Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование нуклеосомного уровня организации хроматина из клеток, различающихся по характеру дифференцировки

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование нуклеосомного уровня организации хроматина из клеток, различающихся по характеру дифференцировки"

РГ Б ОД

1 3 МАЙ ЬЬО

На правах рукописи

УДК 576.315.42:577.'112.823:577.218

г// х у

ИВАНОВ Глеб Сергеевич

ИССЛЕДОВАНИЕ НУКЛЕОСОМНОГО УРОВНЯ ОРГАНИЗАЦИИ

ХР0.!У1МИНА..„.„ИЗКЛЕТОК, .........

РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ХАРАКТЕРУ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации-на соискание, ученой степени кандидата биологических наук.

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена в Институте цитологии РАН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор В. И. Воробьев.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член, корр. РАМН

B. С. Гайцхоки

НИИ экспериментальной медицины РАМН.

C.-Петербург

кандидат биологических наук, А. Г. Цветков Институт цитологии РАН, С.-Петербург

Ведущее учреждение

Кафедра биохимии Санкт- Петербургского государственного университета, С.-Петербург

Защита состоится "Щ " МЖ'-'А 996г. в /Л ч. на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института

цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно -ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан " 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета д.б.н, Л.Н.Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акхуядьярсть пробламьи

Традиционно выделяют три структурных уровня организации хроматина: ¿клеосомный уровень, уровень хроматиновой фибриллы и петельный уровень, тдельные уровни этой иерархически организованной структуры взаимно согласованы пя выполнения различных программ, направленных на поддержание жизнедеятельности 1етки и развитие организма. Поэтому особый интерес представляет сопоставление груктурных и динамических характеристик хроматина на каждом из уровней его груюурной организации со спецификой клеток, из которых он был получен. 'Это тносится как к хроматину в целом, так и к его отдельным участкам.

Наиболее изучен нуклеосомный уровень организации хроматина. Он' описывается акими параметрами, как величина нуклеосомного повтора, конформационная абильность комплекса ДНК с гистонами, состав гистонов и их модификации, асположение нуклеосом относительно последовательности ДНК. По-видимому, именно ти базовые характеристики определяют также характер структуры хроматина на оследующих, более высоких уровнях.

До сих пор не существует единой точки зрения на структуру хроматиновой )ибриллы. Большинство гипотез, касающихся наднуклеосомной организации хроматина, юною разделить на два класса: к первому относятся дискрртные модели, предлагающие |ргсниэацию фибриллы в так называемые супербиды или нуклеомеры, а ко второму -юдели, представляющие 30 нм фибриллу непрерывным рядом нуклеосом, уложенных в иде соленоида или суперспирали. Существуют и промежуточные между этими классами юдели (см. Бавыкин, 1988). Следует отметить, что наибольшее экспериментальное юдгверждение получили модели непрерывной 30 нм фибриллы. Причем различные юдели непрерывной хроматиновой фибриллы отличаются друг от друга, главным >бразом, по способу укладки межнуклеосомной или линкерной ДНК. По этому принципу IX можно разделить на три класса; - линкерная ДНК свернута в виде суперспирали, фодолжая путь ДНК коровой частицы; - линкерная ДНК свернута в петлю внутри ¡оленоида; - соединяющая две соседние нуклеосомы линкерная ДНК растянута. Для уточнения способа организации линкерной ДНК необходима информация о таких

характрристиках нуклеосомной организации хроматина, как длина нуклеосомной ДНК. ассонииронанмой с октамером гистонов, и взаимное расположение точек входа и выхода ДНК с нуклеосомы.

Третий уровень организации ДНК в хроматине состоит в укладка 30 им хроматиновой фибриллы о петли, прикрепляющиеся к ядерному матриксу. Показано, что концы петель могут присоединяться к ядерному матриксу через топоизомеразу II (Earnsha.v et al., 1985; Berrios et at., 1985) - фермент способный релаксировать как положительно, так и отрицательно супорспирализованную ДНК. В настоящее время можно считать доказанным, что в транехрипционно • активном хроматине существуют торсионные напряжения (см. van Holde, 1989)..которые, возможно, они являются одним из существенных факторов в регуляции транскрипции хроматина. (Weintraub, .1986). В клетках прокариот существует специальный класс ферментов • гиразы. которые способны пероводить ДНК в суперскрученное состоянио. и аналоги которых не обнаружены у эукариот. Поэтому предполагается, что создание торсионных напряжений е гкпло хроматина может происходить благодаря частичному раскручиванию ДНК нуклеосом. В связи с этим представляется интересным провести сравнительное исследование динамики конформационных изменений нуклеосомной ДНК тотальногс хроматина из клоток. различающихся транскрипционной актионостью. а также находящегося в особом, гетерохроматиновом состоянии. Это можно осуществить применяя наряду с биохимическими подходами, метод кругового дихроизма (КД) который позволяет оценить конформационное состояние ДНК в хроматине.

Цели_и_аваач илмдодооакши

Цель настоящей работы состояла в том. чтобы исследовать взаимосвязь межд; структурными, (размер нуклеосомного поотора и длина нуклеосомной ДНК ассоциированной с октамером гистонов) и динамическими параметрами, нуклеосомно! организации хроматина, выделенного из клеток, различающихся по характер' дифференцировки и тотальному уровню транскрипционной активности ядер. В качеств! динамического параметра проводим оценку величины, характеризующей лабильное^ нуклеосомной ДНК, т. е. изменение длины ДНК, ассоциированной с октамером гистонов при изменении ионной силы раствора.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Методом кругового дихроизма провести сравнительное исследование динамики компактизаиии олигонуклеосомных фрагментов хроматина, индуцируемой увеличением ионной силы раствора. С помощью этого приема, традиционно используемого при исследованиях in vitro в качестве аналога процесса конденсации хроматина в ядра, изучить компактизацию фрагментов хроматина, выделенного из следующих типов клеток и тканей: тимус крыс, асцитной гепатомы 22А мыши, нормальной и регенерирующей печени мыши линии СЗНА, спермиев морского ежа и нейронов больших полушарий мозга голубя.

2. На основании полученных данных, используя модельные расчеты, оиенить размеры компактного (ассоциированного с октзмером гистонов) и развернутого

г

участков нуклеосомной ДНК в составе олигонуклеосом для каждого из указанных выше типов клеток.

3. Определить величину тотального нуклеосомного повтора в клетках асцитной гепатомы 22А мыши, а также в плаценте и эмбриональной печени человека. Для последних двух типов клеток сравнить тотальную величину нуклеосомного повтора с нуклеосомным повтором хроматина, включающего сателлитную ДНК 3 человека, которая находится, согласно литературным данным, преимущественно в составе гетерохроматина.

Научная новизна и научно-практическая ценность.

Проведено сравнительное исследование ряда хроматинов, выделенных из клеток, различающихся по характеру дифференцировки и тотальному уровню транскрипционной активности ядер.

В настоящей работе выявлены интересные характерные особенности изученных образцов и предпринята попытка обобщить полученные данные.

Методом кругового дихроизма показано, что первый этап компмктиэацш всех изученных типов хроматина, за исключением хроматина асцитной гепатомы 22А, происходит за счет увеличения доли нуклеосомной ДНК, ассоциированной с октамером гистонов.

Показана неспособность к образованию хроматосомной структуры при повышении ионной силы в хроматинах, выделенных из клеток, характеризующихся высокой транскрипционной активностью: кортикальных нейронов больших полушарий мозга голубя и асцитной гепатомы 22А.

Впервые обнаружена устойчивость нуклеосомной ДНК хроматина асцитной щпатомы 22А к компактизующему действию хлорид натрия в раствора. Это свойство отнимает хроматин гепатомы от других известных типов хроматина.

Данные, полученные в нашей работе, дают основания полагать, что характер компактизации хроматина спермиев морского ежа при концентрации NaCI выше 30 мМ отличается от такового для хроматинов, не имеющих сверхконденсированного состояния. Компактизация хроматина в этих условиях сопровождается уменьшением смиральности гистонов, которое может быть объяснено конформационным переходом в С-концеиом фрагменте спермий-специфического гистона Н1 из а-спиральной конформации в конформацию вытянутой левой спирали.

Получены приоритетные данные о различной величине нуклеосомного повтора в хроматине, содержащем сателлитную ДНК 3 человека для двух разных тканей одного организма, характеризующихся одинаковым тотальным нуклеосомным повтором. Эти результаты тем более интересны, что особенности структурной организации гетерохроматина мало изучены.

На основании полученных данных делается заключение о важной роли в оценке организации хроматина таких критериев, как возможность дополнительной ассоциации части литерной ДНК с октамером гистонов и способности к образованию хроматосомной структуры.

" Полученные в работе результаты углубляют понимание механизмов Функционирования хроматина и уточняют наши представления о структурно-"функциональных взаимоотношениях в хроматине. Они способствуют более полному пониманию изменений, происходящих в хроматине в процессе дифференцировки, v выяснению структурной организации и особенностей функционировав« пэтерохроматина

йддабаиия работы.

Материалы диссертации докладывались на Республиканском симпозиум« "Ядерные белки и экспрессия генома" (Канев, 1983). на VIII (Пущино, 1984) и 0 (Черноголовка, 1987) Всесоюзных симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра" на V (Харьков, 1984) и VI (Харьков 1988) Всесоюзных конференциях по спектроскопа биополимеров на VI симпозиуме по конформационным изменениям биополимеров i

• J-

растворах (Тбилиси, 1985), на II русско-германском симпозиуме по белкоио-нуклеиногиум взаимодействиям (Берлин 1995) и на сек*икарзх Института цитологии РАН.

По томе диссертации опубликовано S статей.

Объем работы.

Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из ееедения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждений собственных исследований, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 1 таблицей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение pasiflfl ММ!Ш1_хрАиа1Ина_и_л репашшгя_о л и гаду* леосоьк

Выделение хроматина из кортикальных нейронов больших полушарий мозга голубя (хроматин мозга), тимуса крыс, эритроцитов голубя, асцитной гепатомы 22А мышей линии СЗНА (асцитный хроматин) и печени тех же мышей, а также из спермиев морского ежа проводилось в соответствии с описанными ранее методиками (Поспелов и др., 1984., Рамм и др., 1986., Осипова и др., 1986,, Сапожникова и др., 1988., Заленская и др., 1981). Процедуры приготовления хроматина из различных типов клеток различались в части выделения ядер.

Растворимый хроматин получали обработкой ядер микрококковой нуклеазой из расчета 30 единиц на 1 мг ДНК в растворе ТЭ - буфера (5 мМ трис-НС1, pH 7,5, 1 мМ ЭДТА) содержащем 0,1 мМ PMSF. Для разделения нуклеосомных фрагментов гидролизат ядер центрифугировали в линейном градиенте сахарозы (5 - 20 %) в течение 17 часов при 25000 об/мим в роторе "С-30* ультрацентрифуги Ж-Р2 (СССР) при 4° С. Для исследования спектров кругового дихроизма из сахарозного градиента брали отдельные фракции или смесь фракций с определенным числом нуклеосом, имеющих идентичные спектральные параметры при всех условиях.

Хроматин из плаценты и эмбриональной печени человека (абортивный материал) получали сходным образом.

Для определения величины нуклеосомного повтора проводили электфорез ДНК нуклеосом в агарозном геле. В качестве реперз использовали pst 1 фрагменты ДНК

фага >. Гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали в ультрофиолетовом свете. При исследовании хроматина сателита 3 человека ДНК из геля переносили на нитроцеллюлоэные мембраны и проводили гибридизацию по Саузсриу. В качестве зондов использовали клонированные в плазмидзх фрагменты ДНК сателлита 3 человека размером 1800 п.н. и 360 п.н., меченные о,гР методом случайного праймера.

МотодлйУговохв_аихмизмв_(КДЬ.

Спектры КД измеряли на регистрирующем спектрополяриметре - дихрографе 'Сзгу-6003 CD" (Varían, Швейцария) в области 210-310 нм в кварцевых кюветах с длиной пути в 1 см при 20° С. Величину молярной эллиптичности в град см1 /дмоль рассчитывали на средний вес нуклеотида в области 250-310 нм и на средний вес пмимокислотного остатка в области 210-250 нм после вычитания из спектра КС муклеосом вклада ДНК.

Спектры КД олигонуклеогомных фрагментов хроматина измеряли в ТЭ - буфер« при различных концентрациях NaCt. Наличие агрегации контролировали по мутност» растворов, которая характеризовалась отношением, оптических плотностей раствора npt 320 и 260 нм (ts¡2o /А;м). Концентрацию ДНК в препаратах олигонуклеосом определял) по поглощению при 260 нм. исходя из соотношения Агвэ =20 для 1 мг ДНК Концентрацию белка в препаратах олигонуклеосом определяли по методу Хартри поел* тщательного диализа препаратов против деионизованной воды.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Величина нуклоосомного повтора._как_йаноаноя_«йукхурав

х ар а кгер исхика_хрлг м атна^.

Основной структурной характеристикой нуклеосомного уровня органиэаш хроматина является величина повторяющегося элемента ДНК (нуклеосомного повтора), есть усредненная длина участка ДНК, приходящаяся на структурную единицу нуклеосому. Тот факт, что различные ткани одного и того же организма мог обнаруживать различную величину нуклеосомного повтора, которая иногда изменяет также в процессе дифференцировш ткани (Cornpton et al., 1976; McGhee and Felsenfe

-71980), указывает на го, что этот аспект структуры хроматина имеет определенное функциональное значение.

Величины нуклеосомных повторов для ясех исследованных нами типов хроматина указаны в Табл. 1. Из приведенных в таблице значений в рамках настоящей работы определялась величина нуклеосомного повтора хроматина асцитной гепатомы 22А. Полученная величина 187±2 п.н. отличается от нуклеосомного повтора тотального хроматина нормальной печени мышей линии СЗНА, равного 196\3 п.н. Уменьшение величины нуклеосомного повтора в случае асцитной гепатомы, являющейся результатом действия химического канцерогена ортоаминоазотолуола, отражает определенной переустройство хроматина печени здоровых животных в результате дедифференцировки клеток печени при их злокачественной трансформации.

Нами также получены данные о том, что после частичной гепатэктомии величина нуклеосомного повтора хроматина регенерирующей печени в период относительно высокой пролифератиеной активности не изменяется по сравнению со здоровой печенью. Следовательно, изменение этого параметра в хроматине клеток асцитной гепатомы характеризующихся также высоким уровнем пролиферации, на яаляотсч реэультатомпростого изменения пролиферативной активности клеток печени. Эти данные согласуются с данными работы (Sperling and Weiss, 1980), где для клеток в культуре также показано, что величина нуклеосомного повтора хроматина коррелирует с характером дифференцировки клеток, а не с уровнем их пролиферативной активности.

Давно известна обратная корреляция между величиной нуклеосомного пооторч о хроматине и уровнем его транскрипционной активности. Такие экспериментальные данные получены как для тотальных препаратов хроматина (Morris, 1976), так и для хроматина о области индивидуальных генов (Villeponteau et а!., 1992). Исследованные нами типы хроматина (Табл. 1) также укладываются в рамки этого представления. С целью получения дополнительной информации о соотношении этих двух параметров, позволяющих связать структурные и функциональные характеристики хроматина, была предпринята попытка сравнить величину нуклеосомного повтора тотального хроматина и гетерохроматина.

Были определены величины нуклеосомных повторов тотальных хроматинов из плаценты человека и из эмбриональной печени человека, а также нуклеосомные повторы хроматина сателлита 3 человека (СЧЗ) в собтаве этих тканей. Микрококковая нуклеаза выявляет в тотальном хроматине плаценты типичный нуклеосомный повтор 196±б п.н., что в пределах ошибки совпадает с нуклеосомным повтором эмбриональной печени -

ОБЪЕКТ Нуклео-сомный повтор (п.н.) Длина линкер- ной ДНК (п.н.). (•) Ионная сила (мМ) Длина ДНК ассоциированной с октамером гистонов.(п. .нК"). Лабильность нуклеосомной ДНК при изменении ионной силы {мМ"') С"') Угол между входом и выходом ДНК с нуклеосомы (град.) (••*)

Асцитная 187 42 5 120 0 160

гепзтома 22А 45 120 160

Мозг 165 20 5 140 1.5 10* •110

голубя. 45 150 -70

Печень 198 53 5 158 2.7 ю;® -40

мыши. 45 177 50

Тимус 196 51 5 168 1.3 10"' 0

крысы. 45 178 50

Эритроци- 210 65 5 163 2.1 10 3 •10

ты голубя 45 181 70

Сперма 5 150 4.6 10 3 -70

морского 248 103 25 174 40

ежа 55 150 3,2 10'3

Таблица 1.*- Здесь имеется в виду разность между размером нуклеосомноп повтора и длиной ДНК коровой частицы (145 п.н.)

** - Длина ДНК ассоциированной с октамером гистонов определялась нами и спектров КД как ДНК имеющая третичную, структуру левой спирали. Точност определения ± 5 п.н.

*"*- Угол между входом и выходом ДНК с нуклеосомы рассматривается из точк1 в центре нуклеосомы. Точность определения ± 20°

•***- Лабильность нуклеосомной ДНК измеряется как относительное (к величин! нуклеосомного повтора) изменение длины ДНК ассоциированой с октамером п< отношению к соответствующему изменению ионной силы раствора.

193±6 п.и. Посла гибридизации с зондом СЧЗ оралось, что нуклеосомный пой юр хроматина сателлита 3 человека составляет 161±8 п.н. в плацента человека и 1ЗД!8 п.н. в эмбриональной печени. Несмотря на довольно большую величину ошибок, рнэгмчия между размерами повторов статистически значимы. Насколько нвм изйестно, представленные здесь данные о различной величине нуклеосомного повтора в области гетерохроматина для двух разных тканей одного организма (тем болен, характеризующихся одинаковым тотальным нуклеосомным повтором), являются приоритетными.

- За редким исключением, касающимся клеток зародышевого пути и, возможно, заннего эмбриогенеза, хроматин, образованный на сателлитных ДНК, транскрипционно неактивен. Тем более это относится к гетерохроматину. И тем не менее, полученные'нами значения нуклеосомного повтора на сателлитной ДНК значительно меньше, чем в тотальном хроматине. Это согласуется о литературными данными для хроматина ;ателлита I в клетках печени крысы, который имеет нуклеосомный повтор 185 п.н., чтп приблизительно на 10 п.н. короче, чем у тотального хроматина (Omori et al., 1980). Можно предположить, что, так как управление транскрипцией с гетерохроматина не требуется, эеличина его нуклеосомного повтора определяется иными требованиями, связанными с эсобенностями его функционирования, например, характером структурной организации иест стабильного прикрепления хромосом к ядерной оболочке в центромерных и/или геломерных областях хромосом, где преимущественно локализуется сателлитная ДНК Razin et ai., 1985).

Применение-метода квугопого... . _дихйдизш1__ддя_и qs лад он али я

Метод КД может, быть использован для характеристики конформационного состояния ДНК в хроматине, благодаря высокой чувствительности положительной полосы КД 8 области 250-310 нм к параметрам двойной спирали ДНК и отсутствию вклада белков в спектры КД хроматина в этой области. Отрицательная полоса КД ДНК с максимумом при 245 нм остается неизменной в широком Диапазоне условий. Этот факт позволил Хельму и Хьянгу (1975) предложить способ оценки вторичной структуры гистонов в составе хроматика по их спектрам, полученным после вычитания из спектра КД хроматина вклада ДНК в области 210-240 нм, В нашей работе метод КД используется

■ и -

X, нм

Рис. 1. Спектры КД препаратов хроматина в ТЭ буфере, выделеных из (1) - мозга голубя (2) - асцитной гепатомы 22А, (3) - тимуса крысы, (4) - печени мышей линии СЗНА, (5) эритроцитов голубя (Осипова и др., 1986), (б) - спермиев морского ежа. Реперньм спектры КД: (7)-ДНК и (8) - коровые частицы различных хроматинов.

для характеристики конФсрмационного состояния как ДНК, так и гистонов а составе различающихся по транскрипционной активности хроматинов.

Известно, что ДНК в составе олигонуклеосом характеризуется наличием дпу.< типов участков: развернутой линкерной ДНК, не имеющей жесткой третичной структуры, и компактных участков ДНК минимальной нуклеосомы (нуклеосомного кора), свернуты* на поверхности октамера гистонов в регулярную левую суперспираль. В то же щ>-мч показано, что спектры КД свободной ДНК отличаются от спектров КД ДНК в составе коровых частиц нуклеосом. Спектры ДНК олигонуклсосом занимают промежуточно*) положение между этими крайними состояниями, поскольку они представляют результат суперпозиции спектров линхерной ДНК и ДНК в составе коровых нуклеосомных частиц. Это позволяет оценить в составе нуклеосомы долю развернутой ДНК и 'ДНК, ассоциированной с октамером гистонов.

После вычитания вклада ДНК из спектров КД олигонуклеосом расчет вторичной структуры белков производился по реперным спектрам. Следует отметить, что, поскольку гистоны являются достаточно специфическими белками, имеющими в сао?м составе, помимо глобулы, большой неглобугярный участок, то проблема выбора реперов для них чрезвычайно сложна. В качестве реперов для «-спиральной конформзции и Р-структуры использовали спектры, приведенные в работе ГринФипьд;1 (1969), репер для (З-изгибов взят из работы Обера (1976), за репер структуры вытянутой левой спирали (ВЛС) типа поли-1.-пролин II приняли спектр КД гистона Н1 тимуса теленка в воде при рН 3 (Baker, 1976). В некоторых случрчх использовались спектры, приведенные в работе Болотиной (1980). Используемые реперы можно считан-, линейно независимыми функциями, поскольку спектры этих типов вторичных структур достаточно сильно различаются. В качестве расчетной области обычно использовался диапазон от 240 до 210 нм, так как более коротковолновая область находится на краю ■ разрешающей способности прибора и измеряется с меньшей точностью. Дпя приближенной оценки содержания а-спиральной конформации использовалась та\;те амплитуда отрицательной полосы КД при 222 нм.

С1ЙУК1УRtlQS. С P СTОЯЛИб-ХРАМЯТИH3..ПPИ НИаКО-Й-ЛР-НЛОЙ СИДЙХ

На рисунке 1 представлены спектры КД свободной ДНК в растворе низкой ионной силы (ТЭ-буфер) и ДНК в составе олигонуклеосомных фрагментов шести типов хроматинов: тимуса крысы, мозга и эритроцитов голубя, асцитной гепатомы и печени мышей и спермиев морского ежа в одинаковых условиях в области 250-310 нм, а также спектр КД коровых частиц, идентичный для всех типов хроматина. Видно, что спектры КД ДНК у исследованных хроматинов находятся в интервале между реперными спектрами, в качестве которых использовался спектр свободной ДНК и спектр коровых частиц. Видно, что различия в спектрах КД олигонуклеосомных фрагментов различных хроматинов определяются соотношением ассоциированных с октамором гистонов и развернутых участков ДНК.

При изучении нуклеазных гидролизатов хроматина кроме минимальных нуклеосом (коровых частиц) были обнаружены также мононуклеосомные частицы, содержащие гистон Н1, которые были названы хроматосомами (Simpson, 1978). Хроматосома содержит ДНК длиной 166-168 п.н., что соответствует двум полным супервиткам ДНК вокруг гистонового октамера (Richmond et al., 1984). Присутствие гистона Н1 стабилизирует частицы против тепловой денатурации. В хроматосоме не только подавляется низкотемпературный переход, соответствующий плавлению свободной ДНК, но и увеличивается температура правления ДНК в составе коровой частицы (Simpson, 1978; Cowman and Pasman, 1980). Эти и другие данные говорят о том, что связь ДНК с белком более стабильна в лроматосоме чем в нуклеосомных коровых частицах, в которых ДНК не образует двух полных витков вокруг октамера гистонов.

На основании наших данных мы предполагаем, что а различных типах хроматина размер фрагмента ДНК, ассоциированного с октамером гистонов, варьирует в зависимости от особенностей состава гистонов и величины ионной силы.

Используя данные о величине нуклеосомного повтора ДНК данного хроматина и раскладывая экспериментальный спектры КД по реперным, можно оценить длину ассоциированных с октамером гистонов и развернутых участков нуклеосомной ДНК. Результаты таких оценок для шести типов перечисленных ранее хроматинов приведены в таблице 1.

Качественно уже из рисунка 1 видно, что при низкой ионной силе, что соответствует в рамках наших предположений, декомпактизованному, активированному хроматину, наибольшей величиной амплитуды положительной полосы КД в максимуме

обладают олигонуклеосомы хроматина спермиев морского ежа, характеризующиеся наиболее длинным линкером. Относительное содержание ассоциированной с октамором гистонов ДНК в этом хроматине должно быть наименьшим. Однако такого качественного подхода оказывается недостаточно, т.к. такие различные по транскрипционной активности хроматины, как хроматин мозга голубя и тимуса крыс, различающиеся длиной линкера, имеют идентичные спектры КД. Как видно из таблицы 1, размеры участка ДНК, ассоциированного с октамером гистонов, в этих хроматинах сильно различаются. В олигонуклеосомных фрагментах тимуса крыс длина участка нуклеосомной ДНК. ассоциированного с октамером, превышает размеры ДНК коровой частицы и соответствует двум полным виткам суперспирали ДНК на поверхности нуклеосомы. Это свидетельствует о наличии хроматосомных структур в этом хроматине уже в условиях низкой ионной силы. Такие же структуры наблюдаются и в хроматине эритроцитов голубя (Осипова и др. • 19В6). Размер ассоциированного с октамером участка ДНК в хроматине мозга при низкой ионной силе несколько ниже, чем в нормальной коровой частице, что свидетельствует о ее частичной дестабилизации, т.е. об ослаблении взаимодействий ДНК с гистонами в этих условиях и частичном разворачивании концевых участков коровой ДНК. Таким образом, анализ спектров КД дает существенную информацию о деталях нуклеосомной структуры хроматина.

Более активный хроматин печени не отличается от хроматина тимуса крыс по величине нуклеосомного повтора ДНК. Однако, в растворе низкой ионной силы, 8 отличие от хроматина тимуса, хроматин печени не образует хроматосомных структур. Еще более развернутой структурой обладает опухолевый хроматин асцитной гепатомы, 'который характеризуется высокой степенью транскрипционной и пролиферативной активности. В условиях низкой ионной силы размер компактного участка его ДНК ниже длины ДНК коровой частицы (см. таблицу 1), что свидетельствует о частичном .разворачивании нуклеосом этого хроматина. Как видно из таблицы 1, частичное разворачивание коровой ДНК является особенностью транскрипционно-активных хроматинов. Способность к разворачиванию коровой ДНК может обеспечивать конформационную лабильность этих хроматинов, необходимую им для активного функционирования. В умеренно активных и неактивных хроматинах такого разворачивания ДНК коровых частиц не происходит. Напротив, часть линкерной ДНК оказывается дополнительно навернутой на белковый кор нуклеосомы, что в случае

хроматинов тимуса и эритроцитов приводит к образованию хроматосомных структур. Результаты анализа спектров КД хроматина спермиев морского ежа предложенным нами методом свидетельствуют об отсутствии хроматосом в этом хроматине в условиях низкой ионной силы, что согласуется с данными биохимического анализа (Заленская и др., неопубликованные данные).

Существенным фактором стабилизации хроматосомы является ее взаимодействие с линкерными гистонами семейства Н1. В транскрипционно-активных хроматинах мозга голубя и асцитной гепатомы наблюдается уменьшение содержания этих белков, что, очевидно, приводит к отсутствию хроматосомных структур и способствует большей конформационной подвижности хроматина, являющейся, по-видимому, необходимым условием его активного функционирования.

Известно, что длина фрагмента ДНК; образующего один виток суперспирали на пооерхности октамера гистонов, составляет около 83 л.н. Это позволяет по длине участка ДНК, ассоциированного с гистоновым октамером нуклеосомы, оценить величину угла между входом и выходом ДНК с нуклеосомы. Если посмотреть на последний столбец табл. 1, то видно, что точки входа и выхода ДНК с нуклеосомы лежат в случае асцитной гепатомы почти на противоположных сторонах нуклеосомы - угол около 160° , схожая картина наблюдается в хроматине нейронов мозга голубя - здесь угол составляет около 110°. Понятно, что значения этого параметра определяя траекторию линкерной ДНК в хроматине, свидетельствуют о развернутом состоянии хроматиновой фибриллы (невозможности образования компактного зиг-зага) в условиях низкой ионной силы.

ваствора.

Как известно, при изменении ионной силы раствора in vitro в хроматине происходят изменения, которые можно рассматривать в качестве модели процессов компактМзации - декомпактизации хроматина in vivo. Поэтому следующим этапом нашей работы было исследование способности к компактиэации ДНК в составе различных хроматинов при увеличении ионной силы раствора. На Рис. 2 представлены кривые зависимости амплитуды положительной полосы КД при 282 нм,

йЦо 3 2

[9]агЮ

ВЦ»

-э

1 Ч1

[е]ию -ю

—

О 20 НО 60 80

[НаСЦтМ

Рис. 2..Зависимость амплитуд положительной полосы КД при 282 нм и отрицательной полосы при 222 нм от концентрации ЫаС1 в растворе для хроматина из различных источников: 1 - мозг голубя, 2 - асцитная гепатома 22А мышей линии СЗНА, 3 - тимус крысы, 4 - печень мышей линии СЗНА, 5 - эритроциты голубя (Осипова и др. 1986), 6 -спермин морского ежа.

3

-1С-

характеризующей структурное состояние ДНК в хроматине от концентрации ЫаС1 в растворе ТЭ-буфера. Седиментационные исследования хроматинов мозга голубя, тимуса крыс и спермиев морского ежа ((^¡роуа е1 а1., 1990; \/огоЬ" еу е( а!.. 1994) показали, что процесс компактизации олигонуклеосомных фибрилл этих хроматинов протекает в общих чертах сходным образом и состоит из двух этапов. На первом этапе увеличение ионной силы раствора до 0,025 М сопровождается следующими изменениями гидродинамических параметров олигонуклеосом: увеличен;-ем массы на единицу длины и уменьшением длины цепи, приходящейся на одну нуклеосому при неизменном гидродинамическом диаметре. Данные КД, представлс <ные на Рис.2 показывают, что амплитуда положительной полосы КД для всех хроматинов, кроме асцитной гепатомы понижается при увеличении ионной силы раствора, что свидетельствует об уменьшении доли 1 развернутой свободной ДНК в составе нуклеосомы. Амплитуда отрицательной полосы КД, характеризующей структурное состояние белков в хроматине остается.при этом неизменной (Рис. 2).

В транскрипционно активном хроматине мозга голубя размер ассоциированного с октамером гистонов участка ДНК в пределах экспериментальной ошибки соответствует длине ДНК коровой частицы нуклеосомы. Для этого хроматина, сохранившего способность к образованию компактной наднуклеосомной структуры (Осипова и др., 1986), образования хроматосомных структур, характерного для других типов хроматина, не наблюдается. Следует отметить, что хроматин нейронов мозга представляет собой пример крайне транскрипционно активного хроматина, который происходит из ядер с почти полным отсутствием гетерохроматина (АизЮкег е1 а)., 1972) и характеризуется очень коротким нуклеосомным повтором (165 п.н.), совпадающим по величине с размером фрагмента ДНК, необходимого для образования хроматосомы.

Еще более развернутую структуру, полностью лишенную способности к компактизации, имеет хроматин асцитной гепатомы. Высокая транскрипционная и пролиферативная активность этого хроматина объясняют частичное разворачивание ДНК его коровых частиц.

' В хроматине, выделенном из печени мыши, хроматосомная структура не наблюдается при низкой ионной силе, но появляется при 45 мМ ЫаС1.' Хроматин спермиев морского ежа будет рассмотрен несколько позднее. В хроматине, выделенном из тимуса крысы, который можно рассматривать ' как пример ткани с умеренной транскрипционной активностью, и хроматине, выделенном из эритроцитов голубя,

хроматосомная структура наблюдается как при высокой, так и при низкой ионной силе раствора. Более длинный участок развернутого линкера хроматина эритроишов голубя придает ему большую гибкость, необходимую для более плотной упаковки.

Таким образом, процесс компактизации олигонуклеосомных фибрилл этих хроматинов на первом этапе сопровождается увеличением степени компактности нуклеосомной ДНК за счет дополнительного закручивания линкерной ДНК в левую суперспираль на поверхности гистонового октамера. Степень такого закручивания для разных хроматинов различна. Для характеристики такого рода лабильности хроматина можно рассчитать размер участка ДНК, дополнительно наворачивающийся на гистоновый октамер при Изменении ионной силы (в расчете на мМ). Эти данные, определяющие способность хроматина к компактизации на нуклеосомном уровне, также приведены в Таблице 1.

Обобщая полученные данные, можно заметить, что хроматины, находящиеся в различных функциональных состояниях, отличаются по способности наворачивать ДНК на нуклеосому при компактизации. С одной стороны, это могло бы обозначать, что при закрепленных концах хроматиновой петли в процессе деконденсации в петле будут создаватся различные по величине' торсионные напряжения, которые в свою очередь могут играть существенную роль в реализации данного функционального состояния. Если же посмотреть на это с другой точки зрения, то, при определенном торсионном напряжении в петле менее транскрипционно-активным хроматинам, характеризующимся большими изменениями степени наворачивания ДНК, труднее перейти в декомпактизованное активное состояние.

Второй этап компактизации всех типов хроматина при дальнейшем увеличении ионной силы раствора заключается в образовании суперструктур типа суперспирали или двойной спирали из зигзагообразной цепи нуклеосом (Бавыкин, 1988; Оэ1роуа е1 а1., 1990). Образование наднуклеосомной структуры не сопровождается какими-либо изменениями в спектрах КД (Рис. 2). Особым образом ведет себя хроматин сперииев морского ежа.

Хроматин спермиев морского ежа имеет ряд интересных особенностей. К ним относятся: наличие специфических вариантов гистонов Н2В и Н1 и один из самых

болышх известных нуклеосомных повторов (248 п.н.), что. вероятно, играет важную роль в наблюдаемой в спермиях морского ежа суперкомпактной укладке хроматина.

Несмотря на то, что он имеет по две молекулы гистона Н1 на нуклеосому, в растворе низкой ионной силы этот хроматин не образует хроматосомных структур. Однако уже незначительное повышение ионной силы раствора резко увеличивает степень компактности его ДНК (см. Рис. 2 и Табл.1). Некоторые особенности этого хроматина могут быть связаны с наличием a-спиральных участков в С-концевом домене гистона Н1 (MisselwUz et al.. 1986, Trlebel et al., 1989).

В нашей работе методом кругового дихроизма был обнаружен необычный эффект. В то время, как образование надн^клеосомных структур олигонуклеосомными фибриллами других типов хроматина не сопровождается какими-либо изменениями в' структурном состоянии ДНК и белков, в' хроматине спермиев морского ежа при дальнейшем увеличении ионной силы наблюдается увеличение амплитуды положительной полосы КД и одновременное уменьшение амплитуды отрицательной полосы. Этот эффект не связан с рассеянием света, т.к. мутность исследуемых растворов хроматина, контролируемая по величине отношения Амо /А;во при этом не изменялась.

Данные по КД указывают на уменьшение степени спиральности гистонов в хроматине спермиев морского ежа до значений, соответствующих спиральности гистонов в хроматине тимуса и мозга. Степень спиральности гистонов в хроматине спермиев морского ежа выше главным образом за счет дополнительного a-спирального участка в гитоне Ь1. Поэтому можно заключить, что на этом этапе компактизации происходит разворачивание a-спирального участка , в концевых фрагментах гистонов Н1 спермиев морского ежа. В работе (Misselwitz el al., 1986) было показано, что наличие дополнительного спирального участка вне глобулярного фрагмента в гистоне Н1 из хроматина спермией морского ежа является свойством иглокожих и не обнаруживается в других гистонах Н1 из спермиев морских беспозвоночных , хроматин которых также относится к классу суперкомпактных. Возможно, что более компактное состояние этого белка в хроматине спермиев морского ежа необходимо для размещения двух молекул Н1 мезду двумя, коровыми частицами. В то же время, функционально значимым структурным элементом линкерных гистонов Н1 является • конформация вытянутой левой спирали, обнаруженная в протаминах и высокозаряженных концевых фрагментах гистонов (Рамм и др. 1979, 1983, 1987).

Можно предпложить, что переход из а-спирального компактного состояния в вытянутую левую спираль в длинном С-концевом фрагменте гистона HI хроматина спермиев морского ёжа может является частью механизма, приводящего этот хроматин к суперкомпактному состоянию. Развернутые в левую спираль С-концевые фрагменты гистонов Н1 могут взаимодействовать с функциональными группами ДНК, находящейся на поверхности нуклеосомного кора, скрепляя таким образом суперкомпактные структуры" олигонуклеосомных фибрилл и стабилизируя более компактное состояние хроматина. Результатом такого взаимодействия нуклеосомной ДНК с гистонами Н1 могут быть те структурные изменения, которые отражаются на параметрах положительной полосы КД. Еще одним из возможных объяснений увеличения амплитуды этой полосы ДНК может быть образование изогнутой линкерной ДНК (Осипова и др. 1990) участка правой суперспирали, который тогда будет частично компенсировать вклад левой суперспирали ДНК, образующей нуклеосому. Возможность образования линкером правой суперспирали предлагается в модели 30-нм соленоида с нерегулярно упакованным спейсером (Butler, 1984). Если допустить, что вклады в спектры кругового дихроизма суперспирали ДНК на нуклеосоме и в линкерной петле в расчете на пару оснований приблизительно равны, то размер линкерной петли мог бы составлять от 20 до 50 пар оснований.

В отсутствии однозначной интерпретации наблюдаемого изменения спектров КД можно констатировать следующее: при повышении ионной силы раствора в районе 25-40 мМ NaCI в хроматине спермиев морского ежа на фоне равномерного повышений степени упаковки ДНК, продемонстрированного методом скоростной седиментации (Осипова и др. 1990), происходит структурная

перестройка. сопровождающаяся изменением вторичной структуры гистонов и спиральной симметрии упаковки ДНК. Для более полной характеристики указанного перехода требуется привлечение дополнительных экспериментальных подходов.

Здключениа

Полученные данные хочется обсудить с точки зрения механизмов функционирования хроматина. Для создания необходимого для процесса транскрипции торсионного напряжения в закрепленной петле хроматина у высших организмов предполагается частичное разворачивание ассоциированной с гистоновым октамером ДНК (Bradbury. 1992). Для этого, очевидно, требуется уменьшить константу взаимодействия ДНК с октамером гистонов, что может достигаться In vivo путем модификации гистонов. Ацетилирование, изменяя плотность зарядов в концевых доменах гистонов. может приводить к ослаблению электростатических ДНК-гистоновых взаимодействий и разворачиванию части нуклеосомной ДНК. К сходным результатам . может приводить и убихитинирование гистона Н2А или Н2В, но уже скорее по стерическим причинам. Разворачивание ДНК не только нарушает, хроматосомную структуру, но и должно вызывать некоторую перестройку на уровне хроматиновой фибриллы, так как при этом меняется расположение точек входа и выхода ДНК с нуклеосомы.

Если величина нуклеосомного повтора действительно влияет на величину торсионных напряжений, то было бы интересно выяснить, играют ли торсионные напряжения какую-нибудь заметную роль в функционировании гетерохроматина. И в таком контексте различная величина нуклеосомного повтора сателлита 3 человека в плаценте и эмбриональной печени ставит очень интересные вопросы.

В рамках этой гипотезы можно рассмотреть и связь длины нуклеосомного повтора с уровнем транскрипционной активности. В ткани с более коротким нуклеосомныы повтором фиксированный уровень модификации гистонов в составе нуклеосомы вызовет большее изменение торсионного напряжения за счет более частого расположена нуклеосом на длину ДНК.

Синергично с этим *и влияние образования хроматосомной структуры. Стабилизируя нуклеосому, она препятствует ее разворачиванию при модификацм гистонов и тем самым стабилизирует уровень торсионного напряжения. Поэтому возможность образования хроматосомной структуры и способность к дополнительном) наворачиванию части линкерной ДНК на белковый кор при изменении ионной силь раствора связаны с транскрипционной активностью хроматина. Эта зависимосп приведена на рисунке 3.

-н-

Мы видим, что дпя получения правильного расположения хроматинов в соответствии с уровнем их транскрипционной активности недостаточно использовать какой-либо один из предложенных выше параметров. Так, если ранжировать рассмотренные здесь хроматины по величине нуклеосомного повтора, то хроматин асцитной гепатомы займет промежуточное положение между хроматинами из тимуса мыши и нейронов мозга голубя, причем ближе к первому. При ранжировании по величине изменения накручивания ДНК на нуклеосому при изменении ионной силы раствора хроматин тимуса мыши будет расположен между хроматином асцитной гепатомы и нейронов мозга голубя, а хроматин эритроцитов - между хроматинами нейронов и печени, что также представляется ие сообразным. В то время, как учет, наряду с этим, второго параметра - способности к образованию хроматосомной структуры, позволяет получить на диагонали более адекватное расположение источников хроматина: асцитнач гелатома, нейроны мозга, печень, тимус, эритроциты и спермии. Кажется вероятным, что такое представление результатов не только наглядно, но и отражает реальные механизмы функционирования хроматина.

Лавильность нуклеосомной ДНК • ,. при изменении ионной силы

раствора (мМ"1)

Рис.3 Структурно - функциональные параметры хроматина, выделенного из различнь источников: А - Асцитнай гепатома 22А, М-нейроны мозга голубя, П - печень мыши, Т тимус крысы, Э - эритроцит голубя, С-спермии морского ежа. По оси ординат способность хроматина образовывать хроматосомную структуру в растворе низке ионной силы (два возможных состояния ). По оси абсцис - лабильность. ,Пс лабильностью нуклеосомной ДНК здесь понимается ее способность к дополнительнс ассоциации с октамером гистонов при увеличении ионной силы раствора. Измеряется процентах изменения длины ассоциированой ДНК при изменении ионной силы на ОД1 милимоль.

-1J-

выводы

1. Методом кругового дихроизма показано, что первый этап компактизации всех изученных типов хроматина, за исключением хроматина асцитной гепатомы 22А, происходит за счет увеличения доли нуклеосомной ДНК, ассоциированной с октамером гистонов. Степень такого закручивания ДНК с увеличением ионной силы раствора для разных хроматинов различна.

2. Хроматин асцитной гепатомы 22А мышей линии СЭНА обнаруживает полную неспособность к компактизации, индуцируемой увеличением ионной силы.

3. В исследованной области ионных сил продемонстрировано отсутствие хромаюсомной структуры в хроматинах, выделенных из ядер с высоким уровнем транскрипционной активности (асцитная гепатома 22А мышей линии СЗНА и кортикальные нейроны больших полушарий мозга голубя).

4. Характер компактизации хроматина спермиев морского ежа Strongylocentrolus inlermedius отличается от такового Для не столь комлактизованных in vivo хроматинов. Это может быть связано с особенностями укладки его исключительно длинной лимкерной ДНК.

5. В отличие от других изученных типов хроматина компактиэация хроматина спермиев морского ежа сопровождается изменениями в коротковолновой области спектров КД. Предполагается, что эти изменения связаны с уменьшением спиральности гистонов. соответствующим конформационному переходу в С-концевых фрагментах спермий-специфических гистонов HI из a-спиральной кон формации в конформзцио вытянутой левой спирали.

6. Установлено, что хроматин сателлита III человека образует нуклеосомный иоегор 161+8 п.н. в плаценте человека и 180±8 п.н. в.эмбриональной печени человека в то время, как нуклеосомный повтор тотального хроматина этих тканей составляет 196+6 и 193±6 п.н.. соответственно.

СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

.1. Е. И. Рамм, Г. С. Иванов. В. А. Поспелов, С. Б. Светликоеа, А. Н. Кукушкин. Особенности структурного состояния ДНК в хроматине с коротким линкером// Биофизика, 1988, т.31, вып. 3, стр. 404-408.

2. H.A. Сапожникоаа, Е.И. Рамм, Г.С. Иванов, Л.К. Ткешелашвили. В.И. Воробьев, Сравнительное исследование нуклеосомнЫх частиц хроматина нормальных и опухолевых клеток. Структурные параметры// Молекулярная биология, 1988, т.22, вые. стр. 13451352.

3. H.A. Сапожникова, Е.И. Рамм, Г.С. Иванов, Л,К, Ткешелашвили, В.И. Воробьев. Сравнительное исследование нуклеосомных частиц хроматина нормальных и опухолевых клеток. II Реконструкция, компактизация и ассоциация под действием ионной силы раствора// Молекулярная биология, 1988, т.22. вып. 57 стр. 1353-1358.

4. Е. И. Рамм, Г. С. Иванов, В. И. Воробьев, Исследование информационных особенностей хроматина спермиев морского ежа// Молекулярная биология, 1993г. т.27, вып. 5, стр. 1061-1069.

• 5. Е. И. Рамм, Г. С. Иванов, В. И. Воробьев Исследование особенностей структурной организации хроматина из различных источников// Биохимия, 1993г. т.58, вып. 10, стр. 1604-1615.

Tut Ъ./уГ./-./ОЛ bfyiSs*