Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование хроматина и белков, ассоциированных с ДНК при симбиозе гороха с азотфиксирующими бактериями

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование хроматина и белков, ассоциированных с ДНК при симбиозе гороха с азотфиксирующими бактериями"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК СССР

На правах рукописи

СИНГХ НАРЕНДРА ПРАСАД

ИССЛЕДОВАНИЕ ХРОМАТИНА И БЕЛКОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ДНК ПРИ СИМБИОЗЕ ГОРОХА С АЗОТФИКСИРУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ

03.00.25. — КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1991

Работа выполнена в Институте цитологии АН СССР и ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В. И. ВОРОБЬЕВ кандидат биологических наук А. О. ЗАЛЕНСКИП

Официальные оппоненты: доктор биологических наук О. К. ГЛЕБОВ кандидат биологических наук А. А. ФИЛАТОВ

Ведущая организация: Кафедра биохимии Блолого-почвепиого факультета Ленинградского государственного университета.

у л

Защита состоится « 1991 г. в часов на

заседании специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии АН СССР по адресу: 194064, Ленинград, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР.

Автореферат разослан « ^^ » \ г.

Ученый секретарь специализированного совета

© — Институт цитологии АН СССР.

ВВЕДЕНИЕ

Акт^альность_проблеиы. Симбиоз почвенных бактерий рода Rhizobium с бобовыми растениями является сложный биологическим процессом, результирупцимся в накоплении фиксированного азота, который далее ыожет быть использован в разнообразных трофических путях.

Роль растения-хозяина в процессе формирования симбиоза не вызывает сомнений. С помощью методов классической генетики только у гороха описано более 20-ти генов, контролирующих взаимодействие с бактериями (Kneen et al., 1987; Vance et al.,1988).

Молекулярно-генетические механизмы взаимодействия между бобовыми растениями и бактериями изучены недостаточно. Известно, что развитие и функционирование клубеньков - специфических органов симбиотической азотфиксации, формирующихся на корнях бобовых растений при заражении бактериями, - сопровождается изменением синтеза ряда белков, кодируемых растительными и бактериальными генами (Covers et al., 1985; Verma et al.,1984). Идентийикация и установление функции этих белков является необходимым начальным.этапом расшифровки молекулярно-биологических процессов, лежащих в основе работы симбиотической системы. В этом направлении ведётся активная экспериментальная работа.

Очевидно, что основа возникновения, развития и функционирования симбиотической системы определяется согласованными взаимодействиями геномов высшего растения и бактерии, которые приводят к ткане- и стадиоспецифической экспрессии ряда генов.

По аналогии со многими эукариотическиыи системами можно предполагать , что наряду с линейньши регуляторньши элементами (промоторы, энхансеры и т.д.) существенную роль в активации транскрипции симбиотических генов может играть их пространственная организация в структуры хроматина. Исследования по характеристике хроматина клеток высших растений и по структурной организации генома бактерий в процессе симбиоза до настоящего времени отсутствуют.

Ц§ль_и_зад9чи_работы. Основной целью настоящей работы

-л-

являлось исследование характеристик хроматина гороха (Р1вит ва^тит Ь.) и их изменения, которые предположительно могут иметь место при развита азотфтиксирупцего симбиоза с ШЦгоМит leguл^inosarum Ыуаг. У1с1ае. Частные задачи включали:

1. Анализ тотальных ядерных белков и выявление среди них белков, индуцируемых в развитии симбиоза.

2. Сравнительное изучение структуры хроматина неивфшщрованных корней и корневых клубеньков.

3. Изучение особенностей структур! хроматина регуляторной части гена леггемоглобина в тканях, где этот ген активно транскрибируется.

4. Изучение ассоциированных с ДНК бактериальных белков при дифференцировке бактерий в клубеньках.

Н§5[чная_новизна_работы. В работе впервые показано существование ядерных белков специфических для клеток клубеньков и исследованы молекулярные параметры структурной организации хроматина в этих клетках. Показано, что типичная нуклеосомная организация сохраняется, но при этом повтор ДНК уменьшается в сравнении с неинфицированной тканью проростков корней. Параллельно продемонстрировано общее увеличение чувствительности хроматина к действию экзогенных нуклеаз. На основании этих результатов сделан вывод о том, что характер структурных изменений таков, что он способствует возрастанию транскрипционной активности генома высшего растения в клетках симбиотического органа.

Исследован состав гистонов гороха в процессе образования клубеньков и показано, что коровые гистоны остаются неизменными, а субфракционный состав гистона Н1 меняется. Резкое увеличение содержания субфракций Н1, с уменьшенным молекулярным весом, специфическое для клубеньков, вероятно, определяет уменьшение повтора нулеосомной структуры ДНК при симбиозе.

С помощью Саузерн-гибридизации исследована структурная организация 5 фланкирупцей области гена леггемоглобина гороха, активация которого к трайскрипции связана с развитием эффективного симбиоза. Показано, что данный участок ДНК в целом сохраняет

нуклеосомную организацию при активации транскрипции. Однако, ярко выраженный характер фрагментации ДНК проявляющийся в транскрипционно неактивной ткани проростков становится менее отчётливым в клетках клубеньков, что вероятно свидетельствует об изменении структурной организации ДНК регуляторной зоны гена при развитии симбиоза.

Впервые получены данные, свидетельствующие о крупномасштабных изменениях структурной организации мегаплазмиды Ю11гоЬ1иш при дифференцировке бактерий в состояние бактероидов. Параллельно показано, что в очищенной фракциям бактероидов происходит аккумуляция растительных гистонов.

Впервые получены данные о качественном изменении состава бактериальных белков, предположительно ассоциированных с ДНК, происходящем при переходе в состояние бактероидов.

Научно^практическая ценность. Работа имеет фундаментальное значение, её результаты могут быть использованы в качестве отправных для дальнейших исследований молекулярных основ азотфиксирущего симбиоза. Вследствие того, что многие практически важные системы взаимодействий между растениями и микроорганизмами реализуются посредством сходных молекулярных процессов, разработанные в настоящей работе подходы могут иметь значение для их изучения.

Апробация_работы. Материалы диссертации были доложены на Международном симпозиуме по молекулярной генетике взаимодействий растений с микроорганизмами (Интерлакен, Швейцария, 1990), на Юбилейном симпозиуме общества генетики и растениеводства Индии (Ныо-Дели, Индия,1991), на семинарах Лаборатории биохимических основ репродукции клеток Института цитологии АН СССР и семинарах лаборатории Биотехнологии ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 3 работы, 2 работы принята в печать.

РО^М-Е^о™- Диссертационная работа состоит из введения, ■yi.-op.-i .мт^пптурн, описания материалов и методов, изложения >-.зу-:.тэт' -■ оЛсудднкик, выводов, списка цитированной литературы

206 наименований. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использован сорт гороха (FiBum sativum L.) Виола и бактерии Rhizobium leguminosarum штамм 250а коллекции БНИИСХМ. Растения выращивали и инокулировали в стандартных условиях.

Вщеление_ядер из проростков и клубеньков гороха проводили по модифицированному методу Йенсена (Jensen et al., 1988). Ядра очищали центрифугированием через градиент перколла.

Бактероиды выделяли из пост-ядерного супернатанта, полученного из гоиогената ткани зрелых клубеньков с помощью дифференциального центрифугирования.

Чистоту_и_интактность выделенных препаратов растительных ядер и бактероидов проверяли с помощью флуоресцентной и электронной микроскопии.

Выделение_белков. Тотальные водорастворимые белки получали из супернатанта после цетрифугирования (15000g х 20 мин.) гомогената ткани. Общий гистон и фракцию HI выделяли из отмытого хроматина экстракцией 0.4 М HCl и 5% НСЮд соответственно. Тотальные белки ядер свободнояивущих бактерий и бактероидов получали путём лизиса соответствуюцих органелл в буфере для проб электрофореза по методу Лаеммли.

Электрофорезбелков проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) в Зх системах - анионной системе (Рапуim and Chalklay, 1969), в присутствии ДСН - додецилсульфата натрия (Laeimili, 1970) и в системе двумерного электрофореза

И1ВДНоблоттинг_белков. Разделённые при электрофорезе белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану электрофоретически. Обработку антителами проводили в стандартных условиях. Использовали антитела к общему гистону и фракции HI проростков гороха, любезно предоставленные Э.П.Берс (Молекулярный корпус БИНИИ ЛГУ), комплексы антиген-антитело выявляли с помощью белка А,

1V5

меченого I' .

Обработкунумеазами, электрофоптпескнй аналнз фрагментов хроматана_и_ЩС проводили по методике, опнсанюй И.А.Заленской с соавторами (Zalenfikaya et al., 1961).

Саузерн^гибридизация осуществлялась в стандартных условиях (Манниатис кдр., 1984). В качестве зонде использовали фрагмент ДНК, соответствупций 5* регуляторной зоце гена леггемоглобина I гороха, выделенный препаративным электрофорезом после.расщепления очищенной плазмиды, содержащей соответствующую вставку эндонуклеазами рестрикции. Плазмида Blue-Script с клонированным геном Lb 1 получена от J.-P. Nap (Нидерланды).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОбСУЖДЕНИЕ

1. Вщеление_ядер_и_бактероидов. При исследования молекулярных характеристик и белкового состава хроматина принципиальный является выделение препаратов интактных и очищенных ядер. В случае растительных тканей существуют объективные трудности в достижении этой цели, обусловленные, в частности, прочностью клеточных стенок. Нами был опробован ряд методов, описанных в литературе, и в. результате введены некоторые модификации, позволившие получать выпокоочшценные и морфологически ненарушенные ядра из клубеньков и проростков гороха. Одновременно из ткани клубеньков с помощью дифференциального центрифугирования в 0,25 М сахарозе с последующей очисткой центрифугированием в градиенте перколла были выделены очищенные препарата бактероидов. Чистоту и интактность фракций клеточных органелл контролировали флуоресцентно* микроскопией после окрашивания акридином оранжрьым, а для случая бактероидов -электронномикроскопически.

2. ^ажз ядерх^ Седаов гдэорос™ проводили с помощью одномерного электрофореза и иммуноблоттинга с антителами, выработанными против гиотонов гороха. Итоговая схема результатов приведрн'5 на рис Л.

Больамноство полипептидов (в том числе и коровые гистоны Н2А, Н2В,

Л

НЗ, Н4,) одинаковы в ядрах проростков и клубеньков. Наряду с ними существует ряд фракций, характерных только для клубеньков, которые в соответствии с существующими принципами классификации белков симбиотической системы (Van Калгпеп., 1984) могут быть определены как ядерные нодулины, ранее не описанные в литературе.

Можно предполагать, что выявленные нами ядерные нодулины

Рис.1. Сравнение ядерных белков корней проростков и клубеньков гороха.

Схема основана на совмещении данных электрофореза в 15% ПАГ в присутствии ДСН (гели окрашивали Кумасси) и иммуноблоттинга с антителами к гистонам. Стрелками отмечены ядерные нодулины.

участвуют в регуляции экспрессии растительных генов, специфически активирующихся к транскрипции в результате развития симбиоза с бактериями. Существуют предварительные данные об участии ядерных белков в активации одного из таких генов - леггемоглобина (Jensen et al., 1990).

3. Характеристаки_хроматина.растительных_ядер. Исследовали доступность хроматина в составе очищенных ядер неинокулированных корней и клубеньков к действию экзогенных нуклеаз - микрококковой нуклеазы и ДНКазы1. В целом, кинетические характеристики переваривания хроматина растительных ядер являются типичными -плавный рост содержания кислоторастворимых фрагментов ДНК (фракция SI) со временем и колоколообразная зависимость накопления растворимых фрагментов хроматина (фракция S2). Обращает на себя внимание то, что хроматин ядер клубеньков является более доступным к действию нуклеаз, о чём свидетельствует превышение (на 5-15%)

----1-- 1 -1 1 Itr

I г

-=ll 1 1

1 !-\Г

_>AJ i cgp I-i

1Ш"---1 --------- 1 1 m 1 1

!ш ! 1 1 1 1

содержания ДНК, высвобождающейся в обе упомянутые фракции.

Злектрофоретический анализ фрагментов хроматина (фракция. Б2) в 5% ПЛАТ низкой ионной силы и двумерный электрофорез, позволяющий характеризовать размеры ДНК и белки в составе частиц (рис.2) позволяет сделать вывод о том, что стандартная нуклеосомная организация сохраняется при Формировании клубенька._

I

II

в

л

—гвч-.й оликтрифОреТИЧеОкйи аНЭЛНЭ растворимых Фрашьнтив-

хроматина, полученных в результате обработки ядер клубеньков гороха микрококковой нуклеазой. ''

I направление: электрофорез нуклеосом в неденатурирупцнх условиях (555 ПААГ).

II направление: разделение белков (А) и ДНК (Б), содержащихся в нуклеосомах (15% ПААГ с ДСН). Окраска на ДНК бромистым этидием, на белки - Ктмасси 0-250.

"тот же вывод подтверждается данными электрофореза депротеинизированной ДНК, выделенной из ядер обработанных нуклеазой (или фракции 52), в 1,8% агарозном геле. Обработка результатов такого электрофореза по стандартный методам позволяет определить размеры ДНК, входящей в повторяющуюся нуклеосомную единицу. Рассчёты показали, что величина повтора в ядрах корней неинфицирсванных проростков составляет 185+5 н.п., а в ядрах клубеньков - 168+5 н.п. Таким образом в результате развития симбиоза длина линкерной ДНК в хроматине уменьшается примерно на 17 н.п (согласно данным двумерного электрофореза размер ДНК в

коровой частица оставтая постоянным). Значительное уменьшение длины линкерной ДНК вероятно отражает общую закономерность -сокращение размеров повтора в тканях, обладающих более высокой транскрипционной активностью (Uurray & Kennard, 1984; Welntraub, 1978). Продемонстрированное увеличение доступности ДНК ядер клубеньков действию нуклеаз свидетельствует об уменьшении компактности хроматина, что также может способствовать интенсификации транскрипции.

Нами исследовались элементы структурной организации хроматина промоторной зоны гена лехтемоглобина (Lb), который специфически экспрессируется только при развитии эффективного симбиоза в клетках корневых клубеньков бобовых растений. Использовали Саузерн-гнбридизацию ядерной ДНК проростков (ген Lb репрессирован) и ДНК функционирующих клубеньков (ген Lb активно транскрибируется), выделенных после обработки иикрококковой нуклеазой. Зондом служил меченый Р фрагмент ДНК размером 1000 н.п., соответствующий 5' фланкирующему участку гена Lbl. Результаты гибридизации свидетельствуют, что в ядрах клубеньков элементы нуклеосоиной организации в этом участке ДНК обнаруживаются. Однако, если в неактивных в транскрипции Lb ядрах проростков картина гибридизации неотличима от полученной для тотального хроматина с помощью неспецифического окрашивания фрагментированой ДНК бромистым этидием, то в ядрах клубеньков гибридизационный ответ выражен слабо и преимущественно связан с зонами ДНК, соответствующими moho-, ди-, и три-нуклеосомам.

4. Иэиенегае_в_су6фра5^отои_составе_гастон развития_клубеньков.

Известно, что вариации в характеристиках линкерного гистона HI коррелируют с вариациями длины линкерной ДНК нуклеосомной структуры (McGhee & Feleenleld, 1980). Нами было показанр, что размер линкерной ДНК в ядрах клубеньков на 17 н.п. меньше, чем в ядрах неинфицированных корней проростков гороха. Также известно (Бердников и др., 1976), что гистон HI гороха представлен множественным набором субфракций, состав которого является

тканеспецифичным.

В связи с этим нами был проанализирован субфракционный состав Н1 ядер корней гороха на разных стадиях развития симбиоза. Из участков корней, соответствующих зоне развития клубеньков выделяли белки, растворимые в 0,4 Н НС1. Эти белки разделяли элетрофоретически в длинных (~20 см) блоках 15% ПААГ по методу Панима и Чолкли (Рапу1га & С11а1к1еу, 1969). Разделённые в этой системе (I направление э.ф.) белки подвергали электрофорезу (II направление) в системе с ДСН. Далее анализировали белки с помощью иммуноблоттинга, используя в качестве антител сыворотку против гистона Н1 проростков гороха (рис. 3).

Данные авторадиографии (рис. За) показывают, что через 7 дней после инокуляции гистон Н1, выделенный из зоны ткани корней, соответствующей зоне инфекции, представлен пятью хорошо выраженными субфракциями. Через две недели после инокуляции в добавление к ним происходит появление шестой субфракции, меньшего молекулярного веса. Одновременно относительное содержание субфракции 5 увеличивается. Такой же состав гистона Н1 характерен для развитых, функционирующих клубеньков. Следовательно, в процессе развития и становления симбиоза происходят изменения в составе гистона Н1, выражающиеся в появлении, специфических для клубеньков субфракций с уменьшенным молекулярным весом. Детальный анализ авторадиограмм показывает, что субфракции 5 и 6 присутствуют в следовых количествах и в неинфицированных корнях. Таким образом, речь должна идти о резкой интенсификации синтеза упомянутых субфракций и их накоплении в хроматине при симбиозе. Мы предполагаем, что "низкомолекулярные" субфракции Н1 определяют уменьшение размеров линкерной ДНК хроматина клубеньков. Отметим, что появление этих белков связано с относительно ранними этапами развития симбиоза, предшествующими активации экспрессии генов поздних нодулинов. Гипотетически, новые субфракции Н1 могут являться факторами, участвующими в транс-регуляции транскрипции таких растительных генов.

5. Еел™±_предполомтельно_а^

Высвобождение бактерий из инфекционной нити в цитоплазму растительных клеток сформировавшегося клубенька сопровождается передифференцировкой в так называемые бактероиды. При этом происходят морфологические изменения, синхронная репрессия одних и активация других генов ризобий. Можно предполагать, что эти процессы требуют крупномасштабной перестройки структурной организации бактериальной ДНК. Так как большиноство функций связанных с симбиозом у быстроделящихся видов ризобий кодируется генами расположенными в мегаплазмидах, вероятные перестройки структуры ДНК в первую очередь могут затрагивать эти плазмиды.

7 days

15 (Ьу$

21 бжу

30 days

Рис. 3. Схема авторадиограммы полученной в результате 1 иммукоблоттикга двумерного электрофореза кислоторастворимых белков, выделенных из зоны развивающихся клубеньков в разные сроки после инокуляции Я. 1е^ит1поБагиш 250а.

I направление - электрофорез в анионной системе.

II напрвление - электрофорез в присутствии ДСН. Первые антитела выработаны против гистона Н1 проростков

гороха, для выявления антиген-антитело использовали белок А, меченый 1,за1.

С помощью электрофореза по методу Экхарда ("FV.khardt, 1978)

нами проанализирован состав Буга плазмид Б. legшninoвaггml в свободноживущем состоянии и в состоянии бактероидов, которые были выделены из азотфиксирующих клубеньков (рис. 4).Данные рис. 4 показывают, что в бактероидах отсутствуют зоны ДНК, соответствующие Буга мегаплазмидам. Согласно многочисленный данным, полученным методом Саузерн-гибридизации (см. обзор Аронштам и др., 1990) гены, входящие в состав Буш плазмиды присутствуют в составе тотальной ДНК, выделенной из бактероидов, при зтом их линейное расположение совпадает с установленный для Буш плазмид свободноживущих бактерий. Невозможность обнаружения Буш плазмиды в бактероидах с помощью сочетания различных физикохимических методов

Рис. 4. Плазмидный состав И. 1е-guminoБaгum в свободноживущем состоянии (а) и состоянии бактероидов (б).

Схема дана по данным электрофореза по методу Экхарда. Стрелками указаны положения Буга мегаплазмид.

была также продемонстрирована для другого вида ризобий - И. теИ-1оП даеа1;сгоП ег а1., 1990). Эти факты могут быть объяснены: а) встраиванием ДНК Буга плазмиды в хромосомную ДНК, б) изменением суперспирализации плазмидной ДНК, в) крупномасштабной перестройкой структуры плазмидной ДНК, которая в свою очередь может быть индуцирована изменением ассоциированных с ней белков.В рамках настоящей работы нами была экспериментально исследована последняя возможность, при этом использовался обнаруженный нами факт существования в составе бактерии группы белков, обладающих иммунологической кроссреакцией с антителами к гистонам.

Тотальные белки, полученные с помощью лизиса свободноживущих

бактерий и бактероидов в растворе с 2% ДСН, разделяли электрофорезом по методу Лаеммли. После переноса на нитроцеллюлозную мембрану проводили обработку антителами к гистонам (рис. 5).

Антитела к общему гистону проростков гороха выявляют в составе белков свободноживущих бактерий (рис. 5 А,б) три полипептида с молекулярными весами ~16, 20, 40 кД. Мы называем эти белки гистоноподобными (Н-11ке), сравнение с белками растительных ядер (рис. 5 А,а) показывает, что по характеристикам молекулярного веса они не совпадают с фракциями гистонов. При дафференцировке в бактероида белки 16 и 20 кД исчезают из состава белков бактерий, а количество белка 40 кД напротив увеличивается. Данные

Рис. 5. Иммуноблоттинг тотальных белков И. пйповагит с антителами к общему гистону (А) и гистону Н1 (Б) проростков гороха. Для выявления этих

ПС

антител использован I-белок А.

а- белки растительных ядер б- белки свободноживуших бактерий

в- белки бактероидов.

иммуноблоттикга также показывают, что в составе белков очищенных бактероидов (чистота фракций по данным электронной микроскопии более 95%) присутствуют растительные гистоны (рис. 5 А,в).

Антитела против фракции гистона Н1 выявляют среди белков бактерий два полипептида - 40 кД (тот же белок, который тестируется антителами к общему гистону) и белок с молекулярным весом 9 кД. При дафференцировке в бактероид белок 9 кД практически исчезает из клеток, полученные выше данные о возрастании содержании

высокоыолекулярного белка 40 кД подтверждаются. В составе белков бактероидов обнаруживается 2 субфракици растительного гистона HI (рис. 3 Б,в).

Обнаруженные "гистоноподобные" белки бактерий являются основными по характеру, так как они экстрагируются раствором 0,4 Н НС1. Белок с молекулярным весом 9 кД, вероятно, соответствует белку HU, который подробно изучен как один из ДНК-связывапцих белков Е. coli (Rouviere-Yaniv et al., 1979). Гомологичные по последовательности белки были обнаружены у различных представителей семейства Rhlzoblaceae (Kanaka et al., 1985). Наше предположение основано на данных о существовании иммунологической кроссреактивности HU Е. coll с антитеЛами к гистону HI (Кулыба, 1989). Функции этого и остальных Зх "гистоноподобных" белков R. leguminoBarum требуют дальнейшего изучения.

Таким образом, в бактериях нами обнаружена группа "гистоноподобных" (предположительно ассоциированных с ДНК) белков, состав которой меняется при дифференцировке в состояние бактероидов.

Факт обнаружения в составе бактероидов растительных гистонов сам по себе представляется весьма интересным, но требует дополнительных экспериментальных доказательств существования ассоциации гистонов с бактериальной ДНК in vivo. На настоящем этапе, мы можем лишь высказать предположение о том, что аккумуляция гистонов в бактериях, происходящая после заселения последними цитоплазмы инфицированных клеток, может являться одним из молекулярных механизмов, обеспечивающих резкое и крупномасштабное переключение характера экспрессии генома микросимбионта, происходящее в этот момент. Продемонстрированная выше невозможность обнаружения Sym плазмиды в составе бактероидов может быть связана с формированием её специфической структуры, обеспечиваемой взаимодействием с гистонами.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучен состав ядерных белков клеток клубеньков гороха. Электрофоретическое сравнение с аналогичными белками, выделенными из неинфицированных молодых корней, показало существование специфичных для клубеньков негистоновых белков, которые могут быть названы "ядерными нодулинами".

2. Показано, что чувствительность ядерной ДНК клубеньков к действию эндонуклеаз (микрококковая нуклеаза, ДНКаза I) увеличена в сравнении с ДНК ядер нешфщированных корней.

3. Показано, что как в ядрах неинфицированных корней проростков, так и в ядрах клубеньков гороха имеется типичная нуклеосомная организация. Размер ДНК, входящей в повторяющуюся нуклеосомную единицу составляет в ядрах неинфицированных корней 185+4 нуклео-тидных пар, а в ядрах клубеньков 168+4 нуклеотидных пар. Уменьшение повторяющегося элемента ДНК в хроматине при клубенькообразова-нии связано с уменьшением длины линкерной ДНК примерно на 17 нуклеотидных пар.

4. С помощью техники иммуноблоттинга показано, что в процессе развития клубеньков меняется субфракционный состав гистона Н1 за счёт появления дополнительных подфракций меньшей молекулярной массы. Мы предполагаем, что их аккумуляция в хроматине коррелирует с наблюдаемым уменьшением размеров линкерной ДНК.

5. Совокупность выводов 2-4 позволяет предположить, что в процессе развития симбиоза происходят такие изменения в структурной организации хроматина растительных ядер, которые должны способствовать увеличению транскрипционной активности.

6. В составе свободноживущих бактерий показано сущвить-лмчи« 4 полипептидов, имеющих антигенное родство с гистонами (гис.'ок.-подобные белки). В процессе дифференцироыш бактерий в <-<у,т">-ч-|-бактероидов происходят качественные изменения состава гистоноподобных белков.

7. Дифференцировка бактерий при симбиозе сопровождается изменением в характере структурной организации симбиотической вуга плазмиды и предположительной аккумуляцией растительных гистонов в бактероидах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. A. Zalensky, N. Singh, V. Pardonen, Е. Bers and A. Aronstam. Changes In structural organization of plant and bacterial genomes during Pisum sativum - Rhizobium legumlnosarum symbiosys.// Abstracts oi the 5th International Symp. on Molecular genetics oi Plant-Microbe Interactions (Interlaken, Switzerland, 1990). P.238.

2. Сингх Н.П. и Заленский A.O. Сравнительная характеристика хроматина клубеньков и'проростков гороха. Нуклеосомная организация промоторного участка гена леггемоглобина. // Труды ВНИИСХМ, 1991, N 35.

3. Singh N.P., Bers Е.Р. and Zalensky A.O. Nuclear proteins and chromatin structure oi pea (Pisum sativum L.) root nodule.// Biojournal, 1990, v.1.

Л. Singh N.P. and Zalensky A.O. Changes in histone HI during symbiosis.// Abstracts of Golden Jubilee celebration Symp. oi Indian Soc. of Genetics and Plant Breeding (New Deli, 1991), P.

Заказ ¿01 . Тираж 100. Формат бумаги 60x84 1/16. I печ.лист Ротапринт ПО № 3.Ленуприздата,. 191104, Ленинград, Литейный пр.,55 Бесплатно