Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследования процессов компактизации-декомпактизации ДНК в составе хроматина и в модельных системах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследования процессов компактизации-декомпактизации ДНК в составе хроматина и в модельных системах"

Академия медицинских иаук СССР Институт питают

А

Нз правах рукописи

ВЕНГЕРОВ Юрий Юзвфович

УДК 577.213.7.03-576315.42

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ КОМПАКТИЗ АЦИИ - ДЕКОМПАКТИЗАЦИИ ДНК В СОСТАВЕ ХРОМАТИНА И В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ

03.00.04 — Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва 1990

Работа выполнена в Научном центре молекулярной диагностики Минздрава СССР.

Официальные оппоненты:

академик АМН СССР Збарский Илья Борисович Институт биологии развития АН СССР

доктор Оиол. наук, профессор Спитковский Давид Михайлович институт медицинской генетики АМН СССР

доктор биол. наук, профессор Спнричев Владимир Борисович Институт питания АМН СССР

Ведущая организация - Институт молекулярной генетики АН ссср

Зашита диссертации состоится •_*-1 990 г. в

• часов на заседании Специализированного совета д-001.02.01. Москва, lii9240, Устьинский проезд 2/14. Институт питания АМН СССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института питания АМН СССР

Автореферат разослан ' 1 _1 990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат медицинских наук

1мннчеико В.М.

Актуальность проблемы. Структурная организация ДНК и ее укладка в составе хроматина имеет важнейшее значение для реализации генетической информации. Очевидно, что многие процессы регуляции активности клеток, связанные с воздействия™ условий внешней среды или влиянием физиологически активных соединений, реализуются на уровне ядра за счет активации или подавления активности тех или иных генов, и сопряженных с этим процессов компактизации или декомпактизации соответствующих участков генома. Поэтому исследования структурной организации генома и механизмов, ответственных за структурные перестройки отдельных участков генома, всегда вызывали значительный интерес.

Особую актуальность проблемы укладки ДНК в составе хроматина приобретают в связи с растущим разрывом между значительной информацией, накопленной об организации генов на уровне первичной последовательности ДНК, и очень ограниченными представлениями о пространственной организации нитей ДНК в составе тех или иных структур.

В настоящее время полно охарактеризован только первый уровень компактизации ДНК в клетках - уровень нуклеосом. Уже следующие уровни слабо изучены, и по поводу организации 200300 X фибрилл нет единого мнения. Практически не выяснены способы укладки ДНК в более крупных структурах, очень мало исследованы механизмы структурных переходов хроматина.

В связи с этим значительный интерес представляет исследования структурных переходов фибрилл хроматина различных уровней и компактных структур ДНК, выяснение механизмов этих переходов, изучение воздействий, способных вызывать такого рода пе-

реходы. В ходе таких исследований могут быть сформулированы общие принципы формирования компактных структур ДНК, которые могут реализовываться в различных ситуациях in vivo.

Цели и задачи исследования. Основная цель настоящей работы состояла в изучении структурного разнообразия фибрилл хроматина в составе интерфазных ядер, исследовании организации структур различных уровней при активации транскрипции и установлении на модели взаимодействия пептидов с ДНК общих закономерностей процессов компактизации-декомпактизации ДНК в составе хроматина и других компактных структур.

Б ходе выполнения работы были сформулированы следующие основные задачи:

1) изучить структуру фибрилл неактивного хроматина различных уровней организации и исследовать структурные переходы хроматина, вызванные действием различных агентов;

2) исследовать структуру фибрилл хроматина в составе транскрипционных комплексов рибосомных и нерибосомных генов и охарактеризовать структурные изменения хроматина при активации транскрипции.

3) изучить взаимодействие с ДНК синтетических пептидов, способных образовывать ^-структуру в растворе, исследовать образовывающиеся при этом компактные структуры ДНК и выяснить способы укладки нитей ДНК в их составе;

4) на основе данных, полученных в этой модельной системе, сформулировать общие принципы компактизации ДНК, которые могут реализовываться в системах in vivo.

Научная новизна и практическая ценность работы. Исследованы структурные переходы фибрилл хроматина под действием различных агентов. Впервые показана роль бивалентных катионов, гистона НГ в стабилизации нуклеосомных и наднуклеосоыных фибрилл хроматина.

Проведены исследования изменений структуры фибрилл хроматина при активации транскрипции рибоссмных и нерибосомных генов. Прослежена динамика структурных перестроек хроматина, связанных с изменениями степени активности транскрипции ДНК макронуклеуса инфузории В. truncate!1 а. Выявлены субъединицы интерфазного неактивного хроматина, установлена их петельная организация. Описаны новые типы транскрипционных комплексов, встречающиеся в активном макронуклеусе, изучена их организация.

Проведены подробные исследования организации комплексов ДНК с синтетическими олигопептидаш, способными образовывать

R, -структуру в растворе. Показано, что эти олкгопептиды являются новым классом компактизующих ДНК агентов. Открыты новые компактные структуры кольцевой и линейной ДНК (тройные кольца, улиткообразные компактные структуры), исследована организация ДНК в составе этих структур. Сделаны обобщения о возможных принципах укладки ДНК в системах in vivo. Эти исследования являются новым направлением в изучении процессов компактиэации ДНК.

Для исследований структурных переходов хроматина под действием различных агентов и комплексов ДНК с гистонами разработаны электронно-микроскопические методические подходы, опирающиеся на метод безбелковой пленки. Эти методы открывают новые возможности для исследований компактизации ДНК in vitro.

Результаты работы проливают свет на проблему процессов коипактизации-декомпактизации ДНК в составе хроматина и модельных системах tn vit.ro и имеют не только важное теоретическое значение, но и практическое приложение. Работа служит основной для нового перспективного направления исследований физико-химических механизмов, ответственных за специфическое взаимодействие регуляторных белков с ДНК

На основании разработанных в диссертации положений могут быть предложены подходы к практическим работам по доставке генетического материала в клетки. Направленное формирование тех или иных структур ДНК при взаимодействии с различными агентами может служить основой для повышения эффективности имеющихся методов трансфекции и трансформации клеток, использующихся в генной инженерии. Данные и теоретические положения работы используются при научных исследованиях в ряде НИИ АН и ММ СССР.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на X и II Всесоюзных конференциях по электронной микроскопии (Ташкент, 1976, 1979), Всесоюзном симпозиуме по методам подготовки сложных объектов и анализу электронномикроскопических изображений (Петрозаводск, 1976), 6-ом Всесоюзном симпозиуме по структуре и функции клеточного ядра (Алма-Ата, 1977), 12-й конференции FEBS (Дрезден, 1978), II конференции по электронной микроскопии и микроанализу (Сегед, 1979), Всесоюзном симпозиуме "Макромолекулы клетки. Структуры, функции, взаимодействия"(Москва, Т979),п Советско-итальянском симпозиума "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Пущино, 1980), VII Всесоюзном симпозиуме по структуре и

функции клеточного ядра (Харьков, 1981), Симпозиуме по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов (Таллин, 1981), 4-ом Двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома" (Ереван, 1981), Третьем съезде Всесоюзного общества протозоологов (Вильнюс, 1982), 8-ом Европейском конгрессе по электронной микроскопии (Будапешт, 1984), 8-ом Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Пущино, 1984), 8-ом объединенном симпозиуме Биохимических обществ СССР-ГДР (Рига, 1985), II Международном Съезде по электронной микроскопии (Киото, 1986), 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), 19-й конференции РЕВБ (Рим, 1989).

Объем работы. Диссертация представляется в форме научного доклада по 48 публикациям (26 статей, 20 тезисов докладов на научных конференциях, 2 авторских свидетельства). Общий объем материалов составляет 417 страниц машинописного текста, 158 рисунков и микрофотографий. В списках цитированной литературы насчитывается 452 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объекты исследований

(1) Исследования организации неактивного хроматина проводили на ядрах и выделенном хроматине из тимуса теленка.

(2) Изменения структуры хроматина при активации транскрипции рибосомных генов изучали на материале из ядер ооцитов вьюна Жздигпи; ^эЯНз I..

(3) Для изучения изменений структуры хроматина при активации транскрипции использовали хроматин из макронуклауса инфузории Виг^аг! а 1гипса1е11

(4) Для исследований закономерностей комлактизации ДНК использовали комплексы ДНК различной топологии с синтетическими пептидами и гистонами.

Препараты ДНК. Для приготовления комплексов с пептидами использовали: (I) Кольцевую суперскрученную ДНК плазмиды рSR 322, (2) Кольцевую релаксированную ДНК плазмиды pBR 322, (3) ДНК pBR 322, линеаризованную рестриктазой Pst I.

Препараты синтетических пептидов. Олигопептиды, использованные в дзнной работе, были синтезированы в лаборатории химии белкового синтеза ИМБ АН СССР. Все пептиды имели флуоресцентную метку дэнсил (DnS) на своем с-конце. Было изучено взаимодействие с ДНК пептидов: (I) H-Val-j -{nh)^ -OnS (трива-лин, ДГТВ); (2) H-Vjl-Thr^ -Val2 -(нн) -DnS (пентапептид), (3) H-Thr-Val -<Thr4>s-Vj1-G!y)2 -Thr-Val^ -(nh)^ -CnS (тридека пептид. ТДГГ).

Препараты гистоков. Гистокы HI, Н2а, Н2ь, использовавш-еся в данной работе, выделяли из тимуса теленка по стандартным методикам. Чистоту препаратов контролировали электрофоре-тически.

Комплексы ДНК с олигопептидами готовили прямым смешиванием аликвот воднометанольного раствора соответствующего пептида и раствора ДНК при 20°С с инкубацией, как правило, в течение 30-50 часов при 4-8°С.

Комплексы ДНК с гистонами готовили как прямым смешиванием, так и специально разработанным нами методом безбелковой пленки, наслаивая ДНК в ТЭА-НС1 буфере на гипофазу, содержащего соответствующие гистоны в концентрации 2-4 мкг/кл.

- 7 -

Биохимические методы.

Хромзтин получали мягким лизисом ядер, выделенных из тимуса теленка в присутствии 0,1 шМ CaCl¿. Ядерный осадок лизиро-вали 2-3 кратным переосаждением в 2 шМ трис-HCl рН 8.(1 Такой хроматин далее обозначается ДНПо .

Хроматин, обедненный гистоком HI. получали, из ядерного осадка, экстрагированного 0,6 к Nací после 2-3 кратного переосаждения в растворе 0, б М Nad. Такой хроматин далее обозначается ДНП_н1 .

Для анализа структуры хроматина непосредственно из лизи-рованных ядер гомогенат ядер наносили на линейный градиент сахашзы 10-40 % и центрифугировали 90 кин при 15 ООО д. Алкк-воту каждой фракции анализировали в электронном микроскопе.

Белковый состав хроматина анализировали диск электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Физико-химические исследования.

Спектральные характеристики комплексов. Спектры поглощения ДНК и пептидов снимали на спектрофотометре "Сагу II8C" (США). Спектры кругового дихроизма регистрировали на дихрографе "Job!п Yvon Hark III" (Франция). Спектры флуоресценции получали с помощью спектрофлуориметра "Amineo SP-IOOO CS" (США). Константа седиментации комплексов определяли на аналитической ультрацентрифуге "Splnco", модель Е фирмы "Весквап" (США) при 20°С.

Связывание нетропсина и ДНК хроматина определяли количественно по изменениям спектров кругового дихроизма.

- 8 -

Электронно-микроскопические исследования.

Препараты выделенного хроматика и комплексы пептидов с ДНК готовили прямым нанесением. Для этого каплю образца объемом 5-IO мкл наносили ка сеточки, покрытые соответствующими пленками-подлоисами, после инкубации удаляли избыток жидкости, и сетки высушивали на воздухе.

Хроматин ядер вьюна и макронуклеуса В. truncatella исследовали, используя метод Миллера /Miller and Bestty, 1969/.

Для исследования влияния различных агентов на структуру хроматина и изучения комплексов гистонов с ДНК применяли также специально разработанный нами метод безбелковойпленки. Исследуемый материал в Трис-HCl буфере рн 8,3 или ТЭА-НС1 буфере рн 8, 0 наслаивали на гипофззу, содержащую соответствующие агенты (катионы, гистоны, антибиотики, полиамины), а затем после инкубации переносили на сеточки. Контрастирование электронно-микроскопических препаратов проводили круговым напылением пла-тино-палладиевого сплава /4:1/ под углом 6°, или препараты контрастировали окрашиванием уранил-ацетатом.

Авторадиографичьские исследования хроматина макронуклеу-сз В. truncatella проводили после инкубации инфузорий с [3Н]~ уридином и приготовления препаратов ядер по методу Миллера. После напыления сеточки покрывали мелкозернистой фотоэмульсией, экспонировали в течение 4-5 месяцев, проявляли фенидоно-вны проявителем.

Препараты изучали в электронных микроскопах JEH-IOOcx и JEH-IOCB ("JEOL", Япония).

- 9 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Организация и структурные перехода фибрилл неактивного хроматина 1.1. Строение фибрилл неактивного хроматина. Одним из подходов в изучении структурной организации хроматина является шок ядер путем перевода в условия низкой ионной силы с последувдим анализом получанного материала. Для оощей характеристики структур интерфазного хроматина такой подход в сочетании с электронной микроскопией особенно про-дотверен, так как при гипотоническом шоке ядер имеющиеся структуры как бы ".-замораживаются", и по препаратам можно судить об организации ядерного материала.

Для изучения неактивного хроматина мы исследовали препараты хроматина, приготовленные гипотоническим шоком ядер с последуйте й очисткой в сахарозном градиенте. На микрофотографиях (электронномгасроскопические фотографии, относящиеся к разделам I и 11 экспериментальной части не приводятся из-за невозможности их четкого воспроизведения) очищенный хроматин из нижних фракций градиента представлен нитями различной толщины. Бее структуры можно отнести к одному из 4-х классов: (I) нити толщиной 30-50 % представляющие, вероятно, развернутые нити ДНК, частично или полностью свободнъв от гистонов; (2) нити, состоящие из нуклеосом, связанных короткими спейсерными участками (дальше - нуклеосомные нити); (3) нити толщиной 200-300 % и (4) нити толщиной более 300 X и агрегаты нитей.

Изучение большого количества препаратов показало, что 200250 % фибриллы представляет собой наднуклеосомный уровень ор-

ганизации хроматина и содержат плотноупакованные нуклеосомные нити, присутствие 30-50 X фибрилл может быть обусловлено разрушением структур более высоких уровней организации.

Для дальнейших исследований были отработаны условия мягкого лизиса ядер, в значительной степени сохраняющие исходные структуры хроматина. (Такой хроматин далее называется ДНП0). Электронномикроскопические исследования показали, что ДНП является структурно гомогенным препаратом и имеет вид крупных скоплений фибрилл толщиной 200-250 %.

Структурно-гомогенный препарат хроматина ДНПд, сохраняющий наднуклеоссмную организацию, представляет собой удобную модель для исследований способности различных воздействий вызывать структурные переходы хроматина.

I. 2. Структурные переходы хроматина под действием различных агентов.

Исходя из морфологии препаратов ДНП0мокно было предполагать, что 200-250 К фибриллы представляют наднуклеосоыный уро-зень организации хроматина. Дальнейшие работы были посвящены изучению структурных переходов препарата ДН110под влиянием раз-дачных агентов.

Как выяснилось, целый ряд воздействий вызывает структурный переход от 200-250 X фибрилл к нуклеосомным нитям. Например, на препаратах ДНП0 после обработки 5 тМ ЭДГА, хроматин представлен, в основном, нуклеосомными нитями. Эти результаты показывают, что в поддержании наднуклеосомной организации в условиях низкой ионной силы важную роль играет бивалентные катионы. К аналогичному переходу от наднуклессомного уровня к.

нуклеосомным нитям приводит и удаление гистона Н1. По данным электрофореза в полкакриламидном геле обработка 0,6 М и»С1 приводит к удалению гистона Н1, а электронногшхроскопическио исследования показали, что для ДНП-щ характерна морфология нуклео-сомных нитей. ДНП-н1 также исследовали после обработки 5тК ЗДТА. После такого воздействия на препаратах выявляются, в основном, 70-100 1 нити без нуклеос.омной структуры. Эти результаты показывают, что гистон КГ играет важную роль дая поддержания надаук-леосомных структур и участвует в стабилизации самих нуклеосом.

Описанные наблюдаемое электронномккроскопкчески структурные переходы мы пьггались проследить по изменениям спектров кругового дихроизма (КД) хромзтина. Сопоставление спектрон КД исходного ДНПд, ДНП0 в присутствии ЭДТА и ДНП-к! дал0 возможность сделать выводы, что при структурном переходе имеют место изменения конформации ДНК Относительно малая амплитуда этих изменений говорит о том, что они затрагивают только часть ДНК хроматина, по-видимому, ДНК спейсерных участков, а ДНК нуклеосомных кор-частиц сохраняет свою конформацию. В дальнейших исследованиях, проведенных методом безбелковой пленки с нанесением ДНИ в присутствии ЭДТА на поверхность гипофазы, содержащей различные концентрации бивалентных катионов, была продемонстрирована

о

частичная обратимость перехода от 200- 250 А фибрилл к нуклеосомным нитям.

Были та;сже исследованы изменения структуры ДНП0 пра добавлении связывающегося с ДНК антибиотика нетропсина.

Электронномикроскотгаческиэ исследования показали, что связывание нетропсина в низких кснцэнтрациях 0, 005 < г < 0,05

(г - обозначено количество молекул нетропсина на фосфат ДНЮ вызывает переход от 200-250 фибрилл к нуклеосомным нитям. При более высоких концентрациях нетропсина ( г > О, I ) имеет место разрушение нуклеосомной структуры хроматина и на препаратах появляются 70-100 % "гладкие" фибриллы. Были также проведены исследования изменений спектров КД и белкового состава хроматина при связывании нетропсина. Совокупность полученных данных позволила сделать вывод о том, что наблюдаемые структурные переходы связаны с влиянием связывающихся по малой бороздке ДНК молекул антибиотика на взаимодействие с ДНК гистона Н1 и кегистоновых белков, ответственных за поддержание наднух-леосомной структуры.

Было также показано, что нуклеосомы могут быть разрушены и в ходе выделения хроматина, если при атом применяются жесткие механические воздействия, такие как гомогенизация или даже длительное перемешивание на магнитной мешалке. При этом исходный препарат становится очень гетерогенным, а после обработки ЭДТА основная часть хроматина представлена ненуклеосомны-ми 70-100 X фибриллами.

В целом, полученные данные позволили охарактеризовать возможные структурные переходы неактивного интерфазного хроматина. На рис. I в схематическом виде показаны исследованные структурные переходы. Приведенные результаты о взаимных переходах фибрилл хроматина различных уровней организации хорошо согласуются с полученными паралельно данными о переходах нитей хроматина, наблюдаемых при изменениях конной силы растворов (ТЬоша е1 «1., 1979).

- 13 -

Б нашем случае, в условиях низкой ионной сшщ перехода имеют место за счет связывания или добавления бивалентных катионов. Общие выводы, касапциеся структуры хроматина, роли

"мягкое выделение

200-250 "¡Г

фибриллы

ТА

нуклеосои ные ни

Суспензия ядер

механические вос^Ястшл

0,6 М ХМ

гетерогенныйнухлейоэи-хроиетин^у^^зРг" япти

Рис. I. Структурньв переходы фибрилл хроматина.

гистона Щ и ионного окружения ДНК в стабилизации наднуклео-сомных и нуклеосомных фибрилл, возможных переходах от нуклео-с о иных фибрилл к "гладким нитям", были подтверждены как в цитированной так и в ряде других работ. Подобные переходы могут иметь место и при процессах функционирования генетического материала, например, при активации транскрипции, когда отдельные участки генома должны приникать развернутую конформацию.

- 14 -

2. ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ ХРОМАТИНА Ш, АКТИВАЦИИ ТРАНС КРШШ

В наших исследованиях изменений хроматика, связанных с активацией транскрипции, использовались три модели. Это - ооциты вьюна и домашней курицы, на которых изучалась организация хроматина активно транскрибируемых рибосомных и нерибосомных генов, б такге инфузория Вигхама 1гилса1еПа, на которой исследовали изменения общей организации хроматина активации процессов транскрипции.

2.1. Изменения организации хроматина при активной транскрипции рибосомных и нерибосошьэг генов.

Одной из наиболее полно охарактеризованных групп генов являются рибосошые гены, кодирующие пре-рРНК Они имеются в ядрах в большм количестве копий, локализованы в ядрыжах и имоют хорошо идентифицируемую организации. Мы подробно исследовали морфологию транскрипционных комплексов рибосомных генов ооцитов вьюна на разных стадиях вителлогенеза. На хорошо диспергированных ядрах удается наблюдать расправленные фибриллы хроматина, которые можно проследить на значительном расстоянии. При активной транскрипции на таких фибриллах часто встречаются характерные по морфологии транскрипционные комплексы рибосомных генов. На рис. 2 представлено схематическое изображение отдельного транскрипционного комплекса (ТК) рибосомного гена, имеющего типичную морфологию.

Для определения »кета начала транскрипции были построены зависимости длины боковых РНП-фибрплл от размера транскрибируемого участка ДНК Представленный на рис. 2 ТК имеет харак-

терную организацию. Осевая фибрилла, в нетранскрибирунцихся участках имеет нуклеосомную организацию с равномерным располо- ■ жением нуклеосоы. В транскрибируемом участке на осевой фибрилле располагаются РНК- полимеразы, из-за плотного расположения пош-мераз обычно не удается прсследить осевую фибриллу в транскрибируемой части гена. Однако, встречаются гены, содержащие с во-

•

бодные от РНК-полимераз участки, и именно такой ген представлен на рис. 2 . В этих случаях хорошо видно, что осевая фибрилла имеет вид "гладкой" яенуклеосомной нити толщиной 60-80 X.

Рис. 2. Схематическое изображение транскрипционного комплекса рибосомного гена и зависимость длины РНП-фибрилл от размера прочитанного участка ДНК (место начала транскрипции указано стрелкой, посттранскрипционный отрезок обозначен « "Ч ).

Сопоставление результатов измерений на электронномикрос-копических фотографиях длины транскрибируемой части большого

числа генов с данными о размерах пре-рРНК в транскрибируемом . участке показало, что степень компактизации транскрибируемого участка гена составляет I-I, 2 разе, что соответствует практически развернутому состоянию ДНК. Таким образом, полученные результаты говорят о том, что при активной транскрипции рибо-сомных генов и.меет место потеря нуклеосомной структуры осевой фибриллы и почти полное разворачивание ДНК Иногда на препаратах встречаются гены, в которых процесс транскрипции только начался, и полммеразы имеются только недалеко от точки начала транскрипции. Однако, практически весь ген имеет ненуклеосом-ную структуру. Анализ таких генов, а также наличие у многих транскрибируемых участков посттранскрипционного развернутого участка осевой фибриллы показывает, что при транскрипции рибосомы ых генов вьюна происходит разворачивание всего транскрибируемого участка, причем это изменение структуры происходит или до начала транскрипции или при посадке первых молекул РНК-полимераз.

Наличие аналогичной стадии разворачивания транскрибируемого участка было продемонстрировано у эмбрионов Oncopeltu» f»ic1 »tui /Fo«, 1978/.

Изучение' транскрипции нерибооомных генов затруднено тек, что обычно число активных нерибосоыных генов в клетке весьма невелико, а активность их транскрипции незначительна. В качестве модели с активной транскрипцией нерибосомных генов кы выбрали превителогеиные и в#гелогекные ооциты домашней курицы.

На приготовленных методом Миллера препаратах активно транскрибируемые нерибосомныв гены петель хромосом типа "лам-

новых !';отск" игпюг тракторный вид "елочек". Незктизкьй хроматин или скгйсьр'гт учгсгся, отгйляйдо «¡стивно кби-руоыьм пли: имоггг нуллпосомио сгроет*.«. "зет о удэраг:сь наблюдать ти-,1 хрогапта аи'ачззукьной дллнц. на когорых тандсячз располагались траяскр.т-изико .-.дтивтш г--пи„, различзадйся как по направлении таг. и 110 н>*гсм;.зскос,?и тра.чскрилцп::. Колн-честоент/о оценки ростре^ -лгглл Г1£*-пог^раз и иухязосом в транскрипционных ьхиьсдох с I '.опта уроы.о',: е-сгаалосга транскрипции покязчли, что фибриллы ТК с высоким урсьнем транскрипции имеют практически развернутую организации. По-видимому, мотао говорить о корреляции между степенью интенсивности транскрипции нерибосомшх генов и уровнем декомпактизз--ции за счет развертывания нуклеосом осевых фибрилл транскрибируемого участка.

Эти результаты хорошо согласуются с многочисленны:.!;! биохимическими исследованиями, свидетельствующий об изменениях нуклеосомной структуры хроматина при активации транскрипции.

Отсутствие нуклеоеом может быть одним из способов структурной регуляции активности транскрипции, так как такие изменения организации у.роматиновой фибриллы характерны именно для участков с очонъ интенсивной транскрипцией как. рябосошис так и керибосомнмх генов.

2.2. Структуры;/.? «зг?!»:шт хроматина шкронукдзуеа (Ма) шйузорли ц-,г5«г1а {гипсз1е11а з процессз роста и дилере пциро г-к х Крупная прпеноводолч г.'-•узоры 8«;г«аг1 в £ птгл •„-т. ^ тз-лтэтея удобный объектом дад •»«ктуоиноикроскоштсках

дований хроматина. Из одиночной инфузории легко выделяется индивидуальное соматическое ядро (макронуклеус, Ма), содержащее достаточно материала для приготовления электронно-микроскопического препарата. Таким образом, можно поллчигь представление о состоянии хроматина ядра отдельной особи, а отбирая инфузорий, находящихся на различных стадиях процессов,диф*еренци-ровки после деления, можно изучатьсостояния, характеризующиеся различными уровнями активации хроматина.

Структурная организация хроматина Ма в разные сроки после деления.

Проведенные исследования показали, что в период от 0,5 до 1,5 часа после деления, т. е. во время интенсивного роста и' дифференцировки клеток инфузорий, основная часть хроматина Via находится в декоипактизованном состоянии и имеет вид рыхлых скоплений переплетающихся нитей хроматина, от которых отходят боковые РКП-фибриллы. Осевые фибриллы транскрипционных комплексов (ТК) могут располагаться как индивидуально, так и ь виде пучков, состоящих из параллельно идущих нитей. На этих же пре-.паратах встречаются также скопления активного декомпактизован-ного хроматина, отличающиеся по организации от описанных выше.

В таких скоплениях удается наблхдать структуры, в которых от осевой нити хроматина отходит большое число боковых фибрилл, расположенных близко друг к другу, причем такие структуры присутствуют в большом числе копий. Наличие новосинтезированной РНК в составе боковых фибрилл таких необычных структур бьвю подтверждено методом электронномикроскопической авторадиографии. Вероятно, подобные структуры представляют собой транскрипционные

единицы повторяющихся нерибосомных генов. Так как описываемые ТК имвюг весьма необычную шрфо логик, в дальнейшем ш будем называть их необычными транскрипционными комплексами (НТК). Схематические изображения транскрипционных комплексов хроматина Ма в. иипсПеП* различных типов приведены на Рис. 3.

а <5 а

Рис. 3. Схематическое изображение транскрипционных комплексов нерибосомных генов (а, б) и транскрипционных комплексов необычной морфологии (в) макрокукяеуса в. ггипса1е11а.

Кроме описанных структур на тех же препаратах присутствует- некоторое количество хроматина, организованного в плотные глыбки размером 120-180 нм. На радиоавтографах над хрома-

тиновьаш глыбками зерна серебра отсутствуют, что свидетельствует о неактивном состоянии хроматина в этих структурах.

В разные сроки после деления инфузорий соотношение количеств декомпактизованного и компактного неактивного хроматина существенно различается. Через 0,5-1,5 час. после деления доля хроматина Ма, организованного в хроматиновые глыбки, невелика, и основная часть хроматина имеет вид скоплений декомпактизованного хроматина, в которые активно включается рН]-уридин. Через 2-3 часа после деления наблюдается тенденция к увеличению доли компактного хроматина, организованного в глыбки. В Ма бурсарий, закончивших рост и дифференцировку (более 3 часов после деления) основная часть материала имеет морфологию связанных между собой плотных хроматиновых глыбок размером 120-180 нм.

Таким образом, по мере завершения процессов роста и диф-ференцировки клеток, количество декомпактизованного транскрип-ционно-активного хроматина уменьшается, а количество неактивного хроматина, организованного в глыбки, постепенно увеличивается.

Важным представляется тот факт, что в Ма бурсарии очень часто декомпактизованный транскрипционно-активный хроматин связан или соседствует с имеющим компактную структуру неактивным хроматином. Это может свидетельствовать о высокой избирательности активации тех или иных генов (или блоков генов), которые могут находиться в непосредственной близости от транскрипционно-неактивных генов, работа которых не является необходимой на данной стадии жизненного цикла организма.

Организация транскрипционных комплексов нерибосомных генов_макронуклеус£ в. truncate Па.

Строение ТК нерибосомных генов Ма в. truncatella по общей организации не отличается от строения ТК нерибосомных генов других эукариот. Своеобразие транскрипции нерибосомных генов Ма бурсарии состоит в том, что часто встречаются несколько параллельных осевых фибрилл, на которых белковые РКП-фибриллы располагаются сходным образом. По-видимому, такая организация объясняется политенным строением некоторых участков Ма.

Наблюдаемые на препаратах НТК также относятся к нерибо-сомным генам (рис. 3 в). Они характеризуются очень вьсокой плотностью боковых РНП-фибрилл, однако градиент длин РКП-фибрилл не прослеживается. Как правило, к НТК подходит несколько фибрилл хроматина. Иногда удается видеть, что транскрипция идет на нескольких параллельно расположенных осевых фибриллзх, причем эти фибриллы лишены нуклеосомной структуры. Повидимому, близкое расположение транскрибируемых участков нескольких осевых фибрилл приводит к наложению боковых РНП-фибрилл, что и обусловливает необычную морфологию описываемых ТК.

Активная транскрипция некоторых генов, присутствующих в геноме в. truncatella во многих копиях, по-видимому, необходима для быстрой смены определенных стадий клеточного цикла такого крупного одноклеточного организма, каким является инфузория В. truncatcl1 а.

- 22 -

Структурная организация неактивного хроматина

макронуклеуса в. truncate!!».

Неактивный хроматин Ма в. truncate?!л организован в крупные электронно-плотные хроматине выв структуры - гяыЗки, ш-звдие размеры 12Г-180 ни. Воздействуя на выделенные из зрелых инфузорий Ma in vitro и изучая возникающие при этом структуры, можно исследовать организацию этих субъеданиц хроматина. Исходя из имеющихся данных о влиянии различных факторов на хроматин, в качестве деконпактизирумцего воздействия мы использовали инкубацию в растворах с низкой ионной силой.

В препаратах хроматина Ма, инкубированного в 0,1 Ш 6о-ратном буфере в течение 3-5. иин, хроматиновые глыбки обычно расположены близко друг к другу (рис. 4а). Через 10-30 мин. инкубации становится видно, что хроматиновые глыбки связаны друг с другом фибриллами хроматина, и вокруг глыбок появляется короткие радиальные фибриллы гранулярного строения, причем некоторые из них имеют форму петель (рис. 4 б).

низкой ионной силой.

Поспэ инкубации Ма в О, I мМ боратном буфере в течение х-2 часов вокруг хро матине вых глыбок появляется "ореол" из радиаль-

ных петель фибрилл хроматина, длина которых варьирует от 0, 5 до I мкм. Более продолжительная инкубация (5 часов) приводит к значительному увеличению длины петель, достигающей 5-10 микрон (рис. 4 в. г). После инкубации 12-15 часов хроматиновые глыбки исчезают, и наблюдаются длинные фибриллы хроматина нуклеосомно-го строения (рис. 4 д). Последовательность структурных изменений дает возможность сделать заключение о петельной укладке фибрилл хроматина в составе глыбок.

Разворачивание глыбок с образованием петель может иметь и функциональное значение для регуляции транскрипционной активности ядер (Тихоненко и др., 1983). Выявленная дискретная организация хроматина Ма инфузорий, по-видимому, принципиально не отличается от организации хроматина высших эукариот в виде хромомеров в составе хромосом и отражает общий припцип дискретности в структурной организации эукариотической хромосомы Можно предположить, что существует определенное структурно-функциональное соответствие между хроматиновыми глыбками бурса-рии и хромомерами в хромосомах высших эукариот. По данным ряда авторов хромомеры имеют вид телец с радиально отходящими фибриллами хроматина (Зацепина и др., 1983). Такие структуры по морфологии сходны с декомпактизованныни глыбками хроматина Ма.

Полученные данные позволяют сделать заключение о важном биологическом значении дискретной петельной пространственной организации хроматина, которая может обеспечивать возможность избирательной компактизации-декомпактизации отдельных участков генома при функционировании ядра.

- 24 -

3. ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПАКГИЗАПИИ ДНК В ЮДЕЛЬНЬИ СИСТЕМАХ I* VI TRO.

Изучение структурных переходов хроматина позволяет охарактеризовать различные типы структур, а также воздействия, вызывающие переходы от одних структур к другим. Однако эти процессы, очевидно, чрезвычайно трудны для исследований из-за очень сложной организации нуклеопротеидкых комплексов.

Одним из подходов, позволяющих выявить и исследовать те или иные закономерности формирования компактных структур генетического материала in vive, является изучение коипакгиза-ции ДНК в модельных системах, т. е. в присутствии агентов, имитирующих окружение ДНК в живых системах.

Тем не менее традиционные модельные системы с коыпакти-зацией ДНК в присутствии гистона Ш, полиаминов, спиртов и других агентов имеют ограниченную ценность в связи с существенной структурной гетерогенностью получаемых компактных частиц, межмолекулярным характером взаимодействия.

В предложенной нами новой модельной системе взаимодействия ДНК с синтетическими олигопептидами, способными образовывать В-структуру в растворе (далее ^ -олигопептиды), как показали наши исследования, удается наблюдать формирование целого спектра различных упорядоченных компактных структур как внутримолекулярного, так и межмолекулярного характера.

3. i. Коипактизация линейной ДНК при взаимодействии с синтетическими олигопептидами.

Для понимания происходящих при взаимодействии с ^-олигопептидами изменений организации ДНК важное значение имеет он-

тические исследования, позволяпние судить о характере связывания пептидов с ДНК. а также физико-химические характеристики комплексов.

Связывание с ДНК о лито пептидов изучаемого ряда (тримлин, пентапептид, тридекапептид) сопровождается концентрационно зависимыми изменениями в спектрах поглощения, флуоресценции н кругового дихроизма. Изменения в спектрах в частности, говорят о том, что при связывании с ДНК олигопептида переходят в упорядоченную конформацию антипараллельного £-слоя (ГурсккЙ и др., 1983).

При связывании пептидов, меченных дансилом,с ДНК происходит сдвиг максимума интенсивности флуоресценции в коротковолновую область, и увеличение квантового выхода флуоресценции более чем на порядок величины.

Рост интенсивности флуоресценции наблюдается в довольно узком диапазоне концентраций пептидов, а при уменьшении концентрации ДНК возрастание интенсивности начинается при значительно более низких концентрациях пептидов. Характер концентрационных зависимостей говорит о кооперативном связывания пептидов на ДНК.

Анализ совокупности данных оптических исследований приводит к предположим), что £ -олигопептида могут ассоциировать между собой, будучи локализованными на удаленных сегментах ДНК, что должно приводить к компактизации ДНК.

Подробная информация о компактизации линейной ДНК при взаимодействии с В-олигопептидами была получена при исследования морфологии комплексов при повышашихся концентрациях пептидов.

- 26 -

Электронномикроскопические фотографии исходного препарата линейной ДНК и комплексов ДНК с тридекапептидом при различных концентрациях пептида представлены на рис. 5. На рис. 5а представлена микрофотография исходного препарата ДНК, приготовленного по методу Кляйншмидта. При концентрации пептида около 10 И ДНК на препаратах представлена вытянутыми фибриллами некоыпактизованной ДНК (рис. 56). При повышении концентрации пептида основную долю материала на препаратах составляют фибриллы расправленной ДНК, имеющие сильно извитую структуру (рис. 5в).

-6

При концентрации пептида 5 х 10 М на препаратах преобладают палочкообразные структуры (рис. 5 г). При более высоких концентрациях пептида на препаратах преобладают палочкообразные структуры, по форме напоминающие запятые (рис. 5д). При концентрации пептида около 5 х 10 М практически весь материал представлен плотными глобулами (рис. 5е).

Изучение морфологии компактных структур комплексов, конт-растированных водным уранилацетатом, при большом увеличении был сделан вывод о том, что палочкообразные структуры сворачиваются в глобулы, сохраняя в составе глобул свою структурную организации По длине теней глобул на препарате, контрастированием напылением металла с одного направления, были вычислены высоты наблюдаемых частиц. Оказалось, что большинство глобул имеют дискообразную форму. Тдким образом, глобулы представляют собой плотно спирально свернутые палочкообразные компактные структуры,« по своей форме и организации напоминают улиток.

Рис. 5. Компактизация тимусной ДНК при взаимодействии с три-

декапептидом. (а) -препарат исходной ДНК, приготовленный по методу

Кляйншмидта; (б-е) - ДНК в присутствии пептида в концент,. чдаях -? -г

от 10 М до 5 х 10 М. Контрастирование круговым напылением металла. Вычисленные значения объемов улиткообразных структур для

комплексов с ТДП, приготовленных с использованием ДНК стандартной длины, после сопоставления с литературными данными о плотности упаковки ДНК в кристаллах и в компактных структурах других типов позволили строго доказать, что в составе глобулярных компактных частиц содержится одна молекула ДНК. Эти данные показывают, что компактизация линейной ДНК при взаимодействии с тридекапептидом носит внутримолекулярный характер.

Сходным образом происходит процесс компактизации линейной ДНК при взаимодействии с пентапептидом и тривалином. На рис. 6 представлена схема событий компактизации линейной ДНК при взаимодействии с 6 -о лиго пептида ми.

3. 2. Компактизация кольцевой ДНК при взаимодействии с тривалином

Идентификацию хода отдельных сегментов ДНК в составе компактных структур целесообразно проводить с использованием кольцевых молекул, так как в этом случае их форма накладывает определенные топологические ограничения на молекулу в целом. С другой стороны, исследования компактизации кольцевой ДНК представляют самостоятельный интерес, так как отдельные петли.

Рис. 6. Схема внутримолекулярной компактизации линейной ДНК при взаимодействии с тридекапептидом. Штрихи обозначают связанные с ДНК молекулы олигопептидов. Двойные штрихи-контакты нитей ДНК бок о бок.

- 29 -

в которые организован геном эукариот, топологически эквивалентны замкнутым кольцам.

При изучении компактизации кольцевой суперскрученной ДНК плазмиды рвя 322 при взаимодействии с тривалином удалось однозначно интерпретировать укладку нити ДНК в составе компактных кольцевых структур, которые мы назвали "тройными кольцами".

При низкой концентрации тривалина в растворе ( ~10 М) ДНК на препаратах (рис. 7 б) имеет вид практически расправленных кольцевых молекул. Можно заметить, что многие молекулы ДНК содержат участки, где два соседних сегмента ДНК сближены и образуют структуру, напоминающую шпильку (указаны стрелками на рис.7 б). При повышении концентрации пептида шпильки имеют тенденцию к удлинению (рис. 7в). В дальнейшем такие шпильки ассоциируют с одним из сегментов ДНК, отходящих от их основания, образуя на молекуле тройной участок. Микрофотография таких "переходных" структур, представлена на рис. 7 г.

-5" .

При дальнейшем повышении концентрации пептида ( ~10 Ю, длина тройного участка увеличивается за счет расправленной части молекулы вплоть до того момента, когда петли на концах тройного участка встречаются, завершая формирование тройного кольца.

Выводы об организации ДНК в составе тройных колец подтверждаются результатами измерений коэффициента компактизации ДНК в составе тройных колец, который составляет 3,6±0, 3.

Алч Ът

Г 'ЛЙГУ

*** »4« <

?л

•Л'- '. •/,

Ш. /П

" г О

Рис. 7. Комплексы кольцевой суперскрученной ДНК с тривалином (б-х) и исходный препарат ДНК, приготовленный по методу Кляйн-ншмидта (а). На рис. 7 в-е приведены схематические интерпретации хода нити ДНК в составе компактных фибрилл.

Рис. 8. Схема формирования тройного кольца-Шгриховьк изображения как на рис. 6.

То, что коэффициент компактизации превышает 3, 0 отражает перевитость нитей дуплексной ДНК в составе тройного сегмента. Этим же объясняется периодическая субструхтура компактных фибрилл, ясно различимая на многих микрофотографиях. На рис. 8 представлена схема формирования тройного кольца.

Так как кольцевые молекулы мсгут находиться в двух топологических состояниях - суперскручекном и релакскровакном, представляло интерес исследование компактизации кольцевой ре-лаксированной ДНК в тех же условиях.

Как выяснилось, в этом случае реализуется йринципиально иная последовательность событий компактизации, которая начинается с возникновения на молекуле ДНК небольшого участка, завитого в кольцо (рис. 9 б,в). При повышении концентрации пептиде это "миникольцо" служит как бы катушкой для остальной части молекулы е для других молекул ДНК что приводит к формирование тороидальных частиц,в составе которых ДНК уложена бухтообразно.

Вычисление объемов частиц позволили заключить, что большинство тороидальных компактных частиц содержит 50-150 молекул ДНК, т. е. компактизация в данном случае носит межмолекулярный характер.

; Ту

л а.» *

"-ач»к

Ды

.....<______^.......__л .

Рис. 9. а - исходный препарат кольцевой ралаксированной ДНК,

нанесенный методом Кляйншмидта; б-г - компактизация при взаимодействии с тривалином с образованием тороидов.

3.3. Общие принципы организации компактных структур ДНК в комплексе с исследованными пептидами.

Анализ всего спектра исследованных структур показывает, что ключевым моментом для процесса компактизации является начальная стадия формирования компактной структура Особенно четко это показывают результаты изучения компактизации супер-скрученной и релаксированной кольцевых.ДНК при взаимодействии с тривалином.

В случае взаимодействия ДГТВ с кольцевой суперскручеяной ДНК на стадии инициации компактизации образуется шпилька из двух сзтштов ДНК (рис. 7 6, в), а затем тройной участок

(рис. ? г, д). Эти структуры не имеет тенденции к ассоциации с другими молекулами ДНК, и дальнейшее формирование компактной частицы - тройного кольца - происходит с вовлечением в компактные структуры неконденсированных сегментов той жв самой мэлеку-лы ДНК (схема на рис. 8).

На начальном этапе коипактизации кольцевой релаксирован-вой ДНК формирующаяся компактная структура (первичное кольцо или нинитороид, рис. 9) ассоциирует как с фрагментами той жа молекулы ДНК,, так и с другими молекулами ДНК, что приводит к межмолекулярной коипактизации.

Формирование упорядоченных структур, в которых потенциальные возможности взагаюдействия молекул пептида н ДНК почти полностью исчерпаны, характерно и для линейной ДНК, что приводит и в этом случае к внутримолекулярной коипактизации.

К возникновению таких упорядоченных структур мэжет приводить ассоциация молекул пептида, сорбированных на ДНК В пользу такого предположения говорят данные о самоассоциации молекул ^олигопептидов.

Саыоассоциация пептидов, зарегистрированная ранее с помощью физико-химических методов, проявляется'в образовании уторя-доменных агрегатов, процесс формирования которых был изучен с помощью электронной микроскопии.

При низких концентрациях пептида образуются нити толщиной 20-40 %. При более вьсоких концентрациях эти нити ассоциирует, формируя более крупные стержнеобразныэ ассоциаты. Вероятно, что в сорбированном на ДНК состоянии молекулы пептида, как ж в отсутствие ДНК, имеет тенденцию к ассоциации, благодаря чему они

стимулируют латеральные контакты отдельных сегментов ДНК и формирую!' гидрофобную серцевину компактных фибрилл.

Исходя из этого предположения, учитывая гидрофобную природу пептидов, и на основе ряда электронноиикроскопических данных можно сделать вывод о наличии в палочкообразных сегментах и фибриллах тройных колец гидрофобной пептидной сердцевины, вокруг которой располагается ДНК. На рис. 10 представлены схемы укладки ДНК в улиткообразных компактных частиц и молекул пептида в составе этих структур.

а. ход нити дуплексной ДНК Компактная фибрилла изображена аналогичной по структуре фибриллам тройных колец.

б. кружками показаны молекулы пептида. На врезке иллюстрировано формирование пептидной "сердцевины" компактной структуры.

Рис. 10. Схемы укладки ДНК в составе улиткообразных компактных частиц линейной ДНК в комплексе с -олигопептидами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные о структурных переходах хроматина под действием различных агентов и при активации процессов транскрипции характеризуют фибриллы хроматина как чрезвычайно динамичные структурные образования. Зарегистрированные переходы от наднуклеосомньсс фибрилл к нуклеосомным нитям и к гладким нитям имитируют декомпактизацию крупных субструктур хроматина и разворачивание нуклеосом в активно-транскрибируемых рибо-сомных и нерибосоиных генах.

Структурные переходы, выявляемые при исследованиях ядерного материала, характеризуются высокой степенью избирательности. Транскрибируемые участки определенной длины, не содержащие нуклеосом, располагаются на осевой фибрилле в окружении имеющих нуклеосомную организацию спейсерних участков. Активно транскрибируемый, декомпактизованный хроматин в. ггипсагеИа находится в непосредственной близости или связан с неактивным компактизованным хроматином. Отдельные петли хромосом типа "ламповых щеток" ооцитов курицы характеризуются различной интенсивностью транскрипции и также соседствуют с неактивным хроматином.

Очевидно, чтобы обеспечить такого типа переходы, их избирательность и обратимость, необходимы разнообразные механизмы коипактизации и тицы укладок материала.

Одним из типов организации, обеспечивающих избирательность коипактизации, является петельная укладка фибрилл, продемонстрированная для хроматиновых глы5ок в. 1.гипсаг«Па и

характерная для хромосомой других эукариот. Б этом случае петли лэгут компактизоваться независимо друг от друга. Ком-пактизация кольцевой суперскрученной ДНК при взаимодействии с тривалиноы дает новый вариант укладки нитей в составе петель, который может реализоваться для целых петель или отдельных участков. Такая укладка не имеет топологических ограничений так как структура типа тройного кольца может возникать и на петле ДНК (рис. II).

Важным свойством такого типа компактизации является способность к сохранению внутримолекулярьости процесса для располагающихся в непосредственной близости петель. Это свойство было продемонстрировано при изучении компактизации кинятопласт-ной ДНК при взаимодействии с тривалином. В этом случае была показана полная независимость конденсации отдельных катенирован-ных ыиниколец в комплексе кинетопластной ДНК

Избирательность процесса компактизации может быть обеспечена и за счет комбинации различных факторов, оказывающих влияние на разные компоненты нуклеопротеидных комплексов. №>-дельь одного из вариантов такого избирательного процесса может являться компактизация кольцевых молекул ДНК при взаимодействии с)-олигопептидами, которая обеспечивает различные результаты конденсации в зависимости от топологического сос-

пактизации петли по типу тройного кольца.

Рис. II. Схема ком-

тояния ДНК В клетках могут встречаться ситуации, в которых необходимо структурно дискриминировать крупные фрагменты генома . В этих случаях при реализации описанного для пептидов механизма "меткой" для порций ДНК или хроматина, подлежащих неспецифической мекмолекулярной конденсации может служить ре-лаксированное состояние, вызванное введением "ников" ядерными нуклеазами. При этом фрагменты ДНК, сохранившие суперскру-ченное состояние не будут вовлекаться в этот процесс.

Очевидно, что помимо описанных в приведенных вьаю примерах, и другие структуры, наблвдапциеся на промежуточных стадиях формирования компактных структур (первичные "шпильки", "миникольца", небольшие тройные участки, минитороиды) мэгут реализоваться в различных ситуациях ln vivo.

Расширение представлений о компактиэационных возможностях ДНК механизмах формирования компактных структур и принципах их организации может служить базой для более глубокого понимания роли структурных факторов в функционировании генома.

ВЫВОДЫ

1. Разработан комплекс методик на основе метода безбелковой пленки для злектронномикроскопических исследований макромолекул и процессов формирования компактных структур ДНК и хроматина в тонких поверхностных пленках.

2. Охарактеризованы по морфологии типы фибрилл хроматина различных уровней организации. Изучены различные воздействия, способные вызывать структурные переходы хроматина. Показано,

что связывание бивалентных катионов ЭДТА, удаление гистона Щ, добавление связывающегося с ДНК антибиотика нетропсина вызывают переход от 200-300 £ фибрилл к фибриллаи куклеосоьыого уровня. При более жестких воздействиях (высокие концентрации нетропсина, изханические воздействия) имеет место дестабилизация нуклеосомной структуры и переход к "гладкиьГ 70-80 % фибриллам хроматина.

3. Изучена морфология транскрипционных комплексов активно транскрибируемых рибосомных и нерибосомных генов. Показано, что в активных рибосомных генах вьюна спейсерные участки имеют нуклеосоиное строение, в то время как в транскрибируемых участках осевая фибрилла находится в развернутом состоянии. Сделан вывод о наличии предшествующей транскрипции стадии разворачивания нуклеосомной структуры транскрибируемого участка.

4. Проведены исследования структурных изменений хроматина соматического ядра инфузории в. 1гипс»1е11», связанных с активацией транскрипции в разные сроки после деления. Показано, что основная часть хроматина макронуклеуса в период интенсивного роста и дифференцировки находится в декомпактизованнок состоянии и характеризуется активной транскрипцией. По мере завершения роста и дифференцирован количество активного хроматина падает и повышается доля неактивного хроматина. После окончания роста и дифференцировки практически весь хроматин организован

в компактные хроматиновые глыбки. Путем декоглактизацли в растворах с низкой ионной силы установлена петельная организация хроматиновых фибрилл в составе этих компактных структур.

5. Обнаружены и изучены необычные транскрипционные комл-

лексы, представленные в активном хроматине ыакронуклэуса в большом количестве копий. Эти транскрипционные комплексы характеризуются высокой плотностью располохзния боковых РНП-фмб-рилл, активной транскрипцией с нескольких расположенных параллельно сближенных осевых фибрилл.

6. Изучено взаимодействие ряда синтетических ^ - олиго-пептидов, с ДНК различной топологии (суперскрученная, релакси-роьанная кольцевая, линейная) и исследованы образующиеся при этом компактные структура ^ -олигопептиды охарактеризованы как новый класс компактизунщих ДНК агентов.

7. Описаны и подробно исследованы компактные структуры, возникаксие при взаимодействии тривалина с кольцезой суперск-рученной ДНК. На основании комплексного исследования процесса кокпактизации предложена шдель организации ДНК в составе этих структур, которые были названы "тройными кольцами". Установлено, что при взаимодействии кольцевой релаксированной ДНК с "•ривалином образуются мекмолекулярньк тороидзльньге частицы содержащие, как правило, 50-100 молекул ДНК. На основании этих данных предложена модель кошактизации кольцевых ДНК, конечный результат которой определяется топологический состоянием ДНК

8. При изучении коилактизации линейной ДНК с тризалиноц, пентапептидом и тридекапептидом описан необычных ход кошактизации с формированием компактных палочкообразных структур, которые затем сворачиваются в плотньв улиткообразные глобулы. Продемонстрировано, что этот процесс кошактизации носит внутримолекулярный характер. Предлогена иодель пространственной организации ДНК и молекул пептида в составе таких структур.

- 40 -

9. Исходя из данных электронно-микроскопических и физико-химических исследований установлено, что наиболее вероятным механизмом образования описанных структур ДНК является ассоциация фибрилл дуплексой ДНК бок-о-бок за счет взаимодействия иеаду молекулами пептида, локализованными на различных сегментах ДНК. На основе анализа полученной информации предложены новые модели процессов компактизации фибрилл хроматика и ДНК ín vivo.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Бенгеров П. II, Попенко В И., Кадыков R А. Новый метод без-бежозой пленки для электронной микроскопии ДНК Доклады Академии наук СССР, 1975, т. 224, N 4, стр. 935-955.

2. Кадыков Е А., Бенгеров Ю. Ю., Попенко R И., Тихоненко А. С. Исследование структурной организации элементарной фибриллы хроматина. Доклады Академии наук СССР, 1975, т. 223, К б, стр. 1463-1464.

3. Бенгеров KL Е , Попекко R И , Кадыков R А. Структурная организация нитей хроматина толщиной 100-200 Л X Всесоюзная конференция по электронной микроскопии, Ташкент, 1976, стр.

4. Векгеров Ю. II, Попенко R И., Кадыков R А. Новый метод безбелковой пленки для электронной микроскопии ДНК Всесоюзный симпозиум по методам подготовки сложных объектов и анализу электронномикроскопических изображений, Петрозаводск, 1976, стр. 34-35.

5. Венгеров К1 Ю., Попенко Е И., Кадыков Е А. Способ приготовления препаратов биологических макромолекул для электронной микроскопии. Авторское свидетельство N 519610, 1976, Бюл. N 24.

6. Попенко Е И., Венгеров Е III Исследование структуры хроматина при частичном удалении гистона КГ. VI Всесоюзный симпозиум по структуре и функции клеточного ядра, Алма-Ата, 1977, стр. 47.

7. Венгеров Ю. П., Попенко Е И., Тихоненко А. С. Структурная организация нитей хроматина толщиной 100-200 £ Доклады Академии наук СССР, 1977, т. 232. N б, стр. 1442-1444.

8. Венгеров Ю. Е , Попенко Е И., Минченкова Л Е. Изучение влияния моно- и бивалентных катионов на структуру хроматина с помощью нового безбелкового метода для электронной микроскопии. XI Всесоюзная конференция по электронной микроскопии, Ташкент, 1979, т. 2, стр. 42.

9. Попенко Е И., Венгеров Е Ю., Минченкова X Е. Влияние ионных условий на структурную организацию хроматина. Всесоюзный симпозиум "Макромолекулы клетки. Структуры, функции взаимодействия", Москва, 1979, стр. 140.

10. Попенко Е И., Венгеров Ю. & , Тихоненко А. С. Струхтура транскрипционных комплексов рибосошых генов ооцитов вьюна. И Советско-Итальянский симпозиум "Макромолекулы в функционирующей клетке", Лущино, 198Ц стр. 69-70.

11. Попенко Е И., Венгеров Ю. Ю. , Тимофеева М. Я , Тихонешсо А. С. Визуализация транскрипции рибосомных генов вьюна.

VI1 Всесоюзный симпозиум по структуре и функциям клеточ-

- 42 -

ного ядра, Харьков, 1980, стр. 140.

12. Лзнг X., Венгеров Е Е, Попенко Е И., Циммер К. Взаимодействие УФ-света с ДНК и хроматином. Симпозиум по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов, Таллин, 1981, стр. 195.

13. Карпекчук К Г., Ундрицов И. М., Мияченкова Л Е , Венгеров Ю. И, Мирзабеков А. Д. Разворачивание нуклеосом при частичной нейтрализации положительных зарядов гистоноа Симпозиум по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов, Таллин, 1981, стр. 114.

14. Попенко К И., Венгеров Е Е , Тихоненко А. С. Электронно-микроскопическое исследование транскрипции рибосомных генов ооцитов вьюна. Молекулярная биология, 1981, т. 15, N 2, стр. 430-438.

15. Мартынкина Л Е , Венгеров Е Е , Сергеева Г. И., Беспалова И. к , Попенко Е И., Тихоненко к С. Структурная организация хроматина мэкронуклеуса инфузорий. Четвертый двусторонний симпозиум СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома". Тезисы докладов и стендовых сообщений, Ереван, 1981, стр. 94-95.

16. Ундрицов И. М., Кактинис К И., Вашакидзе Р. П., Карпенчук К. Г., Венгеров Е Е , Попенко Е И. Исследование комплексов гистона Н1 с суперспиралькой ДНК. Молекулярная биология, 1982, т. 16, N 4, стр. 720-730.

17. Тихоненко к С., Мартынкина Л. Е , Венгеров Е Е , Беспалова И. к , Попе1Жо К И., Сергеева Г. И. Структурно-функциональная организация хроматина интерфазного макронуклеуса

(Мэ) Ви^ама 1гипса1е11а. Материалы третьего съезда Всесоюзного общества протозоологов "Современниз проблены протозоологии", Вильнюс, 1982, стр. 382.

18. Венгеров Я Е , Попенко Е И. Способ приготовления кошлек-сов ДНК с белком для электронномикроскопического исследования. Авторское свидетельство N 945517,1982, бпл. N 28.

19. Карпенчук К Г., Минченкова Л Е , Ундрицоз И. Л , Венгеров Ю. Е , Мирзабеков А. Д. Разворачивание коровых нуклэосон, вызванное химическим ацетилированием гистоков. Молекулярная биология, 1983, т. 17, N 4, стр. 855-867.

20. Венгеров Ю. Ю., Сергеева Г. II, Мартынкина X П. , Беспалова И. А., Попенко Е И., Рябова Р. К , Тихо не нк о А. С. Структура интерфазного хроматина макронуклеуса инфузории Зиг$а-г) а 1гипса1е11а. Молекулярная биология, 1983. т. 17,

N 6, стр. 1305-1311.

21. Макаров В Л., Стрельцов С. А., Венгеров В. Ю., Хорлин А. А., Гурский Г. Е с дансилгидразидом тривалина с образованием структур нового типа - тройных колец. Молекулярная биология. 1983, т. 17, N 4, стр. 1089-1101.

22. Еенгеров Е Ю., Мартынкина Л П , Беспалова II А., Сергеева Г. И., Тихоненко А. С. Структура интерфазного хроматина иакронуклекса инфузории Виг$аг1а ггипсаге11а. Молекулярная биология, 1984, т. 18, н I, стр. 272-276.

23. Венгеров Е Ю., Макаров Е Л., Семенов Т. Е , Стрельцов С. А., Хорлин А. А., Кузе А. Л , Готтих Е П., Гурский Г. Е Компак-тизация кольцевой ДНК при взаимодействии с дансилгидразидои тривалина с образование« структур нового типа -

- 44 -

тройных колец. Молекулярная биология, 1935, т. 19, H 5, стр. 1223-1230.

24. Семенов Т. Е , Венгеров Е Е , Суровая А. Н., Сидорова H. Е, Стрельцов С. А., Хорлин А. А., Еузе A. Jl , Готтих Ь П., Гурский Г. В Внутримолекулярные компактные структуры линейной ДНК, форшрувдиеся при взаимодействии с синтетическим тридекапептидом. Молекулярная биология. 1986,

т. 20, N 5, стр. 1422-1432.

25. Сидорова К. Ю., Семенов Т. Е, Суровая A. Е , Венгеров Ю1 Е , Стрельцов С. А., Хорлин А. А., Еузе А. Л., Гурский Г. Е Взаимодействие синтетического пентапептида с ДНК- специфичность связывания и кошактизация ДНК. Молекулярная биология, 1987, т. 21, К б, стр. 1534-1550

26. Венгеров Ю. Е , Семенов Т. Е Комплексы ДНК с синтетическими олигопептидаыи: шдель для изучения закономерностей кошактизащш ДНК 1л vivo. Молекулярная микробиология, вирусология, генетика. 1989, и I, стр. 3-10.

27. Мартынкина JL П., Новикова Е. Г., Колесников А. А., Стрельцов С. А., Семенов Т. Е , Венгеров Е Е Структурная организация кинетопластной ДНК и ее компактизация в модельной система in vitro. Молекулярная биология, 1989,т. 23, к 6, стр. 172-184.

28. Irlebel К., Reinert К.Е., Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l., lang H. Structura' charges of UV-i rradi ated DMA evaluated from hydrodynamlc and electron microscopic oeasurenents. ICuhlunborn, DOR, Abstracts of VI UV-Kol-loqutun UV-Stral en In biologie und medí zi n, 1977,1 V, p. 4-7.

29. Vengerov Yu.Yu., Popenko V.I, Changes In chromatin structure induced by EDTA treatment and partial removal of

hi stone Hi. Nucl. Acids Res., 1977, v. 4, p. 3017-3027.

30. Vengerov Yu. Yu., Lang H. , Popenko V.l., Tlkhonenko A. S. Neuere Aspekte zur struktur des Chromatins. Proc. I Arbeitstagung "Biophysik der Nucleoproteldsysteme", Weimar, DOR, 1977, 3, p. 22-26.

31. Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l., Lang H. , Tikhonenko A. S. Orgaqnlzation of nucleosomes in chromatin fibres, ßiol, Zbl. 1978, V. 97, p. 29-38.

32. Lang H., Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l., Zimmer Ch. Structural changes of chromatin induced by interaction with Netropsin. Abstracts of I2th FEBS Meeting, Oresden ODR, 1978, VII, 2-8.

33. Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l. Protein free spreading technique for the electron microscopy of DNA and chromatin. Hicroscoplce Acta, 1978, v. 80, p. 375-382.

34. Popenko V.l., Vengerov Yu.Yu. The effect of various conditions of chromatin Isolation on the nucleosonal structure of the isolated chromatin. Holec. Biol. Rep. 1978, v. 4, N I, p. 45-50.

35. Lang H., Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l., Zimmer Ch. Stuctural transitions of chromatin Induced by netropsin. Acta biol. med. germ. 1979, v. 38, N I, p. 33-40.

36. Popenko V.l., Vengerov Yu.Yu., Minchenkova L.E. Effect of mono- and bivalent cations on chromatin structure as revealed by electron microscopy. Proc. Ilth Conference

- 46 -

on Electron Microscopy and Microanalysis, Szeged, Hungary, 1979, p. 185-186.

37. Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l., Tikhonenko A. S. Electron microscopic study of loach oocytes ribosomal genes transcription. Proc. X Tagung elektronenmicroskopie, Leipzig, DDR, 1981, d. 115.

38. Kuprijanova N.I., Popenko V.l., Vengerov Yu.Yu., Timofeeva H. Ya., Tikhonenko A. S., Skryabin K. G., Bayev A.A. Organization of loach ribosomal genes (Ml s g umus fossil is 1.) Hoi ec. Biol. Rep. 1982, v. 8, p. 143-148.

39. Lang H. , Vengerov Yu.Yu., Popenko V.l., Zimmer Ch. Interaction of UV-11 ght with DNA and chromatin. Studia bio-physica, 1982, v. 87, p. 243-244.

40. Martinkina L.P., Vengerov Yu.Yu., Bespalova I.A., Tikhonenko A.S., Sergeev« G.I. "fhe structure of inactive interphase macronuclear chromatin of the ciliate Bursaria truncatella. Radial loops in the structure of chromatin clumps", Eur. J. Cell Biol. 1983, v. 30, p. 47-53.

41. Vengerov Yu.Yu., Sergeeva G.I., Nartinkina L.P., Bespalova I.A., Popenko V.l., Ryabova R.V., Tikhonenko A. S. Electron microscopic and autor?diographic study of the macronuclear chromatin of Bursaria truncatella at different times after cell division. Chromosoma, 1983, v. 88, p. 328-332.

42. Vengerov Yu.Yu., Semenov T. E., Streltsov S.A., Makarov V.L., Khorlin A.A., Gursky G. V. Triple rings - a new type of compact structure of circular DNA. - Proc.

VIII the Eur. Cong, on Electron Microscopy, Budapest, Hungary, 1984, v. 2, p. I44I-I442.

43. Gagynskaya E.R., Tsvetkov A.G., Vengerov Yu.Yu., Kropo-tova E.V. Electron microscopic study of lampbrush chromosomes from avian oocytes. Proc, Vlllth Eur. Cong, on Electron Microscopy, Budapest, Hungary, 1984, v. 3.

p. 1885-1886.

44. Vengerov Yu.Yu., Semenov T. E. , Streltsov S. A. , HskaroV V.L., Khorlin A.A., Gursky G.V. Torus-shaped particles formed due to 1ntermolecular condensation of circular DNA upon Interaction with synthetic tripeptlde. -fEBS Lett. 180, p. 81-84, 1985.

45. Vengerov Yu.Yu., Semenov T. E. , Streltsov S.A., Makarov V.L., Khorlin A. A. , Gursky G. V. Triple rings - a new type of compact structure of circular DNA. - J. Hoi. Biol. 184, 1985, p. 251-255.

46. Vengerov Yu.Yu., Semenov T. E. , Zhuze A. L. , Gottikh B. P., Gursky G. V. Intramolecular condensation of linear DNA upon interaction with synthetic tridecaptlde. Proc. IXth Int. Cong, on electron Microscopy, Kyoto, Japan, 1986,

p. 2407-2408.

47. Vengerov Yu.Yu., Semenov T. E. , Surovaja A. N. , Sidorova N. Yu. , Streltsov S. A. , Khorlin A. A., Zhuze A. Z., Gursky G.V. Electron Microscopic and Phys 1 co-Chemica 1 Studies of ONA Complexes with Synthetic Oligopeptides: Binding Specificity and DNA Compact Structures. Journal of Bio-molecular Structure and Dynami cs, 1988, v. 6. , p. 311-330.

48. Novlkova E.S., Hartlnkina L.P., IColesnlkov A.A., Semenov T.E., Vengerov Yu.Yu. "Structural organization of Leishmania gynnodactyli kinetoplast DNA and compactfzatton of klnetoplast OHA networks in vitro". Abstracts of I9th FEBS meeting. Rone, Italy, 1989, p. 44.

JI46062. DoannoaHo s nesaTfe 19.02.90.

B H H H H U T

3aK. 535.Tap. 100.