Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение статуса негистоновых белков хроматина при гормональных воздействиях

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изменение статуса негистоновых белков хроматина при гормональных воздействиях"

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

АБРАМЯН АНУШ ИАВАРШЕВНА

ИЗМЕНЕНИЕ СТАТУСА НЕГИСТОНОВЫХ БЕЖОВ ХРОМАТИНА ПРИ ГОРМОНАЛЬНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

Специальность 03.00.02 - Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН- 1992

Работа выложена в Институте молекулярной биологии АН Республики Армения.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник А.А.АРУТШЯН

доктор биологических наук, доцент

Э.С.ГЕВОРКЯН

доктор биологических наук, профессор

Ж.И.АКОШН

доктор биологических наук, доцент

Р.Р.ВАРДАПЕТЯН

Институт кардиологии им. Л.А.Оганесяна Министерства Здравоохранения РА

Защита диссертации состоится /¿¿(</?77Х 1992 г. в

Му

часов на заседании специализированного Совета

К 055.01.08 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Ереванской государственном университета (375049, Ереван, ул.Мравяна, I, Ереванский госуниверситет, биологический факультет, кафедра биохимии).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан " (УЗ&Д^

1992 года

Ученый секретарь Специализированного совета, канд.биолог.наук

--Л.Г.АНАНЯН

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эстрогенная индукция вителлогенеза печени петушков хорошо охарактеризована на генетическом уровне. Сравнительно меньше, однако, известно о ядерных событиях, ассоциированных с ответом и включающих широкомасштабные структурные изменения хроматина. Особый интерес представляет вопрос о взаимодействии гормон-рецепторных комплексов с акцепторными участками хроматина, в структуре которых важная роль принадлежит не-гистоковым белкам, обеспечивающим зысокую специфичность взаимо-( действия.

В настоящее время известно, что функционирование хроматина решающим образом зависит от характера взаимодействия входящих в его состав компонентов, определяющего в конечном счете упаковку, генетического материала. Вместе с тем, недостаточно изучен вопрос о природе связей негистоновых белков хроматина с ДНК, гис-тонами и друг с другом, и об изменении типа взаимодействий их со структурой хроматина при генной активации. Эти белки чрезвычайно гетерогенны по составу и свойствам, выполняют структурные, каталитические, регуляторные функций и являются наименее изученными. Трудности структурно-функционатъкого исследования белков хроматина являются препятствием для дальнейшего продвижения исследований структуры хроматина при различных специфических воздействиях, включая гормональные. Поэтому, предотавляется актуальным разработка нового методического подхода для выяснения типов взаимодействий, опредачяющкх положение белков в структуре хроматина, изучения изменения их взаимного расположения при гормональном воздействии.

Такую, качественно новую информацию о негистоновых белках хроматина дает предложенный в работе метод двухкоординатной экстракции, результаты которого имеют графически наглядное представление и легко подвергаются компьютерному анализу.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было изучение как традиционными методами, так и новым методическим подходом (методом двухкоординатной экстракции) изменения ассоциации негистоновых белков хроматина с областями генома при воздействии стероидных гормонов.

В работе были поставлены следующие задачи:

I) выявить характерные дам воздействия эстрадиола-17е

- 4 -

структурные сдвиги в хроматине и его фракциях,

2) выяснить роль негистоновых белков хроматина в акцепции гормонального сигнала,

3) применить разработанный новый методический подход для изучения структурированности белков хроматина,

4) изучить статус негистоновых белков хроматина в контроле и после воздействия стероидными гормонами методом двухкоор-динатной экстракции,

5) изучить влияние структурных перестроек хроматина на положение негистоновых белков.

Научная новизна работы. С использованием метода термической денатурации выявлены характерные структурные сдвиги в хроматине при эстрадиоловом воздействии. В составе кислых негистоновых белков обнаружены стероид-чувствительные фракции. Связывание стероид-рецепторных комплексов зависит не только от состава негистоновых белков, но и от их взаимного расположения в структуре хроматина.

Новый метод изучения белков в составе надмолекулярных комплексов позволил получить качественно новую информацию о бачках хроматина в структурно-функциональном плане. Проведена классификация негистоновых белков по типу экстрагируемости, выявлены типы взаимодействий, определяющие положение белка в структуре с помощью ряда новых физико-химических параметров. Составлены таблицы-диаграммы с линиями полувыхода для исследуемых белков как контрольных, так и опытных образцов в системах экстракции ЫаС1 -мочевина, ЫаС1-рН. Совокупность линий полувыхода анализируемых белков в обеих системах экстракции является специфической и индивидуальной характеристикой для каждого из них. Метод фиксирует специфические изменения в характере выхода отдельных белков из хроматина гормсн-обработанных животных с помощью анализа поверхностей экстракции и диаграмм экстрагируемости этих белков, а также выявляет сдвиги в сродстве белков к хроматину.

¡Практическая ценность работы. Полученные в работе данные позволяют углубить представления о физико-химических особенностях хроматина, конкретизировать известные модели структурно-функциональных белок-белок и белок-ДНК взаимодействий, предложить качественно новые параметры для сравнительного исследования белков хроматика при гормональных взаимодействиях.

Метод "даухкоордннатной экстракции", использовапный' в рабо-

те для изучения структурированности белков хроматина печени петушков при стероидном воздействии, может быть применен также для изучения сдвигов статуса как отдельных белков, так и их совокупности в составе других сложных макромолекулярных структур (мембрана, рибосома).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Республиканской научной конференции по вопросам биофизики (Ереван, 1982), УШ Всесоюзном симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра (Пущино, 1984), II Республиканской конференции, посвященной проблемам физико-химической биологии (Ереван, 1986), IX Всесоюзном симпозиуме по структуре .и функциям клеточного ядра (Черноголовка, 1987), III конференции молодых ученых Института экспериментальной биологии АН Арм.ССР (Дилижан, 1988), Международном конгрессе биохимиков (Прага, 1988г.). Работа апробирована на заседании ученого совета Института молекулярной биологии АН РА от 13 декабря 1991 года и на заседании кафедры биофизики биологического факультета Ереванского государственного университета от 17 декабря 1991 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, трех глав (I - обзор литературы, II - объект и методы исследований, III - результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста.

Библиография включает 155 наименований литературных источников.

В обзоре литературы подробно изложены современные данные о физико-химических свойствах негистоибвых белков хроматина и механизме действия стероидных гормонов.

Краткое содержание остальных глав приводится ниже.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .

При выполнении данной работы в качестве экспериментального объекта использовали печень неполовозрелых петушков и половозрелых кур в контроле и после введения животным стероидных гормонов.

Выделение хроматина. Хроматин печени кур выделяли по мето-

- 6 -

даке Цанева ( Tsanev R., Rusev G.X974).

Чистоту полученных препаратов проверяли путем измерения оптических параметров хроматина и определения соотношения его основных компонентов. Белок определяли по методу Лоури и др. ( Lowry et alД954Г.), ДНК - ПО Бартону (Burton,I956). ГИСТОНЫ выделяли методом кислотной экстракции по Джонсу (Johns, 1964).

Выделение компонентов хроматина. ДНК выделяли по методу > Батерфорд и др. (Butterworth et азД971). Фракционирование негис-тоновых белков проводили по методу Ванга (Wang,l967, I97B). Фракционирование лабильно-связанных негистоновых белков проводили на колонке с ДЗАЭ-целлюлозой.Белки элюировали ступенчатым градиентом хлористого натрия в концентрациях 0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8; 1,0 И в 5мМ трис-фосфатном буфере рН 8,2. Элтаты диализовали против 0,06 М трис-HCI буфера рН 6,7 и концентрировали с помощью сухой сахарозы.

Реконструкция хроматина. Реконструкцию хроматина проводили смешиванием ДНП-комплексов и лабильно-связанных негистоновых белков в 2М HaCI с последующим диализом против раствора, содержащего 1мМ ЫаС1, 0,1 мМ ЭДТА, IМ трис-HCI рН 7, в течение 48 часов с многократной заменой диализирующего раствора. Аналогичным образом приготовляли комплексы ДНК-негистоновые белки.

Плавление препаратов хроматиьа. Плавление ДНК, комплексов и хроматина проводили на спектрофотометре "Unicam "sp -8-100. Перед плавлением препараты ставили на диализ в течение 24 часов против раствора, содержащего 1мМ NaCI, 0,1мМ ЭДТА, ЪМ трис-HCI рН 7. Нагрев осуществляли с помощьи температурного программника с линейной скоростью нарастания температуры 0,5 град./мин.. Поглощение регистрировали при 260 нм на программируемом калькуляторе "HP 975 I/O". Точность определения температуры составляла ± 0,05°С, оптической плотности - + 5«Ю~40Е. Эксперименты по плавлению каждого образца повторялись 5-6 раз. В экспериментах использовали кварцевые кюветы с плотно притертыми тефлоновыми пробками.

Экстракция хроматина. Исследование характера экстрагируе-мости белков хроматина в двухкомпонентных средах проводили в 16 отдельных пробах при одновременном изменении двух компонент раствора. К 200 мкл суспензии хроматина (концентрация 2 мг/мл по белку) добавляли по 200 мкл соответствующих буферов для получения возрастающих концентраций экстрагирующих агентов. Конечные

концентрации экстрагирующих веществ в эпендорфе соответствовали координатам определенной точки из сетки экстракции. По осям экстракции в порядке возрастания отложены следующие значения координат: HaCI - концентрации 0; 0Д5М; 0,ЗМ; 0,5М; мочевина -концентрации 0,5М; IM; 2ГЛ; 4М; М^С12 - концентрации 0; 1мМ; 5мМ; 20мМ; рН - значения рН 5,0; рН 6,3; рН 7,6; рН 9. Все растворы содержали 1мМ M^CL>, исключая эксперименты с использованием в качестве одной из осей координат концентрацию M^GIg. Все пробы хроматина, после добавления экстрагирующих агентов, инкубировали при 0°С, непрерывно перемешивая в течение I часа. После центрифугирования при 30000 ^ в течение I часа, надосадочную жидкость, содержащую солюбилизированные белки, отделяли, определяли в ней содержание белка по методу Брэдфорда (Bradford м.е., 1976), с использованием в качестве стандарта сывороточный глобин. Солюбилизацию и осаждение препаратов хроматина проводили строго идентично для всех проб. Для одновременного осаждения всех проб контрольных и эстрадиол-обработанных животных специально были изготовлены деревянные вкладыш в центрифужные гнез- '■ да, содержащие по 8 позиций для отдельных проб.

Электрофорез образцов. ДСН-электрофорез белков проводился по методу Лаэмшиг (baemmii У.к.,197о) в двухступенчатом ПМГ 3% и 10%. При полимеризации гель химически связывался со стеклянной пластинкой с помощью сшивающего агента siian A-I74 (sicmа ). Соотношение бис/акриламид было выбрано 1,3x10"^, что приводило к увеличению дистанции миграции негистоновых белков в геле.

Сканирование электрофорегаамм и определение молекулярных весов. Наиболее интенсивные из белковых полос, выявляемых на электрофореграммах пронумерованы в порядке убывания молекулярного веса. Денситометрирование белковых полос проводили на ultrascan XI(ькв) при 633 нм. В качестве величины, характеризующей концентрацию белка в экстракте, нами рассматривается высота пика F , регистрируемая при сканировании электрофореграммы. Поскольку полуширина гауссовых пиков вследствие одинаковой дистанции миграции белка на разных треках практически одинакова, то эта постоянная составляющая при сравнительных исследованиях теряет смысл. Молекулярные веса рассматриваемых белков определяли по методу Вебера и Осборна (weber,Osbora м.,1969). Результаты экспериментов обрабатывали статистически.

Компьютерная обработка результатов экспериментов. Икформа-

ция по всем рассматриваемым белковым полосам, после сканирования электрофореграмм и обработки данных, вводилась в компьютер Ш1/РС. Построение поверхностей экстракции исследуемых белков, их сравнительный анализ проводили при помощи специализированного пакета графических программ До^.щ; ргарь .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изменения в составе негистоновых белков хроматина при эс-традиоловой индукции. Негистоновые белки были фракционированы на' лабильно-связанные (ЛСНБ), прочно-связанные (ПСНБ) и остаточные белки согласно методу Ванга ( иапв , 19?о). Результаты экспериментов показали, что эстрадиоловое воздействие не оказывает существенного влияния на общее содержание ЛСНБ. Заметные изменения обнаруживаются во фршищи ПСНБ и остаточных белков. Количество ПСНБ уменьшается на 15-20$ с одновременным повышением на 50% содержания негистоновых белков "остаточной" фракции.

Вместе с тем, фракционирование на ионнообменнике препаратов ЛСНБ показало, что введение гормона приводит к изменению профиля алюции: резкому снижению содержания белка во фракции Ф^ и повышению - во фракции <1^ (рис.1). Электрофоретическое разделение этих фракций обнаружило исчезновение относительно низкомолекулярных фракций с мол.массами 30,2; 20,4;16,0 кД во фракции и появление более высокомолекулярных белков во фракции Фд (мол.массы 65,3; 57,3; 52,5 кД). Наблюдаемое перераспределение,, возможно, ' связано с изменениями транскрипционно-активной конформации хроматина, изучение которой проводилось методом плавления.

Изучение термостабильности хроматина печени петушков, его различных фракций при эстрадиоловой индукции. Препараты хроматина, лишенного ЛСНБ, проявляют различную термостабильность в контроле и при гормональной активации генома. Оставшийся после удаления ЛСНБ ДЕ1П-комплекс у гормон-обработанных животных более стабилизирован, чем у контрольных, о чем говорит смещение его кривой плавления в сторону высоких температур по сравнению с контролем. Реконструкция хроматина путем инкубации препаратов ДНП-комплексов с соответствующими фракциями ЛСНБ приводит к структуре,плавящейся как нативный хроматин (рис.2а). Эти результаты свидетельствуют о дестабилизирующем структуру хроматина действии фракции ЛСНБ при гормональной активации генома. В то же

о.п.одо

(I «I

0.75

I I

0.50

0.25

0.00

О

10

20

30 фракция

Рис. I. Хроматографическое разделение препаратов ЛСНБ хроматина печени контрольных (-----) и подопытных животных (......)

на колонке с ДЭАЭ-целлшозой. % - % ~ фракции ЛСНБ в контроле, ~ Фд - те же при воздействии зстрадиола. Фракции ФоСФ^) - злюированы с колонки 0,2М г 0,4 М , 0,6 М ,

О,8М, 1М ЫаС1, соответственно. По оси абсцисс - номер фракций, по оси ординат - оптическая плотность.

время опыты яо плавлению комплексов ДНК с ЛСНБ хроматина показали, что данная белковая фракция обладает заметным стабилизирующим структуру ДНК действием, причем эффект сильнее выражен при плавлении комплекса ДНК с ЛСНБ хроматина, активированного эстрадиолом (рис.26).

Проводилось также изучение плавления "остаточной" фракции хроматина, которая обогащена последовательностью ДНК, специфически узнаваемой остаточными белками. Воздействие эстрадиолом приводит к смещению кривой плавления "остаточной" фракции хроматина печени петушков в сторону высоких температур (рис.2в). Вместе с тем, введение зстрадиола приводит к увеличению некоторой доли легкоплавких участков, соответствующих сайтам связывания остаточных негистоновых белков с АТ-богатыш участками. Обнаружено также, что "остаточная" фракция начинает плавиться

Рис .¿а

Рис. 2а. Кривые плавления препаратов хроматина, лишенного ЛСНБ, и реконструированного с ЛСНБ хроматина в контроле и после 'воздействия эстрадиола. I - хроматин без ЛСНБ в контроле, 2 - хроматин без ЛСНБ после влияния гормона, 3 - реконструированный хроматин в контроле, 4 - реконструированный хроматин после воздействия эстрадиола. По оси абсцисс - температура, по оси ординат - доля расплавленности ДНК.

Рис. 26. Плавление комплекса ДНК-ЛСНБ в контроле и после воздействия эстрадиола. I - кривая плавления свободной ДНК, 2 - кривая плавления комплекса ДНК-ЛСНБ в контроле, 3 - кривая плавления комплекса ДНК-ЛСНБ после воздействия эстрадиола.

Рис. 2 в. Кривые плавления свободной ДНК (I), хроматина (2), "остаточной" фракции хроматина в контроле (3) и "остаточной" фрак-, ции хроматина при воздействии эстрадиола (4).

раньше, чем свободная Д11К, причем это явление сильнее выражено у "остаточной" фракции хроматина при воздействии эстрадиола (рис. 2в). В литературе такой эффект объясняется формированием петли путем раскрытия двойкой спирали фракцией НГБ (веГэг et а1, 1978). Следовательно, область формирования петли на "остаточной" фракции-хроматина у гормон-обработанных животных более обширна, чем у контрольных, поскольку её плавление начинается раньше.

Приведенные результаты подтверждают концепцию о комплексном влиянии различных групп хроматиновых белков на процессы стабилизации-дестабилизации при гормональной активации генома.

Метод двухкоординатной экстракции.Для дальнейшего детального изучения гормонального ответа на уровне негистоновых белков хроматина возникла необходимость применения более чувствительных методов детекции, которая была реализована в новом методическом подходе изучения сложных надмолекулярных структур (Арутюнян А.А. и др., 1988). Суть метода заключается в "двухкоординатной экстракции" белков из структуры и иллюстрируется на рис.За. По осям координат X ж У откладываются значения концентраций экстрагирующих агентов (ЫаС1, мочевина, рЮ. Точка М на координатной плоскости, имеющая координаты Лги ^представляет из себя раствор М со значениями концентраций экстрагирующих агентов г у; . Таким образом, ( I = I; Н) и = I; п/ ) являются заданными значениями концентраций -X и У , соответственно. Совокупность таких точек (растворов) мы называли "сеткой экстракции". Таким образом, каждый образец с номером М экстрагируется раствором с тем же номером из сетки экстракции. После экстракции из образца белков в наничии имеем набор надосадков, в котором каждая ячейка содержит белковый экстракт из среды с заданной координатой , Затем проводится электрофоретическое разделение исего набора надосадков, сканирование треков и идентификация белковых полос. Идя каждой белковой полосы определялась величина выхода белка Р во всех треках электрофореграммы, которая пропорциональна высоте пика данной белковой полосы. Поместив во всех точках "сетки экстракции" соответствующие этим точкам числовые значения выхода белка Я" в раствор, мы получим так называемую таблицу-диаграмму конкретного белка (рис.36). Каждая диагр?мла составляется из 16 точек. Совокупность значений /-" в 16 треках можно рассматривать также в качестве функции Г {х>, у) двух переменных (различных концентраций экстрагирующих агентов, используемых в ка-

и

т

—--4Ь-»-

*2 х3

а)

Моч-1 /М/ а

4,0 23 29 47 26

2,0 10 17 46 22

1,0 0 15 34 Г 14

0,5 С 6 0 О

0,0 0,15 0,30 0,50

6)

КаС1

В)

Рис. 3. Иллюстрация к методу двухкоординатной экстракции: а) двух-координатная таблица для сетки экстракции в общем виде; б) двух-координатная таблица-диаграмма белковой полосы $ 17 в системе ЫаС1-мочевина. Жирной линией обозначена линия полувыхода; в) поверхность экстракции белковой полоса № 17 в системе ЫаЯ--мочевина.

честве координат). Очевидно, что графически представля-

ет некую поверхность в трехмерном пространстве - поверхность экстракции белка (рис.Зв).

При изучении белков с помощью таблиц-диаграмм информативным параметром состояния белка может служить "линия полувыхода", проведенная на таблице-диаграмме по точкам, соответствующим 50$ от максимального значения выхода белка (рис.36). Она характеризует граничные условия устойчивости комплекса белок-материнская структура.

Довольно наглядным является сопоставление форм поверхностей

- 13 -

экстракции белков в сравнительных экспериментах.

Оценка степени сродства белков хроматина к нативной структуре с помощью диаграмм экстрагируемости белков. Поскольку, линия полувыхода отражает переход белка из связанного состояния в свободное, то по диаграмме и форме кривой можно, в принципе, оценить характер тех или иных сил, осуществляющих комплексообразова-ние. Белки, имеющие однотипные лишш полувыхода, должны иметь схожий тип взаимодействия со структурой. В диссертационной работе приведены диаграммы состояния для 29 основных белковых полос, обнаруженных на электрофореграмме, с соответствующими линиями полувыхода.

В системе ЫаС1-мочевина для контрольных препаратов разграничено 5 типов экстракции белков, которые пронумерованы в порядке убывания роли гидрофобных и возрастания вклада электростатических взаимодействий (рис. 4, полуплоскости "а"). Каждая из приведенных на рис.4 конкретных диаграмм является наиболее характерной для белковых типов, описанных в тексте (номера приведенных на рис.4 белков в тексте подчеркнуты).

Тип I. "ГЛо ч овин о з авИсимыйп б ел ок -(полоса 20). Выход данного белка из структуры зависит только от концентрации мочевины, повышение ионной силы не влияет на его связь со структурой. Форма линии полувыхода - "горизонтальная".

Тип 2. "Мочевина-ЫаС1 зависимые" белки - (полосы I, 3, 5, 8, 9, 13, 14, 17-19, 21-25, 27-29). В бессолевом растворе группа этих белков высвобождается при концентрации мочезины 2-Ш, введение в экстрагирующую среду соли (0,15-0,ЗМ) приводит к понижению порога требуемой для диссоциации концентрации мочевины. Форма линии полувыхода - "диагональная".

Тип 3. "КаС1-мочевинозави'симые"белки - (М 6, 7, 10, II, 12). Мочевина без соли практически не нарушает связь белка со структурой, но в сочетании с солью она усиливает эффект высвобождения. Форма линии полувыхода - "диагональная"или "сложная".

Тип 4. "ЫаС1-зависимый белок" (белковая полоса Связь

белка со структурой обусловлена исключительно ионными взаимодействиями. Форма линии полувыхода - "вертикальная".

Тип 5. Белки данной группы (белковые полосы №№ 15, 16) стабильны в структуре хроматина в определенных точках экстракции (0,15М, 0,ЗМ КаС1 с 0,5М мочевиной). Форма линии полувыхода - "островковая".

а б • •

* >х г -■». -

.... ..... ....

в г -1

МО НЧ5 »19

к

<-

кй ::::

Г20 «та . В84

Рис.4. Объединенные .диаграммы белков хроматина печени петушков в корме (а, в) и при гормональном воздействии (б, г) в двух-координатной системе экстракции "ЯаС1-мочевина" (а, б) и "ЫаС1-рН" (в, г). Оси X и X1 соответствуют значениям концентрации НаС1 (0; ОД5М; 0,ЗМ; 0,5М), ось У - концентрации мочевины (0,5М; 1М; 2М; 4М), ось У - рН (5,0; 6,3; 7,6; 9,0).

В системе ЫаС1-рН разграничено 4 типа экстракции белков, подробное описание которых приводится в диссертационной работе. При рассмотрении таблиц-диаграмм белков с линиями полувыходов в обеих системах экстракций становится очевидным, что совокупность линий полувыхода для каждого из рассматриваемых белков в обеих системах КаИ-мочевина, ЫаС1-рН является индивидуальной

- 15 -

характеристикой (рис.4, полуплоскости "а", "в").

Сравнительное изучение статуса белков в хроматине при гормональном воздействии. Введение эстрадиола-17^ неполовозрелым петушкам приводит к изменению сродства негистоновых белков к структуре хроматина, о чем можно судить по увеличению (лабили-зация) или уменьшению (стабилизация) количества точек экстракции на таблицах-диаграммах, в которых белок находится в свободном состоянии. Результатом "разрыхления" определенных участков структуры хроматина является выход большой группы белков из хроматина гормон-обработанных животных при более низких концентрациях солюбшшзирующих агентов, чем в контроле (И 10, II, 12, 19, 20, 27, 28 - координаты КаС1-мочевина, Ж 9, 21, 24, 28 -координаты КаС1-рН). Наряду с этим, другая группа белков стабилизируется в структур^, и для ее выхода в растворимую фракцию требуются более высокие концентрации экстрагирующих агентов, чем в контрольных препаратах (М I, 3, 4., 13, 18, 21, 22, 25 - координаты КаС1-мочевина, М 5, 6, 8, 14, 15, 16, 29 - координаты ЫаСГ-рН). У ряда белков (Ш 8, 14, 19) > полученных из гормон-обработайного хроматина, наблюдаете^ стабилизирующий эффект 0,15М ЫаС1, что обусловлено "чувствительностью" самого гормон-обработанного хроматина к физиологическим значениям ионной силы.

Кроме наблюдаемого изменения общего сродства белков к хроматину заметны также специфические изменения характера выхода или формы линий полувыходов некоторых белков, что указывает на изменение типа взаимодействия этих белков со структурой. В большинстве случаев происходит переход диагональной формы линии полувыхода в сложную. В качестве характерного примера рассмотрим такой переход на диаграмме состояния белковой полосы №_19 (рис. 4, полуплоскости "а", "б"). Если в контрольных препаратах выход этого белка из связанного состояния в диссоциированное зависит от обеих переменных (концентраций ЫаС1, мочевины), пркчем повышение концентрации соли до 0,ЗМ снижало требуемый для выхода белка порог концентрации мочевины, то после гормонального воздействия белок при физиологической ионной силе остается стабильным в структуре при всех используемых в опыте концентрациях мочевины. При повышении концентрации соли белок полностью выходит в растворимую фракцию также независимо от концентрации мочевины. На рисунке 5(6) приведены поверхности экстракции белка ^ 19, на которых прослеживается разница в выходе белка из структуры

хроматина контрольных и гормон-обработанных животных. В диссертационной работе подробно проанализированы наиболее характерные изменения поверхностей экстракции ряда белков хроматина после эстрадиолового воздействия в двухкоординатных системах. В качестве примера на рис.. 5 показаны изменения поведения белкоЕ Ш 4, 20 после гормонального воздействия.

Белок № 4. - Количество белка после гормонального воздействия не меняется, но происходит изменение его точки максимальной экстракции из материнской структуры. Выраженный максимум достигается после введения гормона в точке экстракции 0,5М ЫаС1, 4М мочевина. Форма поверхности экстракции претерпевает наиболее заметные изменения в областях экстракции выше физиологической ионной силы.

Белок й 20. - После гормонального воздействия- регистрируется резкое изменение поведения белка й заданной системе экстрак-' ции. Отмечается двукратное количественное увеличение выхода белка из хроматина гормон-обработанных животных и изменение его поверхности экстракции. Резкие изменения наблюдаются в области физиологической ионной силы и выше. В контроле белок является мочв-винозависимым, в связи со структурой преобладают гидрофобные взаимодействия; после же введения гормона характер силы связывания меняется, выход белка становится ЫаС1-мочевинозависимнм.

В системе рН-ЫаС1 в основном форма поверхностей экстракции отдельных белков после введения гормона животным не претерпевает каких-либо заметных изменений. Изменения чаще всего наблюдаются в конкретных точках- экстракции и в абсолютном количестве выхода белков из материнской структуры. Из общих закономерностей выхода белков' из структуры в системе ЫаС1-рН необходимо отметить заметное уменьшение или полное отсутствие после гормонального воздействия экстракции большой группы белков. Поскольку в присутствии мочевины эти белки выходят из структуры в том яе количестве, что и в контроле, то становится очевидным, что 'опроделяющими силами связывания их со структурой являются гидрофобные силы. В эксперименте выявляются также белковые фракции, которые при гормональной индукции в спектре белков хроматина отсутствуют (полосы № 7, 17).

Применение метода "двухкоординатной экстракции" для изучения ассоциации хроматиновых белков с областями генома ггой торможении активности женских половых гормонов мужскими.

Рис. 5. Гормональные различия в форме поверхно й

системе HaCI-мочевина белков № 4 (а), № 19 (б), * 20 (в), со любилизированных из хроматина печени контрольных (К) и эстра-даол-обработанных животных (Э). По осям X Л отлокеш отмеченные в тексте значения концентраций экстрагарувдих агентов, по оси £ - оптической плотности.

D работе проведено исследование состояния негистоновых белков хроматина печени половозрелых кур методом "двухкоординатной экстракции" после воздействия мужским половым гормоном. Данное

исследование было необходимо для апробирования предложенного ме- . тода на альтернативной эстрадиоловой индукции модели, с целью выяснения его универсальности в сравнительных экспериментах.

Спектр белков половозрелой особи' в системах НаИ-мочевина, ЫаС1-рН отличается от такового неполовозрелой, что согласуется с литературными данными по изменению состава белков хроматина в результате старения организма (Клименко А.И., 1985).

Анализ диаграмм состояния белков, экстрагированных в системе ИаС1-мочевина, показал, что тестостерон частично дестабилизирует структуру хроматина половозрелой курицы. Заметные сдвиги наблюдаются в сторону дестабилизации у белков, в основном, с высокими и средними значениями молекулярных масс (66 - 200 кД, Ш _4, 6-8, 10, II, 15, 17, 20, 21, 27 - рис. 6). У другой большой группы белков каких-либо изменений с введением гормона не обнаруживается (Ж 12, 13; 16, 23^6, 28),или они довольно незначительные (№№ 2, 3, 5, 10, 14, 22, 29). Стабилизирован внутри структуры лишь белок №_9_(рис. 6). Таким образом, в, системе экстракции КаС1-мочевияа действие тестостерона ограничивается лшпь ослаблением силы связывания негистоновых белков со структурой хроматина. Иная картина наблюдается при экстракции белков в системе Най-рН. У некоторых из нах обнаружены изменения в характере связывания, причем как в сторону понижения порога выхода белка из структуры (белковые полосы Л» 17, 20), так ,и в сторону повышения (Ш_2, 3, 6, 12, 19 - рис. 6). Заслуживающим большего внимания является обнаружение изменения формы линии пслувыхода и поверхностей экстракции белков, что говорит о более глобальных изменениях их состояния после гормонального воздействия«. На примере ряда белков рассмотрены такие изменения. На рис, 6 приведен один из таких примеров: балок Л 20 обнаруживает переход сложной формы линии полувыхода б простую. Б норме белок Й 20 устойчив к действию соли в кислой среде. По мере смещения рН среды в щелочную область белок становится чувствительным к действию соли, причем зависимость его выхода от этого фактора сложная: выявляется дискретность выхода вдоль обеих осей диаграмма. Тестостерон упрощает выход белка в зависимости от обеих переменных (ЫаИ, рН). Зависимость от соли.полностью исчезает; 50$ выход белка обеспечивается в областям рН 5-6. Форма линии полувыхода становится горизонтальной (рис. 6). Изменения, происходящие с акстрагирув-мостью белка после воздействия тестостерона, хорошо шшэстриру-

14

ею

mi

i. . • « • . , . .JT • . • • . .J' • • • • . .J.....

ixlitli ifLlil

«42

»13

p24

№2

№12

ipi9

ШМ1

Рис. 6. Объединенные диаграммы белков хроматина печени кур в норме (К) и при гормональной воздействии (Т) в двухкоординат-ной системе экстракции NaCI-мочевина (а, б, в) и JMaCI-pH (г, д). Оси X ж X'соответствуют значениям концентрации ЫаС1 (0; 0,15М; 0,ЗМ; 0,5М), ось У в системе ЫаС1-мочевина - концентрации мочевины (0,5М; IM; 2М; 4М), ось У в системе ЫаИ--рН - рН (5,0; 6,3; 7,6; 9,0).

к

ются с помощью поверхностей экстракции белка до и после введения гормона (рис. 7).

Сопоставление данных по двум координатам показывает, что при действии тестостерона налицо изменение характера силы связывания большинства белков со структурой: гидрофобные силы превалируют над ионными вне зависимости от рН среды. Такой же эффект зарегист-

Рис. 7. Гормональные различия в форме поверхностей экстракции в системе ЫаС1-рН белка № 20, солюбшшзированного из хроматина печени контрольных (К) и тестостерон-обработанных <Т) животных.

рирован при действии на объект исследования эстрадиолом-17/a . Таким образом, можно заключить, что полученный результат характерен, в целом, для негистоновых белков хроматина печени при воздействии стероидных гормонов.

Влияние двухвалентных катионов на экстрагируемооть белков хроматина печени петушков в норме и при воздействии эотрадиола -17^7. Наш проводилось также изучение влияния структурных перестроек, вызванных ионами Mgf-2+, на положение негистоновых белков в хроматине. Полученные результаты свидетельствуют о том, что структурные перехода Юны - ЗОнм фибриллы при концентрациях М^С12 в пределах 0-1 мМ, описанные в литературе (smirnov j.v., 1988), не вызывают изменения спектра негистоновых белков как у контрольных, так и у опытных образцов хроматина. Отсюда можно заключить, что негистоновые белки не оказывают какого-либо заметного влияния на структуру фибриллы 30 нм, что хорошо согласуется С литературными данными (Thomas Т.,Koller Th., 1981).

Вместе с тем, агрегация 30 ям фибрилл, происходящая при повышении концентрации,MgfCl2 до 5 мМ, приводит к исчезновению группы высокомолекулярных белков из спектра негистоновых белков хроматина. Из контрольных препаратов хроматина, при наличии в среде экстракции 5 мМ , негистоновые белки солюбилизируются пропорционально повышению концентрации солюбилизирующего агента

(0,5М - 4М мочевины), и 505? выход белков достигается в области концентрации, мочевины 2М. При соблюдении тех же условий экстракции, что и в контроле из гормок-обработанных образцов хроматина негистоновые белки солюбилизируются в основном при максимальной концентрации мочевины (4М). Отмеченная закономерность характерна для основной массы негистоновых белков эстрадиол-обработан-ных животных. Солюбилизация белков из эстрадиол-обработанного хроматина при более высоких концентрациях мочевины, чем в контроле, несомненно является результатом их более стабилизированного состояния внутри макромолекулярного комплекса. Такой же эффект по оси концентрации мочевины да наблюдали при экстракции белкоэ из хроматина в системе ЦаС1-мочевина. Все это говорит в пользу того, что гормон-обработанный хроматин является более конденсированным, чем контрольный, что, очевидно, необходимо для запуска синтеза белка на конкретных участках генома.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены количественные и качественные изменения в составе негистоновых белков хроматина печени петушков при эстрада-оловом воздействии. Отмечено увеличение доли легкоплавких участков "остаточной" фракции хроматина, повышение температуры плавления данной фракции при воздействии эстрадиола-ГТ^ . Подтверждена концепция о комплексном влиянии различных груш хроматиновых белков на процессы стабилизации-дестабилизации хроматина при стероидной активации генетического аппарата.

2. Предложен новый методический подход (метод "двухкоординатной экстракции") для изучения состояния структурных белков в составе хроматина.

3. Проведена классификация негистоновых белков хроматина печени петушков на основе данных по двухкоординатной экстракции. Составлены таблицы-диаграммы с линиями полувыходов для исследуемых белков. Показано, что совокупность линий полувыхода в обеих системах экстракции ЫаС1-мочевина, ЫаСГ-рН является специфической и индивидуальной характеристикой для каждого изучаемого белка.

4. С помощью метода двухкоординатной экстракции выявлены сдвиги в сродстве белков хроматина, вызванные гормсначьным воздействием. В координатах КаС1-мочевина, КаС1-рН обнаружено из-

менение общего сродства бачков к хроматину в результате эффектов "разрыхления" и "конденсации" разных участков его структуры под воздействием гормона. Показаны специфические изменения в характере выхода отдельных белков из хроматина гормон-обработанных животных путем анализа на конкретных примерах их поверхностей экстракции и диаграмм экстрагируемое™.

5. На основании результатов, полученных методом двухкоординатной экстракции, заключено, что воздействие эстрадиола на печень петушков приводит к компактизации структуры тотального хроматина печени, что, по-видимому, каким-то образом связано с запуском синтеза белка на конкретных участках генома.

6. Метод апробирован также в экспериментах по торможению активности женских половых гормонов мужскими. Показано, что тестостерон частично дестабилизирует структуру хроматина половозрелой курицы.

7. Показано, что при действии стероидных гормонов имеет место изменение характера связывания большинства белков со структурой. При этом обнаружено, что эффект стероидных гормонов опосредован через гидрофобные взаимодействия.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Абрамян А.Ш., Матинян К.С., Геворкян Э.С. Изучение негис-токовых белков хроматина печени петушков при воздействии эстрадиола. III Республиканская научная конференция по вопросам биофизики, посвященная 60-летию образования СССР. Тезисы докладов. Ереван, 1982 г., с.65.

2. Паносян Г.Л., Абрамян А.Ш., Матинян К.С., Геворкян-Э.С. Изменения в составе лабильно-связанных негистоновых белков при воздействии эстрадиола. Тезисы 8 Всесоюзного симпозиума по структуре и функциям клеточного ядра. Нущино, 1984 г., с.146.

3. Геворкян Э.С., Абрамян А.Ш., Матинян К.С., Паносян Г.А. Изучение состава лабильно-связанных негистоновых белков хроматина печени петушков при воздействии эстрадиола. Вопросы медицинской химии, 1985, т.31, выл,5.»с.107-110.

4. Абрамян А.Ш. Исследование состава фракций йегистоновых белков хроматина печени петушков при гормональной индукции. II Республиканская конференция, посвященная цробле-

- 23 -

мам физико-химической биологии. Тезисы докладов. Ереван, 1986 г., с.З. 1

5. Лбрамнн А.Ш., Геворкян Э.С., Вардеванян П.О., Паносян Г.А. Роль лабильно-связанных негистояовых белков в термостабильности хроматина печени петушков при эстрадиоловой активации. Тезисы докладов 9-го Веесоюз. симп. по струк. и функц. клеточного ядра, Черноголовка. 1987. с.44.

6. Абрамян А.Ш., Геворкян Э.С., Вардеванян И.О., Паносян Г.А. Изменение термостабильности "остаточной" фракции хроматина при воздействии эстрадиола. Еиол. журнал Армении, 1988, т.41, № 4, с.326-330.

7. Калачян A.C., Абрамян А.Ш., Сарвазян H.A. Действие низких концентраций ионов натрия и магния на ядра клеток печени

и эритроцитов кур. III конференция молодых ученых тхтиту- 4 та экспериментальной биологии АН Армянской ССР, 1988 г.с.22

8. Arutunian A.A., Abramian A.SH., Kalachian H.S., Mnatsaka-nian G.A., Sarvasian N.A., Akopian T'.N. A new approach .for structural protein investigation. Abs.of 19-t.h Intern.Bio-chem. Congress, p.56, Prague, 1988.

9. Абрамян А.Ш., Геворкян Э.С., Вардеванян П.О., Паносян Г.А. О роли лабильно-связанных негистоновых белков в термостабильности хроматина при его активации эстрэдаолом. Вопросы мед. химии, 1990, № 2, с.96.

10. Сарвазян H.A., Абрамян А.Ш., Шагинян К.А., Акопян Т.Н., Арутюнян A.A. Двухкоординатная экстракция белков хроматина. Биологический журнал Армении, т.8, 1990, с.673-678.

11. Сарвазян H.A., Абрамян А.Ш., Шагинян К.А., Акопян Т.Н., Арутюнян A.A. Двухкоординатная экстракция белков хроматина. Экстракция в системах рН-ЫаС!, pH-мочевина. Биоло-

• гический журнал Армении, т.З, 1990, с.679-686.

12. Абрамян А.Ш., Калачян A.C., Сарвазян H.A., Шагинян К.А., Акопян Т.Н., Арутюнян A.A. Изменение статуса белков хроматина печени петушков при воздействии эстрадаолом. Биол. журнал Армении, 1990 г., т.43, гё l'0-II, с.910-918.