридизационной картины требовалось количество образца, соответствующее 102 вирусных частиц.

Для определения воспроизводимости метода следующие образцы были трижды проанализированы на биочипах: два клинических образца ДНК ЖУ-

15

1, два образца ДНК HSV-2, два образца ДНК HBV и три образца ДНК HBУ. В пределах данной выборки настоящий эксперимент показал полную воспроизводимость результатов.

Флуоресцентный сигнал от ячеек микрочипа регистрировали аналогично методу Герпокс.

Апробация метода Нео-1.

С помощью разработанного метода было проанализировано 78 клинических образцов ДНК, любезно предоставленных Научным центром акушерства гинекологии и перинатологии РАМН.

Образцы ДНК были выделены из крови, мочи, урогенитальных соскобов беременных женщин и из крови, мочи и буккальных соскобов новорожденных: 19 образцов были идентифицированы как HSV-1, 6 образцов - HSV-2, 12 - образцов CMV, 1 - образцов HB У, 34 образца показали отрицательный результат. Методы ИФА (USA «Bio-Rad», USA «DCLab») и ПЦР с индивидуальными праймерами (Россия, «ДНК-технология»), использованные в качестве контрольных методов, показали высокую корреляцию результатов. Количество отрицательных и положительных образцов, а также родовая принадлежность положительных образцов полностью совпали. Два из шести образцов, идентифицированных сконструированным методом как HSV-2, были идентифицированы ИФА как HSV-]. Анализ этих образцов методом сиквенирования подтвердил присутствие в образцах ДНК HSV-2.

Часть 3. Метод одновременной идентификация HSV-1. HSV-2. CMV. М. hominis, C.trachomatis, U.urealyticum на основе ПЦР на биологическом микрочипе (Нео-2).

Разработанный метод включает в себя следующие стадии анализа: мультиплексную ПЦР в пробирке в режиме ТЕМР (см. диссертацию), последующую стадию мультиплексной ПЦР на чипе, регистрацию и интерпретацию результатов. Время анализа - 3,5 часа.

J6

В рамках метода сконструирован внутренний контроль, который позволяет контролировать прохождение реакции в каждом анализе. В качестве внутреннего контроля выбран коммерческий препарат ДНК бактериофага X.

Выбор генов-мишеней для конструирования праймеров осуществлялся по алгоритму аналогичному методу Герпокс.

Для идентификации HSV-1, HSV-2, CMV - выбран ген pol, для идентификации М. hominis - ген adi, кодирующий фермент аденин деиминазу, для идентификации U. Urealyticum - ген urea, кодирующий фермент уреазу, для идентификации С. trachomatis - ген 16S г RNA.

Праймеры конструировались согласно специальному алгоритму выбора праймеров для системы мультиплексной ПЦР и критериям выбора иммобилизованных праймеров при помощи программ «Oligo 6» (Molecular Biology Insights, США) и 01igoAnalyzer3.0

(hllp://\v u \v.idtdna.corn/anaKvcr/Applications/01igoAnalv7er//del'ault.asn\) (см. диссертацию).

Все обратные праймеры на стадии мультиплексной ПЦР в пробирке на 5'-конце содержали общую адаптерную последовательность X (см. табл.5).

Обратный праймер для амплификации внутреннего контроля на стадии мультиплексной ПЦР в пробирке состоял из адаптерной последовательности.

Таким образом, все получаемые на первой стадии двуцепочечные ПЦР -продукты содержат общую универсальную последовательность. Это позволило использовать один общий праймер для ПЦР всех мишеней на второй стадии.

Мультиплексная ПЦР в пробирке предназначена для предварительной наработки специфичных ДНК-фрагментов и включения в них адаптерной последовательности(Х). Последовательности всех использованных праймеров и их позиции в геноме представлены в таблице 5.

Таблица 5

Последовательности праймеров, использованных для проведения

мультиплексной амплификации (Нео-1)

Название возбудителя Праймер Нуклеотидная последовательность У У

HSV-1, HSV-2, CMV Hrp_f GCG GGT CAT СТА CGG GGA САС GGA С

HSV-1, HSV-2 HSV г X-CGG TTG ATA ААС GCG CAG TTG

CMV CMV г X-GCC GAT GTA ACG ТТТ СТТ GC

U urealyticum Ur f CAG AAG GTG CTG GTG GTG GAC А

U urealyticum Ur r Х-СТТ CTG GAA ССТ TAG GAT ТТА AGT G

М hominis Мус ad f GAC TAC ATT ACA CCA GCT CGT ТГА GAC

М hominis Мус ad r X-CAA CAA CGT TGA TTC CTC TGT

С trachomatis Chi f GCG TGT GTG ATG AAG GCT СТА GGG TTG

С trachomatis Chi r X-AAC TAA СТТ ACC TTT CCG ССТ AC

lamda lam for ATT GAG CGT GCA GCC AGT GA

lambda lam r AGG TGG TGA ACG GGC TGT ACG CTG T

*Х- последовательность AGG TGG TGA ACG GGC TGT А

Номера последовательностей, представленных в GenBank соответствующих данным праймерам, и нуклеотидные позиции в геноме для всех праймеров приведены в диссертационной работе.

В реакционной смеси на первой стадии присутствует 11 праймеров (см. таб.5), поэтому особое внимание было уделено специфичной работе праймеров в системе мультиплексной ПЦР и выбору оптимальной температуры отжига всех пар праймеров.

В процессе проведения оптимизации, были снижены концентрации всех праймеров на первой стадии (с 200 пМ до 20 пМ). Снижение концентрации было произведено без потери чувствительности анализа.

Далее, был изменен режим амплификации с обычной ПЦР на ПЦР в режиме Тетр (см. диссертацию).

Предпринятые меры позволили избежать накопления неспецифичных взаимодействий на первой стадии мультиплексной ПЦР.

ПЦР на чипе проводится в присутствии меченного цианиновым красителем дезоксиуридин трифосфата (сШТР-Су*, (ИМБ, Москва)), что позволяет идентифицировать специфичные продукты по флуоресценции достроенных иммобилизованных праймеров. На рис. 3 представлена схема ПЦР на чипе.

ПЦР-продукт первой стадии

«« »

* • * »

6

Рис.3. Схема ПЦР на чипе.

В реакционную смесь для проведения ПЦР на чипе, в качестве матрицы добавляется ПЦР-продукт, полученный на первой стадии амплификации.

Красной полоской обозначена последовательность X, которая была включена в ПЦР-продукт первой стадии в составе обратного праймера первой стадии. Зеленой полоской в ПЦР-продукте первой стадии обозначена последовательность, комплементарная X последовательности. Звездочками обозначен сШТР-Су5.

На второй стадии в ПЦР - смесь добавляется только один праймер X. В результате предварительной амплификации в растворе, над поверхностью ячеек, нарабатывается одноцепочечный флуоресцентно меченный ПЦР -продукт (флуоресцентная метка включается в ПЦР-продукт в составе меченного цианиновым красителем дезоксиуридин трифосфата).

Далее, одноцепочечный флуоресцентно меченый продукт гибридизуется на специфичный иммобилизованный праймер, и происходит достройка иммобилизованного праймера в результате ПЦР на чипе.

После прохождения ПЦР на чипе проводили электрофоретическую отмывку чипа. При этом, происходило вымывание из ячеек геля не использованных в реакции флуоресцентно меченных нуклеотидов, а также не отгибридизовавшихся на специфичный иммобилизованный праймер одноцепочечных флуоресцентно меченных продуктов.

В рамках работы по оптимизации стадии ПЦР на чипе был выбран оптимальный температурно-временной режим отжига для всех иммобилизованных праймеров. Особое внимание было уделено выбору оптимального временного режима денатурации на каждом цикле ПЦР (см. диссертацию).

Важным шагом в оптимизации ПЦР на чипе был выбор оптимальной концентрации ДНК бактериофага X (внутреннего контроля) для проведения анализа методом Нео-2. Проведенные эксперименты показали, что концентрация ДНК бактериофага X соответствующая 105 копий на реакцию является необходимой и достаточной (см. диссертацию).

Описание работы биочипа для идентификации HSV-1, HSV-2, CMV, М. hominis, С. trachomatis, U. urealyticum.

Разработанный биочип содержит семь дискриминирующих праймерных зондов (рис.4).

Im_HSV_l - иммобилизованный праймер специфичный HSV-1, Im_HSV_2 -иммобилизованный праймер специфичный HSV-2, Im_CMV - иммобилизованный праймер специфичные CMV,

Рис. 4. Схема чипа для проведения ПЦР.

Im_ur - иммобилизованный праймер специфичный U. urealyticum, Im_chl -

иммобилизованный праймер специфичный С. trachomatis, Im_myc_ad -

иммобилизованный праймер специфичный М hominis,

Im_lam - иммобилизованный праймер специфичный bacteriophage Я,

М - маркерные ячейки с иммобилизованным флуоресцентным красителем

(они ограничивают поле чипа), Gel - ячейки пустого геля (использованные

для сравнения при обсчете флуоресцентных сигналов).

Каждому идентифицируемому возбудителю соответствует одна ячейка на чипе. После прохождения ПЦР реакции на чипе, наличие флуоресценции в ячейке с внутренним контролем (im_lam) обозначает, что реакция прошла. Наличие флуоресценции в ячейке, содержащей дискриминирующий иммобилизованный праймер, обозначает наличие инфекционного агента.

Для определения чувствительности метода была приготовлена серия разведений коммерческого препарата ДНК бактериофага X. Количество образца, соответствующее 101 копий на реакцию, оказалось достаточным для получения достоверной флуоресцентной картины.

Для определения воспроизводимости метода следующие образцы были проанализированы разработанной системой три раза: образец ДНК HSV-], образец ДНК C.trachomatis и образец ДНК M.hominis. В пределах данной выборки настоящий эксперимент показал полную воспроизводимость результатов.

Флуоресценцию ячеек можно оценивать как визуально, так и при помощи специализированного программного обеспечения, аналогично методу Герпокс.

Апробация метода Нео-2.

Разработанным методом было проанализировано 44 клинических образца ДНК, любезно предоставленных Научным центром акушерства гинекологии и перинатологии РАМН. Образцы ДНК были выделены из крови, мочи и урогенитальных соскобов. В 5-ти образцах была идентифицирована ДНК HSV-1, в пяти - ДНК HSV-2, в трех - ДНК CMV, в ] 3 - ДНК С. trachomatis, в четырех - ДНК М. hominis, в четырех - ДНК U. urealyticum-, один образец содержал одновременно ДНК С. trachomatis и

CMV, семь образцов содержали одновременно ДНК М. hominis и U. urealyticum. В двух образцах идентифицируемых возбудителей обнаружено не было.

Проведен сравнительный анализ полученных результатов с результатами коммерческих тест-систем, основанных на ИФА ( USA «DCLab») и ПЦР с индивидуальными праймерами (Россия, «ДНК-технология»), На данной выборке результаты анализа всех образцов методом Нео-2 полностью совпали с результатами анализа коммерческих тест-систем.

На рис.5 представлены флуоресцентные картины, полученные в результате анализа образцов ДНК на разработанном методе. Расположение ячеек на чипе соответствует схеме, представленной на рис.4.

eis ¡¡ш •

А

• 'Ш •

С

• -

• ♦ • •

£

• ■ шМ

•

• в й-вд.;:-: •

в

• ; • * • •

О

• -

• • • •

F

И

• • • • •

G н

Рис.5. Флуоресцентные картины, полученные после проведения ПЦР на чипе. А -отрицательный контроль; В - флуоресцентный профиль CMV, С - флуоресцентный профиль HSV-1, D - флуоресцентный профиль HSV-2, Е -флуоресцентный профиль С.trachomatis, F - флуоресцентный профиль U. urealyticum,G - флуоресцентный профиль М. hominis, Н - флуоресцентный профиль, соответствующий присутствию в образце ДНК двух возбудителей U. urealyticum и М. hominis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Разработаны и исследованы методы на основе биологических микрочипов, позволяющие проводить идентификацию возбудителей неонатальных инфекций, а также заболеваний, имеющих схожую с натуральной оспой клиническую картину.

Разработанные методы показали высокую воспроизводимость, чувствительность и специфичность на проанализированных выборках образцов ДНК.

Разработанные методы могут найти применение, как в определенных сферах медицинской практики, так и для решения научных задач. ВЫВОДЫ.

1. Разработан метод на основе гибридизации на биологическом микрочипе для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, VZV и вирусов рода Orthopoxvirus (Герпокс).

2. Разработан метод на основе гибридизации на биологическом микрочипе для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, CMV и HBV (Нео-1).

3. Разработан метод на основе ПЦР на биологическом микрочипе для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, CMV, С. trachomatis, М. hominis, U. Urealyticum (Нео-2). В рамках метода сконструирован внутренний контроль, который позволяет контролировать прохождение реакции в каждом анализе.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Мызникова А.И., Файзуллин Л.З., Захарова Н.В., Грядунов Д.А., Володин Н.Н., Барский В.Е., Михайлович В.М., (2006), Олигонуклеотидные биочипы в диагностике неонатальных вирусных инфекций. Вопросы практической педиатрии, 1, №3, 61-64.

2. Мызникова А.И., Лапа С.А., Грядунов Д.А., Ходаков Д.А., Заседателев А.С., Михайлович В.М., (2007), Биологический микрочип для идентификации ортопоксвирусов и возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину. Вопросы вирусологии, №2, 41-45.

3. Мызникова А.И., Лапа С.А., Суслопаров И.М., Фесенко Е.Е., Козлова А.Ю., Ходаков Д.А., (2005), Биологический микрочип для дифференциации родов Orthopoxvirus, Herpesvirus и Varicella-Zoster virus, Материалы Международной научной конференции «Современные проблемы генетики», Минск, 1,стр.281.

4. Мызникова А.И., Захарова Н.В., Грядунов Д.А., Лапа С.А., Файзулин Л.З., Михайлович В.М. и Заседателев А.С., (2006), Олигонуклеотидные микрочипы для выявления возбудителей вирусных инфекций в неонатальном периоде, материалы ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины, Москва, стр. 149.

5. Мызникова А.И., Захарова Н.В., Грядунов Д.А., (2007), Идентификация ДНК возбудителей инфекционных вирусных заболеваний, протекающих в неонатальный период, методом гибридизации на биологическом микрочипе, «Биология наука XXI века», 11 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Сборник Тезисов, стр. 102103.

6. Мызникова А.И., Захарова Н.В., Михайлович В.М., (2008), Олигонуклеотидный микрочип для идентификации возбудителей внутриутробных и неонатальных заболеваний, XX Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-

химической биотехнологии», Сборник тезисов докладов и стендовых сообщений, Москва, стр. 64.

7. Мызникова А.И., Захарова Н.В., Михайлович В.М., (2008), Идентификация возбудителей неонатапьных заболеваний на биологическом микрочипе, Сборник материалов XII Конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, стр. 231-232.

Подписано в печать 15.09.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 736 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мызникова, Анна Игоревна

Список сокращений.

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1.Натуральная оспа и возбудители, вызывающие схожую с натуральной оспой клиническую картину.

1.2. Неонатальные инфекции.

1.2.1 .Герпетическая неонатальная инфекция.

1.2.2.Хламидийная, микоплазменная и уреаплазменная неонатальные инфекции.

1.2.3. Цитомегаловирусная неонатальная инфекция.

1.3. Современные методы идентификации инфекционных агентов.

1.3.1.Современные методы идентификации вирусов рода Orthopoxvirus.

1.3.2. Современные методы идентификации вирусов сем. Herpesviridae {HSV-1, HSV-2, VZV,

CMV).

1.3.3.Современные методы идентификации С. trachomatis, М. hominis, U. Urealyticum.

1.3.4. Метод ПЦР и альтернативные методы амплификации нуклеиновых кислот.

1.4.Биологические микрочипы.

2. Материалы и методы.

2.1. Образцы, использованные в работе.

2.1.1. Образцы HSV-1, HSV-2 и VZV.

2.1.2. Образцы Orthopoxvirus.

2.1.3. Клинические образцы HSV-1, HSV-2, CMV, HBV, М. hominis, С. trachomatis, U.

Urealyticum.

2.2. Олигонуклеотиды и праймеры.

2.3. Подготовка образцов для гибридизации на микрочипе.

23Л. HSV-1, HSV-2, Orthopoxvirus, VZV {Герпокс).

2.3.2. HSV-1, HSV-2, CMV,\ HBV{Heo-l).

2.4. Подготовка проб для проведения ПЦР на чипе.

2.4.1. HSV-1, HSV-2, CMVj М hominis, U. urealyticum, C. trachomatis

Нео-2).

2.5. Биологический микрочип.

2.6. Гибридизация.:.

2.6.1. Гибридизационные биочипы {Герпокс и Нео-1).

2.7. ПЦР на чипе {Нео-2).

2.8. Регистрация результатов.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Метод одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, VZV и вирусов рода Orthopoxvirus на основе гибридизации на биологическом микрочипе {Герпокс).

3.1.1. Гены-мишени {Герпокс).

3.1.2.Конструирование олигонуклеотидов и праймеров {Герпокс).

3.1.3.Описание работы гибридизационного биочипа для идентификации HSV-1, HSV-2, VZV и вирусов рода Orthopoxvirus {Герпокс).

3.1.4. Регистрация результатов {Герпокс).

3.1.5. Апробация Герпокс метода.

ЗЛ.б.Область возможного применения Герпокс метода.

3.2. Метод одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, CMV и HBV на основе гибридизации на биологическом микрочипе {Нео-1).

3.2.1. Гены-мишени {Нео-1).

3.2.2.Конструирование олигонуклеотидов и праймеров {Нео-1).

3.2.3. Описание работы гибридизационного биочипа для идентификации HSV-1, HSV-2, CMVnHBV {Нео-1).

3.2.4. Регистрация результатов {Нео-1).

3.2.5. Апробация Нео-1 метода.

3.2.6.0бласть возможного применения Нео-1 метода.

3.3. Метод одновременной идентификация HSV-1, HSV-2, CMV, М. hominis, С.trachomatis, U.urealyticum на основе ПЦР на биологическом микрочипе (Нео-2).

3.3.1. Гены-мишени (Нео-2).

3.3.2.Конструирование праймеров (Нео-2).

3.3.3. Оптимизация мультиплексной ПЦР первой стадии Нео-2 метода.

3.3.4. Оптимизация второй стадии Нео-2 метода.

3.3.5. Описание работы биочипа для идентификации HSV-1, HSV-2, CMV,

М. hominis, С. trachomatis, U. Urealyticum (Нео-2).

3.3.6. Регистрация результатов (Нео-2).

3.3.7. Апробация Нео-2 метода.

3.3.8. Область возможного применения Нео-2 метода.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация возбудителей неонатальных инфекций и заболеваний, имеющих схожую с натуральной оспой клиническую картину, с помощью биологических микрочипов"

К настоящему времени известны 4 основных вида вирусов, принадлежащих роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae, способных вызвать заболевания человека различной степени тяжести. Наиболее опасным представителем данной таксономической группы является вирус натуральной оспы (variola major), обязательная вакцинация против которого была отменена в 1979 году после завершения международной программы по его искоренению.

Доминирующая часть населения сейчас не обладает устойчивостью к этому опасному возбудителю, и риск возникновения эпидемии при наличии даже спорадических случаев заболевания натуральной оспой весьма велик. Потенциальная возможность возникновения заболевания должна быть учтена по ряду причин: а) живые штаммы возбудителя до сих пор сохраняются в двух официально зарегистрированных коллекциях; б) на территории США был создан прецедент применения инфекционных агентов в качестве биологического оружия; в) возможность образования новых естественных резервуаров инфекции не отрицается.

Схожую с натуральной оспой клиническую картину на ранних стадиях заболевания вызывают все патогенные для человека вирусы, принадлежащие роду Orthopoxvirus, а таюке вирусы простого герпеса первого {HSV-1) и второго типа (.HSV-2) и вирус ветряной оспы (VZV).

Быстрый и надежный метод идентификации вирусов рода Orthopoxvirus, а также HSV-1, HSV-2 и VZV позволит выявить инфекционного агента уже на ранней стадии развития заболевания, назначить адекватное лечение и предупредить распространение инфекции.

В настоящее время актуальной проблемой в перинатологии и неонаталогии является экстренная диагностика внутриутробных инфекций, являющихся причиной ранней детской смертности, соматических и психоневрологических отклонений в развитии детского организма в постнеонатальном периоде. Основными возбудителями опасных внутриутробных и неонатальных заболеваний являются: цитомегаловирус ('CMV), вирусы простого герпеса первого и второго типа, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis. Развитие герпетической и цитомегаловирусной инфекции у новорожденных усиливается в присутствии вируса гепатита В (HBV) или в случае сочетания с различнымй другими возбудителями при микст инфекциях.

Своевременное применение соответствующей этиотропной и иммунопатогенетической терапии позволяет существенно снизить риск неблагоприятных исходов. Быстрый и надежный метод идентификации вышеперечисленных возбудителей позволит своевременно выявить патогенный агент у новорожденного и провести направленную терапию.

Биологический микрочип (биочип) - одна из прогрессивных современных разработок, являющаяся надежным инструментом для проведения молекулярно-биологических исследований и клинической лабораторной диагностики. Применение биочипов позволяет анализировать нескольких генетических мишеней одновременно.

Настоящее исследование посвящено разработке следующих методов идентификации возбудителей с помощью технологии биологических микрочипов: а) метода идентификации возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину на основе гибридизации на биологическом микрочипе (Герпокс), б) метода одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, CMV, HBV на основе гибридизации на биологическом микрочипе (Нео-1), в) метода одновременной идентификации на биологическом микрочипе HSV-1, HSV-2, CMV, М. hominis, U. Urealyticum, С. trachomatis на основе ПЦР на биологическом микрочипе (Нео-2).

1. Литературный обзор

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мызникова, Анна Игоревна

выводы.

1. Разработан метод на основе гибридизации на биологическом микрочипе для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, VZV и вирусов рода Orthopoxvirus (Герпокс).

2. Разработан метод на основе гибридизации на биологическом микрочипе для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, CMV и HBV (Нео-1).

3. Разработан метод на основе ПЦР на биологическом микрочипе для одновременной идентификации HSV-1, HSV-2, CMV, С. trachomatis, М. hominis, U. Urealyticum (Нео-2). В рамках метода сконструирован внутренний контроль, который позволяет контролировать прохождение реакции в каждом анализе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Разработаны и исследованы методы на основе биологических микрочипов, позволяющие проводить идентификацию возбудителей неонатальных инфекций, а также заболеваний, имеющих схожую с натуральной оспой клиническую картину.

Разработанные методы показали высокую воспроизводимость, чувствительность и специфичность на проанализированных выборках образцов ДНК.

Разработанные методы могут найти применение, как в определенных сферах медицинской практики, так и для решения научных задач.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мызникова, Анна Игоревна, Москва

1. Букринская А.Г. Вирусология 1986, Издательство «Медицина», Москва, с. 198-206.

2. Василисков В.А., Тимофеев Э.Н., Суржиков С.А. и др. Метод получения микрочипов с помощью сополимеризации с акриламидом. Прикладная молекулярная биология, 1998, Т. 32, №5, с. 923-925.

3. Врожденные, перинатальные и неонатальные инфекции. Пер. с англ.под. ред. А.Гриноу, Дж. Осборна, Ш.Сазерленд. 2000, Медицина, Москва, 288с. ил.

4. Евсюкова Н.Н., Кошелева Н.Г., Башлякова М.М. Хламидийная инфекция в акушерстве и перинатологии. Ст-Петербург, 1995.

5. Инфекционные болезни у детей. Учебник для педиарических факультетов медицинских вузов, под ред. Проф. В.Н. Тимченко.

6. Котова Е.Ю., Крейндлин Э.Я., Барский В.Е., Мирзабеков А.Д. Изучение оптических свойств флуорофоров, перспективных для использования в биологических микрочипах. Молекулярная биология, 2000, Т. 34, №2,с. 304-309.

7. Краснов В.В. Инфекционные болезни в практике педиатра. 2-е издание, переработанное и дополненное. Нижний Новгород. Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии. 2002, 222 с.

8. Хламидийная инфекция, стр. 171 —187.

9. Малкова Е.М., Гришаева О.Н. Методические рекомендации для врачей, Диагностика внутриутробных инфекций у новорожденных детей методом полимеразной цепной реакции. Томск, Кольцово, 2000.

10. Маренникова С.С. Выделение вируса натуральной оспы на куриных эмбрионах, Ж.микробиол, 1960, 6, с. 102-105.

11. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. КМК Scientific Press Ltd, 1998, с. 386.

12. Маренникова С.С., Янова Н.Н., Жукова О.А. Электронная микроскопия как метод диагностики при эпидемиологическом надзоре за поксвирусными инфекциями. Ж. микробиол, 1990, 8, с.57-62.

13. Молекулярная биотехнология. Принципы и применения. Б. Глик, Дж. Пастернак. 2002, Издательство «МИР», г.Москва, с. 196-198.

14. Попова О.В. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. 2006, Особенности клинического течения и лечения церебральных нарушений у детей с персистирующими вирусными инфекциями. Бишкек.

15. Протоколы диагностики, лечения и профилактики внутриутробных инфекций у новорожденных детей, 2002, Министерство здравоохранения Российской Федерации, Российская ассоциация специалистов перинатальной медицины, Издание 2-ое, Москва, ГОУ ВУНМЦМЗ РФ.

16. Рудинский Н.И., Михайлович В.М., Донников М.Ю. и др. Разработка биологических микрочипов для выявления мутаций устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам протеазы и результаты их применении. Вопросы вирусологии, 2004,6, с. 10-15.

17. Фесенко Д.О., Наседкина Т.В., академик Мирзабеков А.Д. Бактериальный микрочип: принцип работы на примере обнаружения антибиотиков. Доклады академии наук, 2001, Т.381, №6, с. 831-833.

18. Aldea С., Alvarez C.P., Folgueira L., et al. Rapid detection of herpes simplex virus DNA in genital ulcers by real-time PCR using SYBR Green I dye as the Detection Signal. J. Clin. Microbiol., 2002, V.40, p. 1060-1062.

19. Baczynska A., Helle F Svenstrup, Jens Fedder, et al. Development of real-time PCR for detection of Mycoplasma hominis. BMC Microbiology, 2004, 4,p.35

20. Bas S., Muzzin P., Ninet B. et al. Chlamydial serology: comparative diagnostic value of Immunoblotting, Microimmunofluorescence test, and Immunoassays using different recombinant proteins as antigens. J. Clin. Microbiol., 2001,Vol.39, p. 1368 -1377.

21. Biernat-Sudolska M., Rojek-Zakrzewska D. and Lauterbach R. Assessment . of various diagnostic methods of ureaplasma respiratory tract infections in newborns. Acta Biochimica Polonica, 2006, V. 53, №3, p. 609-612.

22. Birch С J., Druce J.D., Catton M.C. Detection of varicella zoster virus in genital specimens using a multiplex polymerase chain reaction. Sex.Transm.Infect, 2003, V.79, p. 298-300.

23. Bouchard M. J. and Schneider R. J. Minireview. J Virol, 2004, V.78, p. 12725-12734.

24. Brownie J, Shawcross S, Theaker J, Whitcombe D, Feme R, Newton С and Little S. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res, 1997, 25, p. 3235—3241.

25. Cassell G. H., Waites К. В., Watson H. L., Crouse D. Т., and Harasawa R. Ureaplasma urealyticum Intrauterine Infection: Role in Prematurity and Disease in Newborns. Clin. Microbiol. Rev., 1993, V. 6, p. 69-87.

26. Cassinotti, P., and G. Siegl. A nested-PCR assay for the simultaneous amplification of HSV-1, HSV-2, and HCMV genomes in patients with presumed herpetic CNS infection. J. Virol. Methods, 1998, 71, p. 105-114.

27. Coffin S. E. and Hodinka R. L. Utility of Direct Immunofluorescence and Virus Culture for Detection of Varicella-Zoster Virus in Skin Lesions. J. Clin. Microbiol., 1995, V. 33, p. 2792-2795.

28. Colaizy, Т. Т., Т. Kuforiji, R. S. Sklar, and A. M. Pillers. PCR methods in clinical investigations of human ureaplasmas: a minireview. Mol. Genet. Metab., 2003, 80, p.389-397.

29. Compton J. Nucleic Acid Sequence-Based Amplification. Nature, 1991, 350, p. 91-92.

30. Cunha B.E. Monkeypox in the United States: an occupational health look at the first cases. AAOHN J., 2004, Vol. 52, № 4, p. 164-168.

31. Druce J., Catton M., Chibo D., et al. Utility of a Multiplex PCR Assay for Detecting Herpesvirus DNA in Clinical Samples. J. Clin. Microbiol., 2002,V. 40, №.5, p. 1728-1732.

32. Ellis L., Fleming D. M., and Zambon M. C. Multiplex reverse transcription -PCR for surveillance of influenza A and В viruses in England and Wales in 1995 and 1996. J. Clin. Microbiol, 1997, 35, p. 2076-2082.

33. Elnifro E. M., Ashshi A. M., Cooper R. J., and Klapper P. E. Multiplex PCR: Optimization and Applicationin Diagnostic Virology. Clin. Microb. Rev., 2000, p. 559-570.

34. Espy M. J., Cockerill F. R., Meyer R. F. et al. Detection of Smallpox Virus DNA by LightCycler PCR. J. Clin. Microbiol., 2002, V.40, p. 1985-1988.

35. Gronowski A.M., Copper S., Baorto D., and Murray P. R. Reproducibility Problems with the Abbott Laboratories LCx Assay for Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. J. Clin. Microbiol., V.38, p. 2416— 2418.

36. Gryadunov D., V. Mikhailovich, S. Lapa, et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Iinfection, 2005, V. 11, p.531-539.

37. Han J., Swan D. C., Smith S.J., et al. Simultaneous Amplification and Identification of 25 Human Papillomavirus Types with Templex Technologyio J. Clin. Microbiol., 2006, V. 44, p. 4157-4162.

38. Hartley J. C., S. Kaye, S. Stevenson et al. PCR detection and molecular Identification of Chlamydiaceae speciesio J. Clin. Microbiol., 2001, V. 39, p. 3072-3079.

39. Heymann D.L., Szczeniowski M., Esteves K. Re-emergence of monkeypox in Africa: a review of the past six years. Br. Med. Bull., 1998, V. 54, №3, p. 693 702.

40. Hiroko S., Tetsushi Y., Masaru I., et al. Comparison of Loop-Mediated Isothermal Amplification, Real-Time PCR, and Virus Isolation for the Detection of Herpes Simplex Virus in Genital Lesions. Journal of Medical Virology, 2005, 75, p.583-587.

41. Hogrefe W., Su Xin, Song J. et al. Detection of Herpes Simplex Viruses Type 2 specific immunoglobulin G antibodies in African sera by using recombinant gG2, Western blotting, and gG2 inhibition. J. Clin. Microbiol, 2002, V.40, №10, p. 3635-3640.

42. Hutin Y. J. F., Williams R. J., Malfait Ph. et al. Outbreak of human monkeypox, Democratic Republic of Congo, 1996 —1997. Emerg. Infect. Dis., 2001, V. 7, № 3, p. 434 438. .

43. Ibrahim, M. S., J. J. Esposito, P. B. Jahrling, and R. S. Lofits. The potential of 5'-nuclease PCR for detecting a single-base polymorphism in Orthopoxvirus, Mol. Cell. Probes, 1997, 11, p. 143-147.

44. Kearns A. M., Draper В., Wipat W et al. Letters to the Editor LightCycler-Based Quantitative PCR for Detection of Cytomegalovirus in Blood, Urine, and Respiratory Samples. J. Clin. Microbiol., 2001, V.39, p. 2364-2365.

45. Kessler H. H., Muhlbauer G., Rinner В., et al. Detection of Herpes Simplex Virus DNA by Real-Time PCR. J. Clin. Microbiol., 2000, V.38, p. 26382642.

46. Kimberlin D.W., Lin C.Y., Jacobs R.F., et al. Natural history of neonatal herpes simplex virus infections in the acyclovir era. Pediatrics, 2001; V.108 №2, p. 223-9.

47. Knausz M., Niederland Т., Dosa E. and Rozgonyi F. Meningo-encephalitis in a neonate caused by maternal Mycoplasma hominis treated successfully with chloramphenicol. J. Med. Microbiol, 2002; 51, p. 187-188.

48. Knezevic A., Martic J., Stanojevic M. et al. Disseminated neonatal herpes caused by herpes simplex virus types 1 and 2. Emerging Infectious Diseases, 2007, V.13, №2, p. 302-304.

49. Laassri M., Chizhikov V., Mikheev M. et al. Detection and discrimination of orthopoxviruses using microarrays of immobilized oligonucleotides. Journal of Virological Methods, 2003, 112,p. 67- 78.

50. Lanari M., Lazzarotto Т., Venturi V., et al. Neonatal cytomegalovirus blood load and risk of sequelae in Symptomatic and Asymptomatic congenitally infected newborns. Pediatrics, 2006, V.117, №1, p. e76-e83.

51. Lander E. Array of hope. Nature genetics supplement. Nature, 1999, p. 21.

52. Lapa S., Mikheev M., Shchelkunov S., et al. Species-Level Identification of Orthopoxviruses with an Oligonucleotide Microchip. J. Clin. Microbiol., 2002, V.40, p. 753-757.

53. Leone G, Schijndel H, Van Gemen B, Kramer FR and Schoen CD. Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous, real-time detection of RNA. Nucl Acids Res, 1998, 26, p.2150—2155.

54. Liljeqvist J.-A., Svennerholm B, and Bergstom T.Typing of clinical Herpes Simplex Viruses type 1 and type 2 isolates with monoclonal antibodies. J.Clin. Microbiol., 1999, V.37, №8, p. 2717-2718.

55. Lim D. V., Simpson J.M, Kearns E. A., and Kramer M. F. Current and Developing Technologies for Monitoring Agents of Bioterrorism and Biowarfare, Clin Microbiol Rev, 2005, V.10, p. 583-607.

56. Mackay I.M., Arden K.E. and Nitsche. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research, 2002, V. 30, N.6, p.236-240.

57. Mancini-Bourgine M., Bayard F., Soussan P. Hepatitis В Virus Splice-Generated Protein Induces T-Cell Responses in HLA-Transgenic Mice and Hepatitis В Virus-Infected Patients. J Viro., 2007, V. 81, p. 4963-4972.

58. Marennikova, S. S., F. G. Nagieva, G. R. Matsevich, E. M. Shelukhina, N. A. Khabahpasheva, and G. M. Platonova. Monoclonal antibodies to monkeypox virus: preparation and application. Acta Virol., 1988, 32, p. 1926.

59. Markoulatos P., Georgopoulou A., Siafakas N., Plakokefalos E., et al.1.boratory Diagnosis of Common Herpesvirus Infections of the Centralt

60. Nervous System by a Multiplex PCR Assay. J. Clin. Microbiol., 2001, V.39, p. 4426-4432.

61. Meyer H., De Perrichot M., Stemmler M., et al. Outbreaks of disease suspected of being due to human monkeypox virus infection in the Democratic Republic of Congo in 2001. J Clin Microbiol, 2002, V. 40, p.2919- 2921.

62. Meyer H., Pfeffer M., and Rziha H.-J. Sequence alterations within and downstream of the A-type inclusion protein genes allow differentiation of Orthopoxvirus species by polymerase chain reaction. J. Gen. Virol, 1994, 75, p. 1975-1981.

63. Mikhailovich V., Lapa S., Gryadinov D. et al. Identification of rifampin-resistant Mycobacterium Tuberculosis Srtin by hydridization, PCR, and Ligase Detection reaction on oligonucleotide microchips. J. Clin. Microbiol, 2001, p. 2531-2540.

64. Minjolle S., Michelet C., Jusselin I., et al. Amplification of the Six Major Human Herpesviruses from Cerebrospinal Fluid by a Single PCR. J. Clin. Microbiol, 1999, V.37, p. 950-953.

65. Mukinda, V. В., G. Mweta, M. Kilundu, D. L. Heymann, A. S. Khan, J. J., Esposito, et al. Re-emergence of human monkeypox in Zaire in 1996. Lancet, 1997, 349, p.1449-1450.

66. Nagasse Sugahara Т. K., Kisielius J. J., Ueda-Ito M. et al. Human vaccinialike virus outbreaks in Sao Paulo and Goias States, Brazil: virus detection, isolation and identification. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 2004, V. 46, №6, p. 315-322.

67. Nasedkina T.V., V.S. Zharinov, E.A. Isaeva, et al. Clinical screening of gene rearrangements in childhood leukemia using a multiplex PCR-microarray approach. Clinical Cancer Research, 2003, V.9, p. 5620-5629.

68. Notomi Т., Okayama H., Masubuchi H. et al. Loop-mediated izotermal amplification of DNA Nucleic Acid research, 2000, V. 28, p. 129-136.

69. Numazaki" K. Current problems of perinatal Chlamydia trachomatis infections. J Immune Based Ther Vaccines, 2004, V. 2, №4.

70. Panning M., Asper M., Kramme S., et al. Rapid Detection and Differentiation of Human Pathogenic Orthopox Viruses by a Fluorescence Resonance Energy Transfer Real-Time PCR Assay, 2004, Clinical Chemistry, V. 50, №4, p. 702-708.

71. Parinov S., Barsky V., Yershov G., et al. DNA sequencing by hybridization to microchip octa- and decanucleotides extended by stracked pentanucleotides. Nucleic. Acids. Res. 1996, V.24, №15,p. 2998-3004.

72. Razin S., Yogev D., and Naot Y., Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas, Microbiol Molecul Biol Rev, 1998, V. 62, p. 1094-1156.

73. Read S. J., Jeffery K. J. M., and Bangham C. R. M, Aseptic Meningitis and Encephalitis: the Role of PCR in the Diagnostic Laboratory, J Clin Microbiol, 1997, V.35, p. 691-696.

74. Reed K. D., Melski J.W., Graham M.B. et al. The detection of monkeypox in humans in the Western Hemisphere. New Engl. J. Med., 2004, V. 350, p.342-350.

75. Riedel S., Smallpox and biological warfare: a disease revisited, 2005

76. Rithidech, K. N., J. J. Dunn, and C. R. Gordon. Combining multiplex and touchdown PCR to screen murine microsatellite polymorphisms. BioTechniques, 1997, 23, p.36-45.

77. Ropp, S. L., Q. Jin, J. C. Knight, R. F. Massung, and J. J. Esposito. PCR strategy for identification and differentiation of smallpox and other orthopoxviruses. J. Clin. Microbiol, 1995, 33, p. 2069-2076.

78. Rubina A.Yu., Pan'kov S.V., Ivanov S.M. et al. Protein microchips. Dpklady biochemistry and biophysics, 2001,381, p. 419-422.

79. Rubina A.Yu, Pan'kov S.V., Dementieva E.I. et al. Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production. Anal. Biochem, 2004, 325, p. 92-106.

80. Sachadyn P. and J. Kur. The construction and use of a PCR internal control.

81. Molecular and Cellular Probes, 1998, 12, p. 259-262.f

82. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., et al. Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, 239, p. 419-422.

83. Schachter J., Hook 1П E.W., Mccormack W.M., et al. Ability of the Digene Hybrid Capture II Test To Identify Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in Cervical Specimens. J. Clin. Microbiol, 1999, V. 37, p. 3668-3671.

84. Schupp P., Pfeffer M., Meyer H., et al. Cowpox virus in a 12-year-old boy: rapid identification by an orthopoxvirus-specific polymerase chain reaction. British Journal of Dermatology, 2001, 145, p. 146-150.

85. Sorokin N. V., Yurasov D. Y., Cherepanov A. I., et al. Effects of external transport on discrimination between perfect and mismatch duplexes on gel-based oligonucleotide microchips. J. Biomol. Struct. Dyn., 2007, V.24, №6, p.571-578.

86. Sugimura K., Ohno Т., Azuma I., and Yamamoto K. Polymorphism in Genes for the Enzyme Arginine Deiminase among Mycoplasma Species. Infecrion and immunity, 1993, V.61, p. 329-331.

87. Tafreshia N. K., Sadeghizadeha M., Amini-Bavil-Olyaeeb S. et al. Development of a multiplex nested consensus PCR for detection and identification of major human herpesviruses in CNS infections. J Clin Virol, 2005, 32, p. 318-324.

88. Thibault С, V Le Berre, S Casimirius, et al. Direct microcontact printing of oligonucleotides for biochip applications, Journal of nanobiotechnology, 2005.

89. Van Der Pol В., Quinn T.C., Gaydos Ch. A. Multicenter evaluation of the Amplicor and automated Cobas Amplicor CT/NG tests for detection of Chlamydia trachomatis. J. Clin. Microbiol., 2000, V.38, p. 1105-1112

90. Van Doornum G. J. J., Guldemeester J., Osterhaus A. D. M. E., and Niesters H. G. M. Diagnosing herpesvirus infections by real-time amplification and rapid culture, J. Clin. Microbiol., 2003, V. 41, p. 576-580.

91. Waites К. В., Katz В., and Schelonka R. L. Mycoplasmas and Ureaplasmas as Neonatal Pathogens, Clin Microbiol Rev, 2005, V. 18, p. 757-789.

92. Walker G. Т., Little M. C., Nadeau J. G., and Shank D. D. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2005, V.89, p. 392 396.

93. Weidmann M., Meyer-Ko"nig U., and Frank T. Hufert. Rapid Detection of Herpes Simplex Virus and Varicella-Zoster Virus Infections by Real-Time PCR. J. Clin. Microbiol., 2003, V.41, p. 1565-1568.

94. Wienecke R., Wolff H., Schaller M. Cowpox virus infection in an 11-year-old girl, J. Am. Acad. Dermatol., 2000, V. 42, № 5Pt2, p. 892-894.

95. Yoon, В. H., R. Romero, M. Kim, E. C. Kim, T. Kim, J. S. Park, and J. K. Jun. Clinical implications of detection of Ureaplasma urealyticum in the amniotic cavity with the polymerase chain reaction. Am. J. Obstet. Gynecol, 2000, 183, p.l 130-1137.

96. Yue J.,Xie J., Li Ya. et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis srtrain by using a specialized oligonucleotide miroarray. Diagn. Micr. Infec. Dis., 2004, 48, p. 47-54.1. БЛАГОДАРНОСТИ

97. Отдельно автор благодарит доктора биологических наук Калинину Наталью Олеговну и кандидата биологических наук Заваду Ларису Леонидовну за помощь и терпеливое отношение при оформлении необходимой для защиты документации.