Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительно-иммунохимическое исследование хроматина позвоночных животных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительно-иммунохимическое исследование хроматина позвоночных животных"

ЛЕНИНГРАДСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени А. А. ЖДАНОВА

На правах рукописи

ФЕДОРОВА Наталия Андреевна

УДК 576.315.42 : 615.373.3

СРАВНИТЕЛЬНО-ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХРОМАТИНА ПОЗВОНОЧНЫХ животных

03.00.04 — БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ЛЕНИНГРАД

1988

Работа выполнена на кафедре биохимии биолого-почвенного факультета Ленинградского государственного университета им. А. А. Жданова.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор И. Г. ЩЕРБАК; доктор биологических наук, профессор В. И. ВОРОБЬЕВ; доктор биологических наук, старший научный сотрудник И. П. ГАВРИЛЮК.

Ведущее учреждение: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова АН СССР.

дании специализирован!! г , ученой

степени доктора биологических наук при Ленинградском государственном университете им. А. А. Жданова (199034, Ленинград, Университетская наб. 7/9, ауд. 90).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ленинградского государственного университета им. А. А. Жданова.

Защита состоится

засе-

Автореферат

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Н. Д. ЕЩЕНКО

5 3

I , J ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

| v г/. Актуальность теш. Универсальность нуклеосомного уровня ^'.^организации хроматина эукариот не исключает различий в белковом составе и размерах нуклеосом. Спектры поверхностно-расположенных фрагментов хромосомальных белков определяются как собственно белками, так и их взаимодействием с гомологичной ДНК, т.е. они . являются по-существу интегрированным выражением фено- и ге-нотипических признаков. В связи с этим представляется перспективным использовать результаты сравнения спектров поверхностно расположенных фрагментов хромосомальных белков при изучении превращений хроматина в процессе раннего эмбрионального развития и дифференциации тканей, а также апробировать возможность использования результатов такого сравнения в качестве количественного критерия при построении естественных систем. В предстоящем десятилетии, вероятно, именно молекулярно-биологическим критериям будет принадлежать главенствующая роль при решении спорных вопросов филогении ныне живущих ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ /Nelson, 1987/.

Изменения функциональной активности хромосомального материала эукариот имеют, по-видимому, решающее значение в становлении состояний длительной устойчивой адаптации к экстремальным воздействиям и, в частности, к гипоксии. Однако к началу настоящей работы особенности состава и конформации хроматина тканей контрольных и адаптированных к гипоксии животных не были изучены. Отсутствовали также данные по сравнению влияния адаптации к гипоксии на хроматин разных тканей. В качестве одного из подходов для выявления изменений состава и конформации хромосоыально-го материала, обусловливающих изменения его функциональной активности, может быть сравнение спектров фрагментов белковых молекул, расположенных на поверхности хроматина.

Иммунохимический анализ является весьма тонким и чувствительным приемом как для обнаружения аминокислотных замен в гомологичных белках, происходящих в процессе эволюции, так и для выявления изменений в конформации целых биологических систем и входящих в их состав молекул. Указанные особенности делают в настоящее время иммунохишческие методы инструментом, не имеющим эквивалента в исследовании целостных биологических систем. Это позво-

ляет считать иммунохимический анализ хроматина перспективным для выявления филогенетических связей и понимания механизмов адаптации к экстремальным воздействиям.

Цель работы. Исследование антигенных свойств хроматина позвоночных животных в процессе раннего индивидуального развития, дифференциации тканей и при изменении функциональных состояний.

Апробация возможности использования различий в антигенных свойствах хроматина в качестве доголнительного количественного критерия при проведении сравнительно-эволюционных исследований.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые для изучения стадийно- и функционально-специфических превращений хроматина позвоночных животных использованы цриемы иммунохимического анализа, применение которых не вызывает разрушения надмолекулярной организации хроматина. Преимущество такого подхода состоит также в том, что он обладает высокой чувствительностью и позволяет улавливать изменения как во всей совокупности поверхностно-расположенных эпитопов хроматина, так и, в случае применения антисывороток к индивидуальным белкам, в отдельных фрагментах системы".

Установлено, что формирование спектра антигенных детерминант хроматина происходит в процессе индивидуального развития животных и не заканчивается к моменту окончания органогенеза.

Впервые в опытах ин виво показано, что при длительной адаптации к прерывистой гипоксии средней тяжести происходят изменения в антигенной структуре хроматина мозга и сердца. Эти изменения выражаются , в частности, в увеличении антигенной активности белков высокоподвижной группы. Отсутствие изменений в антигенных свойствах хроматина печени свидетельствует, вероятно, о том, что в данных условиях этот орган или не испытывает недостатка в кислороде, или его энергетические затраты восполняются за счет гликолиза.

Выявленные изменения в антигенных свойствах хромосомалъных белков при адаптации к гипоксии позволяют приблизиться к пониманию механизмов процесса адаптации, происходящего в генетическом аппарате.

Обоснована возможность использования данных сравнительно-иммунохимического анализа хроматина в качестве дополнительного критерия в сравнительно-эволюционных исследованиях и для решения вопросов таксономии.

Апробация работа. Материалы диссертации были доложены: на Всесоюзных конференциях по нейрохимии /Ростов-на-Дону,. 1976; Ереван, 1983; Горький, 1987/; Всесоюзной конференции по белкам ЦНС /Днепропетровск, 1978/; Всесоюзных симпозиумах по структуре и функции клеточного ядра /Новосибирск, 1975; Алма-Ата, 1977; Харьков, 1980/; Конференции биохимиков Прибалтийских республик, Белорусской ССР и Ленинграда /Рига, 1981/; Всесоюзных биохимических съездах /Ленинград, 1979; Киев, 1986/; Советско-американском симпозиуме по метаболизму миокарда /Ташкент, 1979/; X Международном конгрессе кардиологов /Москва, 1980/; ганференциях Федерации Европейских Биохимических Обществ /Дрезден, ГДР, 1978; Москва, 1984/.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитированной литературы - 350 наименований на русском и иностранных языках. Работа изложена на 282 страницах машинописного текста и иллюстрирована 87 рисунками и 25 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для сравнения антигенных свойств хроматина печени и мозга использовали 21 вид позвоночных животных, из них: 8 видов млекопитающих и 9 видов рыб. Место обитания 6 исследованных видов рыб - Черное море и трех шдов - пресноводные водоемы Северо-Запада Европейской части СССР. Остальные виды животных были получены из питомника "Рапполово".

Адаптацию крыс линии Вистар к высотной гипоксии проводили в барокамере в течение 30 суток по 6 часов ежедневно при постепенном нарастании условной высоты по следующей схеме: 1-й день 3000 м, 2-3-й дни -.4000 м, 4-8-й дни - постепенное повышение до 5500 м, с 10-го дня - до 6500-7000 м. Высоте 2500-3000 м над уровнем моря соответствует 15-16$ содержание кислорода в воздухе, 5000 м - 11% и 6500 м - 8-9%. Последнее создает условия для создания гипоксии средней тяжести у данного вида животных.

Методы выделения кардиомиоцитов. ядер и хроматина. Кардио-миоциты выделяли из желудочков сердца крыс /5Нск е.а., 1974/.

Выделение ядер из всех исследованных тканей, за исключением сердечной мышцы, проводили с использованием тритона Х-100 /ьисасз, Sekeris, 1967/. Ядра из клеток миокарда выделяли с использованием 0,15? тритона Х-ЮО и 2,2 М сахарозы ¿.iew,Soie, 1978/. Выделение хроматина осуществляли обработкой осадка ядер раствором Naci-.ЭДЕА, а затем последовательно растворами трис'а (рН-7,9) убывающей концентрации - ОТ 0,05 ДО 0,001 М / Huang,Huans, 1969/.

Выделение и очистка свракыий гистонов. их комплексов и фракций негистоновых белков Мб. Отдельные фракции гистонов выделяли методом кислотной экстракции с последующим дробным осавдени-ем этанолом /j0hns е.а., I960/ и фракционированием на карбокси-метилцеллшозе /johns, 1964/. Гистон HI получали методом солевой экстракции /i'iiohaiakis, е.а., 1976/. Комплексы гистонов Н2А-Н2В и НЗ-Н4 получали путем замещения гистонов в препаратах ДНП про-тамином с последующим фракционированием гистонов и их комплексов на колонках сефадекса Г-50 тонкий /уап der westhvzen,von Holt, 1971/.

Выделение тотальных белков НМ6 осуществляли либо из целой ткани /Sanders, 1971/, либо из ядер'/Rabbani е.а., 1978/. Суммарный препарат белков НМ6 фракционировали на карбоксиметил се-фадексе Г-25 /Rabbani е.а., 1978/.

Электрофорез белков хроматина осуществляли в 7,5$ полиак-риламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия /Bhoryee, Pederson ^73>/. Расчет площадей белковых пиков на основании денситограмм хромосомальных белков осуществляли с помощью системы анализа изображений ibas -Г (ФРГ). Электрофорез основных белков проводили в 15$ полиакриламидном геле при рН-2,7 в присутствии 2,5 М мочевины /Panyim,Chaikiey, 1969/. Электрофорез комплекса гистонов проводили в 10$ полиакриламидном геле в нативных условиях /tewis., 1976/.

Чистоту фракций белков HMG контролировали по электрофоре-тической подвижности по величинам молекулярных масс, определяемых методом тонкослойной хроматографии /Лазуркина, 1972/. и по аминокислотному составу. Аминокислотный анализ фракций белков HMG проведен в отделе молекулярной биологии Всесоюзного института растениеводства им.Н.И.Вавилова под руководством старшего научного сотрудника З.В.Чмелевой.

Имиунохимиче ские методы. Для получения иммунных сывороток использовали кроликов породы шиншилла. В зависимости от вводимого антигена применялись различные схемы иммунизации. В работе использованы антисыворотки к хроматину печени и мозга различных видов позвоночных животных, к хроматину сердца крысы, дегисто-низированному хроматину печени и мозга крысы, гомплексу гистонов НЗ-Н4, белкам НМ6 2, НМ6 14 и НМ6 17. Дегистонизированный хроматин получали по методу Хитила и Спелсберга /сьу-Ы1,Зре1зЪеге, 1971/ в нашей модификации. Выделение гамма-глобулиновой фракции из иммунных сывороток осуществляли методом ионообменной хроматографии на колонках ДЕАЕ целлюлозы /ьеуу,ЗоЪег, 1960/. Анализ электрофореграмм гамма-глобулиновой фракции показал, что с помощью этого метода возможно получить достаточно очищенную гамма-глобулиновую фракцию иммунных сывороток, содержащую меньше 4% примеси других сывороточных белков. Сыворотки и выделенные из • них гамма-глобулиновые (фракции хранили в запаянных ампулах с добавлением мертиолата (1:1000) при -Ю°С.

Двойную иммунодиффузию в геле проводили по Оухтерлони в микромодификации Гусева и Цветкова /1961/. В работе использованы два варианта реакции связывания комплемента: микро /Кэбот, Мей-ер, 1968/ и количественный вариант /Зейфарт, 1979/. Фиксацию препаратов для проведения непрямой иммунофлуоресценции проводили по методу Сидоровой и Грушина /1979/. Далее препараты обрабатывали иммуноспецифичной антисывороткой в соответствующем разведении и люминесцирующей ослиной антисывороткой против глобулинов кролика, меченой изоцианатом флуоресцеина (Институт им.М.Ф.Гамалеи АН СССР). Препараты фотографировали на фотопленку фото-130 с помощью фотомикроскопа ор-ьоп (ФРГ), Интенсивность иммунофлуоресценции ядер определяли на сканирующем денситометре '¿ИР-03 Ор-Ьоп (фрг) .

Математическую обработку результатов проводили согласно рекомендациям Рокицкого /1967/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изменения антигенных свойств хроматина в процессе онтогенетического развития. Нами проведено сравнение антигенных свойств хроматина ранних стадий развития эмбрионов травяной лягушки ( r. temporaria ). в таблице I суммированы результаты, полученные методом двойной иммунодиффузии в геле при использовании тотальных и адсорбированных антисывороток. Сопоставление данных, полученных с применением тотальных и адсорбированных антисывороток, показывает, что они хорошо совпадают. При использовании в качестве сорбента хроматина эмбрионов определенной стадии развития из антисыворотки удалялась часть антител и происходило уменьшение спектра линий преципитации, образованного .истощенной"' антисывороткой при взаимодействии с гомологичным хроматином. В каждом случае число исчезнувших линий преципитации было равно числу линий, образуемых неистощенной антисывороткой с хроматином, используемым в качестве сорбента. Сравнительно-иммунохимическое изучение хроматина ооцитов и эмбрионов лягушки стадий средней гаструлы, хвостовой почки и мышечных реакций показало, что в процессе раннего онтогенетического развития происходят изменения антигенных свойств хроматина, характеризующиеся постепенным увеличением сходства с хроматином дифференцированных тканей (печень).

Сопоставление результатов иммунохимического анализа хроматина и электрофоретического разделения хромосомальных белков эмбрионов лягушки разных стадий развития позволяет предположить, что изменения антигенных свойств хроматина обусловлены в первую очередь качественными изменениями состава негистоновых белков и в меньшей степени отдельных фракций гистонов.

Исследование антигенных свойств хроматина печени и мозга куриных эмбрионов поздних стадий развития (9-, 13-, 18-й дни инкубации) показало, что и после окончания оргалогенеза в го згу и печени куриных эмбрионов продолжается формирование спектра белковых антигенных детерминант, образующих на поверхности хроматина меняющуюся мозаику. Электрофоретический анализ хромосомальных белков мозга куриных эмбрионов разного возраста не выявил различий в содержании и подвижности фракций гистонов. В то же время существенные изменения имели место в группе негистоновых белков. Наблюдаемые различия в качественном и количественном со-

Таблица I

Иммунологическое сходство хроматина ранних стадий эмбрионального развития лягушки (ооциты, средняя гаструла, хвостовая почка, стадия мышечных реакций) с хроматином печени взрослых особей 36

Антисыворотка к хроматину печени Антиген - хроматин печени

Ш опытов Антигены (хроматин) Антисыворотка к хроматину печени Антисыворка к хроматину печени, истощенная хроматином эмбрионов ранних стадий развития

Печень лягушки Ооциты Средняя гаструла Хвостовая почка Стадия мышечных реакций Ооциты Средняя гаструла Хвостовая почка Стадия мышечных реакции

I 8 0 I 2 3 8 8 6 6 5

2 8 0 2 2 3 8 8 6 6 5

3 8 0 2 2 3

* Цифрами в таблице обозначено число линий преципитации

Таблица 2

Сравнительная иммунологическая характеристика хроматина печени разных стадий онтогенетического развития куриных эмбрионов и взрослых птиц *

Антисыворотка к хроматину печени Антиген - хроматин печени курицы

ш опытов пп Антигены (хроматин печени) Антисыро-тка к хроматину печени курицы Антисывортка к хроматину печени курицы, истощенная хроматином печени куриных эмбрионов:

курицы куриных эмбрионов

9-дневных 13-дневных 18-дневных 9-дневных 13-дневных 18-дневных

I 6-7 2 2 5 7 6 4 2

2 6-7 I 2 5 6 5 4 2

3 7 1-2 3 5 7 6 4 2

4 6 I 2

5 7 2 5

6 7 2 3 5

36 Цифрами в таблице обозначено число линий преципитации

ставе негистоновых белков одноименных тканей куриных эмбрионов разного возраста, очевидно, обусловливают отличия в антигенных свойствах хроматина (таблица 2).

Антигенные свойства хроматина некоторых видов позвоночных; животных (сравнительно-эволюционный аспект). При апробации возможности использования результатов сравнительного иммунохимичес-кого анализа хроматина в качестве критерия в эволюционных исследованиях на первом этапе работы было необходимо установить возможные границы применения этого критерия, иными словами выяснить между хроматином представителей какого ранга таксонов имеют место перекрестные иммунологические реакции.

Для решения этой задачи был использован метод двойной иммуно-диффузии в геле, позволяющий при использовании специальных штампов вносить в гель сразу несколько антигенов или антисывороток и выявлять наличие или отсутствие перекрестных иммунологических реакций одновременно между несколькими видами хроматина.

В опытах применялись кроличьи антисыворотки к хроматину печени И мозга карпа /Cyprinus carpiq/ И лягушки (Rana temporaria

), мозга курицы (Gallus domesticus ) И крысы (Rattus ), печени черепахи (Testudo horsefieide ). Указанные антисыворотки практически не реагировали перекрестно с гетерологичным хроматином одноименных тканей представителей других классов (рис.1).

В дальнейшем сравнивались антигенные свойства хроматина одноименных тканей в пределах отдельных классов позвоночных животных: костные и хрящевые рыбы, млекопитающие.

В результате проведенных исследований по сравнению антигенных свойств хроматина одноименных тканей представителей класса млнкопитающих методом двойной иммунодиффузии в геле с использованием тотальных и адсорбированных антисывороток не было выявлено общих антигенных детерминант у представителей разных отрядов. В то же время черты иммунологического сходства отчетливо выявлялись в хроматине видов млекопитающих, принадлежающих к одному отряду.

Для оценки количественных различий в иммунологических свойствах хроматина печени и мозга исследуемых видов млекопитающих был использован микровариант реакции связывания комплемента. Активность связывания комплемента при взаимодействии антисыворот-

Рис.1. Взаимодействие антисывороток к хроматину печени карпа (А), лягушки (Б) и черепахи (В) с гомологичным и гетероло-гичным хроматином.

А:АС - антисыворотка к хроматину печени карпа; хроматин печени карпа (I и 4), лягушки (2), черепахи (3), курицы (5) и крысы (6).

Б:АС - антисыворотка к хроматину печени лягушки: хроматин печени лягушки (I и 4), карпа (2), черепахи (3), курицы (5) и крыВ сы (6).

В:АС - антисыворотка к хроматину печени черепахи; хроматин печени черепахи (I и 4) карпа (2 и 3), курицы (5) и крысы (6).

ки к хроматину печени крысы с хроматином печени различных видов убывала в ряду: крыса у мышь > хомяк У морская свинка > кошка собака у баран. Подобная закономерность имела место и при взаимодействии антисывороткй к хроматину мозга крысы с хроматином мозга указанных видов. Так, различия в иммунологических свойствах хроматина мозга крысы и мыши были недостоверны. Величины индексов различий- и иммунологические дистанции для хроматина печени и мозга исследуемых видов приведены в табл.3. Индексы различий представляют собой отношение титра антисыворотки при ее взаимодействии с гомологичным антигеном, дающим 50% связывание комплемента, к титру этой антисыворотки при ее взаимодействии с гетерологичным антигеном. Иммунологическую дистанцию вычисляли по формуле: ИД = 100 х ИР,

где ИД - иммунологическая дистанция; ИР - индекс иммунологических различий.

Таблица 3

Индексы иммунологических различий (ИР) и иммунологические дистанции (ИД) для хроматина печени, и мозга некоторых видов млекопитающих *

Отряд Грызуны Парнокопытные Хищные

Подотряд Мышеобразные Дикообразные Жвачные

Семейство Мышеобразные Хомякооб-разные Свинковые Полорогие Волчьи Кошачьи

Род Крыса Мышь Хомяк М.свинка Баран Собака Кошка

щ> печень мозг 3,2 1,1 4,3 3,2 17,3 3,5 52,0 84,0 43,3 56,0 19,2 30,0

щ печень мозг 47 4,1 60 50 123 54 171 192 163 174 127 147

х Систематическое положение видов дано по Соколову (79,80)',

Анализ полученных результатов, проведенный с помощью компьютера ibas-1 (ФРГ), показал, что различия в иммунологических свойствах хроматина печени у представителей разных родов семейства мышеобразных (крыса-мышь), у представителей разных семейств отряда (мыше образные-хомякообразные) и между отрядом грызунов и представителями других отрядов класса млекопитающих (парнокопытные, хищные) достоверны с уровнем достоверности 99$. Величины ИД для хроматина печени представителей разных отрядов класса млекопитающих были в 2,5-3,6 раза выше, чем для представителей разных родов. Еще большие величины ВД были установлены для хроматина мозга представителей разных отрядов, которые в 3,6-4,8 раза превышали таковые у представителей разных родов.

При сравнении антигенных свойств хроматина печени и мозга представителей 2-х классов рыб - костных и хрящевых - использовались антисыворотки к хроматину печени и мозга карпа и печени морской лисицы. Систематическое положение исследуемых видов рыб приведено в таблице 4.

Методом двойной иммунодиффузии в геле с использованием тотальной и адсорбированной антисыворотки к хроматину печени карпа было показано, что в хроматине печени представителей разных отрядов костных рыб имеются общие и специфические антигенные детерминанты. В то же время иммунологическое сходство между хроматином печени костных и хрящевых рыб этим методом не было выявлено. Аналогичные результаты были получены при использовании в реакции двойной иммунодиффузии антисыворотки к хроматину печени морской лисицы. Напротив, в хроматине мозга костных (карп) и хрящевых (катран, морской кот) рыб были обнаружены общие антигенные детерминанты.

Для количественной оценки иммунологических различий между хроматином одноименных тканей исследуемых видов рыб был использован метод РСК. Величина ИД при сравнении хроматина печени лосося с хроматином печени карпа составляла 90,3. Значительно больше величины ИД были получены при сравнении хроматина печени карпа с хроматином печени хрящевых рыб - катрана - 150,5 и морского кота - 180,6.

В сравнительных исследованиях хроматина печени рыб с помощью метода РСК была использована также антисыворотка к хроматину печени морской лисицы. Данная антисыворотка в гетерологичных

Таблица 4

Систематическое положение исследуемых видов рыб (70)

Л Вид Семейство Отряд Класс

I Катран Катрановые акулы Катранообразные Хрящевые рыбы

2 Морская лисица Ромбовые скаты Скатообразные

3 Морской кот Хвостоколовые скаты Хвостколообразные

4 Сазан-карп Карповые Карповые Костные рыбы

5 Лосось озерный Лососевые Лососеобразные

6 Форель радужная * _II_

7 Ласкирь Спаровыо Окунеобразные

8 Барабулька Султанковые

9 Морская камбала Камбаловые Камбалообразные

Места обитания карпа, лосося и форели - пресноводные водоемы Ленинградской области Место обитания остальных указанных в таблице рыб - Черное море

системах при уменьшении ее разведения, необходимого для достижения 50% связывания комплемента, проявляла заметнуй антикомплементарную активность. Поэтому сравнительную оценку антикомплементарной активности гомологичной и гетерологичной систем осуществляли на основании данных с связывании комплемента при одинаковом разведении антисыворотки. При разведении 1:64 антисыворотка к хроматину печени морской лисицы в гомологичной системе связывала комплемента больше, чем при взаимодействии .с хроматином печени катрана, морского кота, камбалы, лосося, ласкиря и барабульки в 2,27; 2,34; 2,46; 2,60; 2,88 и 4,43 раза, соответственно."По степени иммунологического -сходства с хроматином печени морской лисицы хроматин одноименной ткани исследуемых видов рыб может быть представлен в виде следующего ряда: катран / морской кот / камбала>

лосось > ласкирь ^ барабулька. Таким образом, тенденция к превышению межклассовых различий в антигенных свойствах хроматина над межотрядными наблюдалась и при использовании в РСК антисыворотки к хроматину печени морской лисицы.

В целом проведенные исследования показали, что перекрестные иммунологические реакции мевду хроматином печени представителей классов костных и хрящевых рыб выражены слабо и выявляются при использовании одного из наиболее чувствительных методов иммунохимии - РСК. При использовании антисыворотки к хроматину печени карпа межклассовые различия (костно-хрящевые рыбы) в иммунологических свойствах хроматина^печени, выраженные в величинах иммунологических дистанций, превышали межотрядные в 1,6-2 раза. В то же время было установлено, что в хроматине мозга хрящевых и костистых рыб имеются как общие, так и специфические антигенные детерминанты, выявляемые методом двойной иммунодиффузии.

Антигенные свойтсва хроматина сердца, мозга и печени кшс в норме и при адаптации к гипоксии. Устойчивая адаптация к длительной гипоксии характеризуется увеличением транскрипции ядерных геномов сердечной мышцы и нейронов головного мозга /Меерсон, 1973; Меерсон и др., 1973/. Однако в литературе практически отсутствуют данные об особенностях белкового состава и пространственной организации хроматина ин виво при изменениях функциональных состояний, не связанных с процессом дифференциации и злокачественного перерождения тканей. В связи с этим представляло интерес провести сравнительное изучение антигенных свойств хро-

17 Я

Рис„2. Спектры линий преципитации, образованные антисыворотками к хроматину сердца адаптированных к гипоксии (А) и контрольных ХБ) крыс с хроматином сердца адаптированных к гипоксии (3,7) и контрольных (I, 5,9) крыс, негистоновыми белками (2) и гистоном НЕ (4) сердца крысы и комплексами гистонов Н2А-Н2В (6) и НЗ-Н4 (8) тимуса теленка.

матина и входящих в его состав'белков в тканях, чувствительных

к недостатку кислорода: мозг, сердце в норме и при адаптации к

гипоксии.

Сравнение спектров линий преципитации хроматина сердца контрольных и адаптированных к гипоксии животных показывает, что при адаптации к гипоксии возрастает антигенная активность неги-стоновых белков и гистона НЕ (рис.2). Увеличение антигенной активности негистоновых белков может быть обусловлено как увеличением их содержания, так и изменением конформации хромосомального материала. Увеличение же в степени "представленности" антигенных детерминант гистона НЕ может быть, по-видимому, связано с изменениями в его локализации.

Дальнейшие исследования показали, что интенсивность иммуно-флуоресценции ядер кардиомиоцитов контрольных животных (рис.3 и . 4), обработанных антисывороткой к хроматину сердца адаптированных к гипоксии животных, больше, чем при использовании антисыво-

Рис.3. Желудочковые кардиошоциты крысы. Окраска гематоксилином и эозином.

Рис.4. Иммунофпуоресценция ядра келудочкого кардио-миоцита крысы.

Разведение кроличьей антисыворотки к хроматину сердечной мышцы крысы, адаптированной к гипоксии 1:160. Разведение флуоресциирующей антикроличьей сыворотки 1:64.

ротки к хроматину сердца контрольных (табл.5). Полученные результаты свидетельствуют об увеличении способности антигенных детерминант хроматина миокарда стимулировать выработку соответствующих антител при адаптации к гипоксии, т.е. указывают на кон-формационные превращения (релаксацию) хромосомального материала.

Для сравнительного исследования хроматина мозга контрольных и адаптированных к гипоксии крыс в данной работе были использованы метод непрямой иммунофлуоресценции и реакция связывания комплемента. При постановке опытов применялись антисыворотки, полученные при иммунизации кроликов хроматином мозга контрольных и адаптированных к гипоксии крыс и к отдельным фракциям белков HMG. Использование последних представляло особый интерес, так как возможно, что белки HMG являются одними из обязательных факторов, обеспечивающих формирование активно-транс1фибируемой конформации хроматина //Jesterman.Grossbach, 1984; Wooley е.а. 1981; Cooper,Spaudling, 1983; Dobric.Witting, 1987/. При использовании антисывороток к белкам HMG 14, HMS 17 и HMG 2 в реакции непрямой иммунофлуоресценции было показано, что антигенная активность белков этой группы в хроматине мозга адаптированных к гипоксии животных выше, чем контрольных (табл.6).

Для изучения антигенных свойств белков HMG в составе хроматина мозга контрольных и адаптированных к гипоксии крыс методом РСК были поставлены две серии опытов. В первой серии в РСК использовали в качестве антигенов белки НМ6 14, HMG 17 и HMG 2. При сравнении интенсивности взаимодействия белков HL'IG 14 и HMG 17 с антисыворотками к хроматину мозга контрольных и адаптированных к гипоксии животных было установлено, что процент связывания комплемента выше при использовании последних (рис.5). Статистический анализ показал, что эти различия достоверны при уровне достоверности 99$. Наблюдаемый параллелизм в изменении антигенных свойств белков HMG 14 и HMG 17 в составе хроматина при адаптации к гипоксии обусловлен, вероятно, сходством их первичной структуры и связью с одними и теми же участками нуклеосом, а также общностью выполняемых функций. При взаимодействии белка HMG 2 с антисыворотками к хроматину связывается меньшее количество юмплемента, чем при использовании в качестве антигенов белков HMG 14 и HMG 17. Полученные результаты показывают, -что при длительной адаптации к гипоксии возрастает антигенность белков HMG в составе хро-

Таблица 5

Интенсивность иммунофлуоресценции ядер кардиомиоцитов крыс при использовании антисывороток к хроматину сердца контрольных и адаптированных к гипоксии животных к Разведение иммунных сывороток 1:160

№ Разведение фяуоресциирующей антикроличьей

сыворотки

1:32 1:6 4

контроль опыт контроль опыт

I 2,3 3,2 1,9 1.7

2 1,8 2,6 1,8 2,3

3 1,9 1,9 1,8 2,4

4 2,1 2,4 1.7 2,3

5 2,1 2,2 2,4 2,6

6 2,4 2,0 2,3 2,6

7 2,2 1.9 1,9 2,0

8 1,9 2,5 2,1 2,1

9 2,3 3,0 2,2 1,9

10 2,0 2,6 - 1.7

II 2,5 2,5 2,0 1,9

12 - 2,4 - 2,6

13 - — - 2,3

X 2,1+0,2 2,4+0,3 2,0+0,2 2,2+0,3

Разница при использовании антисывороток к хроматину сердца конт- . рольных и адаптированных к гипоксии животных достоверна при уровне значимости Р=0,05.

к Световая энергия преобразовывалась в электрическую с помощью фотоумножителя в системе змр 03 Ор-Ьоп(ФРГ). Цифры, приводимые в таблицах 5-6, получены в результате отношения величин напряжения при установке зовдов на светящиеся ядра и фон.

Таблица 6

Интенсивность иммунофпуоресценции ядер мозга контрольных и адаптированных к гипоксии крыс при обработке антисыворотками к белкам НМ6 2, НМ6 14 и НМ6 17. Разведение иммунной сыворотки 1:100

№ Ан гисыворотки к белка) м

НМ6 2 НМ6 14 и те 17

норма гипоксия норма гипоксия норма гипоксия

I 2,1 2,0 2,0 3,0 1,9 2,6

2 1,9 1,5 1,9 2,6 1,7 5,4

3 1,8 2,2 1,8 2,7 2,0 3,8

4 1,8 2,1 2,4 3,1 2,3 4,3

5 2,1 2,3 1,9 3,9 2,5 4,4

6 1,7 2,0 2,2 2,2 1,9 5,4

7 1,7 1,8 2,1 2,3 1,8 5,0

8 1.8 2,2 2,6 3,2 1,9 5,3

9 1,7 1,8 2,5 2,5 2,3 4,7

10 1,7 2,1 2,6 3,2 2,0 3,4

II 1,6 2,0 2,1 3,7 2,2 5,2

12 2,0 2,0 2,2 2,8 2,0 ' 5,0

13 1,9 1,9 2,2 2,7 2,4 3,2

14 1,8 2,4 2,5 3,0 1,9 4,3

15 1,6 2,2 2,4 2,8 2,3 2,5

16 2,0 1,8 2,3 3,9 1,8 2,9

17 2,1 1,9 2,5 2,6 1,9 4,3

18 — 2,0 ■ — зд 2,0 3,6

X 1,8+0,1 2,0+0,1 2,2+0,1 3,0+0,4 2,1+0,1 4,0+0,3

матина мозга,-обусловливающая увеличение содержания соответствующих антител в антихроматиновых сыворотках. Повышение содержания антител к белкам НМ& в антисыворотках к хроматину мозга адаптированных к гипоксии животных определяет увеличение связывания комплемента при взаимодействии этих антисывороток с белками Ш6 2, т.е 14 и НШ 17 в 1,3; 1,7 и 2,7 раза соответственно.

и с

}.шг Н'ДО

10

Рис.5. Связывание комплемента (в %) белками НМ6 и антисыворотками к хроматину мозга крыс, адаптированных к гипоксии, и контрольных.

---- антисыворотки к хроматину мозга крыс, адаптированных к

гипоксии

_ антисыворотки к хроматину мозга контрольных животных

Разведение антисывороток 1:500 .......НМ6 2; ххххх НМ6 14;.*^ НМ6> 17.

10 яо

ггкг "'^о :"Т'Т!'о.

Рис.6. Связывание комплемента (в %\ хроматином мозга контрольных (_) и адаптированных (---) крыс и антисыворотками к

белкаЕГШе 2, НМ6 14 и НМб 17. Разведение антисывороток 1:500. .....НМ6 2; ххххх НМ6 14; НМ6 17.

Во второй серии опытов в качестве антигенов использовали хроматин мозга контрольных и адаптированных к гипоксии животных и антисыворотки к белкам НМб 2, НШ 14 и НМ6 17. Установлено, что связывание комплемента было больше при использовании в качестве антигена хроматина мозга адаптированных к гипоксии животных (рис.б)Статистический анализ показал достоверность различий при использовании антисывороток к белкам НМ6 2, НМ6 14 и НМ6 17 при уровне достоверности 95%.

Анализ электрофореграмм хромосомальных белков мозга контрольных и адаптированных к гипоксии животных, проведенный с помощью ЭВ1 13АБ —I, показал достоверное увеличение белков с м.м. от 10 до 25 кД и от 40 до 60 кД и уменьшение с м.м. более 60 кД и от 25 до 40 кД в хроматине мозга адаптированных животных (табл. 7). Поскольку белки Мб входят в группу белков с м.м. от 10 до 25 кД, то можно предположить, что одной из причин увеличения их антигенной активности в составе хроматина мозга при адаптации к гипоксии является повышение их содержания. Однако увеличение ан-тигенности белков НМ6 в составе хроматина мозга адаптированных животных может быть также обусловлено релаксацией хромосоыально-го материала, в результате которой уменьшается экранированность антигенных детерминант, предсуществованпих в хроматине белков данной группы.

Для выяснения роли белков НМ6 в формировании активно, транскрибируемой конформации хроматина было проведено сравнение антигенной активности белков данной группы в тканях с активно транскрибируемым (печень и мозг крысы) и блокированным (эритроциты лягушки) геномом. Было показано, что представленность антигенных детерминант белков НШ 14 и НМ6 17 в тканях с высоким уровнем функциональной активности достоверно выше, чем в ткани с репрессированным геномом. В то же время не было отмечено различий в антигенной активности белка НМб 2 в составе хроматина исследованных тканей (рис.7). Полученные результаты свидетельствуют в пользу предположения об участии белков НМ6 14 и НМ6 17 в создании активно транскрибируемой конформации хроматина.

Таблица 7

Расчет площадей белковых пиков по денситограммам хромосомальных белков мозга контрольных и адаптированных к гипоксии крыс с помощью ЭВМ ibas-I

№ опы- Хроматин мозга крыс

та Контроль Опыт

Группа I П Ш 1У I П Ш 1У

I 28,0 24,3 10,9 10,9 12,3 28,3 9,1 17,6

2 26,6 18,4 16,9 11,5 П,7 40,2 5,3, 21,9

3 27,1 23,8 15,7 9,0 13,1 42,8 5,6 13,8

4 24,4 22,2 13,6 12,4 II,I 38,6 7,9 18,1

5 25,3 24,6 11,2 12,0 15,0 36,7 5,0 20,6

X 26,28 22,66 13,66 11,16 12,84 39,52 6.58 18,4

+0,64 +1,14 +1,19 +2,52 +0,59 +1,21 ±6,81 ¿1,39

Содержание гистонов кора - 100% Р=0,05

I - белки с к.м. более 60 кД ¡ц - белки с ы.м. от 25 до 40 кД

П - белки с км. от 40 до 60 кД ху _ ¿елт с ММт от jo до 25 кД

81

Рис.7. Связывание комплемента при взаимодействии антисывороток к белкам НМ6 14 (I), НМ6 17 и НМ6 2 (ИП с хроматином печени и мозга (2) крысы и эритроцитов лягушки (3). На оси ординат - связывание комплемента в %. На оси абсцисс - содержание белка в пробе в мкг. Разведете антисыворотки 1:500.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В результате проведенных исследований показано, что в процессе онтогенеза увеличивается иммунологическое сходство между хромосомальным материалом эмбрионов и печени взрослых лягушек. В то же время не'было выявлено общих антигенных детерминант в хроматине мозга взрослых амфибий и эмбрионов всех исследуемых стадий развития. Изменения в антигенных свойствах хроматина определяются, очевидно, двумя взаимосвязанными факторами: сменой состава белков и конформационными превращениями хромосомального материала. В данной работе показано, что электрофоретическая подвижность и относительное содержание фракций гистонов и неги-стоновых белков изменяются в процессе раннего эмбриогенеза амфибий.

На поздних стадиях индивидуального развития в морфологически сформировавшихся органах куриных эмбрионов (мозг, печень) не наблюдалось различий в электрофоретической подвижности и содержании основных фракций гистонов по сравнению с таковыми взрослых птиц. В негистоновой области электрофоретического спектра

хромосомальных белков печени и мозга изменения имели место и на поздних стадиях развития куриных эмбрионов. Продолжающиеся на поздних стадиях индивидуального развития включения в состав хроматина новых белков, хотя и менее значительные, чем на более ранних стадиях, должны обусловливать, вероятно, конформационные преобразования хромосомального материала. Однако использование нук-леазного дробления в качестве теста для выявления возрастных пространственных преобразований хроматина сердца и печени мышей оказалось неинформативным /Gaubatz е.а., 1979/, что, по-видимому, можно объяснить недостаточной чувствительностью метода /rhakur, 1984/. Лишь в хроматине нейронов коры и мозжечка крыс в ранний гостнаталъный период исследование продуктов нуклеазного дробления ПОКазаЛО укорочение ДЛИНЫ ПОВТОРОВ / Thompson, 1977/. Высокая чувствительность иммунохимических методов позволила установить, что антигенные свойства хроматина, определяемые, очевидно, его белковым составом и конформацией, окончательно не стабилизируются к моменту окончания органогенеза.

В дифференцированных тканях взрослых животных на поверхности хроматина в результате взаимодействия белок-белок и белок-ДНК образуются спектры белковых антигенных детерминант, являнциеся интегрированным выражением фено- и генотипических цризнаков. Поскольку белки хроматина отличаются по своей эволюционной консервативности: коровые гистоны > Щ> легкоэкстрагируемые негисто-новые белки > прочносвязанные кегистоновые белки, то, очевидно, что в результате взаимодействия этих белков друг с другом и ДНК образуются эпитопы разных уровней иммунологической специфичности. Существование иерархии уровней иммунологической специфичности может, по-видимому, определять сгепень несходства мевду таксонами разных рангов /Сидорова и др., 1979/.

Проведенное сравнение антигенных свойств хроматина одноименных тканей представителей разных классов позвоночных животных показало практически полное отсутствие общих эпитопов хроматина у животных разных классов. Наблюдалась лишь слабая перекрестная иммунологическая реактивность между хроматином одноименных тканей представителей некоторых классов позвоночных животных: хрящевые рыбы - костные рыбы; рептилии - птицы; птицы - млекопитающие. Дальнейшие исследования показали, что в классе млекопитающих иммунологическое сходство хроматина одноименных тканей выра-

жено сильнее у видов, принадлежащих к одному роду, чем у представителей разных родов одного семейства. Еще меньшее сходство обнаруживалось у видов, принадлежащих к разным отрядам. Наличие перекрестной иммунологической реактивности между хроматином одноименных тканей представителей классов хрящевых и костных рыб, установленное методом двойной иммунодиффузии в геле, послужило основанием для апробации возможности осуществления количественной оценки иммунологических различий между хроматином представителей двух классов рыб. Методом РСК было показано, что величины ИД для хроматина печени представителей разных классов рыб (карп - катран, карп - морской кот) превышают в 1,7-2 раза величины ИД для хроматина печени представителей разных отрядов класса костных рыб (карп - лосось). Сопоставление величин ИД, рас-читанных на основании сравнения антигенных свойств хроматина'таксонов одинаковых рангов в классах хрящевых и костных рыб и млекопитающих, показывает, что в последнем они выше. В быстро эволюционирующем классе млекопитающих антигенные свойства хроматина, по-видимому, изменяются быстрее и, следовательно, сравнение этих свойств может осуществляться в пределах таксонов более низких рангов, чем в классах хрящевых и костных рыб. В связи с этим отправным моментом исследований по сравнению антигенных свойств хроматина одноименных тканей разных видов должно быть определение ранга таксона, в пределах которого этот инструмент является действенным. В целом полученные результаты свидетельствуют о том, что иммунохимический анализ хроматина, позволяющий оценить иммунологические различия во всей совокупности его антигенных детерминант, может быть использован в качестве дополнительного щште-рия для решения вопросов таксономии и установления филогенетической близости видов в пределах отдельных таксонов позвоночных животных.

Изменения антигенных свойств хроматина имеют место не только в процессе онтогенетического развития и дифференциации тканей, но и при адаптации к экстремальным воздействиям (гипоксия). Нами было проведено сравнение антигенных свойств хроматина ряда органов (мозг, сердце, печень) крысы в норме и при адаптации к гипоксии. Исследуемые органы отличаются по типу энергетического обмена, характеру функциональной и пролиферативной активности. Осуществление их специфических функций обеспечивается, очевидно,

структурно-функциональными особенностями генетического аппарата, в формировании которых цринимают участие тканеспецифичные неги-стоновые белки-.

Нами показано, что при адаптации к гипоксии имеют место качественные и количественные изменения белкового состава хроматина мозга и сердца. В печени подобные изменения не были отмечены. В хроматине мозга адаптированных животных наблюдается увеличение относительного содержания низкомолекулярных негистоновых белков. По-видимому, именно изменения состава негистоновых белков ответственны, в первую очередь, за структурные преобразования хромо-сомального материала, происходящие при адаптации к гипоксии и сопровождающиеся изменениями антигенных свойств хроматина. При адаптации к гипоксии в хроматине сердца увеличивается антигенная активностьлёгЕ'бэкстрагируемых негистоновых белков. В группе лег-коэкстрагируемых негистоновых белков особый интерес представляют белки НМ6, которым принадлежит, вероятно, особая роль в конфор-мационных превращениях хроматина. Дальнейшие исследования показали, что при адаптации к гипоксии в хроматине мозга щшс возрастает число антигенных детерминант белков НМ6 14 и НМ6 17, способных взаимодействовать с соответствующими антителами, менее значительными были изменения в антигенной активности белка НМ6 2. Конформаци'онные превращения хроматина, затрагивающие кор, могут быть следствием включения в его состав новых белковых молекул, в том числе НМ6 14 и НМ6 17. В меньшей степени конформавдонные перестройки касаются, по-видимому, белка НМ6 2, находящегося на линкерном участке нуклеосомы. Таким образом, изменения антигенных свойств белков НМ6 при адаптации к гипоксии могут быть обусловлены как увеличением их содержания, так и релаксацией хромо-сомального материала, причем обе эти причины не являются альтернативными.

Проведенные исследования показали, что на молекулярном уровне характерными чертами длительной устойчивой адаптации организма к гипоксии средней тяжести является изменение белкового состава и антигенной активности хроматина органов,чувствительных к недостатку кислорода (мозг, сердце). В то же время подобные изменения не были обнаружены в хроматине печени. Следовательно, изменения белкового состава и конформации хроматина печени не является обязательными факторами адаптации организма к данному ви-

ду гипоксии, поскольку в этих условиях энергетические затраты печени, по-видимому, сбалансированы.

Наблюдаемое увеличение антигенной активности белков НМ6 в составе хроматина мозга при адаптации к гипоксии указывает на их роль в процессах преобразования хромосомального материала. Кроме того, большая представленность антигенных детерминант белков НМе в составе хроматина тканей с активно транскрибируемым геномом (печень и мозг крысы) по сравнению с репрессированным геномом (эритроциты амфибий) является дополнительным подтверждением участия белков этой группы в структурных перестройках хроматина.

ВЫВОДЫ

1. В процессе индивидуального развития увеличивается иммунологическое сходство между хроматином эмбрионов травяной лягушки и печени взрослых особой. 3 то же время общие антигенные детерминанты в хроматине мозга и эмбрионов'исследуемых стадий развития отсутствуют.

2. Формирование спектра антигенных детерминант хроматина

не заканчивается к моменту окончания органогенеза. Иммунологическое сходство между хроматином печени куриных эмбрионов и взрослых птиц увеличивается с возрастом эмбрионов. То же увеличение сходства в процессе онтогенеза наблюдается и в отношении хроматина мозга.

3. Перекрестные иммунологические реакции между хроматином одноименных тканей представителей разных классов позвоночных животных как правило отсутствуют.

4. Количественные различия в антигенных свойствах хроматина одноименных тканей исследуемых видов в пределах классов костных рыб и млекопитающих коррелируют с их положением в филогенетической системе. Антигенные свойства хроматина, являющиеся интегрированным выражением ф:ено- и генотипических признаков, могут быть использованы в качестве быстрого и высокочувствительного дополнительного критерия при уточнении систематического положения видов.

5. В процессе адаптации животных к длительной прерывистой гипоксии средней тяжести увеличивается антигенная активность легкоэкстрагируемых высокоподвижных негистоновых белков в составе хроматика мозга и сердца. В то же время при адаптации к гипок-

сш не наблюдается изменений в экспрессируемости антигенных детерминант указанных белков в составе хроматина печени.

6. Антигенная активность белков HMG 14 и НМ6 17 в составе хроматина тканей с высоким уровнем транскрипционной активности (мозг, печень крысы) значительно Еыше, чем в тканях с репрессированным геномом (эритроциты амфибий).

7. Увеличение антигенной активности белков НМ6 14 и НМ6 17 при адаптации к гипоксии в составе хроматина мозга и их высокая экспрессируемость в тканях с активно транскрибируемым геномом свидетельствуют в пользу участия этих белков в формировании активно трайскрибируемой конформации хроматина.

8. В изменении спектра эпитопов хроматина проявляется динамичность его структуры. Сравнительное исследование антигенных свойств хроматина является высокочувствительным инструментом при изучении структурно-функциональных перестроек хромосомального материала в процессе индивидуального развития, при экстремальных воздействиях и адаптации к ним.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТИЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ашмарин И.П., Федорова Н.А .Характеристика (йзакций хроматина печени крысы // Тез.докл. 2 Всесоюзн. симп. по структуре и функции клеточного ядра. - М., 1970. - С.33-38.

2. Ашмарин И.П., Федорова .H.A. На пути реконструкции хроматина // Успехи биол. хим. - 1973. T.I4. - С.76-90.

3. Ашмарин И.П., Камышенцева ¡O.E., Конарев В.Г., Сидорова В.В., Федорова H.A. Иммунохимический анализ белкового состава хроматина крысы и лягушки // Журн. эволюц. биохим. и физиол.

- 1975. Т. II.5. - С.515-519.

4. Ашмарин И.П., Камышенцева ¡O.E., Конарев В.Г., Сидорова В.В., Федорова H.A. Тканевая и видовая специфичность хромосома-льных белков некоторых видов позвоночных животных // Тез.докл. 5 Всесоюзн. симп. по структуре и функции клеточного ядра. - Но-висибирск. 1975. - С.100.

5. Ашмарин И.П., Конарев В.Г., Сидорова В.В., Симановский Л.Н., Федорова H.A. Изменения белкового состава хроматинов мозга' и печени крыс при функциональной перестройке клеток // Докл. АН СССР. - 1976. - Т.228.1. - С.222-224.

6. Ашмарин И.П., Камышенцева Ю.Е., Федорова H.A. Сравнение белкового состава хроматинов некоторых видов позвоночных животных // Журн. эволщ. биохим. и физиол. - 1976. - T.I2.4. - С. 367-369.

7. Ашмарин И.П., Галушко Е.И., Федорова H.A., Федорова Т.М. Изменения хроматина в процессе онтогенетического развития некоторых видов позвоночных, выявляемые иммунохимическими методами// Докл. АН СССР. - 1976. - Т.230.2. - С.482-484.

8. Федорова H.A. Иммунохимический анализ белкового состава хроматина животного происхождения // Вестник ЛГУ. - 1976. - Вып. 21. - С.114-122.

9. Ашмарин И.П., Сидорова В.В., Симановский Л.Н., Федорова H.A. Изменения белкового состава хроматина мозга врыс при адаптации к гипоксии // Тез.докл. 7 Всесоюзн. конф. по нейрохимии. -Ростов-на-Дону. - 1976. - С.166.

10. Ашмарин И.П., Галушко Е.И., Федорова H.A. Исследование хромосомальных белков мозга и печени в онтогенетическом развитии куры // Журн. эволюц. биохим. и физиол. - 1977. T.I3.3. - С.336-339.

11. Ащмарин И.П., Галушко Е.И., Федорова H.A. Хромосомальные белки мозга и печени в онтогенетическом развитии курицы // Тез. докл. 6 Всесоюзн. симп. по структуре и функции клеточного ядра.

- Алма-Ата. 1977. - С.ИЗ.

12. Федорова H.A. Иммунохимический анализ белков хроматина мозга некоторых видов позвоночных животных // Нервная система.

- Л., Изд. ЛГУ. - 1978. - Вып.19. - С.36-38.

13. Федорова H.A. Сравнительно-биохимическое исследование хроматина мозга позвоночных животных с использованием приемов иммунохимического анализа // Тез. докл. Всесоюзн. симп. по метаболизму белков ЦНС. - Днепропетровск. 1978. - С.130.

14. Ashmarin I.P.,?edorova H.A. Changes in chromatin during ontogenesis of some vertebrates // 12-th Jong. ?EBS-Dresden.-1978.-abs.;-125.

15. Войнова Э.Б., Лысенко Н.Д., Федорова H.A. Исследование хромосомальных белков на разных стадиях индивидуального развития лягушки // Тез. докл. научн. конф. болгарских аспирантов, обучающихся в СССР. - М., 1978. - С.599-604.

16. Федорова H.A., Структурная организация хроматина Сданные иммунохимического анализа) // Вестник ЛГУ. - 1979. - Вып.21. -С.67-71.

17. Федорова H.A. Сравнительные исследования хроматина позвоночных // Тез. симп. докл. 4 Всесоюзн. биохим. съезда. - М.

1979. - С.42-43.

18'. Федорова H.A. Антигенные свойства белков // Нервная система. - Л., Изд. ЛГУ. - 1980. - Вып.2Т. - С.40-48.

Г9. Fedorova N.A.,Muzurov I.V.The role of some chromosomal proteins in the changes in rat heart chromatin antigenic properties upon adaptation to hypoxia//J. mol. and cell.cardiology .-198o.-V.12.Suppl.1.-P.39.

20. Fedorova N.A.,Muzurov I.V.,Nesterchuk L.B.Changes in antigenic properties of rat myocardial chromatin upon adaptation to hypoxia//4-th USA-USSR symp,on myocardial metabolism.-

1980.-P.323-328.

2Г. Федорова H.A., Войнова Э.Б. Сравнительно-иммунологическое исследование хроматина в онтогенетическом развитии некоторых видов позвоночных // Тез. докл. 7 Всесоюзн. симп. по структуре и функции клеточного ядра. - Харьков, Г980. - С.175-176.

22. Федорова H.A., Карпинская Г.В. Сравнительное исследование антигенных свойств хроматина-млекопитающих // Еурн. эволюц. биохим .и Ф13И0Л. - Г 981. - ТЛ7.Л. - С.50-52.

23. Федорова H.A. Иммунохимическое исследование некоторых классов позвоночных животных // Тез.докл. 6 конф. биохимиков Прибалтийских Республик, Белорусской ССР и Ленинграда. - Рига. I98I-. - C.T5T-I52«

24. Федорова H.A., Музуров И.В., Нестерчук Л.Б. Изменения антигенных свойств хроматина миокарда крыс при адаптации к гипоксии // Тез. докл. 4 советско-американского симп. по метаболизму миокарда. - М., Медицина. - Г98Г. - С.279-282.

25. Федорова H.A., Войнова Э.Б. Изменения иммунологических свойств хроматина в онтогенезе лягушки и куры // Журн. эволюц. биохим. и физиол. - Г981. - T.I7.4. - С.4П-4Т4.

26. Музуров И.В., Федорова H.A. Антигенные свойства некоторых хромосомальных белков сердца и печени при адаптации к гипоксии // Биохимия.- 1983. - Т.48.2. - С.230-234.

27. Федорова H.A., Суркова Е.А. Антигенные свойства хроматина мозга крыс в норме и при адаптации к гипоксии // Тез. докл. 9 Всесоюзн. конф. по биохим. нервной системы. - Ереван. 1983. - С. 324-325.

28. Федорова H.A., Суркова Е.А. Сравнительное исследование хроматина позвоночных животных. // Тез. докл. 16 конф. Федерации Европейских Биохим. Обществ. - М., 1984. - С.243.

29. Федорова H.A., Суркова Е.А. Антигенные свойства белков HMS хроматина мозга и печени крыс при адаптации к гипоксии // Биохимия. - 1985. - Т.50.5. - С.755-759.

30. Федорова H.A., Суркова Е.А., Серых М.М. Сравнение антигенных свойств белков НМ6 хроматина тканей, различающихся по уровню транскрипционной активности // Тез. докл. 5 Всесоюзн. биохим. съезда. - М., Наука. - 1986. - C.I85.

31. Суркова Е.А., Федорова H.A. Изменения антигенных свойств хроматина мозга крыс при адаптации к гипоксии / Структура и энергетика нервной системы. - Л., Изд. ЛГУ. - 1966. - Вып.25. - С.

155-161.

32. Федорова H.A., Суркова Е.А. Сравнение антигенных свойств белков НШ в составе хроматина тканей, различающихся по уровню транскрипционной активности // Журн. эволюц. биохим. и физиол.

- 1986. - Т.22.5. - С.441-444.

33. Федорова H.A.,Суркова Е.А. Роль белков HMG в формировании транскрипционно-активной конформации хроматина мозга крыс при адаптации к гипоксии. Данные иммунохимического анализа // Тез.докл. 10 Всесоюзн. конф. по биохим. нервной системы. - Горький. 1987. - С.23.

М-3^84? . Подписано к печати . Заказ /3 ¿Г"

Тираж /СО , формат бумаги 60x84 1/16, л печ.л. Бесплатно. ПО - 3 "Ленуприздата". 191104 Ленинград, Литейный пр., дом № 55.