Структурная и функциональная организация реплицируемого хроматина

Голышев, Сергей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурная и функциональная организация реплицируемого хроматина
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная и функциональная организация реплицируемого хроматина"

На правах рукописи

у*

ГОЛЫШЕВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК 576.315.42 576.315.43

СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ РЕПЛИЦИРУЕМОГО ХРОМАТИНА

03.00.25 — гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в отделе электронной микроскопии Института физико-химической биологии им. А,Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАЕН

Поляков Владимир Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Коломиец Оксана Леонидовна

доктор биологических наук Ляпунова Наталия Алексеевна

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится «21» ноября 2006 г. в '(-> часов Л О минут на заседании Диссертационного Совета Д.501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва Ленинские горы, д. 1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд._.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «/^ » п к и 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Калистратова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Растущий объем сведений о биохимических механизмах, осуществляющих внутриклеточные процессы, делает все более актуальным вопрос об их регуляции и координации. Очевидно, что разграничение внутриклеточного пространства на структурные и функциональные компартменты является важнейшим механизмом, обеспечивающим правильное функционирование клетки на всех уровнях ее организации.

Ядро клетки - яркий образец реализации этого принципа. В настоящее время не вызывает сомнений утверждение о том, что ядро представляет собой высокоупорядоченную систему. Однако, метаболические реакции, в которые напрямую вовлечен хроматин, до настоящего времени изучены в недостаточной степени, что связано с отсутствием последовательной модели, описывающей связь конформации ДНП-комплексов с их функционированием. Основные затруднения при исследовании организации хроматина связаны с высокой плотностью упаковки ДНП-материала, лабильностью его структуры и отсутствием универсальных маркеров, позволяющих отслеживать динамику преобразований конкретных структур.

Репликация ДНК представляет особый интерес в связи с центральной ролью этого процесса в клетке. Механизмы и динамика репликации хорошо изучены на уровне целого ядра и на уровне белковых комплексов, осуществляющих синтез ДНК. Однако поведение нативного субстрата репликационных комплексов - хроматина - в ходе репликации, изучено фрагментарно.

Особый интерес представляют ультраструктурная организация репликационных сайтов - зон непосредственной активности факторов репликации. Немаловажными являются вопросы о конформации ДНК в этих зонах, о пространственной структуре мультиферментых комплексов, вовлеченных в синтез дочерних цепей ДНК, а так же о влиянии репликационных событий на общую организацию хроматина.

Цель данной работы состоит в том, чтобы, используя методы, позволяющие стабилизировать и выявлять нативные макромолекулярные комплексы хроматина, изучить положение реплицируемого хроматина в иерархии структурных уровней организации генома и предложить динамическую модель организации репликационных сайтов.

Задачи работы:

1) Изучить структуру реплицирующегося хроматина и репликационных сайтов в условиях, изменяющих характер компактизации хроматина, а также в условиях исчерпывающей экстракции гистонов.

2) Визуализировать макромолекулярные комплексы эу- и гетерохроматина, завершившего репликацию, используя длительное введение предшественников синтеза ДНК.

3) На ультраструктурном уровне провести сравнительный анализ методов визуализации репликационных сайтов.

4) Визуализировать репликационные сайты и макромолекулярные комплексы эухроматина, факультативного и конститутивного гетерохроматина при репликации ДНК на ультраструктурном уровне,

5) На модели преждевременно конденсированных хромосом изучить действие индукторов компактизации на реплицирующийся хроматин.

6) Изучить динамику структурных изменений реплицирующегося хроматина в преждевременно конденсированных хромосомах.

Научная новизна и практическое значение работы. В работе получены новые данные относительно структурной организации и физико-химических свойств тотального и реплицируемого хроматина. Впервые показано, что реплицируемый хроматин находится в менее компактном состоянии, и, в отличие от тотального хроматина, не компетентен к формированию структур высшего порядка — хромомеров и хромонемных комплексов.

Впервые показана хромонемная организация гетерохроматических блоков (хромоцентров) в ядрах клеток мыши. Изучены преобразования структуры хромоцентров при репликации слагающей их ДНК.

Полученные данные позволяют обобщить результаты с в етом и крое ко п ич ее к их, биохимических и ультраструктурных исследований организации сайтов репликации ДНК. На основании результатов работы предложена модель организации репликационных сайтов в контексте высших уровней организации генома, учитывающая структурные и функциональные особенности реплицируемого хроматина.

Предлагаемая в работе совокупность методических подходов к изучению ультраструктуры хроматина может применяться для решения исследовательских задач, сопряженных с необходимостью дискриминации различных доменов хроматина по структурным особенностям и репликационному статусу.

Полученные данные также могут быть использованы в лекционных курсах, предназначенных для студентов и аспирантов, специализирующихся в области клеточной и молекулярной биологии.

Апробация работы. Основные результаты работы были изложены на заседании кафедры Клеточной биологии и гистологии Биологического факультета МГУ и на Московском семинаре по клеточной биологии под руководством Ю.С. Ченцова.

Публикации, По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Список сокращений. БСА - бычий сывороточный альбумин, БрдУ - 5'-бром-дезоксиуридин, ГА - глютаровый альдегид, ПЭГ — полиэтиленгликоль, PC — репликационный сайт; ТЭА - триэтаноламин.

Материалы и Методы.

В качестве экспериментальных моделей использовали культивируемые in vitro клетки линий СПЭВ и L929 (Коллекция клеточных культур позвоночных института Цитологии РАН, Санкт-Петербург).

1. Выявление сайтов репликации и новореплицированной ДНК. В зависимости от задач экспериментов БрдУ (Sigma, США) вносили в среду культивирования в концентрации от 30 (для иммунофлуоресцентного исследования) до 50 мкМ (для иммуноэлектронной микроскопии) на 15-30 минут (пульс-мечение), 180 минут (длительное мечение) и 15 минут с последующим удалением БрдУ и инкубацией в свежей среде культивирования в течение 180 минут (отложенное мечение).

Клетки фиксировали свежеприготовленным 3,7 % нейтральным раствором параформальдегида (Sigma) на буфере PBS при температуре +37 °С в течение 20 минут и обрабатывали 0,5 % раствором Triton-XlOO на PBS в течение 10 минут. Раствор Triton Х-100 отмывали тремя сменами PBS в течение 15 минут. Гидролиз ДНК проводили, обрабатывая клетки 4-х нормальной соляной кислотой 20 минут при комнатной температуре. Клетки тщательно отмывали в PBS и переносили в 1 % раствор БСА (Sigma) на PBS на 1 час.

Антитела против БрдУ (Sigma, клон BU-33, титр 1:100) и антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с FITC или Техасским красным (Sigma, титр 1:200), готовили на PBS с добавлением 0,05 % Tween-20. Инкубацию с антителами против БрдУ проводили в течение 60 минут при температуре +37 °С, инкубацию со вторыми антителами проводили при +4 °С в течение 12 часов. Для выявления тотальной ДНК клетки докрашивали флюорохромом DAPI (4', б-д иам и но-2-фе н ил и н дол) в концентрации 0,1 мкг/мл на PBS (10 минут при комнатной температуре). Препараты заключали в MOVIOL (Calbiochem) или в 50 % раствор глицерина на PBS с добавлением DABCO (1,4-диазабицикло[2.2.2]октан) (Sigma, 50 мг/мл).

2. Индукция преждевременной конденсации хроматина. Клетки, высаженные на покровные стекла или чашки Петри с адгезивным покрытием (Costar), культивировали до достижения конфлюэнтного монослоя. Перед слиянием клетки обрабатывали нокодазолом (Sigma, США) в концентрации 20 мкг/мл в течение 120 минут. Все этапы процедуры осуществляли при температуре +37 °С. Для инициации слияния клетки линии СПЭВ тщательно промывали в трех сменах PBS и обрабатывали 50 % (по массе) раствором ПЭГ-1500 (Merck) на ССРХ с добавлением 15 % ДМСО (по объему) в течение 60

секунд, затем тщательно отмывали ПЭГ и ДМСО, и переносили клетки в свежую среду культивирования. Полученные гибридные клетки фиксировали спустя 45 минут после инициации слияния.

3. Получение хромосомных препаратов, Для получения распластанных хромосомных препаратов использовали стандартную процедуру (Seabright, 1972). Для получения хромосомных препаратов in situ действовали согласно методике, изложенной в книге Брэдбери и др. (Москва, «Мир», 1992).

4. Пермеабилизация клеток в растворах с низкой ионной силой. В зависимости от задач эксперимента для пермеабилизации использовали следующие растворы: 1) 20 ммоль ТЭА, 4 ммоль хлорида магния; 2) 20 ммоль ТЭА; 3) 2 ммоль ТРИС, 3 ммоль хлорида кальция. pH всех растворов - 7,4. Клетки обрабатывали 1% раствором Triton Х-100 на одном из вышеприведенных буферов в течение 1 минуты и фиксировали, перенося в 3,7 % раствор формальдегида или 1% ГА на том же буфере на 20 минут или 60 минут соответственно.

Для дифференциальной деконденсации клетки, пермеабилизированные на буфере 2 ммоль ТРИС 3 ммоль СаС12, переносили в раствор 2 ммоль ТРИС 0,1 ммоль СаС12 и инкубировали в нем до визуально выявляемой дисперсии митотических хромосом и деконденсации материала ядрышек интерфазных клеток (~60-90 секунд), после чего клетки фиксировали, перенося в раствор фиксатора на декоденсирующем буфере.

5. Получение препаратов стабилизированного ядерного матрикса. Клетки, выращенные на покровных стеклах, пермеабилизировали в течение 5 минут 1 % Тритоном Х-100, приготовленным на растворе, содержащем 50 ммоль ТРИ С-HCl (pH 7,5), 5 ммоль MgCb, 1 ммоль CuS04, 1 ммоль PMSF. Затем промывали тем же раствором без Тритона Х-100 в течение одной минуты и переносили в 2М раствор NaCl на 20 ммоль TRIS с добавлением 10 ммоль ЭДТА на 6 минут, Югетки фиксировали добавлением раствора формальдегида до финального содержания 3 %. Зафиксированные препараты ядерного матрикса тщательно отмывали дистиллированной водой для удаления хлорида натрия, после чего проводили процедуру выявления БрдУ.

6. Изучение препаратов и регистрация результатов. Полученные препараты изучали и фотографировали на оптическом микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200М, оборудованном объективом Plan-Neofluar lOOx 1,3 и цифровой камерой AxioCam HRm (1300x1030, 14 бит), управляемом программным комплексом AxíoVision v3,4. Также использовали конфокальный лазерный сканирующий микроскоп LSM 510 (Carl Zeiss), оснащенный аналогичным объективом. Полученные изображения обрабатывали в программах ImageJ vl.49x и Adobe Photoshop v5.0 LE (Adobe Inc, США). Для первичной обработки данных, получаемых с конфокального микроскопа, использовали программу AIM Confocal Image Browser (Carl Zeiss, Германия). Трехмерную деконволюцию серий оптических срезов осуществляли по алгоритму

Constraned Iterative Filter с помощью соответствующего модуля из комплекта поставки демонстрационной версии программы AxioVision v3,l (Carl Zeiss, Германия).

7, Электронная микроскопия. Клетки маркировали антителами, конъюгированными с Nano-gold, согласно процедуре, изложенной выше, дополнительно фиксировали 1 % ГА на PBS, после чего обрабатывали согласно протоколу серебряного усиления (Dancher, 1981). Клетки заключали в Эпон по процедуре, включающей обезвоживание в серии спиртов повышающейся концентрации, обезвоживание ацетоном, пропитку в трех сменах смеси эпон-ацетон с повышающейся долей эпона и полимеризацию смолы при 60°С, Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Reichert Jung Ultracut Е с использованием стеклянных ножей.

Для выявления реплицированной ДНК на ультратонких срезах свежеприготовленные срезы неокрашенных клеток на никелевых сетках, покрытых формваровой подложкой, обрабатывали в течение 10 минут 10 % раствором пероксида водорода, тщательно отмывали в PBS, и переносили в 5 % раствор БСА на PBS. Антитела против БрдУ в разведении использовали в разведении 1:75 — 1:50 на PBS с добавлением 0,1 % БСА. Инкубацию с антителами проводили в течение 12 часов при +4 °С, Далее срезы отмывали, и на 60 минут помещали в капли суспензии коллоидных золотых частиц диаметром 15 нм с адсорбированными на них антителами против иммуноглобулинов мыши (1:100 на 0,1 % растворе БСА в PBS). Инкубацию проводили при комнатной температуре во влажной камере. По завершении инкубации срезы промывали PBS и дистиллированной водой.

Далее срезы дополнительно контрастировали 2 % водным раствором УА (20 минут) и раствором цитрата свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). В качестве отрицательного контроля на чистоту связывания антител использовали немеченые клетки, имеющиеся на каждом из изученных срезов.

Изучали и фотографировали полученные препараты на электронных микроскопах Hitachi HU-11В и HU-12В (Япония). Негативы сканировали в монохромном режиме с разрешением 1200 точек на дюйм и глубиной представления цвета 16 бит. Использовали слайд-сканнер Duoscan Т1200 (Agfa). Сканированные изображения монтировали в программе Adobe Photoshop v5.0 LE. При измерениях структур в качестве внутреннего стандарта размеров использовали частицы коллоидного золота, конъюгированные с антителами. Их размер составляет 15±1 нм.

Результаты и их обсуждение.

Общая организация ядер исследуемых клеток. В качестве моделей в работе использовались две линии культивируемых клеток - СПЭВ и L929, ядра которых различаются по характеру компактизации хроматина. В ядрах клеток СПЭВ, окрашенных DAPI, материал, содержащий ДНК, представлен

флуоресцирующими зонами различного размера, в которых можно различить дискретные глобулы и тонко фибриллярные элементы. В этом типе клеток хорошо выражен слой околоядрышкового хроматина и неокрашенные интерхроматиновые зоны, однако в целом материал распределен в нуклеоплазме однородно,

В ядрах клеток линии Ь929 прицентромерный гетерохроматин структурно обособлен и представлен дискретными блоками (хромоцентрами), хорошо различимыми при окраске ДНК флуоресцентными красителями. Преимущественно хромоцентры располагаются на периферии ядра и ядрышек. Околоядрышковый гетерохроматин в клетках линии Ь929 выражен слабее, чем в клетках линии СПЭВ.

Динамика репликациоппых сайтов в клетках линии СПЭВ и Ь929 фиксированных т В импульсно меченых клетках обеих линий зоны, включающие предшественник синтеза ДНК — репликационные сайты (РС) — представляют собой флуоресцирующие точечные структуры. В клетках линии СПЭВ выявляются три хорошо различимых типа распределения РС, а в клетках линии Ь929 - четыре. На основании имеющихся данных литературы (СКееЯг е1 а!., 1992; СиепаЫ е1 а!,, 2004) они были классифицированы и сопоставлены со стадиями протекания Б-фазы.

Первый тип соответствует начальной стадии Э-фазы и характеризуется равномерным распределением точечных сайтов репликации в нуклеоплазме, за исключением зоны ядрышка и периферии ядер.

Второй тип характеризуется наличием немногочисленных крупных интенсивно метящихся сайтов, имеющих сложное строение. Иногда в их составе можно выявить отдельные точечные элементы. Сайты репликации выявляются в ассоциации с ядрышком и на периферии ядра. Такой тип распределения РС соответствует среднему периоду Б-фазы.

В клетках линии Ь929 для средней Б-фазы характерны два типа распределения реплицирующейся ДНК. В обоих случаях РС объединены в крупные, имеющие сложную структуру ассоцииации, которые либо колокализуются с хромоцентрами, либо контактируют с ними без перекрывания областей БАР1- и БрдУ-позитивного окрашивания. Второй случай, предположительно, соответствует репликации блоков минорного сателлита (виепаМ е1 а1.., 2005).

Третий тип мечения характеризуется наличием многочисленных точечных сайтов репликации, расположенных на периферии ядер и вокруг ядрышка. Этот тип мечения соответствует позднему периоду Б-фазы.

При использовании отложенного мечения перераспределения меченого материала по сравнению с импульсным мечением не выявляются.

Длительное мечепие. При увеличении времени инкубации клеток с 5'-БрдУ до 60 минут общая картина распределения реплицированного материала так же, как и в случае отложенного мечения, не изменяется по сравнению с

картиной, выявляемой при импульсном внесении БрдУ, однако повышается интенсивность мечения.

При увеличении времени мечения до трех часов в ядрах, по распределению РС соответствующих ранним и поздним периодам S-фазы, выявляются цепочки меченых сайтов и отрезки тонких фибрилл. В ядрах, получивших длительную метку в поздний период S-фазы, фибриллярные элементы имеют большую толщину и протяженность. С помощью конфокальной микроскопии показано, что фибриллярные ассоциации блоков поздно реплицирующегося меченого хроматина находятся на периферии ядер в тесном контакте с ядерной оболочкой.

В ядрах с типом мечения, соответствующим средней S-фазе, в клетках обеих линий выявляются сложно организованные компактные блоки меченого материала, ассоциированные с ядерной оболочкой и периферией ядрышек. Такой характер длительного мечения указывает на глобулярную организацию этих доменов и более плотную упаковку ДНП.

Таким образом, длительное репликационное мечение позволяет выявлять фибриллярные мотивы организации генома на светооптическом уровне. Это дает основание предполагать, что различные субхромосомные домены не только отличаются по структуре и способу упаковки хроматина, но и по способу разделения молекулы ДНК на единицы репликации.

Эти наблюдения также согласуются с данными о том, что активация новых репликационных единиц происходит в непосредственной близости от локусов хроматина, уже завершивших свою репликацию, что приводит к направленному перемещению зоны репликации вдоль фибриллы хроматина (Manders et al., 1992; Manders et al., 1996).

PC в условиях структурной модификации хроматина. Пермеабилизация в растворах с низкой ионной силой, содержащих двухвалентные катионы (20 ммоль ТЭА, 4 ммоль MgCI2 или 2 ммоль TRIS, 3 ммоль СаС12) приводит к структурированию содержимого ядер, однако характерные типы локализации реплицируемой ДНК сохраняют свои различия.

При пермеабилизации клеток в растворе, не содержащем двухвалентных катионов, происходит полная декомпактизация хроматина в ядрах. Несмотря на дисперсию содержимого ядра, взаимное расположение различных фракций хроматина и характерные типы распределения РС в пермеабилизированных клетках не нарушаются. Отдельные репликационные сайты при этом деконденсируются, увеличиваясь в размерах по сравнению с контролем.

Тот факт, что в растворах, не содержащих двухвалентных катионов, реплицированный материал сохраняет относительно компактную конформацию, когда тотальный хроматин представлен нуклеосомными фибриллами (Kiryanov et al., 1976; Kiiyanov et al., 1982; Prusov et al., 1983), может быть объяснен с помощью следующего приблизительного расчета. При средней скорости репликации около тысячи пар оснований в минуту (Hozak et

al., 1994), и длине сегмента молекулы ДНК, соответствующего одной нуклеотидной паре, равной 0,48 нм, за 15 минут реплицируется сегмент молекулы ДНК длиной 7,2 мкм. Такой отрезок ДНК, будучи упакованным в нуклеосомную фибриллу (степень компактизации 1:7-10, (Bäk et ab, 1979)), будет иметь линейные размеры порядка 0,7-1 мкм при толщине фибриллы 10 нм. Представляется возможным, что такой отрезок фибриллы за счет взаимодействия с окружающим хроматином, может сохранять компактную конформацию и удерживаться в пределах объема диаметром 0,2-0,4 мкм, но не формировать при этом упорядоченных структур.

Полученные данные согласуются с данными о том, что нуклеосомные частицы не теряют связи с реплицируемой ДНК (Jackson, 1990; Krude and Knippers, 1991; Randall and Kelly, 1992). Таким образом, есть все основания считать, что гистоны играют важную роль в компактизации ДНК в сайтах репликации.

Роль гистонов и негистоновых белков в организации PC. При обработке клеток двумолярным раствором хлорида натрия в присутствие ионов меди формируется нуклеоид, состоящий из остаточного ядра (ядерного матрикса) и окружающего его ДНК-содержащего гало. Данные электронной микроскопии свидетельствуют, что материал гало представлен тонкими фибриллами, соответсвующими депротеинезированным молекулам ДНК.

В части клеток реплицируемая ДНК локализуется во внутренней области нуклеоид а. При этом сохраняется сходство пэттерна окрашивания нуклеоид а с распределением ранореплицирующейся ДНК в неэкстрагированных клетках.

Реплицирующийся материал, расположенный преимущественно на периферии ядер, выявляется не только на границах нуклеоидов, но и снаружи -в зоне гало. Протяженность меченых отрезков ДНК, покидающих границы остаточного ядра, незначительна по сравнению с общими размерами гало.

При отложенном мечении так же выявляется фракция ДНК, сохраняющая свою локализацию внутри остаточного ядра и сходство с пэттерном ранней S-фазы. Такие ядра окружены небольшим слабо-флуоресцирующим гало, что указывает на уменьшение сродства ДНК эухроматина к «ядерному матриксу» после завершения репликации.

Этот факт может быть объяснен тем, что скорость репликации в ранней S-фазе невысока, а размер индивидуальных репликонов и количество репликонов в кластерах в эухроматических областях меньше, В пользу этой гипотезы выступают полученные в настоящей работе данные о том, что, при длительной инкубации клеток в присутствие 5'-БрдУ, в клетках, демонстрирующих репликацию эухроматина, выявляются короткие и тонкие фибриллярные комплексы, в то время, как при той же продолжительности мечения в гетерохроматических областях выявляются гораздо более протяженные фибриллы большего диаметра.

Кроме того, РНК-полимеразы при проведении процедур экстракции также становятся компонентами ядерного матрикса (Vincent et al., 1996; Wei et al» 1999), и могут вносить свой вклад в удержание ранореплицируемой ДНК эухроматина внутри остаточного ядра. Стойкая ассоциация репликационных сайтов, локализованных во внутренних областях ядра, со структурами ядерного матрикса, является, таким образом, отражением транскрипционной активности эухроматина, на что указывает сходство распределения сайтов транскрипции и сайтов репликации в ранней S-фазе (Goldman et al,» 1984; Wansink et al., 1994; Hassan, 1995).

Помимо фракции ДНК, реплицируемой в центральной зоне ядра и сохраняющей свою локализацию после экстракции, не покидает пределы ядерной оболочки и ДНК гетерохроматиновых локусов, связанных с остаточным ядрышком. Положение этих доменов в экстрагированных препаратах не зависит от их репликационного статуса.

Остальные фракции хроматина покидают объем остаточного ядра, полностью мигрируя в гало. При этом зоны включения БрдУ в зоне гало сохраняют дискретность.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что ДНК в зонах репликации, выявляемых с помощью импульсного внесения предшественника синтеза ДНК 5'-БрдУ, определенным образом упакована и сохраняет достаточно компактное состояние, в поддержание которого вовлечены и гистоны, и компоненты репликационных комплексов.

Оптимизация метода выявления репликационных сайтов на ультраструктурном уровне.

Для оптимизации условий ультраструктурного анализа PC в работе было проведено тестирование нескольких различных методических подходов:

1. Клетки фиксировали и обрабатывали так же, как и для оптической микроскопии, проводили кислый гидролиз. Реакцию с антителами, конъюгированными с наночастицами золота и процедуру «серебряного усиления» осуществляли до заключения материала в эпоксидную смолу. Далее Препараты подготавливали для электронно-микроскопического исследования стандартным способом.

В контроле в ядрах клеток линии СПЭВ, фиксированных ш situ на 0,1 M фосфатном буфере (буфере Зеренсена), элементы хроматина имеют вид гранул диаметром 15-30 нм, образующих скопления различной плотности. После процедуры кислого гидролиза хроматин приобретает тонко фибриллярную или волокнистую структуру. Средний диаметр фибрилл хроматина в этих условиях составляет 6-10 нм.

При импульсном введении БрдУ зерна золота располагаются кластерами неправильной формы, которые частично ассоциированны с ядерной оболочкой

и периферией блоков конденсированного хроматина. Большое количество зерен золота выявляется в материале ядрышка и в цитоплазме.

2. Клетки пермеабилизовали в буфере, содержащем двухвалентные катионы (20 ммоль ТЭА, 4 ммоль фиксировали 3,7% формальдегидом на том же буфере, и обрабатывали так же, как описано выше. Этот метод позволяет сохранить все структурные домены ядра: хроматин, ядрышки, интерхроматиновые гранулы. Хроматин на препаратах представлен двумя типами структур - компактными блоками и фибриллами толщиной 60-100 нм с «изрезанными» поверхностями. По данным литературы, такого рода структурные комплексы хроматина соответствуют хромомерам и хромонемам (Зацепина и др., 1983).

Метка, маркирующая реплицирующийся хроматин, выявляется строго на периферии хромонем и хромомеров. Кластеры гранул золота имеют вид цепочек, лежащих параллельно фибриллам хроматина, иногда - по обеим сторонам, а также принимают форму колец, окружающих фибриллы, срезанные поперек.

3. Клетки фиксировали 1% раствором ГА на 0,1 М фосфатном буфере Зеренсена. Реакцию с антителами проводили непосредственно на поверхности ультратонких срезов после травления их поверхности 10% раствором пероксида водорода. Для визуализации использовали вторичные антитела, конъюгированные с коллоидными золотыми частицами диаметром 15 нм.

Зерна коллоидного золота в клетках, зафиксированных на фосфатном буфере Зеренсена, располагаются случайным образом относительно хроматиновых элементов, как непосредственно над электронно-плотными структурами, так и в непосредственной близости.

Отличительной особенностью такого подхода является сохранность внутриядерных и цитоплазматических структур и высокое отношение сигнала к фоновому шуму.

4. Для того, чтобы параллельно с выявлением реплицируемой ДНК, визуализировать макромолекулярные комплексы хроматина клетки, пермеабилизованные в конденсирующем буфере, содержащем ионы кальция, фиксировали 1 % раствором глютарового альдегида на том же растворе, и далее обрабатывали аналогично варианту 3.

Эффективность мечения, достигаемая при использовании методов 2 и 3, невысока. Однако низкая эффективность компенсируется полной сохранностью структур, а также очень высоким отношением сигнала к фоновому шуму. Внутренний отрицательный контроль - ядра, не реплицирующие ДНК — подтверждает эффективность и адекватность метода. Также данный метод позволяет исключить артефакты, связанные с неспособностью антител проникать в конденсированные хроматиновые блоки.

Имеющиеся в литературе данные о конформации репликационных сайтов получены в системах, не позволяющих выявлять индивидуальные фибриллы

хроматина, что связано с применением буферных растворов, диспергирующих хроматин (Jaunin et al., 2000; Phüimonenko et al., 2005), или в системах, где хроматин частично удален (Hozak and Cook, 1993; Hozak et al., 1994).

Пермеабилизация клеток в растворах с низкой ионной силой в присутствие двухвалентных катионов (Кирьянов и др., 1981; Зацепина и др., 1983) позволяет не только выявлять конформации фибрилл хроматина, но и, благодаря удалению растворимых компонентов кариоплазмы, дает возможность дифференцировать зоны концентрации ДНП-материала и пространства, им обедненные, что позволяет не использовать удаление хроматина.

Визуализация зон включения БрдУ на поверхности ультратонких срезов возможна при использовании любого протокола фиксации и заключения (O'Keefe et al., 1992; Lattanzi et al., 1998), что, возможно связано с тем, что - остаток БрдУ не теряет иммуногенности при заключении в смолу. Вероятно, с потерей белковыми молекулами своих антигенных свойств связана высокая специфичность данного метода.

Недостатком такого метода является то, что частицы коллоидного золота располагаются только на поверхности среза, что ограничивает возможность изучения образца только классическими методами электронной микроскопии, не позволяя в полной мере применить возможности современной электронно-микроскопической томографии (Marco et al., 2004; Macintosh et al., 2005).

Таким образом, сочетание обработки клеток растворами, стабилизирующими макромолекулярные комплексы хроматина, с выявлением репликационной метки на ультратонких срезах открывает широкие перспективы для изучения топологии сайтов репликации и организации хроматина.

Ультраструктурная организация реплицирующегося хроматина в клетках линии L929.

Эухроматин и факультативный гетерохроматин. В клетках линии L929, пермеабилизированных в присутствие ионов кальция (2 ммоль ТРИС, 3 ммоль СаСЦ), хроматин структурируется. Большая часть хроматина представлена глобулярными образованиями диаметром 60-80 нм -«элементарными» хромомерами, тесно ассоциированными в протяженные фибриллы — хромонемы,

Новореплицированная ДНК преимущественно выявляется в зонах частичной деконденсации ДНП-материала, и гораздо реже выявляются компактных хромомерах.

В областях деконденсации выявляются частицы диаметром -30 нм -нуклеомеры - которые формируют аморфные кластеры или линейные ассоциации, выявляющиеся между сегментами хромонем. Также выявляются аморфные образования с пониженной, по сравнению с материалом хромомеров, электронной плотностью.

Особый интерес представляют структуры, интерпретированные нами как участки бифуркации фибрилл хроматина (рис. 1а, б). Это отчетливо выявляемые структуры длиной до 0,2 мкм, состоящие из трех цепочек глобул диаметром 30 нм, расходящихся из одной точки. Репликационная метка выявляется как в точке бифуркации, так и вне ее, на расходящихся фибриллах. В случае, когда структура, содержащая зону бифуркации, лежит в плоскости среза, видно, что тонкие фибриллы диаметром 30 нм в ее составе оканчиваются в контакте с ближайшими хромомерами, однако малая толщина срезов не позволяет прослеживать ход большей части фибриллярных элементов.

Перевод пермеабилизированных клеток в раствор, содержащий 0,1 ммоль ионов кальция, приводит к тому, что хромомеры превращаются в агрегаты глобул диаметром 30 нм. При этом нивелируются структурные отличия реплицирующегося и тотального хроматина.

Полученные результаты указывают на то, что основной формой организации ядерного материала являются глобулярные образования диаметром 60-80 нм и линейные ассоциации таких элементов. Единичные глобулярные структуры соответствуют «элементарным» хромомерам, а их линейные ассоциации — сегментам хромонем (Зацепина и др., 1983).

Зоны высокой концентрации ДНП-материала, такие, как периферический гетерохроматин, с которым мы соотносим фибриллярные комплексы, выявляемые светооптическими методами, характеризуются большим количеством витков или петель хромонемы в единице объема, что может быть обусловлено формированием многочисленных контактов этих сегментов хромосомы с ядерной оболочкой.

На текущий момент не накоплен достаточный объем данных, позволяющих связать топологию фибриллярных комплексов хроматина с биохимическими процессами, осуществляемыми на них. Имеющиеся факты

Рис. 1. Сайты репликации в пермеабилизированных клетках линии Ь929: а, б — в эухроматических областях; в — в конститутивном гетерохроматине. Инкубация с БрдУ — 15 мин. Стрелками отмечены фибриллы диаметром 30 нм.

консолидируются в два блока. Первые получены биохимическими методами и не позволяют делать какие-либо выводы о структурных уровнях выше фибриллы диаметром 30 нм (Gilbert et al., 2004). Вторые получены методами световой микроскопии, которые позволяют анализировать динамику хроматиновых комплексов высшего порядка (Volpi et al., 2000; Muller et al., 2001), тонкие детали строения которых остаются не изученными. Важно отметить, что все эти данные получены при изучении преобразований, связанных с активацией и прогрессией транскрипции. Тем не менее, в настоящее время признается, что процессы, в которые вовлекается хроматин, требуют его перехода в более «открытое», менее компактное состояние (Volpi et al., 2000; Mahy et at., 2002).

Модель, предложенная в работе (Jaunin et al.., 2000), предусматривает периферическую локализацию активно реплицируемой ДНК по отношению к комплексам конденсированного хроматина, которая сохраняется в течение приблизительно пяти минут, после чего начинается миграция новореплицированного материала в зоны, занятые конденсированным хроматином.

Режим импульсного внесения предшественника, использованный в настоящей работе, позволяет выявлять только хроматин уже покинувший репликационный комплекс, локализующийся в интер хром ати новом пространстве. Результаты визуализации репликационной метки в клетках, не подвергнутых пермеабилизации, полностью согласуются с такой моделью.

Однако, данные, полученные при изучении клеток, пермеабилизированных в растворах с низкой ионной силой, свидетельствуют, что меченый хроматин выявляется в составе менее конденсированного материала, часто представленного 30 нм глобулами, что говорит о том, что, несмотря на завершение репликации, новосинтезированные ДНП-комплексы еще не приобрели свойства тотального хроматина.

Совокупность результатов позволяет сделать вывод о том, что, несмотря на конденсацию новореплицированной ДНК, выявляемую в клетках, фиксированных in situ , хроматин в репликации оных сайтах реагирует на изменения ионного состава иначе, чем хроматин тотальный, не формируя хромомеров.

Важно отметить, что ни в клетках, фиксированных in situ , ни в клетках, подвергнутых пермеабилизации в растворах с низкой ионной силой, не удается выявить структур, по плотности, размерам и строению отличающихся от элементов хроматина, и в то же время обогащенных меткой, соответствующей новореплицированной ДНК. Таким образом, полученные в настоящей работе данные находятся в противоречии с моделями, постулирующими существование субъядерных «репликационных органелл» или «репликационных фабрик» (Hozak et al., 1993; Cook, 2000).

Обнаруженные в некоторых клетках бифуркации ДНП-фибрилл диаметром 30 нм, в которых меченый материал выявляется непосредственно в зоне ветвления или вблизи этого участка, предельно соответствуют представлению о репликации ДНК в контексте подвижных репликационных комплексов, скользящих вдоль фибрилл хроматина. Такое представление в настоящее время непопулярно, и большее предпочтение отдается модели о неподвижных полимеразах, протягивающих нити ДНК сквозь себя (DNA spooling model) (Cook, 1999).

Наблюдение многочисленных зон бифуркации хроматиновых фибрилл могло бы стать важным аргументом в пользу гипотезы о «свободных» репликационных комплексах, но отчетливые зоны бифуркации встречаются достаточно редко.

В то же время нельзя исключать возможность частичной экстракции компонентов реплисом в условиях, использованных в настоящей работе, так как при приготовлении препаратов не применяли реагентов, присутствие которых приводит к стабилизации белкового наполнения ядра и формированию структур ядерного матрикса (Lebkowski and Laemmli, 1982).

Конститутивный гетерохроматин. Во время репликации сателлитной ДНК хромоцентры теряют четкие очертания и правильную эллипсоидную форму, на их периферии становятся различимы многочисленные впячивания и выступы. Меняется характер окрашивания материала хромоцентра флуорохромом DAPI — окраска становится негомогенной, начинают выявляться мелкие детали.

При этом меченый материал располагается как в периферической области хромоцентров, так и, в случае крупных хромоцентров, на фоне тотального материала. В мелких хромоцентрах меченый материал располагается на периферии блока. Сигнал, соответствующий новореплицированной ДНК, выявляется в зонах, обедненных тотальной ДНК хромоцентров.

В остальные периоды S-фазы хромоцентры сохраняют гладкие контуры и окрашиваются АТ-спефичными ДНК-связывающими флуорохромами однородно.

Одной из проблем, затрудняющих изучение ультраструктуры хроматина, является отсутствие хорошо различимых маркерных структур, позволяющих выявлять и отслеживать конкретные локусы хромосом без применения вспомогательных процедур. Большой прогресс в этой области был достигнут с внедрением в исследовательскую практику трансгенной системы на основе HSR (Homgeneously Staining Region, тандемного повтора гена дигидрофолат-редуктазы, возникающего в клетках некоторых линий под действием метатрексата (Robinett et al., 1996)), позволяющего методами флуоресцентной микроскопии изучать динамику этого локуса во времени (Li et al., 1998).

Хромоцентры, выявляемые в ядрах клеток некоторых грызунов, являются не менее удобным маркером. Ключевая особенность этой модельной системы

состоит в том, что хромоцентры представляют собой естественные, генетически однородные домены хроматина (виепаМ е( аЦ 2004; Кигг^эоуа й а1., 2005). Кроме того, хромоцентры находятся в компактном состоянии на всем протяжении клеточного цикла (Прокофьева-Бельговская, 1984).

В ядрах клеток, пермеабилизированных в присутствие ионов кальция, толщина фибрилл хроматина в хромоцентрах такая же, как и в тотальном хроматине, но они упакованы гораздо плотнее и однороднее по толщине. В небольших лакунах между фибриллами выявляется аморфный материал с меньшей, чем у хроматина, электронной плотностью.

Реплицирующиеся хромоцентры менее конденсированы. Расстояния между соседними петлями хромонемы в них увеличено. Весь блок становится достаточно аморфным, в то время как нереплицирующийся хромоцентр на срезе чаще всего имеет форму, близкую к округлой.

Помимо общей деконденсации на уровне хромонем, в реплицирующихся хромоцентрах выявляются зоны диссоциации хромонемных элементов, в которых хроматин представлен глобулами со средним диаметром 30±5,4 нм, аналогичными обнаруженным в зонах бифуркации фибрилл ДНП, Гранулы коллоидного золота в таких препаратах маркируют периферические области или поверхности хромонемных элементов, где материал наиболее деконденсирован и имеет меньшую электронную плотность (рис. 16).

Изучение серийных срезов показало, что репликация идет не только по периферии хромоцентра, как можно заключить на основе анализа данных оптической микроскопии, но и во внутренних областях.

Реплицируемый периферический гетерохроматин также переходит в деконденсированное состояние. В полном соответствии с данными оптической микроскопии, сайты репликации в этом ядерном домене имеют большие размеры, сложную структуру и прилегают к ядерной оболочке. Подавляющая масса золотых частиц, маркирующих новореплицированную ДНК, так же, как и в других ядерных доменах, приурочена к наиболее деконденсированным зонам и разрывам между отдельными глобулярными элементами различного диаметра.

При дифференциальной деконденсации нереплицирующиеся хромоцентры в значительной степени разрыхляются - увеличиваются размеры лакун между фибриллами, но фибриллярная организация не претерпевает значительных изменений. Диаметр фибрилл в составе хромоцентра составляет те же 60-80 нм.

В реплицирующихся хромоцентрах в этих ионных условиях происходит полная деконденсация хромонемных элементов до 30 нм фибрилл.

Генетическая однородность материала хромоцентров позволяет предполагать и однородность их ультраструктурной организации. Данное предположение удалось подтвердить прямым наблюдением. Полученные данные находятся в частичном противоречии с опубликованными в работе (Фролова и др., 1989), где постулируется отсутствие хромонемных элементов в

прицентромерном гетерохроматине клеток мыши. Такое несоответствие может объясняться отличиями ионного состава среды, используемой для пермеабилизации. В работе (Фролова и др., 1989) раствор, используемый для пермеабшшзации клеток, содержал не только ионы кальция, но и 1 ммоль ионов магния. Нельзя исключить возможность конкуренции и/или кооперативного взаимодействия этих ионов с хроматином, а также решающее влияние высокой концентрации двухвалентных катионов, приводящей к гораздо более сильной конденсации хроматина.

В настоящей работе впервые проведен сравнительный анализ данных оптической и световой микроскопии, полученных при изучении ьслеток, в которых происходит репликация сателлитной ДНК. Выявляемая на уровне оптической микроскопии неоднородность материала реплицирующихся хромоцентров соответствует уже имеющимся данным о перераспределении реплицированного хроматина в составе прицентромерных блоков (Quivi et al., 2004). Предложенная авторами модель предполагает репликацию ДНК на периферии гетерохроматинового блока с последующей миграцией материала во внутренние области хромоцентра (Quivi et al., 2004).

Ультраструктурные данные показывают, что репликация сателлитной ДНК идет во всем объеме хромоцентра или на протяженных сегментах хромонемы, слагающей хромоцентр. Светооптические данные могут быть интерпретированы не с позиции направленной миграции, а в контексте конденсации-деконденсации ДНП-материала.

Репликация материала хромоцентров осуществляется в течение достаточно короткого промежутка времени (Guenatri et al., 2004). В связи с этим есть все основания предполагать, что репликация гетерохроматиновых локусов происходит за счет единовременной активации большого числа репликонов.

Известно, что компактная конформация и репрессированное состояние гетерохроматина частично определяются эпигененетически и поддерживаются специфичными для гетерохроматина белковыми ансамблями, обладающими репрессорной и компактизирующей функциями (Craig, 2005). Репликация ДНК приводит к утрате части маркеров, ассоциированных с молекулами гистонов (Smith et al., 1984; Krude and Knippers, 1991; Randall and Kelly, 1992), что приводит к разрушению микроокружения гетерохроматиновых локусов и частичной потере компактного состояния. В пользу этого предположения выступают и данные о вовлечении в процесс репликации гетерохроматина АТФ-зависимых белковых комплексов, изменяющих конформацию нуклеосом (Collins et al., 2002.

Реакция реплицирующихся хромоцентров на дифференциальную деконденсацию, предположительно, так же определяется понижением прочности связывания или временным уменьшением количества белков, детерминирующих гетерохроматиновый статус.

Упаковка хроматина, закончившего репликацию.

При использовании отложенного мечения в пермеабилизированных клетках гранулы золота выявляются над конденсированными хроматиновыми элементами. Особый интерес представляют протяженные фибриллярные ансамбли» имеющие толщину 60-80 нм. В составе таких фибрилл четко выявляются отдельные сегменты, каждый из которых несет метку.

Зоны репликации в преждевременно конденсированных хромосомах.

Выбор преждевременно конденсированных хромосом (ПКХ) в качестве объекта диктуется тем, что в ПКХ, сформировавшихся в ядрах на стадии S-фазы, реплицирующийся хроматин кластеризован и пространственно отделён от хроматина, не вступившего в репликацию или закончившего этот процесс.

На хромосомных препаратах таких клеток хроматин клетки-реципиента представляет собой скопление мелких фазово-плотных, DAPI-позитивных блоков, связи между которыми на уровне разрешения светлопольной и флуоресцентной микроскопии не выявляются — т.н. «пульверизованный хроматин». На препаратах клеток, фиксированных in situ и окрашенных ДНК-специфичными флуорохромами, такой хроматин представлен мелкозернистой окрашенной массой, отдельными элементами которой являются отрезки фибрилл или цепочек, состоящих из последовательно расположенных глобул.

На хромосомных препаратах, приготовленных с использованием гипотонической обработки и фиксации смесью спирта и уксусной кислоты, репликационная метка, включающаяся в «пульверизованный» хроматин, выявляется преимущественно рядом или между плотными блоками. При этом колокализации обогащенного ДНК материала и зон, в которых выявляется бром-содержащая новореплицированная ДНК, не наблюдается. Сайты включения представлены отдельными точечными образованиями, индивидуальными или собранными в цепочки из нескольких флуоресцентных единиц. В цепочках отдельные фокусы разделены промежутками, в которых не выявляется ни DAPI-позитивный, ни БрдУ-содержащий материал.

На препаратах, зафиксированных in situ , или на хромосомных препаратах, приготовленных без использования кислой фиксации, достаточно сложно точно определить пространственные отношения между сайтами репликации и тотальным хроматином. Однако, в массе своей, БрдУ-содержащие сайты обособлены от DAPI-позитивного материала.

В клетках с ПКХ, способных к включению репликационной метки, могут выявляться и фибриллярные комплексы тотального, немеченого хроматина. В этом случае визуально хроматиновые фибриллы напоминают ПКХ, индуцированные в G2. В них наблюдаются участки, где прослеживаются две хроматцды, однако общая толщина таких хромосом, в отличие от настоящих G2-nKX или митотических хромосом, не постоянна. В таких клетках

новореплицированная ДНК выявляется на периферии фибрилл хроматина в виде очень крупных блоков, в которых отдельные точечные сайты неразличимы.

Для изучения хроматина, закончившего репликацию, предшественник вносили за 15 минут до индукции слияния клеток и выявляли через 45 минут после слияния.

На хромосомных препаратах из таких клеток отчетливо видны линейные ассоциации меченых единиц. Они также имеют вид цепочек, однако в них расстояния между отдельными флуоресцентными единицами существенно меньше, чем на препаратах из клеток, получивших импульсную метку.

При удлинении периода ожидания до 180 минут (135 минут до индукции слияния клеток и 45 минут после), БрдУ-содержащий материал колокализуется с конденсированными элементами пульверизованного хроматина.

В некоторых клетках, за время ожидания перешедших в фазу G2, сформировались хромосомы, демонстрирующие характерное распределение метки в виде поперечных полос, аналогичных выявляемым на митотических хромосомах методом репликационного бэндинга.

Клетки с ПКХ предоставляют уникальную возможность наблюдать естественное фракционирование хроматина по его способности к компактизации, что делает эту модель своеобразным ш v/vo эквивалентом пермеабилизации в растворах с низкой ионной силой. Обе модели наглядно демонстрируют зависимость способности хроматина к упаковке в структуры высшего порядка от его репликационного статуса.

Использование репликационного мечения в сочетании с иммуноцитохимической визуализацией сайтов включения позволило продемонстрировать наличие нескольких зон включения предшественников ДНК в растянутых деконденсированных сегментах, соединяющих отдельные конденсированные блоки в составе пульверизованного хроматина в клетках с ПКХ. Этот факт является прямой демонстрацией кластеров репликационных единиц в живых клетках.

Также была показана прогрессия упаковки материала отдельных репликонов в фибриллы хроматина. Согласно полученным данным, при завершении репликации данного сегмента ДНК, упаковка реплицированной ДНК в фибриллу хроматина — предположительно, уровня хромонемы. Однако такая хромонема не способна к дальнейшей упаковке в более крупные блоки.

Данные литературы позволяют с уверенностью считать выявляемые в составе пульверизованного хроматина конденсированные блоки сегментами формирующихся хроматид, на что указывает, в первую очередь, динамика изменения их размеров, количества и взаиморасположения, охарактеризованная в работе (Mullinger and Johnson, 1983). НовореплицированныЙ хроматин приобретает способность упаковываться в надхромонемные структуры по прошествии нескольких часов после завершения репликации.

В пользу этого утверждения свидетельствуют не только результаты изучения локализации отложенной метки, но и прямая визуализация клеток, в которых продолжается репликация отдельных сегментов ДНК на фоне хромосом, повторяющих строение G2-nKX и демонстрирующих четко выраженные две хроматиды. Это наблюдение показывает, что к концу S-фазы большая часть хроматина, завершившего репликацию, полностью готова к дальнейшей компактизации.

Данные, полученные при изучении клеток с ПКХ, согласуются с результатами визуализации отложенной метки на ультраструктурном уровне. В части клеток выявляются достаточно протяженные меченые участки хромонемных элементов, в которых реплицированный хроматин выявляется в хорошо различимых отдельных сегментах, отождествляемых с хромомерами. Эти данные позволяют предполагать, что именно хромомеры являются формой упаковки индивидуальных репликонов.

Важно отметить, что при электронно-микроскопическом исследовании с применением пермеабилизации в растворах с низкой ионной силой, в большинстве клеток после отложенного мечения нельзя выявить точек бифуркации и участков, на которых прослеживались бы две параллельные меченые фибриллы хроматина, в то время, как данные, полученные с помощью флуоресцентной гибридизации in situ , показывают, что сегрегация новореплицированной ДНК происходит почти сразу после завершения репликации (Selig et al., 1992).

Модель организации репликационного сайта и структурной организации реплицируемого хроматина.

В свете представленных данных предлагается следующая универсальная модель организации репликационного процесса в контексте высших уровней организации хроматина (рис. 2). Единица репликации — линейный репликон (сегмент молекулы ДНК, реплицируемый одним репликационным комплексом) - соответствует хромомеру, глобулярному хроматиновому комплексу диаметром 60-100 нм. Линейные ассоциации хромомеров формируют сегменты хромонем. В активно транскрибирующемся хроматине хромонемы могут не выявляться, распадаясь на отдельные хромомеры, что косвенно подтверждается данными литературы (Muller et al., 2001; Muller et al., 2004).

Индивидуальные хромомер представляет собой плотную ассоциацию нуклеомеров — относительно независимых друг от друга сегментов элементарной хроматиновой фибриллы диаметром 30 нм (Кирьянов и др.., 1981). Инициация репликации приводит к дестабилизации хромомеров. Хроматин разворачивается до 30-нм нуклеомерной фибриллы и в такой форме реплицируется. Нельзя отрицать возможность существования хроматина в форме 10-нм нуклеосомной фибриллы в непосредственной близости или внутри репликационного комплекса (реплисомы).

Рис. 2. Модель организации PC. а - Тандемно расположенные, одновременно начинающие функционировать репликоны в составе фибрилл хроматина. Исходный хроматин обозначен серым цветом, прошедший репликацию - темно-серым. Реплисомы обозначены белыми ромбами. Пунктирный контур - границы флуоресцентного PC. б-е — Этапы корепликационных преобразований индивидуального хромомера, глобулярного комплекса диаметром 100 нм, содержащего 7-10 нуклеомеров или 70-100 нуклеосом. Инициация репликации вызывает распад хромомера на нуклеомеры. Восстановление хромомерной конформации происходит после прохождения репликационного комплекса. Завершение репликации соседних репликонов происходит при встрече движущихся навстречу друг другу реплисом.

Зона репликации ДНК (репликационный сайт) представляет собой участок локальной деконденсации хромонемы. Тот факт, что деконденсация одного сегмента хромонемы может не затрагивать соседние хромомеры, позволяет определять репликционный сайт как субхромосомный микродомен, относительно независимый от соседних сегментов. Имеющиеся данные о поведении меченых участков ДНК в последующих клеточных циклах (Sparvolli et al., 1994; Jackson and Pombo, 1998) дают все основания предполагать подобное поведение и для хромомеров, формирующихся после завершения репликации в данной зоне.

Современные модели топологических преобразований ДНК указывают на ключевую роль разделения молекулы ДНК на топологические домены, без чего невозможна эффективная декатенация и сегрегация дочерних цепей ДНК после завершения репликации (Hardy et al., 2004). Можно предполагать, что хромомерная организация ДНК является отражением системы барьеров, выполняющих эту функцию.

Упаковка новореплицированного хроматина в комплексы высшего порядка осуществляется в течение нескольких минут после прохождения полимеразы.

Происходит частичное восстановление хромомерной конформации. Сегрегация новореплицированного материала происходит спустя некоторое время после завершения репликации данного сегмента молекулы ДНК.

В эухроматических доменах единовременная активация происходит в немногочисленных тандемно расположенных репликонах, а при репликации гетерохроматиновых областей синхронно инициируется большое количество репликационных единиц. Имеющиеся данные пока не позволяют дать ответ на вопрос о природе механизма синхронной активации репликации в нескольких репликонах.

Репликационный сайт, визуализируемый иммуноцитохимическими методами с помощью светового микроскопа, представляет собой несколько пар репликационных комплексов, движущихся вдоль 30 нм фибрилл хроматина. Подвижность полимераз ограничена в небольшом объеме из-за взаимодействия с более компактным хроматином, окружающим репликационный сайт, и поэтому не может быть выявлена при светооптических наблюдениях.

Выводы.

1) Показано, что оптимальным подходом к визуализации РС, обеспечивающим сохранность структур хроматина, является выявление репликационной метки на поверхности ультратонких срезов,

2) В условиях структурной модификации хроматина, общая организация паттернов распределения РС, соответствующих различным стадиям Б-фазы, не претерпевает изменений. При полной экстракции гистонов сохраняется только паттерн, соответствующий ранней 5-фазе.

3) При декомпактизации хроматина до нуклеосомных фибрилл РС сохраняют дискретность, но частично деком пактизируются. Полная декомпактизация РС происходит только при исчерпывающей экстракции гистонов в условиях отложенного мечения.

4) Реплицируемый хроматин, включающий импульсную метку, формирует линкеры между компактными сегментами хромонем, представлен фибриллами и глобулярными элементами диаметром 30-40 нм и не компетентен к компактизации в макромолекулярные комплексы более высокого порядка — хромомеры и хромонемы.

5) В условиях, позволяющих выявлять иерархические уровни компактизации хроматина (нуклеомеры и хромомеры/хромонемы) не обнаружено структур, соответствующих гипотетическим «репликационным фабрикам».

6) Структурная организация реплицирующегося хроматина не различается в эухроматине, факультативном и конститутивном гетерохроматине,

7) Основным структурным мотивом конститутивного гетерохроматина является плотно уложенная хромонема, состоящая из хромомеров.

8) Эу- и гетерохроматические домены отличаются друг от друга по

размерам кластеров репликонов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Лазарева Е.М., Наджип Г. А., Голышев С. А., Поляков В. Ю., Динамика репликационных сайтов и макромолекулярных комплексов хроматина (хромонем) в клетках Allium сера L. Биологические мембраны, 22(3): 188-195(2005).

Голышев С.А., Шеваль Е.В., Вихрева П.Н., Поляков В.Ю. Гетерогенность структуры и состава хромоцентров в клетках линии L929. Материалы XV Всероссийского совещания «Структура и функции клеточного ядра», Цитология, 47: 804 (2005).

Поляков В.Ю., Зацепина О.В., Киреев И.И., Прусов А.Н., Файс Д., Шеваль Е.В., Коблякова Ю.В., Голышев С.А., Ченцов Ю.С., Структурно-функциональная модель митотической хромосомы. Биохимия, 71(1): 6-16 (2006),

Голышев С.А., Поляков В.Ю. Ультраструктура хроматина в сайтах репликации. В печати.

Заказ № 27/10/06 Подписано в печать 03.10.2006 Тираж 130 экз. Усл. п л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 yvwwxfr.ru ; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Голышев, Сергей Александрович

Введение.

Обзор литературы.

Организация интерфазного хроматина.

Уровни компактизации хроматина в интерфазе и в митозе.

Компартментализация хромосом в интерфазном ядре.

Подвижность хроматина.

Репликация ДНК - процесс, организованный в пространстве и во времени.

Дискретность репликации.

Локальные изменения структуры хроматина при взаимодействии с репликационным комплексом.

Топология, структура и свойства репликационных сайтов.

Ультраструктура репликационных сайтов.

Преждевременно-конденсированные хромосомы - «моментальный снимок» активных репликационных единиц.

Задачи работы.

Материалы и Методы.

Используемые сокращения.

Культура клеток.

Маркирование сайтов репликации и новореплицированной ДНК.

Индукция преждевременной конденсации хроматина.

Получение хромосомных препаратов.

Стандартная фиксация.

Пермеабилизация клеток.

Получение препаратов стабилизированного ядерного матрикса.

Иммуноцитохимическое выявление БрдУ.

Изучение препаратов и регистрация результатов.

Электронно-микроскопические исследования.

Выявление реплицированной ДНК на ультратонких срезах.

Изучение и обработка электронно-микроскопических данных.

Результаты.

Характеристика клеточных моделей.

Динамика репликационных сайтов в клетках линии СПЭВ, фиксированных т эки.

Импульсное и «отложенное» мечение.

Длительное мечение.

РС в условиях структурной модификации хроматина.

Роль гистонов и негистоновых белков в организации РС.

Репликационные сайты в клетках линии Ь929. Импульсное и «отложенное» мечение. .56 Оптимизация метода выявления репликационных сайтов на ультраструктурном уровне.

Ультраструктурная организация реплицирующегося хроматина (факультативного гетерохроматина и эухроматина) в клетках линии Ь929.

Структурная организация реплицирующегося конститутивного гетерохроматина хромоцентров) в клетках линии Ь929.

Световая микроскопия.

Электронная микроскопия.

Организация реплицирующейся ДНК в дифференциально деконденсированном хроматине.

Упаковка хроматина, закончившего репликацию.

Зоны репликации в преждевременно конденсированных хромосомах.

Обсуждение результатов.

Методические подходы к изучению ультраструктуры реплицируемого хроматина.

Организация тотального хроматина.

Реакция репликационных сайтов и реплицированного хроматина на изменения ионных условий.

Различные конфигурации зон репликации ДНК.