Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение новой ДНК-полимеразы репаративного типа из яйцеклеток костистой рыбы Вьюн (Misgurnus fossilis L. )

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Выделение новой ДНК-полимеразы репаративного типа из яйцеклеток костистой рыбы Вьюн (Misgurnus fossilis L. )"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н. К. КОЛЬЦОВА

рГ 6 ОД на правах рукописи

УДК 577.213.3

о в ^' ^

ДИМИТРОВА ДИАНА ДИМИТРОВА

ВЫДЕЛЕНИЕ НОВОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ РЕПАРАТИВНОГО ТИПА ИЗ ЯЙЦЕКЛЕТОК КОСТИСТОЙ РЫБЫ ВЬЮН (М'^дигпиБ ^ввШэ I..)

03.00.03 молекулярная биология 03.00.30 биология развития

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1998

Работа выполнена в лаборатории биохимии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Директор Института • академик Н.Г. Хрущов

Научные руководители:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, проф. С. Н. Кочетков

кандидат биологических наук А. А. Минин

В. С. Михайлов Н. П. Шарова

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится 11 февраля 1998 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.85.01 при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: г. Москва, ул. Вавилова, 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (г. Москва, ул. Вавилова, 26)

9

Автореферат разослан / января 1998 года.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е.В. Волина

Актуальность проблемы. Репарация ДНК является важнейшей генетической функцией, направленной на сохранение интактной структуры клеточйого генома. Различные физические и химические факторы вызывают различные повреждения в ДНК, что определяет многообразие механизмов репарации этих повреждений. Проблема коррекции структурных аномалий, возникающих в ДНК, особенно актуальна на ранних этапах эмбрионального развития, так как дефект в репаративной системе клеток эмбриона в условиях интенсивной пролиферации приводит к многократному повторению ошибки. Репаративный синтез ДНК в ходе первых делений клеток эмбриона обеспечивается запасенными в зрелом ооците репаративными ДНК-полимеразами. Низкое содержание ДНК-полимеразы ß в зрелых яйцеклетках вьюна в сравнении с ее содержанием в яйцеклетках других видов (Mikhailov and Gulyamov, 1983; Carre et al., 1980, Matsumoto et al., 1994) ставит вопрос о возможном участии других ДНК-полимераз в репарации повреждений ДНК на ранних этапах эмбриогенеза.

Согласно современной классификации, существуют пять типов ДНК-полимераз эукариот: а, ß, у, 5 и е (Burgers et al., 1990), которые участвуют в репликации и репарации ДНК. Недавно опубликованы данные о новой ДНК-полимеразе, названной ДНК-полимеразой С,, выделенной из тимуса теленка (Bialek and Grosse, 1993), зрелых яйцеклеток вьюна (Шарова и др., 1994) и клеток дрожжей (Nelson et al., 1996). ДНК-полимераза ? участвует, по-видимому, в репарации ДНК. Если о структуре, физико-химических и энзиматических свойствах ДНК-полимераз а, ß, у, 5 и е существуют многочисленные данные, то о новом ферменте известно крайне мало. Решение вопроса о роли обнаруженной ДНК-полимеразы требует детального анализа строения фермента, идентификации каталитической субъединицы и исследования механизма взаимодействия с модельными ДНК-субстратами. Физико-химический и энзимологический анализ ДНК-полимеразы С, может выявить новые механизмы репарации клеточной ДНК и их специфику в раннем развитии животных.

Цели настоящей работы сформулированы следующим образом. Получить высокоочищенный препарат недавно обнаруженной ДНК-полимеразы С, из зрелых яйцеклеток вьюна; определить ее полипептидный состав,

каталитическую субъединицу и исследовать ее физико-химические и ферментативные свойства; изучить динамику активности ДНК-полимеразы в эмбриогенезе вьюна; исследовать действие активных форм кислорода, вызывающих повреждения в структуре ДНК, на активность анализируемого фермента.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из зрелых яйцеклеток и эмбрионов вьюна выделена новая ДНК-полимераза, сходная по своим свойствам с недавно описанной ДНК-полимеразой £ из тимуса теленка {Bialek and Grosse, 1993). Показано, что каталитической субъединицей фермента является полипептид 68 кДа. Выявлена способность; фермента к дистрибутивному (низкопроцессивному) синтезу ДНК, дистрибутивному 3'-»5'-гидролизу одноцепочечной ДНК и неспаренных З'-концевых нуклеотидов в составе дуплекса ДНК.

Исследована динамика активности ДНК-полимеразы С, в ходе эмбрионального развития вьюна. Показано, что в зрелых яйцеклетках и развивающихся эмбрионах удельная активность ДНК-полимеразы ^ в 50 - 60 раз выше удельной активности ДНК-полимеразы ß. Впервые показано в экспериментах in vivo, что активные формы кислорода, генерирующие разного типа повреждения в ДНК, вызывают повышение активности ДНК-полимеразы что является указанием на репаративную функцию фермента.

Результаты работы подтверждают существование нового, принципиально отличающегося от известных ДНК-полимераз фермента с выраженной репаративной функцией. Они имеют научно-теоретическое значение для. развития представлений о репаративной системе ДНК эукариот и ее функционировании на ранних стадиях эмбрионального развития. Полученные данные могут быть использованы при исследовании регуляции репарации ДНК в эмбриогенезе позвоночных животных и для изучения механизмов коррекции разного типа повреждений в структуре ДНК.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции "Окислительный стресс и регуляция окислительно-восстановительных процессов: клеточные сигналы, СПИД, рак и другие болезни" (Париж, Франция, 1996) и международном совещании "Репликация ДНК у эукариот" (Колд Спринг Харбор, США, 1997)

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения и выводов. Работа изложена на /-// стр., экспериментальные данные представлены на 13 рисунках и в 6 таблицах. Список цитируемой литературы включает <31 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для получения экспериментального материала использовали вьюнов Misgurnus fassilis L, содержащихся при 4°С. Экстракты яйцеклеток и эмбрионов фракционировали методами колоночной хроматографии и дифференциального ультрацентрифугирования в градиенте глицерина.

ДНК-полимеразную активность во фракциях определяли по включению радиоактивной метки из [3H]dNTP или [a-32P]dNTP в активированную ДНК. Единицу ДНК-полимеразной активности определяли как включение 1 нмоль dNMP в ДНК за 60 мин инкубации. 3'-»5'-экзонуклеазную активность в препаратах ферментов определяли по гидролизу меченных на 5'- или на 3'-конце олигонуклеотидов.

Процессивность ферментов определяли по включению радиактивного dTMP в poly(dA)*dTio в условиях избытка праймер-матричных комплексов. Размер радиоактивных олигонуклеотидов определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 7 М мочевины как описано ранее (Маниатис и др., 1984).

Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия проводили по методу Леммли (Laemmly, 1970). Полипептиды окрашивали серебром (Oakley et al., 1980).

Каталитическую субъединицу определяли с помощью нативного электрофореза препарата белков в ПААГ (Mechali et al., 1980) и последующего электрофореза белковых фракций в денатурирующих условиях.

Оплодотворенные яйцеклетки подвергали окислительному стрессу в системе ксантин-ксантиноксидаза как описано Пескиным (Пескин и др., 1997).

Схема выделения ДНК-полимераз £ и ß из икры вьюна

Зрелые яйцеклетки Misgurnus fossilis

Гомогенизирование, Центрифугирование при 105 00( Фосфоцеллюлоза Р-11

| Элюция 0,6 М KCl

Фосфоцеллюлоза Р-11

I Элюция градиентом

I 0,26-0,52 М KCl

DEAE-Toyopearl

Элюция градиентом 0-0,4 М КС!

Гидроксиапатит

Элюция градиентом 0-0,4 М фосфата калия

Фенил-сефароза

Нанесение в 0,5 М (NH4)*S04

Элюция градиентом 0,5-0 M(NH4)2S04

Несвязавшаяся с сорбентом фракция

ДНК-целлюлоза

Градиент 15-30% глицерина

Элюция градиентом 0-0,6 М КС!

Центрифугирование при 200000g

ДНК-полимераза ß

Фракция 0,35-0,15 (NH4)2S04

ДНК-целлюлоза

Градиент 15-30% глицерина

ДНК-полимераза Q

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Выделение ДНК-полимераэы С, из зрелых яйцеклеток вьюна

На первых этапах очистки (вплоть до хроматографии на DEAE-Toyopearl) ДНК-полимеразы из зрелых яйцеклеток вьюна выделяются совместно (см. схему выделения). В результате хроматографии препаратов ДНК-полимераз на колонке DEAE-Toyopearl получены 3 основные фракции ферментов, различающиеся по сродству к ионообменнику (рис. 1). Первый компонент (фракции 5-8) элюируется при 50 - 90 мМ калий-фосфатного буфера и устойчив к ингибиторам ДНК-полимераз типа а бутиланилин-dATP (BuAdATP) и бутилфенил-dGTP (BuPhedGTP). Второй (фракции 11-15) и третий (фракции 1722) компоненты элюируются с колонки, соответственно, при 130 и 230 мМ калий-фосфата и ингибируются афидиколином и BuAdATP или BuPhedGTP. Они соответствуют выявленным ранее двум формам ДНК-полимеразы a, ai и аг. Дальнейшая очистка препарата из фракций 5 - 8 с помощью хроматографии на колонке с фенил-сефарозой позволила разделить его на два компонента. Первый из них не связывается с гидрофобным сорбентом при нанесении в присутствии 0,5 М (NH^SOi. и содержит, в основном, ДНК-полимеразу ß, которую идентифицировали по устойчивости к N-этилмалеимиду. Второй компонент связывается с сорбентом и элюируется в интервале 0,35-0,15 М (NH-thSO^ Он содержит ДНК-полимеразную и 3'-*5'-экзонуклеазную активности, устойчивые к BuAdATP и обладающие высокой чувствительностью к N-этилмалеимиду. При дальнейшей очистке ДНК-полимеразная активность распределяется совместно с 3'->5'-экзонуклеазной активностью при хроматографии на однонитевой ДНК-целлюлозе и при последующем дифференциальном центрифугировании в градиенте плотности 15-30% глицерина, где обе активности соосаждаются с коэффициентом седиментации 6 S (рис. 2А). Это указывает на возможную связь ДНК-полимеразной и 3'->5'-экзонуклеазной активностей с одним белком. Ингибиторный анализ полученного препарата с использованием афидиколина и d2TTP позволил идентифицировать его как ДНК-полимеразу, сходную с ДНК-полимеразой С, из тимуса теленка (Bialek and Grosse, 1993). С помощью колоночной жидкостной хроматографии и центрифугирования в градиенте глицерина ДНК-полимераза С,

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29

номер фракции

Рис. 1 Распределение ДНК-полимеразной активности во фракциях при хроматографии на колонке с ОЕАЕ-Тоуореаг1 (табл. 1, стадия 5) в отсутствие ингибитора (1) и в присутствии 1 мкМ ВиАс1АТР (2). Материал из фракций 5-8 объединяли и использовали как источник ДНК-полимераэ с, и р.

номер фракции

«За

9 10 ¡1 12 15 14 15

а

эис. 2 А - Седиментация ДНК-полимеразы ц из цитоплазматической фракции икры зьюна в градиенте 15-30%-ного глицерина: 1 - ДНК-полимеразная активность (левая зсь ординат), 2 - 3'->5'-экзонуклеазная активность (правая ось ординат). Б .электрофорез белков из фракций градиента в 7 %-ном ПААГ в присутствии Оэ-Ма. Зедиментационные стандарты: каталаза (И.ЗБ), альдолаза (8,33) и БСА (4,38). Стандарты для электрофореза: р-галактсзидаза (116 кДа), фосфорилаза В (94 «Да), 5СА (67 кДа), овальбумин (43 кДа) и карбоангидраза (30 кДа), а - полипептид с сажущэйся молекулярной массой 68 кДа. (Гель окрашен серебром)

очищена примерно в 5000 раз. Ее удельная активность составляла около 2000 ед/мг белка. Дальнейшая очистка ДНК-полимеразы £ не приводила к увеличению удельной активности фермента из-за нестабильности ДНК-полимеразной и 3'->5'-экзонуклеазной активностей в препаратах ДНК-полимеразы С,, несмотря на использование смеси из пяти ингибиторов протеаз.

II. Полипептидный состав ДНК-полимеразы £

Для определения полипептидного состава ДНК-полимеразы С, проводили разделение белков, содержащихся в выделенной после хроматографии на ДНК-целлюлозе фракции ДНК-полимеразы в градиенте глицерина или с помощью нативного электрофореза с последующим анализом активных фракций электрофорезом в денатурирующих условиях.

После седиментации препарата в градиенте плотности глицерина материал из фракций, где выявлялась ДНК-полимеразная и 3'—>5'-экзонуклеазная активности, исследовали электрофорезом в 7%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na. Оптическая денситометрия геля показала, что количество одного из мажорных полипептидов с кажущейся молекулярной массой 68 кДа коррелирует с ДНК-полимеразной и 3'-»5'-экзонуклеазной активностями (рис. 2А, Б). Этот полипептид, по-видимому, соответствует полипептиду 66 кДа в препарате ДНК-полимеразы С, из тимуса теленка (Bialek and Grosse, 1993). Однако в препарате ДНК-полимеразы С, из яйцеклеток вьюна отсутствуют полипептиды, близкие по молекулярной массе к полипептидам 40 и 35 кДа, обнаруженным в ферменте из тимуса теленка.

Для уточнения полипептидного состава исследуемого фермента и определения его каталитической субъединицы, мы использовали метод нативного электрофореза белков препарата, полученного после хроматографии на колонке с однонитевой ДНК-целлюлозой, поскольку препарат ДНК-полимеразы С, после седиментации в градиенте глицерина был нестабилен. ДНК-полимеразная активность обнаруживалась в двух зонах геля (рис. ЗА), зоне 1 - фракции 10-12 и зоне 2 - фракции 25-31. Электрофорез белков из пиковых фракций № 10, 11 и 28, 29 в присутствии Ds-Na выявил единственный мажорный полипептид, который присутствует в обеих зонах геля и имеет кажущуюся молекулярную массу 68 кДа (рис. ЗБ, дорожки 1 и 3). Этот

номер фракции

Рис. ЗА Активность ДНК-полимеразы С, в неденатурирующем 4% полиакрил-эмидном геле.

Рис. ЗБ Электрофорез белков из фракций, полученных после нативнсго 'пектрофореза, в 7,5%-ном ПААГ э присутствии Оэ-№. На электрофорез 5рьл, фракции 11, 12 из пика 1 (дорожка 1); фракции 19, 20 из области, не содержащей активности (дорожка 2) и фракции 28, 29 из пика 2 (дорожка 3). Стандарты для электрофореза: р-галактозидаза (116 кДа), фосфорилаза В (97 кДа), БСА (66

сДа), овальбумин (45 кДа) и карбоангидраза (29 кДа), а - полипептид с кажущейся молекулярной массой 68 кДа. (Гель окрашен серебром)

полипептид отсутствует во фракциях 19,20 не обладающих ДНК-полимеразной активностью (дорожка 2), которые использовали в качестве контроля. Таким образом, полученные данные указывают на то, что препарат ДНК-полимеразы Q из икры вьюна содержит субъединицу 68 кДа, которая обладает каталитической активностью.

Двумерный электрофорез белков фракции 11, полученной при центрифугировании препарата в градиенте 15-30%-ного глицерина, позволил отделить 68 кДа-полипептид от примесных полипептидов и определить его изоэлектрическую точку, которая оказалась равна pi 6,3 (рис. 4). Таким образом, каталитическая субъединица ДНК-полимеразы С, является слабокислым полипептидом с молекулярной массой 68 кДа. Коэффициент седиментации ДНК-полимеразы С, вьюна 6 S совпадает с коэффициентом седиментации фермента из тимуса теленка (Bialek and Grosse, 1993).

III. Энзиматическая характеристика ДНК-полимеразы

По энзиматическим свойствам и чувствительности к ингибиторам ДНК-полимераза С, отличается от ДНК-полимераз а, ß, у, 5 и е. Чувствительность к ингибиторам ДНК-полимеразы <; из икры вьюна соответствует чувствительности к ингибиторам ДНК-полимеразы q из тимуса Теленка с той лишь разницей, что ДНК-полимеразная активность фермента в присутствии BuAdATP не меняется, в то время как активность ДНК-полимеразы :<; из тимуса теленка возрастает. Чувствительность к афидиколину и BuAdATP ДНК-полимеразы t, из икры вьюна и тимуса теленка отличается от чувствительности ДНК-полимеразы с,, недавно-обнаруженной в дрожжах (Nelson et al., 1996). Последняя практически нечувствительна к афидиколину и умеренно чувствительна к BuAdATP, что не характерно для ДНК-полимераз С, из тимуса теленка и яйцеклеток вьюна. Кроме того, ДНК-полимераза дрожжей не использует в качестве субстрата ни активированную ДНК, ни poly(dA)»dTio и не обладает 3'->5'-экзонуклеазной активностью. Это означает, что фермент, выделенный из икры вьюна и тимуса теленка, отличается от фермента из дрожжей, также названного ДНК-полимеразой <;.

6.8 6.5 6-2 5.6 5.0

рН

94 67

а

?

43

30

Рис. 4 Двумерный электрофорез белков препарата ДНК-полимеразы С, из цитоплазматической фракции икры вьюна. Первое направление изофокусирование белков, второе - электрофорез в 8%-ном ПААГ в присутствии Оэ-Ыа. Стандарты для электрофореза: фосфорилаза В (94 кДа), БСА (67 кДа), овальбумин (43 кДа) и карбоангидраза (30 кДа). а - полипептид с кажущейся молекулярной массой 68 кДа. (Гель окрашен Кумасси)

ДНК-полимераза с, является ДНК-зависимым ферментом и не использует в качестве матрицы ро1у(А). Оптимальной матрицей для ДНК-полимеразы <; является ДНК, активированная ДНКазой I. Удельная ДНК-полимеразная активность ДНК-полимеразы <; в исследуемом препарате при тестировании на активированной ДНК составляла ~2000 ед/мг белка, а удельная активность 3'->5'-экзонуклеазы при гидролизе сГГюо составляла примерно -400 ед/мг белка, что говорит об аномально высоком отношении 3'-+5'-экзонуклеазной активности фермента к его ДНК-полимеразной активности (0,2). Указанное отношение в 20 раз выше, чем отношение экзонукпеазной и ДНК-полимеразной активностей у ДНК-полимеразы е человека, которое при тестировании в аналогичных условиях составляло 0,01.

Процессивность ДНК-полимеразы С, вьюна определяли на матрице ро1у(с!А)-с1Т1о (рис. 5, дорожки 8-10) и сравнивали с процессивностью ряда других ДНК-полимераз: ДНК-полимеразы б человека (дорожки 2-4), ДНК-полимеразы а (дорожки 5-7) и ДНК-полимеразы р (дорожки 11-13) вьюна. В отличие от высокопроцессивной ДНК-полимеразы в, которая даже в отсутствие белка РСЫА синтезирует на ро1у(с!А) фрагменты ДНК длиной до сотни нуклеотидных остатков, и умеренно процессивной ДНК-полимеразы а, ДНК-полимераза С,, подобно ДНК-полимеразе р, присоединяет к затравке в среднем один нуклеотидный остаток за один цикл связывания с праймер-матричным комплексом. Таким образом, синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой С,, дистрибутивен. Кроме того, он РСЫА-независим, что отличает ДНК-полимеразу ^ от ДНК-полимеразы 6 (данные не приведены).

3'->5'-экзонуклеаза в препарате ДНК-полимеразы осуществляет гидролиз однонитевых поли- и олигонуклеотидов с З'-конца (рис. 6, А), а также специфически удаляет неспаренные водородными связями З'-концевые нуклеотиды из дуплексов (рис.6 Б) Гидролиз спаренных тимидиловых нуклеотидов в комплексе ЬТюо([3Н]с1Тп)-3' с ро1у(с!А) практически не регистрируется при данных условиях эксперимента (рис. 6, Б, кривая 1). Гидролиз неспаренных З'-концевых дезоксицитидиловых остатков в дуплексе йТюо([эН]с1С1-5)-3' с ро!у(с1А) происходит в 3-4 раза медленее, чем гидролиз тех же остатков в смеси сГГюоЦ^сЮьбЬЗ' с соответствующим количеством

i 2 3 4

5 6 7

8 3 Ю Ч /2

Рис. 5 Процессивность ДНК-полимеразы е - 0,05 ед. (2-4), а - 0,01 ед. (5-7), С, -0,03 ед. (8-10) и (3 - 0,03 ед. (11-13) при полимеризации на ро!у(с1А)сГГ10 (10:1), взятом в концентрации 10 (2, 5, 8,11), 50 (3, 6, 9.12) и 250 мкг/мл (4, 7, 10, 13). Реакционная смесь содержала 2,5 мкМ сЛТР, 50 мкКи/мл [а-32Р]с!ТТР. Представлен радиоавтограф, полученный после разделения продуктов реакции в 10%-ном ПААГ в присутствии 7 М мочевины. В качестве маркера использовали 5'~[^Р]с1Т10 (1)

u о t-

19 &

ю >. о

JJ I-

и о

X

о

S

ь

¡£ я о

S

ч

Я

а к п X

т

е

в

80

40

0 120

80

40

- ----л—...... 0 2 (5l?2p)

\ 1 (3-Н)

---т—- 1 (з^н)

2 (5-2Р)

1 < ' ~ " 3 <з-3н) t

30

60 90

время, мин

120

Рис. 6 Экзонуклеазный гидролиз однонитевсго субстрата 5'-[32Р№Тюо([3Н]сЯ(6)-3' (А) и двунитевых субстратов ро1у(с)А)-5'-["Р]с1Т,оо([3Н]сП>3-3' (Б, кривые 1, 2) и ро1у(ЬА) с!Т1оо([3Н]с1СИ)-3' (Б, кривая 3) в присутствии препарата ДНК-полимеразы С Реакционная среда содержала смесь ро!у(сЮ) и сИюо^НдаСкЦ-З' (Б. кривая 4):

1, 3, 4 - остаточная ?Н- радиоактивность З'-концов, 2 - остаточная радиоактивность 5'-концов.

■р-

Дг

4 2 3 4 5 6

Рис. 7 Гидролиз 5'-[32P]dT10 под действием ДНК-полимеразы ; в присутствии poly(dG). Реакцию проводили в течение 0 (дорожка 1), 15 мин (2), 30 мин (3), 60 мин (4-7). В реакционную смесь вносили 4 мМ AMP (5), ю мМ NaF (6).

poly(dG) (рис.6, Б, ср. кривые 3 и 4). В препарате ДНК-полимеразы С, отсутствует 5'->3'-экзонуклеазная активность в отношении однонитевой и двунитевой ДНК (рис. 6, А, Б).

3'->5'-экзонуклеаза ДНК-полимеразы С действует дистрибутивно. Наименьшим по длине эффективным субстратом для нее являются олигонуклеотиды из шести звеньев (см. рис. 7).

Специфичность 3'-»5'-экзонуклеазы, связанной с ДНК-полимеразы в отношении неспаренных З'-концевых нуклеотидных остатков указывает на возможную корректирующую функцию этой экзонуклеазной активности, в то время как низкая процессивность при полимеризации согласуется с участием этого фермента в репаративном синтезе ДНК.

Исследован эффект ряда ингибиторов на ДНК-полимеразную активность и 3'->5'-экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы AMP (4 мМ) ингибирует как ДНК-полимеразную, так и 3'->5'-экзонуклеазную активности ДНК-полимеразы С, (рис. 7, дорожка 5). Согласно литературным данным, AMP ингибирует 3'->5'-экзонуклеазную активность ДНК-полимераз 8 и ё, однако этот нуклеотид активирует ДНК-полимеразную активность этих ферментов (Sabatino and Bambara, 1988). Фторид натрия оказался специфическим ингибитором 3'-»5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы В концентрации 10 мМ он ингибирует на 85-90% экзонуклеазный гидролиз олигонуклеотидов (рис. 7, дорожка 6, тогда как ДНК-полимеразная активность фермента подавляется всего на -15%. В то же время NaF не являлся селективным ингибитором для ДНК-полимеразы б человека. Таким образом, селективный ингибирующий эффект фторида натрия на 3'-»5'-экзонуклеазу ДНК-полимеразы К, может оказаться специфичным для этого типа ДНК-полимераз высших эукариот.

Особенности энзиматических свойств ДНК-полимеразы а именно низкая процессивность при полимеризации в сочетании с высокой корректирующей 3'-»5'-экзонуклеазной активностью, позволяют рассматривать ее как ДНК-полимеразу с предположительно репаративной функцией.

IV. Изменение активности ДНК-полимераэ р и С в раннем развитии вьюна

Оплодотворение яйцеклеток животных приводит к активации ДНК-синтезирующего аппарата ранее покоящихся клеток. Высокий темп деления клеток и дупликации ядерного генома предполагает функционирование в ядрах эффективной системы репарации ДНК, основными компонентами которой являются репаративные ДНК-полимеразы. Характерной особенностью зрелых яйцеклеток и ранних эмбрионов вьюна является исключительно низкое содержание ДНК-полимеразы р (всего 3,6 ед/г белка), которая, согласно литературным данным, участвует- в репарации ядерной ДНК. Активность ДНК-полимеразы р, приходящаяся на зрелую яйцеклетку аксолотля, на два порядка выше активности фермента в яйцеклетках вьюна, тогда как значения активности ДНК-полимеразы а, приходящейся на яйцеклетку аксолотля и вьюна, близки. (Carre, 1981; Mikhailov and Gulyamov, 1983). Видимый дефицит ДНК-полимеразы р в яйцеклетках и ранних эмбрионах косвенно указывал на наличие других энзиматических систем, способных обеспечивать эффективную репарацию ядерной ДНК в ранних эмбрионах костистых рыб. Свойства ДНК-полимеразы С, согласуются с возможной репаративной функцией этого фермента. Активность обеих репаративных ДНК-полимераз р и Q измеряли на разных стадиях эмбриогенеза вплоть до выклева. Препараты ДНК-полимераз получали из партий по 1000 шт. зрелых яйцеклеток и эмбрионов на стадии развития 8ч. (поздняя бластула), 14 и 16ч. (средняя гаструла), 20ч. (закладка осевых органов) и 40ч. (стадия, предшествующая выклеву) по шкале развития при 21.5°. Фракции 50-90 мМ калий-фосфата с DEAE-Toyopearl, содержащие ДНК-полимеразы р и q, объединяли и ' анализировали с помощью хроматографии на колонке с фенил-сефарозой. Такое фракционирование позволило получить препараты ДНК-полимераз р и q, свободные от примесей других ДНК-полимераз. Анализ показал, что удельная активность ДНК-полимеразы q в 50 - 60 раз выше удельной активности ДНК-полимеразы р, но в 10 раз ниже активности ДНК-полимеразы а (данные не приведены). Активность ДНК-полимеразы р начинает постепенно увеличиваться, начиная со стадии

14 ч. (среднняя гаструла), а активность ДНК-полимеразы <; возрастает начиная со стадии 20 ч. (начало органогенеза). Увеличение удельной активности ДНК-полимеразы р и С, в ходе эмбриогенеза, возможно, связано с запуском экспрессии ядерных генов на стадии средней бластулы. К началу органогенеза (20 ч. развития) активность обоих ферментов существенно возрастает -примерно в 2,5 раза. Перед выклевом (40 ч. развития) активность ДНК-полимеразы g увеличивается примерно в 8,5 раз в сравнении с исходной активностью фермента в зрелых яйцеклетках. При этом активность ДНК-полимеразы а остается практически постоянной в ходе раннего эмбриогенеза, что соответствует ранее опубликованным данным (Mikhallov and Gulyamov, 1983). Таким образом, накопленный в ооцитах фонд ДНК-полимеразы а, вероятно, способен полностью обеспечить интенсивную репликацию ДНК на ранних стадиях эмбриогенеза, в то время как в ходе эмбриогенеза необходим дополнительный синтез ДНК-полимераз р и С,. При этом, значительный фонд ДНК-полимеразы С, в ранних зародышах может потенциально компенсировать дефицит систем репарации в ДНК-полимеразе р.

Чтобы проверить возможную репаративную функцию ДНК-полимеразы с,, проведены эксперименты, в которых оплодотворенную икру подвергали воздействию окислительного стресса. Активные формы кислорода (АФК) вызывают различные повреждения в структуре ДНК клетки (Wallace, 1988), для устранения которых необходимо участие репаративных ДНК-полимераз. Таким образом, измеряя активность ДНК-полимераз в контрольных и опытных эмбрионах, можно судить о функции исследуемых ферментов. Эмбрионы после начала дробления (стадия 4 бластомера) инкубировали в ксантин-ксантиноксидазной системе, генерирующей АФК и оставляли развиваться до стадии 14 ч. (средняя гаструла). На этой стадии активность ДНК-полимеразы <; в контрольных эмбрионах продолжает оставаться низкой. Хроматография на DEAE-Toyopearl препаратов ДНК-полимераз, полученных из эмбрионов вьюна на стадии 14 ч., представлена на рис. 8. Соотношение активностей репликативных форм ДНК-полимеразы а - а1 и а2 и их общая активность практически не меняются в результате воздействия окислительного стресса. Суммарная активность ДНК-полимераз р и С, (I пик) в этих условиях резко

X X X 5 с

.¿Г

I-

о о

X

ш

Н <

0.3

о

О-

см

X

0.2

0.1

Н о

25 30

номер фракции

Рис. 8 Воздействие ксантин-ксантиноксидазной системы на ДНК-полимеразную активность в эмбрионах вьюна. Представлено распределение ДНК-Полимеразной активности (левая ось ординат) во фракциях при хроматографии на колонке с ОЕАЕ-Тоуореаг! в контроле - в отсутствие ингибитора (1) и в присутствии 1 мкМ ВиАс!АТР (2); после окислительного стресса -в отсутствие ингибитора (3) и в присутствии 1 мкМ ВиАс)АТР (4) Градиент концентрации соли-5 (правая ось ординат).

возрастает. После разделения ДНК-полимераз р и £ на колонке с фенил-сефарозой оказалось, что активность ДНК-полимеразы р увеличилась в 2,4 раза, а активность ДНК-полимеразы с, возросла в 4,7 раза. Увеличение активности ДНК-полимеразы р под действием окислительного стресса - факт, уже известный (№гауап е1 а1., 1995), но в отношении ДНК-полимеразы <; такие сведения отсутствовали. Стимуляция активности ДНК-полимеразы с; активными формами кислорода на фоне постоянного соотношения активностей форм репликативной ДНК-полимеразы а - а1 и а2 и их суммарной активности является прямым указанием на возможную репаративную функцию ДНК-полимеразы С,.

ВЫВОДЫ

1. В яйцеклетках и эмбрионах вьюна обнаружена ДНК-полимераза нового типа, обозначенная как ДНК-полимераза С, (дзета), которая отличается по физико-химическим и энзиматическим свойствам от описанных ранее ДНК-полимераз а, р, у, 8 и е эукариот.

2. ДНК-полимераза С, вьюна осуществляет дистрибутивный синтез ДНК на матрице ро1у(с!А)*с)Т1о как в отсутствие, так и в присутствии репликативного фактора РСЫА.

3. ДНК-полимераза ^ вьюна обладает высокой 3'->5'-экзонуклеазной активностью. Отношение 3'-»5'-зкзонуклеазной к ДНК-полимеразной активности в 20 раз выше подобного соотношения у ДНК-полимеразы е человека.

4. 3'-»5'-экзонуклеаза фермента гидролизует предпочтительно однонитевые олигонуклеотиды и неспаренные З'-концевые нуклеотиды двунитевых субстратов. Гидролиз однонитевых олиго- и полинуклеотидов осуществляется дистрибутивным образом.

5. ДНК-полимеразная и 3'->5'-экзонуклеазная активности соосаждаются совместно при ультрацентрифугировании в градиенте 15-30%-ного глицерина с коэффициентом седиментации 6 Б, при этом обе активности коррелируют с распределением полипептида 68 кДа в градиенте.

6. С помощью нативного электрофореза с последующим электрофорезом в денатурирующих условиях показано, что в препарате ДНК-полимеразы С, вьюна ДНК-полимеразной активностью обладает полипептид с кажущейся молекулярной массой 68 кДа. Полипептид 68 кДа является слабокислым белком с изоэлектрической точкой pi 6,3.

7. Активные формы кислорода, генерируемые системой ксантина с ксантиноксидазой в эмбрионах вьюна, повышают в несколько раз активность ДНК-полимераз р и С,, не влияя на активность ДНК-полимеразы а.

8. Свойства ДНК-полимеразы С, свидетельствуют о репаративной функции этого фермента. Высказано предположение, что ДНК-полимераза С, осуществляет репарацию ДНК в клетках эмбрионов костистых рыб.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах

1. Шарова Н. П, Димитрова Д. Д, Михайлов В. С. Выделение и характеристика ДНК-полимеразы дзета из зрелых яйцеклеток костистой рыбы Misgurnus fossilis. Биохимия. 1995. том 60 (11) 1889-1902

2. Peskin А., N. Sharova, D. Dimitrova, S.Stolyarov "Oxidative stress changes the patern of DNA polymerase activity in embryogenesis", Oxidative stress and Redox Regulation: Cellular Signaling, Aids, Cancer and other Diseases, Internationalmeeting, Paris, 21-24 May, 1996. Abstracts, p. 160.

3. Пескин А.В., Шарова Н.П., Димитрова Д.Д., Столяров С.Д. и Филатова Л.С. Влияние окислительного стресса на ДНК-полимеразы в эмбриогенезе вьюна Misgurnus fossilis L. Доклады РАН 1997, том 355, № 2, 262-265

4.Sharova N., Dimitrova D. and Peskin A., "Active oxygen changes the patern of DNA polymerase activity in embryogenesis" Eucariotic DNA Replication, Internationalmeeting Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 3-7 September 1997, Abstract book. p.203.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Димитрова, Диана Димитрова, Москва

¿v? * 3 /j ^ ^

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им„Н.К. Кольцова

на правах рукописи

ДИМИТРОВА ДИАНА ДИМИТРОВА

ВЫДЕЛЕНИЕ НОВОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ РЕПАРАТИВНОГО ТИПА ИЗ ЯЙЦЕКЛЕТОК КОСТИСТОЙ РЫБЫ ВЬЮН

( Misgurnus fossil is L. )

03.00.03 молекулярная биология 03.00.30 биология развития

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук B.C. Михайлов, кандидат биологических наук Н.П. Шарова

Мосша, 1993

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

Список сокращений............................................................................................................................................................................................................4

1. ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................................................................................................5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................................................................................7

2.1. Повреждения в ДНК и факторы, их вызывающие..........................................................................7

2.2. Механизмы репарации ДНК..................................................................................................................................................8

2.2.1. Эксцизионная репарация основания..............................................................................................9

2.2.2. Эксцизионная репарация нуклеотидного остатка......................................................14

2.3. Репаративные ДНК-полимеразы..................................................................................................................................18

2.3.1 ДНК-полимераза р..........................................................................................................................................................18

2.3.2. ДНК-полимеразы 5 и г..............................................................................................................................................22

2.3.3. ДНК-полимераза а........................................................................................................................................................28

2.3.4. ДНК-полимеразаС............................................................................................................................................................32

2.4. ДНК-полимеразы в раннем развитии животных..................................................................................36

2.5. Окислительный стресс и репарация ДНК........................................................................................................40

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................................................................................43

3.1. Источник и квалификация основных реактивов и ферментов....................................43

3.2, Получение биологического материала................................................................................................................44

3.3 Фракционирование ДНК-полимераз........................................................................................................................45

3.3.1. Получение препаратов репаративных ДНК-полимераз для исследования динамики их активности в эмбриогенезе......................................................................................45

3.3.2. Получение очищенных препаратов ДНК-полимераз р и С,

из икры вьюна для седиментационного анализа..............................................................................................................46

3.4. Получение ДНК-субстратов....................................................................................................................................................48

3.4.1. Получение субстратов экзонуклеазы, меченных 3Н с З'-конца............48

3.4.2. Получение субстратов экзонуклеазы, меченных 32Р с 5'-конца.... ^8 -—""^3.5. Определение активности ферментов...........................................................49

3.5.1. Определение активности ДНК-полимераз..............................................................................49

3.5.2. Определение активности 3'-»5' и 5'->3'-экзонуклеазы......................................49

3.6. Определение процессивности ДНК-полимераз....................................................................................50

3.7. Другие методы..............................................................................................................................................................................................51

3.7.1. Электрофоретическое разделение белков и

нуклеиновых кислот..........................................................................................................................................................................................................51

3.7.2. Электрофорез ферментов в неденатурирующем полиакриламидном геле............................................................................................................................................................................................52

3.7.3. Определение концентрации белка и соли..............................................................................52

4. РЕЗУЛЬТАТЫ..................................................................................................................................................................................................................54

4.1. Выделение репаративных ДНК-полимераз из зрелых

яйцеклеток вьюна.........................................................................................................

4.2. Полипептидный состав ДНК-полимеразы (3................................................................................................60

4.3. Полипептидный состав ДНК-полимеразы С..............................................................................................62

4.4. Энзиматическая характеристика ДНК-полимеразы С..................................................................69

4.4.1. Матричные свойства......................................................................................................................................................69

4.4.2. Процессивность......................................................................................................................................................................®9

71

4.4.3. 3'->5'-экзонуклеазная активность...................................................... ' '

76

4.4.4. Ингибиторный анализ.........................................................................

4.5. Изменение активности ДНК-полимераз р и С в раннем

81

развитии вьюна............................................................................................................

4.6. Влияние окислительного стресса на ДНК-полимеразы в

83

эмбриогенезе вьюна....................................................................................................

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................................................ 87

87

5.1. Репаративные ДНК-полимеразы в эмбриональном развитии..................

5.2. Характеристика ДНК-полимеразы С из зрелых

89

яйцеклеток вьюна.........................................................................................................

6. ВЫВОДЫ................................................................................................................ 97

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................... 99

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AP-сайт - апуриновый/ апиримидиновый сайт

БСА - бычий сывороточный альбумин

он ДНК - однонитевая дезоксирибонуклеиновая кислота

дн ДНК - двунитевая дезоксирибонуклеиновая кислота

«Да - килодальтон

o.e. - оптическая единица

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

н.о. - нуклеотидные остатки

ПААГ - полиакриламидный гель

ТЕМЕД - N, N, N, N, - тетраметилэтилендиамин

Трис - трис-(оксиметил)-аминометан

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ЭРО - эксцизионная репарация основания

ЭРН - эксцизионная репарация нуклеотидного остатка

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

А, G, С, U, Т - (в нуклеотидах и нуклеозидах) аденозин, гуанозин,

цитидин, уридин, тимидин BuAdATP - бутил-анилин-дезоксиаденозин-5'-трифосфат BuPhedGTP - бутил-фенил-дезоксигуанозин-5'-трифосфат DMSO - диметилсульфоксид Ds-Na - додецилсульфат натрия

dNMP, dNTP - дезоксинуклеозид-5'-монофофат, -трифосфат d2TTP - 2', 3'-дидезоксинуклеозид-5'-трифосфат dRp - дезоксирибофосфат

PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

PPi - пирофосфат

RF-C - репликативный фактор С

RP-A - репликативный белок А

SSB белки - белки, связывающие однонитевую ДНК

1. ВВЕДЕНИЕ

Репарация ДНК является важнейшей генетической функцией, направленной на сохранение интактной структуры клеточного генома. Различные физические и химические факторы вызывают различные повреждения в ДНК, что определяет многообразие механизмов репарации этих повреждений. Проблема коррекции структурных аномалий, возникающих в ДНК, особенно актуальна на ранних этапах эмбрионального развития, так как дефект в репаративной системе клеток эмбриона в условиях интенсивной пролиферации приводит к многократному повторению ошибки. Репаративный синтез ДНК в ходе первых делений клеток эмбриона обеспечивается запасенными в зрелом ооците репаративными ДНК-полимеразами. Низкое содержание ДНК-полимеразы ß в зрелых яйцеклетках вьюна в сравнении с ее содержанием в яйцеклетках других видов (Mikhailov and Gulyamov, 1983; Carre et al., 1981, Matsumoto et al., 1994) ставит вопрос о возможном участии других ДНК-полимераз в репарации повреждений ДНК на ранних этапах эмбриогенеза.

Согласно современной классификации, существуют пять типов ДНК-полимераз эукариот: а, ß, у, 8 и s (Burgers et al., 1990), которые участвуют в репликации и репарации ДНК. Недавно опубликованы данные о новой ДНК-полимеразе, названной ДНК-полимеразой С,, выделенной из тимуса теленка (Bialek and Grosse, 1993), зрелых яйцеклеток вьюна (Шарова и др., 1994) и клеток дрожжей (Nelson et al., 1996). ДНК-полимераза С, участвует, по-видимому, в репарации ДНК. Если о структуре, физико-химических и энзиматических свойствах ДНК-полимераз а, ß, у, 5 и в существуют многочисленные данные, то о новом ферменте известно крайне мало.

Решение вопроса о роли обнаруженной ДНК-полимеразы требует детального анализа строения фермента, идентификации каталитической субъединицы и исследования механизма взаимодействия с модельными ДНК-субстратами. Физико-химический и энзимологический анализ ДНК-полимеразы С, может выявить новые механизмы репарации клеточной ДНК и их специфику в раннем развитии животных.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. ПОВРЕЖДЕНИЯ В ДНК И ФАКТОРЫ, ИХ ВЫЗЫВАЮЩИЕ

Существуют два типа структурных аномалий, которые могут привести к стабильно наследуемым изменениям в последовательности ДНК, так называемым мутациям. В первом случае обычные нуклеотидные остатки, включаясь в ДНК, нарушают контекст последовательности ДНК. Эти аномалии связаны с появлением в ДНК неспаренных оснований, петель в ДНК за счет вставки или делеции нуклеотидных остатков и др. Ко второму типу относятся так называемые повреждения в структуре ДНК: в нормальный контекст последовательности ДНК включены аномальные, с точки зрения их химического строения, нуклеотидные остатки. К ним относятся модифицированные, фрагментированные и кросс-связанные нуклеотиды.

Как известно, ДНК постоянно подвергается разного рода изменениям, как спонтанным, так и индуцируемым физическими и химическими мутагенами, и даже клеточными метаболитами. В ДНК сравнительно часто происходят такие спонтанные изменения как апуринизация (Lindahl and Nyberg, 1972) и дезаминирование оснований (Sakumi and Sekiguchi, 1990). Продукты дезаминирования цитозина, аденина и гуанина а именно - урацил, гипоксантин и ксантин, соответственно, являются основаниями, не характерными для первичной структуры ДНК . Это обстоятельство позволяет репаративной системе клетки узнавать эти "необычные" основания и удалять их. Главным нарушением, возникающим под действием ультрафиолетового облучения, является насыщение двойных связей оснований и образование пиримидиновых димеров из двух соседних пиримидинов в одной цепи ДНК. Ионизирующая радиация приводит часто к размыканию пуринового кольца,

фрагментации основания и к образованию одно- и двухцепочечных разрывов (см. обзор Sankar, 1996) Продую- формамидопирин, например, препятствует дальнейшей репликации цепи ДНК. Химическими реагентами, которые модифицируют ДНК, могут являться как различные активные формы кислорода, образующиеся в процессе его метаболизма (Wallase, 1988), так и различные неорганические и органические электрофилы, включая металлы, алкилирующие агенты и полициклические ароматические углеводы (см. обзор Demple and Harrison, 1994).

2.2. МЕХАНИЗМЫ РЕПАРАЦИИ ДНК

Функциональная стабильность ДНК обеспечивается серией ферментативных реакций, объединенных термином репарация. Ряд повреждений клетка удаляет из ДНК путем прямой реактивации. Типичные ферменты такой репарации - ДНК-фотолиаза бактерий, которая способна "расшивать" циклобутановое кольцо пиримидинового димера, и m-06G-flHK-метилтрансфераза, которая переносит метильную группу с алкилированного гуанина на один из собственных цистеиновых остатков. Прямая реактивация повреждений в ДНК не нуждается в участии репаративных ДНК-полимераз, поэтому она не рассматривается детально в этом обзоре (для допольнительной информации см. обзор Wood, 1996).

Другим путем репарации является эксцизионная репарация. В этом случае для восстановления изначальной первичной структуры дуплекса необходимо наличие информации интактной комплементарной цепи, считываемой репаративными ДНК-полимеразами.

Репаративные реакции, в ходе которых происходит корректировка неспаренных нуклеотидов и повреждний ДНК, сходны. Неправильно вставленное или поврежденное основание удаляется (в этом сучае имеет

место т. наз. эксцизионная репарация основания), либо вырезается весь нуклеотидный остаток (т. е. происходит эксцизионная репарация нуклеотидного остатка). Образовавшаяся в результате реакции вырезания брешь "заполняется" ДНК-полимеразой в ходе репаративного синтеза, после чего разрыв в цепи ДНК лигируется.

2.2.1. Эксцизионная репарация основания

Эксцизионная репарация основания (ЭРО) является способом коррекции модифицированных оснований. Существуют данные об ЭРО, связанной с застраиванием однонуклеотидной бреши, что обычно наблюдается в случаях образования нормального апуринового/апиримидинового (АР)-сайта ("short-patch" repair), и ЭРО, в ходе которой ДНК-полимеразы заполняют брешь из нескольких (до шести) нуклеотидов ("long-patch" repair), зачастую связанной с репарированием аномального АР-сайта (Klunglan and Lindahl , 1997). Согласно модели, предложенной Lindahl (Lindahl, 1993), модифицированные основания репарируются в ходе пяти последовательных реакций: (1) удаление основания специфичной ДНК-1М-гликозилазой (показано в случаях гидролитического дезаминирования, алкилирования и при повреждениях, вызванных активными формами кислорода (Sakumi and Sekiguchi, 1990; Wallase, 1988) с получением общего промежуточного продукта - АР-сайта; (2) надрезание АР-сайта с его 5'-конца АР-эндонуклеазами класса II; (3) вырезание 5'-концевого дезоксирибофосфата (dRp) с образованием однонуклеотидной бреши; (4) репаративный синтез ДНК, застраивающего брешь; (5) "зашивание" разрыва ДНК-лигазой.

Так как АР-сайты образуются достаточно часто в клетке вследствие спонтанной или индуцированной потери основания, интересной представляется идентификация ферментов, эффективно обеспечивающих

репарацию данного типа. Были предприняты попытки установить, какие из известных ДНК-полимераз способны участвовать в эксцизионной репарации G:U пары синтетического олигомера (Dianov et al., 1992). Показано, что такой тип неправильного спаривания в экстрактах клеток Е. coli и линии клеток человека репарируется в результате замены одного одинственного нуклеотидного остатка, катализируемой, по всей видимости, ДНК-полимеразой ß, на что указывает ингибиторный анализ с использованием афидиколина, d2TTP и DMSO. Так как репарация сопровождалась образованием однонуклеотидной бреши, авторы предположили, что удаление dRp происходит при помощи не экзонуклеазы, а

дезоксирибофосфодиестеразы.

Участие ДНК-полимеразы ß в ЭРО подтверждено в экспериментах по реконструкции системы репарации in vitro с использованием клеток семенников быка (Singhai et al., 1995). В грубом ядерном экстракте репарация G:U пары подавлялась поликлональными антителами к ДНК-полимеразе ß и ее 8-кДа домену, а также при полном исключении из среды Мд2+. Правильная замена нуклеотида происходила при внесении препаративно очищенной ДНК-полимеразы ß в реакционную смесь, содержащую частично очищенные компоненты фракций, обладающие урацил-ДНК-гликозилазной, АР-эндонукпеазной и лигазной активностями. Практически никакой активности в данной системе не проявляли ДНК-полимеразы 5 или е и очень низкую репаративную активность демонстрировала ДНК-полимераза а, что, в действительности, могло быть проявлением связанной с ДНК-полимеразой а корректирующей активности ДНК-полимеразы Это вполне правдоподобно в виду полученных результатов авторов о том, что ни афидиколин, ни нейтрализующие ДНК-полимеразу а антитела не блокировали репаративный синтез.

Недавно Sobol с соавт. (Sobol et al., 1996) опубликовали результаты работ, выполненных на клеточной линии гомозиготных по делетированному гену ДНК-полимеразы р фибробластов из эмбрионов трансгенных мышей, по выявлению роли этой полимеразы in vivo. Экстракты этих клеток оказались дефектными по урацил-инициированной ЭРО. Они также обладали повышенной чувствительностью к монофункциональным ДНК-алкилирующим агентам, однако их чувствительность к другим ДНК-повреждающим агентам, таким как ультрафиолетовая радиация, у-облучение, Н202 и цисплатина не отличалась от контрольных экстрактов. Эти данные допускают участие других репаративных ДНК-полимераз в ликвидации повреждений, вызванных этими факторами.

Альтернативный путь репарации АР-сайта с участием ДНК-полимеразы 5 был исследован Matsumoto с соавт. (Matsumoto et al., 1994). Репарация тетрагидрофурана (синтетический аналог АР-сайта) поддерживалась системой, состоящей из фракций очищенных PCNA, АР-эндонуклеазы, ДНК-полимеразы 5 и ДНК-лигазы. Эта PCNA-зависимая система репарировала нормальный АР-сайт так же хорошо, как и тетрагидрофурановый остаток. В отличие от ДНК-полимеразы 5, ДНК-полимераза р была способна осуществлять замену только естественного АР-сайта независимо от присутствия PCNA. Активность очищенной ДНК-полимеразы а в подобном эксперименте не проявлялась. Эксцизионная репарация основания с участием ДНК-полимеразы 8 происходит также в тех случаях, когда вместо нормального АР-сайта в составе олигонуклеотида присутствует его ре�