Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электронная микроскопия в диагностике и исследовании некоторых поксвирусов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Электронная микроскопия в диагностике и исследовании некоторых поксвирусов"

РГЗ Од

2 7

На правах рукописи УДК 616.98:578.821.5]-07б.4

ЯНОВА Наталья Николаевна

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ В ДИАГНОСТИКЕ И ИССЛЕДОВАНИИ НЕКОТОРЫХ ПОКСВИРУСОВ

(03.00.06 - вирусология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вирусных препаратов (НИИВП) РАМН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор медицинских наук,

действительный член РАЕН, Заслуженный деятель науки России,

профессор Варенникова С.С.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, действительный член РАЕН, профессор Зуев 5.А.

доктор биологических наук Королев М.5.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт эпидемиологии и мик]

биологии им.Н.Ф.Гамапеи РАМ

Защита состоится ¿лл^и^ 1996г. в ^ часов на

заседании диссертационного совета Д.001.27.01. в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН (142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН.

Автореферат разослан ^¿сСи^ 1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Медведкина О.А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В конце 70-ых годов XX века впервые в истории медицины была достигнута полная ликвидация одного из самых тяжелых заболеваний человека -натуральной оспы. Объявлению об этом событии, сделанному в 1980 году на XXXIII Всемирной Ассамблее Здравоохранения (ВАЗ), предшествовала двухлетняя работа по выявлению и обследованию, в том числе и лабораторному, всех подозрительных на оспу случаев, подтвердившая отсутствие оспы на земле. Одним из важных последствий этого события явилась рекомендация ВАЗ о прекращении прививок против оспы во всех странах. Параллельно с этим XXXIII ВАЗ был принят ряд рекомендаций на постэрадикационный период, среди которых, в частности, была рекомендация по установлению эпиднадзора, в ходе которого должны были обследоваться все возникающие случаи подозрительных на оспу заболеваний. В соответствии с этой же резолюцией начал осуществляться специальный проект по изучению открытой к этому времени отечественными учеными (Маренникова С.С. и соавт.,1971; Ладный И.Д.и соавт.,1972) новой инфекции - оспы обезьян, клинические особенности которой сходны с таковыми

у натуральной оспы. Было рекомендовано также продолжение эпидемиологического надзора за инфекциями, вызванными другими поксвирусами, а также дальнейшее проведение научных исследований в этой области.

Как было установлено (Маренникова С.С. и соавт.,1971, 1984, 1985, 1989; Ходакевич Л.Н.,1990; Шелухина Э.М.,1980), возбудители таких заболеваний, как оспа коров и оспа обезьян, имеют природные резервуары среди животных. С прерыванием трансмиссии оспы среди людей и постоянным увеличением числа неиммунных к оспе лиц в результате отмены оспопрививания вероятность возникновения этих инфекций потенциально возрастает. Что касается оспы обезьян, то для нашей страны угроза заражения этой инфекцией существует в связи с возможностью ее заноса от животных, привозимых из-за рубежа и находящихся в тесном контакте с человеком.

Все это обусловливает, с одной стороны, важность диагностических исследований, а с другой - необходимость совершенствования методов диагностики, которые позволили бы быстро расшифровать этиологию оспоподобного заболевания. Основные исследования по диагностике ортопоксвирусных инфекций при осуществлении программы сертификации ликвидации оспы, постэрадикационного эпиднадзора и проекта ВОЗ по изучению оспы обезьян у людей проводились двумя Сотрудничающими центрами ВОЗ в Атланте (Центр по борьбе с болезнями) и в Москве (НИИ вирусных препаратов РАМН); где эта работа выполнялась с

участием автора настоящего исследования. Попутно отметим, что в 1981 году ВОЗ был направлен в национальные органы здравоохранения документ ("Поведение при подозрительных на оспу случаев в период после ее ликвидации"), в котором подчеркивалась важность электронномикроскопических исследований как метода экспресс-диагностики.

Цель и задачи работы. Цель работы заключалась в усовершенствовании метода электронной микроскопии при диагностике поксвирусных инфекций, оценке его эффективности.

Кроме того, было необходимо изучить особенности внутриклеточных включений, образуемых некоторыми изолятами ортопоксвирусов, выделенными от людей и животных на территории нашей страны.

Для выполнения поставленной цели решались следующие основные задачи.

1. Проведение электронномикроскопических исследований при массовых обследованиях подозрительных на оспу заболеваний людей в период сертификации ликвидации оспы, выполнения постэрадикационного эпиднадзора и проекта ВОЗ по изучению оспы обезьян у людей, а также при расшифровке спорадических оспоподобных заболеваний в нашей стране. .

2. Проведение исследований, направленных на повышение эффективности метода электронной микроскопии при экспресс-диагностике ортопоксвирусных инфекций за счет

применения специфических антител (иммуноэлектронная микроскопия) и его внедрения в практику.

3. Изучение возможности выявления и одновременной идентификации вируса оспы обезьян с помощью иммуноэлектронной микроскопии на основе моноклональных антител (МАТ) к этому вирусу.

4. Характеристика некоторых выделенных отечественных изолятов ортопоксвирусов с помощью электронной микроскопии, в частности, по структуре внутриклеточных включений, являющихся одним из важных маркеров при идентификации изолята.

Научная новизна работы и теоретическая значимость

1. Впервые использован метод иммуноэлектронной микроскопии для быстрого выявления ортопоксвирусов и разработаны оптимальные условия его практического применения.

2. Впервые показана возможность применения метода иммуноэлектронной микроскопии на основе МАТ к вирусу оспы обезьян для быстрого выявления и одновременной идентификации этого вируса и разработаны условия применения этого метода.

3. На основе проведенных исследований в комплексе с вирусологическими данными расшифрована природа оспоподобных заболеваний в нашей стране в период после ликвидации оспы и впервые установлено, что белые крысы могут быть источником заражения человека оспой коров.

Практическая ценность работы. Усовершенствован метод экспресс-диагностики ортопоксвирусных инфекций на основе иммуноэлектронной микроскопии, что позволило повысить эффективность метода, в частности, проводить диагностические исследования образцов с низкой концентрацией вируса. Метод внедрен в практику работы Московского Сотрудничающего центра ВОЗ по оспе и родственным инфекциям, наряду с разработанным нами способом быстрой видоспецифической диагностики оспы обезьян на основе иммуноэлектронной микроскопии с использованием МАТ к этому вирусу.

В дополнение к "Инструкции по лабораторной диагностике оспы" разработаны методические рекомендации по экспресс-диагностике ортопоксвирусных инфекций с помощью иммуноэлектронной микроскопии, которые утверждены Ученым советом НИИ вирусных препаратов РАМН 10 июня 1990 года.

Публикация результатов исследования и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ. Материалы доложены на международной конференции в Швейцарии (1994г.). Диссертация апробирована на Ученом совете НИИ вирусных препаратов РАМН 15 июня 1995 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, включая иллюстрации ( 29 рисунков и 10 таблиц ). Работа состоит из

следующих разделов: введение, обзор литературных данных, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы, который включает 158 источников, из которых - 122 зарубежных.

Материалы и методы исследования

Материалами для элекгронномикроскопических исследований являлись: содержимое кожных поражений больных людей и животных, а также внутренние органы животных (белые крысы, сибирские белки, краснохвостая песчанка), хориоаллантоисные оболочки (ХАО) куриных эмбрионов, культура клеток и клеточные фракции культуры клеток Vero (линия клеток любезно предоставлена докт.мед. наук Н.Н.Мальцевой, НИИ вирусных препаратов РАМН),диплоидных клеток человека ( штамм Л-68 любезно предоставлен докт.мед.наук Л.Г.Степановой, НИИ вирусных препаратов РАМН).

Материалы из кожных поражений и органов использовались в виде гомогената в буферном растворе Мак-Ильвейна.

Для исследования препаратов в электронном микроскопе применяли метод негативного контрастирования. При этом использовали 2% раствор фосфорновольфрамовой кислоты. Для иммуноэлекгронной мифоскопии применяли

способ введения сыворотки в агар по Anderson, Doane (1973); Lamontagne et al. (1980) с незначительной модификацией. Для данного метода использовали поликлональные и МАТ к ортопоксвирусам, предварительно проводя отбор сывороток и определяя их оптимальные разведения. МАТ использовали в виде иммунных асцитических жидкостей продуцируемых гибридомами, любезно предоставленных докт.мед.наук Ф.Г.Нагиевой (НИИ вирусных препаратов РАМН). Фиксацию клеточных культур осуществляли следующим образом: после центрифугирования клеточной суспензии при 2 ООО об/мин в течение 5 мин осадок клеток собирали, фиксировали в 2,5 % растворе глутарового альдегида в течение 20 минут с последующей дофиксацией 1 % раствором четырехокиси осмия в течение 1 часа. Фиксаторы готовили на фосфатном буфере Зоренсена (pH 7,2-7,3). После обезвоживания препараты заключали в эпоксидные смолы (Mollenhauer, 1964). Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме 8802 А (фирма LKB, Швеция) с помощью стеклянных ножей. Срезы контрастировали растворами уранилацетата и лимоннокислого свинца по общепринятой методике.

Препараты исследовали в электронном микроскопе JEM-100 СХ-П при ускоряющем напряжении 80 кВ. Все электронномикроскопические исследования сопровождались параллельно проводимыми сотрудниками лаборатории везикулярных вирусных инфекций НИИ вирусных препаратов РАМН (Центр ВОЗ по оспе и родственным инфекциям)

вирусологическими исследованиями, включая выделение и идентификацию вирусных изолятов, а также исследование соответствующих сывороток людей и животных, от которых были взяты пробы для элеюронномикроскопического изучения.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Стьюдента (Ашмарин И.П., Воробьев В.В., 1962 ). Результаты считали достоверными при р ^ 0,95.

Результаты и обсуждение

В период проведения исследований ( 1977 - 1992гг) нами было обработано более 3500 материалов от людей подозрительных на заболевание натуральной оспой либо оспой обезьян, а также от дикоживущих и содержащихся в питомниках животных. Было показано, что после ликвидации натуральной оспы в мире все имевшие место оспоподобные заболевания не являются натуральной оспой.

Таблица 1

Результаты элеюронномикроскопического и вирусологического исследования 3525 образцов содержимого кожных поражений людей_

Период обследования Общее число проб Количество проб положительных на поксвирусы, из которых был выделен вирус натуральной оспы

1977-1992 143 0

В период сертификации ликвидации оспы электронно-микроскопические изучения образцов и параллельное вирусологические исследования показали, что большая часть заболеваний вообще не связана с поксвирусами.

В 78% исследованного материала не обнаружены ни покс- и ни герпесвирионы, в 18,5 % обнаружены вирионы вируса герпеса и только в 3,5 % образцах от больных были выявлены вирионы поксвирусов ( Танапокс, контагиозный моллюск, оспа обезьян).

Надо отметить, что быстрое исключение с помощью электронной микроскопии оспенной природы болезни, например в случае обнаружения герпесвируса, имело большое значение для эпидслужбы, так как экономились силы и средства, необходимые для организации

противоэпидемических мероприятий. Высокий процент отрицательных результатов можно, вероятно, объяснить двумя причинами.

С одной стороны, в период сертификации ликвидации оспы (начиная с регистрации последнего случая заболевания Сомалийского больного в октябре 1977 г) резко уменьшилось или, вероятно, исчезла заболеваемость натуральной оспой, а с другой стороны, массовые обследования проводившиеся во многих странах Азии, Африки и Средиземноморья, привлекли к работе персонал разной степени квалификации, которые могли гипердиагносцировать подозрительные случаи, куда, естественно, попадали пробы от больных с разной этиологией.

Поксвирусы, обнаруженные электронномикроскопически в 15 пробах от больных из Центральной Африки оказались: натуральной оспы - 0, два - вирусом оспы обезьян, а в 13 случаях обнаруженные вирионы на основе их неспособности реплицироваться на ХАО , а также с учетом клинических данных были классифицированы как Танапокс вирус.

Электронномикроскопические исследования при выполнении организованного ВОЗ проекта по изучению оспы обезьян у людей и постэрадикационного периода эпиднадзора проводились на материале, целенаправленно собранном от больных, подозрительных на оспу обезьян, бригадами ВОЗ, что сказалось на результатах этих исследований. Процент положительных находок поксвирусов в этих случаях значительно выше, чем в период проведения сертификации ликвидации оспы (31,1 % и 3,5% соответственно).

Электронномикроскопические и вирусологические исследования с учетом клинических и эпидемиологических данных позволили установить, что среди выявленных положительных проб 20,6 % относились к вирусу оспы обезьян, 5,1 % - контагиозному моллюску, 5,4 % - Танапокс вирусу.

В результате осуществления электронно-микроскопических исследований материалов, поступающих в период выполнения проекта ВОЗ по изучению оспы обезьян у людей, было установлено, что вирионы вируса оспы обезьян в пробах, взятых от больных в разные периоды болезни, обнаруживались, как и при натуральной оспе (Маренникова

С.С., 1963; Мальцева Н.Н.,1980), в содержимом соскоба папул, везикулярной и пустулезной жидкости и в корках.

В ходе выполнения проекта ВОЗ по изучению оспы обезьян у людей были проведены экспериментальные исследования по заражению в лабораторных условиях особей сибирских белок и последующему выделению и биологическому изучению вируса из внутренних органов. В этот же период были изучены материалы из кожных поражений дикоживущей тропической белки РитзЫигиэ апегуОпгиз отловленной в Заире. Выделенный от этой белки изолят был идентифицирован как вирус оспы обезьян. Таким образом было впервые доказано, что этот вид животных является природным носителем вируса оспы обезьян.

Систематическое обследование подозрительных на оспу случаев в нашей стране, проводившееся в 1984 - 1992 г.г., включивших более 100 больных, показало, что в этот период имели место заболевания, вызванные вирусами оспы коров и паравакцины, и кроме того, зарегистрировали 3 случая заражения детей прививочным вирусом вакцины.

Бесспорная ценность метода электронной микроскопии была подтверждена при диагностике заболеваний, вызванных вирусом паравакцины. В этом случае морфологические особенности возбудителя паравакцины позволили быстро дифференцировать его от ортопоксвирусов. Такая возможность тем более важна, посколько как показано рядом исследователей (Шелухина Э.М. и др., 1986 ), этот вирус не

удается культивировать ни на ХАО куриных эмбрионов, ни в клеточных культурах 1-41, Нер-2 и др. Он способен реплицироваться только в эмбриональной ткани почек крупного рогатого скота, причем процент полученных при этом положительных результатов значительно ниже таковых при электронной микроскопии.

В исследованных нами препаратах от больных паравакциной были выявлены два типа частиц - "М" и "С" формы вирионов.

До настоящего времени в известной нам отечественной литературе описывали вирионы только одной формы - "М". Наличие двух форм вирионов было показано в отношении ортопоксвирусов (Быковский А.Ф., 1965), а №капо ( 1988 ) ранее отмечал также для паравакцины.

Заражения людей вирусом вакцины произошло в результате неосторожного обращения с заразным материалом. Пострадавшими оказались пятеро детей в возрасте 8-12 лет, которые разбили ампулы с вакциной в помещении. Заболевание развилось на третий день после происшествия. У троих из пяти детей в содержимом носовых секретов и поражений на крыльях носа обнаружены кирпичеобразной формы вирионы, характерные для ортопоксвирусов.

Из всех этих материалов получены изоляты вируса, оказавшиеся при идентификации вирусом вакцины.

В исследованных нами материалах спорадические случаи заражения людей оспой коров и дополнительные

лабораторные обследования животных, с которыми контактировали эти люди, позволили установить, что источником заражения в 4-х из 6-ти случаев являлись крысы. Так в отношении белых крыс удалось установить прямую передачу инфекции от животного человеку. Следует подчеркнуть, что ни в одном случае у заболевших не было контакта с больными коровами.

Для повышения эффективности метода электронной микроскопии ряд авторов (Королев М.Б., 1980; Григорьев В.Б., 1984; Kapikian, 1972,1974; Kelen, 1974; Gardner, 1977; Milne, 1977 и др.) предложил использовать иммуноэлекгронную микроскопию. Мы в своей работе с этой целью использовали один из его вариантов - введение соответствующих антител в агар.

В предварительных опытах с лабораторными культурами вирусов вакцины и оспы обезьян нами было показано, что образующиеся комплексы вируса и антител облегчают и ускоряют выявление самих вирионов. Эти данные полностью подтверждаются результатами других исследователей (Дроздов С.Г. и др.,1979; Сергеев А.Г. и др., 1985; Хаустов В.И. и др., 1986; Анджапаридзе А.Г. и др.,1987; Морган-Капнер П., 1988; Чепчев И., 1990; Kelen, 1974; Lamontagne et.al.,1980; Doane, 1987; Folkers E. et al., 1991, 1992 и др.). Так, было установлено, что в препарате, подвергнутому воздействию антител, находящихся в агаре, увеличивалось

количество вирионов в среднем в 5-12 раз по сравнению с контролем.

Получив доказательства существенного повышения разрешающей способности метода, мы приступили к его апробации непосредственно на материале от больных, используемом для диагностических целей.

Анализируя результаты этих исследований, с использованием иммуноэлектронномикроскопического метода, мы хотели бы прежде всего обратить внимание на результаты исследования одного из материалов - от больной С.О.. Она четырежды была вакцинирована против оспы, но заболела после укуса белой крысой и имела на месте укуса небольшие кожные поражения. Обнаружить вирус в содержимом этих поражений нам удалось только с помощью метода иммуноэлектронной микроскопии; выявленные вирионы оказались при исследовании сыворотки крови вирусом оспы коров. Результаты исследования этого же материала методом прямой электронной микроскопии, а также непосредственного выделения вируса на ХАО куриных эмбрионов дали отрицательный результат. В остальных исследованных материалах процент положительных результатов был одинаков как при иммуноэлектронной микроскопии, так и при прямой электронной микроскопии, однако в первом случае количество выявляемых вирионов было больше и их обнаружение осуществлялось в первые минуты просмотра.

Следующим этапом усовершенствования метода электронной микроскопии для диагностики ортопоксвирусных инфекций явилось изучение возможности использования видоспецифических МАТ к вирусу оспы обезьян для выявления и одновременной идентификации этого вируса. Предварительно было показано, эти МАТ не реагируют в иммуноферментном анализе (ИФА) и других серологических реакциях ни с одним вирусом, кроме вируса оспы обезьян, взаимодействуя при этом с одним белком, имеющим молекулярную массу 70-72 КД (Маренникова С.С., Нагиева Ф.Г., 1988; Жукова O.A., 1993). В модельных опытах на лабораторных культурах вирусов оспы коров и вакцины нам удалось показать, что при обработке этими МАТ вируссодержащих материалов количество обнаруживаемых вирионов не изменяется по сравнению с контролем, тогда как в материалах, содержащих вирус оспы обезьян, количество вирионов увеличивается в 3-8 раз.

На основе этих данных использование МАТ к вирусу оспы обезьян при условии параллельного использования стандартных культур вируса оспы коров и вакцины может быть рекомендовано для одновременного выявления и серологической идентификации вируса оспы обезьян непосредственно в материалах от больных или культурах ХАО куриных эмбрионов 1 пассажа. Таким способом была проведена быстрая идентификация изолята ортопоксвируса от ребенка из Габона в 1988 году, погибшего от острого

геморрагического заболевания сопровождавшегося сыпью, вызванного оспой обезьян, а также изолятов, полученных от больных из этой же страны в 1991 году. Тем самым впервые было показано существование эндемического очага оспы обезьян в новом регионе.

Еще одним аспектом применения электронной микроскопии в рамках проекта по эпидемиологическому надзору после ликвидации оспы, является осуществленное нами по предложению ВОЗ исследование кожных поражений мумии ребенка, обнаруженной при вскрытии захоранения XVI века в Неаполе. Интерес ВОЗ к этому объекту и ее озабоченность были вызваны тем, что на коже мумии имелись явные следы везикулярно-пустулезной сыпи. Расположение сыпи, мономорфизм ее элементов и наличие характерного вдавления в центре каждого из них позволили предположить, что причиной смерти ребенка явилась натуральная оспа. Проведенное элекгронномикрокопическое исследование препаратов кожных поражений мумии методом прямой и иммуноэлектроной микроскопии выявило наличие вирионов вируса с практически полностью сохраненной наружной структурой, характерной для ортопоксвирусов. Эти данные подтверждены ранее сделанными находками итальянских ученых, обнаружившими оспенные вирионы в ультратонких срезах кожи этой мумии с помощью иммуноэлектрон-номикроскопического метода, при использовании в качестве метки коллоидного золота (Ротааап С., МагсЬеЙ А., 1986).

Однако, несмотря на наличие морфологически сохраненных оспенных вирионов, было показано, что они не обладали жизнеспособностью. Свидетельством этого являются отрицательные результаты двукратных попыток выделения вируса на ХАО куриных эмбрионов в 4-х последовательных пассажах. Результаты непосредственного выявления антигена ортопоксвируса в ИФА, в РПГА оказались также безуспешными.

Самостоятельным разделом работы явилось изучение структуры внутриклеточных включений трех отечественных изолятов вируса оспы коров, проведенное нами в сравнении с референс-штаммом вируса оспы коров Брайтон, в инфицированной культуре клеток Vero. Два из указанных изолятов были выделены от заболевших людей, а третий был одним из первых изолятов вируса оспы коров от животных, выделенный в 1974 году Мальцевой H.H. от пумы во время вспышки оспы коров среди хищных животных семейства кошачьих в Московском зоопарке.

Проведенными исследованиями было подтверждено наличие как А, так и В типа внутриклеточных включений у двух (нЕль-87", "Пума-74")из трех изучаемых изолятов, а также штамма Брайтон.

. Третий исследуемый изолят "Аф-91" формировал внутриклеточные включения только типа В, что в отличие от упомянутых выше изолятов не позволяет по морфологическим критериям классифицировать его как вирус оспы коров. В то же время нами было показано, что изоляты, формирующие

включения типа А, различались по структуре включений этого типа: один из них "Пума-74" был аналогичен референс штамму Брайтон и формировал гомогенные включения, не содержащие вирионы, а изолят "Ель-87", выделенный от женщины, заразившейся от белой крысы, формировал включения, содержащие зрелые вирионы, расположенные по периферии включения. Полученные результаты подтвердили данные D. Вахву (1975 ), F.Fenner (1992) о наличии разных вариантов включений типа А у изолятов из различных географических зон. Изолят "Аф-91", который не образовывал включений типа А, по этому маркеру был близок к вирусу вакцины. О том, что этот изолят не отличался от вируса вакцины, свидетельствовали и данные рестриктазного анализа ДНК этого вируса, проведенные в Вирусологическом центре НИИ микробиологии МО (Маренникова С.С., личное сообщение). Кроме того, этот изолят отличался от вируса оспы коров по некоторым вирусологическим маркерам: он образовывал полиморфные по структуре и размерам оспины на ХАО и не вызывал выраженных некрозов при внутрикожном введении кроликам. Хотя возможность циркуляции в природе вируса, аналогичного вирусу вакцины, оспаривается многими исследователями, имеется сообщение о выделении подобного вируса от людей (Воигке and Dambell, 1972), а также от обезьян (Шелухина З.М., 1980). С другой стороны, принимая во внимание тот факт, что работа с материалом, из которого был выделен этот изолят, проводилась в помещении, где в соседних комнатах велись

исследования с вирусом вакцины, нельзя полностью исключить возможность контаминации материала вирусом вакцины.

ВЫВОДЫ

1. На основе проведенных исследований показана высокая ценность электронной микроскопии в общей системе диагностического исследования при поксвирусных инфекциях как при массовых обследованиях подозрительных на оспу случаев (период сертификации ликвидации оспы, период постэрадикационного эпиднадзора и осуществления проекта ВОЗ по изучению оспы обезьян у людей), так и при расшифровке природы спорадических оспоподобных заболеваний на территории нашей страны.

2. Подтверждена возможность применения электронной микроскопии как диагностического метода, позволяющего проводить дифференциацию ортопоксвирусов (оспа коров) от парапоксвирусов (паравакцина), вызывающих у людей и животных болезни, сходные по клиническим проявлениям.

3. Применительно к ортопоксвирусам впервые показаны существенные преимущества иммуноэлектронной микроскопии по сравнению с прямой электронной микроскопией, выражающиеся в увеличении количества выявляемых вирионов за счет образования иммунных комплексов, что

существенно сокращает время просмотра препаратов и повышает достоверность ответа.

4. Впервые показана возможность выявления и одновременной идентификации вируса оспы обезьян с помощью метода иммуноэлектронной микроскопии на основе моноклональных антител к этому вирусу.

5. Подтверждена принадлежность к вирусу оспы коров двух изолятов ортопоксвирусов, выделенных в Москве в 1974г. и 1987г. (от заболевшей пумы и человека, укушенного белой крысой) по характеру внутриклеточных включений. Показано наличие разных вариантов включений типа А у этих изолятов.

6. Метод электронной микроскопии в комплексе с вирусологическими и серологическими исследованиями позволил установить новые данные, касающиеся экологии вирусов оспы обезьян и оспы коров (выявление новых природных носителей вируса оспы обезьян и оспы коров).

7. Дополнительно к известным эпидемиологическим зонам распространения вируса оспы обезьян в Заире, Камеруне, Нигерии, Либерии, Съерра-Лионе, Берег Слоновой Кости, Центральной Африканской Республике впервые, благодаря диагностически подтвержденным случаям заболевания людей оспой обезьян, выявлен новый эпидемиологический очаг этой инфекции в Габоне.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Маренникова С.С., Шелухина Э.М., Ходакевич Л.Н., Янова Н.Н. Выделение вируса оспы обезьян от дикоживущей африканской белки // Bonp.BHpyc.-1986.-N 2.-C.238-241.

2. Маренникова С.С., Жукова О.А., Маненкова Г.М., Янова Н.Н. Лабораторно подтвержденный случай заражения человека оспой крыс (оспой коров) //Ж.микробиол., эпидемиол. и иммунологии. -1988. - N 6. - с.30-32.

3. Янова Н.Н., Маренникова С.С., Жукова О.А., Слугин М.И. Повышение эффективности элеюронномикроскопической диагностики ортопоксвирусных инфекций /У Вопр.вирус. - 1989. -N 6. - с.752-755.

4. Цанава Ш.А., Маренникова С.С., Сакварелидзе А.А., Янова Н.Н. Выделение вируса оспы коров от краснохвостой песчанки / /Вопр.вирус. -1988. - N 1. - с.95 - 97.

5. Marennikova S.S., Shelukhina Е.М., Matsevith G.R., Ezek Z., Khodakevich L.N., Zhukova O.A., Yanova N.N., Chekunova E.V. Monkey pox in humans: current results // Acta virol.- 1989.- v.33. -p.246-253.

6. Marennikova S.S., Shelukhina E.M., Zhukova O.A., Yanova N.N., Loparev V.N. Smallpox diagnosed 400 years later results of skin lesions examination of 16-th ceantury italian mummy If J. of hygiene, epidemiol., microbiol. and immunol. - -1990. - v.34. - N2. - p.227-231.

7. Маренникова С.С., Янова H.H., Жукова O.A. ' Электронная микроскопия как метод диагностики при эпидемиологическом надзоре за поксвирусными инфекциями // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунологии. - 1990. - N8. - с. 5762.

8. Янова H.H., Маренникова С.С. Вариации патоморфологических изменений, вызванных в чувствительных клетках вирусом, идентифицированным как вирус оспы коров // Микроскопические аспеюы патогенеза вирусных инфекций.-Новосибирск. -1991. -C.47.

9. Marennikova S., Zhukova О., Shelukhina Е., Tsanava Sh., Gashnikov P., Shehelkunov S., Yanova N. Rats in the ecological chain of cowpox virus U Immunobiology of viral infections. Proc. 3rd Congress Europ. Soc. Vet. Virol. Switzerland. -1995.- p.94-98.