Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование процессов компактизации - декомпактизации ДНК в составе хроматина и в модельных системах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование процессов компактизации - декомпактизации ДНК в составе хроматина и в модельных системах"

Академия медицинских наук СССР Институт питания

На правах рукописи

ВЕНГЕРОВ Юрий Юдефовмч

УДК 577,213.7.03-576.315.42

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ КОМПАКТИЗАЦИИ - ДЕКОМПАК'ГИЗАЦИИ ДНК В СОСТАВЕ ХРОМАТИНА И В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ

03.00.04 — Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва 1990

Работа выполнена в Научном центре молекулярной диагностики Минздрава СССР.

Официальные оппоненты:

академик АМН СССР Збарский Илья Борисович Институт биологии развития АН СССР

доктор Оиол. наук, профессор спитковский давил Михайлович Институт медицинской генетики АМН СССР

доктор бнол. наук, профессор Спиричев Владимир Борисович Институт питания АМН СССР

Ведущая организация - Институт молекулярной генетики АН СССР

Завита диссертации состоится • ' 1990 г. в

> ¡.СР

'/¡у ' часов на заседании Специализированного совета А-001.02.01 . Москва, 11/9240, Устьинский проезд 2/14. Институт питания АМН СССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания АМН СССР

Автореферат разослан " _(ХДч^цр^с^.)990 г

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат медицинских наук

хминченко в.м.

Актуальность проблемы Структурная организация ДНК и ее укладка в составе хроматина имеет важнейшее значение для реализации генетической информации. Очевидно, что многие процессы регуляции активности клеток, связанные с воздействиями условий внешней среды или влиянием физиологически активных соединений, реализуются на уровне ядра за счет актизации или подавления активности тех или иных генов, и сопряженных с этим процессов компактизации или декомпактизации соответствующих участков генома. Поэтому исследования структурной организации генома и механизмов, ответственных за структурные перестройки отдельных участков генома, всегда вызывали значительный интерес.

Особую актуальность проблемы укладки ДНК в составе хроматина приобретают в связи с растущим разрывом между значительной информацией, накопленной об организации генов на уровне первичной последовательности ДНК, и очень ограниченными представлениями о пространственной организации нитей ДНК в составе тех или иных структур.

В настоящее время полно охарактеризован только первый уровень компактизации ДНК в клетках - уровень нуклеосом. Уже следующие уровни слабо изучены, и по поводу организации 200300 X фибрилл нет единого мнения. Практически не выяснены способы укладки ДНК в более крупных структурах, очень мало исследованы механизмы структурных переходов хроматина.

В связи с этим значительный интерес представляют исследования структурных переходов фибрилл хроматина различных уровней и компактных структур ДНК, выяснение механизмов этих переходов, изучение воздействий, способных вызывать такого рода пе-

реходы. В ходе таких исследований могут бить сформулированы общие принципы формирования компактных структур ДНК, которые могут реализовываться в различных ситуациях in vivo.

Пели и задачи исследования. Основная цель настоящей работы состояла в изучении структурного разнообразия фибрилл хроматина в составе интерфазных ядер, исследовании организации структур различных уровней при активации транскрипции и установлении на модели взаимодействия пептидов с ДНК общих закономерностей процессов компактизации-декомпактизации ДНК в составе хроматина и других компактных структур.

В ходе выполнения работы были сформулированы следующие основные задачи:

1) изучить структуру фибрилл неактивного хроматина различных уровней организации и исследовать структурные переходы хроматина, вшванные действием различных агентов;

2) исследовать структуру фибрилл хроматина в составе транскрипционных комплексов рибосомных и нерибосоыных генов и охарактеризовать структурные изменения хроматина при активации транскрипции.

3) изучить взаимодействие с ДНК синтетических пептидов, способных образовывать jj-структуру в растворе, исследовать образовывающиеся при этом компактные структуры ДНК и выяснить способы укладки нитей ДНК в их составе;

4) на основе данных, полученных в этой модельной системе, сформулировать общие принципы компактизации ДНК, которые могут реализовываться в системах 1п vivo.

Научная новизна и практическая ценность работы. Исследованы структурные перехода фибрилл хроматина под действием различных агентов. Впервые показана роль бивалентных катионов, гистона HI в стабилизации нуклеосомных и наднуклеосомных фибрилл хроматина.

Проведены исследования изменений структуры фибрилл хроматина при активации транскрипции рибосомных и нерибосомных генов. Прослежена динамика структурных перестроек хроматина, связанных с изменениями степени активности транскрипции ДНК макронуклеуса инфузории В. truncate!1а. Выявлены субъединицч интерфазного неактивного хроматина, установлена их петельная организация. Описаны новые типы транскрипционных комплексов, встречающиеся в активном макронуклеусе, изучена их организация.

Проведены подробные исследования организации комплексов ДНК с синтетическими олитопептидами, способными образовывать

^ -структуру в растворе. Показано, что эти олигопептиды являются новым классом компактизующих ДНК агентов. Открыты новые компактные структуры кольцевой и линейной ДНК (тройные кольца, улиткообразные компактные структуры), исследована организация ДНК в составе этих структур. Сделаны обобщения о возможных принципах укладки ДНК в системах 1п vivo. Эти исследования является новым направлением в изучении процессов компактизации ДНК

Для исследований структурных переходов хроматина под действием различных агентов и комплексов ДНК с гистонами разработаны электронно-микроскопические методические подходы, опирающиеся на метод безбелковой пленки. Эти методы открывают новьв возможности для исследований компактизации ДНК in vitro.

Результаты работы проливают свет на проблему процессов к.омпак.ткзацки-декотак.тизации ДНК в составе хроматина и модельных системах In vitro и имеют не только важное теоретическое значение, но и практическое приложение. Работа служит основной для нового перспективного направления исследований физико-химических механизмов, ответственных за специфическое взаимодействие регуляторных белков с ДНК

На основании разработанных в диссертации положений могут быть предложены подходы к практическим работам по доставке генетического материала в клетки. Направленное формирование тех или иных структур ДНК при взаимодействии с различными агентами может служить основой для повышения эффективности имеющихся методов трансфекции и трансформации клеток, использующихся в генной инженерии. Данные и теоретические положения работы используются при научных исследованиях в ряде НИИ АН и АМН СССР.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы бьши доложены и обсуждены на X и II Всесоюзных конференциях по электронной микроскопии (Ташкент, 1976, 1979), Всесоюзном симпозиуме по методам подготовки сложных объектов и анализу электронномикроскопических изображений (Петрозаводск, 1976), 6-ом Всесоюзном симпозиуме по структуре и функции клеточного ядра (Алма-Ата, 1977), 12-й конференции FEBS (Дрезден, 1978), II конференции по электронной микроскопии и микроанализу (Сегед, 1979), Всесоюзном симпозиуме "Макромолекулы клетки. Структуры, функции, взаимодействия"(Москва, 1979), II Советско-итальянском симпозиуме "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Пущино, 1980), VII Всесоюзном симпозиуме по структуре и

функции клеточного ядра (Харьков, 1981), Симпозиуме по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов (Таллин, 1981), 4-ом Двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома" (Ереван, 1981), Третьем съезде Всесоюзного общества протозоологов (Вильнюс, 1982), 8-ом Европейском конгрессе по электронной микроскопии (Будапешт, 1984), 8-ом Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Пущино, 1984), 8-ом объединенном симпозиуме Биохимических обществ СССР-ГДР (Рига, 1985), II Международном Съезде.по электронной микроскопии (Киото, 1986), 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), 19-й конференции FEBS (Рим, 1989).

Объем работы. Диссертация представляется в форма научного доклада по 48 публикациям (26 статей, 20 тезисов докладов на научных конференциях, 2 авторских свидетельства). Общий объем материалов составляет 417 страниц машинописного текста, 158 рисунков и микрофотографий. В списках цитированной литературы насчитывается 452 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объекты исследований

(1) Исследования организации неактивного хроматина проводили на ядрах и выделенном хроматине из тимуса теленка.

(2) Изменения структуры хроматина при активации транскрипции рибосомных генов изучали на материале из ядер ооцитов вьюна Mlsgurnus fossHis L. .

(3) Для изучения изменений структуры хроматина при активации транскрипции использовали хроматин из иакронуклеуса инфузории Bursarla truncate!1 а.

(4) Для исследований закономерностей компактизации ДНК использовали комплексы ДНК различной топологии с синтетическими пептидами и гистонами.

Препараты ДНК. Для приготовления комплексов с пептидами использовали: (I) Кольцевую суперскрученную ДНК плазмиды рВR 322, (2) Кольцевую релаксированную ДОС плазмиды pBR 322, (3) ДНК pBR 322, линеаризованную рестриктазой Pst I.

Препараты синтетических пептидов. Олигопептиды, использованные в данной работе, были синтезированы в лаборатории химии белкового синтеза ИМБ АН СССР. Все пептиды имели флуоресцентную метку дансил (OnS) на своем с-конце. Было изучено взаимодействие с ДНК пептидов: (I) H-Valj -(nk)j2 -OnS (трива-лин, ДГТВ); (2) H-V»1-thr^ -Va12 -<мн) -OnS (пентапептид),

(3) H-Thr-Val-Ohr-lys-Val-Gly)2 -Thr-Val^ 4nh)2 -OnS

( триде капе птид, ТДП).

Препараты гистонов. Гистокы HI, Н2а, Н2ь, использовавшиеся в данной работе, выделяли из тимуса теленка по стандартный методикам. Чистоту препаратов контролировали электрофоре-тически.

Комплексы ДНК с олигопептидами готовили прямым смешиванием еликвот воднометанольного раствора соответствующего пептида и раствора ДНК при 20°С с инкубацией, как правило, в течение 30-50 часов при 4-8°С.

Комплексы ДНК с гистонами готовили как прямым смешиванием, так и специально разработанным нами методом безбелковой пленки, наслаивая ДНК в ТЭА-НС1 буфере на гипофазу, содержащую соответствующие гистоны в концентрации 2-4 ыкг/ия.

Биохимические методы.

Хроматин получали мягким лизисом ядер, выделеннъа из тимуса теленка в присутствии О,I тМ СаС12- Ядерный осадок лизпровали 2-3 кратным переосаждением в 2 «и трис-HCl рН 8. Q Такой хроматин далее обозначается ДНПф .

Хроматин, обедненный гистоком HI. получали, из ядерного " осадка, экстрагированного 0,6 m NaCl после 2-3 кратного переосаждения в растворе 0,6 М NaCl. Такой хроматин далее обозначается ДНП_н1 .

Для анализа структуры хроматина непосредственно из лизи-рованных ядер гомогенат ядер наносили на линейный градиент сахаоозы 10-40 % и центрифугировали 90 мин при 15 ООО д. Алкк-воту каждой фракции анализировали в электронном микроскопе.

Белковый состав хроматина анализировали диск электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Физико-химические исследования.

Спектральные характеристики комплексов. Спектры поглощения ДНК и пептидов снимали на спектрофотометре "Сагу II8C" (США). Спектры кругового дихроизма регистрировали на дихрографе "JoMn Yvon Hark III" (Франция). Спектры флуоресценции получали с помощью спектрофлуориметра "Aminco SP-IOOO CS" (США). Константы седиментации комплексов определяли на аналитической ультрацентрифуге "Spinco", модель Е фирмы "Beckraan" (США) при 20°С.

Связывание нетропсина и ДНК хроматина определяли количественно по изменениям спектров кругового дихроизма.

_ 8 -

Электронно-микроскопические исследования.

Препараты выделенного хроматина и комплексы пептидов с ДНК готовили прямым нанесением. Для этого каплю образца объемом 5-IO мел наносили на сеточки, покрытые соответствующими пленками-подложками, после инкубации удаляли избыток жидкости, и сетки высушивали на воздухе.

Хроматин ядер вьюна и макронуклеуса в. truncate Л а исследовали, используя метод Миллера /мп 1 er and Beatty, 1969/.

Для исследования влияния различных агентов на структуру хроматина и изучения комплексов гистонов с ДНК применяли также специально разработанный нами метод безбелковой пленки. Исследуемый материал в Трис-nci буфере рН 8,3 или ТЭА-НС1 буфере рн 8, 0 .наслаивали на гипофазу, содержащую соответствующие агенты (катионы, гистоны, антибиотики, полиамины), а затем после инкубации переносили на сеточки. Контрастирование электронно-микроскопических препаратов проводили круговым напылением пла-тино-падладиевого сплава /4:1/ под углом 6°, или препараты контрастировали окрашиванием уранил-ацетатом.

Авторадиографические исследования хроматина макронуклеуса В. tгипсаtella. проводили после инкубации инфузорий с [3Н]-уридином и приготовления препаратов ядер по методу Миллера. После напыления сеточки покрывали мелкозернистой фотоэмульсией, экспонировали в течение 4-5 месяцев, проявляли фенидоно-выы проявителем.

Препараты изучали в электронных микроскопах JEH-IOOcx и JEM-IOOB ("SeOL", Япония).

- 9 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Организация и структурные переходы фибрилл неактивного хроматина I. I. Строение фибрилл неактивного хроматина. Одним из подходов в изучении структурной организации хроматина является шок ядер путем перевода в условия низкой ионной силы с последующим анализом полученного материала. Для общей характеристики структур интерфазного хроматина такой подход в сочетании с электронной микроскопией особенно про-дотвсрен, так как при гипотоническом шоке ядер имеющиеся структуры как бы "замораживаются", и по препаратам можно судить об организации ядерного материала.

Для изучения неактивного хроматина мы исследовали препараты хромзтина, ир ¡{готовленные гипотоническим шоком ядер с последующей очисткой в сахарозном градиенте. На микрофотографиях (электронномикроскопические фотографии, относящиеся к разделам I и II экспериментальной части не приводятся из-за невозможности их четкого воспроизведения) очищенный хроматин из нижних фракций градиента представлен нитями различной толщины. Все структуры можно отнести к одному из 4-х классов: (I) нити толщиной 30-50 % представляющие, вероятно, развернутые нити ДНК, частично или полностью свободные от гистонов; (2) нити, состоящие из иуклеосом, связанных короткими спейсерныыи участками (дальше - нуклеосомные нити); (3) нити толщиной 200-300 £ и (4) нити толщиной более 300 1 и агрегаты нитей.

Изучение большого количества препаратов показало, что 200250 X фибриллы представляют собой наднуклеосомный уровень ор-

ганизации хроматине и содержат плотноупакованные нуклеосомные нити. Присутствие 30-50 X фибрилл может быть обуслйвлено разрушением структур более высоких уровней организации. г Для дальнейших исследований бьиш отработаны условия мягкого лизиса ядер, в значительной степени сохраняющие исходные структуры хроматина. (Такой хроматин далее называется ДНП0). Электрояномикроскопические исследования показали, что ДНИ является структурно гомогенным препаратом и имеет вид крупных скоплений фибрилл толщиной 200-250

Структурно-гомогенный препарат хроматина ДНПф, сохраняю^ щий наднухлеоссмную организацию, представляет собой удобную модель для исследований способности различных воздействий вызывать структурные переходы хроматина.

I. 2. Структурные переходы хроматина под действием

различных агентов. Исходя из морфологии препаратов ДНП0можно бьшо предполагать, что 200-250 К фибриллы представляет1 наднуклеосомный уро-зень организации хроматина. Дальнейшие работы были посвящены изучению структурных переходов препарата ДНП0под влиянием различных агентов.

Как рьшснилось, целый ряд воздействий вызывает структурный переход от 2130-250 X фибрилл к нуклеосомным нитям. Например, на препаратах ДНП0 после обработки 5 тМ ЭДТА, хроматин представлен, в основном, нуклеосомными нитями. Эти результаты показывают, что в поддержании наднуклеосоыной организации в условиях низкой ионной силы важную роль играют бивалентные катионы. К аналогичному переходу от наднуклессомного уровня к

нуклеосомиым нитям приводит и удаление гистона Ш. По данным электрофореза в полиакриламидном геле обработка 0,6 M NiCI приводит к удалению гистона Ш, а электронномихроскопические исследования показали, что для ДНП_щ характерна морфология нуклео-сомных нитей. ДНП-щтакже исследовали после обработки 5шН ЭДТА. После такого воздействия на препаратах выявляются, в основном, 70-100 X нити без нуклеог.омной структуры Эти результаты показывают, что гистон Ш играет важную роль для поддержания наднук-леосомных структур и участвует в стабилизации самих нуклеосом.

Описанные наблюдаемые электронномикроскопически структурные перехода мы пытались проследить по изменениям спектров кругового дихроизма (КД) хроматина. Сопоставление спектров КД исходного ДНПд, ДНП0 в присутствии ЭДТА и ДНП-hi дало возможность сделать выводы, что при структурном переходе имеют место изменения хонформации ДНК. Относительно малая амплитуда этих изменений говорит о том, что они затрагивают только часть ДНК хроматина, по-видимому, ДНК спейсерных участков, а ДНК нуклеосомных кор-частиц сохраняет свою конформацию. В дальнейших исследованиях, проведенных методом безбелковой пленки с нанесением ДНЛ в присутствии ЭДТА на поверхность гипофазы, содержащей различные концентрации бивалентных катионов, была продемонстрирована

о

частичная обратимость перехода от 200- 250 А фибрилл к нуклео-сомным нитям.

Были та;сже исследованы изменения структуры ДНП0 при добавлении связывающегося с ДНК антибиотика нетропсина.

Электронномикроскопическиэ исследования показали, что связывание нетропсина в низких концентрациях С, 005 < г < 0, 05

(г - обозначено количество молекул нетропсина на фосфат ДНК) вызывает переход от 200-250 £ фибрилл к нуклеосомным нитям. При более высоких концентрациях нетропсина ( г > О, I ) имеет место разрушение иуклеосомной структуры хроматина и на препаратах появляются 70-100 1 "гладкие" фибриллы. Были также проведены исследования изменений спектров КД и белкового состава хроматина при связывании нетропсина. Совокупность полученных данных позволила сделать вывод о том, что наблюдаемые структурные переходы связаны с влиянием связывающихся по налов бороздке ДНК молекул антибиотика на взаимодействие с ДНК гистона Н1 и негистоновых белков, ответственных за поддержание наднук-леосомной структуры.

Было также показано, что нуклеосомы могут бить разрушены и в ходе выделения хроматина, если при этом применяются жесткие механические воздействия, такие как гомогенизация или даже длительное перемешивание на магнитной мешалке. При этом исходный препарат становится очень гетерогенным, а после обработки ЭДГА основная часть хроматина представлена ненуклеосомны-ми 70-100 £ фибриллами.

В целом, полученные данные позволили охарактеризовать возможные структурные переходы неактивного интерфазного хроматина. На рис. I в схематическом виде показаны исследованные структурные переходы. Приведенные результаты о взаимных переходах фибрилл хроматина различных уровней организации хорошо согласуются с полученными паралельно данными о переходах нитей хроматина, наблюдаемых при изменениях конной силы растворов (тьоя» е1 «Ь, 1979).

- 13 -

Б нашем случае, в условиях низкой ионной силы, переходе имеюгг место за счет связывания или добавления бивалентных катионов. Общие выводы, касашиеся структуры хроматина, роли

"мягкое" выделение

200-250 1Г

фибриллы

здта

кунлеосон ние лит

Суспензия ядер

иеханичесние вогдейстшл

т: -

гетерогенный хроиетин!"

0,6 И )/й&

Рис. I. Структурные перехода фибрилл хроматина.

гистона И и ионного окружения ДНК в стабилизации наднуклео-сомных и нуклеосомных фибрилл, возможных переходах от нуклео-сомных фибрилл к "гладким нитям", были подтверждены как в цитированной так и в ряде других работ. Подобные переходы могут иметь место и при процессах функционирования генетического нате риала, например, при активации транскрипции, когда отдельные участки генома должны приникать развернутую конформацип

- 14 -

2. ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ ХРОМАТИНА ПРИ АКТИВАПИИ ТРАНСКРИПЦИИ

В наших исследованиях изменений хроматина, связанных с активацией транскрипции, использовались три модели. Это - ооциты вьюна и домашней курицы, на которых изучалась организация хроматина активно транскрибируемых рибосомных и нерибосомных генов, 6 такге инфузория Виг$аг1а 1гипса1еПа, на которой исследозали изменения общей организации хроматина активации процессов транскрипции.

2.1. Изменения организации хроматина при активной транскрипции рибосомных и нерибосомных генов.

Одной из наиболее полно охарактеризованных групп генов являются рибосомные гены, кодирующие пре-рРШС Они имеются в ядрах в большом количестве копий, локализованы в ядрышках и имеют хорошо идентифицируемую организации Мы подробно исследовали морфологию транскрипционных комплексов рибосомных генов ооцитов вьюна на разных стадиях вителлогенеза. На хорошо диспергированных ядрах удается наблюдать расправленные фибриллы хроматина, которые можно проследить на значительном расстоянии. При активной транскрипции на таких фибриллах часто встречаются характерные по морфологии транскрипционные комплексы рибосомных генов. На рис. 2 представлено схематическое изображение отдельного транскрипционного комплекса (ТК) рибосомного гепа, имеющего типичную морфологию.

Для определения места начала транскрипции бьиш построены зависимости длины боковых РНП-фибрклл от размера транскрибируемого участка ДНК Представленный на рис. 2 ТК имеет харак-

' лГ - 15 -

терную организацию. Осевая фибрилла, в нетранскрибируыдихся участка^'имеет нуклёосомну® организации с равномерным располо- -жением нуклеосоы. В транскрибируемом участке на осевой фибрилле располагаются РНК- полимеразы, из-за плотного расположения полн-мераз обычно не-удается проследить осевую фибриллу в транскрибируемой части гена. Однако, встречаются гены, содержащие сво-.бодныё от РНК-полимераз участки, и тленно такой ген представлен на рис. 2 . В этих случаях хорошо видно, что осевая фибрилла

Рис. 2. Схематическое изображение транскрипционного комплекса рибосбмного гена и зависимость длины РНП-фибрилл от размера прочитанного участка ДНК (место начала транскрипции указано стрелкой, постт.ранскрипщ!онный отрезок обозначен « "> ).

Сопоставление результатов измерений на электрокнсникрос-копических фотографиях длины транскрибируемой части большого

числа генов с данными о размерах пре-рРНК в транскрибируемом . участке показало, что степень компактизации транскрибируемого участка гена составляет I-I, 2 раза, что соответствует практически развернутому состоянию ДНК Таким образом, полученные результаты говорят о том, что при активной транскрипции рибо--сомных генов ^меет место потеря нуклеосомной структуры осевой фибриллы и почти полное разворачивание ДНК. Иногда на препаратах встречаются гены, в которых процесс транскрипции только начался, и полимеразы имеются только недалеко от точки начала транскрипции. Однако, практически весь ген имеет ненуклеосом-ную структуру. Анализ таких генов, а также наличие у многих транскрибируемых участков посттранскрипционного развернутого участка осевой фибриллы показывает, что при транскрипции ри-босомных генов вьша происходит разворачивание всего транскрибируемого участка, причем это изменение структуры происходит или до начала транскрипции или при посадке первых молекул РНК-полимерзз.

Наличие аналогичной стадии разворачивания транскрибируемого участка было продемонстрировано у эмбрионов Oncopeltuj fiiclitu» /Го«, 1978/.

Изучение' транскрипции нерибосомных генов затруднено теи, что обычно число активных нерибосомных генов в клетке весьма невелико, а активность их транскрипции незначительна. В. сачес тве модели с активной транскрипцией нерибосомных генов ыы выS рали превителогенные и в#телогенные ооциты домашней курицы.

На приготоЕленных методом Миллера препаратах активно транскрибируемые нерибосомнш гены петель хромосом типа "лай-

повых щеток" имеют характерный вид "елочек". Негативный хроматин или спейсерные участки, отделяющие активно транскрибируемые гены имеют нуклеосомное строение. Часто удавалось наблюдать нити хроматина значительной длины, на которых тандемно располагались транскрипционно активные гены, различающиеся как по направлению так и по интенсивности транскрипции. Количественные оценки распределения РНК-полимераз и нуклеосом в транскрипционных единицах с разным уровнем активности транскрипции показали, что осевые фибриллы ТК с высоким уровнем транскрипции имеют практически развернутую организацию. По-видимому, можно говорить о корреляции между степенью интенсивности транскрипции нерибосомных генов и уровнем декомпактиза-ции за счет развертывания нуклеосом осевых фибрилл транскрибируемого участка.

Эти результаты хорошо согласуются с многочисленными биохимическими исследованиями, свидетельствующими об изменениях нуклеосомной структуры хроматина при активации транскрипции.

Отсутствие нуклеосом может быть одним из способов структурной регуляции активности транскрипции, так как такие изменения организации хроматиновой фибриллы характерны именно для участков с очень интенсивной транскрипцией как рибосомных так и нерибосомных генов.

2.2. Структурные изменения хроматина макронуклеуса (Ма) инфузории ВигзаНа 1гипса1е11а в процессе роста И дшфференцировки.

Крупная пресноводная-инфузория ви^аНа 1гигса1е11а является удобным объектом для электронномикроскопических иссле-

.^Цатина. -йэ• одииоино* вд$у&орив легко выгуляется кн-

:>-Ыа)., содержащее

^с^^б'.^^р^вэ для врвдэтйДОшя электрогаю-микроскопи-ческого\прева5>атвг Звкт ойреэом,.'можно яол**ить -" представление о оостоянкй хрбиатина ядра отдельной особи, а отбирая инфузорий, находящихся на разумных стадиях процессов.дйффарвкои-ровки после делания, можно йзучатьсостояиия, характерна упвдеся различными уровнями активации хроматина.

Сдруктэтжая организация хроматина На р разные сроки после деления. /•■

Проведенные исследования показали, что в период от 0,5 до 1,5 часа после деления, т. е. во время интенсивного роста и диффэренцировки клеток инфузорий, основная часть хроматина 1!а находятся в декомпактизованкомеостсянии кишетвид рыхлых скоплений переплетающихся нитей хроматина, от которых отходят боковые РШЪ-фибриллы. Осевые фибриллы транскрипционных комплексов ("ПО югут располагаться как индивидуально, так и в виде пучк^ состошах ю шраллельно кдушаде ннтей. На этих «а пре-.паратах встречается также скоплгкдявктквного деко«па»тчзован-ного хроматина, отличающиеся по органуации от описанных выв».

Б таких скоплениях удается яа&шцдать структуры, в которых от осевой-интн хроматина-осходит больше число бокевых фибрилл, расположенных бдазко.-друг к другу, причем такие- структуры присутствует в большем чиол® копий. Наличиеновосинтезированной , РНК в составе боковых фибрилл таких необычных структур бмяо подтверждено методом алактронноыикроскопнческой авторадиографгт. Вероятно,, подобные.структуры представляют собой транскрищдюнныэ к-' • ,'

единицы повторявшихся нерибосомных генов. Так как описываемые ТК имэют весьма необычную морфологию, в дальнейшем мы будем называть их необычными транскрипционными комплексами (НТК). Схематические изображения транскрипционных комплексов хроматина Ма в. иипсагеПа различных типов приведены на Рис. 3.

а б а

Рис. 3. Схематическое изображение транскрипционных комплексов нерибосомных генов (а, б) и транскрипционных комплексов необычной морфологии (в) макронукявуса В. иипсагеПа.

Кроме описанных структур на тех же препаратах присутствует- некоторое количество хроматина, организованного в плотные глыбки размером 120-180 нм. На радиоавтографах над хрома-

тиновыми глыбками зерна серебра отсутствуют, что свидетельствует о неактивном состоянии хроматина в этих структурах.

В разные сроки после деления инфузорий соотношение количеств декомпактизованного и компактного неактивного хроматина существенно различается. Через 0,5-1,5 час. после деления доля хроматина Ма, организованного в хроматиновые глыбки, невелика, и основная часть хроматина имеет вид скоплений декомпактизованного хроматина, в которые активно включается (?Н]-уридин. Через 2-3 часа после деления наблюдается тенденция к увеличению доли компактного хроматина, организованного в глыбки. В Ма бурсарий, закончивших рост и дифферекцировку (более 3 часов после деления) основная часть материала имеет морфологию связанных между собой плотных хроматиновых глыбок размером 120-180 ни.

Таким образок по мере завершения процессов роста и диф-ференцировки клеток количество декомпактизованного транскрип-ционно-активного хроматина уменьшается, а количество неактивного хроматина, организованного в глыбки, постепенно увеличивается.

Важным представляется тот факт, что в Ма бурсарии очень часто декомпактизованный транскрипционно-актнвный хроматин связан или соседствует с имеющим компактную структуру неак-. тивныы хроматином. Это может свидетельствовать о высокой избирательности активации тех или иных генов (или блоков генов), которые могут находиться в непосредственной близости от транскрипционно-кеактивных генов, работа которых не является необходимой на данной стадии жизненного цикла организма.

Организация транскрипционных комплексов нерибосомных генов макронуклеуса В._1_гипг<1еЛа.

Строение ТК нерибосомных генов Ма в. 1гипс»1еП» по общей организации не отличается от строения ТК нерибосомных генов других эукариот. Своеобразие транскрипции нерибосомных генов Ма бурсарии состоит в том, что часто встречаются несколько параллельных осевых фибрилл, на которых белковые РНП-фибриллы располагаются сходным образок. По-видимому, такая организация объясняется политенныы строением некоторых участков Ма.

Наблхдаемые на препаратах НТК также относятся к нерибо-сомныы генам (рис. 3 в). Они характеризуются очень высокой плотностью боковых РНП-фибрилл, однако градиент длин РНП-фибрилл не * прослеживается. Как правило, к НТК подходит несколько фибрилл хроматина. Иногда удается видеть, что транскрипция идет на нескольких параллельно расположенных осевых фибриллах, причем эти фибриллы лишены нуклеосомной структуры. Повидимому, близкое расположение транскрибируемых участков нескольких осевых фибрилл приводит к наложению боковых РНП-фибрилл, что и обусловливает необычную морфологию описываемых ТК.

Активная транскрипция некоторых генов, присутствующих в геноме в. ггипсагеП* во многих копиях, по-видимому, необходима для быстрой смены определенных стадий клеточного цикла такого крупного одноклеточного организма, каким является инфузория В. 1гипса1е11«.

-22-

Структурная организация неактивного хроматина

макронуклеуса в. truncate!V».

Неактивный хроматин Ma в. truncate!1а организован в крупные электронно-плотные хроматиновые структуры - глыбки, игэпцие размеры 12Г-180 км. Воздействуя на выделенные из зрелых инфузорий Ma in vitro и изучая возникающие при этом структуры, ложно исследовать организацию этих субъединиц хроматина. Исходя из имещихся данных о влиянии различных факторов на хроматин, в качестве декомпактизирующего воздействия мы использовали инкубацию в растворах с низкой ионной силой.

В препаратах хроматина Ма, инкубированного в О, I мМ бо-ратном буфере в течение 3-5. мин, хроматиновые глыбки обычно расположены близко друг к другу (рис. 4а). Через 10-30 мин. инкубации становится видно, что хроматиновые глыбки связаны друг с другом фибриллами хроматина, и вокруг глыбок появляются короткие радиальные фибриллы гранулярного строения, причем некоторые из них имеют форму петель (рис. 4 6).

ш

а ' б б &1ЛЛ г Рис. 4. Декомпактязашя хрома- \ типовых глыбок в растворе с низко!! ионной силой.

Пос ла инкубации Ма в О, I мМ боратном буфере в течение 1-2 часов вокруг хроматиневых глыбок появляется "ореол" из радиаль-

ных петель фибрилл хроматина, длина которых варьирует от 0,5 до I мкм. Более продолжительная инкубация (5 часов) приводит к значительному увеличению длины петель, достигающей 5-10 микрон (рис. 4 в, г). После инкубации 12-15 часов хроматиновые глыбки исчезают, и наблюдаются длинные фибриллы хроматина нухлеосомно-го строения (рис. 4 д). Последовательность структурных изменений дает возможность сделать заключение о петельной укладке фибрилл хроматина в составе глыбок.

Разворачивание глыбок с образованием петель может иметь и функциональное значение для регуляции транскрипционной активности ядер (Тихоненко и др., 1983). Выявленная дискретная организация хроматина Ма инфузорий, по-видимому, принципиально не отличается от организации хроматина высших эукариот в виде хромомеров в составе хромосом и отражает общий припцип дискретности в структурной организации эукариотической хромосомы. Можно предположить, что существует определенное структурно-функциональное соответствие между хроматиновыми глыбками бурса-рии и хромомерами в хромосомах высших эукариот. По данным ряда авторов хромомеры имеют вид телец с радиально отходящими фибриллами хроматина (Зацепина и др., 1983). Такие структуры по морфологии сходны с декоыпактиэованными глыбками хроматина Ма.

Полученные данные позволяют сделать заключение о важном биологическом значении дискретной петельной пространственной организации хроматина, которая может обеспечивать возможность избирательной компактизации-декомпактизации отдельных участков генома при функционировании ядра.

- 24 -

3. ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПАКТИЗАПИИ ДНК В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ IN VITRO.

Изучение структурных переходов хроматина позволяет охарактеризовать различные типы структур, а также воздействия, вызывающие переходы от одних структур к другим. Однако эти процессы, очевидно, чрезвычайно трудны для исследований из-за очень сложной организации нуоеопротеидных комплексов.

Одним из подходов, позволяющих выявить и исследовать те или иные закономерности формирования компактных структур генетического материала tr vivo, является изучение компактизации ДКК в модельных системах, т. е. в присутствии агентов, имитирующих окружение ДНК в живых системах.

Тем не менее традиционные модельные системы с компакти-зацией ДНК в присутствии гистона И, полиаминов, спиртов и других агентов имеют ограниченную ценность в связи с существенной структурной гетерогенностью получаемых компактных частиц, мэжмолекулярным характером взаимодействия.

В предложенной нами новой модельной системе взаимодействия ДНК с синтетическими олигопептидами, способными образовывать f-структуру в растворе (далее ^-олигопептиды), как показали наши исследования, удается наблюдать формирование целого спектра различных упорядоченных компактных структур как внутримолекулярного, так и межмолекулярного характера.

3.1. Компактизация линейной ДНК при взаимодействии с синтетическими олигопептидами.

Для понимания происходящих при взаимодействии с ^-олигопептидами изменений организации ДНК важное значение имеют on-

тические исследования, позволяющие судить о характере связывания пептидов с ДНК, а также физико-химические характеристики комплексов.

Связывание с ДНК олигопептидов изучаемого ряда (тривалин, пентапептид, тридекапептид) сопровождается концентрационно зависимыми изменениями в спектрах поглощения, флуоресценции и кругового дихроизма. Изменения в спектрах КД, в частности, говорят о том, что при связывании с ДНК олигопептиды переходят в упорядоченную конформацию антипараллельного £-слоя (Гурсккй и др., 1983).

При связывании пептидов, меченных дянсилом.с ДНК происходит сдвиг максимума интенсивности флуоресценции в коротковолновую область,и увеличение квантового выхода флуоресценции более чем на порядок величины.

Рост интенсивности флуоресценции набладается в довольно узком диапазоне концентраций пептидов, а при уменьшении концентрации ДНК возрастание интенсивности начинается при значительно более низких концентрациях пептидов. Характер концентрационных зависимостей говорит о кооперативном связывании пептидов на ДНК.

Анализ совокупности данных оптических исследований приводит к предположнию, что £ -олигопептиды могут ассоциировать между собой, будучи локализованными на удаленных сегментах ДНК, что должно приводить к компактизации ДНК.

Подробная информация о компактизации линейной ДНК при взаимодействии с -олигопептидами была получена при исследовании морфологии комплексов при повышающихся концентрациях пептидов.

- 26 -

Электронномикроскопические фотографии исходного препарата линейной ДНК и комплексов ДНК с тридекапелтидом при различных концентрациях пептида представлены на рис. 5. На рис. 5а представлена микрофотография исходного препарата ДНК, приготовленного по методу Кляйншмидта. При концентрации пептида около 10 М, ДНК на препаратах представлена вытянутыми фибриллами некомпактизованной ДНК (рис. 56). При повышении концентрации пептида основную долю материала на препаратах составляют фибриллы расправленной ДНК, имеющие сильно извитую структуру (рис. 5в).

При концентрации пептида 5 х 10 М на препаратах преобладают палочкообразные структуры (рис. 5 г). При более высоких концентрациях пептида на препаратах преобладают палочкообразные структуры, по форме напоминающие запятые (рис. 5д). При концентрации пептида около 5 х Ю^М практически весь материал представлен плотными глобулами (рис. 5е).

Изучение морфологии компактных структур комплексов, конт-растированных водным уранилацетатом, при большом увеличении был сделан вывод о том, что палочкообразные структуры сворачиваются в глобулы, сохраняя в составе глобул свою структурную организацию. По длине теней глобул на препарате, контрастиро-ванном напылением металла с одного направления, были вычислены высоты наблвдаеных частиц. Оказалось, что большинство глобул имеют дискообразную форму. Таким образом, глобулы представляют собой плотно спирально свернутые палочкообразные компактные структурой по своей форме и организации напоминают улиток.

Рис. 5. Компактизация тимусной ДНК при взаимодействии с трн-

декапептидоы. (а)-препарат исходной ДНК, приготовленный по методу

Кляйншмидта; (б-е) - ДНК в присутствии пептида в концент* -циях -? -г

от 10 М до 5 х 10 М. Контрастирование круговым напылениви иеталла. Вычисленные значения объемов улиткообразных структур для

комплексов с ТЩ1, приготовленных с использованием ДНК стандартной длины, после сопоставления с литературными данными о плотности упаковки ДНК в кристаллах и в компактных структурах других типов позволили строго доказать, что в составе глобулярных компактных частиц содержится одна молекула ДНК. Эти данные показывают, что компактизация линейной ДНК при взаимодействии с тридекапептидом носит внутримолекулярный характер.

Сходным образом происходит процесс компактизации линейной ДНК при взаимодействии с пентапептидом и тривалином. На рис. 6 представлена схема событий компактизации линейной ДНК при взаимодействии с & -олигопептидзми.

3. 2. Компактизация кольцевой ДНК при взаимодействии с тривалином.

Идентификацию хода отдельных сегментов ДНК в составе компактных структур целесообразно проводить с использованием кольцевых молекул, так как в этом случае их форма накладывает определенные топологические ограничения на молекулу в целом. С другой стороны, исследования компактизации кольцевой ДНК представляют самостоятельный интерес, так как отдельные петли.

Рис. 6. Схема внутримолекулярной компактизации линейной ДНК при взаимодействии с тридекапептидом. Штрихи обозначают связанные с ДНК молекулы олигопептидов. Двойные штрихи-контакты нитей ДНК бок о бок.

в которые организован геном эукариот, топологически эквивалентны замкнутым кольцам.

При изучении компактизации кольцевой суперскрученной ДНК плазмиды р8(? 322 при взаимодействии с тривалином удалось однозначно интерпретировать укладку нити ДНК в составе компактных кольцевых структур, которые мы назвали "тройными кольцами".

-е л

При низкой концентрации тривалина в растворе ( *-10 М) ДНК на препаратах (рис. 7 б) имеет вид практически расправленных кольцевых молекул. Можно заметить, что многие молекулы ДНК содержат участки, где два соседних сегмента ДНК сближены и образуют структуру, напоминающую шпильку (указаны стрелками на рис.7 б). При повышении концентрации пептида шпильки имеют тенденцию к удлинению (рис. 7в). В дальнейшем такие шпильки ассоциируют с одним из сегментов ДНК, отходящих от их основания, образуя на молекуле тройной участок. Микрофотография таких "переходных" структур, представлена на рис. 7 г.

При дальнейшем повышении концентрации пептида (~10 Ю» длина тройного участка увеличивается за счет расправленной части молекулы вплоть до того момента, когда петли на концах тройного участка встречаются, завершая формирование тройного кольца.

Выводы об организации ДНК в составе тройных колец подтверждаются результатами измерений коэффициента компактизации ДНК в составе тройных колец, который составляет 3,6*0, 3.

Рис. 7. Комплексы кольцевой суперскрученной ДНК с триваликом С б -ж) и исходный препарат ДНК, приготовленный по методу Кляйн-ншмидта (а). На рис. 7 в-е приведены схематические интерпретации хода нити ДНК в составе компактных фибрилл.

Pucu 8. Схема, форгя- , •р05Ш1ШЯ. тройного- кольца. Штрдасолье* таоорагэшш как на ряс. 6.

То, что коэффициент кокпактизации йревызает 3,0 отрагает паревитость. нитей дуплексной ДНК в составе тройного сегиэнта. Этим га объясняется периодическая субструктура компактных фибрилл ясно различимая на многих микрофотографиях. На рис. 8 предетавлака схема форкяровакня тройного кольца.

Так как кольцевш шлекулы исгут находиться в двух топологических состояниях - суперскрученном и релаксироващЬн, представляло интерес исследование коклэктиззодп кольцевой ра-лаксированной ДНК & тех ез условиях.

Как выяснилось, в этом случае рэолкэуэтся йргощкпиально иная послзяо&атвдыюсть событий ко&ахтизащга, которая качд-цается с возникновения на колвкудэ ШК кзбольетго участга, завитого р кольцо (рис. 9 б, в). При повысится Korawirrpaica пгптада это "капаольцо" сдусит как бы катуской для остальной чзстн тале к улы и.для других вэлзкул ДНК, что приводит к форцяроваяга тороидальных частиц,в состав® которых ДНК улогена бухтообразко.

Выделение объаизв частиц позволила заключить, что большинство тороидальных компактных частиц содврпгг 50-150 иолекул ДНК, т. е. коыпакткзацкя в данной случае носит кзхмэлэкудяркыЗ характер.

Рис. 9- а -' исходный препарат кольцевой релаксированной ДНК. нанесенный методом Кляйншмидта; б-г - компактизация при взаимодействии с тривалином с образованием тороидов.

3. 3. Общие принципы организации компактных структур ДНК в комплексе с исследованными пептидами.

Анализ всего спектра исследованных структур показывает, что ключевым моментом для процесса компактизации является начальная стадия формирования компактной структуры. Особенно четко это показывают результаты изучения компактизации супер-скрученной и релаксированной кольцевых ДНК при взаимодействии с тривалином.

В случае взаимодействия ДГТВ с кольцевой суперскрученной ДНК на стадии инициации компактизации образуется шпилька из двух сегментов ДНК (рис. 7 6, в), а.затем тройной участок

(рис. ? г, д). Эти структуры не ииест тенденции к ассоциации с другими молекулами ДНК, и дальнейшее формирование компактной частицы - тройного кольца - происходит с вовлечение« в коыпакт-нш структуры неконденсированных сегментов той гз самой иэлеку-лы ДНК (схе!3 на рис. 8).

На начальном этапе коипактизации кольцевой релаксировян-ной ДНК фориирупцаясл кошактнзя структура (первичное кольцо или иинитороид, рис. 9) ассоциирует как с фрагдантаки той га цолекулы ДНК,, так и с другими иолекулами ДНК, что приводит к квизолекулярной коишктизации.

Формирование упорядоченных структур, в которых потенциальный возшзности взаимодействия колекул пептида и ДНК почти полностью исчерпаны, характерно и для линейной ДНК, что приводит и в этом случае к внутримолекулярной костакткэацик.

К возникновению таких упорядоченных структур гагат приводить ассоциация ¡ззлекул пептида, сорбированных на ДНК. В пользу такого предполосения говорят дзнкыэ о саьюассощшции пэлекул лито пептидов.

Саиэассоциация пептидов, зарегистрированная ранее с попзсьп физкко-хи1Л1ческ1гх га то до а, проявляется'® образовании упорядоченных агрегатов, процесс форхыровзния которых был кзучэи с попзиью электронной гг'-кроскошш.

При низких концентрациях пептида образуется нити толезшой 20-40 X. При более вьсоких концентрациях эти нити ассоциирует, формируя более кругаоа стергшеобразньэ ассоциата Еероятно, что в сорбированном на ДНК состеяшш «эяэкулы пептида, хак я з отсутствие ДНК, иизет тенденцию к ассоциации, благодаря чему 01Ш

- 34 - ^,

стимулируют латеральные контакты отдельных сегментов. ДНК и формируют гидрофобную серцевину компактных фибрилл. л .

Исходя из этого предположения, учитывая гидрофобную природу пептидов, и на основе ряда электронномикроскопических данных можно сделать ьывод о наличии а палочкообразных сегментах и фибриллах тройных колец гидрофобной пептидной сердцевины, * вокруг которой располагается ДНК. На рис. 10 представлены схемы укладки ДНК в улиткообразных компактных *1йстиц и молекул пептида в составе этих структур.

а. ход нити дуплексной ДНК Компактная фибрилла изображена аналогичной по структуре фибриллам тройных колец.

б. кружками показаны молекулЬг пептида. На врезке иллюстрировано формирование пептидной "сердцевины" компактной структура

Рис. 1(1 Схемы укладки ДНК в составе улиткообразных компактных частиц линейной ДНК в комплексе с ^ -олигопептидэки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные о структурных переходах хроматина под действием различных агентов и при активации процессов транскрипции характеризуют фибриллы хроматина как чрезвычайно динамичные структурные образования. Зарегистрированные переходы от наднуклеосомных фибрилл к нуклеосомныы нитям и к гладким нитям имитируют декомпактизацию крупных субструктур хроматина и разворачивание нуклеосом в активно-транскрибируемых рибо-сомных и нерибосомных генах.

Структурные переходы, выявляемые при исследованиях ядерного материала, характеризуются высокой степенью избирательности. Транскрибируемые участки определенной длины, не содержащие нуклеосом, располагаются на осевой фибрилле в окружении имеющих нуклеосомную организацию спейсерных участков. Активно транскрибируемый, декокпактизованный хроматин В. 1гипс»ге11а находится в непосредственной близости или связан с неактивным компактизованным хроматином. Отдельные петли хроиосои типа "ламповых щеток" ооцитов курицы характеризуются различной интенсивностью транскрипции и также соседствуют с неактивны« хроматином.

Очевидно, чтобы обеспечить такого типа переходы, их избирательность и обратимость, необхо1имы разнообразные механизмы компактизрции и тилы укладок материала.

Одним из типов организации, обеспечивающих избирательность компактизации, является петельная укладка фибрилл, продемонстрированная для хроматиновых глыбок в. иипсагеПа и

характерная для хромосомоы других эукариот. Б этом случае петли могут компактизоваться независима друг от друга. Ком-пактизация кольцевой суперскрученной ДНК при взаимодействии с тривалином дает новый вариант укладки нитей в составе петель, который может реализоваться для целых петель или отдельных участков. Такая укладка не имеет топологичэских ограничений так как структура типа тройного кольца может возникать и на петле ДНК (рис. II).

Важный свойством такого типа кзмпактизации является способность к сохранению внутримолекулярьости процесса для располагающихся в непосредственной близости петель. Это свойство было продемонстрировано при изучении ксмпактизации кинетопласт-ной ДНК при взаимодействии с тривалином. В этом случае была показана полная независимость конденсации отдельных катенировенных ииниколец в комплексе кинетопластной ДНК.

Избирательность процесса компактизации может быть обеспечена и за счет комбинации различных факторов, оказывающих влияние на разные компоненты нуклеопротеидных комплексов. Моделью одного из вариантов такого избирательного процесса может являться компактизация кольцевых молекул ДНК при взаимодействии с^-олитопептидами, которая обеспечивает различные результаты конденсации в зависимости от топологического сос-

Рис. II. Схема ком-

пактизации петли по

типу тройного кольца.

тояния ДНК. В клетках- могут встречаться ситуации, в которых необходимо структурно дискриминировать крупныэ фрагменты генома . В этих случаях при реализации описанного для пептидов механизма "меткой" для порций ДНК или хроматина, подлежащих неспецифической межмолекулярной конденсации мотет служить ре-лаксированное состояние, вызванное введением "ников" ядернынн нуклеазами. При этом фрагменты ДНК, сохраняйшиа суперскру-ченное состояние не будут вовлекаться в этот процесс.

Очевидно, что помимо описанных в приведенных выше примерах, и другие структуры, наблкдапциеся на промежуточных стадиях формирования компактных структур (первичныэ "шпильки", "миникольца", небольшие тройные участки, шшитороиды) шгут реализоваться в различных ситуациях 1п *)уо.

Расширение представлений о компактнаационных возможностях ДНК, механизмах формирования компактных структур и принципах их организации может служить базой для более глубокого понимания роли структурных факторов в функционировании генома.

ВЫВОДЫ

1. Разработан комплекс методик на основа метода безбелковой пленки для электронноыикроскопических исследований макромолекул и процессов формирования компактных структур ДНК и хроматина в гонких поверхностных пленках.

2. Охарактеризованы по морфологии типы фибрилл хроматина различных уровней организации. Изучены различные воздействия, способные вызывать структурные переходы хроматина. Показано,

что связывание бивалентных г.атиснов ЭДТА, удаление гистона И, добавление связывающегося с ДНК антибиотика нетропсина вшивают переход от 200-300 X фибрилл к фибриллам куклеосомного уровня. При более жестких воздействиях (высокие концентрации нетропсина, механические воздействия) имеет место дестабилизация нуклеосомной структуры и переход к "гладким" 70-80 % фибриллам хроматина.

3. Изучена морфология транскрипционных комплексов активно транскрибируемых рибосомных и нерибосомных генов. Показано, что в активных рибосомных генах вьюна спейсерные участки имеют нуклеосомное строение, в то время как в транскрибируемых участках осевая фибрилла находится в развернутом состоянии. Сделан вывод о наличии предшествуюцей транскрипции стадии разворачивания нуклеосомной структуры транскрибируемого участка.

4. Проведены исследования структурных изменений хроматина соматического ядра инфузории в. ггипсИеП», связанных с активацией транскрипции в разные сроки посла деления. Показано, что основная часть хроматина макронуклеуса в период интенсивного роста и дифференцировки находится в декомпактизованнок состоянии и характеризуется активной транскрипцией. По мере завершения роста и дифференцировки количество активного хроматина падает и повышается доля неактивного хроматина. После окончания роста и дифференцировки практически весь хроматин организован

в компактные хроматиновые глыб г. и. Путем декотлактизации в растворах с низкой ионной силы установлена петельная организация хроматиновых фибрилл в составе этих компактных структур.

5. Обнаружены и изучены необычные транскрипционные кокп-

лексы, представленные в активном хроматине макронуклеуса в большом количестве копий. Эти транскрипционные комплексы характеризуются зысокой плотностью расположения боковых РНП-фиб-рилл, активной транскрипцией с нескольких расположенных параллельно сближенных осевых фибрилл.

6. Изучено взаимодействие ряда синтетических ^ - олиго-пептидов, с ДНК различной топологии (суперскрученная, релакся-рованная кольцевая, линейная) и исследованы образующиеся при этом компактные структуры. ^ -олигопептиды охарактеризованы как новый класс компактизующих ДНК агентов.

7. Описаны и подробно исследованы компактные структуры, возникающие при взаимодействии тривалина с кольцевой суперск-рученной ДНК На основании комплексного исследования процесса кокпактизации предложена нодель организации ДНК в составе этих структур, которые были названы "тройными кольцами". Установлено, что при взаимодействии кольцевой релаксированной ДНК с тривалином образуются иежмолекулярные тороидальные частицы содержащие, как правило, 50-100 молекул ДНК На основании этих данных предложена модель компактизации кольцевых ДНК, конечный результат которой определяется топологическим состоянием ДНК

8. При изучении компактизации линейной ДНК с тризалинои, пентапептидом и тридекапептидоы описан необычных ход компактизации с формированием компактных палочкообразных структур, которые затем сворачиваются в плотные улиткообразкыэ глобулы. Проденонстрировано, что этот процесс компактизации носит внутримолекулярный характер. Предложена модель пространственной организации ДНК и молекул пептида в составе таких структур.

- 40 -

9. Исходя из данных электронно-микроскопических и физико-химических исследований установлено, что наиболее вероятным механизмом образования описанных структур ДНК является ассоциация фибрилл дуплексой ДНК бок-о-бок за счет взаимодействия между молекулами пептида, локализованными на различных сегментах ДНК На основе анализа полученной информации предложены новые модели процессов компактизации фибрилл хроматика и ДНК 1 n vivo.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Венгеров & & , Лопенко Е И., Кадыков R А. Новый метод безбелковой пленки для электронной микроскопии ДНК Доклады Академии наук СССР, 1975, т. 224, N 4, стр. 935-955.

2. Кадыков R А., Венгеров KL Ю., Попенко R И., Тихоненко А. С. Исследование структурной организации элементарной фибриллы хроматина. Доклады Академии наук СССР, 1975, т. 223, N б, стр. 1463-1464. ;

3. Венгеров JOi Ю., Попенко Е И., Кадыков R А. Структурная организация нитей хроматина толщиной 100-200 Л X Всесоюзная конференция по электронной микроскопии, Ташкент, 1976, стр.

4. Венгеров Л Ю. , Попенко R И., Кадыков R А. Новый метод без--белковой пленки для электронной микроскопии ДНК Всесоюзный симпозиум по методам подготовки сложных объектов и анализу электронномикроскопических изображений, Петрозаводск, 1976, стр. 34-35.

5. Венгеров Е Е , Попенко Е И., Кадыков Е А. Способ приготовления препаратов биологических макромолекул для электронной микроскопии. Авторское свидетельство н 5I96IG, 1976, Бил. N 24.

6. Попенко Е И., Венгеров Е Е Исследование структуры хрома-' тина при частичном удалении гистона KL vi Всесоюзный симпозиум по структуре и функции клеточного ядра, Алма-Ата, 1977, стр. 47.

7. Венгеров Е XI, Попенко Е И., Тихокенко А. С. Структурная организация нитей хроматина толщиной 100-200 L Доклады Академии наук СССР, 1977, т. 232, N 6, стр. 1442-1444.

8. Венгеров Е Е , Попенко Е И., Минченкова JL Е. Изучение злияния моно- и бивалентных катионов на структуру хроматина с помощью нового беэбелкового метода для электронной микроскопии. XI Всесоюзная конференция по электронной микроскопии, Ташкент, 1979, т. 2, стр. 42.

9. Попенко Е И., Венгеров Ю. Ю., Минченкова Л Е Влияние ионных условий на структурную организацию хроматина. Всесоюзный симпозиум "Макромолекулы клетки. Структуры, функции взаимодействия", Москва, 1979, стр. 140.

10. Попенко Е И., Венгеров Е Е , Тихоненко А. С. Струхтура транскрипционных комплексов рибосомных генов ооцитов вьюна. II Советско-Итальянский симпозиум "Макромолекулы в функционирующей клетке", Пущино, 1980, стр. 69-7CL

11. Попенко Е И., Венгеров Е Е , Тимофеева № Я , Тихоненко А. С. Визуализация транскрипции рибосомных генов вьюка.

VII Всесоюзный симпозиум по структуре и функциям клеточ-

ного ядра, Харьков, 1980, стр. 140.

12. Лзнг X. , Венгеров К). Ю., Попенко Е И., Циммер К Взаимодействие УФ-света с ДНК и хроматиноя Симпозиум по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов, Таллин, 1981, стр. 195.

13. Карпекчук К. Г.,. Ундрицов И. М., Минченкова Л. Е., Венгеров Е Ю., Мирзабёков А. Д. .Разворачивание нуклеосоы при частичной нейтрализации положительных зарядов гистонов. Симпозиум по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов, Таллин, 1981, стр. 114.

14. Попенко В. И,, Венгеров Е XI, Тихоненко А. С. Электронно-микроскопическое исследование транскрипции рибосомных генов ооцитов вьюна. Молекулярная биология, 1981, т. 15, К 2, стр. 430-438.

15. Мартынкина Л. Е., Венгеров Ю. Ю., Сергееза Г. И., Беспалова И. А., Попенко а И., Тихоненко А. С. Структурная организация хроматина макронуклеуса инфузорий. Четвертый двусторонний симпозиум СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома". Тезисы докладов и стендовых сообщений, Ереван, 1981, стр. 94-95.

16. Ундрицов И. М., Кактинис К И , Вашакидзе Р. П., Карпенчук К. Г., Венгеров Ю. Ю., Попенко Е И. Исследование комплексов гистона Щ с суперспиральной ДНК Молекулярная биология, 1982, т. 16, N 4, стр. 720-730.

17. Тихоненко А. С., Мартынкина Л Е , Венгеров & Ю., Беспалова И. А., Попекло Е И., Сергеева Г. И. Структурно-Функциональная организация хроматина интерфазного макронуклеуса

- 43 -

(Ма) Ви^аМа ггипслге!1 а. Материалы третьего съезда Всесоюзного общества протозоологов "Современные проблемы протозоологии", Вильнюс, 1982, стр. 362.

18. Венгеров Е Е , Попенко Е И. Способ приготовления комплексов ДНК с белкой для электронномикроскопического исследования. Азторское свидетельство N 946517,1982, бюл. Н 28.

19. Карпенчук К. Г., Минченкова Л К , Ундрицов И. М., Венгеров а Ю., Мирзабеков А. Д- Разворачивание коровых нуклэосом, вызванное химическим ацетилированием гистонов. Молекулярная биология, 1983, т. 17, N 4, стр. 855-867.

20. Венгеров Е Е , Сергеева Г. И., Мартынкина Л П., Беспалова II А., Попенко Е И., Рябова Р. Е , Тихонеюсо А. С. Структура интерфазного хроматина макронуклеуса инфузории Вигха-г1 а 1гипса1е11а. Молекулярная биология, 1983, т. 17,

м 6, стр. 1306-1311.

21.

Макаров В. Л , Стрельцов С. Л. , Венгеров 10.10. , Хорлии А. А. , Гурский Г. В. Пространственная структура комплекса ДНК с олигопептидом - дансилгидразидом тривалина. Молекулярная биология. 1983, т. 17, N 5, стр. 1089-1101.

22. Венгеров Е Е , Мартынкина Л П , Беспалова И. А., Сергеева Г. II, Тихоненко А. С. Структура интерфазного хроматина макронуклекса инфузории ВигзаНа 1гипса1еПа. ¡Молекулярная биология, 1984, т. 18, м I, стр. 272-276.

23. Венгеров Е Е , Макаров Е Л., Семенов Т. Е., Стрельцов С. А., Хорлин А. А., Нузе А. Л , Готтих Е П., Гурский Г. Е Компактна ация кольцевой ДНК при взаимодействии с дансилгидразидом тривалина с образованием структур нового типа -

- 44 -

тройных колец. Молекулярная биология, 1935, т. 19, N 5, стр. I223-I23CL

24. Семенов Т. Е , Венгеров И. Е , Суровая к Н., Сидорова Е К1, Стрельцов С. А., Хорлин А. А., Жузе A. JL , Готтих Б. IL , Гурский Г. R Внутримолекулярные компактные структуры линейной ДНК, формирующиеся при взаимодействии с синтетическим тридекаг.ептидом. Молекулярная биология. 1986,

т. 2Ц N 5, стр. 1422-1432.

25. Сидорова ЕЕ, Семенов T. R , Суровая А. Е , Венгеров НЮ., Стрельцов С. А., Хорлин А. А., Жузе А. Ti, Гурский Г. Е Взаимодействие синтетического пентапептида с ДНК: специфичность связывания и компактизация ДНК. Молекулярная биология, 1987, т. 21, M 6, стр. 1534-1550.

26. Венгеров Е Е , Семенов Т. Е Комплексы ДНК с синтетическими олигопептидами: модель для изучения закономерностей компактизации ДНК in vivo. .Молекулярная микробиология, вирусология, генетика. 1989, N I, стр. 3-IQ.

27. Мартынкина JL П., Новикова Е Г., Колесников А. А., Стрельцов С. А., Семенов Т. Е , Венгеров Е Е Структурная организация кинетопластной ДНК и ее компактизация в модельной системе in vitro. Молекулярная биология, 1989, т. 23, N 6, стр. 172-184.

28. Triebe! H., Reinert К.Е., Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l., Lang H. Structural changes of UV-irradl ated DNA evaluated from hydrodynamiс and electron microscopic eseasureiaents. ICuhlunborn, DDR, Abstracts of VI UV-Kol-loquiura UV-Stral en in biologie und medi zi n, 1977,1 V, p. 4-7.

29. Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l. Changes in chromatin structure Induced by EDTA treatment and partial removal of

hi stone Hi. Nucl. Acids Res., 1977, v. 4, p. 3017-3027.

30. Vengerov Yu.Yu., Lang H., Popenko V.l., Tlkhonenko A. S. Neuere Aspekte zur struktur des Chromatins. Proc. I Arbeltstagung "Biophysik der Nucleoproteldsysteme", Weimar, DDR, 1977, 3, p. 22-26.

31. Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l., Lang H., Tikhonenko A. S. Orgaqnl zati on of .nucleosomes in chromatl n. fl bres. B1ol. Zbl. 1978, V. 97, p. 29-38.

32. Lang H. , Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l., Zimmer Ch. Structural changes of chromatin induced by Interaction with Netropsln. Abstracts of I2th FEBS Meeting, Dresden DDR, 1978, VII, 2-8.

33. Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l. Protein free spreading technique for the electron microscopy of DNA and chromatin. Mlcroscoplce Acta, 1978, v. 80, p. 375-382.

34. Popenko V.l., Vengerov Yu.Yu. The effect of various conditions of chromatin isolation on the nucleosonal structure of the isolated chromatin. Holec. Biol. Rep. 1978, v. 4, N I, p. 45-5C1

35. Lang H., Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l., Zimmer Ch. Stuctural transitions of chromatin Induced by netropsin. Acta biol. med. germ. 1979, v. 38, N I, p. 33-40.

36. Popenko V.l., Vengerov Yu.Yu., Mfnchenkova L.E. Effect of mono- and bivalent cations on chromatin structure as revealed by electron microscopy. Proc. Ilth Conference

- 46 -

on Electron Microscopy and Microanalysis, Szeged, Hungary, 1979, p. 185-186.

37. Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l., Tikhonenko A. S. Electron microscopic study of loach oocytes ribosomal genes transcription. Proc. X Tagung el ektronenmi croskopi e, Leipzig, DDR, 1981, d. 115.

38. Kupri janova N.I., Popenko V.l., Vengerov Vu.Yu., Timofeeva H. Ya., Tikhonanko A. S., Skryabin K. G., Bayev A.A. Organization of loach ribosonal genes (Misgurnus fossil is L.) Mol ec. Biol. Rep. 1982, v. 8, p. 143-148.

39. Lang H., Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l., Ummer Ch. Interaction of UV-light with DNA and chromatin. Studia bio-physica, 1982, v. 87, p. 243-244.

40. Martinkina L.P., Vengerov Yu.Yu., Bespalova I.A., Tikhonenko A.S., Sergeeva G.l. "fhe structure of inactive interphase macronuclear chromatin of the clllate Bursaria truncatella. Radial loops in the structure of chromatin clumps", Eur. 0. Cell Biol. 1983, v. 30, p. 47-53.

4L Vengerov Yu.Yu., Sergeeva G.I., Martinkina L.P., Bespalova I.A., Popenko V.l., Ryabova R.V., Tikhonenko A. S. Electron microscopic and autor»diographic study of the macronuclear chromatin of Bursaria truncatella at different times after cell division. Chromosoma, 1983, v. 88, p. 328-332.

42. Vengerov Yu.Yu., Semenov T.E., Streltsov S.A., Makarov V.L., Khorlin A.A., Gursky S.V. Triple rings - a new type of compact structure of circular DNA. - Proc.

- 47 -

VIII the Eur. Cong, on Electron Microscopy, Budapest, Hungary, 1984, v. 2, p. I44I-I442.

43. Gagynskaya E.R., Tsvetkov A. G. , Vengerov Yu. Yu. , Kropo-tova E.V. Electron microscopic study of lampbrush chromosomes from avian oocytes. Proc. VHIth Eur. Cong, on Electron Microscopy, Budapest, Hungary, 1984, v. 3.

p. I885-I8S6.

44. Vengerov Yu.Yu., Semenov T. E., Streltsov S. A., Mskarov V. L., Khorlin A. A. , Gursky G. V. Torus-shaped particles formed due to 1ntermolecular condensation of circular DNA upon Interaction with synthetic tripeptide. -FEBS Lett. 180, P- 81-84, 1985.

45. Vengerov Yu.Yu., Semenov T.E., Streltsov S.A., Makarov V.L., Khorlin A. A., Gursky G. V. Triple rings - a new type of compact structure of circular DNA. - J. Hoi. Biol. 184, 1985, p. 251-255.

46. Vengerov Yu.Yu., Semenov T.E.,Zhuze A. L., Gottlkh B. P., Gursky G. V. Intramolecular condensation of linear DNA upon interaction with synthetic trldecaptlde. Proc. IXth Int. Cong, on electron Microscopy, Kyoto, Japan, 1986,

p. 24C77-2408.

47. Vengerov Yu.Yu., Semenov T. E. , Surovaja A.M., Sidorova N. Yu., Streltsov S. A., Khorlin A. A., Zhuze A. Z., Gursky G. V. Electron Microscopic and Physico-chemical Studies of ONA Complexes with Synthetic Oligopeptides: Binding Specificity and DNA Compact Structures. Journal of Bio-molecular Structure and Dynami cs, 1988, v. 6., p. 3II-33Q.

48. Novikova E.G., Martinkina L.P., Kolesnlkov A.A., Semenov

T.E., Vengerov Yu.Yu. "Structural organization of Leishmania gymnodactyll kinetoplast DNA and compactization of klnetoplast OHA networks in vitro". Abstracts of I9th FEBS meeting, Rome, Italy, 1989, p. 44.

Ü46062. flojuiHcaHO B neiaTi 19.02.90. 3aK. 535.Tnp. 100.

B H H H H « T