Белки эукариот, связывающиеся в однонитевой ДНК (SSB-белки): характеристика и участие в репликации репарации ДНК

Котеров, Алексей Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Белки эукариот, связывающиеся в однонитевой ДНК (SSB-белки): характеристика и участие в репликации репарации ДНК
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Белки эукариот, связывающиеся в однонитевой ДНК (SSB-белки): характеристика и участие в репликации репарации ДНК"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

РГ8 ОД пРавах ру—

- 8 ОКТ 1996

КОТЕРОВ Алексей Николаевич

УДК 577.¡¿13 : 547.112

БЕЛКИ ЭУКАРИОТ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ОДНОНИТЕВОЯ ДНК ( ББв- БЕЛКИ): ХАРАКТЕРИСТИКА И УЧАСТИЕ В РЕПЛИКАЦИИ И РЕПАРАЦИИ ДНК

(03.00.04 - биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Государственном Научном Центре РФ -Ь;-с:итуте биофизики Министерства Здравоохранения и Медицинской Промышленности Российской Федерации

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Б. Спиричев,

доктор биологических наук, профессор A.C. Коничев,

доктор биологических наук A.B. Иткес

Ведущее учреждение - Институт биологической и медицинской химии РАМН

Защита диссертации состоится " А^ _" ПСГЛс)Л 1996 г. часов на заседании Диссертационного совета Д.С01.02.Л при Институте питания РАМН по адресу: 10924U, Москва, Устьинский проезд, д. 2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института питания РАМН.

Автореферат разослан '49 " CßU/С)¿С 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

В.М. Жминченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЬШ'Ы

Актуальность проблемы. Репликация и репарация да обеспечивают пролиферацию клеток, поддержание стабильности генома и устойчивость ДНК к гено-токсическим воздействиям. Эти генетические процессы осуществляются с участием неспаренных нитей ДНК и требуют наличия факторов, способствующих их образованию, стабилизации и зашите от нуклеаз. Компонентами репликатив-ного комплекса бактерий и фагов являются специальные белки, которые путем связывания с однонитевой (он) ДНК, без участия А'ГР, выполняют эту функцию. Эти белки получили названия "белки, дестабилизирующие двойную спираль" ("helix-destabilizing proteins ", ИЛИ "ЦДР"), "расплетающие беЛКИ ("unwinding protein^', ИЛИ "ИР") И "белки, связывающиеся С он ДНК" ("single-stranded DNA-binding proteins ", или "ssb -белки"). Наиболее часто используется последний термин. ssB-белки прокариот не имеют ферментативной активности, обладают субъединичной структурой и кооперативно связываются с он ДНК. Образуя комплексы с ДНК-полимеразами, ssn-белки бактерий и фагов стимулируют ИХ активность / Chase J.W., Williams К.К., 1УЬо/.

Поиск факторов, выполняющих в клетках высших организмов функции ssb-белков, осложняется большими размерами эукариотического генома. Содержание ДНК в клетках млекопитающих превышает бактериальный показатель приблизительно в 3000 раз, причем у эукариот ДНК входит в состав хроматина, содержащего сотни белков. ДНК бактерий реплицируется в одной единице репликации (репли-коне), в то время как для клеток млекопитающих показано наличие десятков и сотен тысяч репликонов /Георгиев P.II., 1989; Збарский И.В., 1988; Faiaschi д., Giacca м., 1994/. Из тимуса теленка были вьщелены ssB-белки (ИР 1 и ИР 2), по ряду свойств аналогичные ssB-балкам прокариот. Хотя они не имели субъеданичной структуры и кооперативного связывания с нуклеиновыми кислотами, эти банки взаимодействовали преимущественно с он ДНК по сравнению с двунитевыми (дн) матрицами и стимулировали ДНК-полимеразы оС /Herrick g., Alberts в.м., 1976/. Позже белки типа ИР получены из ряда других эукарио-тических объектов. По первым открытым полипептццам подобные белки назвали " ssb -белками типа ИР" или "каноническими ssb -селками эукариот". Для них характерна следующая совокупность свойств: 1. Наличие в соматических клетках. 2. Отсутствие ферментативной активности. 3. Высокое содержание (сотни тысяч - миллионы мсшекул/клетку). 4. Относительно высокое сродство к он ДНК 'Касс.-^ аиоция с он ДНК-целлюлозы при 0,25-lM №С1). 5. Меньшее

сродство к дн ДНК по сравнению с он ДНК. 6. Способность дэсгаЗотиршгь дн ДНК. 7. Стимуляция активности ДНК-полимераз in vitro ь. Слабая сорбция на

ДЗАЭ-Целлкшозе /Chase O.W., Williams K.R., 1986; Kovalczykowski S.С. et al.« 1981/. Прямых доказательств участия белков типа ИР в метаболизме ДНК получено не бьшо. Однако, ранее использовали не совсем удачные экспериментальные модели и объекты. Так, тимус содержит относительно малое число проли{)е-рируювдх клеток /Мирошниченко И.В. и др., 1987/. ssB-белки в большинстве случаев ввдаляли из клеточной фракции, которая не содержит едерной ДНК (вне-хроматиновая фракция), а не из хроматина /chin y.e. et .al., 1994; Herrick G./Alberts В,,1976; Merrill В.M. et al., 1986; Riva S. et al., 1980;1986; Williams k.r. et al., 1985/, хотя для sse-белков постулирована рсяь, основанная на стехиометрическом связывании с он ДНК /Kouaiczykovski s.с. et al., 1981/. Было обнаружено антигенное и структурное родство белков ИР 1 и ЦЦР 1 из тимуса и шеломы шшей с белками гетерогенных ядерных рибонуклеопротеид-ных комплексов (гяРНП-комплексов) и появилось мнение, что низкомолекулярные (22-27 кДз) ssB-белки типа ИР являются продуктами протесшиза белков гяРНП-комллексов. Однако, при этом допускалось существование у ssB-белков и самостоятельной роли В метаболизме ДНК /Chase J.W., Williams K.R., 1986; Jong A.Y.S. et al.,-1987; Merrill в.М. et al., 1986; 1988; Pandolfo M. et al., 1985; 1987; Riva s. et al., 1986/. Известны вадные отличия в свойствах ssb-белков и белков гяРНП-комплексов. Первые преимущественно связываются с он ДНК по сравнению с дн ДНК и РНК, стимулируют ДНК-палишразы<^ и дестабилизируют дн ДНК, а вторые - обладают предпочтением к РНК, не изменяют активности ДНК-псшимераз и, главные балки гяРНП-комплексов, не расплетают дн матрицы. Не ясно такяе, насколько велико преимущественное сродство белков гяРНП-комплексовК ОН ДНК по сравнению С дн ДНК /Burd с. et al., 1994; Kumar айal.,1986; Riva s. et al., 1986/. Помимо низкомопекулярных ssß-белков (ИР 1 и НДР 1) обнаругены и более высокомолекулярные (ИР 2 массой 30-43 кДэ), которые не являются продуктами протесшиза белков гяРНП-частиц /Lahiri d.k., Thomas л.о., 1986/. Для ИР 2 известен аминокислотный состав, показано преимущественное сродство его к он ДНК и способность стимулировать ДНК-палимеразуо< /Merrill В.М. et al ., 1986; Riva S. et al 1980/. Другие СВОЙСТВа ВЫСОКОмолекулярных белков типа ИР высших эукариот исследованы не бьши, и вопрос об их возможных функциях оставался открытым.

Некоторые авторы отрицают необходимость существования у эукариот специ!и-ческих ssB-белков, поскольку их функции предположительно могут выполнять другие группы полипептадов /Richter a. et al., 1986/. Среда последних назывались лактатдегвдрогеназа (ДЦГ) и глицералвдегвд£осфвтдегвдрогеназа (ГАфЦ), которые при низкой ИОННОЙ силе имеют сродство К он ДНК /Grosse F. et al., 1986; Kaiserraan H.B. et al., 1989/, беЛКИ HM6 /Einck L.,Bustin M ., 1985/ И

др. /Richter a. et al., 1986/. Получены многие другие белки, которые in vitro связываются с он ДНК (поэтому иногда их называют "ssB-белками" безотносительно к возможной функции) - продукты протеолиза белка ядрышка нуклеолина /Sapp m. et al., 1985; 1986/, факторы транскрипции /Haas -S. et al., 1995; Negishi y. et al., 1995/, беЛКИ МеЙОЗЭ /Hotta M.< Stern H., 1979/ И Т.Д. /stigare j. et al., 1994/. Оставалось не ясным, какие белки могут осуществлять функцию ssB-белков и необходимы ,пи они вообще. Существуют, однако, данные, что инициация репликации ДНК у высших эукариот отличается от подобного процесса у бактерий и даже дрожжей и требует расплетания дн ДНК с образованием бОЛЬШИХ ИНТермеДИатоВ С ОН Структурой /Benbou r.m. et al., 1992/. В клетках млекопитающих обнаружено наличие значительных участков он ДНК, превышающих по размеру фрагменты Оказаки /Lonn и., Lonn s., 1988; Lucchini r.< sogo j.м., 1995/. В ¡слетках до 6% ДНК присутствует в он форме /Збарский И.В., 1988; Панин Л.Е. и др., 1995/. Таким образом, дестабилизация дн ДНК, поддержание он структур в нативном состоянии для функционирования ДНК-псшимераз и защита он ДНК от нуклеаз необходимы, хотя вопрос о том, какие факторы играют роль ssB-белков у эукариот оставался без ответа.

В 1988-1992 г.г. был вьщелен фактор ("репликативный белок А" или "RP-A") который по свойствам был близок к ssB-белкам прокариот. Хотя RP-A млекопитающих некооперативно связывался с он ДНК /Kim с. et al., 1994; 1995/, он обладал способностыо путем образования комплексов с ДНК-репликазой (ДЩ-поли-меразой << с ассоциированной праймазой) и вспомогательными факторами ДНК-полимеразы S стимулировать синтез ДНК in vitro /Када s. et al., 1994/. В 90-х годах RP-A интенсивно изучался и было показано, что у дрожжей этот белок играет роль В генетических процессах /Guzder S.N. et al., 1995; Longhe-se m.p. et al., 1994/. Ряд фактов не позволяют сделать вывод, что в клетках высших эукариот RP-A является единственным ssB-белком. Содержание его в клетке относительно мало (порядка (5-6)'10^ молекул/клетку /кеппу м.к. étal ., 1990; Nasheuer н.p.et al.,1992/ и приблизительно равно как числу реплико-нов /Збарский И.Б., 1988; Falaschi м.в. et al ., 1994/, так и молекул ДНК-пслимеразы et (6-10^ /Hubacher и., 1983/Л с которой RP-A образует комплекс. Поэтому в клетках эукариот должны быть и другие полипептнцы, осуществляющие функции ssB-белков не только при инициации репликации (как RP-A /Adachi y., Laemmii U.K.,•1992/), но и на стадии элонгации, когда необходимо поддержание стабильной структуры он ДНК. В опытах in vitro RP-A мог играть последнюю рель /waga s. et ai., 1994/, однако in vivo его количество достаточно: только для образования комплекса с праймазой. Наиболее вероятными кандидатами на con л------ """авались белки типа ИР, хотя до получения специальных дан-

них нельзя было сказать, что и другие группы полипептвдов (ДПР, белки НМ6 и. др.) не играют подобной роли.

В Вэссии и странах бывшего СССР ssB-белки эукариот не исследовались. Можно упомянуть изучение sss-белка фага Т4 (продукт гена 32) /Дебабов И.Г., 1979/ и опыты Г.Е. Зрадкина с соавт. на мутантных штаммах E.coli , лишенных способности синтезировать ssB-белок /Зрадкин Г.Е., 1983/. В то же время," за рубежом поиск специфических ssB-белков эукариот ведется достаточно интенсивно. Но и у зарубежных авторов отсутствуют сведения о ssB-белксх типа ИР насекомых. Показано, однако, что целый ряд факторов репликации и репарации ДНК, созревания мРНК и других процессов у насекомых и млекопитающих аналогичны /Коничев А.С. и др., 1982; Михайлов B.C. и др., 1990; Marton r.e. et al., 1994; Katunis E.L. et al., 1992/.

F&Hee ssB-белки типа ИР вьщеляли преимущественно из слабопролиферирукхцих клеток и тканей, а их исследование ограничивалось молекулярно-биологическими и биохимическими опшаи in vitro . Отсутствуют данные о динамических изменениях количества ssB-балков в популяциях делящихся клеток. Нет сведений о том, с кш^&и нуклеиновыми кислотами связаны ssB-белки in vivo, и связаны ли вообще (поскольку вьщеление проводили из внехроматиновой фракции). Поэтому, нами в качестве основного объекта исследования бьши выбраны проли£ерирующие клетки асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ; перевиваемая опухоль мышей, развивающаяся в брюшной полости). На соврешнном этапе изучения факторов, участвующих в генетических процессах у эукариот, выбор АКЭ представляется целесообразным. Действительно, в 90-х годах основными объектами исследования подобных факторов служит Неьа /кеппу м.к. et al., 1990; waga s. et al., 1994/, представляющая исходно клетки рака матки. Главный подход при изучении факторов репли-каирл и репарации ДНК заклшается в вьщелении из раковых клеток (Het-a) белков, которые стимулируют репликацию ДНК вируса sv40 in vitnywaga s. et al., 1994/. Однако, такие m факторы обнаружены и в нормальных тканях /Atrazhev a. et al., 1992; Podust v.n. et al., 1993; 1994/. Известно, что основные закономерности репликации и репарации ДНК в клетках опухолей и нормальных тканей во многом аналогичны /Збарский И.Б., 1988/.

Другим объектом исследования является грена (яйца) тутового шелкопряда. Это насекомое имеет столь высокую хозяйственную значимость, что ему иногда придают статус "лабораторного объекта" /Клименко В.В., 1975; йшппович Ю.Б., 1963/. Поэтому, изучение факторов репликации ДНК в клетках грены приобретает большую важность.

В связи с изложенным, становится ясным, что исследование факторов, выполняющих в клетках высших эукариот функции ssB-белков яшшется весьма актуаль-

ним, а выбор нами в качестве основных объектов таких популяции прсшиферирую-щих клеток, как АКЭ и грена тутового шелкопряда, представляется оправданным.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы заключалась в получении, путем постановки экспериментов и углубленного сравнительного анализа литературных данных, доказательств участия sse-белков в репликации и репарации ДНК у эукариот.

В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:

1. Выделить ssB-белки из клеток млекопитающих (АНЬ) и насекомых (грена тутового шелкопряда) и охарактеризовать их свойства. Разработать метод количественного определения ssB-белков в клетках эукариот.

2. В опытах на молекулярном уровне (с очищенными ДНК-полимеразами и ДНК-репликазой) изучить способность ssb -белков изменять активность ферментов репликации и репарации ДНК.

3. В экспериментах на субклеточном уровне (клетки и ядра, проницаемые для макромолекул) исследовать стимуляцию ssB-балками репликативного синтеза ДНК.

4. Провести сравнительное изучение основных свойств ssB-белков, полученных из двух клеточных фракций, одна из которых содержит ядерную ДНК.

5. Определить типы нуклеиновых кислот, с которыми ssü-белки связаны в клетках in vivo.

6. На клеточном уровне исследовать связь мевду содержанием ssb -белков

и интенсивностью репликации ДИК в популяциях клеток, характеризующихся различным пролиферативным статусом (рост АКЭ и развитие грены); при подавлении и стимуляции репликативного синтеза ДНК.

7. Выяснить, участвуют ли ssB-белки млекопитающих в репарации ДНК после облучения УФ и у-радиацией. ,

8. Исследовать специфичность ssB-белков типа ИР как отдельной группы, отличной от других белков эукариот, связывающихся с однонитевымн нуклеиновыми кислотами.

У. Определить специфичность ssB-оелкоБ для различных классов эукариот на примере млекопитающих (АКЭ) и насекомых йрена тутового шелкопряда).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. ssB-белки типа ИР представляют собой спещ-фмную ipynny негистоновых белков хроматина, отличную от других ДНК-связываюших белков и ферментов. ssB-белки спецдачны для клеток млекопитающих и насекомых.

'¿. ssb-белки типа ИР принимают участие в репликации ДНК в клетках эукариот.

3. ssb-белки типа ИР участвуют в репарации ДНК в клетках млекопитающих.

Научная новизна работы. В рамках непосредственно ответа на основные вопросы диссертации:

1. Впервые установлено, что ssB-белки типа ИР представляют собой группу, по совокупности свойств отличающуюся от других групп белков, связывающихся с однонитевыми нуклеиновыми кислотами.

2. Впервые вьщелены и охарактеризованы ssB-белки типа ИР из клеток насекомых.

3. Впервые продемонстрирована способность ssB-белков из АКЭ и грены тутового шелкопряда дестабилизировать дн ДНК.

4. Обнаружено разнонаправленное действие ssB-белков из АКЭ на активность ферментов репликации и репарации ДНК (ДНК-пслимераз Ы. и J) ). Впервые показан ингибирующий эффект ssB-белков типа ИР на активность ДНК-репликазы и праймазы. Впервые получены данные об активирующем действии ssB-белков типа .iP на некоторые ДНК-полимеразы прокариот.

5. Впервые обнаружен активирующий эффект ssE-балков на репликацию ДНК в опытах нэ субклеточном уровне (клетки и ядра, проницаемые для макромолекул).

6. Впервые показана специииность ssB-белков для клеток млекопитающих и насекомых.

7. Впервые проведено сравнительное исследование ssB-белков, выделенных из разных клеточных фракций, сдна из которых содержит, а другая не содержит, ядерную ДНК.

В. Впервые установлено, что фосфорилирование ssb-белков типа ИР повышает прочность связывания их с он ДНК.

У. Впервые показано, что в хроматине ssB-белки связаны с ДНК, а во вне-хроматиновой фракции могут контактировать с гяРНК.

10. Впервые обнаружено, что содержание ssB-белков в хроматине клеток эукариот строго коррелирует с интенсивностью репликативного синтеза ДНК.

П. Впервые продемонстрировано участие ssB-белков типа ИР в репарации ДНК в клетках млекопитающих после облучения.

Следует отметить, кроме того, что впервые проведен углубленный анализ литературных данных, позволивший получить дополнительные сведения о возможном участии как ssb -белков, так и других групп ДНК-связываюшцх белков, в репликации ДНК. Некоторые впервые полученные-данные имели вспомогательный характер. Так, впервые дая белков из плазмы крови шекопитакхцих, связывающихся с он ДНК, показана способность стимулировать ДНК-полимеразу оС и ингибировать экзонук-леазу in vitro . Впервые обнаружено, что количество этих белков повышается при лучевой патологии. В специальных опытах впервые продемонстрировано, что

очищенный цинк-металлотионеин (цинк-ИГ) стимулирует репликативный синтез ДНК и повышает уровень белковых факторов репликами (в данном случае, ббв-белков) в клетках костного мозга млекопитающих. Впервые показано, что хроматография на вт-целлюлозе может служить методом оценки ДНК-расплетакхцей активности белков.

Практическая значимость. Доказательство роли конкретных белковых факторов в репликации и репарации ДНК у высших организмов является актуальным для понимания механизмов этих процессов, которые обеспечивают, с одной стороны, пролиферацию клеток, а, с другой, поддержание стабильности генома и его устойчивость к генотоксическим воздействиям. Отсвда следует важная практическая значимость подобных исследований для различных областей биологии и медицины. Понимание процессов регуляции репликации и репарации ДНК опухолевых клеток может оказаться важным для разработки рациональных основ лечения злокачественных новообразований. Определение уровня ББВ-белков может послужить маркером пролиферативной активности как нормальных клеток, так и клеток опухолей. Исследование механизмов репликации ДНК и пролиферации клеток грены весьма ценно в связи с высокой хозяйственной значимостью шелкопряда. Содержание белков плазмы крови, связывающихся с он ДНК, может послужить основой для разработки метода биоиндикации радиационного поражения организма и роста олухолей.

Разработанные в диссертации методы могут быть внедрены как в области фундаментальной биохимии и молекулярной биологии (способ оценки ДНК-распле-тающей активности белков), так и в клинике (метод определения количества Бгв-белков в тканевых экстрактах и применение фильтров с фиксированной ДНК).

При выполнении диссертации в Институте биофизики Р5 (ГНЦ РФ- ИБФ) получены три удостоверения на рационализаторские предложения:

1. "Способ измерения ДНК-связыващей активности ДНК-расплетающего белка из клеток эукариот" (Уд. «5 1185 от 28.09.87 г.).

2. "Применение бумажных фильтров с фиксированной ДНК в качестве носителя при хроматографии белков, связывающих ДНК" (Уд. № 1220 от 9.02.88 г.).

3. "Метод оценки ДНК-расплетакхцей способности белка, связывающегося с однонитевой ДНК (Бзв-белка)" (Уд. № 1293 от 23.05.90 г.).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 9-м Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1987), Всесоюзном совещании "Гомеостаз при радиационном повреждении организма" (Пущи-но, 1987), Мевдународном симпозиуме "Физико-химия ДНК и молекулярные механизма функционирования генома" (Тбилиси, 1987), 1-м Всесоюзном радиобиоло-

гическом съезде (Москва, 1989), на научных конференциях молодых ученых Института биофизики МЗМП Р£ (1986, 198?, 1988, 1989), на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки" (Минск, 1990), на Всесоюзной конференции "Эндокринная система организма и вредные факторы окружающей среды" (Ленинград, 1991), на 2-м Радиобиологическом съезде (Киев, 1993), на конференции "Действие ионизирующей радиации на иммунную и кроветворную системы" (Москва, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственного исследования и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка литературы (563 источника). Работа изложена на 498 страницах, содержит 77 рисунков и 22 таблицы.

МАТЕРИАЛУ И МЕТОДЫ

Животные. Использовали: беспородных мышей (22-28 г), мышей (cbaxc57bi)f1 массой 22-32 г, беспородных крыс (300-400т), кроликов "Шиншилла" (около 2 кг), поросят (около 50 кг; содержались в виварии Института биологической физики РАН, Пущино) и одну собаку-самца (12 кг).

Основные объекта исследования. АКЭ (гиперципловдный штамм) пассировали на мышах. Прена тутового шелкопряда Bombyx mori l (гибрвд "Кавказ 1 х Кавказ 2") предоставлена Е.П. Андриановой. Развитие зародыша (при комнатной температуре) ивдуцировали путем помещения диапаузирующей грены в горячую воду.

Жизнеспособность АКЭ определяли по пролиферативной активности, подсчиты-

вая число клеток в опухоли на 6 день ее развития после введения мышам 4*10 клеток АКЭ /Проскуряков С.Я. и др., 1986/.

in vitro клетки АКЭ культивировали в среде 199 (5-10 клеток/мл) с 20%-й инактивированной сывороткой крупного рогатого скота, 0,9 мг/мл глутамина, 5 мг/мл глюкозы, 1,5 ыг/мл NaHCo3> 2 тыс. ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 20 мкл/мл асцитной жидкости при 37° в 5%-й атмосфере C0g. Клетки полностью сохраняли жизнеспособность и целостность (определяли по исключению эозина) в течение 30 ч, хотя деления клеток не обнаружено. Содержание общего белка во внехроматиновой фракции и хроматине оставалось неизменным.

Облучение АКЭ УФ (лампа БУВ-1, длина волны 254 нм) для индукции репара-тивного синтеза ДНК проводили в растворе Хенкса (5-10 клеток/мл) при мощностях дозы 0,51 и 1,43 Дд/м2.

Воздействие -излучением. АКЭ (1-Ю8 клеток/мл; 0.15М Nací) и мышей обл-1

учали лучами Сз на установке ИГУР (1,74 Гр/ыин). Поросят облучали Со

в Институте биологической физики РАН (выполнено II.И. Сорокиной).

ДНК из АКЭ и молок лососевых рыб выделяли по Мармуру /Химия и биохимия нуклеиновых кислот, Д.: 1968/. Для получения /3Н/-Д11К, мшгам с АКЭ трехкрат-

но вводили / Н/-тимвдин (по 100 мкКю/мышь в день) и затем -вьщоляли ДНК, удельная радиоактивность которой составила 1000 имл/мин на 1 мкг.

Ядерную FHK из АКЭ получали по /Транскрипция и трансляция, В.: 1987/..

Гянш-частици ИЗ АКЭ вьщеляли ПО /Kish V.M., Pedersen т., 1975/.

Содеряание дн ДИК и ДНК с он участками в препаратах очищенных ДНК и в клетках АКЭ определяли хроматографией на bnd-целлюлозе /scudiero d. et ai., 1975/. На этом же методе был основан разработанный нами способ определения ДНК-расплетащей активности ББв-белков.

Репликативний синтез ДК в интактных клетках АКЭ и костного мозга регистрировали по включению / HZ-тимццина /Seki s., Oda т., 1978/. В гроницаеид для макромолекул клетках АКЭ и ядрах грены (получали путем обработки 0,05%-м

тритоном Х-100) - по модафщированному методу /Borger n-л. et al., 1976/, ос-

3 Ч

нованному на включении / Н/-ТМР после инкубации препаратов с / Н/-ТТР, dATP,

dCTP и dGTP в присутствии AIP. Синтез имел репликатнвную природу - отмечено слабое влияние на его интенсивность ингибитора ДНК-полимеразиуЯ (ddiTP) и подавление ингибитором ДНК-полимеразы vi (N-этилмалеимццом). Репликативный синтез в проницаемых клетках и ядрах линейно зависел от количества клеток АКЭ пли общего белка ядер грены в пробе, а также от времени инкубации. Как и ранее /Berger N.A. et al., 1976/, отмечено ингибирование репликативного включения в проницаемые клетки препаратом гистона, что подтвервдает корректность использованного метода.

Репаративный синтез ДНК в интактных клетках АКЭ после облучения определя-3 -2

ли по включению / Н/-тимщина на фоне 10 М оксимочевины (ОМ) при инкубации

■ в течение 30 мин /ни j.j. et al ., 1995/. Поскольку ОМ подавляла репликацию не полностыо (на 90-95%), для рагчета истинно? пелнчшы репаративного синтеза ("корректированный репаративный синтез") вводилась поправка на ингибирование облучением остаточного репликативного включения на фоне ОМ. Правомочность поправки показана с помощью разделения метки, включенной в "утяжелен- 1 ную" 5-броздезоксиурццином ДНК,на репликативный и репаративный пулы путем центрифугирования в градиенте плотности csci/Lee j.c. et al., 1974/.

В проницаемых клетках АКЭ репаративный синтез ДНК регистрировали по /seki s., Oda т., 1978/. Метод был основан на том, что при удалении из среды инкубации проницаемых клеток с / H/-TIP АТР, регистрируемое включение метки обусловлено репарацией ДНК /seki s., Oda т., 1978/.

Ецделение ssB-белкоБ из АКЭ проводили в препаративном (из 18-52 г кле-

ток), полупрепаративном (2-5 г клеток) и аналитическом (1-3)*10 клеток) вариантах,- которые были аналогичны, но различались объемами использованных растворов и носителей. Все буферы содержали 1 мМ фенилметансульфонилфгорид, 10 Ш бисульфит и 12 мМ 2-меркаптоэтанол (МЭ).

Клетки суспендировали в 2,5 объемах (в аналитическом варианте г в 1 мл) 2 мМ фосфатного буфера, рН 8, 5 t.M ЗДГА, добавляли 1/2 объема 0,75%-го тритона Х-100 - 5 мМ ЭДГА, рН 8, осторожно гомогенизировали и центрийтировали (15 мин, 7 тыс.д ). Надосадочные белки ("внехроматиновая фракция") хранили отдельно. Осадок хроматина промывали буфером 'Г (20 мМ трис-НС1, 1 ьМ ЭДГА, рН 7,8) и экстрагировали 2,5 объемами 2М Nacln 15%-го псшиэтиленгликоля в этом не буфере. Экстракты (внехроматиновый и хроматина)либо объединяли, либо очищали далее раздельно. Ионную силу доводили до 50 мМ по Nací путем диализа (18-20 ч; препаративный вариант), или путем разведения экстракта хроматина и добавления во внехроматиновую фракцию соли до нужной концентрации (аналитический, полупрепаративный и часть выделений в препаративном варианте). Наносили на колонки с дн ДНК-целлюлозой и он ДНК-целлюлозой, соединенные последовательно. Емкость первой колонки была достаточна для сорбции 100% белков, связывающихся с дн ДНК-целлкшозой. Промывали 50 мМиасгв буфере Т, затем разъединяли и он ДНК-целлюлозу промывали двумя объемами 0,1М NaciB буфере Т. ^.в-белки элюировали двумя объемами 0,6М NaciB буфере Т. Злюаты доводили до 0,1М Nací диализом,, ультрафильтровали (полупрепаративный и препаративный варианты) и пропускали через колонку с ДЭАЭ-целлкшозой. ssB-белки злюировались со свободным объемом. В аналитическом варианте алюаты с он ДНК-целлкшозы разводили суспензией ДЭАЭ-целлюлозы в буфере Т до ОДМ Nac;.центрифугировали и собирали надосадочную жидкость. Далее препараты подвергали термоочистке (60°, 15 мин с последующим удалением выпавших в осадок белков центрифугированием в течение 30 мин при 18 тыс.д ).

Евдеяение ssb -белков из хроматина грены проводили аналогично. Ядра грены, полученные по /Куранова О.П. и др., 1985/, суспендировали в буфере Т и солю-билизироБали, добавляя 1/2 объема 0,75%-го тритона Х-100 - 5 мМ ЭДГА, рН 8. Далее выделяли ssB-белки как описано выше.

Выделение белков, связываюсдахся с он ДНК (БСД) из плазш крови млекопитающих осуществляли также, как и ssB-белков, нанося на ДНК-целлкшозы вместо экстрактов плазму крови в буфере Т, содержащем 50 мМ Nací.

ЕЬщеление ДНК-шлимераз </■ ,JS и ДНК-репликаэы из клеток АКЭ проводили по оригинальному методу. Растворы содержали те же ингредиенты, что и при выделении ssB-белков. Объединенную фракцию внехроматиновых и хроматиновых белков

(получение описано выше) наносили на дн дак-целлюлозу и алюировали вогнутым градиентом концентрации Naci(80 »AI - 1,5М; концентрацию соли здесь и далее определяли кондуктометрически) в буфере Т. йракции с ДНК-полимеразной активностью наносили на ДЭАЭ-целлюлозу при 0,15М касьДНК-полимеразу^ ашои-ровали со свободным объемом, а ДНК-полимеразу - линейным градиентом концентрации Nací в буфере Т (70 ьМ - 1М; алщия при 0,23-0,33 и 0,39-0,45м"соли). Далее проводили параллельную очистку ферментов на-он ДНК-цашшозе (алкция полимеразы o¿ при 0,1-0,35М, a ß - при 0,1-0,4M №С1) и фосфоцел-люлозе (алюция при 0,3-0,5 и 0,6-0,8М №с1 ). Очистку ДНК-палимеразыß заканчивали, а ДНК-лслимеразу оС из ЛКЭ без праймазы /Yagura т. et ai., 1982; 1986/ и ДНК-репликазу разделяли на Сефадексе G - 200.

Ошстка цинк-ИГ. Использовали компиляцию описанных методик /Heilmaier н., summer к.н., 1985;Kagi j.H.R. et al ., 1974/ с модификациями. Доя индукции синтеза (Я крысам вводили znci2 (10 мг zn на 1 кг), через 1 сут изалекали печень, гомогенизировали в 10 мМ трис-HCl, pH 7,4, центрифугировали и надоса-дочную жадность подвергали термоочистке (2 мин при 80°с последующим центрифугированием)." Экстракт после концентрирования наносили на колонку с Сефа-

дексом 6 - 75 и алюировали тем же буфером. Пик цинк-МГ определяли по свя-109

зыванию ivJCd кадмий-гемоглобиновым методом /Eaton D.L., Toal В.F., 1982/. Цинк-МТ был гомогенным по данным электрофореза с Ds-Na ; его молекулярная масса (7,2 кДа) и спектр поглощения в УФ совпадали с описанными ранее /Kagi J.H.R. et al., 1961; 1974/.

Определение активности ферментов.

ДНК-пслкиераза. Инкубационная смесь (0,1 мл) содержала 60 мМ трис-HCl, pH 7,8, 10 ¡Al МЭ, 7 мМ Mgci2,0,2 мг/мл БСА, по 20 мк.М dATP, dcrp, dGTP, /3Н/-TIP (300-400 имп/мин на 1 пкмоль), 3-6 мкг ДНК (АКЭ или молок), денатурированной нагреванием или активированной ДНКазой 1 и 5-10 ед ДНК-пслимераэ. Инкубировали 30 мин при 37° и регистрировали радиоактивность в кислотонераст-воримой фракции. При определении активности ,".нк-полимеразыу? проба содержала 0,1М KCl.

ДНК-релликаза. По методу /Grosse f., Krauss G.j., 1985/, основанному на регистрации прироста активности ДНК-полимеразы o¿ в присутствии гетр (суб- 1 стратов праймазы).

Ч?

Прайма. По /Yagura т. et ai., 1986/ (включение / Р/-АМР).

Экэонуклеаза. 1. Путем инкубации белков с / Н/-ДНК из АКЭ с последующим определением количества гвдролизованной ДНК по радиоактивности в кислоторас-творимой фракции. 2. По /Крутяков В.М. и др., 1983/ осуществляла Н.Е. Клейщэ.

Эвдонуклеаза. Активность оценивали по числу он разрывов, образующихся в молекуле ДНК фага Я при инкубации с ней исследуемых белков (седиментация ДНК в градиенте щелочной сахарозу). Эти опыты выполнены В.А. Троновым.

ДНК-зависимая АТРаза (геликаза). По методу /Cobianchi f. et ai., 1982/.

ДЦГ. Активность в растворе определяли по /Кочетов Г.А., 1971/, а на зи-мограмйе - по /Гааль Э. и др., 1982/.

Определение связывания белков с да и он нуклеинов»« кислотами проводили четырьмя способами: 1. Регистрируя количество меченой ДНК, связываемой белками на нитроцеллюлозных фильтрах /otto в. et al., 1977/. 2. Конкурентным' вытеснением связанной с белками меченой он ДНК избытком исследуемых немеченых нуклеиновых кислот (регистрация по способу 1). 3. Сорбцией на он ДНК-целлюлозе в пробирке при 50 Ш Nací 4. Хроматографией ssb-белков на микроколонке с он ДНК-целлюлозой.

Условия определения контакта ssb -белков АКЭ с нуклеиновыми кислоташ in

vivo. fíjK. ДНК АКЭ промечивали, вводя мышам с опухолью / Н/-тимидин (по 130 мкКю/мьгшь на 6 и 7 день роста АКЭ). Извлекали АКЭ и облучали клетки in'vitro в 0,15М tea УФ (3000 Дж/м^) для индукции сшивок белки-нуклеиновые кислоты /Boulikas т., 1986; strniste G.F., Rail s.c., 1976/. Получали внехроматино-вую фракцию и хроматин, который обрабатывали ДНКазой 1 (50 мкг фермента на 1 мг ДНК) в течение 30 мин. Далее экстрагировали хроматин 2М tiaci - 15%-м полиэтиленгликсшем и проводили ввделение ssB-белков из внехроматиновой фракции и экстракта хроматина как описано выше. Определяли удельную радиоактивность препаратов ss&-белков.

raFHK. АКЭ инкубировали in vitro с 0,4 мкг/мл актиномщина Д (для подав-

ления синтеза рРНК) и с / Н/-урвдином (20 мкКю/мл) в 0Д5М N=d 20 мин /ste-venin J. et al., 1977; Wagenmakers A.J.M., 1980/. Отмывали КЛеТКИ 0Д5М NaCl, .¿спевдировали в этом же растворе и облучали УФ (4000 Д»/А. Хроматин и внехроматинозую фракцию обрабатывали РНКазой А (25 мкг/ил) и далее проводили ввделение ssB-белков и определение их удельной радиоактивности.

Оценка периода попуаизни sse-белков АКЭ. Белки промечивали, инкубируя

клетки в течение 20 ч с / Н/-лейцином (2 мкКю/мл). Затем суспендировали клетки в среде без метки и инкубировали еще 10 ч. Через различные промежутки времени второй инкубации выделяли ssB-белки и определяли их удельную радиоактивность.

Проиечивание &зв-ч5елков /^Р/-ортофосфатом in vivo проводили, инкубируя клетки АКЭ (в 0,15М Nací, 20 мМ НЕРЕвбуфере, рН 7,4) с 50 мкКю/мл /^р/-0р-тофосфата в течение 2 ч при 37°. Затем проводили ввделение ssB-белков, осаж-

дали ТХУ и.определяли удельную радиоактивность (связанный с ssB-белками / Р/).

/^C/-ssb -белки АКЭ получали путем метилировали аминогрупп очищенных ssa-белков /*4С/-форыалвдегццом по методу /Остерман Л.Л., у. :1983/.

Фоофорилированне ssb -белков АКЭ in vitro сАМР-зависимой протеинкиназой проводили по /Bechtei p.J. et al., 1977/, a Са-фосфолипидзависимой протеинкиназой - по /Воротников A.B. и др., 1988/ (выполнено A.B. Воротниковым).

Получение антасыворотни кролика к ssb -белкам из АКЭ и проведение гамуно-ферыентного анализа. Иммунизацию кроликов проводили семикратно с двухнедельными интервалами /Иммунология. М.: 1983/. Титр антител определяли с помощью иммуноферментного анализа /Александрова И.А. и др., 1987/ который осуществляли автор диссертации (под руководством А.Ю. Сазыкина) и Е.П. Ацприанова.

Аминокислотный состав ssB-белков на приборе " lkb-о/ " по методу /Практическая химия белка, М.: 1989/ проводили Н.В. 'Гарасенко и Е.П. Андрианова.

Электрофорез и иицуноблоттинг белков. Электрофорез в трубках ПААГ в присутствии Ds-Na проводили по Лэммли /Гааль Э. и др., 1982/; алектрофорез на пластинках ПААГ И ишуноблоттинг на приборе "Bio-Rad Protein " осуществлял А.Ю. Сазыкин.

Иэоалектрофокуафование проводили на приборе "Multiphor" фирмы "lkb" (Швеция) по методике этой фирмы.

Определение концентрациябелка проводили спектрофотометрически, методом Лоури /Кочетов Г.А., 1971/ и с Кумасси 6 - 250 /Spector т., 1978/; ДНК -спектрофотометрически, методами Бартона и Дише; FHK - спектрофотометрически и орциновым методом /Химия и биохимия нуклеиновых кислот, Л.: 1968/.

Фосфор в препаратах ssb -белков определяли по /нозз н.н., Dorr j.в.,1975/.

Использованные препараты нуклеиновых кислот и белков. ДНК-целлюлозу готовили по /Litman R.M., 1968/, используя ДНК из молок лососевых рыб (11-10® Да, предоставлена В.А. Троновым). /^С/-ДНК из E.coli (10 тыс.имп/мин/мкг) -" AiEtïtem " (Великофитания). ДНК-псшимераза фага Т4 (140 тыс.ед/мг) - НПО "Фермент" (Вильнюс). Д1®-ПСШИМераза Bacillus stearothermophilus (1000 еД/мг) предоставлена Л.А. Носкиным. Фосфодиэстераза змеиного яда - "caibiochem (США). Протеинкиназа С из мозга крыс очищена .»..В, Воротниковым по оригинальному методу. Каталитическая субъединица сАМР-зависимой протеинкиназы из мышц кролика, очищенная по /Bechtei p.J. et al., 1977/ (1257 ед/мг) предоставлена A.B. Никольским и H.B. Пушкаревой.

Статистическую обработку результатов осуществляли по t критерию Стыодента. На рисунках и в таблицах представлены M im. Коэффициенты корреляции рассчитывали на ЭВМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ssb -БЕЛКОВ ИЗ АКЭ

Выделение проводили из объединенного кпеточного экстракта и отдельно из внехроматиновой фракции и хроматина. Белки, имеющие свойства канонических ssß-белков (см. ВВЕДО1ИЕ) на 95% элюировались с он ДНК-целлкшозы 0,6М Nací. При дальнейшей алюции 2М солью, пропускания через ДЭАЭ-целлюлозу и термообработке (ssB-белки характеризуются тевмостабилыюстыо /carrara g. et al., 1977; Herrick g., Alberts в., 1976; Richter a. et al., 1978/), в препарате практически не отмечено содержания белка. После очистки ssB-белкон из экстракта хроматина не 2М, а 0.35М Nací (в котором содержатся белки НМ6 /Збар-ский И.Б., 1988/), белка в препарате также практически не зарегистрировано. Таким образом, в ssb-белках АКЭ отсутствуют примеси белков НМб.

Обнаружена прямо пропорциональная зависимость мевду количеством выделенных ssB-белков (из тотального экстракта и отдельно из двух фракций) и исходной массой или количеством клеток АКЭ ( г от 0,86 до 0,99). При внесении /■^C/-ssB-6eflKOB в экстракт и выделении в аналитическом варианте, радиоактивность полученного препарата ("recovery") составила 87-90% от исходной. Сделан вывод, что выделение ssb-белков может служить методом их количественного определения в клетках.

Молекулярная масса и pl. При Э5 в ПЛАТ с оз-на ssb-белков из объединенного экстракта и отдельно из двух фракций (см. далее рис.4), зафиксирована основная высокомолекулярная компонента массой 43 кДа и ряд минорных фракций до 20-24 кДа. Количество последних и содержание в них белка изменялись от препарата к препарату. То есть, как и другие препараты канонических ssb-белков /Riva s. et al., 1980; Kovalczykowski s.c. et al., 1981; chase J.W., Williams K.R. et al, 1986; Merrill u.M. et al., 1986/, белки АКЭ характеризуются гетерогенностью, обусловленной протеолизом во время очистки. Действительно, все компоненты ssb-белков имеют структурную гомологию и сходные антигенные свойства /manck s.r., Wilson s.h., 1980; Valentini о. et al-, 1984; 1985,' Pandol-fo m. et al ., 1985/. Протеолиз имеет ограниченный характер -не удается получить ssB-белки массой ниже 22-26 кДа Aalentini о. et al1985/. Это подтвердили и наши опыты - выделение ssb -белков из АКЭ с длительным диализом экстрактов (более 36 ч) приводило к получению, в основном, низкомолекулярных форм, но не ниже 20-24 кДа. Однако, при очистке с коротким диализом или вооб-' ще без него, ssB-белки были представлены гтреимуш,ественнно фракцией в 43 кДа (рис.4). То же самое обнаружено и при изоалектроффокусировании - отмечена главная форма с pi = 7,4, которая значительнэлреобладала над другими компон-

ЯЧМЛШ1,

IP 1_1__

Л. Л

IÍ

ентами. Сделано предположение, что sso-белки ЛКЭ исходно представляют собой высокомолекулярную форму (43 кДа), а содержащиеся в малых количествах низкомолекулярные фракции являются продуктами ее протеолиза.

Связывание с ДНК и РНК. Максимальное сродство ssß-белков к он ДНК (связывание на фильтрах) отмечалось при 0,15- • 0,2М Nací . При 0,2М Nací связывание с дн

ДНК было весьма слабым (рис.1). Он ДНК-мо-14

лок конкурировала с / С/-он ДНК Е. coli ! за взаимодействие с ssb-белками в 100 раз сильнее, чем дн ДНК молок. Сходные опыты

по вытеснению / Н/-он ДНК АКЭ из комплекса с ssB-белками немеченой он ДНК АКЭ, ядерной РНК АКЭ и РНК дрожжей показали, что ssB-балки имеют не менее чем 2-х-кра- В1сЛ> c^g^g 5зв-балков с он' тное предпочтение к он ДНК по сравнению ц) и /3||/-ДНК АКЭ

с гомологичной РНК.

Дестабилизация дн ДНК. Эксперименты проведены с помощью разработанного нами метода, основанного на хроматографии на bnd-целлюлозе, дн ДНК с которой алюируется 1М Nací, а ДНК с он участками - 50%-м диметилформамвдом. Ин-

кубация с ssB-белками дн ДНК молок и / Н/-дн ДНК АКЭ с последующим нанесением на bnd-целлюлозу, приводила к снижению количества ДНК в элюате 1М nad с соответствующим повышением количества нуклеиновой кислоты в ашоате диметилформамвдом (в 2-7 раз при весовых соотношениях ssB-балки/ДНК 1-4 и более). Таким образом, ssB-белки АКЭ расплетают дн ДНК.

Влияние на активность ферментов репликации и репарации ДНК. Молекулярная масса и удельная активность ДНК-полимераз<^ \л j¡ из АКЭ составили - около 200 кДа и 7260 ед/мг и 35-38 нДа и 1880 ед/мг соответственно. При гельфильт-рации на G-200 максимум пика активности ДНК-полимеразы o¿ не совпадал с максимумом активности ДНК-репликазы (рис.2). Более того, гют (ATP, С1Р, 6ТР и ИТР) ингибировали полимеразуо^ во всех фракциях, кроме фракции ДНК-реплика-зы (рис.2). Действительно, для АКЭ показано наличие двух форм ДНК-псшимера-зы o¿ - ассоциированной И не ассоциированной С ПраЙмаЗОЙ Ладига т. et al., 1982; 1986/. В качестве ДНК-репликазы использовали фракцию № 5, а полимеразы - № 6 (рис.2).

о^-Аманитин (50-100 мкг/мл) не влиял на активность ДНК-репликазы и гтрай-мазы. ДНК-полимераза oí ингибировалась на 80-90% 20-50 мМ /УдС/, и в 15 раз -

I ^^mamijDti-

WD кДа KptamuKf.ai-Оосфо 6CH pMl/MJJ, лип<иа\ 6änÄa </0*ia

■ml 1 i

# { S ID n 14

Фракции

Рис.2. Гельфильтрация ДНК-полиме-разы сС на G-200. l-Aggg. 2 и 3 -активность псшимеразы без rNTP и в присутствии rNTP (по 500 мкМ).

1 м?,1 n -этилмалеимидом. 0,2М kaci и n -этилмалеимид почти не снижали активности ДНК-псшиыеразыß , в то время как 0,2М фосфат подавлял ее. В препаратах пслимераэ и ДНК-репликазы отсутствовали примеси зццо- и экзонуклеаз. Таким образом, характеристики полученных ферментов совпадают с литературными данными /Hubscher U., 1983; Grosse F., Krauss G., 1985; Wilson S. et al., 1988; Yagu-ra т. et al., 1982; 1986; Михайлов В. С. и др., 1990/.

esb-белки АКЭ на различных ДЧК-мат-'.".цах стимулировали ДНК-псшимеразуе»: из АКЭ (рис.3). Активация на он ДШ может объясняться: 1. Расплетанием ssB-еелка-т участков локальной ренатуращи в да (шпилечных структур); 2. Снижением числа непродуктивных сайтов посадки поли-у.сразы на он ДМ. Показано, что фермент может связываться прочно, но не продуктивно, с он Д!1К, поскольку для катализа необходаыо контактирование полиыеразы с иницилторными 3-0Н-КОНЦаш /Sapp М. et al, 1985/. Покрывая участки непродуктивного связывания, ssb-белки способствует контакту псшимеразы с 3-0Н-концэми.

На активированной ДНК, при малых величинах соотношения ssb-белки/ДНК, отмечается ингио'ироьание (рис.3,г). Активированная ДНК предоставляет собой дн форМУ, имеющую много брешей и коротких участков с он структурой и инициаторккми концами. При малой величине соотношения, белки не обладают расплетающей активностью, но, видимо, покрывают всю он ДНК, в том числе и инициаторше концы, что ингибирует пешимеразу. При увеличении соотношения, ssb-белки становятся способными расплетать дн ДНК, что делает

1.0 1,1' г з ч 5 ь ? а

Рис.3. Активность псшимеразы с/ в присутствии £Бв-белков. а,б - денатурированные ДНК АКЭ (3 мкг) и молок (0,6-1? мкг); в - псши(дА) (1,4 мкг); г - ДНК АКЭ, активированная ДНКазой 1 (1,5 мкг).

ее лучшим субстратом для пслимеразы (активация). При осльших величинах соотношения ssb -белки/штрица, и на он, и на актиьированной ДНК отмечается подавление реакции (рис. 3), обусловленное тем, что ssb -белки покрывают не только непродуктивные сайты посадки, но и инициаторные 3-ОН-концы.

ssb -белки стимулировали и ДНК-пслимеразы про!сариот - полимеразу $ага Т4 (в 2 раза) и полимеразу B.stearothermophiius (в 3 раза) на он ДНК. Подобный факт для ssb -белков эукариот показан впервые. Механизм и в этом случае обусловлен, по-видимому, расплавлением шпилечных структур, затрудняющих работу полимераз.

ssb -оелки не изменяли активности ДНК-полимеразы ß на он ДНК, но подавляли фермент на активированной ДНКазой ДНК (при высоких весовых соотношениях ssb -белки/матрица - порядка 4:1 и более).

ssB-бслки ингибировали ДНК-репликазу (ня 4ü-bü¡U и праймазу (2,7 мкг белков полностью подавляли активность). Данные получены для ssb-ослков эукариот впервые. Ранее показан ингибирующий эф1ект ssB-балка t. coli /grosse f., krauss G., 19öb; Kenny м.к. et ai.1989/ и активирующее действие RP-A / Drown G.W. et al., 1992; Matsumoto T. et al -, 1990/ на ПраЙ-мазы животных.

Таким образом, эффекты in vitro ssb-белков на активность ДНК-псяимераз и ДНК-репликазы имели разнонаправленный характер, хотя возможность стимуляции пслимеразы с/. показана однозначно. В системе, более приближенной к in vivo- в проницаемых клетках АКЭ (обработка клеток и ядер слабыми растворами неионных детергентов не изменяет структуру и состав дезоксири-бонуклеопротевда / Hancock ц.»1У74/), ssB-белки в б раз увеличивали интенсивность репликативного синтеза ДНК (см. далее рис. 14).

Сводные данные по характеристике ssß-оелков из объединенного экстракта клеток АКЭ представлены в табл.1.

Сравнение свойств ssb-белков из внехроматиновой фракции и хроматина АКЭ. Ранее ssB-белки типа ИР выделяли либо из внехроматиновои фракции, которая не содержит ядерной ДНК (ссылки см. ЬВьДЬНИЬ), либо из тотального экстракта /Kovalczykowski s.c. et al ., 1981; Jong A.Y.s. et al ., lü8b; chin Y.E. et al., 1994/. Наш проведено сравнение свойств ssb-белков из двух клеточных пулов, в одном из которых они могут быть связаны с ДНК. Не отмечено различий в молекулярных массах (рис.4) и в алигшък свосшах (им-

Характеристика ssß-белков из АКЭ

Таблица 1

Свойство

Данные

1. М.м основной компоненты, кДэ (Э$ в ПААГ с Ds-Na)

2. pl

3- Е280

4. Аминокислотный состав

43 ■ 7.4

■ ' • 4,4

Относительно низкое содержание ароматики; высокое - Гли и Глу

5. Связывание с ДНК:

а) Число нуклеотадов он ДНК на 1 молекулу (43 кДа)

б) Он ДНК > дн ДНК

в) Кооперативность связывания с он ДНК

г) Он ДНК > FHK

6. Расплетание дн ДНК

'•'. Ингибирование экзонуклеазы (фосфодиэс-

теразы змеиного ада)

С. Стьму-шдия ДНК-псшимеразы и

(J. Стимуляция прокариотических ДНК-псшимераз

10. Стимуляция ДНК-полимеразы ^ß

11. Влияние на активность ДНК-репликазы и праймазы

12. Стимуляция репликативного синтеза ДНК в проницаемых клетках АКЭ

13. Примеси ДНК-полимераз, ДЛК-зависишх АТРаз (геликаз), эндо- и экзонуклеаз, ДЦГ и белков НМ6

14. Содержание в клетке, молекул на 1 клетку (V.M. принята за 43 кДа)

в 100 раз Не обнаружена Не менее чем в 2 раза Расплетают

Ингибируют Стимулирую? Стимулируют Не стимулируют

Ингибируют

Стимулируют

Отсутствуют

3,6-Ю6 (6-7-ми-даев-ная АКЭ)

муноблоттинг с антисывороткой к Бзв-белкам внехроматиновой фракции) бэв-белков, полученных раздельно из внехроматиновой фракции и хроматина. Не было обнаруаено отличий в связывании Бвв-белков из обоих пулов о он ДЩ двумя ме-■годами - фиксацией комплекса Бзв-белки - / Н/-он ДНК АКЭ на нитроцеллюлоз-ных фильтрах и сорбцией на он ДНК-целлюлозе в пробирках. гэв-белки из обеих фракций одинаково стимулировали репликативный синтез ДНК в проницаемых клетках АКЭ (10-40 мкг белков повышали его интенсивность в 2гЗ раза). Однако, отмечено различное содержание фосфата в препаратах. Прямое определение фосфора показало, что ззв-белки внехроматиновой фракции содержат 2,2-0,1, а хро-

tro

матина - 3,1 - 0,2 мояя фосфата на 1 ноль балка. После инкубации АКЭ 1п VI с /^Р/-ортофосфатом и выделения Ёэв-белков, удельная радиоактивность препаратов различалась практически также (4230 ± 560 и 6430 ± 402 имп/мин/мг; р< 0,05). Са-фосфшипвдзависимая протеинкиназа С и сАУР-зависимая протеин-киназа, хотя и фосфорилировали оба препарата, однако включение фосфата вббв-белки внехроматиновой фракции бшо в 1,5-2 раза более интенсивным (рис.5)»

68 цЦа ■

40 кДа . 30 кДа

12 кДа

Г h

V ,

Г:*£5 2

Л Ю Ч Г !/!.'?[ 31 РJ ( М D .1 в ип 1 мпп|SSÜ- бглы'Л

Рис.4. Э£ в ПААГ с Ds-Na ssB-белков внехроматиновой фракции (1) и хроматина (2)

Рис.5. Фосфорилирование ssu-бел-ков внехроматиновой фракции (1) и хроматина (2) протеинкиназой С (а) и сАМР-зависимой протеинкиназой (б).

Оказалось, что фосфорилирование повышает прочность связывания ssb-белков с он ДНК. Через различные промежутки времени инкубации ssB-белков внехроматиновой фракции с сАМР-зависимой протеинкиназой, пробы наносили на колонки с он ДНК-целлшозой. Белки атоировали 0,6М Nací (как при обычном выделении) и, затем, 2М солью. Исходный препарат почти нацело актировался 0,6М Nací , однако, после фосфорилирования белки более прочно связывались с он ДНК и часть их алюировалась 2MNaci (рис.6). Относительное содержание более прочно связанных с он ДНК белков возрастало в процессе фосфорилирования (рис.6).

Увеличение сродства некоторых белков к он нуклеиновым кислотам после фос-форилирования показано и Другими авторами /са1нпаго-ма^1пде н. а1. | 1975; Збарский И.В.. 1988: ниапд к.-р.,ап<зег3зоп е.б ., 1994/. Повышение

прочности связывания с он ДНК может объясняться тем, что наряду с электростатическими взаимодействиями в нем принимают участие стэкинг-взаимодействия ароматических аминокислот с основаниями ДНК / Chase j.w., Williams k.r .,1986; Kei-riil в.m. et al-, 1986; 1988/. По-ввдимому, фосфорилирование приводит к TaiaiM конформационным изменениям ssB-белков, которые облегчают стэкинг-взаи-модекствия. Ранее показано, что фосфорилированиеssb-белков снижает их сродство к дн ДНК, хотя белки и не изменяли своей способности связывать на фильтрах он ДНК /otto в. et al., 1977/. Нами также не обнаружено отличий в ко-

личестве / Н/-он ДНК, связываемой на фильтрах ssB-белками внехроматиновой фракции и хроматина, несмотря на их различную степень фосфорилирования. Однако, прочность связывания ssB-белков хроматина с он ДНК, видаю, больше, поскольку эти белки сильнее фосфорилированы. Возможно, эта посттрансляционная модификация является причиной перехода ssB-белков из внехромат'чювой фракции в хроматин, где они могут выполнять свои функции по связыванию с он ДНК.

2. ВВДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА SSB-БЕЛКОВ ИЗ ХРОМАТИНА ГРЕНЫ ТУТОВОГО

Полученные данные до настоящего времени (1996 г.) остаются единственными сведениями о ббв-белках типа ИР насекомых. Выбор в качестве источника выделения только хроматина обусловлен трудностью получения внехроматиновой фракции из грены (наличие твердого хориона, большое количество жира и т.д. /Ку-раниьа О.П. и др., 1985/).

Ву. '.еленные Бзв-белки при ЭФ в ПААГ с пз-иа,как и белки ЛКЭ, характеризовались некоторой гетерогенностью (рис.7). Обнаружены две главные фракции (28 и 31 кДа) и минорные1 компонент(18 кДа; иногда - 22-24 кДа), которые Еарьи-

Рис.6. Влияние фосфорилирования на сродство ББв-бел-ков к он ДНК-целлкшозе. а -зависимость фоофорилирова-ния от времени инкубации с сАЧР-эависимой протеинкина-зой; б - отношение содержания Езв-белков в алюате

2М Naci к содержанию в алюате 0,6М NaCl.

ЦЕЛКОПРВДА

ровали от препарата к препарату и объясняется, видимо, протеслизом неходких высокомолекулярных фракций. Бзв-белки [репы были охарактеризованы с применением тех же подходов, что и при и изучении ббв-белков МО. Белки грены несколь ко слабее связывали на фильтрах /^Н/-он АКЭ, чем белки АКЭ, поскольку максимальное взаимодействие отмечено не при

0.15.0,2М N¿01, а при ОДМ ыаС1. В опытах по кокурентному вытеснению /11Н/-он Д1Ж АКЭ дн ДНК молок обнаружено, что зкв-бслки 1рены в 30 раз более прочно связывает1 он да по сравнению с дн матрицей.

Бзв-бепк!! грены обладали способностью дестабилизировать дн ДНК молок и значительно (в 14 раз) стимулировали рсплика-тнвный синтез ДНК в гомологичной системе-в проницаемых ядрах грены (см. далее рис. <4 ). Как и белки АКЭ, ББи-бслки насекомого активировали прокариотическую ДНК-пал имеразу (флга Т4) на он ДНК (рис.8), причем степень активации (пятикратная) была выше, чем для белков млекопитающих. Видимо, и в этом случае ббв-белки дестабилизи- ^та'ьшш руют участки локальной ренатурации, затрудняющие функционирование ДНК-подимерази. Несмотря на некоторые количественные отличия, в качественном смысле свойства Бяв-белков насекомого (грена) и млекопитающего (АКЭ) были сходни. Характеристика бев-ослкоп грены тутового шелкопряда представлена в табл.2 (ср. с табл.1).

УЛ-оглт гр'ни ,пиг

Рис.8. Стимуляция зав-белка-ми грены полимеразы фага Т4

Таблица 2

Характеристика ббв-белков из хроматина грены тутового шелкопряда

Свойство Данные

1. М.м. основных компонент, кДа

(Э£ в ПААГ С Оз-ыа) 31; 28

2. Аминокислотный состав Малое содержание ароматических ос-

татков высокое - Гли и Глу

68 кДа -

40 цЦз —

З'кД"

30 кДа —- •• • г в

17 кДа -----. - • //?

12 к/1а --------

I 2 Ню.7. в ПААГ с Дз - кз -белков-маркеров (1) и Баз-оел-ков грены (2),

Таблица 2 (продолжение)

Свойство Данные

3. Связывание с да:

а) Число нуклеотвдов на 1 молекулу (м.м.

принята за 31 кДа) 15

б) Он ДНК > да ДНК _ в 30 раз

в) Кооперативность связывания ■ - ' 'Не обнаружена

4. Способность дестабилизировать да ДК Дестабилизируют

5. Ингабирование экзонуклеазы Ингибируют

6. Стимуляция ДНК-полимеразы фага Т4 Стимулируют

7. Стимуляция репликативного синтеза ДНК

в ядрах грены Стимулируют

а. Примеси ДНК-полимераз, эндо- и зкзо-

нуклеаз, ЛДГ и белков НМ6 Отсутствуют

3. ВВДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА БСД ИЗ ПЛАЗШ КРОВИ МЛЕКОПИГАЩК-''

Для исследования специфичности эффекта ssB-белков необходимо было выбрат в качестве модели такие полипептады, которые, хотя по некоторым свойствам и были бы сходны с ssB-белками, но заЕедомо не участвовали бы в метаболизме внутриклеточного ДНК. Поэтому и были выбраны БСД плазмы крови.

БСД получены из плазмы крови мышей (исходная концентрация в плазме -13 - 1,5 мкг/мл), поросят (8,1 - 1,5 мкг/мл) и собаки (7 мкг/мл). Препарат БСД бил гомогенным, при 3£ в ПААГ с оз-Na (48 кДа). При гел ¡фильтрации белки локализовались в диапазоне 50-62 кДа. Данные нативного ЕЯ? в ПА' 1 при рН 4,3 и 8,9 показали, что pi БСД находится в кислой области. В препаратах отсутствовали примеси ДНК-полимераз, экзо- и звдонуклеаз.

БСД слабее связывали / Н/-он ДНК АКЗ, чем ssB-белки и, видимо, поэтому слабее ингибировапи экзонуклеазу (фосфодиэстеразу)in vitro . В отличие от ssB-белков, БСД не стимулировали ДНК-полимеразы фага Т4 и В. stearothenraphi lus. Влияния на активность ДНК-полимеразыfl из АКЭ также не обнаружено. Однако, как и ssB-белки, БСД обладали способностью повышать активность ДНК-полимеразы o¿ из АКЭ на он ДНК (рис.9), что может объясняться снижением БСД числа непродуктивных сайтов посадки полимеразы на он ДНК (см. выше).

Ряд свойств сближал БСД с антителами к он ДНК /Поверенный A.M., 1986/: молекулярная масса, которая близка к массе ДНК-связывающего Fab-фрагыента иммуноглобулинов, кислая pi, слабое сродство к ДЭАЭ-целлшозе, относительная теплоустойчивость и уровень в плазме здоровых животных. Как и иммуноглобули-

5t а

ны, БСД осаждались 14%-м полиэтиленгликолем, а концентрация. их увеличивалась после инъекции мышам полисахарида, что характерно для антител к ДНК /izui s. et al, 1977/. Уровень БСД повышался при лучевой патологии - выявлено 2-3-х-кратное увеличение его после острого однократного облучения поросят (600 рад; 8-24 ч после воздействия) и 1,4-1,9-ти-кратное повышение концентрации БСД через 24 ч после облучения мышей (400 -900 рад). Таким образом, наиболее вероятно, что БСД являются антителами к он ДНК, стимуляция которыми ДНК-полимеразы оС и ин-шбирование экзонуклеазы выявлены впервые. Антитела, не участвуя в метаболизме внутриклеточной ДНК /Поверенный A.M., 1986/, являются удобной моделью для выявления специфичности 9®t?KTassB -белков.

"у V j ' i 6 а ю 12

6С9>, мкг Fiic .9. Влияние БСД поросят (а) и мышей (б) на активность ДНК-полиу.еразы №Э(о<)

4. УЧАСТИЕ Бвв-БЕЛКОВ ЭУКАРИОТ В РЕПЛИКАЦИИ ДНК 4.1. Пропорциональность между размерами ДНК и содержанием Бгв-белков в клетках различных организмов

Если основная функция белков типа ИР обусловлена связыванием с ДНК, то их содержание в клетках различных организмов должно находиться в прямой зависи-

мости от размера генома (табл.3).

Таблица 3

Ввд организма

Содержание ДНК, пкг/клетку

Содержание ssß-балков, молекул/клетку

Е. coli

0,0037

З'Ю** /Weiner J.H. et al.,1975/;

8-10'

2т

Дрожжи

0,033*

6-10 (SSB-I) /Jong A.Y.S. et al., 1985/

,b**

Гриб Ustilago maydis

o,r

3-10'

Тимус теленка

5,4 /Bollum F.J, 1975/

8-10'

,bxx

1* 10 rtluang A.Ta-Fu et al, 1975/

Лимфоциты человека

7,3*

Миелома мышей АКЭ

8,0х 10,0

1,8-Ю6** 3,6«10ti

Примечание к табл.3, к - /Збарский И.Б., 1988/; хх -/кзшкзукшзй.s.c.et al., 1981/.

Особняком стоят ооциты X.iaevis , где выявлено очень большое содержание 1?

ssb-белков (4*10 молекул /клетку /Carrara g. et al., 1977/. Однако, в развивающиеся ооцитах, вследствие амплификации генов рРНК, суммарное содержание да (ядерной, штохоццриальной и рибосомной) увеличивается в сотни и тысячи раз /Збарский И.Б., 1988/, достигая 3 нг /Carifaca g. et'al ., 1977/. Даже с учетом этих данных, наблвдается корреляция меаду lg двух показателей (табл.3) с г = 0,9. •

Количество РР-А в клетках различных организмов не коррелирует с размерами генома и гораздо меньше (до (5-6)»ю\шекул/клетку Жеппу м.к. et al., 1990; Nasheuer н.р. et al., 1992/, причем относительное содержание КР-А (мо-лекул/фг ДНК) ниже показателя Е. сон в 7-52 раза. Уровень RP-A приблизительно равен числу репликонов и молекул ДНК-репликазы, с которой RP-A образует комплекс (ссылки см. ВВВДЕНИЕ). Поэтому, функции по связыванию он ДНК и поддержанию значительных по размерам (см. ВВВДЕНИЕ) участков он ДНК в процессе репликации могут выполнять только белки типа ИР.

4.? Связь ssb -белков с ДНК в хроматине

Клетгл АКЭ с меченой / Н/-тимидином ДНК облучали УФ для индукции ковален-тных сшивок белки-нуклеиновые кислоты (см. МЕТОДЫ). После гвдролиза ДЖ хроматина ДНКазой и выделения ssB-белков, только ssB-белки хроматина облученных клеток имели значительную удельную радиоактивность (табл.4).

Таблица 4

Препарат Удельная радиоактивность, (имп/минНО /иг

Контроль УФ

ssB-белки внехроматиновые ssB-белки хроматина 1,382 - 0,08 1,163 - 0,09 2,31 - 0,44 17,3 - ¿,15 (р<0,05)

В контрольных опытах не отмечено сорбции на он ДНКтцеллкяозе ДНКазы 1 (использованной для гвдролиза ДНК хроматина), поскольку фермент, видимо, связы-

вался с да ДНК-целлюлозой, а также продуктов гидролиза ДНКазой очищенной / Н/-ДНК АКЭ. Поэтому, высокая радиоактивность ssB-белшз хроматина облученных УФ

клеток связана, скорее всего, с ковалетно сшитыми с белками фрагментами / Н/-ДНК, с которой ssB-белки контактируют in vivo. Метод вдентафжации контакта белков с ДНК путем воздействия УФ использовался и другими авторами, причем у белков, сшитых с фрагментами ДНК, слабо изменялась алектрофоретическая под-

ВИЖНОСТЬ /Kenny М.К. et al., 1990; Seroussi Б'., Lavi S-. 1093/. В Наших ОШ1-тах при ЕФ В ПЛАГ С Ds-Na SSB-беЛКОБ хроматина ИЗ контрольных и иийучОКНЫл УФ клеток, различий в злектрофоретической подвижности не выявлено.

Эксперименты по индукции УФ сшивок мевду белками и предварительно проме- i ченнси гяРНК (аналогичные описанным выше; см. также МЕТОДЫ) показали, что удельная радиоактивность выделенных ssB-белкоБ хроматина очень мала и отсутствует разница в показателях для контрольных и облученных клеток. В то же время, во внехроматиновой фракции облученных клеток ssB-белки-были, по-ввди-мому, связаны с фрагментами меченой гяРНК.

Сделан вывод, что ssB-белки в хроматине связаны in vivo с ДНК и только с ДНК (но не с гяРНК).

4.3. Пропорцио1ШЛьность мезду содержанием ssb-белков в хроматине и уровне« репликативного синтеза ДНК

4.3.1. Развитие АКЭ и грены тутового шелкопряда

На рис.10 представлена кинетика роста АКЭ in vivo (а). Репликативний синтез для 3-х-дневной опухоли (параметры которой приняты за 100%) был выше, чем для 5-8-ми- и 10-ти-дневной АКЭ (б). Параллельно изменениям репликации снижалось содержание ssB-белкоБ в обеих фракциях (в,г). Способность ssB-белков связывать он ДНК при этом не изменялась.

На рис.11 представлены соответствующие опыты с греной, развитие которой происходило при перенесении в соответствующие температурные условия от диапаузы (день "О") через фазу максимальной пролиферации (5 день) до конечной стадии формирования высокодифференцировашшх тканей зародыша /Клименко В.В., 1975/. ■ Содержание зэв-белков в хроматине грены коррелировало с репликативным синтезом ДНК в ядрах ( г= 0,99), причем максимальным изменениям подвергалась основная фракция ssb-балков (28-31 кДа).

Таким образом, количество ssB-белков в хроматине связано с уровнем репликации ДНК. Подобные данные для охарактеризованных ssB-белков получены впервые. В то жеегсмя;. уровень КР-А не изменяется на разных стадиях щеточного

2 Ч 6 в 10 Лии /

Рис.10. Рост АКЭ in vivo, х - (здесь и далее) - р<0,05.

§?0-белкн, мкг/г ядер

600

Включение

/3Н/-'ШР,

(имп/мин)* IÖ3 на мг белка

400

200

- 5

Рис.11. Содержание к;в-белков (1) и реп-ликативный синтез ДНК в ядрах (2) при развитии грены.

ЦИКЛа /01г\ Б. еС а1., 1990; Бегоизз1 Г. Б. б ., 1993/. Возможно, повышение уровня бзй-белков в хроматине про-лиферирувдх клеточных популяций обусловлено фосфорилированием этих белков щклин-зависимыми протеинкиназами, участвующими В пролиферативном сигнале ,Ва1а1п V. еЬ а1 ., 1993; Иезп^гку а1 . > 1995/. Фосфорилирование может повышать прочность связывания ББв-белков с он ДЩ (см. 1) и, как следствие, увеличивать их содержание в хроматине. С другой стороны, содержание Бзв-белков может зависеть от количества участков с он ДНК, которое повышается в прсли£ерирующих клетках.

4.3.2. Ингибирование репликативного синтеза ДНК

Дни развития

При инкубации АКЭ in vitro 30 ч обнаружено снижение репликации ДНК (рис.

Включение ЛН/-тими-

12 а). Возможно, культуральная среда оказывается недостаточной дня АКЭ. Клетки снижают репли-кативную активность, не делятся, хотя полностью сохраняют жизнеспособность и целостность (см. МЕТОДЫ) . Параллельно снижению репликации, наблвдаются аналогичные изменения уровня ssb-белков в хроматине (б) с соответствующим повышением во внехроматиновой фракции (в). Период полужизниssb-белков, по-видимому, достаточно длителен -

Btc.12. Инкубация АКЭ in vitro.

дина, %

'ssB-белки хроматина, мкг/108 клеток

ssB-белки

внехрома-

тиновые,

мкг/108

клеток

нами не обнаружено распада промечених in vivo ssD-белков при инкубации АКЭ в течение 10 ч (см.МЕТОДЦ). При солировании результатов всех опытов in vivo и in vitro , в которых параллельно исследовали содержание ssB-белков в хроматине АКЭ и интенсивность репликативного синтеза ДНК, получена прямо пропорциональная зависимость мевду этими параметрами (г = 0,9). Для суммарных ssb-белков АКЭ такой закономерности не отмечено.

4.3.3. Активация репликативного синтеза ДНК

Клетки костного мозга мышей инкубировали (45 мин, 37°, 0.15М Nací с 20 мМ НЕРЕЗбуфером, рН 7,4) с цинк-МТ, для которою предполагается участие в меи-клеточном транспорте цинка /ihomas d.g. et al., 1937/ и, в качестве его донора, в пролиферации /Vaiiee B.L ., 1991/. Выбор АКЭ в качестве объекта в этом случае оказывался неоправданным, поскольку опухоль имеет высокий и постоянный уровень цинка при развитии /Kraker A.J. et al-, 1988/.

Обнаружено зависимое от количества цинк-МТ повышение уровня реш.нкыполого синтеза и содержания ssu-белков в хроматине (рис.13). Поскольку в.составе SSB-белков мышей (АКЭ) не обнаружено цистеина (компонента ДНК-связывающих участков ("цинковых пальцев") факторов метаболизма ДНК / Vallee B.L, 1991/), ВЛИЯНИе ЦИНК-МГ вряд ли связано с модуляцией ДНК-связывающей активностью ЯВ-бслков. Возможно, увеличение их уровня обусловлено повышением количества ДНК с он участками при

Рис.13. Содержание ssB-бел-ков в хроматине (1) и репли-кативный синтез (2) при инкубации клеток костного мозга с щнк-КТГ.

за)

200

ТОО

-П^ - -

Ü 50 ТОО ¡5Í 7

Дпнк-МТ, гдкг/10 клеток

стимуляции репликации ДНК цинк-МГ

по другим механизмам.

4.4. Спещфмность стимуляции ssb—белками репликативного синтеза ДНК..

Специфичность ssB-белиэв для клетоп млекопитающих и насекомых

Представленные данные в совокупности доказывают участие ssû-белков в репликации ДНК, однако механизм их действия оставался не ясным. И другие поли-аептиды при тех или иных условиях in vitro стимулируют ДНК-полимеразу оС (БСД. ДДГ /Kaiserman H.В. et al., 1989/, беЛКИ НМ6 /Marekov L.N. et-al., " 1984/, продукты протесшиза нуклеолинаvsapp м< et al., 1985/, но не белки iïiPHn-частиц /Riva s. et ai., 198o/). Однако, в опытах с проницаешми клетками и ядрами, то есть, в условиях, приближенных к in vivo, обнаружено, что эффект ssB-белкоБ, по-ввдимому, специфичен (рис.14). Максимальный уровень активации отмечен в гомологичных системах, а в гетерологичныхэзв -белки проявляли слабый эффект, сравнимый с действием БСД. Белки АКЭ стимулировали синтез ДНК в клетках АКЭ начиная с количества 3,5 мкг, что всего в 1,5 раза превышает уровень эндогенных белков. Относительно слабая стимуляция БСД и ssa-белками в гетерологич-ных системах, видимо, неспеци£ична и объясняется снижением числа непродуктивных сайтов посадки полимеразы oi на он ДНК (см. 1). Таким образом, активация репликации ДНК, возможно, специфична для ssü-белков и требует гомологичного дезоксирибонуклеопротезда. Другие исследованные на этот предмет белки не обладают подобным свойством. Так, белок Н'.ё 1 в проницаемых клетках увеличивал репликативный синтез всего в 1,5 раза /Mexandrova E.A.et рис.14. Стимуляция репликативного син-ai., 1984/ (что сравнимо с БСД), а теза ДНК в проницаемых клетках АКЭ (а) белки гяРНП-частиц не активируют ДНК- и ядах грены (б) ssB-белкаш АКЭ (1), полимеразу . Доя RP-A данные нам ^ны (2) и БСД (3). неизвестны.

Степень активации

_1-1-1-L_

20 40 60 60

Балки, мкг

Стимуляция репликации оказалась специфичной для ssß-белков млекопитающих и насекомых (рис.14). Аминокислотный состав их, хотя и имел общие черты (и был сходен с составом .других белков, связывающихся с он ДНК и РНК), однако имел и существенные отличия. Иммуноферментныи анализ с антисывороткой к ssb-белкам АКЭ показал, что белки АКЭ и грены не имеют общих антигенных'детерминант. Иммуноблоттинг продемонстрировал, что антитела к ssB-белкам АКЭ не реагируют с лабильно связанными негистоновыми оелками хроматина (где находятся белки НМ6 /Збарский И.В., 1988/) и основными коровыми белками гяРНП-час-тиц. В то же время, в составе гяРНП-частиц АН1> наш обнаружена илнорная фракция, взаимодействующая с антителами. По-видимому, в хроматине ssB-белки участвуют в репликации, стабилизируя он ЖК, защишдя ее от нуклеаз и модулируя ДНК-полимеразы,- а во внехроматиновой фракции ммут входить в качестве минорных компонент в состав гяРНП-частиц и быть связанными с гяРНК (см. 4.2).

Эффект ssB-белков и RP-A на репликацию ДНК в клетках имеет, скорее всего, комплексную природу. Можно предположить, что на начальной стадии KP-А, связываясь с праймазной субъединицей ДНК-репликазы, стимулирует инициацию. Такой комплекс RP-A - праймаза становится нечувствительным к ингибированию каноническими sss-белками (которое показано нами в опытах с ssB-белками и выделенной ДНК-репликазой - см. табл.1). Происходит инициация репликации. Далее, на стадии элонгации, принимают участие белки типа HP, количество которых в клетках значительно больше, чем №-А (см. 4.1).

5. УЧАСШЕ ssb -БЕЛКОВ В РЕПАРАЦИИ ДНК ПОСЛЕ ВСВДЙСПВИЯ УФ И ИЗЛУЧЕНИЯ НА АКЭ

Кривая выживаемости АКЭ после воздействия УФ (1,53-40 Дж/А характеризуется следующими параметрами: ¡¡^ = 9 Дж/ьГ, Д^у = 11,0 Дж/м^, Д = 4 Дж/м*" и = 1,03, а после воздействия у-излучения (3-20 1р) - 4,4 Гр, 8 1р, 3,8 11? и 2,4 соответственно.

На рис.15 представлена зависимость корректированного (см. МКЮДУ) репара-тивного синтеза и содержания ssß-белков от времени после облучения УФ. Пик повышения количества ssB-белков в хроматине совпадает с максимумом репара-тивного синтеза. Поскольку на содержании ssB-белков отражаются колебания и в регшикативном синтезе (см. 4.3), который изменялся по экспоненциальному закону, наблюдается уменьшение уровня ssß-белков в ранние и поздние сроки после воздействия (рис.15). Изменения количества ssB-белков во внехроматиновой фракции были обратны колебаниям в хроматине (рис.15) и суммарное содержание их оставалось постоянным. Через 2,Ь ч после облучения уровень 5-ь-белков в хроматине повышался в зависимости от дозы излучения (1,53-20 Дж/А.

Рис.1Ь. Репаративный синтез ДНК (1), ордината справа, и содержание ssB-белкоз в хроматине (2) и внехроматиновой фракции (3), ордината слева,

после облучения АКЭ УФ (10 р

Дк/м ) и инкубации in vitro . Штриховка (здесь и далее) -зона максимального ш для уровня ssb-белков в контроле.

Содержание ssu-белков, • X от контроля

юо

шшЖШ А

Репаративный синтез,

(илшМО

• На рис.16 представлены соответ ствутеие значения для АКЭ после воздействия ^-радиации в дозе время после облучения, ч 15 Гр. Увеличение сепаративного

включения / Н/-тимидина отмечено через 1 ч и, затем, через 6-9 ч после воздействия ("быстрая" и"медленная" компоненты репарации /Пелевина И.И. и др., 1985/Л Количество ббв -белков в хроматине изменялось в соответствии с колебаниями репаративного синтеза. Видимо, относительно небольшое снижение репликацци, обнаруженное нами (на 30-40%) при действии облучения, не отражается существенно на уровне бэв-белков в хроматине. Как и в случае воздействия УФ, содержание ббв-белков через 6 ч. после облучения ионизирующей радиацией (5-15 Гр) было пропорционально дозе излучения.

И после воздействия УФ, и ^-радиации, накопление ББВ-белков в хроматине не было напрямую связано с повышением содержания ДНК с он участками, которое увеличивалось относительно слабо (на 10-15%) и находилось на постоянном уровне спустя 1 ч и далее после воздействий.

Для исследования влияния ББв-белков на репаративный синтез, АКЭ облучали УФ (20

Дж/м^), инкубировали 2 ч и, затем, получали препарат проницаемых клеток. Ин-

2 I ю

Время, ч

Рис.16. Репаративный синтез ДНК (1) и содержание Бэв-бел-ков в хроматине (2) после действия ^-радиации (15 П?). Обозначения ординат как на рис. 15.

кубация последних с ssB-беяками приводила к увеличению интенсивности репа-ративного синтеза ДНК (ö vier ssB-белков - до 13V ± '/%, lü мкг - до 215 - 5% (р< ü,0b) и 24 мкг - до 248 ±8% (р< 0,05) от контроля без белков). Таким образом, ssB-белки принимают участие в репарации ДНК после облучения.

Механизм действия белков в этом процессе может быть связан с их фосфори-лированием после облучения (как это показано для многих белков хроматина /Блюм Я.В., 1987/), что приводит к повышению прочности связывания ssb -белков с он ДНК. Влияние ssB-белков на репарацию реализуется, видимо, на уровне активации ДНК-полимеразы , которая, наряду с другими полимеразами (Ji /Уап Z.-J., Roy D ., 1996/, /Dc-esler S.L. et al ., 1УЬ8/ И £ /schivji м.к.к. et al ., 199t>/) участвует в этом процессе, осуществляя застройку коротких брешей В НИТИ ДНК /Cleaver J., 1УЪ4; Mirzayans К. et al.jyy^/,

выводу

1. Из клеток АКЭ и грены тутового шелкопряда выделены ssB-оелки, которые бьши охарактеризованы по основным физико-химическим параметрам (аминокислотный состав, молекулярная масса, изоалектрическая точка (для белков из АКЭ), связывание с однонитевыми и двунитевыми нуклеиновыми кислотами, способность расплетать двойную спираль ДНК) и биохимическим свойствам (отсутствие примесей ферментов метаболизма ДНК, белков Нмё, ДНК-связивающеи формы ЛДГ, способность ингибировать экзонуклеазу). Разработан метод количественного определения sse-белков в клетках зукариот и продемонслри(.ювана его корректность.

2. Показано, что ssB-оелки АКЭ способны стимулировать гомологичную ДНК-полимеразу ; при больших весовых соотношениях ssu-оелки/он ДНК отмечается ингибирование. ssb-белки АКЭ не изменяли активности ДНК-полимеразы^ на он ДНК но ингибировали фермент на активированной ДНК при больших весовых соотношениях ssb -белки/матрица.

3. ssb -белки АКЭ ингибировали гомологичные ДНК-репликазу и праймазу.

4. ssb -белки из АКЭ и грены тутового шелкопряда активировали прокариоти-ческие ДНК-полимеразы.

5. ssB-белки из АКЭ и грены тутового шелкопряда в клетках АКЭ и ядрах грены, проницаемых для макромолекул, стимулировали репликативный синтез ДНК. Максимальная степень активации отмечена в гомологичных системах, белки из плазмы крови, связывающиеся с он ДНК, не имитировали эффекты ssb-белков на субклеточном уровне, хотя на молекулярном уровне были способны стимулировать ДНК-полимеразу из АКЭ на он ДНК.

6. ssB-белки из внехроматиновой фракции и хроматина клеток АКЭ бьши иден-

тичны по всем основным свойствам, за исключением степени фосфорилирования, которая бьша выше для ssB-белков хроматина в 1,4-1,5 раза. Вследствие этого, ssB-белки внехроматиновой фракции фосфорилировались сАМР-завис, ■: юй протеин-киназой и протеинкиназой С белее интенсивно. Фосфорилирование ssB-белкоа из АКЭ сАМР-зависимой протеинкиназой повышало прочность связывания их с он ДНК.

V. Показано, что in vitro ssB-белки АКЭ связаны в хроматине с ДНК и только с ДНК. Во внехроматиновой фракции возможен контакт с гяРНК.

8. Интенсивность репликативного синтеза ДНК в клетках АКЭ и ядрах грены тутового шелкопряда тесно коррелирует с содержанием ssB-белков в хроматине ( г равны 0,9 и 0,99 соответственно). Подавление репликации ДНК в клетках АКЭ сопровождается снижением уровня ssB-белков в хроматине. Стимуляция реп-лихат^вчого синтеза ДНК цинк-Mi' в клетках костного мозга мышей приводит к парагл влькому увеличению содержания ssß-белков в хроматине.

9. Уровень репаративного синтеза ДНК в клетках АКЭ после воздействия УФ

и у-излучения коррелирует с количеством ssB-белков в хроматине. Гомологичные ssB-белки при добавлении к облученным клеткам АКЭ, проницаемым для макромолекул, активируют репаративныи синтез ДНК.

10. ssB-белки типа ИР являются специ$ичной группой нешетоновых белков хроматина, участвующих в репликации и репарации ДНК, которая отличается от других групп белков, связывающих однонитевые нуклеиновые кислоты. ssB-белки характеризуются относительно низкой степенью консервативности, поскольку отличны для клеток насекомых и млекопитающих.

СПИООК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Котеров А.Н., Новорадовская H.A., Филиппович И.В. Влияние белка, связывающего однонитчатую ДНК (ssß-белка) на некоторые ферменты репликативного комплекса из клеток асцитной карциномы Ерлиха. Тез.докл. IX Всес. симп. "Структура и функции клеточного ядра". Черноголовка, май 1987, с.229.

2. Koterov A.N., Novoradovskaya N.A., Filippovich I.V. Effect of single--cranded DNA-binding protein (SSB-protein) on the activity of some enzymes of the replicative complex. Intern. Symp. "Physico-chemistry of DNA and molecule niochanisins of genome functioning". /detracts. Ibi-lisii 1967, p. 120-121.

Ь. аотеров A.H., Новорадовская H.A., Золотарева Л.А., Филиппович И.В. Влияние радиации на белки, стабилизирующие однонитчатую структуру ДНК. Ин£ормац. бкшл. АН СССР по проблемам радиобиологии, вып.34. М, 1987, с.35.

4. Чиркова Л.П., Власов М.С., Золотарева Л.А., Котеров А.Н. Некоторые аспекты изучения радиационного поражения ДНК. В кн.: "Радиобиологический эксперимент и человек". Сб.тр. Института биофизики МЗ СССР/Под ред. Ю.И. Москалева. М., 1987, с.88-93.

5. Новорадовская H.A., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Влияние ионизирующей радиации на содержание ДНК-связывакхцего белка в плазме крови млекопитающих. FVK-деп. в ВИНИТИ № 1388-В-88 от 22.02.1988 г.

6. Котеров А.Н., Новорадовская H.A., Тронов В.А., Золотарева Л.А., Филиппович И.В. Выделение и характеристика белка, связывающегося с однонитевой да (ssB-белка) из ¡слеток асцитной карциномы Эрлиха. Биохимия., 1988. Т.53, №7. С. 1193-1202. .

7. Котеров А.Н., Новорадовская H.A., Филиппович И.В. Влияние ssB-белка из клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) на активность некоторых ферментов репликации и репарации ДНК. Биохимия. 1988. Т.53. №8. С.1278-1287.

8. Новорадовская H.A., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Участие ssB-белка в репарации ДНК клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) после облучения УФ и ионизирующей радиацией. Тез. докл. 1 Всес. радиобиол. съезда. М.: 1989, т.1, с.120-121.

9. Филиппович И.В., Котеров А.Н. Белки, связывающиеся с однонитевой ДНК (ssB-белки): свойства и возможные функции в клетках эукариот (обзор). Успехи соврем.биол. 1989. Т. 107. №2. С.163-178.

10. Новорадовская H.A., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Участие ssB-белка в репарации ДНК шгеток асцитной карциномы Ерлиха (АКЭ) после облучения УФ. Радиобиология. 1989. Т.29. № 6. С.723-728.

11. Новорадовская H.A., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Участие ssB-белка в репарации ДНК клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) после у-облучения. Радиобиология. 1989. Т.29. № 6. С.729-731.

12. Котеров А.Н., Новорадовская H.A., Филиппович И.В. Участие белка, связывающегося с однонитевой ДНК (ssB-белка) в репликации ДНК в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Биохимия. 1990. Т.55. № 3. С.911-916.

13. Новорадовская H.A., Котеров А.Н. Белки плазмы крови млекопитающих, связывающиеся с одноцепочечной ДНК; влияние на реакции полимеризации и деградации ДНК. Укр.биохим.журн. 1990. Т.62. Р 3. С.31-37.

14. Новорадовская H.A., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Экспресс-метод оп-редления количества белков, связывающих ДНК, в сыворотке крови млекопитающих. Вопр. мед. химии. 1990. Т.36. № 4. С.85-88.

15. Котеров А.Н., Новорадовская H.A., Филиппович И.В. Участие белка, связывающегося с однонитевой ДНК (ssB-белка) в репарации ДНК клеток асцитной опухали Е£лиха (АСВ) после облучения УФ-светом и ионизирующей радиацией. Тез.докл. Всес. симп. "Биохимия опухолевой клетки". Минск, ноябрь 1990,

с.53-54.

16. Новорадовская H.A., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Применение экспресс-метода определения количества белков, связывающихся с ДНК (БСД) для диагностики злокачественных новообразований. Тез.докл. Всес. симп. "Биохимия опухолевой клетки". Минск, ноябрь 1990, с.142-143. "

17. Котеров А.Н., Новорадовская H.A., Пушкарева Н.Б., Воротников A.B., Никсшьский A.B., Рисник В.В. Фоофорилирование и другое свойства белков, ■• связывающихся с однонитевой ДНК (ззв-белков) ,из .хроматина и внехроматино-вой фракции клеток асцитной карциномы флиха. Биохимия. 1991. Т.56. № 4. С.666-673.

18. Котеров А.Н., Андрианова Е.П., Филиппович И.В. Метод определения количества белков, связывающихся с однонитевой ДНК (ssB-белков) в грубом экстракте клеток эукариот. Рук. деп. в ВИНИТИ № 2154-В-91 от 23.05.91 г.

19. Котеров А.Н., Сазыкин А.Ю., Новорадовская H.A., Филиппович И.В. Антигенные свойства белков гетерогенных ядерных рибонуклеопротевдных частиц, лабильно связанных негкстоновых белков и белков, связывающихся с однонитевой ДНК (белков ssb) из асцитной опухали Эрлиха. Укр.биохим.журн. 1991. Т.63. № 5. С.26-32.

20. Тронов В.А., Зайцев В.А., Черный Д.И., Котеров А.Н., Филиппович И.В. Связывание ssß-белка из клеток асцитной карциномы Эрлиха с ДНК и полирибо-нуклеотвдами. Мол. бися. 1991. Т.25. №1. С.212-222.

21. Котеров А.Н., Никольский A.B., Пушкарева Н.Б., Рисник В.В. цАМФ-за-висимое фоофорилирование белков, связывающихся с одноцепочечной ДНК (ssb-белков) как возможный модулятор процесса репарации ДНК после облучения УФ-светом и ионизирующей радиацией. Тез. докл. 1У Всес. конф. "Эндокринная система организма и вредные факторы окружающей среды". Ленинград, сентябрь 1991, с. 123.

22. Котеров А.Н., Андрианова Е.П., Филиппович И.В. Стимуляция реггликатив-ного синтеза ДНК белками эукариот, связывающимися с однонитевой ДНК. Укр. биохш.журн. 1992. Т.64. № 1. С.35-41.

23. Котеров А.Н., Ацдрианова Е.П., Филиппович И.В. Использование хроматографии на бензоил-нафтил-ДЭАЭ-целлюлозе для определения способности белков из асцитной карциномы Эрлиха, связывающихся с однонитевой ДНК (ssß-белков), десто.ллиз:фовать двойную спираль ДНК. Биохимия. 1992. Т.57. № 2.С.195-200.•

24. Андрианова Е.П., Тарасенко Н.В., Котеров А.Н., Филиппович Ю.Б. Белки . грены тутового шелкопреда, связывающиеся с однонитевой ДЩ (ssB-белки): выделение и свойства. Биохимия. 1992. Т.57. № 3. С.398-405.

3L>

25. Котеров Л.Н., Рисник В.В. Связь ssu-белков с да б хроматине клеток асцитной 1сарцинош Эрлиха. Биохимия. 1992. Т.57. №7. С.1083-1088.

26. Koterov A.N.< Novoradovskaya N.A., Filippovich I.V. The relationship of single-stranded DNA-binding proteins of the Ehrlich asfcites tumor to cell growth phase and DNA replication. Indian J. Biochem. Biophys. 1992. V.29.

N 1. P.9-12.

27. Koterov A.N., Novoradovskaya N.A., Nikpl'skii A.V., PushXareva N.B., Vorotnikov A.V.» Risnik V.V. Properties of single-stranded DNA-binding proteins (SSB-proteins) from chromatin and nonchromatin fraction of Ehrlich ascites tumour. Phosphorylation enhances the affinity of SSB-proteins for single-stranded DNA. Indian J. Biochem. Biophys. 1992. V.29. N 1. P.13-19.

28. Котеров A.H., Сазыкин A. 10., Филиппович И.В. Снижение острой токсичности этанола препаратом цинк-металлотионеина /выделение и характеристика цинк-металлотионеина/. Бюл. экспер. бисш. 1993. Т.115. № 1. С.39-40.

29. Котеров А.Н. Возможность участия белков, связывающихся с однонитевой ЛИК, в репликации да у эукариот (обзор). Укр.биохим.журн. 1994. Т.66. N° 2. С.17-30.

30. Котеров А.Н., 'Гребенок З.А., Пушкарева Н.Б., Никольский А.В. Стимуляция экзогенным цинк-металлотионеином репликативного синтеза ДНК и пролиферации клеток костного мозга у облученных мышей. Тез. докл. конф. "Действие ионизирующей радиации на иммунную и кроветворную системы". Москва, ноябрь 1995, с.11-12.

31. Котеров А.Н., Филиппович И.В. Радиобиология металлотионеинов (обзор). Рэдиац.биоп. Радиоэкся. 1995. Т.35. № 2. С.162-178.

32. Котеров А.Н., Требенок З.А., Пушкарева Н.Б., Никольский А.В. Стимуляция экзогенным цинк-металлотионеином репликативного синтеза ДНК и пролиферации клеток костного мозга мышей. Бюл. экспер. бисш. 1996. Т.122. tP-i2. С.

33. Котеров А.Н. Влияние цинк-металлотионеина на репликативный синтез ДНК и содержание белков, связывающихся с однонитевой ДНК (белков ssb) в хроматине клеток костного мозга мышей. Укр.биохим.журн. 1996. Т.бУ. С.

В публикациях, отражающих основные материалы работа, участие соавторов заключалось в совместном с диссертантом проведении части экспериментов, что отражено в разделе МАТЕРИАЛЫ И МЕГОДЫ. Личный вклад диссертанта состоял в -пределении задач, разработке основных подходов, напраапений и методов исследования, самостоятельном проведении большей части экспериментов, литературном поиске, анализе и обобщении полученного материала.

Информация о работе

Котеров, Алексей Николаевич
доктора биологических наук
Москва, 1996
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы