Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электронно-микроскопические исследования специфических комплексов ДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Черный, Дмитрий Ильич, Москва



{ /

ч;

( п

/

Российская Академия наук Институт молекулярной генетики

' ¡погиение о™

::, ;Г|Суд:йлу^гну;о степень ДО А 1ОИА

I ..и_ " шотииш^

аук

! :-1:гчальг;-1к гтэавд.ения ВАК России

/

На правах рукописи УДК 577.352/.354'52.086.3 577.21.086.3

Черный Дмитрии Ильич

Электронно-микроскопические исследования специфических комплексов ДНК

03.00.03 - Молекулярная биология

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1999

Оглавление

1. Введение 5

2. Литературный обзор. Анализ структурных особенностей

ДНК и ее комплексов с белками и нуклеиновыми

кислотами с помощью электронной микроскопии:

возможности метода 9

2.1. Введение 9

2.2. Общие принципы формирования изображения биологических объектов в просвечивающем электронном микроскопе 14

2.3. Общие принципы приготовления образцов ДНК для

электронной микроскопии. 18

2.4. Возможности электронной микроскопии при изучении ДНК 25

2.5. Изучение специфических комплексов ДНК с белками и нуклеиновыми кислотами 40

2.6. Возможности применения электронной микроскопии для физического картирования 53

Заключение 58

3. Материалы и методы 61

4. Экспериментальная часть 64 4.1. Взаимодействие РНК-полимеразы Е. coli с ДНК. 64

4.1.1. Введение 64

4.1.2. Материалы,методы 71

4.1.3. Результаты 74

4.1.4. Резюме 80

4.2. Изучение специфического взаимодействия метилтрансфераз

с ДНК 97

4.2.1. Введение 97

4.2.2. Материалы,методы 101

4.2.3.Результаты 104

4.2.4. Резюме 111

4.3. Изучение специфического взаимодействия триплекс

образующих нуклеотидов с ДНК 121

4.3.1. Введение 121

4.3.2. Материаль^методы 127

4.3.3. Результаты 131

4.3.4. Резюме 138

4.4. Изучение специфического взаимодействия пептидной

нуклеиновой кислоты с ДНК 148

4.4.1. Введение 148

4.4.2. Материалы}методы 152

4.4.3. Результаты 155

4.4.4. Резюме 159

4.5. Специфическое взаимодействие с ДНК протяженных олигонуклеотидов 169

4.5.1. Введение 169

4.5.2. Материалы?методы 175

4.5.3. Результаты 177

4.5.4. Резюме 179

5. Анализ экспериментальных данных 184 Введение 184

5.1. Общий анализ достоверности электронно-

микроскопического картирования 184

5.2. Частный анализ карт связывания 194

5.3. Анализ структурных изменений ДНК при специфическом взаимодействии с белками

или нуклеиновыми кислотами 202

6. Обсуждение и перспективы 210

7. Выводы 218

8. Список цитированной литературы 222

Введение

Структурная организация ДНК имеет важнейшее значение для реализации

генетической информации и регуляции основных клеточных процессов.

Взаимодействия ДНК с белками играют ключевую роль в регуляции этих

процессов. Несмотря на значительные достижения в понимании природы ДНК-

белковых взаимодействий, многие аспекты узнавания ДНК белками еще не

выяснены. Для правильного понимания молекулярных механизмов, лежащих в

основе этих взаимодействий, необходимо получение структурной информации о

комплексах ДНК с белками. Структурный полиморфизм, вариабельность,

ту.

многокомпонентность и мульфункциональность этих комплексов создают серьезные проблемы при их анализе. Мощным инструментом в исследованиях ДНК-белковых комплексов и получении структурной информации о них является электронная микроскопия .

В настоящее время интенсивно изучается взаимодействие ДНК с олигонуклеотидами и их аналогами^ поскольку эти соединения позволяют разрабатывать методы направленного манипулирования активностью генов. Высокая специфичность реакции взаимодействия позволяет надеятся на создание широкого спектра методов искусственной модификации ДНК. Эти соединения представляют особый интерес с точки зрения разработки методов изучения структурной организации геномов, в том числе и с помощью электронной микроскопии, причем нет принципиальных ограничений для использования электронной микроскопии для изучения этих взаимодействий.

Уникальность микроскопии состоит в том, что она позволяет видеть индивидуальные молекулы ДНК и локализовать участки специфического связывания в составе протяженных молекул ДНК длиной до нескольких сотен тысяч пар оснований. Тем самым становится возможным получение уникальной информации о структуре ДНК в комплексе с белками или олигонуйеотидами, а также определение кинетических и равновесных констант реакции связывания. Надежная информация может быть получена только в случае разработки соответствующих методов наблюдения и правильного выбора критериев анализа экспериментальных данных.

Дуализм изучения специфического узнавания ДНК белками или олигонуклеотидами с помощью электронной микроскопии состоит в том, что оно является одновременно не только предметом исследования, но и его средством. Локализация участков специфического связывания является основой для разработки методов физического картирования. Это создает принципиально новые подходы к исследованиям структурной организации генома человека.

Для реализации потенциала электронной микроскопии необходимо уметь картировать участки узнавания различного размера и состава. В связи с этим направленное изучение специфического взаимодействия ДНК с различными белками и олигонуклеотидами и их аналогами чрезвычайно важны. В ходе таких исследований могут быть получены новые данные о специфическом узнавании ДНК и сформулированы общие принципы физического картирования ДНК с помощью электронной микроскопии.

Цель данного исследования состояла в изучении специфического взаимодействия ДНК с различными белками и олигонуклеотидими и их

аналогами с помощью электронной микроскопии и разработке методов физического картирования ДНК. Для выполнения поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи:

1) разработать методы и изучить специфическое взаимодействие ДНК с РНК-полимеразой Е.соН и метилтрансферазами;

2) разработать методы и изучить специфическое взаимодействие ДНК с триплекс-образующими олигонуклеотидами (ТОО) и аналогами олигонуклеотидов типа пептидная нуклеиновая кислота (ПНК);

3) разработать подходы к физическому картированию ДНК с помощью протяженных олигонуклеотидов;

4) разработать методы количественного анализа электронно-микроскопических данных;

I

5) разработать методы определения достоверности электронно-микроскопического картирования.

В данной работе для анализа ДНК автор в основном использовал методы просвечивающей электронной микроскопии. В некоторых случаях были использованы методы атомно - силовой микроскопии. Несмотря на принципиальные различия в процессах формирования изображения в электронном и атомно-силовом микроскопах, применение в атомно-силовой микроскопии одной из электронно-микроскопических методик приготовления препаратов (адсорбция на слюду с последующим высушиванием) создает серьезные предпосылки, чтобы рассматривать данные методы как взаимодополняющие, и позволяет легко адаптировать результаты, полученные с

помощью атомно - силовой микроскопии для электронно-микроскопических исследований и наоборот.

Представленные в данной работе результаты демонстрируют принципиальную возможность количественного изучения специфического взаимодействия предложенных белков, олигонуклеотидов и их аналогов с ДНК. Для каждого типа взаимодействия были найдены оптимальные условия изучения и на их основе предложены новые подходы к физическому картированию протяженных фрагментов ДНК.

2. Литературный обзор. Анализ структурных особенностей ДНК и ее комплексов с белками и нуклеиновыми кислотами с помощью электронной микроскопии: возможности метода

2.1. Введение

Можно с уверенностью констатировать, что не существует области живой природы, в которой не была бы использована электронная микроскопия. Начиная с молекул и заканчивая целыми организмами - все это доступно изучению электронной микроскопии. Со времени разработки первого просвечивающего электронного микроскопа Е. Ruska в начале сороковых годов, электронные микроскопы значительно эволюционировали: просвечивающие микроскопы были существенно технически модернизированы, появились сканирующие электронные микроскопы, появились микроскопы, позволяющие анализировать спектр рассеянных электронов по энергиям. Стало возможным анализировать объекты в широком интервале температур от нескольких градусов по Кельвину до нескольких сотен градусов по Цельсию. Предельное разрешение современных просвечивающих микроскопов составляет 0.1 - 0.15 пш, а сканирующих - около 0.5 пш. В последние годы интерес к электронной микроскопии значительно возрос в связи с появлением нового класса сканирующих зондовых микроскопов? таких как туннельный микроскоп и атомно-силовой микроскоп (АСМ). Несмотря на принципиальное различие между зондовыми и электронными микроскопами, многие исследователи считают весьма целесообразным использование этих микроскопов параллельно для анализа одних и тех же структур, а результаты -

взаимодополняющими. Примечательно, что в 1986 г. Е. Ruska была присуждена Нобелевская премия за фундаментальные работы в электронной оптике и за разработку первого электронного микроскопа, одновременно с G. Binnig и Н. Rohrer за создание туннельного микроскопа.

Электронная микроскопия (ЭМ) позволяет "видеть" отдельные молекулы, хотя необходимо отдавать отчет в том, что "увидеть" в электронном микроскопе - это не то же самое, что увидеть что-либо своими глазами или в световом микроскопе, поскольку в каждом конкретном случае конечное изображение, возникающее на сетчатке глаза экспериментатора и запечатлеваемое в его мозге, было сформировано в результате различных физических процессов, протекающих при взаимодействии объекта с фотонами или электронами.

Начиная с 1959 года, со времени опубликования Kleinschmidt'ом и Zahn'oM пионерской работы, в которой был: описан способ приготовления молекул ДНК в расправленном состоянии, позволяющий проводить количественные измерения вдоль цепи ДНК (Kleinschmidt and Zahn, 1959), началась бурная эра развития электронной микроскопии в молекулярной биологии. Со временем появились модификации основного метода и были разработаны принципиально новые методы приготовления, которые позволяли изучать структуру нуклеиновых кислот и их комплексов с различными лигандами в разнообразных солевых условиях. В зависимости от поставленной задачи экспериментатор может выбрать адекватную методику изучения конкретной биологической системы. К сожалению следует отметить, что использование ряда методов, несмотря на их большие возможности, определено техническим оснащением лабораторий и часто не

реализуется в полной степени.

В течение длительного начального периода становления электронной микроскопии, она не была самостоятельным методом. Очень часто изображения объектов, "увиденные" в электронном микроскопе, использовали лишь в качестве иллюстративного материала и не рассматривали в качестве серьезных аргументов, подтверждающих или опровергающих различные биологические гипотезы. Значительный рост количества электронных микроскопов, используемых в молекулярно-биологических исследованиях, улучшение методик приготовления препаратов, получение воспроизводимых результатов в разных лабораториях, появление технических средств, обеспечивающих получение не только и не столько наглядной, но и количественной информации, систематическое изучение разнообразных биологических объектов - все это постепенно превращало электронную микроскопию из обслуживающего и вспомогательного метода в самостоятельный, чрезвычайно информативный и полезный метод исследования молекулярно-биологических систем.

Сложность интерпретации данных, получаемых с помощью

электронной микроскопии, в частности, молекул ДНК, возникает вследствие

»

того, что метод, в силу своей уникальной возможности, позволяет наблюдать индивидуальные молекулы. Известно, что многие характеристики ДНК имеют статистический характер вследствие тепловых флуктуации. Это означает, что определенные свойства ДНК могут быть получены либо в результате одномоментного анализа большого ансамбля молекул, что и происходит при изучении, например, оптическими методами, либо в результате долгого наблюдения за поведением одной молекулы, что уже

достижимо при использовании некоторых методов электрофореза или атомно-силовой микроскопии и т.д.

Электронная микроскопия занимает промежуточное положение в общем ансамбле методов: временной анализ поведения ДНК невозможен, а статистический ансамбль ограничен по размеру и, как правило, не превышает несколько сотен или тысяч молекул. Поэтому правильная интерпретация получаемых результатов чрезвычайно важна.

Несмотря на общую тенденцию в электронной микроскопии ДНК в сторону получения количественной информации, морфологический аспект микроскопии все еще очень значителен, а количественные методы анализа разработаны еще слабо. Это, пожалуй, не относится к области изучения строения белковых молекул, в которой именно морфологические исследования проливают свет на трехмерную организацию белковой глобулы. Достойно удивления, что, несмотря на трудоемкость метода, исследователи, работающие в области изучения строения белков, давно осознали возможности метода и необходимость применения специального математического анализа для получения количественной информации, тогда как микроскопия ДНК не имеет хорошо разработанных методов анализа. Такая важная информация, например, как величины кинетических или равновесных констант ассоциации для белков, специфически узнающих определенные последовательности ДНК^ по существу, были определены только для очень ограниченного набора белков, хотя a priori ясно, что это может быть универсальным электронно-микроскопическим методом, пригодным для анализа многих ДНК/белковых комплексов.

В данном обзоре автор стремился раскрыть возможности электронной микроскопии в рамках цели данного исследования, а именно с точки зрения изучения специфического узнавания ДНК белками и олигонуклеотидами и разработки подходов к физическому картированию геномов. При этом автор не ставил своей целью дать подробное описание всех изученных на сегодняшний день разнообразных ДНК/белковых или ДНК/ДНК комплексов, а показать принципиальные возможности микроскопии в исследованиях молекулярно-биологических объектов, проиллюстрировав их на конкретных примерах. К настоящему времени опубликовано большое количество обзоров по электронной микроскопии ДНК, в которых заинтересованный читатель может найти почти исчерпывающую информацию. Так .например, обзоры Brack (1981) и Delain and Le Cam (1995), которые можно рассматривать как развитие одной темы, а именно, электронной микроскопии ДНК, охватывают период с 1960 по 1995 и содержат около 400 неповторяющихся ссылок; обзор Thresher и Griffith (1992), в котором подробно изложены результаты электронно-микроскопического изучения взаимодействия ДНК со многими белками. Кроме того, развитие электронных средств связи, обеспечивающих практически неограниченный доступ в различные научные библиотеки мира; доступ к библиографическим базам данных, таким как Medline, Current Contents, Biosis и др.; наличие библиографических программ, существенно упрощает поиск необходимой информации по интересующему вопросу. Автор должен констатировать, что его собственная библиографическая база по электронной микроскопии ДНК насчитывает более пяти тысяч записей, охватывая период с начала 60-х годов по настоящее время. Количество

статей, в которых анализировали взаимодействие ДНК с белками, насчитывает более двух тысяч.

2.2. Общие принципы формирования изображения биологических объектов в просвечивающем электронном микроскопе

Для правильного понимания основ приготовления и анализа биологических образцов для их изучения с помощью просвечивающей электронной микроскопии, необходимо кратко остановиться на основных принципах формирования изображения объекта (Хейденрайх, 1966; Шиммель, 1972; Спэнс, 1986). В электронном микроскопе изображение объекта формируется за счет взаимодействия эмитированных катодом электронов с атомами образца. Электроны, взаимодействуя с атомами образца, претерпевают упругие и неупругие столкновения и рассеиваются на произвольные углы. Интенсивность рассеивания образца зависит от энергии электронов, которая в случае биологических образцов, обычно составляет 80-120 кЕу, атомного состава образца, сечений упругого и неупругого рассеивания электронов атомами образца, его плотности и толщины. Интерференция рассеянных электронов приводит к появлению в плоскости изображения картины, характеризующейся неравномерным распределением электронной плотности, регистрируемой в виде почернений на фотографической эмульсии и трактуемой как изображение объекта. При этом чем выше рассеивающая способность какого-либо участка образца, тем меньше попадает электронов в соотв�