Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Линкерные гистоны семейства Н1 суперкомпактного хроматина спермиев

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чихиржина, Елена Всеволодовна, Санкт-Петербург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

ЧИХИРЖИНА Елена Всеволодовна

ЛИНКЕРНЫЕ ГИСТОНЫ СЕМЕЙСТВА Н1 СУПЕРКОМПАКТНОГО ХРОМАТИНА СПЕРМИЕВ. КОНФОРМАЦИОННЫЕ ОСОБЕННОСТИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК

Специальность 03.00.25 Клеточная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор

В.И.Воробьев

на правах рукописи УДК 576.315.42 577.112.823 577.218

Санкт-Петербург 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4

Актуальность проблемы. 4

Цели и задачи исследования. 6

Научная новизна и научно-практическая ценность. 7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ

О СТРУКТУРЕ ХРОМАТИНА. 9

1.1.1. Первый уровень организации хроматина. 9

1.1.2.30-нм фибрилла. / 13

1.1.3. Модели 30-нм фибриллы. ^-Ч'"'' 15

1.1.4. Петельный уровень организации хроматина. 22

1.1.5. Метафазная хромосома. 24

1.2. ГИСТОНЫ. 25

1.2.1. Гистоны семейства Н1. 26

1.2.2. Постсинтетические модификации гистонов

семейства Н1. 30

1.2.3. Взаимодействие гистонов семейства Н1 с ДНК. 33

1.3. НЕГИСТОНОВЫЕ БЕЛКИ ХРОМАТИНА. 38

1.3.1. ЬНУЮ белки. 38

1.3.2. Белки семейства НМ01/2. 39

1.3.3. Взаимодействие белков НМ01 и 2 с ДНК и

хроматином. 41

1.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 43

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 2.1. Выделение спермий-специфических белков и негистоновых белков НМ01 и 2.

2.2. Выделение глобулярных фрагментов белков. 46

2.3. Анализ белков. 46

2.5. ДНК. 48

2.6. Искусственные комплексы ДНК с гистонами

семейства Н1. 48

2.7. Метод кругового дихроизма. 49

2.7.1. Применение метода кругового дихроизма в исследовании структуры нуклеиновых кислот. 49

2.6.2. Применение метода кругового дихроизма в исследовании структуры белков. 54

2.6.3. Регистрация спектров кругового дихроизма. 55 2.7.2. Компьютерный анализ спектров кругового

дихроизма. 56

2.8. Спектрофотометрическое плавление. 57

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Электрофоретический анализ белков. 59

3.2. Особенности вторичной и третичной структуры

гистонов семейства Н1. 63

3.2. Конформационные особенности вторичной

структуры негистоновых белков НМХ}1 и 2. 79

3.3. Компактизация хроматина на модельной системе ДНК-белковых комплексов. 91

3.4. Термостабильность ДНК при взаимодействии с

гистонами семейства Н1. 102

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 107

ВЫВОДЫ. 112

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

113

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Исследование структуры хроматина находится в центре проблем современной молекулярной биологии и биофизики. Белки хроматина обеспечивают компактную упаковку ДНК в ядре и принимают участие в процессе управления дифференциальной экспрессией генов [РекепГеМ в., 1992]. В настоящее время важная роль в организации структуры хроматина приписывается гистонам семейства Н1. Эта фракция, связанная с линкерным участком ДНК, отвечает за поддержание высших уровней его структурной организации и, таким образом, по-видимому, участвует в процессах компактизации-декомпактизации хроматина при его функционировании.

Удобной моделью для исследования влияния структуры хроматина на экспрессию генов являются клетки спермиев, в которых хроматин находится в транскрипционно неактивном состоянии. В таких клетках ДНК упакована более плотно, чем в соматических клетках.

В процессе сперматогенеза типичные соматические клетки претерпевают биохимические и морфологические изменения: элиминируется цитоплазма и образуются жгутики, прекращается репликация ДНК, осуществляется высокая степень компактизации ядерной ДНК, достигается полная репрессия активности генов. Ядро спермия в отличие от ядер терминально дифференцированных клеток после оплодотворения должно быть реактивировано. Поэтому эти структурные изменения ДНК в сперматозоидах должны быть обратимыми.

В упаковке ДНК спермиев принимают участие различные типы белков. В противоположность относительно постоянному набору из четырех гистонов нуклеосомного кора (Н2А, Н2В, НЗ и Н4) и линкерного гистона Н1, образующих комплекс с ДНК в хроматине соматических

клеток [Kornberg, 1977; Laybourn and Kadonaga, 1991; Fedor, 1992; Felsenfeld, 1992; Travers, 1992; Widom, 1998], в ядрах спермиев многих животных обнаружены различные основные белки. Все разнообразие смены белкового состава в процессе сперматогенеза можно свести к трем основным вариантам: гистоны замещаются на спермий-специфические варианты, тиопротамины или протамины, помимо гистонов появляются дополнительные S-белки.

В случае замены гистонов на протамины или промежуточные белки происходит исчезновение нуклеосомной структуры хроматина [Kierszenbaum and Très, 1978; Ausio and Subirana, 1982], в то время как наличие гистонов в хроматине спермиев некоторых видов морских беспозвоночных и рыб сохраняет нуклеосомную организацию этого хроматина [Keishline and Wasserman, 1979; Kadura et al., 1983; Poccia, 1986; 1992]. Таким образом, существует несколько механизмов структурных перестроек хроматина, сопровождающих репрессию генома сперматозоидов.

Наиболее интересной является замена гистонов семейства HI на их спермий-специфические варианты [Zalenskaya et al., 1981; Misselwitz et al., 1986; Poccia, 1986; Рамм и др, 1987]. В этом случае в линкерных гистонах увеличивается содержание аргинина до 10-16%, в то время как в соматических клетках эта величина составляет 1-2% [Jenson et al., 1980; Zalenskaya et al., 1981; Misselwitz et al., 1986]. Аргинин способен к более сильным взаимодействиям с ДНК за счет образования водородных связей с остатками фосфорной кислоты, чем лизин, который взаимодействует с ДНК в основном электростатически. Имеются предположения, что увеличение количества аргинина в линкерных белках приводит в процессе сперматогенеза к увеличению плотности упаковки ДНК в ядре и коррелирует с увеличением длины линкерного участка ДНК в нуклеосоме [Костылева и др., 1989], и уменьшением транскрипционной активности ядра [Villeponteau et al., 1992]. Кроме того, спермий-специфические белки

характеризуются более длинной по сравнению с соматическими гистонами полипептидной цепью и более высокой степенью а-спиральности [Crane-Robinson et al., 1984; Misselwitz et al., 1986; Puigdomenech et al., 1987; Рамм и др., 1995; Чихиржина и др., 1998]. Удлинение цепи происходит за счет повторяющихся протаминоподобных вставок Ser-Pro-Lys(Arg)-Lys(Arg) в концевых доменах спермий-специфических гистонов [Von Holt et al., 1979].

Цели и задачи исследования.

Цель предлагаемой работы состояла в том, чтобы выявить связь между физико-химическими свойствами ядерных белков, их конформационными особенностями, и уровнем транскрипционной активности ядер, из которых они выделены, а также исследование процесса компактизции-декомпактизации хроматина на модельных системах ДНК-белковых комплексов. Адекватным методом решения поставленных задач является метод кругового дихроизма. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Методом кругового дихроизма выявить конформационные особенности вторичной и третичной структуры спермий-специфических белков хроматина морского ежа, морской звезды, двустворчатого моллюска и соматического гистона из тимуса крыс в различных ионных условиях.

2. Исследовать термостабильность вторичной и третичной структуры спермий-специфических белков семейства HI.

3. Выделить и охарактеризовать глобулярные фрагменты соматического гистона HI тимуса крыс и гистона HI хроматина спермиев морского ежа.

4. Методами кругового дихроизма и спектрофотометрического плавления исследовать процессы компактизации-декомпактизации хроматина спермиев на модельных системах ДНК-белковых комплексов.

Научная новизна и научно-практическая ценность работы.

В предлагаемой работе методом кругового дихроизма (КД) было проведено исследование конформационных особенностей спермий-специфических гистонов семейства Н1 некоторых морских беспозвоночных. Выявление особенностей структурного состояния белков хроматина спермиев позволило нам высказать предположение о существовании по крайней мере двух различных механизмов, приводящих к суперкомпактной укладке хроматина зрелых сперматозоидов морских беспозвоночных. Исследование термостабильности интактных молекул гистонов Н1 тимуса крыс и спермиев морского ежа и выделенных из них глобулярных фрагментов показало, что структура глобулярной части молекул стабилизируется их концевыми участками.

Впервые в этой работе были охарактеризованы конформационные особенности спермий-специфического гистона Н1, выделенного из хроматина морской звезды Aphelasterias japónica и его искусственных комплексов с ДНК. Было показано, что по своим структурным характеристикам этот белок близок к линкерному гистону Н1 хроматина спермиев морского ежа.

Кроме того, в этой работе были охарактеризованы структурные перестройки ДНК и гистонов при их взаимодействии и изучены образующиеся при этом надмолекулярные ассоциаты. Было показано, что гистон Н1 спермиев моллюска, обладая наибольшей способностью образовывать левоспиральные структуры и наименьшей - а-спиральные участки, при взаимодействии с ДНК формирует комплексы, которые не образуют высокоупорядоченные специфические структуры. Возможно, для образования таких структур существенным является взаимодействие кластеров на поверхности a-спиральных участков, способствующее регулярной организации таких ассоциатов. В гистонах Н1 хроматина спермиев морской звезды и морского ежа таких структур больше, и это может объяснить более ярко выраженную способность их комплексов с

ДНК образовывать конденсированные структуры. Мы предполагаем, что взаимодействие спермий-специфических гистонов с ДНК происходит одновременно и в большом и в малом желобке двойной спирали ДНК, в то время как соматический гистон Н1 связывается с ДНК только в большом желобке.

Методом спектрофотометрического плавления было показано, что при образовании комплексов ДНК с гистонами Н1 участки ДНК, связанные с белком, стабилизированы по отношению к тепловой денатурации.

Полученные в работе результаты важны для понимания связи между структурой хроматина и его функционированием. Выявление структурных особенностей гистонов семейства Н1, входящих в состав суперкомпактного хроматина спермиев, а также изучение влияния этих гистонов на структуру ДНК при их взаимодействии и на физико-химические особенности полученных комплексов являются важными условиями понимания механизмов, обусловливающих стабильность структуры супер компактного хроматина спермиев.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРЕ

ХРОМАТИНА

Генетический материал клеток высших организмов - хроматин -представляет собой иерархически организованную структуру. Длина ДНК, входящей в состав хромосомы, - больше метра, в то время как размер клеточного ядра - всего несколько микрон. До сих пор непонятно, как происходит упаковка ДНК в хромосомах. Этот вопрос играет важную роль в биологии, так как он является не только структурным, а тесно связан с проблемой функционирования генетического аппарата клетки.

1.1.1. Первый уровень организации хроматина.

Хроматин - это цепь плотно прилегающих друг к другу нуклеосом. Фундаментальным элементом этой структуры традиционно считается нуклеосома. Компактная структура нуклеосомы поддерживается межмолекулярными взаимодействиями между ДНК и гистонами. В состав нуклеосомной коровой частицы - октамера - входит гистоновый белковый кор [Mirzabekov, 1980; Воробьев, 1986; Straka and Horz, 1991; Fedor, 1992; Felsenfeld, 1992; Svaren and Horz, 1993; Luger et al., 1997; Ramakrishnan, 1997; Widom, 1998], содержащий по две молекулы гистонов H2A, H2B, НЗ и Н4, и фрагмент ДНК длиной 147 пар оснований, обвивающий октамер гистонов. Каждая нуклеосомная коровая частица ассоциирована с дополнительной молекулой линкерного гистона HI или Н5 (вариант HI, обнаруженный в хроматине птиц). Комплекс коровой частицы, линкерного гистона и участка линкерной ДНК между соседними частицами называется нуклеосомой.

Структура гистонового октамера в отсутствии ДНК была получена с помощью метода рентгеноструктурного анализа с разрешением 3.1 A [Arents et al., 1991], а недавно при разрешении 2.8 А была получена кристаллическая структура целой нуклеосомной коровой частицы [Luger et al., 1997].

Октамер гистонов состоит из (Н3-Н4)2 тетрамера и двух Н2А-Н2В димеров. Эта частица - нуклеосомный кор или минимальная нуклеосома -имеет форму плоского диска размером 11x11x5,7 нм и разделена на два слоя.

Структура коровых гистонов очень близка: каждый из них состоит из структурированного глобулярного домена и неструктурированных NH2- и СООН-хвостов [Luger et al., 1997]. Глобулярный домен состоит из трех а-спиралей, которые образуют две петли. Этот мотив отвечает за образование Н2А-Н2В и НЗ-Н4 гетеродимеров, которые соединяются в октамер. Этот участок гистонов консервативен и идентифицирован во многих активаторах и репрессорах транскрипции. [Luger et al., 1997]. Глобулярные фрагменты коровых гистонов вовлечены в гистон-гистоновые и ДНК-гистоновые взаимодействия, которые важны для структурного единства нуклеосомы. N-концевые участки гистонов принимают участие во взаимодействии между нуклеосомами. Кроме того, важной функцией N-концевых фрагментов коровых гистонов является их взаимодействие с негистоновыми регуляторными белками и мультибелковыми комплексами [Hansen et al., 1998]. Каждая пара histone-fold (половина тетрамера НЗ-Н4 или димера Н2А-Н2В) связана с 27-28 п.н. ДНК, оставляя свободным линкерный участок в 4 п.н.

Анализ данных рентгеноструктурного анализа нуклеосомы позволяет сделать предположение, что N-концевые домены гистонов нуклеосомного кора вовлечены в нуклеосом-нуклеосомные взаимодействия [Rhodes, 1997]. N-концевые участки гистонов НЗ и Н2В располагаются в минорной бороздке

ДНК и пронизывают ее через каждые 20 п.н. Концевые участки гистонов Н4 контактируют с поверхностью димера Н2А-Н2В соседних нуклеосом.

Многочисленные исследования подтвердили присутствие нуклеосомной структуры в хроматине всех эукариот. Данные рентгеноструктурного анализа и спектроскопии комбинационного рассеяния показали, что в составе нуклеосомной частицы конформация двойной спирали ДНК находится в пределах семейства В-формы [Goodwin et al., 1978; Finch etal., 1981].

Участок ДНК, приходящийся на одну нуклеосому, принято называть нуклеосомным повтором. Эта величина является характеристикой данного типа хроматина. Например, для соматических тканей эукариот эта величина составляет 195+5 пар оснований, для транскрипционно неактивного хроматина спермиев морского ежа - 237±5 п.н. [Zalenskaya, Zalensky, 1980], а морской звезды - 224+6 [Zalenskaya et al., 1980].

При исследовании структуры хромосом основная информация была получена из анализа продуктов постепенного гидролиза хроматина различными нуклеазами. Микроккоковая нуклеаза сначала расщепляют хроматин на олигонуклеосомные олигомеры из восьми субъединиц, после этого освобождаются отдельные нуклеосомы, у которых длина ДНК составляет 200 пар оснований. При дальнейшем гидролизе длина ДНК укорачивается до 165 пар оснований. Эта полустабильная частица содержит гистон HI. При продолжении гидролиза гистон HI теряется, и ДНК укорачивается до 146 пар оснований. Недавно было показано, что этот отрезок ДНК образует 1,65 витка левой суперспирали вокруг октамера гистонов [Luger et al., 1997]. В зависимости от типа клеток минимальные нуклеосомы соединены линкерной ДНК разной длины (от 20 до 105 пар оснований) [Osipova et al., 1980; Zalenskya et al., 1981; McGhee et al., 1983;

Рамм и др., 1986; Осипова и др., 1990; Рамм Е.И. и др., 1993а]. При обработке ядер эритроцитов голубя ДНКазой I и ДНКазой II было обнаружено существование фрагментов ДНК, длина которых кратна двойной длине нуклеосомной ДНК [Воробьев, 1986]. Эти эксперименты показали наличие в хроматине эритроцитов особой структурной единицы, состоящей из двух нуклеосом - нуклеодисома. Такая повторяющаяся единица была обнаружена в хроматине спермиев морского ежа и ряда других морских беспозвоночных, т.е. в хроматине транскрипционно неактивных клеток.

С линкерным участком ДНК связаны гистоны семейства HI или Н5 в хроматине птиц (гистон Н5 - вариант гистона HI, в котором многие остатки лизина замещены на аргинин) и негистоновые белки хроматина. Среди негистоновых белков наиболее изучены белки с высокой электрофоретической подвижностью - HMG-белки [EcKner and Birnstiel, 1989]. Это относительно низкомолекулярные белки с высоким содержанием диамино-дикарбоновых аминокислот.

Эксперименты по разрушению хроматина микроккоковой нуклеазой показали, что гистон HI образует комплекс с участком ДНК длиной в 20 пар оснований [Noll and Kornberg, 1977]. Гистон HI связывает вместе нуклеосомы и принимает участие в организации высших структур хроматина [Finch and Klug, 1976; Thoma et al., 1979; Widom, 1998]. С нуклеосомными гистонами он связан через СООН-концевой участок гистона Н2А и, вероятно, через NH2 -конец гистона Н4 [Baneres et al., 1994].

Эксперименты по исследованию влияния гистона HI на процесс энерго-зависимой доступноности ДНК показали, что в зависимости от количества гистона HI изменяется длина нуклеосомного повтора [Varga-Weisz et al., 1995]. При реконструкции хроматина в присутствии экстрактов ранних эмбрионов дрозофил