Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение статуса негистоновых белков хроматина методом многокоординатной экстракции

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение статуса негистоновых белков хроматина методом многокоординатной экстракции"

Форма 3.3

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ . ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи

САРВАЗЯН Наринэ Лрменовна

. ИЗУЧЕНИЕ СТАТУСА НЕГИСТОНОВЫХ БЕЛКОВ ХРОМАТИНА - МЕТОДОМ МНОГОКООРШАТНОЙ ЭКСТРАКЦИИ .

03.00.02 - биофизика

'Автореферат.

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван- 1990

Работа выполнена в Институте экспериментальной биологии АН Республики Армения.

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

ведрдай научный сотрудник

АРУТШЯН A.A.

Официальные оппоненты: чл.-корр.АН Республики Армения

ОГАНЕСЯН С.С. доктор биологических наук МАГАКЯН Ю.А.

Ведуцзе учреждение - Ереванский! медицинский институт иы.Гераци, кафедра биохимии.

Защита диссертации состоится " J.Q2/JTib. I990f г. в час. на заседании специализированного совета К.055.01.08

Ереванского государственного университета (Ереван, 375049, ул. Мравяна, I, Ереванский государственный университет, биологический факультет, кафедра биохимии).

С диссертацией ыозно ознакомиться в библиотеке университета.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

Л.Г.АНАНЯН

Автореферат разослан

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нахоядение адекватного описания, характеризующего состояние белка в составе слоеных надаолекуляр-анх структур и отражающего изменение его статуса при различных воздействиях на биологический объект, является одной из ванных биофизических задач. Налицо дефицит подходов, позволяющих количественно оценить статус молекулы в составе материнской структуры, характеристик, отражающих взаимодействие белка с конкретным молекулярным окружением. В связи с этим представляется актуальным новый методический подход, позволяющий свести совокупность результатов, получаемых в опытах по экстракции белка под воздействием различных физико-химических факторов, к взаимосвязанному массиву данных .поддающемуся четкому графическому описанию я компьютерной обработке. В экспериментах с использованием такого подхода могут варьироваться объект исследования, реагенты,выступающие в качестве координат, измеряемый параметр (выход белка, ферментативная активность, для конкретных задач - уровень фосфо-ршшрования, соотношение Н/'С14 и т.п.). Метод монет быть применим для изучения как отдельных белков, так и их совокупности.

В данной работе новый методический подход с условным названием "многокоординатная экстракция" был реализован на примере негистоновых белков хроматина - слоеного динамичного комплекса нуклеиновых кислот и белков с глубокой структурной иерархией. Белки хроматина,приблизительно в два раза превосходящие по своей массе ДНК, весьма разнородны по составу. Примерно половину из них составляют хорошо изученные внсокоспециалпзированные основные белки всего нескольких типов - гистоны, определяющие структурную организацию первых уровней компактизации ДНК. В отличие от гистонов другая часть ядерного белка - т.н. негястоновне белки - чрезвычайно гетерогенны по составу и свойствам, неоут структурные, регуляторнне, каталитические функции, и являются одним из наименее изученных классов белков. Поэтому качественно новая информация о негистоновых белках хроматина,получаемая методом многокоординатной экстракция,представляется особенно актуальной.

Цель и задачи.исследования. Задачи, определившие результаты данного исследования были следующими:

- добиться экспериментальной реализации нового методичес-

кого подхода для белков хроматина эритроцитов кур;

- провести поиск эффективных координат да негистоновых белков хроматина;

- показать новизну и информативность новых физико-химических характеристик доя исследуемых белков;

- зафиксировать чувствительность метода в сравнительных исследованиях.

Научная новизна работы. Метод многокоординатной экстракции является новым подходом к изучению белков в составе надмолекулярных комплексов. На примере негистоновых белков хроматина эритроцитов кур с помощью этого метода выявлен и рассмотрен ряд новых физико-химических параметров, позволяющих характеризовать положение белка в составе структуры. Проведена классификация белков по типу экстрагируемости и показано, что совокупность таблиц-диаграмм с обозначенными на них линиями полувыхода является индивидуальной характеристикой для каждого рассматриваемого белка. Впервые'для хроматина эритроцитов кур и петухов выявлены качественные и количественные различия в статусе негистоновых белков. Результаты работы, систематизированные в виде бака данных по совокупности поверхностей экстракции для 22 белковых фракций, являются качественно повой информацией о белках хроматина в структурно-функциональном плане.

Практическая ценность работы. Разработанный метод может быть применен для решения различных биофизических и молекулярно-биологических задач по изучению слояных макромолекулярнкх структур, таких как мембрана, хроматин, рибосома и т.п. Метод многокоординатной экстракции дает возможность классифицировать белки по типу экстрагируемости, оценивать типы взаимодействий, .определяющих положение белка в структуре, применять компьютерные методы обработки данных. Чувствительность метода в сравнительных исследованиях определяет его ценность дая изучения сдвигов статуса белков в составе различных клеточных структур, обусловленных возрастными, гормональными, патологическими изменениями в организме.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Ш Всесоюзной конференции "Образный анализ в управлении, научных исследованиях и системах обучения", Москва, 1990 г. Работа апробирована на заседании ученого совета Института экспериментальной био-

логии АН АрмССР от 5 октября 1990 года а на заседании кафедры биофизики биологического факультета Ереванского государственного университета от 15 октября 1990 года.

Публикации. По тема диссертации опубликовано 7 работ. Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, трех глав (I - обзор литературы, П - объект и метода исследований, Ш - результаты и обсуждение), заключения, выеодов и списка литературы. Работа изложена на 101 странице машинописного текста.

Библиография включает 103 наименования литературных источников.

В обзоре литературы подробно изложены современные данные

0 физико-химических свойствзх негистоновых белков хроматина, а также обсуждаются методы изучения этих белксв.

Краткое содержание остальных глав приводится киге.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение хроматина. Хроматин эритроцитов кур получала в соответствии о методикой Данева ( Твапеу Я. ,!?цззеу <5. ,1974) с небольшими модификациями. Выделение проводили при 4°С, все растворы содержали РЮТ в конечной концентрации 0,3 ьИ. Забор крови производился в ОД !Л цитрате с 0,2$ глюкозой из расчета'

1 рХ антикоагулянта на каздые 5 гЛ крови. Эритроциты осадцалд 10 мин при 1000 ср и триады промывали в изотоническом растворе с 0,2% глюкозой. Далее осадок инкубировали в двухкратном по отношении к объему крови объеме раствора к (0,025 М ЗДТА, 0,075 М ИаС1, рН 8.0) с 0,2$ №-40 в течении 15 мин при 4°С, гомогенизировали и осаждали 10 мин при 600^ . Эту процедуру повторяли триады. Затем осадок проживали по два раза раствором А без детергента и раствором, содержащим 0,14 М МаС1, ЮмМ трис-НС1

рН 7.5. После гомогенизации в растворе В (10 [.¿Л трис-НС1 рН 8.0,

2 тМ М^-С1р) хроматин осаядали при 2000 д, в течении 20 мин и оставляли на ночь в растворе Б при 4°С, Перед экстракцией хроматин осаядаля и осадок гомогенизировали в необходимом количестве раствора В.

Деконденсированный хроматин получали многократной промывкой исходного хроматина в 10 мМ ТРИС-НС1 III 8, в отсутствии

M^-CIg. ? экспериментах с тряпсинизацие", хроматина обработка трипсином проводилась в течении 10 минут при 18°С при соотношении белок/фермент - Ю4/1.

Экстракция хроматина. Исследование характера экстрагируе-ыости белков хроматина в двухкомпонентных средах проводили в 16 отдельных пробах, в трехкомпонентной экстрагирующей среде в 64 пробах. В каждую пробу с ZOO pi суспензии хроматина (концентрация 5 ыг/мл по белку) добавляли 300pi буфера, приготовленного таким образом, чтобы конечные концентрации экстрагирующих веществ в эпендорфе с номером М соответствовали координатам точки с номером М из сетки экстракции. Значения координат на осях экстракции соответствуют: для NaCI - концентрациям 0; 0,15 М; 0,35 М; 0,50 М;дяя мочевины - концентрациям 0; I М; 2 М; 4 М; для рН - значениям рй 5,0; рН 6,3; рН 7,6; рН 9,0 и расположены на осях в порядке их возрастания. Значения рН в точках рН 5,0 и рН 6,3 обеспечивались 50 Лй-цитратным буфером, значения рН в точках рН 7,6 и jH 9,0-50 i£A трис-HCI буфером.Все растворы содержали 2 М M^CIg (в экспериментах на деконденси-рованном хроматине экстрагирующие растворы не содержали MjCt^). Экстракцию хроматина проводили в течении I часа при 4°С при непрерывном перемешивании, затем центрифугировали при 30 ООО д, в течении I часа. Операции солвбилизации и осаждения проводили строго идентично для всех проб, что достигалось использованием общего штатива для перемешивания и специально-изготовленных деревянных вкладышей в центрифужные гнезда, содержащих по 8 позиций для отдельных проб (т.о. одновременно можно было осаждать до 64 образцов).

Электрофорез образцов ДДС-электрофорез проводился согласно Лаэмшш ( Laemmli U.K. ,1970) в двухступенчатом ПААГ 35? и 10$, с использованием silane-At74 ( Sigma }, для сшивки геля к стеклу. Соотношение бис/акряламвд составляло I.3.I0"2, а не 2,6.10~2 как у Лаэмшш, что приводило к увеличению дистанции миграции негистоновых белков в геле. В аликвотах солюбшшзиро-ванного белка белок определяли методом Бредфорда ( Bradford. М. е. ,1976), используя в качестве стандарта сывороточный глобин. После окончания электрофореза гель окрашивали 0,25$ раствором Кумасси (R - 250) в 40£ изопропаноле и 10% уксусной кислоты. Обесцвеченный гель на 5 минут погружали в фиксирующий раствор, содержащий 3% глицерина и 70!? изопропанола и сушили на

воздухе.

Сканирование децсктограми. ДепситометрироЕаяяе белковых полос проводила на' Oltrascan si ( Н'в ) при 633 ни. В качестве величины, характеризуй^ концентрации белка в экстракте, кока рассматривается лпзь высота пика F , регистрируемая при сканировании электро$ореграм»дц. При этом ш исходим из того, что полу-вшрина гауссовнх пиков благодаря одинаковой дистанции нитрации бежа из разных треках практически одинакова, и эта постоянная составляющая при сравнительных исследованиях теряет сш:сл. Тек как для данного метода принципиальное значение имеет качественный выход белка, то для получения соответствующей величины Г учитывались следуадие факторы:

1) погрешность, вносимая различной степенью окраски гелей;

2) погрешность, вносимая упирениен трека при загрузке большого количества белка.

Нумерация белковнх додос. Молекулярные веса. Общее количество визуализируемых белковых полос в наши опытах составляет порядка полусотни. Наиболее интенсивные из них пронумерованы в порядке убывания молекулярного веса.

(Для определения молекулярного веса рассматриваемых белков проводили электрофорез 'SDS маркеров).

Для хроматина эритроцитов кур характерно практическое отсутствие протеазной активности (.Cortar D.B., Chao Chi-Вся ,1976) и, следовательно, расщепление белковых полос, как результат про-теолитической деградации исключается. Для того, чтобы убедиться з тем, что полосы является определенными фракциями натшшых белков, а не прздетавлявт собой субъединицы, нами бал проведен контрольный электрофорез в отсутствии р-меркаптоэтаяола, который в основном повторил белковую картину для рассматриваемых полос.

Воспроизвоигмость результатов. В течении эксперимента необходимо было исключить наслоение систематически ошибок и убедиться в воспроизводимости величины выхода белка. В связи с этим были проведены контрольные эксперименты дая сравнения:

- разных выделений для одного объекта;

- выделений из разных объектов (кур одной порода);

- экстракции в разных пробах (тот же экстрагирующий paci4

вор);

- результатов электрофореза одного образца, нанесенного на разные пластинки;

- употребления различных 4-кратных буферов для нанесения;

- линейности функции выхода белка Г при различном' объеме наноски образца в рЕ .

Погрешности, вносимые этими процедурами, не превышали 1520$ от абсолютной величины выхода белка Р .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОЕСУВДЕНИЕ

Метод двухкоординатной экстракции. Идея нового методического ПОДХОДа Предложенного АрутЮКЯНОМ С АгиЬиш.ап et а1, 1988 ) основана на т.н. "многокоординатной экстракции" белка из структуры и для случая 2-х координат иллюстрируется на фиг.1а. В качестве координат X и У выступают различные экстрагирующие агенты - мочевина, тритон, Na.CC , ¿03 и т.п. Значения х^ ,

с =1 ,Л/ и ^ , ¿. = 1,п. представляют конкретные значения концентраций X и У соответственно. Точка с номером М= //(¿-1) , имеющая координаты и в эксперименте

реализуется как раствор М со значениями концентраций экстрагирующих агентов х,. и . ^ , Совокупность таких растворов удобно объединить под термином "сетка экстракции". После выделения объект исследования разбивается на идентичных образцов

и каадый образец с номером М подвергается экспозиции с перемешиванием в растворе М из сетки экстракции. Существенно, что все эти операции производятся одновременно и строго идентично дая всех образцов. После осаждения мы имеем набор п * N над-осадков и осадков, полученный как бы наложением сетки экстракции на исследуемую структуру. После электрофоретического анализа надосадков, сканирования и идентификации белковых полос, для каждой из них определяются величины выхода белка во всех спектрах. Расположит в месте точки Г.! значение выхода какого-либо белка в растворе М, мы получаем т.н. "таблицу-диаграмму" для этого белка (фиг.16).

Совокупность значений Р в 16 треках можно рассматривать также в качестве функции Р ( х , у. ) двух переменных: а именно - различных концентраций экстрагирующих агентов, использо-' ванных в качестве координат. Очевидно, что Р (х, и, ) графи-

54

13

123 из 117 88 79 91

о 43 ээ о 15 ii 22

5,0 5,3 7,6 9,0 рн б/

Шура I. (а,б,в).

а) двухкоординатная таблица для сетки экстракции в общем

виде;

б) двухкоординатная таблица-диаграмма белковой полосы № 20 в системе рН-мочевина;

в) поверхность экстракции для белка полосы № 20 в системе рН-мочевина.

Жирной линией обозначена линия полувыхода.

Фигура 2 (а,б). Поверхности экстракции в системе -мочевп-

■ на: а) белка полосы № 2; бГбелка полосы й 22.

чески представляет собой некую поверхность в трехмерном пространстве. Ограниченное число экспериментальных точек не позволяет представить строгую форму этой поверхности, однако, если соединить все точки Р с помощью кривых, которые являются одномерными зависимостями F (х , у. = const) и Г (х = const, у.) , то форма поверхности приобретает несколько большую наглядность (фигЛв). В рамках предложенного подхода' функция Р ( х,у ) имеет реальный физический смысл: совокупность точек {Р^ или, шнми словами, поверхность экстракции описывает поведение того шеи иного белка в конкретных условиях среда. Если на этой поверхности провести линию по точкам с 50% значением выхода белка из структуры, то она в определенной мере будет характеризовать граничные .условия устойчивости комплекса белок-материнская структура. Эта линия, которую можно назвать "линией полувыхода" обозначена мирной линией на таблице-диаграмме и на поверхности экстракции белка (фиг.16,в). В принципе, монно построить чисто математически и изоградиентную линию данной поверхности. Тогда она приобретает реальный физический смысл и будет представлять собой как бы двухмерную константу диссоциации белка в интервале заданных концентраций двух ингредиентов экстрагирующей среда.

Результаты.применения метода в системе MaCI-мочевина. Поверхности экстракции дая отдельных белковых полос.

Наиболее эффективной системой экстракции для изучения белков хроматина эритроцитов кур является система с координатами AfeCI и мочевина, что обусловлено преобладающим значением электростатических и водородных взаимодействий дая поддержания нативной структуры хроматина. В этой системе координат для всех рассматриваемых белковых полос были получены данные.для таблиц-диаграмм и поверхностей экстракции. Для примера рассмотрим форму поверхности экстракции белков й 2 и й 22 (фиг.2а,б). Величина выхода белка К 2 при возрастании концентрации мочевины монотонно возрастает и при 2 М мочевине количество экстрагируемого белка составляет более половины от максимального. При отсутствии мочевины соль не может экстрагировать эти белки, но когда концентрация мочевины превышает I М, увеличение ионной

сшш раствора способствует выводу белка (фиг. 2а). Пологе и Ее бежа & 2 .определяется преимущественно водороддымз связями.

Полоса ¡1.22 представляет собой гистон Н1. Для этого белка характерен дискретный тип экстракции, когда либо белка нет соз-сем, либо он экстрагируется сразу на 80$-100$ от каксикальной величины. Повнзенпз ионной силы раствора называет скачкообразное увеличение выхода этого белка, цроссходг^ее в интервале 0,35-0,50 М ШС1. Количество мочевЕКЕ в вкстрзгаруЕЗЭм растворе не влияет на величину еыходз белка (флг.2б). Подсгзпсе белка полосы й 22 определяется злектростатачвсзс-'з взатодейатвпшлд.

В результате проведенных экспер^гигоз срэда сэучзйдгх белков Еияияен рад характерных групп л сцзнэпы тяпы взакодойствиа, ответственных за положение белков и структуре хроматина.

Кроме системы //аСб-мочевипы бклп ссуцзствлсгш исследования белков хроматина эритроцитов кур з систе.чзх экстракция рН-мочевина и рН-//аС1. В кандой из этгх систем получены экспериментальные данные п построены таблицы-диаграммы и поверхности экстракции дош всех изучаемых белковых полос.

Классификация белков по группам в различных системах экстракции. Плеск эффективнах координат. Объединенные двухкоордшатнке деаграклн..

Анализ таблиц-диаграмм и поверхностей экстракции всех рассматриваемых белков в рамках одной системы экстракции позволяет сгруппировать их в соответствии с различным типом экстракции. Достигаемая подобным распределением классификация достаточно условна, т.к. имеются белки, которне по рассматриваемым параметрам занимают промежуточное положение между соседними группами. Рассмотрим вкратце результаты экстракции белков хроматина эритроцитов кур в отдельных сетках экстракции.

В системе ЖаС1-мочевина разграничено 6 типов экстракция белков, которые пронумерованы (1-У1) в порядке убывания роли водородных и возрастания вклада электростатических взаимодействий (т.е. от белков, степень экстракции которых определяется только концентрацией мочевины, до белков,выход которых зависит только от ионной сшш раствора).

Тип I (полосы 4 и б). Величина выхода белка не зависит от

ионной силы раствора, а полностью определяется концентрацией мочевины (фяг.3.1).

Тип П. (полосы 5,7,8,9,11,18,20,21). При малых концентрациях мочевины в растворе повышение ионной силы приводит к увеличении выхода белка. Влияние сода исчезает при повышении концентрации мочевины в растворе (фиг.3.2).

Тип Ш (полосы 1,2,3,10,12,17). При отсутствии мочевины соль практически не экстрагирует эти белки, но при значениях концентрации мочевины в растворе выше I М увеличение ионной силы раствора способствует выходу белка (фиг.3.3).

Тип ГУ (полосы 12,13о,14,16). Для этих белков наблюдается плавное увеличение величины выхода белка при повышении как ионной силы раствора, так и концентрации мочевины (фиг3.4).

Тип У (полосы Па, 13а, 15). Выход этих белков зависит от ионной силы раствора. В отсутствии соли мочевина не экстрагирует белки (фиг.3.5).

Тип УГ (полосы 22-25). Эта группа представлена гистонами. Экстракция этих белков зависит только от ионной силы раствора и имеет ярко выраженный дискретный характер (для данных значений координат) (фиг.3.6).

В системе рН-ыочевииа разграничено 5 типов экстракции белков (-характерные поверхности экстракции дая групп 1-1У представлены на фиг.3.7-3.ГО соответственно, поверхность экстракции белка й 20, принадленащего к УГ типу - на фяг.Гв). В системе рН- ЖаС£ разграничено такае пять типов экстракции, характерные поверхности экстракции представлены на фиг.ЗЛГ-ЗЛ5 соответственно. В диссертационной работе проведено подробное рассмотрение всех групп белков в различных системах экстракции.

Нами был проведен скриннинг возможных реагентов, способных выступать в качестве экстрагируювдвс координат. Были опробованы ЖС2 , рН, мочевина, , тритон, Наиболее информа-

тивны для изучения белков хроматина эритроцитов кур ■ — координаты рН, Ша .мочевина, остальные экстрагирующие агенты оказались малоэффективными. В качестве иллюстрации вышеизложенного на фиг.4 представлены поверхности экстракции белка № 3-в шести различных системах экстракции.

Определив наиболее адекватные для хроматина эритроцитов кур координаты мы решили провести экстракцию одновременно в

Фигура 3. Поверхности экстракции, характерные для белков с различными типами экстрагируеглости, разграниченных в системе А&С£-мочевина (3.1-3.6) рй-мочевина (3.7-3.10), jE-Na.CC (3.11-3.15).

трех двухкоордкнатных сетках экстракции: рН-мочевина, рН-АаС£, Ма.С£-мочевина.. Если поступиться частью полезной информация, предоставляемой анализом форм поверхностей экстракции и ограничиться рассмотрением лишь линии полувыхода, то мозно на т.н. объединенной двухкоордкнатной диаграмме обобщить результаты экстракции белка в трех различных сетках экстракции. Б этон случае линии полувыхода в плоскостях координат рН-мочевина, рН- Ka.CZ , }/аС£ - мочевина являются как бы "сечениями" на плоскостях ХУ ,Х2 ,У2. (фиг.5) некой поверхности полувыхода, характеризующей граничные условия устойчивости комплекса "белок-материнская структура" в трехкомпонентной экстрагирующей среде. Как видно из приведенных выше данных двухкоордлнат-ные поверхности экстракции позволяли группировать белки по типу экстракция. Однако при анализе объединенных двухкоордияат-ннх диаграмм типовые разграничения белков уае практически отсутствуют и экстракция каждого белка отражается в индивидуальной диаграмме с характерными линиями полувыхода. На фиг.5 представлены такие объединенные трехкоординатные диаграммы ддя

Фшура 4. Сравнительное построение поверхностей экстракции белка №3 в шести различных системах:

а) МхС£ -мочевина; б) ыочевина-рН;

б) мочевина-тритон; г) pH-yVc.CC ; д) 1>ГаСС -тритон; е) рН-тритон.

Фигура 5. Объединенные двухкоординатные диаграммы для основных белковых полос. Каадая плоскость -таблица-диаграмма с обозначенной линией полувыхода Ось х соответствует рН, ось У -мочевине, ось Ъ -JVa.ee . Пунктирной стрелкой на, диаграмме полосы й I показано,что плоскость У2 (Afa.CZ -мочевина) должна быть смещена по оси X (рН).т.к. экстракция в системе лЫж-ыочевина осуществлялась при значении рН 8,0.

различных белковых полос. Этот результат подтверждает многочисленные литературные данные о разнородности и специфически аегис-тоновых белков и условности принятой в настоящее время классификации. Поэтому в отношении белков хроматина помимо поиска путей классификации может быть информативным подход, т.н. "паспортизации" белков на основе совокупности диаграмм с обозначенными линиями полувыхода. Изменения формы этих кривых обнаружены нзии с помощью описанного подхода при сравнительных исследованиях или'в эксперименте с ожиданием молекулярных сдвигов в хроматине.

Трехкоординатная экстракция. Следующим логическим шагом в развитии метода является использование трехкоординатной экстракции. Совокупность точек экстракции в пространстве будет представлять собой куб (4x4x4 = 64). Точка с номером М ( алеющая координаты зсс, yj , ак в эксперименте реализуется как раствор М со значениями концентраций экстрагирующих агентов равными величинам соответствующих координат. Совокупность таких растворов удобно объединить под условным названием "куб экстракции". Совокупность значений Р (г, у, з ) в 64 клетках представляет собой функцию трех переменных. Р ( зе , у., н ) уге не может быть наглядно представлена в пространстве и информация "за-' логенная" в кубе экстракций монет быть дана через 12 возмозннх сечений куба, то есть совокупности 12 таблиц - диаграмм по 16 точек в кандой.

Метод трехкоординатной экстракции был наш применен к изучению негистоновых белков,хроматина эритроцитов кур с использованием в качестве координат Na.CC, мочевины.рН. В результате проведенных экспериментов для каздой рассматриваемой белковой фракции получен блок данных из 64 значений функции Р (МяС£, мочевина, рН). После разработки программы для создания сечений куба экстракции, совокупность данных для 15 основных белков фракции хроматина эритроцитов кур образовала своеобразный банк данных из 180 (12x15) таблиц-диаграмм. На фиг.6 представлены четыре сечения по координате рН куба экстракции для белка .1 17. Б случае трехкоординатной экстракции линиям полувыхода соответствует т.н. "поверхность полувыхода", которая отделяет внутри куба экстракции точки, в которых значения выхода белка в раствор превышает 50$ от максимального. Форма таких поверхностей в рассматриваемой трехкоординатной системе экстракции ЖаС1-мочевпна-

рН усложнена вследствии немонотонности параметра рН среда. Однако естественно предположить, что вместо громоздкой (хотя и очень информативной) совокупности 12 сечений куба для трехкоординатных систем экстракции, форма такой поверхности полувыхода будет наглядна и ее вид (как в случае совокупности линий полувыхода на объединенных диаграммах) будет индивидуальной характеристикой каждого белка, отражающей тип взаимодействия с ближайшим молекулярным окружением.

В принципе, изложенный подход открывает возможности дальнейшего углубления ж схематизации. Так» .например, .можно рассматривать п. -компонентную экстракцию, включающую в качестве координат все агенты как-либо влияющие на экстракцию белка ¡из данной «акромоледулярной структуры'. Принципиальные трудности дая реализации "многокоординатной экстракции" отсутствуют, однако в связи с методическими., а также графическими ограничениями рассмотрение трех- и более компонентной экстракции затруднено. Очевидно, что ¡использование л-компонентной экстракции даст наиболее полное отражение свойств исследуемого объекта.

Исследования методом двухкоординатной экстракции компактного и деконденсироваяного хроматина, половых различий в статусе негястоновых ¿белков

Одной из задач данного исследования было показать эффективность нового методического подхода в сравнительных исследованиях. Поэтому нам показалось интересным применить метод как для изучения изменений общего состояния структура, так и дая обнаружения различий в статусе отдельных белков хроматина эритроцитов кур и петухов. Мы применили метод двухкоординатной экстракции в системе АаС1-мочевина для изучения структурных преобразований хроматина,вызванных изменением ионных условий среды: СМ^Су=2мМ, большинства негистоновых белков изменение степени конденсации хроматина не приводит к существенному сдвигу форш поверхности экстракции, однако ряд белков изменяет степень сродства к общей структуре. Для сильного изменения структуры в конденсированном и деконденсированном состояниях проводили трипси-тгдяцип хроматина, которая вызывала существенное изменение спектра экстрагируемых белков и форм поверхностей экстракции дая

Зигура 6. Сечения куба экстракции для белка полосы ß 17 ' при фиксированных значениях pH: а) pH - 9,0; б) pH = 7-,6; в) pH = 6,3; г) pH = 5,0.

Фигура

а/ б/

Поверхности экстракции белка полосы Я xpovaras эритроцитов: а) петухов; б) кур.

большинства белковых полос. Удаление определенных белковых структур трипсином приводило к полной утрате полос 1,2,3,10, 12,15,17 п изменению бЧ>рм поверхностей экстракции полос 7,8, 13,19,20. Более разносторонвз информации об этих изменениях дает анализ конкретных поверхностей экстракции для конкретных белков. Сравнение же данных по трипсинизации хроматина в де-конденснрованном и компактном состоянии свидетельствует об отсутствии разницы в формах поверхностей экстракции белков.

В литературе отсутствует данные о существовании половых различий негнстоновых белков хроматина эритроцитов. В эритроцитах незпшх позвоночных практически весь хроматин ядер находится в конденсированном состоянии и в этих ядрах не происходит синтеза ДНК и РНК.С другой стороны известно,что мембрана эритроцитов содержит рецептор эстрадиола. Наши сравнительные опыты по изучению статуса белков хроматина эритроцитов кур и петухов выявили сдвиги в форме поверхностей экстракции и показали наличие как качественных, так и количественных различий у конкретных белковых полос / фиг.7/. Этот результат косвенно шлет свидетельствовать о том, что мембранный рецептор инертной по отноЕешаэ к. гормону клетки с репрессированным в целом гено-£.-.01; проявляет признаки функциональной активности.

ВЫВОДЫ

1. Для хроматина эритроцитов птиц экспериментально реализована ядед цового методического подхода -метода многокоординатной экстракции, выявлены и рассмотрены новые физико-химические параметра, характеризующие состояние структурных белков в составе надмолекулярного комплекса.

2. Показано, что совокупность таблиц-диаграмм или поверхностей экстракции с обозначенными на них линиями полувыхода яв-. ляется специфической и индивидуальной характеристикой дая каждого изучаемого белка. ,

3. Для негистоновых белков хроматина эритроцитов кур проведена классификация на основе данных по двухкоординатной экстракции.

4. Для белков хроматина эритроцитов кур составлен банк дан-

пых по экстракции в трехкоординатной системе АТаСЛ-мочевино-рЛ.

5. Выявлены качественные и количественные различия в статусе негистоновых белков хроматина эритроцитов кур и петухов.

6. В системе ЛаС1-мочевина проведены сравнительные исследования по изучению статуса негистоновых белков хроматина эритроцитов кур деконденсированного и компактного хроматина.

1. Arutunian A.A..,Abramian A.Sh. .Kalachian H.S. .Mnatsaka-niaa G.A., Sarvazian N.A., Akopian Т.К. A new approach for structural protein investigation. Abs.of 19-th Intern.Biochem. Congress, p.56,Prague,1988.

2. Калачян A.C., Абрамян А.И., Сарвазян H.A. Действие низких концентраций ионов натрия и магния на ядра клеток печени и эритроцитов кур. Тезисы докладов Ш конференции молодых ученых института экспериментальной биологии АН АрмССР,Дилижан,1988,с.22

3. Сарвазян H.A. Оценка степени сродства негистоновых белков к нативной структуре хроматина. Тезисы докладов Ш конференции аспирантов АН АрмССР. - Ереван, 1988, с.19.

4. Сарвазян H.A., Абрамян А.Ш., Шагинян К.А., Акопян Т.Н., Арутюнян A.A. Двухкоординатная экстракция белков хроматина. Сообщение I. Биологический журнал Армении, 1990, № 8,с.673-678

5. Сарвазян H.A., Абрамян А.Ш., Шагинян К.А., Акопян Т.Н., Арутюнян A.A. Двухкоординатная экстракция белков хроматина: Сообщение 2. Экстракция в системах pH- No-Ct , pH-мочевина. Трехкоординатные диаграммы. Еиол.ж.Армении,1990,№8,с.679-686 .

6. Сарвазян H.A., Арутюнян A.A. Графический способ описания статуса белков в составе надмолекулярных структур. Тезисы докладов Ш Всесоюзной научно-технической конференции "Образный анализ в управлении, научных исследованиях и системах обучения". - Москва, 1990,с.44.

7. Абрамян А.Ш., Калачян A.C., Сарвазян H.A., Шагинян К.А., Акопян Т.Н., Арутюнян A.A. Изменение статуса белков хроматина печени петушков при воздействии эстрадиолом. Биологический журнал Армении (в печати).

Список работ, опубликованных по материалам диссертации