Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тканевая специфичность и гетерогенность межнуклеосомных взаимодействий конденсированного и слабо деконденсированного хроматина паренхимных и лимфоцитарных клеток in situ

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Тканевая специфичность и гетерогенность межнуклеосомных взаимодействий конденсированного и слабо деконденсированного хроматина паренхимных и лимфоцитарных клеток in situ"

АКАДЕМИЯ НАУК АРМЕНИИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи УДК 57б.315.42.04:577.152.314].08

КАРАГЕБАКЯН ГАЯНЕ ГЕВОРКОВНА

ТКАНЕВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ГЕТЕРОГЕННОСТЬ МЕШЮГООССМНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ КОНДЕНСИРОВАННОГО И СЛАБО ДЕКОНДЕНСИРО -ВАННОГО ХРОМАТИНА ПАРЕНХИМНЫХ И ЛИМФОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК

in situ

/ 03.00.03 - молекулярная биология /

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1992

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии АН Армении /директор - член-корр. АН Армении, профессор К.Г.Карагезкн/.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

В.А.Иагакян старший научный сотрудник кандидат биологических наук А.Т.Хачатркн

Официальные оппоненты: доктор биологических наук» профессор

Ж.И.Акопкн

доктор биологических наук, профессор ' В.А.Саканян

Ведущее учреждение - Ереванский государственный университет.

Защита состоится " р! " ¿уП^До/ " в ч.

на заседании специализированного совета Д 005,15.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биохимии АН Армении /375044, Ереван-44, ул. П.Севака, 5/1/.

Автореферат разослал " £ " ССсгГя^и " 1992г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН Армении.

Ученый секретарь специализированного совета,

докт.биол.наук, проф. с С С С^С -L

Симонян

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Вопрос об упаковке ДНК в клеточной ядре остаётся одной из центральных проблем современной молекулярной биологии. Данные, накопленные до сегодняшнего дня, позволяют различить, по крайней м§ре, несколько уровней укладки хроматина в ядре - нуклеосомнцй, наднуклеосомный, петли-хромо-меры и митотические хромосомы. Из них хорошо изучен лишь нук-леосомный уровень. К настоящему времени предложено много моделей укладки нуклеосом в основной фибрилле хроматина, однако исчерпывающего описания её наднуклеосомной структуры пока нет. Эти модели можно подразделить на 3 основные группы: соленои-дальныэ, супербидные и спиралеобразного скручивания. Как между этими основными группами, так и между разными вариантами моделей в каждой из них существует множество противоречий и неясностей, требующих скрупулёзного изучения. Одним из важных методических подходов применяемых с этой целью является изучение поведения фибриллы при конформационных переходах. Последние сопрянены с процессами функционирования хроматина и поэтому их исследование представляет важность также с точки зрения понимания процессов транскрипции, репликации, регуляции генной активности при клеточной дифференцировке или патологии и др. Моделирование структуры фибриллы хроматина способствует не только объяснению явлений, связанных с её укладкой, но и самым прямым образом может прояснить процессы, связанные с функционированием' генома.

В изучении структуры хроматина достаточно информативны методы, использующие переваривание неспецифическими нуклеазаыи в условиях in situ с дальнейшим анализом разных компонентов. Две из этих нуклеаз - ДНКаза II и ДНКаза I, обладают способностью выявить конформационные изменения хроматина, происходящие вследствие перестройки взаимного расположения нуклеосом.

Цель и задачи исследований: Цель настоящего исследования заключается в изучении изменений наднуклеосомной структуры хроматина, вызванных варьированием ионной силы среды, создаваемой наличием ионов магния разной концентрации.

Конкретные задачи исследования: а. Выяснение причины возникновения нуклеосомных пиков с нечётными номерами в повторе промежуточного типа на картине фрагментации ДНК.

б. Проварка возможности образования полунуклессокногс повтора на разных типах клаток лимфоцитарного и паренхимного происхождения, .

в. Исследований процесса перехода повтора промежуточного типа з полунуклеосомный повтор в ходе деконденсации хроматина« -

г.' Исследование распределения сайтов атаки ДНКааы X в олигонук-леосомных частицах хроматина. . . . .

Научная новизна и практическая значимость работы; В работе проанализировано поведение хроматина в широком интерзале концентраций ионов магния /от 5 до 0.5 мМ/, обеспечивающего его переходы из конденсированного в деконденсированное состояние. Показано, "что промежуточный тип фрагментации конденсированного хроматина для 6 типов плеток, обозначенного Я+23 , является результатом действия ДНКааы I. Показано отсутствие видовой специфичности для этого типа повтора.

Анализ кинетики деконденсации хроматина при мягких условиях выявил особенности ыежнуклеосомных взаимодействий, приводящих к независимому друг от друга образованию следующих фрагментов хроматина - тринуклеосомнойа«имыетрично2 частицы с диффузным сайтом внутри и симметричной динуклеосомной частицы с равнозначными сайтами атаки ДНКааы I по краям и внутри частицы. Показано, также, независимое поочередное образование трёх "полунуклеосоы-ных" фрагментов ДНК - 1*5 а_, 2,5а и 3.5а . Таким образом, отсутствие непосредственного общего предшественника описанных выше фрагментов указывает на нарушение принятой зависимости предшественник-продукт при нуклеазном гидролизе, т.е. все сайты чувствительны одинаково к нукдеазе, и второе - при переваривании сначала образуются крупные фрагменты, после чего накапливаются более короткие.

Р-евукьтаты настоящей работы свидетельствуют о наличии в хроматине набора сайтов атаки ДНКазы I, различающихся по доступности, и раскрывающихся постепенно, по мере, деконденсации фибриллы. По всей:видимости, существуют несколько тдоов мегнуялео-сонных взаимодействий, формирующих основную фибриллу хроматина» Зое это говорит о том, что структура фибриллы хроматина в клз-гочяса кг.рз кхедг боггее сдожнув организацию, чем это предполагается на ооноза забой другой известной модели.

Ывмъ на данной-згапв имеет теоретическую цэЕаоогь.

^двобсдяя па б о ты; Результаты,, представленные в дизсвргацкк,

дсдлэдьгвагись 'на 1У советско-итальянском симпозиуме "Макромоле-

в функционирующей клетке" /Киев,1984/, на 1У симпозиуме CCF-ФРГ "Молекулярное разнообразив организации и экспрессии ге-нс-уа" ДешнградД985/г на республиканской конференции "Махро-мол-экуви и функционирование «легки" /1реван,1986/, на втором, европейском конгрессе по биологии клетки /Будапешт,1986/, на И всесоюзное симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" '/Черноголова,1987/. , ' ?

Работа апробирована на заседании Учёного Совета ИМБ АН Армении- от 1-ого мая 1992 г о и на заседании спшоовета Д.005.15.01 от 24-ого звэня 1992 г.

Публикации; По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объём диссертации; Диссертация состоит из введения, трёх глав /I - обзор литературы, П - методическая часть, I - результаты исследований и обсуждение/, выводов и указателя литературу. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит 20 рисунков. Библиография включаем 158 наименований литературных источников.

МЕТОДЫ ИССЛВДОВАНИЙ

Ядра выделяли в растворе А /0.25 11 сахарозы, 10 Ш трис-HCI, рН 7.5, 3 мМ MgCI2 , 0.1 мЫ феиилметилсульфонилфторида, 0.2 кМ ЭГТА/ с-обработкой 0.5^ раствором Тритона I-IOO, приготовленным на растворе А.

Нуклеазное переваривание хроматина проводили при 37°С в течение I мин. ДШСазу I добавляли из расчёта 50-700 Вд/ыг ДНК. Реакцию останавливали добавлением додецилсульфата натрия до 1% или 5 мМ ЭДТА при выделении хроматина в раствор. Концентрацию ядер в суспензии и хроматина в растворе ЭДТА определяли спект-рофотометрически.

Ультрацентрафугирование хроматина для его фракционирования проводили в 10-30%-ном градиенте концентраций сахарозы /в растворе 10 мМ трло-HGI, рН.7.5, 2 мЫ ЭДТА/ в роторе С-6-30 ультрацентрифуги К-32М /СССР/»' Содержимое пробирки фракционировали по 0.5 мл и выделяли ДНК.

ДНК выделяли по методу Мармура.

Электрофоретическое исследование ДШС проводили на агароз-ных гелях, используя концентрации от 1.2- до 2% /Серва, Сигма, , Вортинггон, Хеыапол/. В качестве электрофоретического буфера использовали раствор, содержащий 40 ыМ трио-И<31, рй 7.8, 5 utt

ацетата натрия, I мМ ЭДТА. Напряжение определяли из расчёта 2.5 В на I см меяэлектродной среды. Гели окрашивали бромистым этидиеы /2 мкг/мл 10 мин./ и фотографировали на плёнку Микрат-300 через красный фильтр при ультрафиолетовом облучении. Негативы плёнок сканировали на денситометре "У лмроскан" ЖБ в режиме интегрирования.

Электрофорегическое исследование ДНП-частиц проводили в 4.5%-ном ПААГ или сложном геле, содержащем смесь 0,5%-ной ага-розы и 3.5%-ного полиакриламида /отношение акриламид: бисакри-ламид было 19г1/. Электродным и гелевыы буфером служил раствор 10 ыМ трис-борат, рН 8.3, I мЫ ЭДТА. ДНК из фрагментов хроматина элюировали, помещая вырезанные куски геля в раствор с 1%-ньш ДСН и 2 мМ ЭДТА. _

Для характеристики разных кривых денситометрирования, а также пиков одной и той ase кривой нами введены параметры "сила пика" - Р, как отношение площадей злок к значению sTor и "ширина пика" - d, являющейся расстоянием /в условных единицах, заданных прибором/ мевду точками локальных минимумов,прилегающих к данному пику /рис.1/.

__Рис.1. Схематическое изображение денсигограм-мы для иллюстрации принципов вычисления ширины ¡ силы пиков. Ширина пика обозначена буквой d , силу пика - Р, определяли как отношение значенш

лок

к

3тот*

Стрелко]

указывается позиция ¡vi

ср*

В качестве достаточно близкого приближения блок принимали площадь треугольника, составленного точками локального минимума и вершиной пика /АБС на рис.1/. Координаты вершин задавались прибором.

Интенсивность переваривания оценивали определением величины М , как абсциссу позиции на кривой денситометрирования, через которую проведённая вертикальная линия делит площадь интегральной кривой на две равные части. Значение М выражаете;

в парах нуклеотидов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЯ

I, Клеточная специфичность тотального конденсированного хроматина при 3 мМ магния и выше.

Методом нуклеазного переваривания хроматина 1а в^и , ис-зледовали типы фрагментации ДНК в ядрах, выделенных из разных тканей при конденсирующих условиях ионной оилы среды /3 и 5 мМ 1агния/• В аналогичных с нашими условиями экспериментах было -юказано, что хроматин эритроцитов кур расщепляется ДНКазой I ш фрагменты, образующих динуклаосомный повтор ДНК. При тех же 'словиях на хроматине ядер тимоцитов крыс и клеток ОНО продемо-ютрировано образование повтора, как бы промежуточного между [звестными динуклеосомным и нуклеосомным /Поспелов, Светликова, 982/. Здесь появляются пики, соответствующие всем олигонуклео-омам, однако пики электрофоретического разделения с чётными омерами выше пиков с нечётными номерами. Это сближает такой овтор с динуклеосомным повтором эритроидного хроматина, и ав-оры работы предположили, что истинная картина фрагментации ДНК тих клеток тоже может соответствовать динуклеосомному типу, а ики с нечётными номерами появляются в результате действия.зн-огенных нуклеаз, которые отсутствуют в эритроцитах.

Нами была поставлена задача проверить происхоядение этих зчётных пиков и обоснованность такого предположения. Для, по эзможности, полного подавления активности ядерных эндонуклеаз, з которых наиболее активной в исследованных нами тканях явля-гся Сэ,Ме -зависимая эндонуклеаза, в процессе выделения ядер в )став буферов добавляли ЭГТА до 0.2 мМ для связывания следовых шмесей Са . В качестве маркеров использовали наборы фрагмен->в ДНК, выделенных из инкубированных в течении 15-30 мин.ядер.в шсутствии Са2+, т.е. стандартный нуклеосомный повтор.

Гидролиз ДНК ДНКазой I инициировали добавлением СаС12 до ,2 мМ непосредственно перед инкубацией. Это, естественно, придало к активизации и эндогенной нуклеазы. Для сведения к ми-шуму возможное воздействие эндогенной нуклеазы мы уменьшили юмя инкубации до I минуты. Как следует из дорожки "Ки", за ■о время эндогенные нуклеазы не успевают вызвать заметной дег-дации хроматина. /См.рис.2/.

Рис.2. Электрофорез ДНК в 2%-ном ага-розном геле. М - ДНК хроматина печени крысы, переваренной эндогенной Са,МБ -зависимой эндонуклеазой.Ки- контрольная дорожка; ДНК выделяли из ядер, инкубированных при 37°С в течение I мин. после добавления СаС^ до 0,2 ыМ. На эту дорожку наносили вдвое большее количество ДНК с целью обнаружения самых малых количеств низкомолекулярной ДНК. I и 2, соответственно, ДНК из ядер-печени крысы, переваренных ДНКазой I при 5 и 3 м!Д магния. Стрелки показывают позиции фрагментов, кратных длине нуклеосомы.

Таким образом, предпринятые нами меры позволяют рассматривать полученные картины фрагментации ДНК в ядрах как результат действия исключительно ДНКазы'1. Из рис.2 видно, что под действием ДНКазы I хроматин ядер, выделенных из печени крысы /а также из почек, селезёнки и тимуса крысы/ фрагментируется по "промежуточному" типу. Мы предложили назвать этот тип повтора к+2к , т.е. повтор, кратный длине нуклеосомы, в котором пики с чётными номерами доминируют над нечётными /аналогично, обозначения № , 2к и 1/2"К соответствуют нуклеосомному, динуклеосомному и полунуклеосомному повтору/. Такая картина фрагментации ДНК, т.е. повтор и+2и наблюдается как при 3 мЫ, так и при 5 мМ магния, рис.1, дорожки I и 2, рис.5, кривые I, 2.

Чтобы ответить на естественно возникающий вопрос, является ли фрагментация ДНК по типу И+21Г особенностью укладки хроматина клеток млекопитающих, мы проведи переваривание ядер, выделенных из тимуса цыплят /рис.3/. Как видим, и в этом случае обнаруживается повтор типа и+2К . С учётом того, что для ядер эритро-идных клеток характерен повтор типа 2Н , можно заключить, что тип фрагментации хроматина ДНКазой I обусловлен особенностями структуры хроматина разных клеток. Видовая специфичность при этом отсутствует.

Кроме воздействия эндогенной нуклеазы, ещё одной возможной причиной образования повтора^ Н+2Ы могло явится то обстоятельство, что изученные нами ткани состояли из нескольких типов клеток, и не исключалась возможность наложения двух типов фрагментации - нуклеосомного и динуклеосомного, если для разных клеток, составляющих ткань, характерны эти разные повторы. Для выяснения этого вопроса мы провели переваривание ядер, выделенных, по возможности, из гомогенных популяций. Такими послужили лимфоциты, очищенные до гомогенности с помощью Г1со11-рачие , периферической крови крыс. Хроматин этих клеток также расщепляется ДНКазой I по типу Н+2И , рис Л. Этот результат даёт основание полагать, что повтор типа N+213 не является результатом наложения двух разных повторов, а отражает реальность определенного способа укладки хроматина в конкретных типах клеток.

М Ки 5мМ 3 мМ

Рис.3. Электрофорез ДНК хроматина тимуса цыплёнка, переваренного ДНКзой I при 5 и 3 мМ магния, в 1.8^-ном агарозном геле. Обозначения те же, что и на рис.2. Повтор соответствует типу Н+2Н .

Рис.4. Денситограмма электрофо-ретического разделения ДНК из лимфоцитов селезёнки - I, и.периферической крови - 2, крысы; расщеплённой ДНКазой I при 3 мМ магния. Стрелкой показан пик, соответствующему фрагменту ДНК около 500п,»н." 3 - маркер, представляющий повтор на дорожках

' Кроме случая характерного для типичного конденсированного состояния хроматина, когда проявляется повтор типа Н+2Н , на рис.4 представлена электрофореграмма, где.в наборе фрагментов ДНК наблюдаются пики, соответствующие половине длины нуклеосомы и её кратные, образующие повтор типа 1/2 N . Появление и поведение полунуклеосомных пиков подробно рассмотрены, в следующей главе. Здесь же отметим важную особенность повтора ДНК лимфоци-• тов крови: при 3 мМ магния наблюдается пик ДНК длиной около 500 п.н., а из "этого следует, что здесь, по крайней мере до уровня 600 п.н. присутствует повтор типа 1/2 N. Фактически, в ядрах лимфоцитов переход промежуточного повтора на полунуклео-сомный может начаться уже при 3 мМ магния. Вероятной причиной этого явления, на наш взгляд, то, что для хроматина этих клеток концентрация магния в 3 мМ представляет "точку перехода" между двумя его состояниями, соответствующим двум картинам фрагментации. По этой причине хроматин, лимфоцитов при этой концентрации магния может находится как в конденсированном, так и в деконде-нсированном /возможно, частично/ состоянии.

Таким образом, результаты этих опытов позволяют с достаточной уверенностью утверждать, что существуют 2 разновидности тотального хроматина, различающихся по картине фрагментации ДНКазой I при концентрации магния 3 мМ и выше. Одна из них -динуклеосомная 2N , характерна для эритроидных клеток птиц и рыб, и спермы морского ежа,_другая - N+2N ,по крайней.мере,для шести разных типов клеток, исследованных в настоящей работе.

Структурные особенности хроматина, лежащие в основе этих различий остаются невыясненными. Возможно, они определяются укладкой основной фибриллы в структуры более высокого порядка; такая гипотеза впервые выдвигалась в отношении повтора ~2н /Хачатрян и др. 1985/.

2. Анализ картины фрагментации ДНК при мягкой деконденсации хроматина.

2.1. Особенности электрофореграмм_ДНК из конденсированного и деконденс_и£ованного хроматина,^е^ева^енных ДНКазой L.

Нами прослеживался процесс образования полунуклеосомного повтора / 1/2 и / в условиях постепенной деконденсации хроматина в зависимости от степени переваривания.

Анализ кривых и пико"в ДНКазного перевара при их сравнении с "каноническим" нуклеосомным повтором, полученным расщеплением

:роматина Ca,Mg - зависимой эндонуклеазой, выявил ряд особенно-:тей, представленных на рис.5., где показаны типичные кривые, :арактеризующие расщепление полностью конденсированного /при ■ мМ магния и более/ и полностью деконденсированного /при I мЫ [агния и менее/ хроматина ДНКазой I in situ.

Рис.5. Типичные денситог-рамыы, характеризующие результат переваривания хроматина эндогенной нуклеазой и ДНКазой I in situ .

1 - конденсированный хроматин, ДНКаза I, М =1250п.н.

2 - то же, цСр#= 400 п.н.,

3 - деконденсированный хро- • матин, ДНКаза I, licp> = = 450 п.н.,

4 - перевар эндогенной нуклеазой.

Прежде всего отметим различия между нуклеосомным повтором кривая 4/ и повтором N+2H конденсированного хроматина, рас-вплённого ДНКазой I /кривые I и 2/. Во-первых, нуклеосомный овтор имеет более выраженные пики, степень выраженности кото-ых понижается равномерно. Второе отличие, характеризующее ЙКааныйповтор, заключается в его "динуклеосомной" природе. В тличие от нуклеосомного повтора параметр Р не убывает с рос-ом номера пика - пики 2п- и, особенно, 4 а явно выражены лльнее, чем это было бы в случае равномерного убывания. Треть-i, очевидным отличием между двумя повторами является наличие в Разном переваре пиков 0.5 п /всегда/, 1.5п /нередко/ и ,5а /иногда/.

Сравнение кривых ДНКазного перевара конденсированного и ¡конденсированного хроматина выявляет ряд различий менду ними, ¡рвое наиболее наглядное отличие - ато, естественно,"полунукле-:омныЙ" характер /тип повтора 1/2N/кривой 3 на рис.5. Второе :личие - более низкие значения Р соответствующих пиков де->нденсированного хроматина по сравнению с конденсированным на • швых денситометрирования. Наконец, при деконденсации аналойным пикам соответсвуют фрагменты ДНК, короче ДНК конденсиро-

ванного хроматина. Как мы полагаем, это обусловлено явлением "откусывания" концов ДНК. ,

Динуклеосомный тип повтора сохраняется и после формирования полунуклеосомного повтора: пики в области 4п оказываются крупнее, чем пики в области нечётных номеров нуклеосом. Такой повтор мы предложили обозначить 1/2 N+2N.

Теперь уже цель настоящего исследования можно сформулировать как прослеживание за ходом превращения кривой I на рис.5 в кривую 3.

2.2. Анализ пиков, соответствующих "полунуклеосомной" длине_ДНК.

п • Кинетика изменения силы пика 1.5 п показывает, что он обнаруживается при всех исследованных нами концентрациях магния. При 2 и 1,5 мМ магния значение Р для.пика 1.5п в зависимости от М меняется беспорядочно, всегда оставаясь выше значения 0.01. При 3 мМ магния этот пик наблюдается почти всегда, рис.б, имея бифазическое поведение в зависимости от степени переваривания, что на наш взгляд, объясняется тем, что при сильном гидролизе происходит рост также и пиков, соседних с 1.5и - просто ввиду накопления материала в низкоыолекуляр-ной области, что выражается как видимое повышение фона вокруг 1.5 п.

Пик ДНК длиной 2.5 п. Как видно из рис.6, в хроматине печени крысы в присутствии 3 мМ магния сила пика 2.5п , независимо от значения редко превосходит значение 0.005 - фоновое

значение, и, следовательно, можно заключить, что в присутствий 3 мМ магния пик 2.5п отсутствует. Сказанное верно и для хроматина клеток', почек и тимуса. Таким образом, свойство хроматина периферических лимфоцитов образовать пик 2.5п в присутствии 3 мМ магния остается пока уникальным.

Совсем другая картина обнаруживается при концентрации магния 2 мМ и ниие /рис.7/. Видно, что уже.при слабом переваре сила пика 2.5 п достоверно превышает фоновое значение. А в области

1000 п.н. и ниже начинается более интенсивный рост Р. Очевидно различие в кинетике роста Значения Р при 1.5 мМ М§+ в хроматине клеток печени и тимуса. Таким образом, тезис о клеточной специфичности формирования, пика 2.5 п получает дополнительное подтверждение.

- 1Г-

о |5> • 55п

ЗмМ ч,"

1500 М.ЛЬр) .

Рио.6. Зависимость силы пиков 1.5п и 2.5п от степени переваривания ДНКазой I при 3, мМ магния.

МО ¡ООО 13Ео

Рис.7. Зависимость рилы пика 2.5 п от степени переваривания ДНКазой I при 1.5 и 2 мМ магния, для печени и тимуса крыс.

Вышесказанное свидетельствует о том, что описанные пики не возникают параллельно и, следовательно, не имеют непосредственного общего предшественника.

Пик ДНК ¿линой_3_.5_п. Анализ ДНКазного переваривания в условиях мягкой деконденсации /1.5-2 мМ магния/ выявляет принца-, пиальное различие между пиками 1.5П и 2.5 п с одной стороны, и 3.5 а - с другой. Если первые два в результате деконденсации-переваривания "растут" между соседними пиками-,-; то 3.5п , как видно из рис.8, возникает путём расщепления конденсироваН-аого хроматина.

Длина пика 3.5п 'и разность длин его и пика вариабельны /рис.8/. Возможно, что пик 3.5п образуется путём "отку-зывания" концов определённой структуры. Это, в свою очередь, указывает, что пик 3.5п не может иметь непосредственного общего предшественника с 2.5П или 1.5а , т.е. не возникает одновременно в результате одного акта расщепления.

Дополнительным доказательством, выступающим против существования непосредственного общего предшественника выступает £акт о том, что любой из пиков 2.5п и 3.5п может присутство- • вать в отсутствие другого. Такие примеры, что довольно редки, демонстрируются на рис.9. '

То обстоятельство, что пик 3.5п возникает в результате

раздвоения пика 4 п, наводит на представление о гетерогенности последнего. Это предположение проверяли путём сравнения зависимости ширины пиков от их номера для гидролизатов хроматина эндогенной нуклеазой и ДНКазой I /рис.10/. Видно, что ширина пиков ДНКазного гидроливата закономерно снижается с ростом номеров пиков, включая пик 2 п.

Рис.9. Образцы ДНКазного перевара, демонстрирующие независимое образование пиков 2.5аи3.5а, фиксированные при 2 мМ магния.

Рис.8. Набор кривых переваривания хроматина печени ДНКазой I в присутствии 2 и 1.5 мМ магния. Пунктирами обозначены позиции рестрик-ционных фрагментов, указанной длины. Вертикальные чёрточки соответствуют позициям пиков 3.5п и 4а . В скобках приведены значения М , длины ДНК пика 4п и длины ДНК 3.5п .

I - /620,760,695/, 2 - /840, 780,7X0/, 3 - /1150,760,682/, 4 - /910,775,685/.

тем, ширина пика 4п явно выступает из этой закономерно-с:'л. Таким образом, описанные три пика формируются независимо д;^г от друга. Более того, пик 1.5п появляется раньше, чем пи-

ки 2.5 п и 3.5 п , а формирование 2.5 п предшествует образование пика 3.5п . Это говорит о том, что при использовании ДНКазы I нарушается общеизвестная зависимость предшественник-продукт при гидролизе, когда при переваривании сначала образуются крупные фрагменты, после чего накапливаются более короткие. Второе отклонение от общепринятой схемы - наличие сайтов атаки ДНКазы-1 различной чувствительности /на это указывают "динуклеосоыная" природа ДНКазного перевара и кинетика "полу-нуклеосомных" пиков/.

п

Рис.10. Зависимость значения ширины пика от номера пика для конденсированного хроматина, переваренного ДНКазой I /15 опытов/ и эндогенной нуклеазой /12 опытов/.

1 I 3 4 5 « ' Л

Вышеописанные явления свидетельствуют, что в образовании ДНКазных повторов вовлечены более сложные структуры, чем пара нуклеосом, образующая структуру зиг-заг. Здесь, по крайней мере, нами обнаружены три таких комплекса нуклеосом, которые являются предшественниками трёх описанных "полунуклеосомных" фрагментов. -

3. Гетерогенность, мекнуклеосомных взаимодействий основной фибриллы хроматина, выявленная в условиях мягкой деконденсации.

Для более детального анализа меинуклеосомных взаимодействий в составе хроматина и распределения сайтов атаки ДНКазы I, раскрывающихся при слабой деконденсации, были проведены исследования ДНП-частиц, выщепленных ДНКазой I. Последние разделяли электрофорезом в смешанном акрилаыидно-агарозном геле. Анализировали фрагменты ДНК, выделенные из частиц хроматина, декон-

денсированного при 2 мМ магния, с электрофоретической подвижностью, соответствующей классическим moho-, ди- и тринуклеосомам /рис.11/. Буквы а, б и с соответствуют трём уровням переваривания хроматина. Фрагменты ДНК, содержащиеся в моно- и динукле-осомных частицах показывают, что мононуклеосома - простая частица, которая могла образоваться прямой атакой по обоим концам

с. а Рис.II. Электрофоретическое

разделение фрагментов ДНК в 2%-ном агарозном геле. Буквы а,б,с условно соответствуют степени переваривания хроматина ДНКазой I при 2 мМ магния. Moho-, ди- и тринуклеосомные частицы фракционировали в сложном геле ПААГ+агароза, откуда элюировали представленные на рисунке наборы фрагментов ДНК. Буквы М, Д и Т соответствуют наборам фрагментов ДНК и:

К. »4*

М д т

moho-, ди- и тринуклеосомных частиц.

Содержащиеся в динуклеосомной частице моно- и димерные фрагменты ДНК показывают, что эта частица симметрична, с идентичными сайтами по краям и внутри. Набор фрагментов ДНК из тринуклеосомных частиц показывает, что в начале переваривания кроме основного фрагмента наблюдаются канонические ди- и мономерные фрагменты, во второй тринуклеосомной частице уже наблюдается больший фон ниже димера, и мономерная ДНК выглядит гетерогенной. H¡ поздней стадии переваривания, естественно, материал начинает,-накапливаться в более низкомолекулярной части. Аналогичные исследования наборов фрагментов ДНК из' олигонуклеосом, образован ных обработкой хроматина Са, Mg - зависимой эндонуклеазой, где отсутствуют внутренние разрывы, показали, что в ДНКазном переваре фрагменты, содержащиеся ниже ДНК полной длины не являются загрязнением более мелких частиц, а реальные компоненты ди- и тринуккеосом. На основании вышеописанного представляется /рис. 12/ схематическое распределение сайтов атаки ДШСааы I в три-, ди- и ыононуклеосомных частицах» В отличие от двух последних, грянуклеосоыа - асимметричная-частица, и один из внутренних

сайтов имеет диффузную природу, "т.е.- по-просту участок доступности сайта шире, чем остальные /зона чувствительности составляет примерно IOO п.нУ.Такое распределение сайтов внутри три-нуклеосомы /рис.12,а/ показывает, что симметричная динуклеосо-ма с идентичными сайтами атаки /рио.12,6/ не может быть продуктом деградации тринуклеосомы.

Рис.12. Схематическое пред-■ ставление характерных сай-m тов атаки ДНКазы I в трину-

клеосомной - а, динуклеосо-мной - б и мононуклеосомной-о, частицах хроматина, выще-юо ъР пленных при 2 мМ магния.

ж;

УШГЛ

Ж.

Ещё одной важной особенностью ДНКазного перевара, обнаруженного при анализе частиц, является отсутствие фрагментов "полунуклеосоыной" длины в описанных частицах /рис.II/. Это свидетельствует о том, что для образования полувуклеосомного повтора необходима полинуклеосомная цепь не короче тетрануклео-сомы. -

Результаты, представленные в двух последних частях работы показывают, что сайты атаки ДНКазы I в хроматике различны по чувствительности, а их распределение говорит об организации хроматина в более сложные структуры, чем зто Представляется в ныне принятых моделях с гетерогенными мекнуклеосомными взаимодействиями.

Итак, полученные нами' результаты позволяют сделать следующие заключения:

I. Конденсированный хроматин б типов клеток, инее! сайты атаки ДНКазы I во всех нуклеосомах, и каждая вторая из н:-х более чувствительна.

2. При постепенной деконденсации хроматина раскрываются и другие сайты, и для этого случая картина их распределения следующая /рис.13/.

I тип сайтов приводит к образованию динуклеосомной частицы с равнозначными сайтами по краям и внутри /рис.12,б/. Сайты под номером 2 образуют тринуклеосомвую частицу с внутренним диф-

фузным сайтом.3. Сайты 4, 5 и 6 соответственно приводят к образованию "полунуклеосомных" фрагментов с длиной ДНК 1.5п , 2.5п и 3.5п .

1. Конденсированный хроматин паренхимных и лимфоцитарных клеток

I фрагментируется ДНКазой I по промежуточному типу, обозначенному нами Н+2Н, Характерной особенностью зтого повтора является превалирование чётных номеров нуклеосомных пиков над нечётными.

2. Особенности укладки хроматина, которые приводят к образованию повтора типа Ы+2К при обработке ДНКазой I тканеспецифи-чны и не обладают видоспецифичностью.

3. Появление полунуклеосомного повтора з зависимости от понижения концентрации ионов магния, чем обусловлена степень конденсации хроматина, обладает тканеспецифичностью.

4. При деконденсации хроматина появляется феномен концевого откусывания ДНКазой I.

5. Для образования повтора типа 1/2 N необходимо наличие поли-нуклеосомной цепи, содержащей не менее четырёх нуклеосом.

6. При переваривании частично деконденсированного хроматина /при 1.5-2 мМ магния/ ДНКазой I независимо друг от друга образуются три "полунуклеосомных" фрагмента ДНК - 1.5п , 2.5п к 3.5 и и две олигонуклеосомные частицы - тринуклеосомная асимметричная частица с диффузным сайтом внутри, и динуклео-ссмная частица с симметричным расположением сайтов атаки ДНКазы I по краям и внутри.

7. Основная фибрилла хроматина 1п сложная организация с гетерогенными межнуклеосомными взаимодействиями, что при переваривании ДНКазой I в конденсирующих условиях выражается образованием повторов типа 2И/кЬас1мИ;г1еп et а1, 1981 / и и+.2Е. , а при постепенной деконденсации обнаруживаются 6 разных сайтов атаки ДНКазы I.

Рис.13. Схематическое

................—I

* * и * * ♦ У * *

1112 32445 56 6

представление линейного расположения нуклеосом с сайтами атаки ДНКазы I в хроматине при 2 мМ магния и ниже.

ВЫВ О ДЫ

- 19 - _

Список работ, опубликованных по материалам'диссертации:

1. Хачатрян А.Т., Матнишян A.A., Карагебакян Г.Г., Магакян Ю.А. ДНКаза I как инструмент для исследования хроматина in situ . ХУ двусторонний советско-итальянский симпозиум "Макромолекулы в функционирующей клетке". Тезисы докладов, Киев, 1984,

с.131.

2. Хачатрян А.Т., Карагебакян Г.Г., Матнишян A.A., Магакян Ю.А., Клеточная специфичность наднуклеосомной организации хроматина, выявляемая с помощью нуклеазного переваривания. 1У двусторонний симпозиум СССР-ФРГ "Молекулярное разнообразие организации и экспрессии генома". Тезисы докладов, Ленинград, 1985, с.27.

3. Хачатрян А.Т., Карагебакян Г.Г., Матнишян A.A., Магакян Ю.А. Клеточная специфичность тотального хроматина. Тезисы докладов республиканской конференции "Макромолекулы и функционирование клетки", Ереван, 1986, с.51.

4. Khachatrian Н.Т., Kharagebakian G.G., Matniehiem A.A. Mngakian Yu., A.

Ion-dependent conformational transitions as indicatorea of specificity of total chromatin in different tipes of cells. Abstracts of the second european congress on cell biology. Acta Biologies, Hungaria, 1986, v. 37, p. 4.

5. Карагебакян Г.Г., Хачатрян А.Т., Магакян Ю.А., Характер декон-денсации разных типов клеток, выявляемой снижением концентрации ионов магния, IX всесоюзный симпозиум "Структура и функции клеточного ядра", Тезисы докладов. Черноголовка, 1987,

с.62.

6. Хачатрян А.Т., Карагебакян Г.Г.,Магакян Ю.А. Анализ нуклеопро-теидных частиц, выщепляемых из хроматина под действием ДНКазы I. IX всесоюзный симпозиум "Структура и функции клеточного ядра". Тезисы докладов, Черноголовка, 1987, с.186.

7. Карагебакян Г.Г., Хачатрян А.Т. Механизм расщепления хроматина ДНКазой I в зависимости от степени его конденсации. Ш конференция молодых учёных ИЗБ АН Арм.ССР. Тезисы докладов.Ереван, 1988, с.27.

8. Хачатрян А.Т.,Карагебакян Г.Г.,Магакян Ю.А. Два типа фрагмз1— тации тотального хроматина ДНКазой I-артефакт или реальность': Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. 1990,